El Dominio ICA512-RESP18HD es un Factor de Condensación de ... · El Dominio ICA512-RESP18HD es un...
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El Dominio ICA512-RESP18HD es un Factor de Condensación de Proteínas y un Inhibidor de la Fibrilación de Insulina Pamela L. Toledo 1,2 , Juha Torkko 3,4,5 , Diego S. Vazquez 1,2 , Gastón Franceschinis 2 , Andreas Müller 3,4,5 , Carolin Wedbrog 3,4,5 , Anke Sönmez 3,4,5 , Michele Solimena 3,4,5 y Mario R. Ermácora 1,2 INTRODUCCIÓN ICA512, también denominada IA2 o PTPRN, es un receptor tirosina fosfatasa catalíticamente inactivo que se encuentra principalmente en los gránulos secretorios (GS) de las células β-pancreáticas y en células neuroendocrinas. Resultados previos demostraron su participación en la biogénesis, transporte y exocitosis de los GS de insulina como también en la proliferación de las células β-pancreáticas. En la región extracelular de ICA512, se encuentra el dominio RESP18HD (de glucocorticoid-responsive regulated endocrine-specific protein 18 homology domain). RESP18HD está compuesto por un péptido señal de translocación al retículo endoplásmico (residuos 1-34), un motivo N-terminal rico en cisteínas (residuos 35-90) y una región con carácter intrínsecamente desordenado (IDR) en el extremo C-terminal. RESP18HD es necesario para direccionar a ICA512 a los GS en células INS-1 de insulinoma de rata y se ha demostrado que se une con gran afinidad tanto a la insulina como a la proinsulina. Nuestro grupo ha demostrado recientemente que RESP18HD e insulina forman complejos reversibles y dependientes de pH que co-precipitan in vitro. A diferencia de otras proteína de carga de los GS con propiedades de agregación, la actividad de condensación de RESP18HD ocurre a valores de pH cercanos a la neutralidad, como los que se encuentran en la vía secretora temprana, mientras que se resuelven a pH ácido y en presencia de altas concentraciones de Zn 2+ , condiciones similares a las encontradas en los GS maduros (Figura 1). Por otra parte, hemos encontrado que el motivo N-terminal rico en cisteínas, región precedente a la IDR, inhibe la fibrilación de insulina in vitro. Figura 1. Modelo de trabajo. Fase 1: RESP18HD e insulina forman agregados a pH fisiológico en el aparato de Golgi dando lugar a la clasificación regulada y la biogénesis de los GS junto a otras principales proteínas de carga. Fase 2: Durante la maduración de los GS, la acidificación causa la resolubilización de los agregados. Durante la maduración también se incrementa la concentración de Zn 2+ . Fase 3: El Zn 2+ interactúa con ambas proteínas y un vez que los GS se fusionan con la membrana plasmática para liberar a la insulina, esta interacción previene la re-agregación a pH neutro. METODOLOGÍA RESP18HD fue expresada en células E. coli BL21D3 y purificada como se describe en Toledo et al. 2019. Los ensayos de autoagregación fueron realizados mediante turbimetría a λ=400nm a pH 4.5 y 6.8 a una concentración constante de 2.5μM RESP18HD y en ausencia o presencia de 50 μM Zn 2+ y/o 8μM insulina a 20°C. La formación de agregados de proteínas de alto peso molecular se analizó mediante SDS-PAGE. La formación de fibras tipo β-amiloides de insulina se realizaron incubando insulina 20μM con tioflavina-T 2μM en buffer HEPES 100mM a pH 6.8 y la reacción fue seguida por fluorescencia (λ ex =440nm y λ em =480 nm). 1 Instituto Multidisciplinario de Biología Celular, CONICET-UNLP, Buenos Aires, Argentina. 2 Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Buenos Aires, Argentina. 3 Molecular Diabetology, Faculty of Medicine, TU Dresden, Germany. 4 Paul Langerhans Institute Dresden of the Helmholtz Center Munich, University Hospital and Faculty of Medicine of TU Dresden, Dresden, Germany. 5 German Center for Diabetes Research, Neuherberg, Germany. CONCLUSIONES A diferencia de otras proteínas de carga de los GS con propiedades de agregación, la actividad de condensación de ICA512-RESP18HD se observó a valores de pH cercanos a la neutralidad, como el que encuentra en la vía secretora temprana, mientras que se logra la resolubilización a pH ácido y en presencia de altas concentraciones de Zn 2+ , condiciones similares a las encuentradas en los GS de insulina maduros. En conjunto, nuestros hallazgos indican que ICA512-RESP18HD es un factor de condensación necesario para la clasificación de las proteínas a los GS de insulina y la granulogénesis en la vía secretora y para la prevención de la fibrilación de la insulina. Fase 1 Fase 3 Fase 2 RESP18HD e insulina co-agregan a pH 6.8 RESP18HD co-agrega con