Enzimo terminado

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INTRODUCCIÓN El método clásico de clonación de ácidos nucleicos es el que aprovecha la capacidad de las células para replicar el DNA. Surge gracias a la aparición de una serie de técnicas que permiten el aislamiento del DNA y al descubrimiento en los años 70 de las enzimas de restricción, que hace posible en el laboratorio cortar el DNA e incorporar los fragmentos a vectores, que a su vez se introducen en células anfitrionas, donde tiene lugar su replicación. Aunque, en principio, esta tecnología sólo se planteaba para clonación del DNA,

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INTRODUCCIÓN

El método clásico de clonación de ácidos nucleicos es el que

aprovecha la capacidad de las células para replicar el DNA.

Surge gracias a la aparición de una serie de técnicas que

permiten el aislamiento del DNA y al descubrimiento en los

años 70 de las enzimas de restricción, que hace posible en el

laboratorio cortar el DNA e incorporar los fragmentos a

vectores, que a su vez se introducen en células anfitrionas,

donde tiene lugar su replicación. Aunque, en principio, esta

tecnología sólo se planteaba para clonación del DNA, existen

actualmente variantes que amplían su eficiencia y extienden

su aplicación al RNA.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

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Para poder describir el proceso de clonación del DNA, es necesario hacer un inciso para

estudiar con cierto detenimiento las propiedades y características de las endonucleasas de

restricción. Aunque estas enzimas desempeñan una función propia en las células procariotas

en las que se descubrieron, son particularmente importantes por su empleo experimental en

varias áreas de la Biología Molecular, de interés tanto básico como aplicado al diagnóstico

clínico. En especial, se utilizan en el proceso de la clonación molecular de DNA; de ahí la

oportunidad de su estudio en este lugar. Además, tienen aplicación en otras técnicas, como

la secuenciación del genoma y el estudio de los polimorfismos, se inicia el estudio de estas

enzimas con un breve recordatorio de las nucleasas en general.

INTRODUCCIÓN A LAS NUCLEASAS

Se denomina de forma genérica nucleasa a cualquier enzima con capacidad de escindir los

enlaces fosfodiéster de la cadena polinucleotídica de los ácidos nucleicos; son por tanto,

fosfodiesterasas. Su especificidad puede analizarse con respecto a tres criterios:

1. Escisión en posiciones internas o terminales en la estructura primaria (endonucleasas

y exonucleasas, respectivamente).

Las exonucleasas hidrolizan exclusivamente enlaces fosfato en los que participa el

nucleótido terminal (bien 5´o bien 3´, dependiendo de la exonucleasa). Generan, por

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tanto, una cadena polinucleotídica acortada y un nucleósido (N), un nucleósido-

monofosfato (pN o Np) o un nucleósido-bifosfato (pNp).

Las endonucleasas sólo hidrolizan enlaces internos de la cadena, es decir, sin afectar

a los nucleótidos terminales. Generan dos fragmentos polinucleotidícos.

2. Actuación sobre uno de los dos tipos de enlace fosfoéster:

Algunas nucleasas (tipo “a”) actúan específicamente hidrolizando los enlaces fosfato

formados con el OH 3´, mientras que otras (tipo “b”) hidrolizan los formados con el

OH 5´.

De este modo, las de tipo “a” dan lugar a extremos 3´-OH y 5´-P, mientras que las de

tipo “b” producen extremos 3´-P y 5´-OH.

Ejemplos de especificidad tipo “a” y “b” de endonucleasas:

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3. Reconocimiento de nucleósidos, bien por la pentosa o bien por la base nitrogenada

(sólo en algunas nucleasas): desoxirribonucleasas o DNasas, que actúan sólo sobre

DNA; ribonucleasas o RNasas, que hidrolizan RNA; finalmente, algunas nucleasas

distinguen entre nucleósidos purínicos de pirimidínicos.

