8/13/2019 Efectos de Crecimiento de e Coli Con Chlorine Dioxide

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APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Oct. 1982, p . 8 1 4 - 8 1 9 V o l . 4 4 , No . 40 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 2 / 1 0 0 8 1 4 - 0 6 0 2 . O O / OC o p y r i g h t 1 9 8 2 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

E f f e c t o f A n t e c e d e n t G r o w t h C o n d i t i o n s o n S e n s i t i v i t y o fE s c h e r i c h i a c o l i t o C h l o r i n e D i o x i d eJAMES D . B E R G , ' * ABDUL M A T I N , 2 AND PAUL V . ROBERTS1

C i v i l E n g i n e e r i n g D e p a r t m e n t , T e r m a n E n g i n e e r i n g C e n t e r , 1 a n d D e p a r t m e n t o f M e d i c a l M i c r o b i o l o g y ,S t a n f o r d U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e d i c i n e , 2 S t a n f o r d U n i v e r s i t y , S t a n f o r d , C a l i f o r n i a 9 4 3 0 5R e c e i v e d 2 8 D e c e m b e r 1 9 8 1 / A c c e p t e d 1 7 M a y 1 9 8 2

B a c t e r i a l r e s i s t a n c e t o i n a c t i v a t i o n b y a n t i b a c t e r i a l a g e n t s t h a t i s i n d u c e d b y t h eg r o w t h e n v i r o n m e n t w a s s t u d i e d . E s c h e r i c h i a c o l i w a s g r o w n i n b a t c h c u l t u r e a n di n a c h e m o s t a t , a n d t h e f o l l o w i n g p a r a m e t e r s w e r e v a r i e d : t y p e o f s u b s t r a t e ,g r o w t h r a t e , t e m p e r a t u r e , a n d c e l l d e n s i t y d u r i n g g r o wt h . Low d o s e s ( 0 . 7 5 m g /l i t e r ) o f c h l o r i n e d i o x i d e w e r e u s e d t o i n a c t i v a t e t h e c u l t u r e s . T h e r e s u l t sd e m o n s t r a t e d t h a t p o p u l a t i o n s g r o w n u n d e r c o n d i t i o n s t h a t m o r e c l o s e l y a p p r o x i -m a t e d n a t u r a l a q u a t i c e n v i r o n m e n t s were more r e s i s t a n t t ha n t ho s e g r o w n u n d e rc o m m o n l y e m p l o y e d b a t c h c u l t u r e c o n d i t i o n s . I n p a r t i c u l a r , b a c t e r i a g r o w n a ts u b m a x i m a l r a t e s w e r e m o r e r e s i s t a n t t h a n t h e i r c o u n t e r p a r t s g r o w n a t p L m a x . T h em o s t r e s i s t a n t p o p u l a t i o n s e n c o u n t e r e d i n t h i s s t u d y w e r e t ho s e g r o w n a t D v a l u e so f 0 . 0 2 h - 1 a n d 0 . 0 6 h - 1 a t 2 5 C . G r o w t h a t 1 5 C l e d t o g r e a t e r r e s i s t a n c e t h a n d i dg r o w t h a t 3 7 C . T h e c o n d i t i o n s t h a t p r o d u c e d r e l a t i v e l y r e s i s t a n t p h e n o t y p e s w e r em u c h c l o s e r t o t h o s e f o u n d i n m o s t n a t u r a l e n v i r o n m e n t s t h a n a r e t h e t y p i c a lc o n d i t i o n s o f b a t c h c u l t u r e m e t h o d s . T h e i m p o r t a n c e o f m a j o r p h y s i o l o g i c a lc h a n g e s t h a t c a n b e i n d u c e d b y t h e a n t e c e d e n t g r o w t h e n v i r o n m e n t i s d i s c u s s e d i nl i g h t o f t h e p o s s i b l e m o d e s o f a c t i o n o f s e v e r a l d i s i n f e c t a n t s .B a c t e r i a t h a t a r e r e s i s t a n t t o i n a c t i v a t i o n b yc h e m i c a l d i s i n f e c t i n g a g e n t s a r e c o m m o n l y e n -c o u n t e r e d i n a d i v e r s e s e t o f a q u a t i c e n v i r o n -m e n t s , i n c l u d i n g d r i n k i n g w a t e r r e s e r v o i r s a n dd i s t r i b u t i o n s y s t e m s ( 2 0 ) , e v a p o r a t i v e a i r c o n d i -t i o n e r s ( 2 1 , 2 2 ) , a n d h u m i d i f i e r s u s e d i n r e s p i r a -t o r y t h e r a p y 9 ) . T h e a p p a r e n t r e s i s t a n c e o f t h et a r g e t o r g a n i s m h a s m o s t o f t e n b e e n a t t r i b u t e di n d i r e c t l y t o p r o t e c t i o n b y p h y s i c a l m e a n s , e . g . ,a s s o c i a t i o n w i t h p a r t i c u l a t e m a t t e r ( 1 3 ) o r o c c l u -

s i o n w i t h i n a b i o l o g i c a l f i l m o n a s u r f a c e 6 ) .E q u a l l y i m p o r t a n t i s t h e g e n o t y p i c p r o v i s i o n o f ap r o t e c t i v e c a p s u l e o r s p o r e , a s w e l l a s a b i o t i cf a c t o r s s u c h a s e x t r a n e o u s c h e m i c a l d e m a n d f o rt h e d i s i n f e c t a n t . O f t e n o v e r l o o k e d , h o w e v e r , i st h e r e s i s t a n c e p r o f f e r e d b y e n v i r o n m e n t a l l y i n -d u c e d c h a n g e s i n p h e n o t y p e t h a t c a n o c c u rd u r i n g g r o w t h b e f o r e t h e d i s i n f e c t i o n p r o c e s s .T h e s e p he n o t y p i c c h a n g e s c a n b e q u i t e s i g n i f i -c a n t , p a r t i c u l a r l y d u r i n g a l a b o r a t o r y e v a l u a t i o no f a d i s i n f e c t a n t . We h a v e s h o w n , f o r e x a m p l e ,t h a t a f e c a l i s o l a t e o f E s c h e r i c h i a c o l i g r o w n i nb a t c h c u l t u r e w i t h n u t r i e n t b r o t h i s o r d e r s o fm a g n i t u d e m o r e s e n s i t i v e t o c h l o r i n e a n d c h l o -r i n e d i o x i d e t h a n a r e i n s i t u w a s t e w a t e r - g r o w nc o l i f o r m s 1 ) . O t h e r s t u d i e s ( 4 , 5 , 7 ) , i n c l u d i n g as t u d y b y M i l b a u e r a n d G r o s s o w i c z i n 1 9 5 9 ( 1 8 ) ,a l s o c o r r o b o r a t e t h e v i e w t h a t a n t e c e d e n tg r o w t h c o n d i t i o n s g r e a t l y i n f l u e n c e t h e s e n s i t i v -i t y o f a n o r g a n i s m t o a v a r i e t y o f d i s i n f e c t a n t s .