otras proteínas El efecto del pH y el rol del Zn 2+ en los agregados RESP18HD-insulina La auto-agregación de RESP18HD es inhibida por Zn 2+ Figura 2. RESP18HD es un aglutinante de insulina y otras proteínas a pH fisiológico. A Turbidimetría de RESP18HD e insulina. La señal generada por la dispersión de luz al mezclar RESP18HD e insulina a pH 6.8 indica la formación agregados. B SDS-PAGE de los agregados de RESP18HD e insulina a pH 6.8. La presencia de ambas proteínas en el precipitado demuestra que las proteínas co-precipitan. Figura 3. La co-agregación de RESP18HD e insulina es reversible por acidificación del medio. A Agregación del complejo RESP18HD-insulina seguida por dispersión a λ=400nm es reversible en condiciones ácidas (pH 4, línea amarilla) mientras que el agregado el agregado de fuerza iónica (un equivalente de NaCl) detiene la agregación (línea verde). B Efecto de la presencia de Zn 2+ en la formación del complejo RESP18HD-insulina a pH 6.8. Se observa que el Zn 2+ no resolubiliza los agregados RESP18HD-insulina. C SDS-PAGE de las muestras del panel A donde se observa la resolubilizacion del complejo. D Cambios de pH y concentración de Zn 2+ seguidos por SDS-PAGE. Se observa que (al igual que en B) que el Zn 2+ no es suficiente para la resolubización de los agregados de RESP18HD-insulina sino que requiere de la acidificación del medio. Figura 4. El Zn 2+ inhibe la auto-agregación de RESP18HD e insulina. A y B. Turbidimetría de RESP18HD en presencia de Zn 2+ y otros metales divalentes. La unión a Zn 2+ evita la formación de agregados de RESP18HD y este efecto es específico para este catión. C. SDS-PAGE de RESP18HD e insulina simulando los cambios de pH y concentración de Zn 2+ de la vía secretoria. Dando lugar a nuestro modelo de trabajo, este resultado muestra que RESP18HD e insulina co-agregan a pH cercano a neutro (condición encontrada en el aparato de Golgi). Luego, al acidificarse el medio durante la maduración de los GS, se produce la resolubilización de las proteínas mientras incrementa la concentración de Zn 2+ , uniéndose a ambas proteínas. Finalmente, al volver a incrementarse el pH, la unión a Zn 2+ de ambas proteínas, evita la auto-agregación de ambas. Figura 5. La presencia de RESP18HD evita la formación de fibras de insulina a pH neutro. La reacción con tioflavina T demuestra que a la pH neutro y 60°C, se forman fibras de insulina. Cuando RESP18HD (RESP18HD131) o solo su variante truncada rica en cisteínas (RESP18HD90) se encuentran en el medio, la formación de fibras es inhibida. C
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El Dominio ICA512-RESP18HD es un Factor de Condensación de Proteínas y un Inhibidor de la Fibrilación de Insulina
Pamela L. Toledo1,2, Juha Torkko3,4,5, Diego S. Vazquez1,2, Gastón Franceschinis2, Andreas Müller3,4,5,Carolin Wedbrog3,4,5, Anke Sönmez3,4,5, Michele Solimena3,4,5 y Mario R. Ermácora1,2
INTRODUCCIÓNICA512, también denominada IA2 o PTPRN, es un receptor tirosina fosfatasa catalíticamente inactivo que se encuentra principalmente en los gránulos secretorios (GS) de las células β-pancreáticas y en células neuroendocrinas. Resultados previos demostraron su participación en la biogénesis, transporte y exocitosis de los GS de insulina como también en la proliferación de las células β-pancreáticas. En la región extracelular de ICA512, se encuentra el dominio RESP18HD (de glucocorticoid-responsive regulated endocrine-specific protein 18 homology domain). RESP18HD está compuesto por un péptido señal de translocación al retículo endoplásmico (residuos 1-34), un motivo N-terminal rico en cisteínas (residuos 35-90) y una región con carácter intrínsecamente desordenado (IDR) en el extremo C-terminal. RESP18HD es necesario para direccionar a ICA512 a los GS en células INS-1 de insulinoma de rata y se ha demostrado que se une con gran afinidad tanto a la insulina como a la proinsulina. Nuestro grupo ha demostrado recientemente que RESP18HD e insulina forman complejos reversibles y dependientes de pH que co-precipitan in vitro. A diferencia de otras proteína de carga de los GS con propiedades de agregación, la actividad de condensación de RESP18HD ocurre a valores de pH cercanos a la neutralidad, como los que se encuentran en la vía secretora temprana, mientras que se resuelven a pH ácido y en presencia de altas concentraciones de Zn2+, condiciones similares a las encontradas en los GS maduros (Figura 1). Por otra parte, hemos encontrado que el motivo N-terminal rico en cisteínas, región precedente a la IDR, inhibe la fibrilación de insulina in vitro.
