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Electroforesis en gel de poliacrilamida con Dodecil sulfato de sodio (SDS):

Mtodo efectivo para la aproximacin del peso molecular de protenas

alimentarias

Claudio Toms Barraza Mandujanoa, Mara Jess Osorio Alfaroa

a Estudiante de Ingeniera en Alimentos, Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas, Universidad de

Chile, Calle Sergio Livingstone Pohlhammer 1007 (ex Olivos), Independencia - Av. Vicua Mackenna 20,

Santiago, Chile.

Resumen

La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, en presencia de un agente reductor como 2-mercapto etanol, es un

mtodo utilizado para la purificacin y caracterizacin de protenas. Este mtodo se basa en la diferencia de migracin

de las protenas en un gel, debido a la carga negativa que stas adquieren con el SDS y a la presencia de un campo

elctrico en la cmara electrofortica: Las protenas de mayor peso molecular aparente, es decir, mayor tamao,

migrarn ms lento, puesto que, les ser ms difcil atravesar el gel. Para este estudio, el uso de la electroforesis

permiti de forma exitosa la obtencin de los pesos moleculares aproximados para las distintas muestras de protenas

alimentarias: protenas de leche, protenas de soya, protenas de zapallo, casenas, mioglobina y ovoalbmina.

Considerando la posibilidad de que las muestras sufran aglomeraciones (formacin de dmeros, trmeros, etc) y

degradacin, se obtuvieron valores de pesos moleculares acorde a la literatura, y otros, explicables bajo el principio de la

degradacin o aglomeracin de las protenas.

Palabras claves: electroforesis, poliacrilamida, SDS, 2-mercapto etanol, zapallo, leche, soya, casena, mioglobina,

ovoalbmina, peso molecular.

1. Introduccin

La electroforesis es un mtodo analtico til para

la separacin y caracterizacin de protenas. Este

mtodo, se basa en el desplazamiento de las

protenas en un campo elctrico, es por esta

razn, que las protenas deben adquirir carga

antes de someterse a este proceso, la cual es

otorgada por el detergente Dodecil sulfato de

sodio (SDS), el cual se une aproximadamente

cada dos residuos de aminocidos a la protena,

por lo mismo, se puede decir que la carga de la

protena, es proporcional a su masa. En general,

la electroforesis de protenas se realiza en geles

de poliacrilamida, los cuales retrasan el

desplazamiento de stas segn su masa, pero

tambin segn su forma. El SDS, se encarga de

otorgar carga neta negativa a las protenas y

altera su conformacin nativa, permitiendo que

todas las protenas presenten una forma similar

(Nelson y Cox, 2005).

La utilizacin de 2-mercapto etanol, provoca la

reduccin de los puentes disulfuro presentes en la

estructura terciaria de algunas protenas

(Maldonado, 2013).

Al aplicar una diferencia de potencial, las

protenas que presentan carga neta negativa,

migrarn por el gel, con direccin al nodo. Como

la relacin carga/masa ser aproximadamente

igual para todas las protenas y su forma no ser

un interferente, stas migrarn segn su tamao,

el cual se ver afectado principalmente por su

peso molecular. A mayor peso molecular

aparente, ms tiempo demorar la protena en

recorrer el gel y llegar al nodo, debido a la

2

dificultad que tendr al atravesar la malla del gel

de poliacrilamida (Maldonado, 2013).

Para la determinacin del peso molecular de

protenas presentes en muestras problema, se

debe utilizar una curva de calibracin, en la cual

se presente el logaritmo del peso molecular

(log(PM)) de protenas patrn vs su movilidad

electrofortica relativa1 (Rf); Posteriormente, al

realizar la electroforesis con SDS, se podr medir

la movilidad electrofortica relativa de las

protenas desconocidas e interpolar el valor del

logaritmo de su peso molecular (Nelson y Cox,

2005).

El objetivo de este estudio, fue demostrar que la

electroforesis en gel de poliacrilamida, con Dodecil

Sulfato de Sodio, es un mtodo efectivo para

determinar el peso molecular de distintas

protenas alimentarias (Maldonado, 2013).