P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a a n d a t y p i c a l m y c o -b a c t e r i a w e r e s h o w n b y C a r s o n e t a l . ( 4 , 5 ) t o b ec a p a b l e o f g r o w t h i n d e i o n i z e d w a t e r . T h e o r g a -n i s m s g r o w n i n t h a t e n v i r o n m e n t p o s s e s s e dm a r k e d l y g r e a t e r r e s i s t a n c e t o c h l o r i n e d i o x i d et h a n d i d t h o s e g r o w n o n T r y p t i c a s e s o y a g a rBBL M i c r o b i o l o g y S y s t e m s ) . S i m i l a r l y , i n as t u d y b y F a v e r o a n d D r a k e ( 7 ) , s w i m m i n g p o o lw a t e r i s o l a t e s g r o w n i n p o o l w a t e r d e m o n -s t r a t e d m u c h g r e a t e r r e s i s t a n c e t o i o d i n e t h a nd i d t h e i r c o u n t e r p a r t s g r o w n o n T r y p t i c a s e s o ya g a r .T h e o b j e c t i v e o f t h e p r e s e n t s t u d y w a s t oi n v e s t i g a t e d i f f e r e n c e s i n s e n s i t i v i t y a t t r i b u t a b l et o t h e a n t e c e d e n t g r o w t h e n v i r o n m e n t . P a r t i c u -l a r l y , we c o n t r a s t e d t h o s e e n v i r o n m e n t a l p a r a m -e t e r s w h i c h a r e r o u t i n e l y e m p l o y e d i n l a b o r a t o r ys t u d i e s w i t h g e n e r a l a m b i e n t a q u a t i c c o n d i t i o n s .F o r e x a m p l e , t h e o p t i m u m g r o w t h t e m p e r a t u r eo f 3 7 C i s o f t e n u s e d t o c u l t u r e e n t e r i c b a c t e r i ai n t h e l a b o r a t o r y , w h e r e a s i n n a t u r e e n t e r i cb a c t e r i a a r e c a p a b l e o f g r o w t h a t a t e m p e r a t u r ea s l o w a s 1 5 C i n w a t e r r e s e r v o i r s ( 2 0 ) . A l s o , t h eg r o w t h r a t e s , u ) e n c o u n t e r e d i n n a t u r a l a q u a t i ce n v i r o n m e n t s a r e o f t e n a s l o w a s 0 . 0 1 h - 1 , a ss h o w n b y J a n n a s c h ( 1 4 ) a n d B r o c k ( 3 ) . Weh y p o t h e s i z e d t h a t s u c h d i f f e r e n c e s i n g r o w t ht e m p e r a t u r e a n d r a t e may a f f e c t i m p o r t a n t l y t h es e n s i t i v i t y o f o r g a n i s m s t o d i s i n f e c t a n t s . T h e r e -f o r e , we c o m p a r e d t h e s e n s i t i v i t y t o d i s i n f e c t i o n

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8/13/2019 Efectos de Crecimiento de e Coli Con Chlorine Dioxide

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SENSITIVITY OF E . COLI T O C HLO RINE DIOXIDE 8 1 5o f c u l t u r e s g r o w n a t s u b m a x i m a l r a t e s a n d s u b -o p t i m a l t e m p e r a t u r e s w i t h t h a t o f c o n v e n t i o n a lb a t c h c u l t u r e s i n w h i c h l L m a , w a s a t t a i n e d .I n t h i s s t u d y t h e c h e m o s t a t w a s e m p l o y e d t oa t t a i n n u t r i e n t - l i m i t e d g r o w t h w h i l e a n o t h e r a s -p e c t o f t h e g r o w t h e n v i r o n m e n t , e . g . , t e m p e r a -t u r e , w a s m a n i p u l a t e d s e p a r a t e l y . M a n i p u l a -t i o n s s u c h a s c h a n g i n g t h e s p e c i f i c g r o w t h r a t eh a v e b e e n s h o w n b y M a t i n ( 1 6 ) a n d o t h e r s ( 1 7 ,1 9 ) t o h a v e i m p o r t a n t e f f e c t s o n t h e p h y s i o l o g yo f b a c t e r i a l c e l l s . T h e s e i n c l u d e a l t e r a t i o n s i nt h e c e l l s u r f a c e - t o - v o l u m e r a t i o a n d i n t h e l e v e l so f s p e c i f i c e n z y m e a c t i v i t y . T h e r e f o r e , t h e s ea n d o t h e r p h e n o t y p i c c h a r a c t e r i s t i c s t h a t maya f f e c t i m p o r t a n t t a r g e t s i t e s f o r d i s i n f e c t a n t smay b e a l t e r e d b y c h a n g e s i n g r o w t h c o n d i t i o n s ,c o n f e r r i n g a c h a n g e i n s e n s i t i v i t y a s a f u n c t i o n o ft h e a n t e c e d e n t g r o w t h e n v i r o n m e n t .

MATERIALS AND METHODSO r g a n i s m . f e c a l i s o l a t e o f E . c o l i w a s o b t a i n e df r o m p r i m a r y e f f l u e n t o f t h e P a l o A l t o W a s t e w a t e rT r e a t m e n t F a c i l i t y b y b e i n g g r o w n o n EMB a g a r( D i f c o L a b o r a t o r i e s ) . T h e i s o l a t e i s a g r a m - n e g a t i v e ,m o t i l e r o d t h a t f e r m e n t s l a c t o s e a t 4 4 . 5 C a n d i s i n d o l ea n d m e t h y l r e d p o s i t i v e a n d V o g e s - P r o s k a u e r a n dc i t r a t e n e g a t i v e ( I M V i C [ + + - - ] ) . C o l o n i e s p r o d u c e ab r i l l i a n t g r e e n m e t a l l i c s he e n o n EMB a g a r . C u l t u r e s

