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El diagnstico viral por el laboratorioMara del Pilar Crespo, Bact., M.Sc.*

El diagnstico de las entidades virales es uno de los mayores retos a los que se enfrentala medicina actual, particularmente en pases semejantes a Colombia donde eldiagnstico viral se hace de manera emprica. Durante las ltimas dcadas, eldesarrollo progresivo de nuevas y mejores herramientas para evidenciar las causas detipo viral, hace posible que estas entidades se puedan descubrir y estudiar no slo anivel de laboratorios especializados, sino tambin en los comunes. Las pruebasdiagnsticas simples, rpidas y poco costosas para la demostracin de antgenos hanreemplazado las tcnicas tradicionales, largas y dispendiosas y esto ha producido unamayor agilidad en la definicin del diagnstico. Por otro parte, descubrir anticuerposes importante para documentar la prevalencia de una infeccin en individuos ypoblaciones. Adems, las pruebas de demostracin molecular han mejorado laprobabilidad de evidenciar los agentes virales pues se documenta la infeccin demodo categrico, y se estudian su progresin y seguimiento teraputico. En Colombiaes importante promover el manejo y ejecucin adecuados y racionales de las tcnicasdisponibles, ya sean las tradicionales o las nuevas que mejoren los diagnsticosvirales y diferenciales. Este artculo brinda un compendio sobre el tema, revisa laspruebas diagnsticas de mayor aplicabilidad en virologa, lo que tiene utilidad comogua rpida, y adems ofrece material de consulta tanto para profesionales como paraestudiantes del rea de la salud.

Palabras claves: Virus. Diagnstico. Infeccin viral.

Conocer cuando una infeccin es deetiologa viral es muy importante por-que determina un cambio en la conduc-ta clnica y en el manejo teraputico delpaciente. El diagnstico viral por ellaboratorio es de gran ayuda para con-firmar la etiologa, as como para elseguimiento clnico de la entidad.Adicionalmente, realizar un diagnsticoadecuado permite conocer laepidemiologa de la infeccin viral ydeterminar las connotaciones que im-plica a nivel de salud pblica; tal es elcaso de infecciones como el dengue y lafiebre amarilla. Por las caractersticasestructurales, ecolgicas y biolgicasde los virus, su demostracin in vitro esy ser uno de los mayores retos a losque se enfrentan los cientficos. Al igualque la mayora de los microorganismos,los virus se pueden descubrir ya sea de

una forma directa o indirecta. Las prue-bas directas son las que evidencian alvirus o algunos de los antgenos viralesque se pueden encontrar presentes enlos tejidos o fluidos humanos. Las prue-bas indirectas son las que se utilizan conms frecuencia y bsicamente demues-tran un contacto del husped con elagente viral mediante la determinacinde anticuerpos especficos contra elvirus. En muchos casos el diagnsticode infeccin viral se hace por el cuadroclnico del paciente y la presencia deanticuerpos contra el agente viral sos-pechoso; sin embargo, hay algunas tc-nicas rpidas para demostrar losantgenos virales y tambin se sabe detcnicas para amplificar su materialgentico.

No obstante la variedad de pruebasdiagnsticas que se han desarrollado,

2000 Corporacin Editora Mdica del Valle Colombia Med 2000; 31: 135-150

* Bacteriloga microbiloga, Clnica Fundacin Valle del Lili, Cali.

es necesario tener en cuenta que paraun ptimo diagnstico de las entidadesvirales, debe haber una adecuada indi-cacin, recoleccin y transporte de lasmuestras que se han de analizar paraeste propsito.

LA TOMA DE MUESTRAS

Un factor determinante y definitivopara el aislamiento viral es la obtencintemprana de una muestra adecuada,esto debido a que la excrecin del virustiende a ser por pocos das y la concen-tracin de partculas virales disminuyeprogresivamente con el tiempo. Ade-ms, la aparicin de anticuerpos en lafase aguda neutraliza el virus y ayuda aformar complejos inmunes. Tener encuenta lo anterior es importante, pues sila concentracin de virus en la muestraclnica es muy baja, se pierde fcilmen-te la posibilidad de infectar clulas vivas

RESUMEN

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y por tanto demostrarlo en los cultivoscelulares. Las muestras se deben tomaren las condiciones de mayor esterilidadposibles, identificadas con el nombredel paciente, lugar de procedencia, eltipo de muestra, la fecha y hora de latoma y un resumen corto de la historiaclnica con la solicitud de examen quese desea realizar. Para una muestraclnica adecuada es necesario tener encuenta factores adicionales que garan-ticen la conservacin de las partculasvirales activas, como: el tiempo de trans-porte de la muestra, la temperatura y elmedio de preservacin que se utilicepara ste (es decir medios de transporteque mantengan la viabilidad viral)1-4.Las muestras no se deben dejar a tem-peratura ambiente o en incubadora, tam-poco es recomendable congelar y des-congelar las muestras, pues as se po-dra alterar la estructura del agente viral(Cuadro 1).

Para el aislamiento viral, las mues-tras clnicas se deben tomar en el mo-mento indicado y rpidamenteinocularlas en clulas vivas (Cuadro 2).En su defecto se guardan en neveraentre 4 C-8 C o en hielo de agua hasta

que sea posible su inoculacin. Si eltiempo de inoculacin se prolonga msde 4 das, se congelan a -70 C y seutiliza un medio de transporte segn seael tipo de muestra. Se pueden utilizaralgunos criopreservantes para mejorarla recuperacin de los agentes virales,entre ellos dimetil sulfxido (DMSO),suero, leche descremada, protenas,sacarosa, glicerol y sorbitol5. Muy po-cos agentes virales se pueden mantenerpor un perodo relativamente largo o deaun das, cuando se transportan en unmedio adecuado y en hielo a 4 C4.

A continuacin se describen las prin-cipales tcnicas para diagnstico viral.

TCNICAS DIRECTAS PARA LADEMOSTRACIN VIRAL

Dentro de las tcnicas directas esposible incluir: Las que visualizan la partcula viral o

su efecto celular especfico comolas tinciones para microscopa deluz, la microscopa electrnica y elcultivo o aislamiento viral.

Las pruebas para demostracin deantgenos virales: los inmunoensayos

(ELISA, IFA, RIA) y las pruebas deltex.

Las que evidencian la presencia dematerial gentico viral como: ensa-yos de amplificacin gentica (reac-cin en cadena de la polimerasa,PCR, por sus siglas en ingls, LCR,etc.) e hibridizacin (sondas, ADNramificado, etc.)

Visualizacin de la partcula viralMicroscopa de luz. Se efecta me-

diante tinciones especiales, generalmenteson coloraciones con Wright o Giemsaen extendidos provenientes de lesionesvesiculares donde se visualizan las in-clusiones o los cambios celulares oca-sionados por la invasin viral. Un ejem-plo de esto lo constituye el estudio deinclusiones producidas por elcitomegalovirus (CMV) en sedimentourinario y la prueba de Tzank paraobservar las clulas infectadas por her-pes (o varicela zster), para sta sehace un raspado de la base de las ves-culas y despus de fijarla con metanol,se hace la tincin y se observan lasclulas, que se tornan agrandadas, conmltiples ncleos y un citoplasma quese tie de oscuro adems de inclusionesintranucleares eosinoflicas. La sensi-bilidad de esta tcnica depende de supreparacin, tincin y la experiencia delobservador, generalmente es menor quela de la inmunofluorescencia y el cultivoviral1,6,7.

