EL LABORATORIO ENOLÓGICO BÁSICO

Ante las preguntas de cómo debe ser e l laborator io enológ ico bás ico, qué métodos se deben implantar y qué inst rumentac ión es necesar ia , e l enólogo debe tener presente que este laborator io debe permi t i r le e fectuar un adecuado cont ro l de e laborac ión de l v ino. Y por e l lo debe dec id i r , según su cr i ter io , que parámetros enológ icos considera necesar ios cont ro lar .

En la tabla 1 , adaptada de la or ig ina l de J . B lou in et a l . (1) , se deta l lan una ser ie de parámetros enológ icos que pueden apor tar in formación suf ic iente para un correcto cont ro l de los d i ferentes estad ios de la e laborac ión de l v ino. Además, se deta l lan las técn icas anal í t icas que se ut i l izan usualmente para e l anál is is de estos parámetros.Tabla 1. Técnicas anal í t icas de interés para el laborator io enológico básico

Parámetros enológicos Técnica anal í t icaPeso de muest ra Grav imetr íaAzúcares to ta les y densidadGrado a lcohól ico

Densimetr ía

Azúcares to ta les Refractometr íaAzúcares reductoresAcidez to ta l y vo lá t i lSO 2

Nit rógeno as imi lab le

Volumetr ía

pH Potenciometr íaGlucosa y f ructosaÁcidos tar tár ico, mál ico, láct ico y c í t r icoÁcido g lucónicoCompuestos fenól icos to ta lesAntoc ianos y tan inosColorHierro y cobreNi t rógeno as imi lab leSO 2

Espect ro fometr ía

Esta tab la es una propuesta in ic ia l que cada enólogo tendrá que a justar en func ión de sus necesidades. De todas formas, se puede observar que para la determinac ión anal í t ica de estos parámetros son necesar ias muy pocas técn icas anal í t icas, las cuales, además, requieren una inst rumentac ión muy bás ica y de coste moderado. De forma breve se puede resumir que, como inst rumentos anal í t icos, apar te de densímetros y a lcohol ímetros y de l mater ia l vo lumétr ico, só lo son necesar ios una balanza, un re f ractómetro, un potenc iómetro y un espect ro fo tómetro.

La instrumentación anal í t ica

La inst rumentac ión antes c i tada es suf ic iente para un buen cont ro l de la e laborac ión de l v ino, pero es necesar io que estos inst rumentos tengan las caracter ís t icas técn icas adecuadas, estén correctamente ca l ibrados y tengan un buen mantenimiento. Hagamos, pues, una breve re f lex ión sobre estos inst rumentos, las caracter ís t icas técn icas deseables, así como a lgunas recomendaciones sobre su ca l ibrac ión y mantenimiento (2) :

1. Balanza anal í t ica

La balanza anal í t ica es e l ins t rumento grav imétr ico bás ico de cualqu ier laborator io . Se ut i l iza, normalmente, para pesar la muest ra y los react ivos empleados en la preparac ión de so luc iones pat rón. En e l laborator io enológ ico normalmente la cant idad de muest ra , usualmente v ino, se mide en vo lumen, pero la ba lanza anal í t ica es impresc ind ib le para pesar muest ras só l idas, como sucede durante e l cont ro l de madurac ión. La ba lanza anal í t ica t iene que permi t i r pesar con una exact i tud mín ima de 0,001g, aunque ser ía prefer ib le que pudiera pesar hasta 0,1mg. Además, se deber ía d isponer de una balanza granatar io , de hasta 0,1g, para pesadas de menor exact i tud ( react ivos aux i l ia res, ad i t ivos, e tc) . E l laborator io deberá tener implantado un p lan de ver i f icac ión y ca l ibrac ión per iód ica de las ba lanzas, u t i l izando, para e l lo , pesas de re ferenc ia .