Ejemplos de especificidad por nucleósidos:

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Características Generales

Las enzimas de restricción se llaman también nucleasas de restricción, endonucleasas de

restricción y, en ocasiones, enzimas restrictivas o restrictasas. Pertenecen a este grupo

una gran diversidad de endodesoxirribonucleasas, descubiertas como enzimas propias de

distintas bacterias y caracterizadas en los años 70. Se disponen hoy comercialmente de

un gran número de ellas con elevada especificidad, estabilidad y pureza.

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Se nombran con tres letras tomadas del género y especie de la bacteria de la que se

aislaron originalmente, seguidas a veces por una letra más, que identifica el serotipo

(variantes antigénica de la bacteria), y finalmente por un número romano que las identifica

en el caso de que en una misma variante se hayan encontrado varias enzimas con

distinta especificidad:

La importancia de las enzimas de restricción radica en su gran especificidad de

reconocimiento de una secuencia corta de DNA dúplex y la consiguiente hidrólisis de un

enlaces fosfodiéster en cada hebra, justamente en secuencias concretas del DNA

llamadas sitios de reconocimiento o de restricción. Los fragmentos de DNA originados son

útiles para iniciar la clonación celular o acelular, para el análisis de DNA, para elaborar

mapas físicos de restricción, para la detección de polimorfismos, etc.

Las diversas enzimas de restricción se agrupan normalmente en tres familias, de acuerdo

con sus propiedades:

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Nos concentraremos en el estudio de las enzimas de tipo II, pues, al cortar en secuencias

muy definidas, son loas utilizadas como herramientas en ingeniería genética.

Papel biológico del sistema metilación-restricción

La existencia natural de las nucleasas de restricción en muchas bacterias ofrece a estas

un mecanismo de defensa contra la entrada de material genético de otro organismo,

concretamente de virus bacteriófagos (cuya reproducción depende de la maquina

genética de la bacteria): se trata de los sistemas de restricción-modificación o metilación-

restricción. Para cada enzima de restricción, una metilasa reconoce la misma secuencia

que constituye el sitio de restricción y une covalentemente grupos metilo a determinadas

bases del DNA en dicha secuencia. En el caso de enzimas de tipo II, la metilasa es una

proteína independiente, mientras que las de tipo I y III poseen las actividades nucleasa y

metilasa en su molécula oligomérica, como subunidades que actúan coordinadamente.

El mecanismo de defensa es el siguiente: el DNA propio de la bacteria es metilado de una

forma específica característica de cada especie bacteriana (en las secuencias

reconocidas tanto por la restrictasa como por la metilasa de esa especie). La metilación

de las bases impide la unión de la enzima de restricción, con lo que el DNA propio no es

hidrolizado. Por el contrario, al entrar en la célula DNA de otro organismo, no metilado o

con un patrón de metilación diferente, este DNA puede ser degradado por la enzima de

restricción, ya que carece de los grupos metilo en la secuencia diana (por razones

puramente aleatorias, en cualquier genoma habrá un cierto número de secuencias de 4,6

u 8 pb iguales a la reconocida por la enzima, luego habrá secuencias diana disponibles).

A partir de este mecanismo de acción combinada surgió precisamente el nombre de

enzimas de restricción: la acción de la nucleasa restringe la posibilidad de infección por

virus.

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Si esté metilada una solo hebra del DNA, el sito no es reconocido por la enzima de

restricción, pero si por la metilasa, que añade el grupo metilo a la otra hebra. Esto es lo

que ocurre, por ejemplo, al final de la replicación, donde el dúplex está formado por una

hebra molde, preexistente y, en consecuencia, metilada, y la otra hebra recién

sintetizada, que aún carece de grupo metilo. Esta acción de las metilasas asegura que

todo el DNA de las dos células hijas quede metilado lo antes posible.

La metilación del DNA afecta principalmente a citosinas y adeninas de la secuencia

reconocida. En la reacción, las metilasas utilizan como donador del grupo metilo el

compuesto S-adenosilmetionina.