La microscopa electrnica. Permi-te visualizar la partcula viral debido a lagran resolucin del microscopio elec-trnico. Para este fin se utilizan dostinciones especiales con sales de meta-les pesados como el uranio o el tungs-teno. La primera es la tincin negativadonde el acetato de uranilo forma unaespecie de molde viral que permite de-tallar la estructura del virus. La segundatincin es la del sombreado, donde laspartculas virales se ponen en un ngulodonde el metal que se utiliza en ella se

Cuadro 1Principales agentes virales, su transporte y sobrevida

Virus Medio de Tiempo das/Temperatura C % de transporte recuperacin

Adenovirus Bentonita 14/ ambiente 100Coxsackievirus A9,B5 Bentonita 21/ ambiente 100CMV 2SP

(Medio chlamydia) 21/ 4 4Sorbitol 70% 3/ 4 4Medio de cultivo viral 3/ 4 1SPG 3/ 4 10

Echovirus 11 Bentonita 21/ ambiente 100HSV Leche descremada 30 / 4 25

Medio de Richards 12 / 2 10-50SPG 3/ 4 30

Influenza Bentonita 14/ ambiente 33Parainfluenza Bentonita 14/ ambiente 50Rubeola Bentonita 14/ ambiente 1VZV 2 SP 3 / 20 4

Sorbitol 70% 3 / 4 4

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deposita sobre el virus pero no sobre susombra y slo se visualiza lo que no seha cubierto con el metal. Esta tcnicano revela las estructuras internas delvirus sino su forma y dimensiones. Eluso de equipo especializado y costoso,el elevado nivel tcnico que requiere, labaja sensibilidad cuando hay un bajonmero de partculas virales y el hechode que en algunos casos la morfologaper se no es suficiente para un diagns-tico viral definitivo, hacen que estesistema sea poco usado y slo se em-plee a nivel investigativo o acadmico.La microscopa electrnica se ha utili-zado para el diagnstico del agenteNorwalk, adenovirus entricos,calicivirus, astrovirus y coronavirus enmateria fecal as como de otros viruspara los cuales no se tiene disponibili-dad de otras pruebas diagnsticas co-merciales o aquellos que no son cultiva-bles5,7.

Aislamiento viral en cultivo. Losvirus son microorganismos intracelu-lares y para evidenciarlos, se debenutilizar sistemas basados en lneas celu-lares que permitan su desarrollo. Lainvasin viral se evidencia a travs deun cambio celular o efecto citoptico(EC) y mediante pruebas complemen-tarias. Los sistemas de cultivo msutilizados son:a) Cultivos primarios. Se caracterizan

por tener varios tipos de clulas. Lamayora son de crecimiento limita-do in vitro, generalmente resisten 5a 10 subcultivos y son permisivas aun amplio rango de virus; p. e.,clulas de rin embrionario huma-no (REH).

b) Cepas de clulas diploides. Deriva-das de tejidos normales, se utilizanen la produccin de vacunas, aisla-miento viral y como sustratos paraprobar materiales txicos. Estnconstituidas por un tipo de clulasque retienen su nmero cromo-

smico diploide original; p.e., losfibroblastos de pulmn.

c) Lneas celulares. Son clulas in-mortalizadas en el laboratorio, resis-ten (n) nmero de pases y se carac-terizan por derivarse de tejidos nor-males o de tumores malignos y sehan pasado por los menos 70 vecesin vitro; p.e., clulas Vero (rin demono verde africano), LLC-MK2(rin mono rhesus) y BSC-1 (tam-bin de tejido normal de rin demono) y HeLa y HEp-2 derivadas declulas humanas malignas. stasgeneralmente tienen un nmero va-riable de cromosomas y a vecestambin son denominadas lneascelulares heteroploides. Otras lneascelulares existentes son A9(fibroblastos subcutneos de ratn),BHK21 (fibroblastos de hmster),BRL3A (epitelio de hgado de rata),GHI, GH3 (epitelio de rata), L929,LS, S180 (fibroblastos de ratn),L1210, L5178Y, P388D1 (linfocitosde ratn), MCF7 (epitelio humano),3T3-L1 (fibroblastos de ratn sui-zo), 3T3-A31 (fibroblastos de ratnBALB/c) y NRK49F (fibroblastosde rin de rata).Para los cultivos virales se utilizan

monocapas celulares adheridas al lechode un tubo, que requieren de sustratosesenciales para su mantenimiento, unasolucin amortiguadora y un pH ade-cuado, adems se deben suplementarcon suero fetal bovino, que contienemltiples factores promotores de cre-cimiento celular7,9,10. Una vez que lamonocapa se inocula con una muestrapretratada que proviene de un individuoinfectado, el virus se puede descubrirpor el desarrollo de un efecto celular ECmorfolgico degenerativo visible o stepuede aparecer despus de 3 4 das. Eltipo de EC que se observa es a menudola clave para identificar el virusinfectante, el EC puede ser de varios

tipos: la formacin de sincicios, o devesculas o inclusiones o el redon-deamiento y desprendimiento de lamonocapa celular. Hay diversas lneascelulares que se pueden utilizar en ellaboratorio de virologa, lo que dependedel virus que se quiera evidenciar. Lasque se emplean con ms frecuencia sonlas clulas Hep-2, HeLa y Vero, encuanto a clulas diploides las ms utili-zadas son las lneas de fibroblastos depulmn (MRC5) que se usan para elaislamiento de citomegalovirus (CMV).El cultivo primario ms utilizado es elrin humano embrionario (RHE) quees permisible a los virus de circulacinfrecuente como el herpes (HSV),adenovirus (ADV), enterovirus, virussincicial respiratorio (RSV) etc. (Cua-dro 3. Lneas celulares y EC produci-dos). Aunque el aislamiento viral es unabuena tcnica para el diagnstico deinfecciones virales asintomticas, cr-nicas y recurrentes, su eficacia depen-de del momento en que se tome lamuestra, del transporte ptimo y rpidode las muestras; adems que se debeescoger el tipo de clulas que seanpermisivas para el virus que se va ademostrar.

Existen otros mtodos para descu-brir y caracterizar un virus en cultivocelular cuando todava no se produce elEC, o ste no es evidente o en los casosen que el virus se debe reconocer porotras propiedades o caractersticas encultivo. Dentro de las tcnicas que ayu-dan a identificar estas propiedades viralesestn:

La hemadsorcin. Consiste en quecuando el virus infectante incorporaprotenas virales con propiedad dehemaglutininas en la membrana celular,las clulas infectadas se pueden descu-brir por la adsorcin de eritrocitos deciertas especies animales, que se puedeobservar al microscopio de luz5,8. Es elcaso de los ortomixovirus y parami-

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Cuadro 2Indicaciones de toma de muestra, tcnica diagnstica y transporte

en las principales entidades virales Entidad Tipo de muestra y tcnica diagnstica Transporte

1. Infeccin respiratoria a. Cultivo viral e identificacinde antgenoAspirado nasofarngeo En medio de cultivo EMEM

Pneumona (RSV, CMV, Aspirado nasal o solucin de Hanks coninfluenza, parainfluenza) Lavado farngeo 0.5%

suero bovino, refrigera-Lavado broncoalveolar do hasta el momento de la

inoculacin

b. Identificacin de anticuerposSangre (suero) Tubo seco para serologa.

