Encapsulación de oleuropeína proveniente de hojas de olivo, su estabilidad y liberación

gastrointestinal in vitro.

Estefanía González Cáceres

Nutricionista

MSc Docencia Universitaria

PhD © Nutrición y Alimentos

e.gonzalez.caceres@gmail.com

Dpto. Ciencia de los Alimentos y Tecnología QuímicaFacultad de Ciencias Químicas y FarmacéuticasUniversidad de Chile

La preocupación sobre la composición química de los alimentos por parte de los

consumidores ha incrementado y la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha

identificado los alimentos ricos en grasas, azúcares y sal como un riesgo para el

desarrollo de enfermedades crónicas no transmisibles en la población (Hawkes,

2005; Gil, 2010).

Numerosos estudios han asociado

el consumo de diversos tipos de

dieta con la prevención del

desarrollo de enfermedades.

Reduce riesgo de

Enfermedades

cardiovascularesAntiinflamatorio

Antibacterial

Antiviral

Antioxidante

Disminuye

progresión de

ciertos tipos de cáncerReduce riesgo de

diabetes

Reduce riesgo de Enfermedades

neurodegenerativas

Arts and Hollman, 2005; Scalbert, Johnson ans Daltmarsh, 2005; Manach et al, 2005; Surh, 2003)

Alimentos

Nutracéutico

s

Alimentos

funcionale

s

Liberación Dirigida

Entrega en el sitio

gastrointestinal donde se

desea su acción y/o

absorción.

Ocultar su sabor

Protección

Sabor

amargo

Condiciones

ambientales (luz,

oxígeno, humedad y

t°)

Condiciones

gastrointestinales

(pH y enzimas)

Interacción con

nutrientes del

alimento ENCAPSULACIÓN

Tecnología de recubrimiento de materiales sólidos, líquidos

o gases mediante la cual es posible obtener partículas que

pueden liberar su contenido en un lugar y/o tiempo deseado

a una velocidad específica.

Para encapsular compuestos, algunas de las técnicas usadasson (Gibbs et al., 1999; Santinho et al., 2002; Wang et al., 2004):

Secado por atomización

Recubrimiento por lecho fluidizado

Atrapamiento por liposomas

Liofilización

Extrusión

Coacervación

Inclusión

Extrusión centrifuga

Suspensión rotacional

Separación

Polimerización interfacial

entre otros.

Los posibles mecanismos de liberación de compuestos

activos descritos desde micropartículas pueden ser (De Vos et al.,

2010):

1) Cambio de presión

durante el tracto

gastrointestinal.

2) Cambio de pH en el

tracto gastrointestinal.

3) Biodegradación del

polímero.

Metabolismo de los compuestos fenólicos tras su ingestión?

¿Resistirán las condiciones ácidas del estómago y

la acción de las enzimas del intestino delgado?

¿ Llegarán intactos al colon?

¿Cuál será el perfil de polifenoles en el lumen

intestinal colónico luego de ser metabolizados

por la microbiota intestinal?

Encapsulados

No sólo extraer y cuantificar compuestos

fenólicos

BIOACCESIBILIDAD

BIODISPONIBILIDAD

Bioaccesibilidad, cantidad de un nutriente ingerido que se

encuentra disponible para su absorción en el intestino luego

de haber pasado por el proceso de digestión (Parada y Aguilera, 2007).

Biodisponibilidad, la fracción de nutriente o compuesto

ingerido que alcanza la circulación sistémica y se utiliza (Wood

2005).

Simulación in vitro de las etapas de

digestión en el TGI (enzimas,

temperatura y pH) (Sabboh-Jourdan et al., 2011).

Estudiar la estabilidad de

compuestos fenólicos en

condiciones GI y su liberación

desde la matriz alimentaria (Gregory et al.,

2005; Tagliazucchi et al., 2010).

Encapsulación de extracto de hoja de

olivo (Olea europaea L.): efecto del agente

encapsulante sobre la eficiencia de

encapsulación y perfil de liberación de

Oleuropeína en condiciones

gastrointestinales in vitro.

En Chile, el cultivo del olivo posee una superficie plantada estimada al año 2015de 27.000 hectáreas.

Arbequina (70%), Frantoio (15%) y Picual (10%) (Chile Oliva, 2014).

Combustible después del secado o quemadas en terreno (Sánchez et al., 2002; Ranalli et al., 2006).

Poseen un interesante perfil de polifenoles.

Oleuropeína

Verbascósido

OleurósidoLigustrósido

Flavonoides glicosilados

Flavonoides aglicona

Ácidos ferúlico, cafeico, p-cumárico, clorogénico y vainíllinico, entre otros.