2. Materiales y Mtodos

2.1 Materiales

2.1.1 Preparacin, corrida y carga del gel:

Agua destilada, Tris-HCl (pH 6.8), Tris-Base (pH

8.8), acrilamida, bisacrilamida, Am persulfato,

TEMED, SDS, amortiguador de corrida (Glicina

192 mM, Tris-Base 25 mM y 0,1% SDS), vidrios,

vaso de precipitado, agua saturada en butanol y

peineta.

2.1.2 Preparacin de las muestras proteicas:

Buffer de carga (Tris-HCl 100 mM, SDS 8%, azul

de bromo fenol, glicerol 40% y 2-Mercaptoetanol

20%), micropipeta y fuente de poder.

Las muestras proteicas analizadas fueron:

protena de zapallo, de soya, de leche, casenas,

ovoalbmina y mioglobina.

1 Distancia que recorre la protena desde el inicio del gel separador, hasta el centro de cada banda observada, dividido en la distancia que ha migrado el in lder.

2.1.3 Tincin de las protenas separadas en el gel:

Agua destilada, recipiente plstico, solucin

teidora (metanol, agua, actico 5:5:2 y 0,1% azul

coumassie R-250), solucin desteidora (25%

etanol, 10% cido actico glacial) y bao de agua

a 50 C.

2.2 Mtodos

2.2.1 Preparacin del gel:

Los geles fueron facilitados por el docente del

trabajo prctico, el cual mont los vidrios y sobre

estos, agreg la mezcla que se detalla en la tabla

1; Posteriormente, coloc una mezcla de agua

saturada en butanol sobre la mezcla del gel. Se

mantuvo a temperatura ambiente hasta observar

la gelificacin y luego se retir el agua saturada en

butanol, lavando con agua destilada.

Tabla 1: Preparacin del gel de poliacrilamida.

10% Separador (mL)

5% Concentrador (mL)

Agua destilada (mL) 3.85 2.100 0,5 M Tris-HCl (pH 6.8) - 0.4% SDS (mL)

----- 0.380

1.5 M Tris-Base (pH 8.8) - 0.4% SDS (mL)

2.60 ----

30% Acrylamide -0.8% Bis (mL)

3.34 0.500

10% Am Persulfate (L)

0.10 0.030

TEMED (L) 0.01 0.003 SDS 10% 0.10 0.030

2.2.2 Corrida y carga del gel:

El gel se mont en la cmara electrofortica, a

continuacin se aadi solucin de amortiguador

de corrida hasta llenar la cmara.

Las muestras proteicas fueron entregadas listas

de parte del docente, esto quiere decir, los

extractos proteicos se mezclaron en la proporcin,

1 parte de buffer de carga (Tris-HCl (pH 6.8) 100

mM, SDS 8%, azul de bromo fenol, glicerol 40% y

2-Mercaptoetanol 20%) con 3 partes de muestra;

Luego las muestras se hirvieron por 5 minutos.

3

El primer bolsillo del gel se carg con un estndar

de peso molecular y las muestras fueron cargadas

en los bolsillos del gel con micropipeta, en el

orden: protenas de leche, protenas de soya,

casenas, protenas de zapallo, mioglobina y

ovoalbmina. La cmara fue tapada y conectada a

la fuente de poder a 200 V, cuidando mantener

constante este voltaje. El tiempo de corrida, fue de

59 minutos y comprendi desde que se conect la

cmara a la fuente de poder, hasta que el frente

de corrida alcanz el final del gel.

2.2.3 Tincin de las protenas separadas en el gel:

Luego de terminar la corrida, los vidrios fueron

desmontados y se lav el gel con agua destilada.

Posterior a esto, en un recipiente plstico se situ

el gel junto a solucin teidora y se llev a bao

de agua 50 C por 30 minutos para acelerar el

proceso; Transcurridos los 30 minutos, se retir la

solucin teidora y se aadi solucin desteidora

al gel, en la cual se dej reposando por 6 das.