(inhibicin de la hemagluti-nacin)

2. Sistema nervioso a. Cultivo viralmeningitis (enterovirus) Lquido cefalorraqudeo Frasco estril refrigerado

Materia fecalEscobilln rectal Culturette

(Herpes) Biopsia cerebral si es para HSV Medio de cultivo EMEM(Eagle minimal essential

medium)

b. Identificacin de anticuerposSangre (suero) Tubo seco (ELISA)

3. Miocarditis Cultivo viralMateria fecalLquido pericrdico Frasco estril refrigerado

4. Exantema a. Cultivo viral(sarampin) Escobilln farngeo Culturette o Virocult

(sistemas de combinacinescobilln y medio de trans-porte) o tubo estril consolucin salina

b. Identificacin de anticuerposSangre (suero) Tubo seco (neutralizacin

ELISA)

5. Erupciones vesicu- a. Cultivo virallares (Herpesvirus: Lquido vesicular Debe tomarse el lquido envaricela, herpes) jeringuilla y enviarse refri-

geradoRaspado de las lesiones Tomar con escobilln en

culturette.b. Identificacin de anticuerposSangre (suero) Tubo seco (ELISA)

6. Infecciones por CMV Cultivo viral y demostracinInmunosuprimidos de antgeno(neonatos, adultos) Orina Frasco estril refrigerado a

4 CSangre Muestra con anticoagulante(capa gruesa de blancos) refrigerada a 4C

7. Dengue Sangre Tubo seco para serologa8. Rubola Suero agudo ( primeros 5 das) (ELISA) para dengue y9. Polio Suero convaleciente (8-15 das) rubola. Neutralizacin

para polio

xovirus que se pueden reconocer por lahemadsorcin de eritrocitos de cobayoa las clulas; la identificacin se confir-ma con la inmunofluorescencia directamediante anticuerpos especficos (Fi-gura 1).

Pruebas para la demostracindirecta del antgeno

Mediante esta tcnica se puedendescubrir antgenos virales circulanteso los que se encuentran en los tejidos delhusped. La sensibilidad de estas prue-bas depende de la cantidad de antgenopresente y su especificidad depende dela calidad de los antisueros disponiblespara este efecto. Estas pruebas permi-ten una demostracin rpida y son muyprcticas para el diagnstico, pues loscultivos virales requieren de una infra-estructura adecuada y personal entre-nado y slo se pueden realizar en cen-tros de docencia o de investigacin.Adems, los resultados del cultivo viralrequieren por lo menos hasta 8 das.Las tcnicas ms utilizadas para el des-cubrimiento directo de antgeno son:

Aglutinacin de ltex. Las partcu-las de ltex son esferas de poliestirenoque se unen fcilmente al fragmentocristalizable (Fc) de molculas deinmunoglobulina G (IgG) o inmuno-globulina M (IgM), esta ltima es mu-cho ms eficiente en aglutinar partcu-las naturales. Los fragmentos de unindel anticuerpo (FAb) quedan expuestosy son capaces de unirse al antgeno quese encuentra en la muestra. Cuando losantgenos tienen varios eptopes (o es-tructuras antignicas repetitivas), losanticuerpos multivalentes acoplados amltiples partculas de ltex se unen alantgeno y se produce un entramado delas partculas de ltex que dan comoresultado una aglutinacin visible. Estatcnica se aplica ampliamente en ellaboratorio de microbiologa, porque esfcil de realizar, requiere slo unosminutos y no necesita equipo, pues se

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lee a simple vista. Sin embargo, ofrececomo desventaja la presencia de reac-ciones cruzadas sobre todo con otrosantgenos en la muestra y tambin ocu-

mente para la demostracin de antgenosde rotavirus en materias fecales11,12.

Inmunofluorescencia directa (IFA).La demostracin de antgeno se hacemediante la utilizacin de un anticuerpomarcado con un fluorocromo (conju-gado) que es especfico para el antgenoque se ha de descubrir. Este procesoimplica la preparacin de un extendidoen placa de la muestra, del tejido o deuna monocapa celular inoculada con lamuestra, luego se fija, se coloca elconjugado con fluorescena y despusde una incubacin y un lavado, la placase observa en el microscopio de fluo-rescencia. La IFA ha tenido gran aplica-cin y se usa con frecuencia para eldiagnstico de infecciones virales deltracto respiratorio en nios. La mues-tra, que puede ser un aspirado nasal, seconcentra mediante centrifugacin y sehacen placas que se fijan y se pruebancon el antisuero para el virus por descu-brir1,8,13. Esta tcnica se sigue para eldiagnstico del virus de influenza, elRSV, paperas, sarampin, coronavirus,ADV, HSV y CMV1,5,6. Particularmentepara RSV y sarampin tiene una sensi-bilidad mayor que el cultivo viral. LaIFA tambin es til para confirmar loshallazgos de cultivo viral y la combina-cin de estos dos mtodos mejora eldiagnstico7. Este mtodo es fcilmen-te aplicable en tejidos que se puedencolocar sobre una placa a manera dehuella y a partir de sta aplicar la tcni-ca; un ejemplo es el caso de biopsias decerebro para el diagnstico de encefali-tis por herpes simplex y para rabia encerebros de animales. Esta tcnica seha desarrollado para el diagnstico deCMV (Shell vial)7,9 que se basa en elcultivo viral combinado con tincin deanticuerpos por IFA donde la positividadal segundo da es de 52% mientras quecon el cultivo solamente es 2%; aloctavo da con el mtodo combinado lapositividad aumenta a 85% comparada

Figura 1. Tcnica de hemadsorcin

rren interferencias por el fenmeno deprozona, en el que un exceso deanticuerpos no permite la formacin delentramado. Esta tcnica se usa comn-

Cuadro 3Principales cultivos celulares, virus aislados y efecto citoptico producido

Tipo de clulas Fuente y tipo Virus aislados Efecto citoptico

Rin embrionario Rin humano Adenovirus Redondeamiento des-humano primario Enterovirus prendimiento, formacin

Herpes de agregados celularesgranulaciones citopls-micas refrctiles, abom-bamiento, degeneracinltica

InfluenzaParainfluenza

Hela Humano Virus sincitial Formacin de sincitiorespiratorio

Continua Herpes Formacin agregadosAdenovirus Redondeamiento celular

Hep 2 Humano Virus sincitialrespiratorio

Continua Adenovirus

Rin de mono verde Rin mono Rubola No presenta ECPafricano primario

MDCK Rin perro Infuenzacontinua Herpes

Parainfluenza

LLC-MK2 Rin mono Parainfluenza No presenta ECPcontinua Enterovirus Hinchazn y redondea-

miento celular

Fibroblastos de pulmn Humano Citomegalovirus Redondeamiento, hin-diploide chamiento, grnulos

caf refrctilesRhinovirus Similar a enterovirusVirus sincitialrespiratorioEnterovirusVaricela Zoster Similar a CMV sin

grnulos refrtiles

Linfocitos sangre Humano VIHperifrica primario

Clula con hemaglutininas virales Hemadsorcin

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con el cultivo donde slo alcanza 27%.Este aumento de la positividad se atri-buye a la IFA; su eficiencia evidenteamerita su empleo14-16.

Inmunoensayos: Ensayos de captu-ra del antgeno (sandwich), inmunocro-matografa. Son inmunoensayos en faseslida donde se fijan los anticuerposespecficos para el virus en la superficiede una matriz, tubo o microplaca yluego se pone en presencia del suero omuestra que contiene el antgeno que sequiere demostrar; una vez ocurre lareaccin antgeno-anticuerpo, se haceun lavado y se agrega un anticuerpomarcado, que depende de la marcacindel anticuerpo. La prueba se denominaradioinmunoensayo (RIA) o inmuno-ensayo ligado a enzimas (ELISA o EIA)dependiendo del trazador que se utilicepara evidenciar la reaccin. Se denomi-na RIA cuando el anticuerpo se marcacon un istopo radioactivo, el ms uti-lizado es el yodo-125, el anticuerpo quereacciona a manera de sandwich, sepega a los eptopes del antgeno que hanquedado expuestos; despus de varioslavados, se mide o cuantifica la radioac-tividad mediante un contador de cente-lleo. El nmero de destellos por minutoes directamente proporcional a la con-centracin del antgeno que reacciona yde acuerdo con una serie de estndaresde concentracin conocida, se realizauna curva y se extrapolan los valores dela muestra. En la tcnica ELISA elanticuerpo se marca con una enzimaque puede ser la fosfatasa alcalina (FA)o la peroxidasa de rbano (PR) y pararevelar la reaccin se coloca el sustratoespecfico para la enzima que es modi-ficado por sta y produce un compues-to coloreado. En el caso de la FA elsustrato es el paranitrofenilfosfato ypara la PR es el perxido de hidrgenoen una solucin de ortofenilendiamina(OPD) que hace visible la reaccin.Para la cuantificacin se mide la absor-