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Debe adelantarse que la metilación del DNA interviene en eucariotas como un

mecanismo de regulación de la expresión génica, aunque este proceso no tiene nada

que ver con el mecanismo de protección que desempeñan los sistemas metilasa-

restrictasa en procariotas. Esencialmente, en eucariotas los genes tienden a estar

desmetilados en los tejidos donde se expresan y metilados donde no se expresan,

especialmente en las regiones de DNA llamadas “islotes CpG”, por tener esta secuencia

dinucleotídica en la que C sufre la metilación.

Acción de las enzimas de restricción de tipo II.

Son estas las restrictasas estructuralmente más simples y las mejor estudiadas por su

utilidad en Ingeniería Genética, a modo de “tijeras” para el corte del DNA. El sitio de

restricción es a la vez lugar de reconocimiento y de hidrólisis. Se hidrolizan de forma muy

específica enlaces fosfoéster del DNA, uno en cada hebra, generándose dos fragmentos

de restricción. El enlace hidrolizado es siempre el 3´-P (es decir, son endonucleasas del

tipo “a”,), por lo que el fosfato queda unido a 5´,dejando en ambos fragmentos extremos 3

´-OH y 5´-P.la reacción no necesita ATP, lo que la diferencia de la catalizada por las

enzimas de tipo I y III.

Ilustración de los distintos tipos de extremos resultantes de la acción de enzimas de

restricción:

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Algunas enzimas de restricción de tipo II empleadas en Ingeniería Genética:

* Extremos compatibles: en algunos casos, distintas enzimas de restricción generan extremos

cuyo saliente tiene la misma secuencia. Ejemplo: Bam HI, Bgl II Y MboI ( ).

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* Isoesquizómeros: nombre que se aplica a dos o más enzimas que reconocen la misma

secuencia; pueden cortar en el mismo punto o bien se diferencian en que el corte o la metilación

asociada tienen lugar en puntos distintos dentro de esa secuencia común de reconocimiento.

Ejemplos: MboI y Sau 3AI ( ); Acc 651 y KpnI ( ).

Obsérvese que en todos los casos los extremos de los dos fragmentos generados son

idénticos, tienen la misma secuencia (se puede ver girando 180° uno de ellos). Esto es

consecuencia de la simetría del palíndromo y de la posición simétrica de los puntos de

corte en cada hebra. Todo ello se debe a que la enzima actúa en forma de dímero, por

tanto reconociendo una misma secuencia y cortando un mismo tipo de enlace en las dos

hebras: por ejemplo, Eco RI corta el enlace (5´) G—AATTC (3´) en ambas hebras. La

formación de extremos cohesivos es de gran interés aplicado en ingeniería genética, pues

fragmentos generados con una misma restrictasa a partir de dos DNAs distintos pueden

interaccionar mediante el apareamiento de las bases de sus extremos cohesivos (tal

interacción no es posible entre extremos romos). Igualmente se pueden asociar los

fragmentos producidos por enzimas distintas que producen extremos compatibles.

Debe resaltarse que el producto de la reasociación de los dos fragmentos en ninguno de

los casos es idéntico al DNA de partida, pues está formado por dos moléculas. La falta de

enlace covalente entre los extremos de los fragmentos reasociados se indica con el

nombre de “mella” o “muesca”. Estas se pueden cerrar o “sellar” por la acción de las

enzimas ligasas (o DNA ligasas), dando una molécula única de doble hebra. Como se ha

visto, las ligasas catalizan la formación en cada hebra del enlace fosfoéster que faltaba,

con consumo de energía. Pueden, incluso, unir o “ligar” dos fragmentos de DNA con

extremos romos, aunque con mucha menor eficacia, pues no hay apareamiento entre

ellos.

La acción de las ligasas es, pues, contraria a la de las nucleasas (formación de enlace

fosfoéster frente a su hidrólisis), pero el mecanismo de la reacción no es exactamente

opuesto, por el requerimiento energético de la primera. Debe resaltarse que la ligasa

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siempre requiere un grupo 5´-p para su actuación, propiedad que posee utilidad

experimental.