w e r e m a i n t a i n e d o n n u t r i e n t a g a r ( D i f c o ) s l a n t s a t 4 Ca n d s u b c u l t u r e d b i m o n t h l y .G r o w t h m e d i a . T wo m e d i a w e r e u s e d t h r o u g h o u t t h es t u d y . T h e f i r s t w a s a g l u c o s e m i n e r a l s a l t s m e d i u mw i t h e i t h e r 0 . 0 2 o r 0 . 1 5 g l u c o s e , c o n t a i n i n g t h ef o l l o w i n g c o n c e n t r a t i o n s o f i n o r g a n i c s a l t s ( i n m g /l i t e r ) : N H 4 C l , 2 0 0 ; MgSO4 7 H 2 0 , 1 0 0 ; N a C l , 6 . 6 ; a n dC a C 1 2 , 1 . 0 ; a n d ( i n g / l i t e r ) : K2HPO4 3 H 2 0 , 1 . 1 3 a n dK H 2 P O 4 , 0 . 8 8 . To t h e a b o v e s o l u t i o n i n d e i o n i z e dw a t e r w a s a d d e d 0 . 2 m l o f t r a c e s a l t s s o l u t i o n p e r l i t e ra s d e s c r i b e d b y V i s h n i a c a n d S a n t e r ( 2 3 ) .T h e s e c o n d m e d i u m c o n s i s t e d o f 0 . 1 6 n u t r i e n tb r o t h ( B B L ) a d j u s t e d t o pH 7 ; d e i o n i z e d w a t e r wasu s e d i n t h e p r e p a r a t i o n o f t h i s m e d i u m .G r o w t h c o n d i t i o n s . P o p u l a t i o n s w e r e g r o w n e i t h e r i na c h e m o s t a t ( B i o F l o ; Ne w B r u n s w i c k S c i e n t i f i c C o . )o r i n b a t c h c u l t u r e . C h e m o s t a t c u l t u r e s w e r e g r o w nu n d e r f o r c e d a e r a t i o n a t 2 7 5 r p m i n a 1 - l i t e r v e s s e l ; t h ew o r k i n g v o l u m e wa s 3 5 0 m l . T h e g r o w t h r a t e s w e r ef i x e d b y a d j u s t i n g t h e d i l u t i o n r a t e ( D ) b e t w e e n 0 . 0 2a n d 0 . 4 0 h - 1 . T h e c o n c e n t r a t i o n o f b o t h n u t r i e n t b r o t ha n d g l u c o s e wa s d e t e r m i n e d t o b e l i m i t i n g i n c o n t r o lb a t c h e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d b e f o r e a n y o f t h e c o n t i n -u o u s c u l t u r e e x p e r i m e n t s .T e m p e r a t u r e s r a n g e d f r o m 1 5 t o 3 7 C i n d i f f e r e n te x p e r i m e n t s . A c o n s t a n t pH o f 7 . 0 + 0 . 2 was m a i n -t a i n e d b y t h e a u t o m a t i c a d d i t i o n o f 5 N a 2 C O 3 . D ,t e m p e r a t u r e , a e r a t i o n r a t e , a g i t a t i o n , a n d pH werec h e c k e d a t l e a s t o n c e d a i l y a n d o f t e n more f r e q u e n t l y .P o p u l a t i o n s w e r e h a r v e s t e d a f t e r a minimum o f f i v ev o l u m e c h a n g e s , b u t o n l y when s e v e r a l c o n s e c u t i v eo p t i c a l d e n s i t y ( O D ) m e a s u r e m e n t s i n d i c a t e d t h a t as t e a d y s t a t e h a d b e e n a t t a i n e d .B a t c h c u l t u r e s w e r e g r o w n i n m a g n e t i c a l l y s t i r r e dE r l e n m e y e r f l a s k s . C e l l s were h a r v e s t e d when t h ec u l t u r e d e n s i t y , a s m e a s u r e d b y t h e OD a t 6 6 0 n m , h a d

a t t a i n e d a v a l u e e q u i v a l e n t t o t h e s t e a d y - s t a t e c e l ld e n s i t y o f t h e c o r r e s p o n d i n g c h e m o s t a t c u l t u r e . T h i su s u a l l y o c c u r r e d a t t h e l a t e l o g a r i t h m i c p h a s e o fg r o w t h . T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e O D a n d t h ec o n c e n t r a t i o n o f b a c t e r i a , a s d e t e r m i n e d b y c o l o n yf o r m a t i o n o n m - E n d o a g a r ( D i f c o ) w i t h b a t c h o r c h e -m o s t a t c u l t u r e s , w a s i d e n t i c a l w i t h i n t h e p r e c i s i o na t t a i n a b l e b y s e r i a l d i l u t i o n s ( f o r c o l o n y c o u n t s ) a n db y a b s o r p t i o n m e a s u r e m e n t s ( f o r OD v a l u e s ) .D i s i n f e c t a n t . C h l o r i n e d i o x i d e ( C I 0 2 ) s t o c k s o l u t i o n so f a p p r o x i m a t e l y 2 , 0 0 0 mg o f C 1 0 2 p e r l i t e r w e r eg e n e r a t e d b y a c i d a c t i v a t i o n o f a s o d i u m c h l o r i t es o l u t i o n a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 1 ) . W o r k i n g s t o c ks o l u t i o n s o f 1 0 0 mg o f C 1 0 2 p e r l i t e r , p r e p a r e d b yd i l u t i o n o f t h e o r i g i n a l s t o c k , w e r e s t a n d a r d i z e d b e f o r ee a c h e x p e r i m e n t . T h e s e s o l u t i o n s w e r e s t o r e d a t 4 C i nt h e d a r k a n d d i s c a r d e d a f t e r 1 0 d a y s . D o s e - r e s p o n s ee x p e r i m e n t s i n d i c a t e d t h a t a d o s e o f 0 . 7 5 mg o f C 1 0 2p e r l i t e r r e s u l t e d i n s i g n i f i c a n t k i l l i n g w h i l e p r o v i d i n gm e a s u r a b l e c o n c e n t r a t i o n s o f r e s i d u a l d i s i n f e c t a n t a n ds u r v i v i n g o r g a n i s m s . R e s i d u a l s w e r e m e a s u r e d b yi o d o m e t r i c b a c k t i t r a t i o n ( 2 ) .I n a c t i v a t i o n c o n d i t i o n s . T h e d i s i n f e c t i o n r e a c t o r c o n -s i s t e d o f a b a f f l e d , w e l l - m i x e d , p r e s s u r i z e d 1 - l i t e rv e s s e l h e l d a t 2 3 1 C . B a c t e r i a w e r e s u s p e n d e d i n6 0 0 m l o f C 1 0 2 - d e m a n d - f r e e b u f f e r e d b a s a l s a l t s s o l u -t i o n a t a c o n c e n t r a t i o n o f a p p r o x i m a t e l y 1 0 7 c e l l s p e rm l . B a c t e r i a l c o n c e n t r a t i o n w a s a d j u s t e d b y u s i n g ODa s t h e c r i t e r i o n . Du e t o t h e C 1 0 2 d e m a n d e x e r t e d b yn u t r i e n t b r o t h , c e l l s g r o w n i n t h i s m e d i u m w e r e c e n t r i -f u g e d a n d s u s p e n d e d i n d e m a n d - f r e e b u f f e r e d s a l t ss o l u t i o n . C o n t r o l e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t t h e c e n t r i f -u g a t i o n d i d n o t a f f e c t v i a b i l i t y , a n d t h e r i n s i n g s t e p h a dn o e f f e c t o n c e l l s e n s i t i v i t y t o C 1 0 2 . C e l l s g r o w n i ng l u c o s e m e d i u m w e r e p l a c e d d i r e c t l y i n t o t h e i n a c t i v a -t i o n s o l u t i o n , s i n c e t h i s m e d i u m s h o w e d n o s i g n i f i c a n tC 1 0 2 d e m a n d .T h e c e l l s u s p e n s i o n i n t h e r e a c t o r was r a p i d l yi n j e c t e d w i t h C 1 0 2 t o y i e l d a d o s e o f 7 5 m g / l i t e r . D y es t u d i e s s h o w e d t h a t c o m p l e t e m i x i n g o c c u r r e d w i t h i n5 s . S a m p l e s w e r e w i t h d r a w n a t t i m e s r a n g i n g f r o m 1 5s t o 1 5 m i n i n s t e r i l e b o t t l e s c o n t a i n i n g s u f f i c i e n tN a 2 S 2 0 3 t o q u e n c h a n y r e s i d u a l C 1 0 2 .R e c o v e r y c o n d i t i o n s . S a m p l e s w e r e i m m e d i a t e l y d i -l u t e d t o y i e l d 2 0 t o 2 0 0 c o l o n i e s a n d r e c o v e r e d o nm e m b r a n e f i l t e r s ( G e l m a n G N - 6 ) i n t r i p l i c a t e . F i l t e r sw e r e p l a c e d o n m - E n d o m e d i u m a n d i n c u b a t e d a t3 5 . 5 C f o r 2 2 + 2 h .P r e s e n t a t i o n o f d a t a . We h a v e q u a n t i f i e d r e s i s t a n c ei n t e r m s o f a s u r v i v a l r a t i o ( N , / N O ) a f t e r t m i n u t e s o fc o n t a c t w i t h t h e d i s i n f e c t a n t C 1 0 2 . I t p r o v e d u n f e a s i -b l e t o e x p r e s s t h e d i f f e r e n c e s i n t e r m s o f p s e u d o k i n e t i cr a t e c o n s t a n t s b e c a u s e o f t h e b i p h a s i c r a t e b e h a v i o r ,c h a r a c t e r i z e d b y a n e x t r e m e l y r a p i d i n i t i a l d i e - o f ff o l l o w e d b y a n a s y m p t o t i c a p p r o a c h t o an a p p r o x i -m a t e l y c o n s t a n t s u r v i v i n g f r a c t i o n w h i c h was r e a c h e dw i t h i n 1 5 m i n i n a l l e x p e r i m e n t s ( s e e F i g . 1 ) . T h e r e -f o r e , t h e r a t i o N 1 5 / N o i s u s e d i n t h i s w o r k a s t h ec r i t e r i o n f o r c o m p a r i n g t h e e f f e c t s o f t h e v a r i o u sa n t e c e d e n t g r o w t h c o n d i t i o n s on t h e s e n s i t i v i t y o f t h ep o p u l a t i o n s .I n p r e v i o u s e x p e r i m e n t s we h a v e c o n s i s t e n t l y o b -s e r v e d n o n - i d e a l , b i p h a s i c s u r v i v a l k i n e t i c s i n a v a r i e -t y o f s i t u a t i o n s , r a n g i n g f r o m f i e l d s t u d i e s o f s e c o n d -a r y - t r e a t e d m u n i c i p a l w a s t e w a t e r t r e a t e d w i t h 1 0 mgo f C 1 0 2 p e r l i t e r t o l a b o r a t o r y s t u d i e s w h i c h u s e d C 1 0 2d o s e s o f 0 . 5 m g / l i t e r i n d e m a n d - f r e e d i s t i l l e d w a t e r .