Ensayos de hibridizacin:Hibridizacin con sondas. Los re-

cientes avances en el campo de la bio-loga molecular y el conocimiento cadavez mayor de los virus que causaninfecciones importantes en la comuni-dad, han hecho posible que en el mo-mento se disponga de fragmentos deADN del material genmico especficoy altamente conservado de un determi-nado virus que se utiliza como sonda.sta frente a sus secuencias comple-mentarias se hibridiza para formar unamolcula dplex. Esta tcnica se puedeaplicar ya sea para confirmar la identi-ficacin de un virus en cultivo o descu-brirlo directamente en una muestra. Sepueden utilizar clulas o tejidos fijadoscon sustancias que conserven la mor-fologa celular y la integridad del ADNo ARN. Para estudios de ARN se re-quieren tejidos frescos congelados r-pidamente con nitrgeno lquido y paraestudios de ADN se pueden empleartanto tejidos fijados como congelados.Las sondas preparadas a partir del ADNo ARN especfico se pueden purificarpor clonacin o copia en un plsmidodel ADN o del ADNc (complementario)obtenido de transcripciones de ARN.Utilizando el plsmido como vector ybacterias como huspedes, es posible

bancia en una longitud de onda determi-nada en un espectrofotmetro. Laabsorbancia ser directamente propor-cional a la cantidad de antgeno descu-bierto. Estas tcnicas se utilizan amplia-mente en el diagnstico de hepatitis A yB, rotavirus, el agente Norwalk, ADV,el RSV, parainfluenza, influenza A yB1,5,7. Para la hepatitis B la demostracinde antgeno de superficie diagnstica lainfeccin activa y en VIH la demostra-cin del antgeno p 24 es til en eldiagnstico de la infeccin en nios yen pacientes que se encuentran en ven-tana inmunolgica, adems es de granutilidad en el pronstico y la progresinde la infeccin as como en el control dela terapia antirretroviral.

Tcnicas de diagnsticomolecular. Comprenden las tcnicasque evidencian o descubren el materialgentico especfico viral conservado yreplicable ya sea que se encuentre en unfluido, en una clula o tejido, ya seaactivo o latente. Estas tcnicas, que sonms rpidas que las tradicionales, per-miten hacer estudios en tejidos almace-nados y se pueden clasificar en doscategoras: Ensayos de hibridizacin. Tcnicas para la amplificacin del

cido nucleico17,18.

Figura 2. Hibridizacin con sondas

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producir sondas genticas en grandescantidades. Los fragmentos de ADN oARN (sondas) se someten a un anlisisde hibridizacin (o apareamiento con elcomplementario que se encuentra en elmaterial que se va a probar); ste sepuede hacer ya sea con ADN o ARNtisular en solucin, directamente en te-jidos o clulas por hibridizacin in situ,o se puede efectuar sobre ADN o ARNtransferidos en membranas de nitroce-lulosa a partir de una electroforesis engel de agarosa. Las sondas se puedenmarcar con radioistopos (P32, I125, S35),enzimas, avidina o molculasquimioluminiscentes para que la forma-cin de las molculas dplex sea descu-bierta. Las sondas radioactivas requie-ren el empleo de autorradiografa parasu descubrimiento mientras que las son-das marcadas con enzimas se demues-tran por mtodos colorimtricos (Figu-ra 2). La sensibilidad de las sondasdepende de la cantidad de materialgentico para la hibridizacin y su espe-cificidad depende de la calidad de lasonda. Una de las principales limitacio-nes de esta tcnica se ve cuando existeuna baja cantidad de ADN o ARN y steno se descubre. Muchas de estas prue-bas tienen una sensibilidad que les per-mite descubrir 105 -106 molculas o aun103-104 molculas; sin embargo, esto

glas en ingls de polymerase chainreaction) mediante esta tcnica se pue-den encontrar cantidades mnimas deun agente infeccioso en una muestraclnica gracias a la amplificacin selec-tiva y repetitiva de una secuencia denucletidos de un microorganismo de-terminado que hace un proceso de sn-tesis de ADN. La PCR consta de trespasos: a) La desnaturalizacin del ADNen la muestra, lo que se logra al some-terlo a altas temperaturas (95C) paralograr la separacin de las cadenas, b)La hibridizacin de los cebadores (a55C) que son unos fragmentos cortosde ADN complementarios a los extre-mos 5' y 3' de las secuencias por ampli-ficar y a partir de los cuales se inicia lasntesis, stos son especficos de lasecuencia del microorganismo que hade descubrir y c) La extensin de estoscebadores por la enzima ADNpolimerasa (a 72C) termoestable (lataq polimerasa extrada de la bacteriaThermus aquaticus) que produce dosbandas de ADN que son idnticas a labanda blanco original. Estas reaccionesse llevan a cabo de una forma automa-tizada en un equipo denominadotermociclador. As, en cada ciclo deestos tres pasos, se duplica el materialgentico en un factor de 2n (donde n esel nmero de ciclos) hasta que ste seevidencia fcilmente en un gel de agarosay se confronta con una sonda especfi-ca para confirmar la identificacin finaldel material encontrado (Figura 3). Deesta manera, despus de 30 ciclos, sepuede demostrar una copia del VIHaunque se encuentre en una de cadamilln de clulas T. La PCR se utilizapara descubrir VIH, CMV, virus de lahepatitis B, papilomavirus, hantavirus,herpes 6 y 8, as como una gran varie-dad de patgenos (bacterias, parsitos,etc.)19-22. Esta prueba se puede hacerdirectamente en muestras de enfermoscon un proceso previo de extraccin de

puede ser insuficiente en muchas situa-ciones clnicas.

Actualmente se hacen esfuerzos paramejorar la especificidad de las sondas yla cintica de las reacciones dehibridizacin con el fin de reducir eltiempo para generar resultados. Estatcnica se sigue con xito para eviden-ciar la presencia de papilomavirus enbiopsias o raspados cervicales, en lademostracin in situ de cantidades pe-queas de virus de la hepatitis B, virusEpstein Barr (EBV), HSV tipo I, CMV,ADV y rotavirus. Se dispone de estu-ches comerciales de sondas para eldescubrimiento de CMV, HSV yADV5,17,18. Tambin se utilizan para iden-tificar las secuencias complementariasdel virus de hepatitis E, identificar elparvovirus B19 en suero, en leucocitos,en secreciones respiratorias, en orina ytejidos; para los virus de hepatitis A, By C tambin hay sondas disponibles. Lahibridizacin con sondas para descu-brir grmenes patgenos incluso se haautomatizado para realizar anlisis detejidos fijos en placa, pero estas tcni-cas todava no se encuentran disponi-bles en Cali.