Finalmente, el gel se retir de la solucin, y fue

puesto en una mica, para poder medir

posteriormente la migracin de las protenas.

2.2.4 Determinacin de los Rf y de la masa

molecular aparente:

Utilizando una regla, se midi la distancia del

inicio del frente de corrida hasta el centro de cada

banda observada, esto tambin se le realiz al

estndar de peso molecular conocido con el cual

se realiz una curva de calibracin, y, mediante

esta, se pudo encontrar las masas moleculares

aparentes de cada banda.

3. Resultados

3. 1 Corrida del gel

Los resultados de la corrida del gel en la

electroforesis se muestran en la Figura 1. Con los

Rf calculados a partir del gel y los pesos

moleculares de las muestras patrn, se construyo

la tabla 2. Adems, se realiz una grafica con los

datos de los pesos moleculares en funcin del Rf

en la figura 2 y 3.

Figura 1: Electroforesis con SDS, donde P es la corrida de los

patrones y M son las distintas muestras problema, M1: Leche,

M2: Soya, M3: Casenas, M4: Zapallo, M5: Mioglobina y M6:

Ovoalbmina.

Tabla 2: Datos experimentales de los 10 patrones utilizados

(Peso molecular en KDa y migracin relativa Rf). FM:

Migracin del in lder.

Patrn Migracin cm Rf PM kDa Log(PM)

P1 0,2 0,053 170 2,230

P2 0,5 0,132 130 2,114

P3 0,8 0,211 100 2,000

P4 1 0,263 70 1,845

P5 1,3 0,342 55 1,740

P6 1,6 0,421 40 1,602

P7 2,2 0,579 35 1,544

P8 2,5 0,658 25 1,398

P9 3,3 0,868 15 1,176

P10 3,7 0,974 10 1,000

FM 3,8

Figura 2: Grfico de peso molecular de los patrones vs su

migracin relativa (Rf).

0

50

100

150

200

0 0,5 1 1,5

PM

kD

a

Rf

PM vs Rf

4

Figura 3: Representacin lineal de los datos expuestos en la

figura 2. Logaritmo del peso molecular de los patrones vs su

migracin relativa (Rf).

3.2 Determinacin de los Rf y de la masa

molecular aparente

Mediante la curva de calibracin hecha con la

corrida de los patrones y los Rf obtenidos para

cada muestra, se obtuvieron las distintas masas

moleculares aparentes, resumidas en la tabla 3.

Tabla 3. Pesos moleculares aparentes obtenidos por regresin lineal de los patrones y los Rf de cada muestra tras la electroforesis.

Muestra Migracin cm Rf PM kD LOG(PM)

Leche

L1 0,3 0,0769 138,026 2,139

L2 0,9 0,2307 87,919 1,944

L3 1,1 0,2820 75,647 1,878

L4 1,3 0,3333 65,087 1,813

L5 1,5 0,3846 56,002 1,748

L6 2,3 0,5897 30,692 1,487

L7 2,8 0,7179 21,0769 1,323

L8 3,4 0,8717 13,425 1,127

L9 3,7 0,9487 10,715 1,029

FM 3,9

Soya

S1 0,8 0,2105 93,294 1,969

S2 1 0,2631 79,955 1,902

S3 1,1 0,2894 74,018 1,869

S4 1,3 0,3421 63,435 1,802

S5 1,45 0,3815 56,503 1,752

S6 1,6 0,4210 50,328 1,701

S7 2,2 0,5789 31,679 1,500

S8 2,4 0,6315 27,150 1,433

S9 2,6 0,6842 23,268 1,366

y = -1,2732x + 2,2379 R = 0,9811

0

1

2

3

0 0,5 1 1,5

Log

(PM

)