VOL. 4 4 , 1 9 8 2

8/13/2019 Efectos de Crecimiento de e Coli Con Chlorine Dioxide

3/6

8 1 6 B E R G , M A T I N , AND ROBERTS

> -5n

-6

1 2 5 1 5CONTACT TIME ( m i n )

F I G . 1 . R e p r o d u c i b i l i t y o f two i n a c t i v a t i o n e x p e r i -m e n t s w i t h s t e a d y - s t a t e c h e m o s t a t - g r o w n c e l l s s a m -p l e d on d i f f e r e n t d a y s ; e x p e r i m e n t 1 ( 0 ) , e x p e r i m e n t 2( 0 ) . An E . c o l i c u l t u r e was g rown a t 2 5 C a t a D o f 0 . 0 6h - 1 . G l u c o s e was t h e l i m i t i n g n u t r i e n t ( S R , 0 . 0 2g l u c o s e ) . C e l l s w e r e i n a c t i v a t e d a t 2 3 C w i t h a d o s e o f0 . 7 5 mg o f C 1 0 2 pe r l i t e r . E r r o r b a r s r e p r e s e n t on es t a n d a r d d e v i a t i o n .

S i n c e d e t e c t a b l e a n d s t a b l e r e s i d u a l s a l s o h a v e b e e no b s e r v e d u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , i t i s a s s u m e d t h a t t h ec o n s t a n t s u r v i v i n g f r a c t i o n ( e . g . , N 1 5 / N O ) i s a r e s i s t a n ts u b p o p u l a t i o n .G e n e r a l e x p e r i m e n t a l d e s i g n . E x p e r i m e n t s w e r e d e -s i g n e d t o f a c i l i t a t e t h e u s e o f a n a l y s i s o f v a r i a n c e t op e r m i t c o m p a r i s o n s b e t w e e n v a r i o u s t r e a t m e n t s . At r e a t m e n t c o n s i s t e d o f on e a n t e c e d e n t g r o w t h e n v i r o n -ment ( e . g . , 1 5 C on 0 . 1 6 n u t r i e n t b r o t h a t D = 0 . 4 0h - 1 ) f r o m w h i c h a p o p u l a t i o n was h a r v e s t e d f o r a ne x p e r i m e n t . An e x p e r i m e n t c o n s i s t e d o f t r i p l i c a t e t r i -a l s i . e . , b a c t e r i a l c o n t a c t w i t h t h e d i s i n f e c t a n t ) per-f o r m e d on t h e s a m p l e on t h e same d a y . T h e v a r i a n c eamong t r i a l s a n d t h e s i m i l a r i t y or d i f f e r e n c e b e t w e e ne x p e r i m e n t a l t r e a t m e n t s c o u l d t h e n b e a s c e r t a i n e d .D u p l i c a t e e x p e r i m e n t s r u n on d i f f e r e n t d a y s c o u l d a l s ob e c h e c k e d f o r r e p r o d u c i b i l i t y . S t a t i s t i c a l a n a l y s e sw e r e c a r r i e d o u t on a n IBM 3 0 3 3 computer w i t h e i t h e rt h e BMDP or M i n i t a b p a c k a g e s .

RESULTSV a l i d i t y o f t h e e x p e r i m e n t a l d e s i g n . A n a l y s i s o fv a r i a n c e i n d i c a t e d t h a t t h e v a r i a t i o n among t r i p -l i c a t e t r i a l s on t h e same d a y i . e . , one e x p e r i -m e n t ) was n o t s i g n i f i c a n t a t t h e 0 . 0 5 l e v e l . A

m e a s u r e o f t h e s i m i l a r i t y i s t h e F r a t i o : F ( 2 , 4 5 ) 1 . 4 3 < 3 . 2 3 . D u p l i c a t e e x p e r i m e n t s p e r f o r m e don d i f f e r e n t d a y s w e r e a l s o s h o w n n o t t o b ed i f f e r e n t a t t he 0 . 0 5 l e v e l : F ( 1 , 5 4 ) = 0 . 5 2 < 4 . 0 0 .