Tcnicas de amplificacin del cidonucleico:

Reaccin en cadena de lapolimerasa. Conocida como PCR (si-

Figura 3. Reaccin en cadena de la polimerasa

Primer paso Desnaturalizacin Hibridizacin ADN Desnaturalizacin Hibridizacin ADNMezcla de reaccin y extensin duplicado y extensin duplicado

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ADN; tambin se puede realizar a partirde cultivos del microorganismo que sequiere descubrir, es relativamente rpi-da (demora entre 6 y 8 horas) y sepuede automatizar. La PCR presentauna sensibilidad y especificidad altas,pero varan segn el ensayo para el quese ha diseado5,17,18. Es una alternativacuando otras pruebas no ofrecen ma-yor sensibilidad y en entidades en lasque no hay mayor disponibilidad depruebas diagnsticas. Sin embargo,posee algunas limitaciones, como lanecesidad de cebadores especficos paraencontrar determinado microorganis-mo y por ello hay la posibilidad de falsospositivos, lo que implica un conoci-miento adecuado de la secuencia denucletidos del agente. Adems, la prue-ba se debe efectuar en condicionesadecuadas de astringencia, es decir,una temperatura, pH y concentracinde cebadores y nucletidos apropiados.Si hay fallas, pueden ocurrir amplifica-ciones inespecficas, y contaminacio-nes con ADN extrao. Esto dificulta laaplicacin de esta tcnica de rutina en ellaboratorio clnico porque exige infra-estructura y entrenamiento adecuados.Es importante tener en cuenta que unaPCR positiva no siempre indica infec-cin activa, pues demuestra materialgentico y se puede tratar de una infec-cin latente o presencia de materialgentico de un agente no infectivo; portanto su interpretacin se hace en elcontexto clnico de la persona. Un ejem-plo de su utilidad en la clnica es laevaluacin de HSV en el LCR en ence-falitis, donde la PCR tiene una sensibi-lidad mayor de 95% en el momento dela presentacin clnica y una especifici-dad de 100%23,24. La PCR ha sido devalor diagnstico considerable en des-cubrir portadores del virus de hepatitisB; mediante esta tcnica se demuestrala presencia del genoma del virus ensecreciones lacrimales de 50% de los

portadores incluso los asintomticos,lo que es importante frente al auge delos transplantes de tejidos oculares.Adems, es de utilidad en el diagnsticode virus mutantes de la hepatitis B queno expresan antgeno e (HBe) asociadocon ADN viral circulante y que soncausa frecuente de hepatitis aguda ymortal. En la hepatitis C se dice que losresultados obtenidos con PCR (RT-PCR transcripcin previa del ARN aADN) son superiores a la pruebaserolgica de demostracin deanticuerpos. En el caso de infeccinpor CMV es importante para encontrarinfecciones subclnicas o que no hansido descubiertas por otros mtodos, loque es de inters en el caso detransplantes y en individuos VIH posi-tivos en los que se debe iniciar la profi-laxis antes que la infeccin comience.Para infecciones por enterovirus la PCRfue la tcnica ms sensible en el diag-nstico de estas entidades en nios5,17,18.

Una de las mayores ventajas de laPCR, es que puede evidenciar una in-feccin aunque el individuo se encuen-tre en ventana inmunolgica, lo quepermite disminuir la transmisin de es-tas infecciones, en el caso del virus dehepatitis B reduce la demostracin a 11das postinfeccin y en la hepatitis C lareduce de 59 a 25 das.

A partir de esta tcnica de PCR hayvarias modificaciones empleadas paradar mayor sensibilidad, entre ellas elsistema para demostracin colorimtricade ADN amplificado que se sigue parademostrar CMV. Este sistema empleaun cebador biotinilado para amplificarla secuencia blanco, una sonda ARNespecfica no marcada y una microplacacon estreptavidina que une una grancantidad de anticuerpos antihbridosARN-ADN y (de la sonda y el amplifi-cado); luego se desarrolla colorimtri-camente la reaccin enzimtica. La sen-sibilidad de esta tcnica es de 100%

comparada con la tradicional que utilizala electroforesis en gel de agarosa ycoloracin con bromuro de etidio quetena una sensibilidad de 79.5%; la es-pecificidad fue igual en ambas (100%),de esta forma esta variacincolorimtrica de la tcnica es rpida (4horas), objetiva, estandarizada, sensi-ble y especfica para la demostracindel producto amplificado en la PCR10.

Una de las modificaciones de la PCRpermite encontrar ARN con un pasoprevio de sntesis de una copia de ADNo cADN a partir del ARN blanco, me-diante la enzima transcriptasa reversa.As se puede hallar menos de una copiadel material gentico del virus5.

Otra modificacin de la PCR es laPCR nested o doble PCR o PCR anida-da, en la que se hacen dos amplificacio-nes sucesivas a partir del productoinicial obtenido. En otra variacin de laPCR, denominada PCR mltiplex, seutilizan una o ms secuencias blanco deADN que se amplifican simultneamen-te. Esto se usa sobre todo como controlinterno de la prueba.

Otros ensayos de amplificacin son:Reaccin en cadena de la ligasa o

LCR. Se basa en fases secuenciales deuna ligacin de dos sondas deoligonucletidos dependientes de unpatrn. El producto de la LCR es elresultado de la ligacin de los cebadoresyuxtapuestos, en este caso se utilizan 4cebadores para lograr una amplifica-cin exponencial, esta tcnica se puedeautomatizar (IMX de los laboratoriosAbbott) y su mayor empleo ha sido parael diagnstico de Mycobacterium tu-berculosis, Borrelia burgdorferi,Neisseria gonorrohoeae y N.meningitidis5,18.

Sistema QB replicasa. La QBreplicasa es una ARN polimerasa quereplica el ARN que tiene la estructuragenmica del ARN del bacterifagoQB. Una pequea secuencia blanco in-

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sertada se puede incluir en el ARNgenmico y esto permite su hibridizacincon una secuencia blanco especfica.La QB replicasa, amplificar la sondamil millones de veces, para que luegosea descubierta. Este mtodo es rpido,altamente sensible y cuantitativo; sinembargo, todava presenta problemasde inespecificidad.

ADN ramificado (branched) obADN. Es un sistema de amplificacin,donde lo que se amplifica es la seal enlugar del blanco de cido nucleico, estose hace mediante pasos sucesivos dehibridizacin. El cido nucleico viral secaptura por hibridizacin, con unoligonucletido unido a una fase sliday una segunda sonda especfica para elvirus que contiene a su vez una sondapara el bADN amplificador. Este bADNtiene mltiples cadenas ramificadas amanera de rbol y cada una de estasramas es un sitio de hibridizacin conuna sonda marcada con una enzima,

que reacciona con un sustrato que per-mite la demostracin colorimtrica oquimioluminiscente. Esta prueba se haaplicado para el diagnstico de HCV,VIH, CMV y hepatitis. Tambin sirvepara monitorear los niveles de ARN deHCV y VIH durante y despus del trata-miento5.

Otras tcnicas de amplificacin des-critas son el 3 SR y el SDA. Sin embar-go su empleo es slo a nivelinvestigativo17.

Ensayo de transcritptasa reversa.Es una prueba aplicada a los retrovirusque pueden ser descubiertos por laactividad de ADN polimerasa depen-diente de ARN que se halla en loscultivos de linfocitos. Adems, los en-sayos de transcripcin de ARN a ADNse utilizan en combinacin con la PCRen el caso de virus con ARN y sondenominados RT-PCR. Ejemplo, parademostrar el genoma de virus como elVIH, VHC5.