2. Densímetros y alcohol ímetros

Los densímetros y alcohol ímetros , de acuerdo con las especi f icac iones de la OIV y de la UE (3,4) , deben estar normal izados y ca l ibrados a 20ºC. Deben ind icar de forma expl íc i ta las un idades de la escala (densidad absoluta o especí f ica, ºBe, ºBr ix , % vo l , e tc . ) y la forma de efectuar la lectura. Con e l a lcohol ímetro se mide e l grado a lcohól ico de l v ino, a par t i r de la densidad del dest i lado, por lo que será necesar io d isponer de un equipo de dest i lación normal izado (3,4) . Como la densidad depende de la temperatura en todos los casos es necesar io e l uso de termómetros , normal izados y ca l ibrados, para la medida de la temperatura de l l íqu ido con e l f in de efectuar las correcc iones opor tunas.

Las anter iores recomendaciones están or ientadas a la obtenc ión de in formación anal í t ica. No obstante, en las bodegas se ut i l iza normalmente e l densímetro para e l cont ro l de la fermentac ión a lcohól ica, a par t i r de la d isminución de la densidad. En este caso puede ser opor tuno, a cr i ter io de l enólogo, t rabajar con densímetros con unas especi f icac iones menos r igurosas que las estab lec idas por las normat ivas.

Análogamente, en e l laborator io enológ ico e l grado a lcohól ico se determina usualmente a par t i r de la medida de la temperatura de ebul l ic ión de l v ino, mediante un ebul lómetro . Este método no está normal izado, pero se puede a lcanzar una exact i tud de 0,2-0,5% vol . en v inos secos (2 ,5) , aunque puede dar er rores mayores en v inos du lces. Por esta razón, la ebul lometr ía es muy adecuada y recomendable para e l cont ro l de grado a lcohól ico, aunque para un correcto func ionamiento es necesar io l impiar regularmente la ca ldera, por ebul l ic ión, con una so luc ión de h idróx ido sódico a l 2-4%, y la ver i f icac ión per iód ica de l termómetro.

3. Mater ia l volumétr ico

El material volumétr ico que se ut i l iza para las medidas anal í t icas son las p ipetas, las buretas y los matraces aforados. Es recomendable que sean de c lase A, lo que nos garant iza que han s ido ca l ibrados a 20ºC según las normat ivas correspondientes. Este mater ia l requiere un correcto mantenimiento de l impieza, usando un detergente adecuado s i es necesar io , y de jando secar a l a i re a temperatura ambiente.

4. Refractómetro

El refractómetro se ut i l iza usualmente para la determinac ión de los azúcares to ta les de l mosto, aunque también puede usarse para la determinac ión de l grado a lcohól ico. E l re f ractómetro puede ser ópt ico o e lect rón ico. Los re f ractómetros e lect rón icos son prefer ib les ya que permi ten un fác i l correcc ión de l cero y una efect iva compensación de la temperatura. E l índ ice de re f racc ión depende de la temperatura y por e l lo debe estar ca l ibrado a 20ºC. Además, y muy impor tante, la medida con e l re f ractómetro debe efectuarse a una temperatura, tanto de l inst rumento como de la muest ra , cercana a los 20ºC. Se recomienda t rabajar a 20 3ºC, ya que, s i se ut i l iza fuera de este rango, a lgo muy t íp ico en las medidas de campo en p lena canícu la est iva l , puede proporc ionar va lores erróneos, aun d isponiendo de compensación de temperatura.

Los azúcares to ta les de un mosto permi ten est imar e l pos ib le va lor de l grado a lcohól ico de l v ino que se obtendrá con este mosto. E l grado a lcohól ico probable se obt iene por cá lcu lo a par t i r de l rendimiento de la fermentac ión que puede osc i lar ent re 16-18 g azúcar / l i t ro para obtener 1%vol . Es, por tanto, só lo un va lor est imat ivo y aprox imado, aunque de gran in terés enológ ico.

5. pHmetro

El potenciómetro es e l t íp ico inst rumento que, u t i l izando un e lect rodo combinado de v idr io , s i rve para medi r e l pH, razón por la cual se le conoce usualmente como pHmetro . Debe poder medi r e l pH con una exact i tud de 0,01 un idades de pH. Normalmente, los inst rumentos modernos t ienen un s is tema de compensación de temperatura y se ca l ibran mediante un procedimiento automat izado en e l que se ut i l izan dos so luc iones pat rón (so luc iones tampón) de pH 4,01 y 6 ,86 a 25ºC ( Tabla 2 ) . Una vez ca l ibrado puede ut i l izarse una so luc ión pat rón de b i tar t ra to potás ico (pH 3,56 a 25ºC) para la ver i f icac ión ru t inar ia de l inst rumento.