A g r a p h i c e x a m p l e o f t h e r e p r o d u c i b i l i t y o ft h e s e e x p e r i m e n t s i s shown i n F i g . 1 .To a s c e r t a i n w h e t h e r t h e t a i l o f t h e b i p h a s i cs u r v i v o r c u r v e w a s d u e t o a r e s i s t a n t f r a c t i o n o fb a c t e r i a o r t o t h e a b s e n c e o f a d i s i n f e c t a n tr e s i d u a l , we m e a s u r e d t h e r e s i d u a l C 1 0 2 . A t ad o s e o f 0 . 7 5 m g / l i t e r , r e s i d u a l s r a n g e d f r o m 0 . 5 0t o 0 . 3 5 mg o f C 1 0 2 p e r l i t e r f o r a l l e x p e r i m e n t s ,w i t h a s t a n d a r d d e v i a t i o n o f 0 . 1 0 d e t e r m i n e dd u r i n g i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t s . C o m p a r i s o n w i t hc o n t r o l e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d w i t h o u t t h e a d d i -t i o n o f a b a c t e r i a l s u s p e n s i o n s h o w e d t h a t a p -p r o x i m a t e l y 13 o f t h e C 1 0 2 c o n s u m e d i n e a c he x p e r i m e n t was a c t u a l l y d u e t o t h e b a c t e r i a ls u s p e n s i o n i t s e l f , w h e r e a s 2 6 o f t h e C 1 0 2 wasl o s t d u e t o r e d o x r e a c t i o n s i r r e l e v a n t t o d i s i n -f e c t i o n . C o n t r o l e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d i n ah e a d s p a c e - f r e e r e a c t o r s h o w e d t h a t 1 4 o f t h eC 1 0 2 was l o s t d u e t o v o l a t i l i z a t i o n .E f f e c t o f g r o w t h t e m p e r a t u r e . T h e e f f e c t o fg r o w t h t e m p e r a t u r e o n s e n s i t i v i t y t o C 1 0 2 w a se x a m i n e d u n d e r t w o i n d i v i d u a l l i m i t a t i o n s , g l u -c o s e a n d some c o m p o n e n t o f t h e n u t r i e n t b r o t h .A t a s u b m a x i m a l g r o w t h r a t e o f 0 . 0 6 h - 1 u n d e rg l u c o s e l i m i t a t i o n i n t h e c h e m o s t a t , a n i n c r e a s ei n g r o w t h t e m p e r a t u r e f r o m 2 5 t o 3 7 C e n h a n c e ds e n s i t i v i t y ( l o g N 1 5 1 N o s t a n d a r d d e v i a t i o n ,- 3 . 2 1 0 . 1 5 a n d - 5 . 4 8 0 . 4 8 , r e s p e c t i v e l y ) .I n c o n t r a s t , a t m a x i m a l g r o w t h r a t e s i n b a t c hc u l t u r e s , a c h a n g e i n t e m p e r a t u r e c a u s e d e s s e n -t i a l l y n o c h a n g e i n s e n s i t i v i t y ( l o g N 1 5 1 N o , - 4 . 6 9 0 . 2 1 a n d - 4 . 7 8 0 . 3 4 a t 2 5 a n d 3 7 C ,r e s p e c t i v e l y ) . A t 2 5 C , b a t c h c u l t u r e - g r o w n c e l l sw e r e m o r e s e n s i t i v e t h a n t h e i r c h e m o s t a t - g r o w nc o u n t e r p a r t s , b u t a t 3 7 C t h e o p p o s i t e w a s t r u e .C e l l s g r o w n i n n u t r i e n t b r o t h , w h e t h e r g r o w na t a s u b m a x i m a l r a t e ( D , 0 . 2 0 h - 1 ) i n t h e c h e -m o s t a t o r i n c o n v e n t i o n a l b a t c h c u l t u r e ( l o gp h a s e ) , s h o w e d a n i n c r e a s e i n s e n s i t i v i t y i nr e s p o n s e t o a n i n c r e a s e i n g r o w t h t e m p e r a t u r e .T h e l o g N 1 5 1 N o f o r t h e c h e m o s t a t - g r o w n c e l l sw a s - 2 . 8 2 0 . 2 0 , - 4 . 2 1 0 . 2 2 , a n d - 5 . 5 1 0 . 3 6 a t 1 5 , 2 5 , a n d 3 7 C , r e s p e c t i v e l y ; f o r t h eb a t c h c u l t u r e - g r o w n c e l l s i t w a s 0 . 4 5 0 . 0 7 a n d0 . 8 5 0 . 3 2 a t 2 5 a n d 3 7 C , r e s p e c t i v e l y . A t b o t h2 5 a n d 3 7 C , t h e b a t c h c u l t u r e - g r o w n c e l l s w e r em o r e s e n s i t i v e .C o n t r o l e x p e r i m e n t s i n w h i c h v i a b i l i t y w a sd e t e r m i n e d a t g r o w t h t e m p e r a t u r e s o f 1 5 o r 3 7 Ca n d a f t e r c u l t u r e s h a d b e e n e q u i l i b r a t e d i n t h et e s t r e a c t o r a t 2 3 C d e m o n s t r a t e d t h a t t h e t e m -p e r a t u r e s h i f t i t s e l f - f r o m t h a t o f t h e g r o w t he n v i r o n m e n t t o t h e t e s t r e a c t o r t e m p e r a t u r e o f2 3 C - c a u s e d n o m e a s u r a b l e c h a n g e i n v i a b i l i t y .E f f e c t o f D . T h e d i f f e r e n t s e n s i t i v i t y o f b a t c h -a n d c h e m o s t a t - g r o w n c e l l s a t a f i x e d g r o w t ht e m p e r a t u r e o b s e r v e d a b o v e c o u l d b e d u e t ot h e i r d i f f e r e n t g r o w t h r a t e s . We t h e r e f o r e d i r e c t -l y m e a s u r e d t h e e f f e c t o f D ( t h e s p e c i f i c g r o w t hr a t e ) o n s e n s i t i v i t y t o C 1 0 2 . T wo d i f f e r e n t m e d i a

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

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SENSITIVITY OF E COLI T O CHLORINE DIOXIDE

\ 250

I I I I - A I I. 0 2 . 0 6 . 2 0 . 4 0 . 6 0 1 . 0 0 1 . 2 0 1 . 4 0

DILUTION RATE h r ' F I G . 2 . E f f e c t o f D o n s e n s i t i v i t y t o c h l o r i n e d i o x i d e u n d e r g l u c o s e l i m i t a t i o n a t t w o g r o w t h t e m p e r a t u r e s . S R( g l u c o s e ) w a s 0 . 0 2 . G r o w t h a t I U m a x v a l u e s ( 0 , * ) w a s o b t a i n e d w i t h b a t c h c u l t u r e s g r o w n i n 0 . 0 2 g l u c o s e a tt h e t w o t e m p e r a t u r e s . S y m b o l s : * , 2 5 C ; O , 3 7 C . E r r o r b a r s r e p r e s e n t o n e s t a n d a r d d e v i a t i o n .

