Efectos diferenciales de inhibidores selectivos de la ciclooxigenasa-2 sobre los canales ionicos de clulas de Musculo liso vascular pueden explicar las diferencias en los perfiles de riesgo cardiovascular

Lioubov I. Brueggemann , Alexander R. Mackie , Bharat K. Mani , Leanne L. Cribbs , y Kenneth L. Byron Informacin Autor notas Artculo Derecho de Autor y la licencia para la informacin Abstracto Celecoxib, rofecoxib, diclofenaco y se utilizan clnicamente (COX-2) inhibidores de la ciclooxigenasa-2, que han estado bajo un intenso escrutinio debido a largo plazo rofecoxib (Vioxx; Merck, Whitehouse Station, NJ) de tratamiento se encontr a aumentar el riesgo de cardiovascular adverso eventos. Un perfil de riesgo diferenciado para estos frmacos ha surgido, pero los mecanismos subyacentes no han sido completamente aclarada. Se investigaron los efectos de celecoxib, rofecoxib, diclofenaco y en las corrientes inicas y la sealizacin del calcio en las clulas del msculo liso vascular (CMLV) utilizando tcnicas de patch-clamp y fura-2 fluorescencia y en la constriccin arterial utilizando miografa de presin. El celecoxib, pero no rofecoxib o diclofenaco, mejorados dramticamente (v 7 K) las corrientes de potasio KCNQ y suprimidas las corrientes de calcio sensibles al voltaje de tipo L en A7r5 rata clulas musculares lisas de aorta (corrientes KCNQ nativo o corrientes KCNQ5 humanos sobreexpresados) y recin aisladas mesentrica de rata miocitos arteria. Los efectos de celecoxib fueron dependiente de la concentracin en el rango de las concentraciones teraputicas, y se invirtieron en el lavado. El celecoxib, rofecoxib, pero no, tambin inhibi respuestas de calcio a la vasopresina en clulas A7R5 y las arterias mesentricas de ratas intactas o endotelio-desprovistas dilatados. Un anlogo de celecoxib, 2,5-dimetil-celecoxib, que no inhibe la COX-2, celecoxib imitaba en su mejora de las corrientes vasculares KCNQ5, la supresin de las corrientes de calcio de tipo L, y la vasodilatacin. Llegamos a la conclusin que el celecoxib inhibe respuestas de calcio en CMLV mediante la mejora de las corrientes KCNQ5 y suprimir las corrientes de calcio de tipo L, lo que reduce en ltima instancia, el tono vascular. Estos efectos son independientes de sus COX-2 acciones inhibitorias y pueden explicar el riesgo diferencial de eventos cardiovasculares en pacientes que toman diferentes frmacos de esta clase.

El celecoxib (Celebrex, de Pfizer, Nueva York, NY) y rofecoxib (Vioxx, Merck, Whitehouse Station, NJ) son medicamentos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) que inhiben selectivamente la ciclooxigenasa-2 (COX-2). Fueron introducidos al mercado en 1999 y se convirti rpidamente en los nuevos frmacos prescritos con ms frecuencia en los Estados Unidos. Estos medicamentos se utilizan clnicamente para tratar el dolor y la inflamacin. COX-1 y COX-2 convierten el cido araquidnico en prostaglandina H 2, que se convierte despus en una variedad de prostanoides, incluyendo prostaglandinas, tromboxanos, y prostaciclinas. El tromboxano A 2, un producto de la actividad COX-1 en las plaquetas, promueve la vasoconstriccin, proliferacin del msculo liso, y la agregacin plaquetaria. En contraste, la prostaciclina generada por COX-2 en las paredes de los vasos sanguneos promueve la vasodilatacin y la inhibicin de la agregacin plaquetaria. Como / agentes anti-inflamatorios analgsicos, inhibidores de la COX-2 se consideraron una mejora sobre / COX-2 inhibidores de menos selectivos de la COX-1, ya que impiden la generacin de prostaglandinas involucradas en la inflamacin y el dolor sin afectar a algunos de los efectos beneficiosos de la COX-1 prostanoides -generated. Sin embargo, estos frmacos han estado bajo intenso escrutinio desde 2004, cuando Vioxx fue retirado voluntariamente del mercado debido a un aumento en el riesgo reportado de infarto de miocardio y accidente cerebrovascular en pacientes que toman el medicamento durante perodos prolongados de tiempo ( Marnett, 2009 ).