PREPARACIÓN DEL VECTOR DE CLONACIÓN

En general, un vector es una molécula de ADN de tamaño pequeño, fácil de aislar y

caracterizar, con secuencia y mapa de restricción, de fácil introducción en la célula

anfitriona y una vez allí con capacidad de replicación autónoma, es decir, independiente

de la replicación del genoma de la célula anfitriona.

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Es conveniente que el vector posea el mayor número posible de sitios de restricción, para

insertar el fragmento de ADN quiere clonar, que incluya al menos un gen marcador (por

ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos) que permita identificar y/o seleccionar las

células que llevan el ADN recombinante. Lo común es que el vector natural no posean

todas estas características, por lo que habitualmente se emplean vectores modificados (a

su vez, obtenidos por técnicas de ADN recombinante, pero ya disponibles comercialmente

con todas las prestaciones deseadas).

La misión del vector es unirse al ADN que se quiere clonar (llamado inserto) para facilitar

su entrada en la célula anfitriona y su replicación. Para poder unir con facilidad ambos, se

debe cortar el vector con las mismas enzimas de restricción que se utilizaron para escindir

el ADN de la muestra o con enzimas que proporcionan extremos compatibles; de ese

modo, sus secuencias complementarias pueden asociarse y ser unidos por la ligasa,

dando lugar a una sola molécula de ADN de doble hebra, llamada ADN recombinante

(ADNr).

En función de los objetivos de clonación (amplificación y expresión), se suele hablar de

dos grandes grupos de vectores. Por un lado, los vectores de clonación, que se emplea

únicamente para amplificar el ADN de interés, también se les llama vectores de inserción

o vectores de propagación. Teóricamente, solo incorporarían el inserto de interés. Por

otro lado, los vectores de expresión, que poseen además características que facilita la

expresión por la célula anfitriona del ADN de interés. En este caso deberá incorporarse,

además de este, el ya mencionado inserto auxiliar con una región de control de la

expresión. En la práctica, los vectores de expresión comerciales suelen incluir ya una

región de control, comúnmente un promotor potente que se induzca fácilmente bajo

condiciones experimentales controlables, válido para expresar cualquier inserto de interés

que se situé tras él en el ADNr.

Aunque existe diversos tipos de vectores, por ahora la descripción se hará con un

plásmido, una molécula pequeña de ADN circular.

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FORMACIÓN DE MOLÉCULA RECOMBINANTE

Consiste en la unión covalente, in vitro, del inserto de ADN al vector fragmentado, mediante

una ligasa. La especificidad de la unión depende del tipo de extremos que hayan resultado al

preparar el inserto y el vector: si son cohesivos, su secuencia es la especifica de la enzima

de restricción empleada y solo se asocian los extremos compatibles; una vez asociado por

apareamiento de bases, la ligasa establece la unión covalente sellando las dos mellas. Si se

trata de extremos romos, no pueden asociarse, pero la ligasa se puede unir, aunque con

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menor eficacia, y no supone ninguna diferencia la enzima de restricción con la que se

prepararon (se puede decir que todos los extremos romos son compatibles).

En la práctica, puede ocurrir diversos tipos de asociación entre fragmento de restricción con

extremos compatibles, todas ellas catalizadas por la ligasa. En primer lugar, siempre puede

darse la asociación intramolecular, es decir, entre los dos extremos de la misma molécula

(vector o inserto); si se trata de un vector circular, da lugar a su recirculación. Esta

interacción esta favorecida cuando la concentración de ADN es baja (pues la probabilidad de

que dos moléculas se encuentren es menor). En segundo lugar, puede tener lugar una

asociación intermolecular, tanto la que conduce al ADNr (vector +inserto) como otras que

conducen a productos no deseados: vector +vector, inserto + inserto, unión de más de dos

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moléculas, etc.; todas ellas circulares o lineales. Estas interacciones son más probables para

concentraciones elevadas de ADN.