( g l u c o s e a n d n u t r i e n t b r o t h s ) a n d t w o d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ( 2 5 a n d 3 7 C ) w e r e i n c l u d e d i nt h e s e m e a s u r e m e n t s . A c o m p o s i t e o f t h e e x p e r i -m e n t s b a s e d o n t h e f r a c t i o n o f c e l l s s u r v i v i n ga f t e r 1 5 m i n i s s h o w n i n F i g . 2 a n d 3 f o r g l u c o s ea n d n u t r i e n t b r o t h g r o w t h m e d i a , r e s p e c t i v e l y .T h e r e s i s t a n t f r a c t i o n ( N 1 5 / N O ) i s p l o t t e d a s af u n c t i o n o f D a n d g r o w t h t e m p e r a t u r e f o r c e l l sg r o w n i n 0 . 0 2 g l u c o s e ( F i g . 2 ) a n d i n 0 . 1 6n u t r i e n t b r o t h ( F i g . 3 ) . I t i s c l e a r t h a t i n e i t h e rm e d i u m a n d a t e i t h e r t e m p e r a t u r e , t h e D a t

z) 0 0

z4

L i r

w h i c h t h e a n t e c e d e n t g r o w t h o c c u r r e d h a d ap r o n o u n c e d e f f e c t o n t h e s e n s i t i v i t y o f t h e c u l -t u r e t o C 1 0 2 ( F i g . 2 a n d 3 ) . I n g l u c o s e m e d i u m ,t h e s e n s i t i v i t y w a s l o w e s t a t a n i n t e r m e d i a t eg r o w t h r a t e ( 0 . 2 0 h - 1 ) a n d i n c r e a s e d w i t h e i t h e rd e c r e a s i n g o r i n c r e a s i n g D . I n n u t r i e n t b r o t h t h ep a t t e r n w a s l e s s c o m p l e x , a n d t h e r e w a s i ng e n e r a l a d e c r e a s e i n r e s i s t a n c e w i t h i n c r e a s i n gD . I n b o t h m e d i a t h e r e s i s t a n c e t e n d e d t o b eg r e a t e r a f t e r g r o w t h a t 2 5 t h a n a t 3 7 C , e s p e c i a l -l y a t l o w D v a l u e s .

-3

- 4 1 -

. 5 1

6

. 0 2 . 0 6 . 2 0 .40DILUTION RATE h r )

.6 0

F I G . 3 . E f f e c t o f D on s e n s i t i v i t y t o C 1 0 2 under t h e l i m i t a t i o n o f a c o m p o n e n t o f n u t r i e n t b r o t h a t t wo g r o w t ht e m p e r a t u r e s . S R ( n u t r i e n t b r o t h ) was 0 . 1 6 . Growth a t Pmax v a l u e s ( 0 , 0 ) wa s o b t a i n e d w i t h b a t c h c u l t u r e sg rown i n 0 . 1 6 n u t r i e n t b r o t h a t t h e t wo t e m p e r a t u r e s . S y m b o l s : * , 2 5 C ; O , 3 7 C . E r r o r b a r s r e p r e s e n t on es t a n d a r d d e v i a t i o n .

_ - Lz _

l Z 5z

~0I V ) - ic 6Jr

H\ \ 37 \ > _ _

I I I t ,

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F

I N - 1 1

8/13/2019 Efectos de Crecimiento de e Coli Con Chlorine Dioxide

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8 1 8 B E R G , M A T I N , AND ROBERTSTABLE 1 . E f f e c t o f S R i n i n f l o w i n g medium ons e n s i t i v i t y t o C l O 2 a

S R ( g l u c o s e ) D ( h - 1 ) C e l l d e n s i t y L o g N 1 5 / N O C0 . 1 5 0 . 0 6 1 . 1 0 - 3 . 1 2 0 . 1 60 . 0 2 0 . 0 6 0 . 2 0 - 4 . 2 4 0 . 2 00 . 1 5 0 . 4 0 1 . 1 0 - 3 . 0 9 0 . 1 30 . 0 2 0 . 4 0 0 . 2 0 - 5 . 0 6 0 . 1 3

a G r o w t h t e m p e r a t u r e w a s 2 5 C .b A v e r a g e OD a t 6 6 0 n m .c S u r v i v a l r a t i o a f t e r 1 5 m i n o f c o n t a c t w i t h a d o s e o f0 . 7 5 mg o f C 1 0 2 p e r l i t e r a t 2 3 C .

E f f e c t o f S R i n m e d i u m i n f l o w . I n a d d i t i o n t ot e m p e r a t u r e a n d D , t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h el i m i t i n g n u t r i e n t ( S R ) i n t h e i n f l o w m e d i u m wasa l s o f o u n d t o i n f l u e n c e s e n s i t i v i t y t o C 1 0 2 . T a b l e1 s h o w s t h i s e f f e c t f o r e x t r e m e v a l u e s o f D a t af i x e d t e m p e r a t u r e . A t b o t h D v a l u e s , p o p u l a -t i o n s g r o w n a t t h e l o w e r S R c o n c e n t r a t i o n w e r em o r e s e n s i t i v e t o i n a c t i v a t i o n b y C 1 0 2 t h a n w e r et h o s e g r o w n a t t h e h i g h e r c o n c e n t r a t i o n .S i n c e t h e r e i s a d i r e c t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n S Ra n d s t e a d y - s t a t e c e l l b i o m a s s ( T a b l e 1 ) , t h er e s u l t s i n d i c a t e t h a t a l o w e r c e l l d e n s i t y d u r i n gg r o w t h i s c o n d u c i v e t o e n h a n c e d r e s i s t a n c e t oC 1 0 2 . We e m p h a s i z e t h a t t h e d e n s i t y d u r i n gg r o w t h i s t h e d e t e r m i n i n g f a c t o r h e r e a n d n o t t h ed e n s i t y o f p o p u l a t i o n s s u b j e c t e d t o t h e i n a c t i v a -t i o n p r o c e d u r e : t h e l a t t e r d e n s i t y was k e p t c o n -s t a n t i n a l l e x p e r i m e n t s , a s d e s c r i b e d a b o v e .DISCUSSION

A m a j o r o b j e c t i v e o f t h i s s t u d y w a s t o c r i t i c a l -l y t e s t t h e p r e m i s e t h a t a n t e c e d e n t g r o w t h c o n d i -t i o n s c a n i n f l u e n c e b a c t e r i a l s e n s i t i v i t y t o d i s i n -f e c t a n t s . T h e r e s u l t s c l e a r l y e s t a b l i s h t h ev a l i d i t y o f t h i s p r e m i s e , a n d i t i s e v i d e n t t h a t t h es e n s i t i v i t y o f E . c o l i i s m a r k e d l y i n f l u e n c e d b ya l l o f t h e f o u r e n v i r o n m e n t a l p a r a m e t e r s o fg r o w t h t e s t e d h e r e , i . e . , t h e q u a l i t a t i v e n a t u r e o ft h e g r o w t h e n v i r o n m e n t ( a s e v i d e n c e d b y t h ed i f f e r e n c e b e t w e e n g l u c o s e a n d n u t r i e n t b r o t h -g r o w n c e l l s c u l t i v a t e d u n d e r o t h e r w i s e s i m i l a rc o n d i t i o n s ) , d e g r e e o f n u t r i e n t l i m i t a t i o n , t e m -p e r a t u r e , a n d d e n s i t y o f t h e c u l t u r e . T h e s e r e -s u l t s s t r e n g t h e n t h e n o t i o n t h a t t h e o f t e n - o b -s e r v e d d i f f e r e n c e s i n s e n s i t i v i t y b e t w e e n n a t u r a lp o p u l a t i o n s a n d t h e i r l a b o r a t o r y - g r o w n c o u n t e r -p a r t s i s d u e t o t h e i r d i f f e r e n t a n t e c e d e n t g r o w t hc o n d i t i o n s .T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n g r o w t h r a t e a n ds e n s i t i v i t y b e c a m e e v i d e n t d u r i n g o t h e r e x p e r i -m e n t s i n o u r l a b o r a t o r y w i t h b a t c h c u l t u r e s ( 8 ) .S i m i l a r l y , f o r E . c o l i c e l l s g r o w n i n t h e c h e m o -s t a t i n n u t r i e n t b r o t h a t e i t h e r 2 5 o r 3 7 C , o u rr e s u l t s s h o w e d a n i n c r e a s e i n s e n s i t i v i t y a s t h eg r o w t h r a t e i n c r e a s e d . B a s e d o n t h o s e r e s u l t s , a