Rf

Log PM vs Rf

5

S10 3,1 0,8157 15,821 1,199

FM 3,8

Caseina

C1 1,2 0,3076 70,169 1,846

C2 1,4 0,3589 60,374 1,780

C3 2,2 0,5641 33,089 1,519

C4 2,6 0,6666 24,496 1,389

C5 3,5 0,8974 12,453 1,095

FM 3,9

Zapallo

Z1 1,25 0,3205 67,580 1,829

Z2 1,35 0,3461 62,686 1,797

Z3 2,05 0,5256 37,038 1,568

Z4 3 0,7692 18,134 1,258

FM 3,9

Mioglobina

M1 1,2 0,3076 70,169 1,846

M2 1,3 0,3333 65,087 1,813

M3 2,05 0,5256 37,038 1,568

M4 2,5 0,6410 26,408 1,421

M5 3,6 0,9230 11,551 1,062

M6 3,9 1 9,219 0,964

FM 3,9

Ovoalbumina

O1 0,1 0,0270 159,767 2,203

O2 0,9 0,2432 84,762 1,928

O3 1,8 0,4864 41,543 1,618

O4 2,05 0,5540 34,078 1,532

O5 2,3 0,6216 27,954 1,446

O6 2,5 0,6756 23,857 1,377

O7 2,7 0,7297 20,361 1,308

O8 3,5 0,9459 10,802 1,033

O9 3,7 1 9,219 0,964

FM 3,7

Mioglobina repetida

M11 1,2 0,3428 63,295 1,801

M12 1,3 0,3714 58,209 1,764

M13 1,5 0,4285 49,231 1,692

M14 1,9 0,5428 35,215 1,546

M15 2,3 0,6571 25,189 1,401

M16 3,2 0,9142 11,853 1,073

M17 3,5 1 9,219 0,964

FM 3,5

6

4. Discusin y Conclusin

La leche esta principalmente constituida de

protenas como las casenas (s1, s2, y k), -

lactoalbminas y -lactoglobulinas, con pesos

moleculares de 23, 25, 23, 19, 14,2 y 18,4 kD

respectivamente (Swaisgood, 1992). En la

electroforesis, se obtuvieron alrededor de 5

bandas intensas, con 4 de ellas ntidas. La

correspondiente a los 21 KDa, fue la banda ms

difusa y cuyo peso molecular podra ser incluida

en la familia de la casenas, pero no podramos

afirmar a qu tipo de casena corresponde, ya que

las bandas de este tipo de protena van desde 19

a 25 KDa y nuestra medicin no es del todo

optima, as, al afirmar a que tipo de casena

corresponde nuestra protena nos conducira a un

error. Por otra parte, las 4 bandas restantes fueron

ms ntidas e intensas, pero no son atribuibles a

ningn tipo de protena de la leche ya que sus

pesos moleculares fueron de 10, 13, 30 y 56 KDa

respectivamente. Las bandas de 10 y 13 KDa

pueden deberse a una degradacin por parte de

los tratamientos previos a la electroforesis que

sufren las protenas, facilitando la formacin de

pptidos de menor peso molecular o podran ser

tambin, parte de -lactoalbminas, pero como

presentan una diferencia significativa se puede

asegurar. Los 30 y 56 KDa registrados pueden

deberse a la formacin de co-agregados proteicos

de de 57 y 64 KDa (Jovanovic et al., 2007) cuya

estabilizacin se produce por la formacin de

puentes disulfuro, pero esto implicara que hubo

una mala desnaturalizacin de la protena, ya sea

por la baja accin del 2-mercapto etanol o el SDS.

A partir de los valores obtenidos de los pesos

moleculares de la protena de soya, podemos

asignar en base a la literatura que, los valores de

23, 27 y 31 kD corresponden a sub unidades de

globulinas 7S o tambin llamadas Vicilinas

(Rodrguez-Oubia, 1997). Para los valores de 50

a 70 KDa podemos sealar que corresponden a

subunidades de globulinas 11s que se mantienen

unidas por interacciones no covalentes (Adachi,

Takenaka y Col., 2001). En ambos casos, no se

obtienen los valores referenciales de la protena

(400-200 KDa), ya que el medio reductor y la

utilizacin del SDS en la electroforesis,

desnaturalizan la protena y a su vez la divide por

subunidades obteniendo finalmente valores

muchos ms pequeos que el de la protena

completa.

