Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos
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Instituto Politécnico NacionalEscuela Nacional de Ciencias Biológicas
Departamento de MicrobiologíaLaboratorio de Microbiología General
“Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos”
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Introducción. • Una mutación es una
modificación heredable en una secuencia de bases del genoma.
• En una población bacteriana suelen aparecer mutaciones sin interferencia experimental, se denominan mutaciones espontaneas.
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Genotipo-Fenotipo.• De acuerdo al tipo de
mutación que se presente, las características fenotípicas pueden variar de la cepa progenitora.
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Tipos de Mutaciones. • Mutaciones puntuales.• Deleciones: Perdida de un
segmento cromosómico.• Duplicación• Translocación: Intercambio
de segmentos. • Inversión: Rotación 180°.
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Tipos de Mutantes.• Auxótrofo• Sensible a las temperaturas.• Resistentes.• Sin pigmento.• Colonias rugosas.• Cápsula.• Inmóvil.• Fermentación de azucares.
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Luz UV.• Radiación electromagnética
emitida por la región del espectro que ocupa la posición intermedia entre la luz visible y los rayos X.
• Regiones del espectro UV- vacío UV entre 100 y 200nm, UVC entre 200 y 280nm, UVB entre 280 y 315nm, y UVA entre 315 y 400nm
• Rango germicida se encuentra entre 240 y 280 nm
• Se obtiene la máxima eficiencia desinfectante cerca de los 260 nm
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Mutaciones por luz UV.
• La radiación UV es absorbida por los nucleótidos, los bloques constitutivos del ADN y ARN de la célula y las proteínas .
• La UV absorbida promueve la formavión de fotoproductos (dimeros e hidratos de pirimidina).
• La formación de dímeros dentro de un microorganismo, impide que éste replique su ADN y ARN, lo cual inhibe su crecimiento incluso pudiendo llegar a ser letal.
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Reparación foto-enzimática.
• Se debe a la acción de una enzima denominada fotoliasa o enzima fotorreactivante
• Las fotoliasas reparan directamente los dímeros de pirimidina, en una reacción que requiere luz visible de 300-500 nm de longitud de onda
• Fotoliasas: flavina reducida (FADH2) y una pterina.
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Mecanismo.• La primera fase del mecanismo
es independiente de la luz.• La fotoliasa reconoce el dímero
de pirimidina, formando un complejo enzima-sustrato [E-S].
• La flavina reducida (FADH2) de la fotoliasa, en presencia de luz , se excita, y dona electrones al anillo de ciclobutano del dímero de pirimidina, rompiéndolo, y regenerando las dos pirimidinas sin alterar.
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Reparación por escisión-resíntesis.• Complejo proteico con
actividad de endonucleasa correctora, conocido como correndonucleasa o escinucleasa
• Las bases dañadas se eliminan y el hueco resultante se rellena por resíntesis reparadora de ADN.
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Mecanismo.1. Un complejo proteico (Uvr[A2B])
desenrolla localmente la doble hélice.
2. Se une la proteína UvrC, formando el complejo Uvr[A2BC], es decir, la correndonucleasa, unido a la cadena dañada del ADN, cerca del dímero.
3. La correndonucleasa realiza dos cortes en la cadena afectada por el dímero
4. Este hueco es ocupado ahora por la ADN-polimerasa-I y por la ADN-helicasa-II (codificada por el gen uvrD), que llevan a la síntesis de nuevo ADN
5. La ADN-ligasa sella la cadena
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Reparación SOS. • Ocurre cuando el DNA es
lesionado por dosis elevadas de agentes mutagénico y los mecanismos anteriores no son suficientes para reparar el daño.
• Tienen lugar modificaciones profundas, entre otras, un retraso en la división celular (tabique transversal), respiración disminuida, etc.
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Mecanismo.• Dirigida por las proteínas LexA
y RecA.
• LexA inhibe funciones celulares y en condiciones SOS pierde su capacidad represora, por lo que la proteína queda sometida a una proteólisis y pierde su capacidad para unirse al DNA, la proteólisis se ve estimulada de nuevo por la proteína RecA.