TCNICAS INDIRECTAS PARAEL DESCUBRIMIENTO VIRAL

Estas son las tcnicas serolgicastradicionales para descubrir anticuerposcontra determinado agente viral, te-niendo en cuenta que la exposicin alagente produce una respuesta por partedel sistema inmune que genera la pro-duccin de anticuerpos especficos.Estos ensayos se pueden clasificar entres grupos con base en la cuantificacinde la reaccin antgeno-anticuerpo.a. Los que dependen de la capacidad

del anticuerpo que se une al antgenopara ejercer alguna funcin no rela-cionada con el virus, por ejemplo: lafijacin del complemento (FC),hemaglutinacin indirecta (HI), aglu-tinacin por ltex.

b. Los que miden la capacidad de losanticuerpos para bloquear la fun-cin viral especfica como la neutra-lizacin, la inhibicin de lahemaglutinacin (IH), la inhibicinde la neuraminidasa (que mide lacapacidad de los anticuerpos parabloquear la infectividad viral), lahemaglutinacin viral y la actividadde neuraminidasa.

c. Los que miden directamente lainteraccin antgeno-anticuerpocomo por ejemplo: la IFA indirecta,el RIA, ELISA y el Western blot1,5. Tcnicas indirectas tipo a:Fijacin de complemento. La FC es

un proceso de dos pasos, esta tcnicaemplea el complemento para lisar loseritrocitos que, a su vez, funcionancomo indicadores. Durante el primerpaso, el antgeno reacciona con el anti-cuerpo que se encuentra en la muestrade suero del paciente, en presencia decomplemento (casi siempre de suero deconejo) titulado previamente. Si elantgeno y el anticuerpo reaccionan, seactiva la va clsica del complemento,luego se aade el indicador constituidoFigura 4. Fijacin de complemento

Antgeno +C Anticuerpo en suero Reaccin Ag-Ac Hemolisina = No hemlisis prueba +

Antgeno +C Anticuerpo No hay reaccin Hemolisina = Hemlisis prueba - inespecfico C libre +C ue se une en suero

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por eritrocitos cubiertos con anticuerposy de esta forma, si el complemento sefija y se activa por el complejo antgenoviral-anticuerpos del paciente, loseritrocitos no se lisarn. Si durante laprimera fase no hay unin antgeno-anticuerpo el complemento permanecelibre y se une al complejo indicador yproduce la lisis de eritrocitos. Este es unsistema semicuantitativo y es una de laspruebas serolgicas tradicionales utili-zada como estndar de comparacin(gold standard) para las nuevas prue-bas comerciales5,12,25. Una de sus apli-caciones es determinar anticuerposcontra agentes de baja prevalencia comolos virus Coxsackie. Los anticuerposque fijan el complemento aparecen tar-damente comparados con los descu-biertos por otras pruebas y tienen unavida corta, lo que puede ser til paradeterminar la actividad de ciertas infec-ciones, como por ejemplo la rubola(Figura 4).

Hemaglutinacin indirecta. Loseritrocitos se pueden sensibilizar condiversos antgenos y se pueden utilizarcomo sistema indicador. As, si se des-cubren los anticuerpos, la reaccin serevelar como una hemoaglutinacinque se puede advertir fcilmente a sim-ple vista. Existe una amplia variedad deantgenos que se pueden unir a losglbulos rojos, entre ellos loscarbohidratos que se adhieren con rapi-dez, en el caso de las protenas serequiere un proceso de pretratamientocon cido tnico o con cloruro de cro-mo. Este sistema se usa para demostraranticuerpos contra toxinas como la dela difteria o del ttanos. Tambin paradescubrir anticuerpos contra el virus defiebre amarilla, VZV, influenza,parainfluenza y dengue1,5,12,26.

Aglutinacin de ltex. Es similar a latcnica de ltex ya descrita slo que eneste caso el antgeno se encuentra fijo ala partcula de ltex y, por tanto, se

espera descubrir los anticuerpos que seencuentran en la muestra. Estos ensa-yos generalmente son pruebas de filtro(tamizaje) pues slo determinan la pre-sencia o no de anticuerpos. Los resul-tados se pueden interpretar como in-mune (si es positivo) o susceptible(si es negativo), como en el caso dedeterminar el estado inmune para elvirus de la rubola. La informacin quesuministra corresponde a exposicin alagente o infeccin pasada y aunque,como se ha afirmado, la IgM es unaaglutinina muy buena, generalmente laspruebas de ltex no son especficaspara sta. En virologa se utiliza conms frecuencia la tcnica de aglutina-cin de ltex directa27,28.

Tcnicas indirectas tipo bNeutralizacin viral. Demuestra

anticuerpos por su efecto inhibitorio enla infectividad viral. Este ensayo midefunciones virales especficas, por loque es bastante selectivo, de esta formala neutralizacin viral slo mide

anticuerpos para antgenos especficossobre la superficie viral. Si losanticuerpos se encuentran en el suerodel paciente que se pone a incubar conuna suspensin del virus, los anticuerposreaccionarn con los antgenos virales,y cuando la suspensin se ponga enpresencia de las clulas permisivas alvirus (en cultivo celular) el resultadoser la neutralizacin de la invasincelular y la no evidencia del EC. En casode no existir anticuerpos en el suero depaciente, se producir la invasin celu-lar y como consecuencia se har evi-dente el EC caracterstico. Para realizaresta prueba se debe disponer de lneascelulares adecuadas y por lo general sehace en laboratorios donde se tiene todala infraestructura para los cultivos celu-lares. Esta tcnica se ha utilizado para eldiagnstico de las infecciones por den-gue26.

Neutralizacin viralResultado positivo (Figura 5A). Re-

sultado negativo (Figura 5B)

Figura 5. Prueba de la neutralizacin

Figura 5A

Figura 5B

Partcula viral Anticuerpos Bloqueo Ac+Ag Clulas infectadas

Partcula viral Anticuerpos No hay reaccin Clulas infectadas por virus en suero libre no neutralizado

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Inhibicin de la hemaglutinacin(IH). Algunos antgenos virales tienencapacidad para aglutinar eritrocitos dediversas especies, sin embargo la pre-sencia de anticuerpos especficos en elsuero del paciente evitan la aglutinacinde los eritrocitos por tales antgenos;cuando esto ocurre se evidencia la pre-sencia de anticuerpos. Para cuantifi-carlos se hacen diversas diluciones delsuero con el fin de hacer una titulaciny determinar el nivel de anticuerpos delpaciente. Esta prueba al principio seutiliz para demostrar anticuerpos con-tra rubola y dengue, pero se ha reem-plazado por ELISA, pues la IH no puedediferenciar entre anticuerpos tipo IgM(infeccin aguda) o IgG (infeccin an-tigua), sin embargo an se utiliza parainfluenza y para otros virus menos abun-dantes que poseen actividadhemaglutinante como los arbovirus(p.e., virus de la fiebre amarilla), reovirusy algunos enterovirus (Figura 6)1,12.

Tcnicas indirectas tipo cIFA indirecta. En una placa se po-

nen las clulas infectadas con un virusdeterminado, que tienen antgenos deste en su membrana, y se fijan; luegose agrega el suero del paciente y des-pus de una incubacin, si hayanticuerpos en el suero, se forma uncomplejo antgeno-anticuerpo, que serevela por medio de un conjugado fluo-rescente. Cuando existen los anticuerpos

descubrir anticuerpos contra rubola,VIH, CMV y HSV1,6,12,19,26,29. Sin embar-go, recientemente ELISA la ha despla-zado porque ofrece una especificidadsimilar y se puede leer mediante equiposautomatizados lo que elimina la subjeti-vidad inherente al observador en IFA yla necesidad del microscopio de fluo-rescencia.