Para la caracterizacin de las casenas, se

obtuvieron 5 bandas: A 70,2 KDa, 60,4 KDa, 33

KDa, 24,5 KDa y 12,5 KDa. Las casenas son un

grupo de protenas, que representan alrededor del

80% de las protenas de la leche. Son protenas

del tipo globulinas. Las 3 fracciones que se

presentan principalmente en estas protenas son

y k, las cuales se diferencian en su peso

molecular y en su cantidad de grupos fosfato. La

-casena pesa alrededor de 27,3 KDa, la -

casena pesa alrededor de 24,1 KDa y la k-

casena pesa alrededor de 19 KDa (Fernndez,

2005). Existen dos tipos de -casena, la s1,

que pesa alrededor de 23,6 KDa y la -s2, que

pesa alrededor de 25,3 KDa (Ribadeau-Dumas y

Grapping, 1989). Adems, existe una fraccin

minoritaria, de -casena, que pesa alrededor de

21 KDa (Alais, 1985). El valor de 12,5 KDa se

puede deber a la degradacin de cualquiera de los

tipos de casena, mientras que el valor de 24,5

KDa posiblemente corresponde a la fraccin de -

casena del extracto, o bien, a una de las dos

fracciones de la -casena; El valor de 33 KDa

observado, puede deberse a una dimerizacin o

trimerizacin de subunidades degradadas de

estas fracciones proteicas; El valor de 60,4 KDa,

puede deberse principalmente a la formacin de

algn trmero, que podra ser entre unidades de k-

casena o bien, una mezcla entre las distintas

fracciones casenicas presentes en la muestra;

Finalmente el valor de 70,2 KDa tambin puede

deberse a la formacin de algn trmero o

tetrmero de k-casena por ejemplo.

7

Para la caracterizacin de las protenas del

zapallo, se encontraron 4 seales luego de la

realizacin de la electroforesis. Las semillas de

zapallo son ricas en globulina, la cual tiene un

peso molecular de aproximadamente 112 KDa

(HARA, WADA, WAKABAYASHI y MATSUBARA,

1976). Se observaron bandas de peso molecular

aparente de 67,6 KDa, 62,7 KDa, 37,0 KDa y 18,1

KDa. La globulina se separa en sus dos

subunidades y en presencia del SDS, cuyos

pesos son aproximadamente 63 y 56 KDa, pero al

estar tambin en presencia de un agente reductor,

para cada subunidad se observan bandas de

polipptidos de alrededor de 36 y 22 KDa (Hara,

Wada, Wakabayashi y Matsubara, 1976). Por lo

mismo, el peso molecular aparente de 67,6 y 62,7

KDa, podran deberse a la trimerizacin de la

subunidad de 22 KDa, a la agregacin de las dos

subunidades entre ellas, o bien, a la seal (en

caso de que hubiese fallado el agente reductor) de

las dos subunidades, y . Adems, el peso

molecular aparente de 37 kDa, es esperable que

sea la subunidad de 36 KDa, mientras que el peso

molecular aparente de 18,1 KDa podra ser la

subunidad de 22 KDa, o bien, una degradacin de

la subunidad de 36 KDa.

