ENZIMAS

Prof. Martha Pernalete Lic. en Bioanálisis

MSc. Bioquímica y Biología Molecular

Tema 8

Objetivos

n Analizar el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente y compararla con una no catalizada.

n Interpretar el significado de KM, y Vmax n Aplicar el concepto de KM y Vmax en la

resolución de problemas. n Interpretar la representación gráfica de

Lineweaver y Burk.

Contenido

n Relación matemática entre la velocidad de una reacción química y la concentración de sustrato, en reacciones catalizadas y no catalizadas enzimáticamente.

n Ordenes de reacción. Representación gráfica de la Velocidad (inicial) vs concentración de sustrato

n Postulados de la teoría de Michaelis y Menten n Reacciones de pseudo primer orden n Representación gráfica de la ecuación de Michaelis y Menten. n Identificación de KM y Vmax en un gráfico de Vo vs [S] n Relación entre el valor de KM y la afinidad enzima­sustrato. n Ejemplos de aplicación de los conceptos de KM y Vmax. n Representación gráfica de Lineweaver y Burk: Utilidad de dicha gráfica.

¿Como funcionan las Enzimas?

SITIO ACTIVO

Quimotripsina unida a un sustrato

SUSTRATO

PRODUCTO

ENZIMA

lEstas proporcionan un ambiente específico dentro del cual una reacción determinada es energéticamente más favorable

Factores que afectan la velocidad de una reacción enzimática

v Temperatura v pH v Concentración de la Enzima v Concentración del Producto v Concentración del Sustrato v Concentración de Inhibidores o

Activadores Bioquímica, Aspectos Estructurales y vías metabólicas Mc Graw Hill, 1996

Introducción

S P

Se mide La Velocidad para caracterizar a las Enzimas

Velocidad Revela la vía que siguen los reactivos

Indica el mecanismo de reacción

La conversión:

Cinética Enzimática

El enfoque central para estudiar el mecanismo de una reacción catalizada por una enzima, consiste en medir la velocidad de la reacción y la forma en como ésta se modifica en respuesta a cambios en los parámetros experimentales.

n Velocidad de una reacción: se define como la cantidad de materia inicial, sustrato, transformado, o como la cantidad de compuesto final, producto, formado, por unidad de tiempo.

Cinética Enzimática

ENZIMAS BUFFER

Sustrato Inhibidores

Deducción funciones Fisiológicas de los mecanismos reguladores de ENZIMAS

Bajo Condiciones de laboratorio y en presencia de sustratos competidores o Inhibidores

¿Como se mide la velocidad?

Espectrofotómetro

Conceptos

Ordenes de reacción

n El Orden de una reacción elemental: corresponde al número de moléculas que deben colisionar en forma simultánea para generar un producto

A temperatura constante, la Velocidad de una reacción elemental, es proporcional a la frecuencia con la que las moléculas que reaccionan se reúnen.

Reacción de primer orden: es unimolecular A P

V = k [A] 1 La velocidad de la reacción en cualquier punto del tiempo es proporcional a la concentración de A

Reacción de segundo orden: es bimolecular

2A P

V = k [A] 2

A + B P

V = k [A] 1 . [B] 1

Ordenes de reacción

El orden de una reacción es un término que se utiliza para definir ésta, en función de los factores que determinan su velocidad.

Análisis matemático de una reacción catalizada por enzima

n Michaelis y Menten analizaron dicha rx n La ecuación deduce a partir de un modelo de acción enzimática en donde:

E + S ES E + P n K 1 ,k ­1 y k 2 : son las constantes de velocidad

K1

K­1 K2

Postulados: Leonor Michaelis y Maud Mentel, 1913

1. La enzima tiene un único sustrato. 2. 2. El complejo E El complejo E- -S se encuentra en estado S se encuentra en estado

estacionario. estacionario. 3. 3. Bajo condiciones de saturaci Bajo condiciones de saturació ón, todas n, todas

las mol las molé éculas de enzima intervienen en culas de enzima intervienen en la formaci la formació ón del complejo E n del complejo E- -S. S.

4. 4. Cuando toda la enzima se encuentra Cuando toda la enzima se encuentra en forma del complejo E en forma del complejo E- -S la velocidad S la velocidad de la reacci de la reacció ón es m n es má áxima. xima.