• Tiene una elevada tasa de error. (umuDC)
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Modelo de Holliday.o Se inicia con roturas de cadena
sencilla en ambos cromosomaso Formación de la estructura de
Holliday.o Migración de la estructura de
Holliday y formación de regiones heteroduplexas.
o Resolución de la estructura por corte de las cuatro cadenas sencillas
o Resolución de la estructura por corte de dos cadenas:• Rotación de la estructura:
estructura isométrica de Holliday
• Corte longitudinal en la estructura y posterior ligación de extremos.
• Corte transversal en la estructura y posterior ligación de extremos.
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Esquema del modelo de Holliday.
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Serratia marcescens.1. Bacilo G(-)2. Anaerobios facultativos. 3. Móviles.4. Produce pigmento
característico conocido como prodigiosina.
5. Colonias altamente mucoides.6. Oxidasa (-) y reducen el
nitrato.7. Indol (-)8. VP (+)9. Citrato y Malonato (+)10. Se encuentra en suelo, agua y
plantas.
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Objetivos.1. Realizar una técnica que nos ayude a realizar una mutación.2. Identificar colonias mutantes.3. Observar la eficacia de los diferentes métodos de
reparación.
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Serie A
0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 210 y 300 segundos.
Serie B
0, 15, 30, 45 y 60 segundos. S.
marcescens
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Serie A
Serie B
Exposición a luz UV durante los tiempos marcados
Incubación 37°C por 48hr.
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Conteo de colonias apigmentadas y pigmentadas en cada placa de Serie A y Serie B
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN•Laboratorio 3
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SERIE A (OSCURIDAD)Tiempo de exposición
0 15 45 60 90 120 210 300
R B T R B T R B T R B T R B T R B T R B T R B T
1 IN IN IN
9 IN
29
0 29
17
0 17
2 0 2 0 0 0 0 0 0
2 IN IN 28
12
40
24
2 26
13
0 13
7 0 7 0 0 0 0 0 0
3 IN IN IN
7 IN
21
0 21
19
0 19
5 0 5 0 0 0 2 0 2
4 IN 53
37
90
7 0 7 43
2 45
0 7 7 2 0 2 1 0 1 7 3 7
5 IN IN 4 20
24
2 12
14
0 10
10
0 2 2 0 0 0 0 0 0
6 IN 109
65
174
2 2 4 9 0 9 1 0 1 2 0 2 4 0 4 0 0 0
7 IN IN 84
7 91
8 5 13
62
1 63
18
3 21
7 3 10
8 1 9
8 IN IN
5 IN
25
0 25
10
0 10
12
0 12
10
0 10
5 0 5 3 0 3
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CÁLCULOS SERIE A
Tiempo de exposición
15 45 60 90 120 210 300
%M
%M
%S
%M
%S
%M
%S
%M
%S
%M
%S
%M
%S
1 0% 3% / 0% 11.6%
0% 58.6%
0% 11.7%
0% 0% 0% 0%
2 0% 30% 16% 7.6% 65% 0% 50% 0% 53.8%
0% 0% 0% 0%
3 0% 2.8% 0% 0% 8.4% 0% 90.4%
0% 26.3%
0% 0% 0% 0%
4 41.1% 0% 7.7% 4.4% 642% 100%
15.5%
0% 28.5%
0% 50% 43%
700%
5 0% 83.3%
9.6% 85.7%
58.3%
100%
71.4%
100% 20% 0% 0% 0% 0%
6 37.5% 50% 2.29% 0% 225% 0% 11.1%
0% 200% 0% 200%
0% 0%
7 0% 7.69%
36.4% 38.4%
14.2%
1.5% 485% 14.2% 33.3%
30%
48% 11%
90%
8 2% 0% 10% 0% 40% 0% 120% 0% 83.3%
0% 50% 0% 60%
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0 50 100 150 200 250 3000
2
4
6
8
10
12
14
Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV
(Serie A)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
des
pig-
men
tada
s
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0 50 100 150 200 250 3000
50
100
150
200
250
300
Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Serie
A)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
tot
ales
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SERIE B (LUZ)Tiempo de exposición
0 15 30 45 60
R B T R B T R B T R B T R B T
1 IN 27 83
110 27 83 110 112 26 128 15 15 30
2 IN IN 14 0 14 60 0 60 5 0 5