Para evitar la formación de estos productos secundarios, que disminuya el rendimiento de la

clonación, se acuda a estrategias experimentales, previa a la mezcla del vector e inserto,

tales como la escisión con dos enzimas de restricción diferentes, que evita la recirculación

del vector o, como se describe a continuación, la desfosforilación del vector con fosfatasa

alcalina.

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TIPOS DE VECTORES

Los vectores empleados para la clonación de insertos de ADN son muy variados. Pueden

clasificarse según varios criterios, tales como procedencia como:

Su procedencia procariótica o euóariotica.

El tipo de molécula a partir de la que se preparan:

Plásmidos: bacterianos, de levaduras o de plantas.

Virus: que infectan bacterias (bacteriófagos o simplemente fagos), plantas,

invertebrados o vertebrados.

Cromosomas artificiales: derivados de elementos cromosómicos del fagos

(PACs), de bacterias (BACs) o de levaduras (YACs).

Quimeras, es decir, moléculas formadas combinadas parte de otras cuyo origen

es diferente.

Normalmente, quimeras de plásmidos y fagos: cósmidos, fagémidos, fásmidos.

El tipo de célula anfitriona en la que el ADN recombinante resultante se puede luego

incorporar.

El gen de resistencia que contiene el vector para su posterior detección o selección.

El tamaño del ADN que admiten como inserto.

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A. Plásmidos

Son moléculas de ADN de doble hebra, de pequeño tamaño (2-5Kb) y forma circular,

presentes en forma libre en el citosol de muchas bacterias (de 1 a 3.000 plásmidos/célula) y

de algunas eucariotas unicelulares (por ejemplo, el plásmido µ de levaduras o “circular de

2µm”). Son fáciles de purificar a partir del cultivo bacteriano. Permiten la incorporación de

insertos de ADN de un tamaño máximo de unas 10 Kb. Los plásmidos naturales contienen

pocos genes propios, ninguno esencial para la viabilidad de la célula, por lo que pueden ser

modificados sin afectarla. Para su replicación autónoma (independiente de la del cromosoma

bacteriano, aunque utilizando las mismas enzimas), se requiere una secuencia origen de

replicación. En cada división celular, el cromosoma origina una sola copia por célula hija,

mientras que el plásmido (en su caso, el ADNr formado a partir de el9 sufre replicaciones

múltiples y origina varias copias por célula (de 20 a 50). Los plásmidos son así replicones

(unidades de replicación) que se transmiten y mantienen de manera estable como círculos

extracromosómicos.

El empleo de un plásmido como vector de clonación se favorece cuando incluye genes

marcadores, cuya presencia puede ser detectada o cuya expresión confiera a la célula

anfitriona portadora del ADNr una serie de propiedades especiales. Por ello, se utilizan

comúnmente plásmidos artificiales o sintéticos, obtenidos a su vez por técnicas de ADN

recombinantes y disponibles comercialmente. Baste como ejemplo el plásmido pUC19.

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B. Bacteriófagos

Los virus en general se replican mediante la introducción de su genoma en células

procariotas o eucariotas (infección). Esta propiedad resulta útil para conseguir una alta

eficiencia de clonación, empleando como vectores virus modificados. Cada tipos de virus

infecta a células especificas y, dependiendo del tamaño del genoma vírico, admite insertos

más o menos grandes, pero en general mayores que los que se pueden insertar en

plásmidos. Así para clonar en bacterias se usan bacteriófagos, baculovirus para células de

insectos, y virus SV40 o retrovirus para células de mamíferos, por su elevada eficacia de

introducción del ADNr, pero dada su complejidad y por razones de extensión no se tratara el

tema.

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Los virus más comúnmente empleados como vectores son los parásitos bacterianos fagos

M13 y λ (lambda). El tamaño del vector recombinante se ve limitado por la necesidad de su

empaquetamiento dentro de la cápsida. El inserto se puede introducir de la misma forma que

para los vectores plasmídicos, es decir, cortando insertos y ADN del fago con las mismas

enzimas de restricción y ligando para obtener un ADNr; esto se denomina técnica de

inserción, y existe vectores específicos para ello. Cuando el tamaño del ADN de interés se

quiera clonar es mayor, se puede incorporar eliminando previamente la parte del genoma

vírico que no se requiere para la infección y replicación; se hable de técnica de sustitución o

reemplazamiento.