ELISA. La prueba ELISA indirectatiene un principio semejante al de laELISA directa, slo que en este caso,un antgeno especfico est unido a unafase slida que puede ser un tubo,microplaca o perlas de vidrio; luego seaade el suero del paciente que poseelos anticuerpos y despus se adiciona elconjugado constituido por un anti-anti-cuerpo IgG o IgM unido a una enzima;posteriormente se adiciona el sustratoespecfico para la enzima, que lo va amodificar y produce un compuestocoloreado, cuya intensidad es propor-cional a la concentracin de anticuerpoen el suero del paciente. Esta prueba seutiliza ampliamente; ms an, con eladvenimiento y la disponibilidad de lossistemas automatizados se puede efec-tuar en un perodo de 1 a 2 horas.Mediante esta tcnica se pueden sealarniveles de IgM e IgG con ensayos porseparado para evitar los falsos positivosy negativos. Su utilidad en virologa esbsicamente para determinar anticuer-pos contra antgenos especficos deldengue, HSV, VIH, RSV, CMV, rubola,hepatitis A, B y C principalmente, y eninfecciones por EBV se usa para de-mostrar marcadores serolgicostempranos de la infeccin, que se pue-den utilizar en el manejo de huspedesinmunocomprometidos1,5,12,18,19,30. Suespecificidad depende del antgeno quese utilice en la fase slida; de acuerdocon esto la prueba puede ser:a. De primera generacin que son prue-

bas incipientes donde se utilizanantgenos crudos sin mayores pro-

en el suero problema y se aade elconjugado fluorescente (anti IgG, IgA,IgM) ocurre una segunda reaccinantgeno-anticuerpo, que origina unpatrn especfico de fluorescencia se-gn los anticuerpos que reaccionen conel sustrato. Este patrn slo se podrobservar en un microscopio de fluores-cencia. Las caractersticas del patrndependen de los antgenos reconocidospor el anticuerpo ya sea intracito-plasmticos o intranucleares. Este con-jugado reacciona con anticuerpos deltipo IgM, IgG e IgA, pero cuando senecesita descubrir la fase aguda de lainfeccin, el conjugado debe ser espe-cfico para las cadenas pesadas de laIgM. No obstante, es posible que hayafalsos positivos debido a diversos fac-tores, entre otros la presencia del factorreumatoide y de anticuerpos hete-rotpicos entre virus de la familia Her-pes-viridae, pues pacientes infectadoscon EBV o el virus varicela-zster pue-den mostrar anticuerpos IgM para CMVsin que haya infeccin por este virus.Las pruebas para IgM tambin puedetener falsos negativos, si la IgG inhibeo compite con la IgM por los sitios deunin al antgeno. Aunque la especifici-dad de la inmunofluorescencia es muybuena y depende del sustrato utilizado,la sensibilidad depende del nivel de fluo-rescencia demostrable por el ojo huma-no. Esta tcnica se ha utilizado para

Figura 6. Inhibicin de la hemaglutinacin

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cesos de purificacin, como p.e., elvirus completo inactivado, es el casode las primeras tcnicas de ELISApara VIH. Sin embargo, estos ensa-yos presentaban como resultadomuchas reacciones inespecficas;

b. De segunda generacin, en este casolos antgenos son protenasrecombinantes, que se producenmediante ingeniera gentica en bac-terias y son sometidas a procesos depurificacin lo que da ms especifi-cidad a la prueba pues se descubrenanticuerpos particulares contra lasprotenas consideradas msinmunognicas;

c. De tercera generacin, que son lasms utilizadas actualmente y las msespecficas, donde se empleanpptidos sintticos (fabricados enun sintetizador en el laboratorio) consecuencias ms especficas del vi-rus: tal es el caso de las pruebasdiseadas para determinar sloanticuerpos contra VIH2 y VIH1.En otra modalidad de ELISA se usa

el sistema biotina/avidina-estreptavidina,mtodo que se fundamenta en sistemascon distintos marcadores unidos a labiotina y demostrados por reaccionesenzimticas, de color o quimiolu-miniscentes que portan la avidina, laestreptavidina o la biotina. La biotinaligada a un anticuerpo, nucletidos,protena o lecitina, se une a una molcu-la blanco que puede ser anticuerpo (in-

directa) o antgeno (directa), la avidinao estreptavidina se marcan con unamolcula demostrable como una enzi-ma, una sustancia fluorescente o unmetal. La avidina o la estreptavidinamarcada se unen a la biotina y de estaforma se descubre la molcula blan-co11.

Hay otras modalidades de ELISA,que son pruebas rpidas que se puedenobservar visualmente y se utilizan enlaboratorios rurales o de primer nivel;son las ELISA de cartucho donde losantgenos se encuentran inmovilizadossobre una membrana de nitrocelulosaen un cartucho, se adiciona el suero y sefiltra a travs de una membrana, se haceun lavado y se usa un anticuerpo mar-cado especfico para la inmunoglobulinaque se quiere demostrar; despus de unlavado se aplica el sustrato. Un resulta-do positivo se observa porque se pro-duce un compuesto coloreado a manerade mancha (dot blot) donde se encuen-tra el antgeno inmovilizado. Esta prue-ba se puede hacer en 10 minutos y seutiliza sobre todo para determinaranticuerpos contra VIH. Sin embargo,ante resultados de difcil interpretacinse recurre a la ELISA de tercera gene-racin y a las pruebas confirmatorias.

Inmunoblot o Western blot. A partirde una extracto viral se hace unaelectroforesis de protenas en un gel depoliacrilamida, lo que permite la separa-cin de las protenas virales de acuerdo

con su peso molecular, y mediante unsistema de transferencia, se fijan a unamembrana de nitrocelulosa. Esta mem-brana que luce un mapa de protenas, secorta en tiras delgadas verticales y cadauna de ellas quedar con un perfil deprotenas, despus se pone a reaccio-nar el suero del paciente donde se en-cuentran los anticuerpos especficospara las protenas virales que se hallanen la membrana y despus de un lavado,se aplica el conjugado que es unantianticuerpo marcado con peroxidasade rbano, se incuba, se lava y poste-riormente se adiciona el sustratoenzimtico. Una reaccin de uninantgeno y anticuerpo se observarcomo una banda de color caf que haceevidente la unin de los anticuerpos quereaccionaron con la protena que migren ese sitio. Al comparar con un controlse ubica y se determina el tipo de pro-tena para la cual hay antgenos espec-ficos; de esta forma se puede definirexactamente contra cules protenasestn dirigidos los anticuerpos del pa-ciente y asimismo determinar la fase dela infeccin en que se encuentra. Estaprueba es muy especfica y se utilizacomo suplementaria y confir-matoriaen infeccin por el VIH o HTLV-Icuando ELISA da resultados contradic-torios o difciles de interpretar. Tam-bin se utiliza para diferenciar entreinfeccin por VIH1 y VIH2. En estosmomentos se emplea en muchos labo-

Figura 7. Western blot o inmunoblot

Electroforesis de protenas Anticuerpos Anti anticuerpos Sustrato Reaccin Ag-Ac *Conj Visualizacin de la transferidas a nitrocelulosa (suero) + peroxidasa reaccin

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dica

Cuadro 4Pruebas para el diagnstico viral

Caracteristicas Examen directo Cultivo viral F. de complemento Hemaglutinacin Neutralizacin

Tiempo de realizacin 1-2 horas 4-8 das o semanas 1 da Varias horas Varias horasGrado de complejidad Bajo Alto Alto Medio Medio

Es una tincin No automatizada No automatizadaQu encuentra? Efectos celulares El virus permisible Anticuerpos Anticuerpos Anticuerpos

producidos por el virus al cultivo celular contra el virus contra el virus contra el virusSensibilidad Depende de la preparacin Buena, relativa a la muestra Buena Buena Buenatincin y el observador

Puede ser bajaEspecificidad Relativa Excelente Buena Buena BuenaLimitaciones Subjetiva Necesita cultivos celulares Es dispendiosa, No diferencia No diferencia

entrenamiento, infraestructura requiere muchos tipos de anticuerpos IgM de IgG. Requierecontroles de reactivos IgM e IgG cultivo celular

Caractersticas Inhibicin de la Aglutinacin de Inmunofluorescencia ELISA- RIA Western blothemaglutinacin ltex

Tiempo de realizacin Varias horas Unos minutos 2-6 horas 1-4 horas 1 daGrado de complejidad Medio Bajo. No necesita Medio Bajo Medio

No automatizado equipo ni entrenamiento Automatizada No automatizadaespecial Permite manejo de

gran volumen de muestrasQu encuentra? Anticuerpos contra virus Antgenos o anticuerpos Antgenos o anticuerpos Antgenos o anticuerpos Antgenos especficosAnticuerposSensibilidad Buena Buena. Buena. Es alta cuando se Muy buena Buena

combina con el cultivo(IF directa)