El extracto de mioglobina, present bandas a los

63,3 KDa, 58,2 KDa, 49,2 KDa, 35,2 KDa, 25,2

KDa, 11,9 KDa y 9,2 KDa. La mioglobina de vaca

tiene un peso molecular de 17.800 y un solo grupo

hemo (Cheftel J.C. y Cheftel H., 1999). Los

valores de 11,9 y 9,2 KDa, evidencian una

degradacin de la protena, pues esta debiese

presentar bandas en valores cercanos a los 17,8

KDa. Se observ una banda a 25,2 KDa, la cual

podra deberse a la unin entre la mioglobina

(17,8 KDa) y alguno de sus pptidos degradados

de menor peso molecular, que haya presentado

un valor de alrededor de 7,3 KDa; Adems, la

banda observada a 35,2 KDa, podra deberse a la

dimerizacin de la mioglobina, puesto que mostr

un valor de alrededor del doble al esperado;

Tambin, se observ una banda a los 49,2 KDa,

que podra deberse a la formacin de un trmero

de distintas formas, pudiendo llevar dos unidades

de mioglobina y una unidad de mioglobina

degradada de alrededor de 13,6 KDa, o bien, tres

unidades de la mioglobina degradada, entre otras;

Por ltimo las bandas observadas a 58,2 y 63,3

KDa, podran atribuirse a la trimerizacin de la

unidad de mioglobina.

En la muestra de ovoalbmina la banda ms

intensa se encuentra a 41,5 KDa y condice muy

cercanamente con los 45 KDa de literatura

(Jimnez e Iregui, 2008). Las dems bandas

pueden ser producto de la degradacin de la

protena, ya que adems de la accin del medio

reductor por parte del 2-mercapto etanol y el SDS

en la preparacin de las muestras de protenas

para la electroforesis, estas son sometidas

tambin a un hervor de 5 minutos, cuyos efectos

pueden incidir directamente en la integridad de la

protena.

Cabe mencionar, dos hechos relevantes en la

realizacin de la electroforesis:

1) Las muestras de protenas de zapallo y la de

casena, no se vieron claramente, presentaban

bandas muy tenues y desteidas comparndolas

con las muestras de los dems bolsillos, esto no

es debido a diferencia en los volmenes de carga

de los bolsillos, puesto que todos fueron cargados

con 20 L. No se encuentra un motivo claro a la

existencia de esta situacin, ni en el mtodo

prctico, ni buscando en literatura.

2) La muestra de mioglobina fue situada en el

bolsillo nmero 6 y el nmero 8, puesto que una

pequea cantidad de ovoalbmina (perteneciente

al bolsillo 7), escurri al bolsillo 6 al ser introducida

en su bolsillo, pese a que no hay grandes

diferencias en los pesos moleculares obtenidos,

se utilizaron los valores del bolsillo 8, para evitar

cualquier error que pudiese causar la

contaminacin.

Los pesos moleculares obtenidos para cada

muestra, no fueron sumados para sacar el peso

molecular total de la protena, debido a que cada

8

muestra presentaba una variada cantidad de

protenas, lo cual impide saber el peso molecular

de cada protena en algunos casos, pues existe

degradacin, o aglomeracin de subunidades

diferentes.

En definitiva, el uso de la electroforesis permiti

de forma exitosa la obtencin de los pesos

moleculares aproximados para las distintas

muestras de protenas con SDS y 2-mercapto

etanol. Considerando la posibilidad de que las

muestras sufran aglomeraciones (formacin de

dmeros, trmeros, etc) y degradacin, cuando el

tratamiento previo a la electroforesis no sea el

correcto, y la complejidad de determinar el peso

entre protenas muy similares como las casenas,

no menoscaban el real potencial que tiene esta

herramienta para el anlisis bioqumico de los

alimentos. Por lo tanto, el uso de electroforesis

con 2-mercapto etanol y SDS ha demostrado ser

un mtodo efectivo para la determinacin

cuantitativa del peso aproximado de protenas

alimentarias.

5. Referencias Bibliogrficas

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9

6. Anexos

Para el clculo del peso molecular de cada banda, expuesto en la tabla 3, se utiliz regresin lineal de la

curva obtenida de las protenas estndar: Y(x) = -1,2732x + 2,2379.

Por ejemplo, para el peso molecular de L1:

Y(x) = -1,2732x + 2,2379.

Rf = x =

= 0,0769,

Luego log(PM) = Y(x) = -1,2732(0,0769) + 2,2379 = 2,139

Finalmente, PM = =138,026 KDa.