La ca l idad en la medida de l pH depende fundamenta lmente de la preparac ión y conservac ión de las so luc iones pat rón y de l estado del e lect rodo:

Soluciones patrón de pH: Pueden prepararse en e l laborator io , aunque normalmente se ut i l izan so luc iones comerc ia les. Éstas t ienen una caducidad de hasta un año, pero es recomendable no ut i l izar una so luc ión pat rón dos o t res meses después de abr i r la bote l la . De todas formas estas so luc iones (excepto la so luc ión de b i tar t ra to potás ico) deben guardarse en e l f r igor í f ico. Para ut i l izar las en la ca l ibrac ión d iar ia de l pHmetro es necesar io u t i l izar so luc iones nuevas (no reut i l izadas) , rec ién sacadas de l f r igor í f ico y a temperatura ambiente.

El t íp ico electrodo combinado de vidr io consta rea lmente de dos e lect rodos, un e lect rodo ind icador de membrana de v idr io y un e lect rodo de re ferenc ia . E l potenc iómetro mide la d i ferenc ia de potenc ia l que se crea ent re estos dos e lect rodos, la cual depende del pH. La v ida media de un e lect rodo de v idr io es de a l rededor de un año. La conservac ión de la membrana del e lect rodo es cr í t ica y por esta razón, cuando no se usa, debe estar s iempre sumerg ida en una so luc ión sa l ina (normalmente una so luc ión 3M de c loruro potás ico) . S i se prevé no ut i l izar lo durante más de un mes, es prefer ib le guardar lo l impio y seco. Cuando e l e lect rodo empieza a dar prob lemas en la ca l ibrac ión, es aconsejab le proceder a la react ivac ión de la membrana sumerg iéndola en una so luc ión de ác ido c lorhídr ico 0,1M durante una noche y a cont inuación en una so luc ión tampón de pH 4 o en c loruro potás ico 3M durante ot ra noche. Para una regenerac ión más drást ica puede sumerg i rse la membrana en ác ido f luorhídr ico a l 40% durante unos segundos y proceder a cont inuación.

Tabla 2. Patrones y valores de referencia para la cal ibración de un pHmetro

pH. Soluciones de referenciaSoluc ión tampón de pH 4

Bi f ta la to potás ico(10,211 g/L)

Soluc ión tampón de pH 7K 2 HPO 4 (4 ,354 g/L)

y KH 2 PO 4 (3 ,402 g/L)T ( ºC) pH T (ºC) pH

10 4,00 10 6,9215 4,00 15 6,9020 4,00 20 6,8825 4,01 25 6,8630 4,02 30 6,85

Soluc ión de b i tar t ra to potás ico (so luc ión saturada)pH = 3,56 0 ,02 (25ºC)

6. Espectrofotómetro

El espect ro fo tómetro es e l ins t rumento más versát i l de l laborator io , ya que, como puede observarse en la tab la 1 , puede ut i l izarse para d i ferentes determinac iones anal í t icas. La espect ro fo tometr ía UV-v is ib le es una técn ica anal í t ica que se fundamenta en la absorc ión de estas rad iac iones por par te de las moléculas. Por e l lo e l espect ro fo tómetro está const i tu ido por un foco de rad iac ión v is ib le o u l t rav io le ta , que emi te una rad iac ión que at rav iesa un se lector , que permi te escoger una rad iac ión de una longi tud de onda ( ) concreta. La rad iac ión se lecc ionada inc ide sobre la muest ra conten ida en una cubeta t ransparente. Una par te de la rad iac ión es absorb ida, mient ras que e l resto es t ransmi t ida y se mide en un detector .

Cada molécula en func ión de su conf igurac ión e lect rón ica puede absorber unas rad iac iones especí f icas, que se caracter izan por su longi tud de onda. Las moléculas en so luc ión pueden absorber rad iac iones de la zona u l t rav io le ta ( 195-325nm) o de la luz v is ib le (325-800nm). En e l caso de la absorc ión de la luz v is ib le , esta absorc ión es la razón por la cual las so luc iones se vean co loreadas. Así , e l v ino t in to es de co lor ro jo porque absorbe rad iac iones ent re 400-700nm, con un máximo en 520nm.