Especificidad Buena Buena Excelente Muy buena, depende ExcelenteSe visualiza el sustrato del tipo de generacin del

ELISA.Limitaciones No diferencia Reacciones cruzadas Subjetiva, produce ELISA directa: la baja Puede dar

IgM e IgG y fenmeno prozona fatiga ocular, necesita concentracin de antgeno resultadosmicroscopio de inmuno- disminuye la sensibilidad. inconcluyentes

fluorescencia. Falsos + RIA: uso de istopos cuando el ttulopor factor reumatoideo radioactivos. de anticuerpos es

bajo

Caractersticas Hibridizacin con sondas Hibridizacin in situ Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Tiempo de realizacin 2- 4 horas Varios das 4-8 horasGrado de complejidad Alto Alto Media automatizada

Puede automatizarse Requiere entrenamiento adecuadoQu encuentra? ADN- ARN viral ADN-ARN viral ADN-ARN viral

Sensibilidad Buena-relativa Buena ExcelenteEspecificidad Excelente Excelente Excelente-relativaLimitaciones La sensibilidad depende Alto costo La sensibilidad y especificidad

de la concentracin de ADN o varia segn el caso y dependeARN presente en la muestra. del apareamiento de los cebadoresLos costos son altos Necesita condiciones estrictas de

astringencia. Alto costo

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ratorios clnicos y de referencia27,30,31(Figura 7).

PRUEBAS DESUSCEPTIBILIDAD VIRAL

El desarrollo de resistencia clnica alos agentes antivirales, se ha documen-tado en varios virus de importanciaclnica, que incluyen el virus de influen-za, HSV, VZV, CMV y VIH. Una de lasprincipales causas para esto es el usodiseminado y cada vez ms frecuente yrutinario de lo antivirales. Por tanto, losdatos acerca de los perfiles de suscep-tibilidad viral son importantes y tiles,tanto por razones clnicas comoepidemiolgicas. Una de las mayoresaplicaciones o en los casos donde esms evidente y necesario esto, es en lainfeccin por el VIH donde el perfil desensibilidad del virus es importante en elseguimiento y en el enfoque del manejoteraputico de la enfermedad.

Es claro que para efectuar pruebasde susceptibilidad es necesario obtenerprimero un aislamiento viral; a partir deste se pueden hacer mtodos diferen-tes para este propsito, a saber: medir lareplicacin vial en presencia de con-centraciones variables de antivirales,que incluyen la reduccin de la forma-cin de placa, hibridizacin de ADN oARN, inmunofluorescencia y ensayoscon colorantes. Adems existe la posi-bilidad de descubrir mutaciones porPCR que son responsables de la resis-tencia a ciertos agentes antivirales, unejemplo de ello es el gen de la trans-criptasa reversa del VIH asociado conresistencia a zidovudina, la timidinaquinasa o la ADN polimerasa asociadascon la resistencia al aciclovir o el genM2 del virus de influenza que se asociacon resistencia a amantadina yrimantadina.

En trminos generales las pruebaspara susceptibilidad viral no se encuen-

tran totalmente estandarizadas salvo paraVIH. Los resultados pueden dependerde factores mltiples como el tipo deprueba, la lnea celular utilizada, elinculo viral y el laboratorio donde sellevan a cabo las pruebas5.

CONCLUSIONES

Las pruebas de diagnstico viral sehan desarrollado de manera importanteen los ltimos aos, nuevas tcnicasms rpidas, simples, poco costosas,sensibles y especficas se ofrecen hoyen da, sin embargo, la evaluacin destas siempre se debe hacer con base enlos estndares de oro (como los cul-tivos y la fijacin de complemento,etc.) y de acuerdo con una adecuadacorrelacin clnica. La disponibilidadde estas pruebas se debe acompaar deuna ptima realizacin a nivel tcnico, yuna adecuada recoleccin y almacena-miento de la muestra, adems de unainterpretacin acertada. La demostra-cin directa de antgenos tiene valor enel diagnstico, pronstico y seguimien-to de la infeccin as como en el trata-miento mdico y es indicador impor-tante de infeccin activa. Sin embargo,en algunos casos la concentracin delantgeno puede no ser suficiente parasu descubrimiento. Por otro lado, ladeterminacin de anticuerpos es tilparticularmente cuando no se tiene laposibilidad de realizar una demostra-cin directa de antgeno o en caso deser negativa a pesar de la sospechaclnica o porque haya pasado la faseaguda de la infeccin. Estos casos cons-tituyen un complemento para determi-nar el diagnstico de una enfermedad.Las pruebas indirectas o de anticuerpostambin son importantes para estable-cer los antecedentes de infeccin viralen la historia clnica de un paciente y enuna comunidad y son claves en definirel modelo de diseminacin de un serotipo

determinado. Sin embargo, deben te-nerse criterios muy definidos para lainterpretacin de un ttulo de anticuerposy esto depende del tipo de la infeccin,la naturaleza del virus, la clase deanticuerpos y la condicin del husped.Para la interpretacin de los ttulos deanticuerpos se deben tener en cuentaalgunas guas:a. Los cambios en el ttulo de anti-

cuerpos slo se pueden interpretarcuando se hayan hecho con la mis-ma tcnica;

b. Debe evitarse en lo posible interpre-tar un solo ttulo alto de anticuerposcomo indicativo de infeccin activao aguda;

c. La cada de los ttulos suministrapoca informacin, slo que la infec-cin ha ocurrido pero no en qumomento;

d. Un aumento significativo en el ttulode anticuerpos en sueros pareados(agudo y convaleciente) se puedeutilizar para el diagnstico. Un sueroagudo se obtiene durante la faseaguda de la enfermedad y se debecomparar con un suero convale-ciente que se debe tomar a las dossemanas cuando la fase aguda ya seha resuelto. Una diferencia de 4ttulos es significante y puede indi-car presencia de infeccin activa;esto es lo ms indicado para el diag-nstico, pues una sola muestra desuero es muy difcil de interpretar1,3.Las pruebas moleculares son una

alternativa til en el diagnstico viral ysu desarrollo es cada vez ms amplio,sin embargo son costosas y requierenaltos niveles de entrenamiento yestandarizacin que hacen que su pues-ta en marcha en el medio nacional serealice en forma progresiva y lenta, noobstante la necesidad de tenerlas dispo-nibles.

Sin embargo, es importante recor-dar que, a pesar de la escasa disponibi-

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lidad de las pruebas ms avanzadas dediagnstico viral, la utilizacin, realiza-cin e interpretacin adecuada de losmtodos de laboratorio accesibles den-tro del contexto clnico del paciente,pueden ofrecer un ptimo diagnstico einstaurar las medidas profilcticas oteraputicas necesarias (Cuadro 4).

SUMMARY

Diagnosis in viral entities is animportant challenge due to is difficulties,particularly in developing countrieswhere, in most cases, empiricaldiagnoses and therapy are usually carriedon. However, worldwide improvementsand availability of new technologiesnow permit the study of viruses andviral diseases in many laboratories, notonly in specialized research facilities.Tradicional tests used many years agohave been replaced by simple, rapid andoften relatively inexpensive antigendetection test kits, that haverevolutionized both clinical care andlaboratory practice. The antibody testis useful to determine prevalence ofviral infection and it is important tocarry on epidemiological studies in lo-cal communities. On the other hand,molecular test have improved the abilityfor detecting viral agents and todocument an infection, the diseaseprogression and the follow up of thetherapy more conclusively. It isimportant the development of newmethodology and the implementation ofnew tests for a good viral diagnosis,also it is appropriate an adequate use ofthe available tests, in order to makemore accurate diagnoses. The aim ofthis article is to discuss the newtechnology for viral diagnosis and howand when to apply it. The review isplanned as a guide about the viraldiagnostic tools for health-care workersand students.

Key Words: Virus. Diagnosis.Viral infection.

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