Estado Estacionario

Tomado de: Bioquímica Aspectos estructurales y vías metabólicas. Interamericana, McGraw Hill

Para un modelo simple:

E + S ES P

Donde Et = E + ES

E: enzima S: sustrato P: producto ES: complejo Enzima + Sustrato

Leonor Michaelis y Maud Mentel, 1913

E + S ES K1

K­1

ES E + P K2

Efecto de la concentración de sustrato, sobre la velocidad Inicial de una reacción catalizada por una enzima

Donde

K M + [S] V max [S] Vi =

Ecuación de Michaelis-Menten

Expresión algebraica de la curva

Vi: Velocidad inicial Vmax: Velocidad máxima [S]: concentración de sustrato KM: constante de Michaelis

[ (K­1 + K2) / K1]

n Representación gráfica de la ecuación de Michaelis Menten

Km: Constante de Michaelis: Define la afinidad de la enzima por su sustrato

Nelson y Cox, 2001

Se observa el efecto de la concentración de sustrato, sobre la velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima

Retomando Ordenes de reacción

Cinética de primer orden

Cinética de orden cero

Mathews y van Holde, 1998

La v es independiente de la concentración de sustrato

Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad inicial De una reacción catalizada por una enzima

La dependencia de la velocidad de reacción y [s] y Km, puede ilustrarse al evaluar la ecuación de M­M bajo 3 condiciones: ptos. a, b y c en la grafica

Tomado de: Bioquímica ilustrada. Harper

Análisis de la relación entre la velocidad de reacción y [s] y Km

Vi = Vmax Punto c: la [s] >> km

Vi = Vmax / 2 Punto b: la [s] = km

Vi es proporcional a la [s]

Punto a: la [s] << km

Richard Harvey, Pamela Champe, 2006

Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de reacción

La E1: Km pequeña Alta afinidad

La E2: Km grande baja afinidad

TRANSFORMACIÓN DE LA ECUACIÓN DE M­M EN UNA ECUACIÓN LINEAL (y = mx + b)

Se invierte

Se factoriza

Se simplifica

Pendiente

Representación de Lineweaver ­ Burk

Nelson y Cox, 2001

y = 1/Vo

x = 1/ [ s ]

b = 1/ Vmáx

m = Km/ Vmáx (pendiente)

vo

1 = K M V max [S]

+ V max

1 1

(y = mx + b)

K M + [S] V max [S] v =

60 2,0 x 10­1

60 2,0 x 10­2

60 2,0 x 10­3

48 2,0 x 10­4

45 1,5 x 10­4

12 1,3 x 10­5

V (microm/min)

[S] (mol/L)

Los datos de velocidad y [S] que se muestran a continuación fueron obtenidos para La reacción S P catalizada por la enzima E

Se desea conocer el valor de km de la enzima E por el sustrato S

Despeje: km

Km: 5x 10­5 M/L

Problemas:

53,3 4,0 x 10­4

48,0 2,0 x 10­4

40,0 1,0 x 10­4

30,0 5,0 x 10­5

22,8 3,0 x10­5

14,0 1,5 x 10­5

12,0 1,3 x 10­5

5,4 5,0 x 10­6

1/V V

(microm/min) 1/S [S]

(mol/L)

vo

1 = K M V max [S]

+ V max

1 1

Los datos de velocidad y [S] que se muestran a continuación fueron obtenidos para La reacción S P catalizada por la enzima E

Se desea conocer el valor de km de la enzima E por el sustrato S

Invertir los valores Buscar una escala Graficar Ver puntos de corte y Calcular Km y Vmax

Tarea:

n Solución…

0,019 2500

0,021 5000

0,025 10000

0,033 20000

0,044 33333

0,071 66667

0,083 76923

0,185 200000

1v 1/s

Invertir valores:

DOBLE RECIPROCO

­0,200

­0,150

­0,100

­0,050

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

­200000 ­100000 100000 200000 300000

1/s

1/v

Graficar:

b: 0,0165

m: 8 x 10 ­7 (pendiente)

y = 1/Vo

m = Km/ Vmáx (pendiente)

x = 1/ [ s ]

b = 1/ Vmáx

vo

1 = K M V max [S]

+ V max

1 1

y = mx + b

b = 1/ Vmáx Vmáx = 1/ b

m = Km/ Vmáx Km = Vmáx x m

Km: 5 x 10­5 Vmax: 62.5

De la grafica se sacan algunos valores, para meterlos en las formulas

Resultado:

Resumen

n La ecuación de Michaelis Menten, ilustra en términos matemáticos la relación entre la velocidad de reacción inicial y la concentración de sustrato.

n La transformación de dicha formula, en una ecuación de la recta, facilita la determinación de los valores de Vmax y km para una enzima determinada.

Bibliografía n Fundamentos de Bioquímica. Voet­Voet­Pratt.

2ª edición 2007; Capitulo 12: Catálisis enzimática. Editorial medica Panamerica

n Bioquímica. Richard Harvey, Pamela Champe. 2006 n Bioquímica. Juan C. Díaz Zagoya y Marco Antonio Júarez Oropeza.

1 era edición. 2007. Editorial Mc Graw Hill. n Bioquímica. Mathews. 3 era edición. 2005. Capitulo 11: Enzimas:

catalizadores Biológicos. Editorial Pearson. n Lehninger Principios de Bioquímica. Nelson y Cox. 4ta edición.

Ediciones OMEGA n Bioquímica, Aspectos Estructurales y vías metabólicas. Editorial Mc

Graw Hill. 1996. n Seminario Enzimas (2008, 2009) n Bioquimica Ilustrada. Harper. 28ª Edición. Capitulo: Enzimas:

Cinética. 2010