Si cada molécula de un anal i to absorbe una rad iac ión caracter ís t ica, la medida de toda la rad iac ión absorb ida nos permi te medi r la cant idad de moléculas, es dec i r , la concentrac ión. La absorbancia (A) , que se ca lcu la a par t i r de la medida exper imenta l de la rad iac ión inc idente y de la t ransmi t ida, y la concentrac ión se ha l lan re lac ionadas por la ley de Beer-Lambert : A = a·b·C, donde b es e l camino ópt ico (espesor de la cubeta) y a es la absor t iv idad especí f ica, que es caracter ís t ica para

cada anal i to , pero depende de la longi tud de onda de la rad iac ión absorb ida y de las caracter ís t icas de la so luc ión (matr iz) que cont iene a l anal i to . Para e l anál is is cuant i ta t ivo se const ruye normalmente una recta de ca l ibrado con pat rones, procurando que la matr iz sea igual o muy s imi lar a la de la muest ra , y la absorbancia de la muest ra se in terpo la en esta recta de ca l ibrado con e l f in de obtener la concentrac ión.

Un espect ro fo tómetro se caracter iza por su rango espectral , ya que puede abarcar las zonas de l v is ib le y de l u l t rav io le ta . En enología, la gran mayor ía de los anál is is espect ro fo tométr icos se efectúan en e l v is ib le , por lo que un rango espect ra l de 325-800nm es suf ic iente. De todas formas, un rango espect ra l de 195-800nm permi te e fectuar determinac iones en e l u l t rav io le ta y , de forma muy par t icu lar , permi te determinar los po l i fenoles to ta les ( IPT) de l v ino, a par t i r de la medida d i recta de la absorbancia a 280 nm. Un espect ro fo tómetro UV-v is ib le requiere una mayor invers ión económica, pero la pos ib i l idad de efectuar este anál is is just i f ica su adquis ic ión.

Otro parámetro impor tante es la anchura de banda de la rad iac ión inc idente. Ésta deber ía ser in fer ior a 10nm, lo que puede consegui rse fác i lmente tanto con f i l t ros como con pr ismas o redes de d i f racc ión. Actua lmente, la gran mayor ía de los inst rumentos incorporan redes de d i f racc ión, aunque los c lás icos co lor ímetros, que ut i l izan f i l t ros, son per fectamente vá l idos para t rabajar en e l v is ib le .

Las cubetas para la muest ra son de especia l impor tanc ia , ya que deben ser t ransparentes a la rad iac ión ut i l izada. Se ut i l izan cubetas de v idr io , de cuarzo y de p lást ico. Para t rabajar en la zona u l t rav io le ta es impresc ind ib le t rabajar con cubetas de cuarzo, ya que tanto e l v idr io como e l p lást ico absorben en esta zona. Las cubetas de v idr io o p lást ico se ut i l izan normalmente para la zona del v is ib le . En e l momento de la medida, la cubeta debe estar con las paredes exter iores l impias y secas. Además, es de gran impor tanc ia que la muest ra que cont iene sea to ta lmente t ransparente y no contenga burbuja a lguna. La fa l ta de t ransparencia es una impor tante fuente de errores en e l anál is is espect ro fo tométr ico y por esta razón, s i procede, las muest ras se f i l t rarán o cent r i fugarán antes de la medida espect ro fo tométr ica.

Es aconsejab le u t i l izar la misma cubeta para todas las medidas, tanto de la muest ra como de los pat rones de ca l ibrac ión. Las cubetas de cuarzo y de v idr io se adquieren por pare jas y están cont rastadas, por lo que pueden usarse s in prob lemas. Las cubetas de p lást ico, normalmente en ca jas de 100 cubetas o más, no se ha l lan cont rastadas por lo que se deberá ver i f icar prev iamente la un i formidad de su t ransparencia en la zona espect ra l de t rabajo. Además, en e l caso de t rabajar con una única cubeta de p lást ico es aconsejab le co locar la en e l por tacubetas s iempre en la misma posic ión, con e l lo la rad iac ión inc ide s iempre por la misma cara de la cubeta, ev i tándose así er rores por fenómenos puntuales de re f lex ión y d ispers ión de la rad iac ión inc idente.