(Jiménez et al., 2011)

• Estudios realizados in vitro y clínicos a partir de extractos de hojas de olivo que han demostradoque la OE presenta efectos beneficiosos, tales como :

anti-oxidante (Visioli et al., 2002; Al-Azzawie and Alhamdani, 2006; Syed, 2010),

hipoglicemiante (Romani et al., 1999; Al-Azzawie and Alhamdani, 2006; Wainstein et al., 2012),

anti-aterogénico (Syed, 2010),

hipocolesterolemico (Luque de Castro y Japón-Luján, 2006; Syed, 2010),

anti-inflamatorio (Visioli et al., 1998; Benavente-García et al., 2000; Syed, 2010),

anti-viral (Fredrickson, 2000; Micol et al., 2005; Lee-Huang et al., 2007),

anti-cancerígeno (Syed, 2010; Scoditti et al., 2012; Samet et al., 2014),

• Gran parte de los mecanismos intestinales que involucran a algunos compuestos fenólicossiguen siendo desconocidos (Manach et al., 2004) (Estructura y metabolismo).

OLEUROPEINA (OE)

Principal secoiridoidepresente en las hojas del

olivo.

Metabolismo de la Oleuropeína tras su ingestión.

Corona et al., 2006; Corona et al., 2009; Furneri et al., 2010; Santos et al., 2012; Carrera-González et al., 2013; Lin et al., 2013; Mosele et al., 2014.

Oleuropeína

Entorno ácido

Oleuropeína aglicona Glucosa

enlace β-glucosídico

+

Dialdehidos

Secoiridoides Transpuestos

Corona et al., 2006; Corona et al., 2009; Furneri et al., 2010; Santos et al., 2012; Carrera-González et al., 2013; Lin et al., 2013; Mosele et al., 2014.

Oleuropeína

Hidroxitirosol Metiloleósido

+

Oleósido

Metanol

Lipasas

+

Metabolismo de la Oleuropeína tras su ingestión.

Corona et al., 2006; Corona et al., 2009; Furneri et al., 2010; Santos et al., 2012; Carrera-González et al., 2013; Lin et al., 2013; Mosele et al., 2014.

Oleuropeína

Hidroxitirosol

Acetato de Hidroxitirosol

Ácido elenólico

Esterasa

Oleuropeína aglicona

SecoiridoidesTranspuestos

β-glucosidasa

LactobacillusBifidobacteriumEnterococcus

Oleuropeína

Metabolismo de la Oleuropeína tras su ingestión.

CROMATOGRAMA DEL EXTRACTO ACUOSO OLE, OBTENIDO POR HPLC-DAD-TOF-MS (Talhaoui et al., 2014)

1-Secologanosido isómero a, 2-HT glucósido, 3-Secologanosido isómero b, 4-TY glucósido, 5-Ác. elenólico glucósido isómero a, 6-Secologanosidoisómero c, 7-Ác. elenólico glucósido isómero b, 8-Ác. elenólico glucósido isómero c, 9-Derivado OE aglicona, 10-LT diglucósido, 11-Ác. elenólicoglucósido isómero d, 12-Dimetiloleuropeína, 13-Rutina, 14-LT rutinósido, 15-LT glucósido isómero a, 16-Verbascósido, 17-AG rutinósido, 18-OEdiglucósido isómero a, 19-OE diglucósido isómero b, 20-OE diglucósido isómero c, 21-OE diglucósido isómero d, 22-LT glucósido isómero b, 23-Crisoeriol-7-O-glucósido, 24-OE isómero a, 25-OE isómero b, 26-OE isómero c, 27-LT glucósido isómero c, 28-OE isómero d, 29-OE isómero e, 30-OE isómero f, 31-Ligstrósido, 32-LT.

1

2

3

4

5

6

7

89

10

11 12

13 14

15

16

19 18

17

21

22

20

23

24 25

27

26

28

29

30

31

32

Hidroxitirosol glucósido

8%Secologanosido

1%

Luteolina glucósido 2%

Vervascósido2%

OE 85%

32 Compuestosfenólicos

mg OE/mL 38.7 ± 0.9mg OE/g hoja seca 95.9 ± 2.3

OE

Secado por atomización (mini Spray-Dryer Büchi B-290)Diseño experimental Composito central más punto axial (12 experimentos).

MP óptima de ASMP-OLE-AS

OLE + AS

1 : 1,6

Variables independientes

- Relación OLE/AS (1:0,5 a 1:2)

- Tº del aire de entrada al secador (140 a 180°C).

Variables dependientes

- Eficiencia de encapsulación (EE).

- Rendimiento del proceso (R)

MSR Deseabilidad

SISTEMA OEG-AS (X ± DE)

OEG-IN (X ± DE)

OEG-MD (X ± DE)

Relación OEG-AE 1:1,6 1:2 1:1,3

Temperatura aire de entrada (°C) 135 166 151 EE de OE (%) 58,2 ± 1,6

a 81,6 ± 0,7

b 92,2 ± 0,1

c

Rendimiento (%) 51,5 ± 3,4 a 68,1 ± 1,1

b 68,1 ± 2,3

b

OE superficial experimental (mg OE/g polvo) 10,2 ± 0,1 c 4,5 ± 0,2

b 2,6 ± 0,1

a

OE total experimental (mg OE/g polvo) 24,3 ± 0,6 a 24,5 ± 0,2

a 33,6 ± 0,1

b

135˚C

Distribución de los Compuestos Fenólicos identificados (%) por

HPLC-DAD-TOF-MS del extracto OLE y de las MP-OLE-AS.