3 IN IN IN 4 INC 45 9 54 25 4 29
4 IN IN 166 20 186 50 1 51 25 20 45
5 IN IN 10 34 44 4 63 67 3 6 9
6 IN 105
24
129 8 1 9 7 8 15 0 0 0
7 IN IN IN 32 9 41 15 2 17
8 IN IN IN 10 IN 22 1 23 13 1 14
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CÁLCULOS SERIE B
Tiempo de exposición
15 30 45 60
%M
%M
%S
%M
%S
%M
%S
1 75.4% 75.4% 100% 20.3% 116.3% 50% 23.4%
2 / 0% 5.6% 0% 428.5% 0% 8.3%
3 / 1.6% / 16.6% 21.6% 4% 53.7%
4 / 10.7% 74.4% 1.9% 27.4% 44.4% 88.2%
5 / 77.2% 17.6% 77.2% 152.2% 66.6% 13.4&
6 / 11.1% 6.9% 11.1% 166.6% 0 0
7 / 0% / 21.9% 16.4% 11.7% 41.4%
8 18.6% 4% / 4.34% 9.2% 7.1% 60.8%
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0 10 20 30 40 50 6002468
101214161820
Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV
(Serie B)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)Prom
edio
de
colo
nias
api
gmen
tada
s
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0 10 20 30 40 50 600
50
100
150
200
250
300
Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Serie
B)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
tot
ales
![Page 30: Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022050702/5872ee6c1a28abfa548b7b85/html5/thumbnails/30.jpg)
0 10 20 30 40 50 6002468
101214161820
Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV
(Comparación).
Serie BSerie A
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
des
pig-
men
tada
s
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0 10 20 30 40 50 600
50
100
150
200
250
300
Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Com-
paración)
Serie BSerie A
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
tot
ales
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Serie A – E.5 L.3
Serie B – E.1 L.3
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN•Laboratorio 4
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SERIE A (OSCURIDAD)Tiempo de exposición
0 15 30 45 60 90 120 210 300
R B T R B T R B T R B T R B T R B T R B T R B T R B T
1 INC 49
75
124
0 0 0 6 17
23
4 13
17
1 4 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 INC 304
68
372
25
78
103
8 1 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 INC 29
91
120
2 23
25
5 9 14
3 0 3 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4 INC 0 0 0 14
1 15
5 1 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
5 INC 38
56
94
12
0 12
8 0 8 6 0 6 2 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 INC 0 0 0 6 0 6 11
3 14
9 1 10
0 0 0 3 1 4 11
2 13
2 0 2
7 INC 6 11
17
3 2 5 0 0 0 15
4 19
0 1 1 1 1 2 0 1 1 0 0 0
8 INC 52
120
172
19
2 21
15
2 17
9 0 9 5 0 5 4 0 4 0 0 0 0 0 0
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CÁLCULOS (SERIE A)
Tiempo de exposición
15 30 45 60 90 120 210 300
%M %M %S %M %S %M %S %M %S %M %S %M %S %M
%S
1 60%
/ / 74%
/ 76%
74%
80%
29%
0% 0% 0% 0% 0% 0%
2 18%
75% 28%
11%
8.7%
/ / 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
3 76%
92% 21%
64%
56%
0% 21%
0% 67%
0% 0% 0% 0% 0% 0%
4 0% 6.6% / 17%
40%
0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
5 59.5$
0% 13%
0% 67%
0% 75%
0% 33%
0% 0% 0% 0% 0% 0%
6 0% 0% / 21%
233%
10%
71%
0% 0% 25%
/ 15%
325%
0% 15%
7 6% 67% 29%
0% 0% 21%
0% 100%
5% 50%
200%
100%
50%
0% 0%
8 69.7%
9.5% 12%
12%
81%
0% 53%
0% 56%
0% 80%
0% 0% 0% 0%
![Page 36: Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022050702/5872ee6c1a28abfa548b7b85/html5/thumbnails/36.jpg)
0 50 100 150 200 250 300-7
3
13
23
33
43
53
Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV
(Serie A)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
des
pig-
men
tada
s
![Page 37: Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022050702/5872ee6c1a28abfa548b7b85/html5/thumbnails/37.jpg)
0 50 100 150 200 250 3000
50
100
150