Una revisin sistemtica de los ensayos clnicos aleatorios de inhibidores de la COX revel que rofecoxib, un agente altamente COX-2 selectivo, y diclofenaco, un AINE con COX-2 / COX-1 selectividad similar a la de celecoxib, tanto aument significativamente el riesgo de enfermedades cardiovasculares eventos ( McGettigan y Henry, 2006 ). En contraste, un nmero de estudios clnicos no han demostrado un aumento del riesgo cardiovascular con celecoxib con respecto a placebo ( McGettigan y Henry, 2006 ; White et al., 2007 ). Las razones de las diferencias entre celecoxib y otros inhibidores de la COX-2 estn siendo ampliamente debatidas.

Efectos antihipertensivos pueden dar lugar a un menor nmero de complicaciones cardiovasculares con celecoxib en comparacin con otros inhibidores de la COX-2. Meta-anlisis de los resultados de 19 ensayos clnicos con inhibidores de la COX-2 revel un riesgo significativamente menor de desarrollar hipertensin en los pacientes tratados con celecoxib en comparacin con rofecoxib ( Aw et al., 2005 ). Asimismo, un anlisis retrospectivo de las historias clnicas de los pacientes tratados con celecoxib o rofecoxib durante un perodo de 90 das, revel que, mientras que la presin arterial sistlica fue significativamente elevado despus de 90 das entre los pacientes tratados con rofecoxib, la presin arterial sistlica disminuy ligeramente entre los tratados con celecoxib- pacientes ( Cho et al., 2003 ).

Varios estudios recientes han reportado efectos vasodilatadores de celecoxib ( Hermann et al., 2003 ; Widlansky et al., 2003 ; . Klein et al, 2007 ), lo que puede explicar sus efectos diferenciales sobre la presin arterial en relacin con otros inhibidores de la COX-2 ( Hermann et al., 2003 ). En este artculo, hemos explorado los mecanismos que podran ser la base de las acciones vasodilatadoras y menor riesgo de complicaciones cardiovasculares para celecoxib, que examinan los efectos de celecoxib y otros AINE sobre los canales inicos del msculo liso vascular y funciones fisiolgicas. Hemos centrado nuestra atencin en dos tipos de canales inicos que son tal vez el ms importante para determinar el estado contrctil de las clulas del msculo liso vascular (CMLV): los canales de K + que determinan la tensin de membrana en reposo, y de tipo L voltaje de Ca 2+ canales, la activacin de los cuales induce Ca 2 + afluencia, contraccin del msculo liso, y la vasoconstriccin. Proporcionamos una clara evidencia de que ambos tipos de canales inicos estn robustamente afectados por celecoxib, pero no por rofecoxib o diclofenaco a concentraciones teraputicas comparables. Estos efectos de los canales inicos tienen importantes consecuencias funcionales para CMLV Ca 2+ de sealizacin y el tono vasomotor de las arterias de resistencia.

Materiales y mtodos

El aislamiento de los miocitos.

Todos los estudios con animales fueron aprobadas por el Comit de Animales Chicago Institucional de Cuidado y Uso de la Universidad Loyola. Ratas macho adultas Sprague-Dawley (n = 20) fueron anestesiados por inhalacin con isoflurano, y los segmentos de mesenterio intestinal se eliminaron quirrgicamente como se describe anteriormente ( Henderson y Byron, 2007 ). Mtodos para el aislamiento de las clulas del msculo liso de las arterias mesentricas (MASMCs) se describieron previamente ( Mackie et al., 2008 ). Recin MASMCs aisladas se mantuvieron en hielo hasta su uso. Las clulas fueron dispensadas sobre una base de cubreobjetos de vidrio de la cmara de registro y se dejaron adherir durante al menos 15 min a temperatura ambiente.

Cultivo celular.

Clulas A7R5 se cultivaron como se ha descrito previamente ( Byron y Taylor, 1993 ). Para los estudios de sobreexpresin KCNQ5, se subcultivaron clulas A7R5 en 50 a 70% de confluencia fueron transfectadas con una secuencia de ADN KCNQ5 humana marcado con FLAG (insertado en un pIRES2-mejorado verde fluorescente vector de la protena) usando Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con reactivo de transfeccin el protocolo del fabricante. Subculturas confluentes de clulas A7R5 se tripsinizaron y se volvieron a sembrar en cubreobjetos de vidrio. Las clulas que expresan la protena fluorescente verde se utilizaron para el registro electrofisiolgico 5 a 10 das despus de la transfeccin.