OLE OLE-SA microparticles

Phenolic Compounds Non-encapsulated Total content

(surface + encapsulated)

mg/g OLE % mg/g

microparticles %

Secoiridoids

Oleuropein (isomer a, b and c)

39.79 ± 0.80 84.54 ± 1.85 24.32 ± 0.41 79.93 ± 1.34

*

Oleuropein diglucoside (isomer a, b and c) 0.25 ± 0.01 0.54 ± 0.01

0.14 ± 0.01 0.47 ± 0.01 *

Ligstroside 0.17 ± 0.01 0.36 ± 0.02 0.14 ± 0.01 0.47 ± 0.01 *

Simple phenols

Hydroxytyrosol glucoside 3.71 ± 0.01 7.87 ± 0.03

3.67 ± 0.01 12.06 ± 0.02 *

Verbascoside 0.95 ± 0.02 2.02 ± 0.04 0.59 ± 0.01 1.93 ± 0.02 *

Elenolic acids

Oleoside 11-methyl ester (isomer a, b, c and d) 0.23 ± 0.01 0.50 ± 0.02

0.16 ± 0.01 0.54 ± 0.02

Oleosides

Oleoside (isomer a and b) 0.46 ± 0.02 0.98 ± 0.03 0.28 ± 0.01 0.93 ± 0.04

Flavonoids

Rutin 0.13 ± 0.01 0.28 ± 0.01 0.05 ± 0.01 0.17 ± 0.01

*

Luteolin rutinoside 0.14 ± 0.01 0.31 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.23 ± 0.01 *

Luteolin glucoside (isomer a, b and c) 0.80 ± 0.02 1.70 ± 0.04

0.83 ± 0.01 2.74 ± 0.02 *

Chrysoeryol-7-O-glucoside 0.14 ± 0.01 0.30 ± 0.03

0.09 ± 0.01 0.31 ± 0.01

Other phenolic compounds 0.33 ± 0.01 0.60 ± 0.03 0.07 ± 0.01 0.23 ± 0.04

*

Total 47.1 ± 0.9 100 ± 1.9 30.4 ± 0.4 100 ± 1.3

Control pH

Control T

CSTR

Muestra de producto

filtrado automatizado

Impulsión

circuito hidráulico

Dosificación

de reactivos

PFR Membrana MF

Control P

Retorno

circuito hidráulico

Simulador del tracto gastrointestinal SimuGIT: bioreactor de tanque agitado continuo conectado enserie a un reactor continuo de flujo de pistón (PFR), equipado con una membrana de MF de cerámica.

100 mg de OE

7,1 g MP-OLE-AS

2,5 g OLE

Digestión gástrica:- 10, 20 y 30 min.

pH 2, 70 rpm y 36,6±1 ºC, pepsina

Digestión intestinal: - 40, 80, 100 y 120 min.

pH 6, 70 rpm, 36,6±1 ºC, sales biliares y lipasas pancreáticas.

Absorción intestinal (difusión simple):

20 g de filtrado (80, 100 y 120 min).

(Rivas-Montoya et al., 2016)

Digestión colónica:- L. platarum, B. ovatus, E. coli y E. faecalis JH2-2

(108 UFC/ml).

- Anaerobiosis, 36,6±1 ºC, 24 h.

OE Oleoside 11-Methyl ester Oleoside

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

800900

Intestinal Digestion Time (min)

12040 100

OLE

OLE-SA microparticle

60 80 12040 10060 80 12040 10060 80

***

* *

*

*** *

*

*

*

Bio

acc

essi

bilit

y (

%)

OE

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intestinal Digestion Time (min)

OLE

OLE-SA microparticle

12040 10060 80

*

*

* *

Bio

acc

essi

bilit

y (

%)

Secoiridoids Simple Phenols Flavonoids

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

325

350

Intestinal Digestion Time (min)

OLE

OLE-SA microparticle

12040 10060 80 12040 10060 80 12040 10060 80

* *

*

*

*

* * * ** * * * * *

Bio

acc

essi

bilit

y (

%)

OE0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intestinal Digestion Time (120 min)

OLE OLE-SA microparticle

*

Pote

nti

al B

ioavailabilit

y (

%)

CONCLUSIONES• El extracto de hoja de olivo (OLE) y el extracto encapsulado con AS (MP-OLE-AS)

no mostraron diferencias en el perfil de compuestos fenólicos.

• A los 120 minutos de simulación de digestión intestinal la bioaccesibilidad de la

OE desde las MP-OLE-AS (55%) fue mayor con respecto al OLE (1,5 %).

• La característica adhesiva de formar un “film” del AS podría contribuir a facilitar

la absorción de la OE por difusión simple a través de la membrana intestinal

(19%), en comparación al extracto no encapsulado (0%).

• Así las MP-OLE-AS podrían ser adecuadas como aditivo para el diseño de

alimentos saludables y/o funcionales que deseen la protección de la OE en el

estómago y durante su liberación en el intestino delgado, para su posterior

absorción.

Estefanía González Cáceres

e.gonzalez.caceres@gmail.com

Muchas gracias por su atención…