Veri f icación del espectrofotómetro: La ca l idad de las medidas espect ro fo tométr icas depende de las prop iedades anal í t icas de l inst rumento, destacando pr inc ipa lmente la exact i tud de la longi tud de onda y la l ineal idad y exact i tud de la respuesta. Estas prop iedades deben ver i f icarse prev iamente para comprobar e l estado del inst rumento. La ver i f icac ión se rea l iza normalmente a par t i r de pat rones de re ferenc ia cer t i f icados por organismos competentes (NIST, SMT, e tc . ) , que se caracter izan por tener per fectamente estab lec idas unas propiedades de in terés, así como la incer t idumbre asoc iada.

De todas formas, se puede efectuar una ver i f icac ión menos r igurosa, pero suf ic iente para un laborator io enológ ico bás ico (2) :

Exact i tud de la longitud de onda: Para asegurar que la se lecc ionada co inc ide con la rea l se puede ut i l izar un f i l t ro de v idr io que cont iene óx ido de ho lmio, que presenta unos máximos de absorc ión a unas caracter ís t icas (Tabla 3 ) .

Exact i tud de la absorbancia: Para asegurar e l va lor de la absorbancia se pueden ut i l izar como referenc ia so luc iones pat rón de compuestos que presentan va lores de absorbancia caracter ís t icos a determinadas longi tudes de onda. Para las medidas en e l v is ib le se puede ut i l izar una so luc ión de su l fa to de

cobre, mient ras que para e l u l t rav io le ta se puede ut i l izar una so luc ión de d icromato potás ico (Tabla 3 ) .

Lineal idad de la absorbancia: D i luyendo las so luc iones anter iores se puede ver i f icar e l rango de l ineal idad de la respuesta de l espect ro fo tómetro.

Tabla 3. Patrones y valores de referencia para la ver i f icación de la exact i tud de un espectrofotómetro

Longitudes de onda de

referenciaAbsorbancias de referencia

Fi l t ro de v idr io de óx ido de ho lmio

Soluc ión de K 2 Cr 2 O 7

0,05 g/L en H 2 SO 4

0,005M

Soluc ión de CuSO 4 ·5H 2 O

20,0 g/L en H 2 SO 4 a l 1%

(nm) (nm) A (nm) A241,5 360,9 235 (mín) 0,626 600 0,068287,5 418,4 257 (máx) 0,727 650 0,224279,4 453,2 313 (mín) 0,244 700 0,527333,7 536,2 350 (máx) 0,536 750 0,817

En todos los casos, se debe estab lecer un cr i ter io de aceptac ión en func ión de la exact i tud que se desea t rabajar o e l er ror máximo que se qu iere aceptar . S i los va lores obten idos en la ver i f icac ión están inc lu idos en e l in terva lo def in ido nos ind ica que e l equipo cumple las especi f icac iones estab lec idas, de lo cont rar io , deberá ca l ibrarse o repararse.

La ver i f icac ión de l inst rumento es cr í t ica cuando se efectúan determinac iones anal í t icas a par t i r de medidas absolutas de la absorbancia. Las medidas re la t ivas son más usuales, ya que normalmente se t rabaja con rectas de ca l ibrado y los pos ib les er rores en la medida de las absorbancias quedan min imizados a l cometerse tanto a l medi r la muest ra como los pat rones de ca l ibrac ión. S in embargo, en enología se efectúan muchas medidas absolutas de la absorbancia de l v ino, los cuales representan parámetros muy impor tantes de l mismo, como e l índ ice de po l i fenoles to ta les ( IPT) , que se obt iene a par t i r de la medida d i recta de la absorbancia a 280 nm o los parámetros de co lor (A 4 2 0 , A 5 2 0 , A 6 2 0 ) obten idos de forma análoga. En estos casos, la ver i f icac ión es fundamenta l para garant izar la exact i tud de las medidas.

Una vez concretada la inst rumentac ión anal í t ica mín ima del laborator io enológ ico bás ico, podemos proceder a re f lex ionar sobre los métodos de anál is is a implementar y sobre la forma de garant izar la f iab i l idad de los resu l tados que se obtengan. Estos temas se t ra tarán en fu turos ar t ícu los.