Patch Clamp.

La configuracin de parche perforado conjunto de clulas se utiliz para medir corrientes de membrana en condiciones de fijacin de voltaje. La anfotericina B (120 mg / ml) en la solucin interna se utiliza para la perforacin parche de membrana. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente con perfusin continua de solucin del bao como se ha descrito previamente ( Brueggemann et al., 2007 ; Mackie et al., 2008 ).

Los potenciales de orden de voltaje-clamp se generaron utilizando un amplificador Axopatch 200B bajo el control del software pCLAMP8 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Procedimientos para la grabacin KCNQ corrientes de K + y de tipo L de Ca 2 + corrientes fueron esencialmente como se describe anteriormente ( Brueggemann et al., 2005 , 2007 ; . Mackie et al, 2008 ). Los detalles de los protocolos de tensin y condiciones de registro se proporcionan en los materiales suplementarios.

[Ca 2 +] i Las mediciones con Fura-2.

Esencialmente como se describe anteriormente ( Mani et al., 2009 ), las monocapas confluentes de clulas A7R5 cultivadas en placas de seis pocillos se lavaron dos veces con medio de control (NaCl 135 mM, 5,9 mM KCl, 1,5 mM CaCl 2, 1,2 mM de MgCl 2, 11,5 mM de glucosa y 11,6 mM HEPES, pH 7,3) y despus se incubaron en el mismo medio con 1 mM fura-2 / acetoximetil ster (Invitrogen), 0,1% de albmina de suero bovino, y 0,02% de detergente Pluronic F127 durante 60 min a temperatura ambiente ( 22-25 C) en la oscuridad. Fura-2 fluorescencia se midi usando un lector de placa Biotek Sinergia HT (340- y 380-nm de excitacin, emisin 510 nm) (BioTek Instruments, Winooski, VT). Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente. Frecuencia de clavar se calcul como el nmero de espigas por minuto a partir del momento de inicio de la repetitiva Ca 2+ clavar. Cada "n" representa la media de pocillos por triplicado.

Miografa presin.

Los mtodos utilizados para aislado miografa presin de la arteria se han descrito anteriormente ( Henderson y Byron, 2007 ). Para algunos experimentos, despus de la diseccin de una arteria mesentrica, denudacin endotelial se realiz frotando suavemente la luz arterial con un cabello humano. Una pequea cantidad de aire (~ 0,5 ml) y despus se pas a travs del lumen de perturbar an ms el endotelio, seguido de solucin salina fisiolgica para eliminar las clulas endoteliales. Para confirmar la atenuacin de la funcin endotelial, la vasodilatacin dependiente del endotelio se evalu despus de preconstriction de las arterias con 100 pM [Arg 8] vasopresina (AVP). Tras el desarrollo de un nivel estable de constriccin, concentraciones crecientes del vasodilatador carbacol dependiente del endotelio se administraron. En las arterias intactas, carbacol 10 mM indujo 97 1,2% dilatacin (n = 7), pero en las arterias denudadas, la misma concentracin indujo significativamente menos dilatacin (49 14%, n = 6, p 3 veces) en 20 mM celecoxib ( Fig. 2 B;. Supplemental Fig 1A). El aumento de la amplitud de la corriente por KCNQ5 10 mM celecoxib no se asoci con un cambio en el voltaje de la dependencia de la activacin (Supplemental Fig. 1B). Fig. 2.

Mejora de las corrientes KCNQ en clulas A7R5 y miocitos arteria mesentrica recin aisladas. A, IV relaciones de corriente aislado KCNQ5 endgena en clulas A7R5. Control (, n = 14); Celecoxib 1 mM (crculos grises oscuros, n = 9); Celecoxib 10 mM (tringulos de color gris claro, n = 9); 20 mM celecoxib ( , N = 8). Se llev a cabo la sustraccin de fugas. B, acumulativos celecoxib dosis-respuesta: densidades de corriente KCNQ5 medidos a -20 mV se normalizaron para controlar las densidades de corriente a -20 mV. *, Una diferencia significativa del control (1 mM celecoxib, p