200
250
300
Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Serie
A)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
tot
ales
![Page 38: Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022050702/5872ee6c1a28abfa548b7b85/html5/thumbnails/38.jpg)
SERIE B (LUZ)Tiempo de exposición
0 15 30 45 60
R B T R B T R B T R B T R B T
1 INC INC 55 8 63 26 2 28 0 0 0
2 INC INC INC 95 10 105 INC
7 INC
3 INC INC 35 95 130 13 2 15 10 2 12
4 INC 0 0 0 36 12 192 18 4 88 0 0 0
5 INC INC 160
92 252 19 2 21 17 1 18
6 INC INC 48 4 52 8 1 9 6 0 6
7 INC INC 16 INC 11 6 17 8 2 10 10 0 10
8 INC INC 174
11 185 37 1 38 26 0 26
![Page 39: Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022050702/5872ee6c1a28abfa548b7b85/html5/thumbnails/39.jpg)
CÁLCULOS (SERIE B)
Tiempo de exposición
15 30 45 60
%M %M %S %M %S %M %S
1 0% 12.6% 25.2% 7.14% 44.4% 0% 0%
2 0% 0% / 9.52% 42% 2.8% /
3 0% 73% 52% 13.3% 11.5% 16.6% 80%
4 0% 6.2% / 4.54% 45.8% 0% 0%
5 0% 36.5% / 9.5% 8.3% 5.5% 85.7%
6 0% 7.6% 20.8% 11.1% 17.3% 0% 66.6%
7 6.4% 35.2% 6.8% 20% 58.8% 0% 100%
8 0% 5.9% 74% 2.6% 20.5% 0% 68.4%
![Page 40: Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022050702/5872ee6c1a28abfa548b7b85/html5/thumbnails/40.jpg)
0 10 20 30 40 50 600
5
10
15
20
25
30
Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV
(Serie B)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)Prom
edio
de
colo
nias
api
gmen
tada
s
![Page 41: Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022050702/5872ee6c1a28abfa548b7b85/html5/thumbnails/41.jpg)
0 10 20 30 40 50 600
50
100
150
200
250
300
Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Serie
B)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
tot
ales
![Page 42: Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022050702/5872ee6c1a28abfa548b7b85/html5/thumbnails/42.jpg)
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50
60
Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV
(Comparación).
Serie BSerie A
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos
Prom
edio
de
colo
nias
des
pigm
en-
tada
s
![Page 43: Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022050702/5872ee6c1a28abfa548b7b85/html5/thumbnails/43.jpg)
0 10 20 30 40 50 60 700
50
100
150
200
250
300
Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Comparación)
Serie BSeire A
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
tot
ales
![Page 44: Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022050702/5872ee6c1a28abfa548b7b85/html5/thumbnails/44.jpg)
Serie B E-6 L-4
Serie A E-8 L-4
![Page 45: Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022050702/5872ee6c1a28abfa548b7b85/html5/thumbnails/45.jpg)
Conclusiones• Al irradiar con luz UV pudimos poner en practica una técnica para producir una
mutación que se puso de manifiesto con la observación de colonias pigmentadas y no pigmentadas y se pusieron de manifiesto algunos mecanismos mediante la comparación de la serie A con la serie B.
• No se logró demostrar cual mecanismo presenta mayor eficiencia en la reparación de dímeros de pirimidina.
• Se logró poner de manifiesto la relación que existe entre el tiempo de exposición a la radiación UV y el efecto mutagénico y/o letal que éste presenta.
![Page 46: Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022050702/5872ee6c1a28abfa548b7b85/html5/thumbnails/46.jpg)
Bibliografía• HOWARD-FLANDERS, P. (1982): Reparación inducible del ADN. Inv. y
Ciencia 64 (enero): 28-37.• SANCAR, A., G.B. SANCAR (1988): DNA repair enzymes. Ann. Rev.
Biochem. 57: 29-67.• http://
www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/18_micro.htm#uv• Madigan M.. (2009). Brock. Biologia de los microorganismos..
México: Pearson Education.