p o p u l a t i o n g r o w i n g m o r e r a p i d l y w a s h y p o t h e -s i z e d t o b e m o r e s e n s i t i v e . F o r e x a m p l e , a c t i v es u b s t r a t e t r a n s p o r t s y s t e m s o r g e n e t i c m a t e r i a lc o u l d b e m o r e e a s i l y d a m a g e d i n a g r o w i n g t h a ni n a s e n e s c e n t p o p u l a t i o n . G r u n a u ( 1 0 , 1 1 ) r e -p o r t e d s i m i l a r r e s u l t s , c o r r e l a t i n g a n i n c r e a s e da m o u n t o f r e p l i c a t i n g DNA d u r i n g r a p i d g r o w t hw i t h i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y t o UV l i g h t .T h e e f f e c t o f g r o w t h t e m p e r a t u r e w a s m o r ev a r i a b l e t h a n t h a t o f g r o w t h r a t e o n s ; n s i t i v i t y .Some d i s t i n c t d i f f e r e n c e s e x i s t e d , y i e l d i n g m o r es e n s i t i v e p o p u l a t i o n s a t h i g h e r g r o w t h t e m p e r a -t u r e s . I f i t i s a s s u m e d t h a t t h e p e r m e a b i l i t y o ft h e o u t e r m e m b r a n e t o s m a l l m o l e c u l e s i s d u e i np a r t t o t h e f l u i d i t y o f t h e l i p i d b i l a y e r , t h e n t h o s er e s u l t s a r e r e a s o n a b l e . T h i s e f f e c t o f p e r m e a b i l i -t y w i t h r e s p e c t t o t e m p e r a t u r e - m o d i f i e d l i p i d sh a s b e e n d e m o n s t r a t e d p r e v i o u s l y ( 8 ) . A l s o ,H a a s , i n h i s w o r k w i t h a t y p i c a l m y c o b a c t e r i a ,s u g g e s t e d t h a t t h e d e n s e l i p i d l a y e r s o f t h em y c o b a c t e r i a o f f e r p r o t e c t i o n a g a i n s t p e n e t r a -t i o n o f c h l o r i n e ( 1 2 ) . A l e s s p e r m e a b l e mem-b r a n e c o u l d r e t a r d t h e l e a k a g e o f o t h e r s m a l lc o n s t i t u e n t s ( e . g . , K + ) c r i t i c a l f o r v i a b i l i t y ( 2 ) a sw e l l , e s p e c i a l l y f o r a s u b l e t h a l l y i n j u r e d b a c t e r i -u m . On t h e o t h e r h a n d , o u r d a t a s h o w e d c a s e s t ow h i c h t h i s h y p o t h e s i s d i d n o t a p p l y , i . e . , w h e nt e m p e r a t u r e h a d n o s i g n i f i c a n t e f f e c t o n s e n s i t i v -i t y . T h i s m ay h a v e ' b e e n d u e t o a n o v e r r i d i n gf a c t o r c o n t r o l l i n g t h e s e n s i t i v i t y i n t h a t p a r t i c u -l a r g r o w t h r e g i m e .T h e S R i n c r e a s e d t h e s t e a d y - s t a t e b i o m a s s .H o w e v e r , a d e c r e a s e i n s e n s i t i v i t y w i t h i n -c r e a s e d S R w a s u n e x p e c t e d . We c a n o f f e r n oe x p l a n a t i o n f o r t h i s f i n d i n g .T h e r e s u l t s p r e s e n t e d h e r e s h o w t h a t p o p u l a -t i o n s g r o w n u n d e r c o n d i t i o n s t h a t m o r e c l o s e l ya p p r o x i m a t e n a t u r a l e n v i r o n m e n t s a r e m o r e r e -s i s t a n t t o d i s i n f e c t a n t s t h a n a r e t h o s e g r o w nu n d e r c o m m o n l y u s e d l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s .S i n c e t h e c o n v e n t i o n a l g r o w t h c o n d i t i o n s ( e . g . ,b a t c h c u l t u r e a t 3 7 C ) a r e r e p r e s e n t a t i v e o ft e c h n i q u e s c o m m o n l y e m p l o y e d i n l a b o r a t o r ye v a l u a t i o n s o f d i s i n f e c t a n t s a n d i n t h e e l u c i d a -t i o n o f m e c h a n i s m s o f i n a c t i v a t i o n , i t a p p e a r st h a t t h e a l t e r n a t i v e m e t h o d s p r e s e n t e d i n t h i sw o r k m e r i t f u r t h e r s t u d y .

ACKNOWLEDGMENTSJ . D . B . w a s s u p p o r t e d b y f u n d s f r o m t h e M a r x - M o r e n oF e l l o w s h i p o f S t a n f o r d U n i v e r s i t y S c h o o l o f E n g i n e e r i n g ,S t a n f o r d , C a l i f .R e v i e w o f t h e m a n u s c r i p t b y C . N . H a s s , I l l i n o i s I n s t i t u t e

o f T e c h n o l o g y , i s g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d .LITERATURE CITED

1 . A i e t a , E . A . , J . D . B e r g , P . V . R o b e r t s , a n d R . C . C o o p e r .1 9 8 0 . C o m p a r i s o n o f c h l o r i n e d i o x i d e a n d c h l o r i n e i n t h ed i s i n f e c t i o n o f w a s t e w a t e r . J . W a t e r P o l l u t . C o n t r o l F e d .5 2 : 8 1 0 - 8 2 2 .