Figura 1. Modelo de trabajo. Fase 1: RESP18HD e insulina forman agregados a pH fisiológico en el aparato de Golgi dando lugar a la clasificación regulada y la biogénesis de los GS junto a otras principales proteínas de carga. Fase 2: Durante la maduración de los GS, la acidificación causa la resolubilización de los agregados. Durante la maduración también se incrementa la concentración de Zn2+. Fase 3: El Zn2+ interactúa con ambas proteínas y un vez que los GS se fusionan con la membrana plasmática para liberar a la insulina, esta interacción previene la re-agregación a pH neutro.
METODOLOGÍA
RESP18HD fue expresada en células E. coli BL21D3 y purificada como se describe en Toledo et al. 2019. Los ensayos de autoagregación fueron realizados mediante turbimetría a λ=400nm a pH 4.5 y 6.8 a una concentración constante de 2.5μM RESP18HD y en ausencia o presencia de 50 μM Zn2+ y/o 8μM insulina a 20°C. La formación de agregados de proteínas de alto peso molecular se analizó mediante SDS-PAGE. La formación de fibras tipo β-amiloides de insulina se realizaron incubando insulina 20μM con tioflavina-T 2μM en buffer HEPES 100mM a pH 6.8 y la reacción fue seguida por fluorescencia (λex=440nm y λem=480 nm).
1Instituto Multidisciplinario de Biología Celular, CONICET-UNLP, Buenos Aires, Argentina. 2Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Buenos Aires, Argentina. 3Molecular Diabetology, Faculty of Medicine, TU Dresden, Germany. 4Paul Langerhans Institute Dresden of the Helmholtz Center Munich, University Hospital and Faculty of Medicine of TU Dresden, Dresden, Germany. 5German Center for Diabetes Research, Neuherberg, Germany.
CONCLUSIONES
A diferencia de otras proteínas de carga de los GS con propiedades de agregación, la actividad de condensación de ICA512-RESP18HD se observó a valores de pH cercanos a la neutralidad, como el que encuentra en la vía secretora temprana, mientras que se logra la resolubilización a pH ácido y en presencia de altas concentraciones de Zn2+, condiciones similares a las encuentradas en los GS de insulina maduros. En conjunto, nuestros hallazgos indican que ICA512-RESP18HD es un factor de condensación necesario para la clasificación de las proteínas a los GS de insulina y la granulogénesis en la vía secretora y para la prevención de la fibrilación de la insulina.
Fase 1
Fase 3
Fase 2
RESP18HD e insulina co-agregan a pH 6.8 RESP18HD co-agrega con otras proteínas
El efecto del pH y el rol del Zn2+ en los agregados RESP18HD-insulina
La auto-agregación de RESP18HD es inhibida por Zn2+
Figura 2. RESP18HD es un aglutinante de insulina y otras proteínas a pH fisiológico. A Turbidimetría de RESP18HD e insulina. La señal generada por la dispersión de luz al mezclar RESP18HD e insulina a pH 6.8 indica la formación agregados. B SDS-PAGE de los agregados de RESP18HD e insulina a pH 6.8. La presencia de ambas proteínas en el precipitado demuestra que las proteínas co-precipitan.
Figura 3. La co-agregación de RESP18HD e insulina es reversible por acidificación del medio. A Agregación del complejo RESP18HD-insulina seguida por dispersión a λ=400nm es reversible en condiciones ácidas (pH 4, línea amarilla) mientras que el agregado el agregado de fuerza iónica (un equivalente de NaCl) detiene la agregación (línea verde). B Efecto de la presencia de Zn2+ en la formación del complejo RESP18HD-insulina a pH 6.8. Se observa que el Zn2+ no resolubiliza los agregados RESP18HD-insulina. C SDS-PAGE de las muestras del panel A donde se observa la resolubilizacion del complejo. D Cambios de pH y concentración de Zn2+ seguidos por SDS-PAGE. Se observa que (al igual que en B) que el Zn2+ no es suficiente para la resolubización de los agregados de RESP18HD-insulina sino que requiere de la acidificación del medio.
Figura 4. El Zn2+ inhibe la auto-agregación de RESP18HD e insulina. A y B. Turbidimetría de RESP18HD en presencia de Zn2+ y otros metales divalentes. La unión a Zn2+ evita la formación de agregados de RESP18HD y este efecto es específico para este catión. C. SDS-PAGE de RESP18HD e insulina simulando los cambios de pH y concentración de Zn2+ de la vía secretoria. Dando lugar a nuestro modelo de trabajo, este resultado muestra que RESP18HD e insulina co-agregan a pH cercano a neutro (condición encontrada en el aparato de Golgi). Luego, al acidificarse el medio durante la maduración de los GS, se produce la resolubilización de las proteínas mientras incrementa la concentración de Zn2+, uniéndose a ambas proteínas. Finalmente, al volver a incrementarse el pH, la unión a Zn2+ de ambas proteínas, evita la auto-agregación de ambas.
Figura 5. La presencia de RESP18HD evita la formación de fibras de insulina a pH neutro. La reacción con tioflavina T demuestra que a la pH neutro y 60°C, se forman fibras de insulina. Cuando RESP18HD (RESP18HD131) o solo su variante truncada rica en cisteínas (RESP18HD90) se encuentran en el medio, la formación de fibras es inhibida.
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