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C. Cósmidos

Son vectores sintéticos, quimeras que combinan características de plásmidos y fagos para

combinar las ventajas de ambos tipos de vectores. El fragmento plasmídico proporciona las

características de tamaño pequeño (5-7Kb), circularidad, un origen de replicación, un numero

de sitios de restricción donde se va a insertar el ADN, uno o más marcadores seleccionables

y la propagación en bacterias como si fuesen plásmidos. Del fago λ se toma las secuencias

“cos” (del inglés cohesive sites), que proporcionan al cósmido la capacidad, propia del ADN

del fago, de ser empaquetado en cápsidas víricas in vitro.

Los cósmidos son útiles para clonar insectos de gran tamaño(hasta 45 Kb), especialmente

en la preparación de librerías genómicas del organismo superior, ya que disminuye en gran

medida el numero de clones necesarios para que todo el genoma este representado en la

genoteca. Los métodos de introducción del ADNr cosmídicos depende del tamaño del

inserto. Si este es pequeño, se puede introducir por transformación (las células se hacen

competentes para incorporarlo en forma de plásmido recombinante). Si el tamaño es

relativamente grande, la transformación se complica y debe acudirse al empaquetamiento

previa en forma de fagos, aprovechando las secuencias cos.

D. Cromosomas artificiales

Este tipo de vectores se ha diseñado en especial para adaptarse al gran tamaño de insectos

requeridos en el caso del genoma humano y de otros mamíferos, y para la clonación en

células eucarióticas.

1. Cromosomas artificiales bacterianos

Se les llama comúnmente BACs (bacterial artificial chromosomes). Se trata de

vectores sintéticos derivados del plásmidos F o el fago P1. Se caracterizan, en primer

lugar, por aceptar grandes insertos de ADN, entre 100 y 300 Kb. En comparación

con otros tipos de vectores, los BACs contienen grandes genes que reducen su

capacidad de copia, es decir, de replicación en una célula anfitriona del ADNr

formado. Como resultado, se consigue mayor estabilidad de los insertos de ADN de

origen eucariótico, que en cósmidos sufren con frecuencia reordenamientos internos.

Gracias a estas dos características, los BACs son vectores adecuados para la

elaboración de genotecas eucarióticos.

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2. Cromosomas artificiales de levadura

Los YACs (yeast artificial chromosomes). Son vectores sintéticos que contienen las

tres regiones relacionadas con la funcionalidad de un cromosoma: secuencias

sustituyentes de un centrómero, de dos telómeros y de un origen de replicación.

Además, incorporar genes marcadores seleccionables y un sitio de clonado múltiple

en la que admite un inserto de gran tamaño, que puede alcanzar 1Mb, lo que

constituye una característica fundamental. En ocasiones, este tipo de vectores se

denominan ARS/CEN/TEL, por los tres tipos de secuencias que contienen. La

secuencia centromérica permite la segregación correcta de las copias hijas del

cromosomas durante la división de la célula. Mientras que los telomeros estabilizan,

como ya se ha estudiado, los cromosomas a lo largo de sucesivas divisiones. El

origen de replicación o secuencias de replicación autónoma (ARS, autonomously

replicating sequence) permite la formación de copias del cromosoma artificial de

forma independiente a la del genoma propio de la célula anfitriona. Los YACs se

utilizan en particular para preparar genotecas de genomas muy grandes, o para

mantener un gen completo en un único clon.

BIBLIOGRAFIA

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LUQUE C., José. “BIOLOGÍA MOLECULAR E INGENIERÍA GENÉTICA”. 1° ed.

Editorial Harcourt. Madrid.

PERERA, Julián. “INGENIERÍA GENÉTICA VOLUMEN 1: Preparación, Análisis,

Manipulación Y Clonaje De DNA. Editorial Síntesis. Madrid.