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

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SENSITIVITY OF E . COLI T O CHLORINE DIOXIDE 8 1 92 . A m e r i c a n P u b l i c H e a l t h A s s o c i a t i o n . 1 9 7 6 . S t a nd a r d m e t h-o d s f o r e x a m i n a t i o n o f w a t e r a n d w a s t e w a t e r , 1 4 t h e d .A m e r i c a n P u b l i c H e a l t h A s s o c i a t i o n , I n c . , Ne w Y o r k .3 . B r o c k , T . D . 1 9 7 1 . M i c r o b i a l g r o w t h r a t e s i n n a t u r e .B a c t e r i o l . R e v . 3 5 : 3 9 - 5 8 .4 . C a r s o n , L . A . , M. S . F a v e r o , W. W. B o n d , a n d N . J .P e t e r s e n . 1 9 7 2 . F a c t o r s a f f e c t i n g t h e c o m p a r a t i v e r e s i s t -a n c e o f n a t u r a l l y o c c u r r i n g a n d s u b c u l t u r e d P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a t o d i s i n f e c t a n t s . A p p l . M i c r o b i o l . 2 3 : 8 6 3 - 8 6 9 .5 . C a r s o n , L . A . , N . J . P e t e r s e n , M. S . F a v e r o , a n d S . M.A g u e r o . 1 9 7 8 . G r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s o f a t y p i c a l m y c o -b a c t e r i a i n w a t e r a n d t h e i r c o m p a r a t i v e r e s i s t a n c e t od i s i n f e c t a n t s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 3 6 : 8 3 9 - 8 4 6 .6 . C h a r a c k l a s , E . G . 1 9 7 3 . A t t a c h e d m i c r o b i a l g r o w t h s . I I .F r i c t i o n a l r e s i s t a n c e d u e t o m i c r o b i a l s l i m e s . W a t e r R e s .7 : 1 2 4 9 - 1 2 5 8 .7 . F a v e r o , M. S . , a n d C . H . D r a k e . 1 9 6 6 . F a c t o r s i n f l u e n c i n gt h e o c c u r r e n c e o f h i g h m e m b e r s o f i o d i n e - r e s i s t a n t b a c t e -r i a i n i o d i n a t e d s w i m m i n g p o o l s . A p p l . M i c r o b i o l . 1 4 : 6 2 7 -6 3 5 .8 . G i l l , C . O . , a n d J . R . S u i s t e d . 1 9 7 8 . T h e e f f e c t s o f t e m -p e r a t u r e a n d g r o w t h r a t e o n t h e p r o p o r t i o n o f u n s a t u r a t e df a t t y a c i d s i n b a c t e r i a l l i p i d s . J . G e n . M i c r o b i o l . 1 0 4 : 3 1 -3 6 .9 . G r i e b l e , H . C . , F . R . C o l t o n , a n d T . J . B i r d . 1 9 7 0 . F i n e -p a r t i c l e h u m i d i f i e r s : s o u r c e o f P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s ai n f e c t i o n s i n a r e s p i r a t o r y d i s e a s e u n i t . N . E n g l . J . M e d .2 8 2 : 5 3 1 - 5 3 5 .1 0 . G r u n a u , J . A . 1 9 7 8 . T h e u l t r a v i o l e t s e n s i t i v i t y o f K l e b s i e l -l a p n e u m o n i a e a s a f u n c t i o n o f g r o w t h r a t e . FEMS L e t t .4 : 4 7 - 5 0 .1 1 . G r u n a u , J . A . 1 9 7 8 . U l t r a v i o l e t l e t h a l i t y a n d t h e s e n s i t i v -i t y o f c h r o m o s o m e r e p l i c a t i o n f o r k s . FEMS L e t t . 4 : 5 1 - 5 4 .1 2 . H a a s , C . N . , a n d R . S . E n g l e b r e c h t . 1 9 8 0 . P h y s i o l o g i c a la l t e r a t i o n s o f v e g e t a t i v e m i c r o o r g a n i s m s r e s u l t i n g f r o mc h l o r i n a t i o n . J . W a t e r P o l l u t . C o n tr o l F e d. 5 2 : 1 9 7 6 - 1 9 8 9 .

1 3 . H o f f , J . C . 1 9 7 8 . T h e r e l a t i o n s h i p o f t u r b i d i t y t o d i s i n f e c -t i o n o f p o t a b l e w a t e r , p . 1 0 3 - 1 17 . I n C . W. H e n r i c k s( e d . ) , E v a l u a t i o n o f t h e m i c r o b i o l o g y s t a n d a r ds f o r d r i n k -i n g w a t e r . U . S . E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o n A g e n c y , C i n -c i n n a t i .1 4 . J a n n a s c h , H . W. 1 9 6 9 . E s ti m a t i o n s o f b a c t e r i a l g r o w t hr a t e s i n n a t u r a l w a t e r s . J . B a c t e r i o l . 9 9 : 1 5 6 - 1 6 0 .1 5 . L a m b e r t , P . A . , a n d S . M . Hammond. 1 9 7 3 . P o t a s s i u mf l u x e s , f i r s t i n d i c a t i o n s o f m e m b r a n e d a m a g e i n m i c r o o r -g a n i s m s . B i o c hi m . B i o ph y s . R e s . Commun. 5 4 : 7 9 6 - 7 9 9 .1 6 . M a t i n , A . , A . G r o o t j i n s , a n d H . H o g e n h u i s . 1 9 7 6 . I n f l u -e n c e o f d i l u t i o n r a t e o n e n z y m e s o f i n t er m e di a r y m e t a b o -l i s m i n t w o f r e s h w a t e r b a c t e r i a g r o w n i n c o n t i n u o u sc u l t u r e . J . G e n . M i c r o b i o l . 9 4 : 3 2 3 - 3 3 2 .1 7 . M a t i n , A . , a n d H . V e l d k a m p . 1 9 7 8 . P h y s i o l o g i c a l b a s i s o ft h e s e l e c t i v e a d v a n t a g e o f a S p i r i l l u m s p . i n a c a r b o n -l i m i t e d e n v i r o n m e n t . J . G e n . M i c r o b i o l . 1 0 5 : 1 8 7 - 1 9 7 .1 8 . M i l b a u e r , R . , a n d N . G ro s s o wi c z. 1 9 5 9 . E f f e c t o f g r o w t hc o n d i t i o n s o n c h l o r i n e s e n s i t i v i t y o f E s c h e r i c h i a c o l i .A p p l . M i c r o b i o l . 7 : 7 1 - 7 4 .1 9 . N i e k u s , H . G . D . , W. d e V r i e s , a n d A . H . S t o u t h a m e r .1 9 7 7 . T h e e f f e c t o f d i f f e r e n t o x y g e n t e n s i o n s o n g r o w t ha n d e n z y m e a c t i v i t i e s o f C a m p y l o b a c t e r s p u t o r u m s u b -s p e c i e s b u b u l i s . J . G e n . M i c r o b i o l . 1 0 3 : 2 1 5 - 2 2 2 .2 0 . S e i d l e r , R . J . , J . E . M o r r o w , a n d S . T . B a g l e y . 1 9 7 7 .K l e b s i e l l a e i n d r i n k i n g w a t e r e m a n a t i n g f r o m r e d w o o dt a n k s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 3 3 : 8 9 3 - 9 0 0 .2 1 . S k a l i y , P . , a n d H . V . M c E a c h e r n . 1 9 7 9 . S u r v i v a l o f l e g i o n -n a i r e s d i s e a s e b a c t e r i u m i n w a t e r . A n n . I n t . M e d . 9 0 : 6 6 2 -6 6 3 .2 2 . S k a l H y , P . , T . A . T h o m p s o n , G . W. G o r m a n , G . K . M o r -r i s , H . V . M c E a c h e r n , a n d D . C . M a c k e l . 1 9 8 0 . L a b o r a -t o r y s t u d i e s o f d i s i n f e c t a n t s a g a i n s t L e g i o n e l l a p n e u -m o p h i l a . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 0 : 6 9 7 - 7 0 0 .2 3 . V i s h n i a c , W . , a n d M. S a n t e r . 1 9 5 7 . T h e t h i o b a c i l l i . B a c t e -r i o l . R e v . 2 1 : 1 9 5 - 2 1 3 .

V O L . 4 4 , 1 9 8 2