Efecto del Quitosano en la Funcionalidad de la Membrana ...

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

Efecto del Quitosano en la Funcionalidad de la Membrana

Plasmática de Rhizopus stolonifer

T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

M A E S T R O EN C I E N C I A S

Q U I M I C O B I O L Ó G I C A S

P R E S E N T A

Q. B. P. JOSAM VEGA PÉREZ

DIRECTORAS DRA. MA. GUADALUPE GUERRA SÁNCHEZ

DRA. ANA N. HERNÁNDEZ LAUZARDO

MÉXICO, D.F. 2009

El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Bioquímica Microbiana del Departamento de Microbiología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la Dra. Ma. Guadalupe Guerra Sánchez* y de la Dra. Ana Niurka Hernández Lauzardo**.

Algunos de los experimentos de este trabajo fueron realizados en el Laboratorio 306 ote. del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México contando con el apoyado del Dr. Antonio Peña Díaz, de la QFB. Norma Silvia Sánchez y de la Dra. Martha Calahorra Fuertes.

Este trabajo fue financiado por la Secretaria de Investigaciones y Posgrados del IPN mediante los proyectos SIP 20080561*, 20080476**, 20090565* y 20090224**.

El sustentante recibió beca por parte del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) de Agosto 2007 a Junio 2009, por el Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) Agosto 2007 a Diciembre 2009 y por parte del IPN a través de la Beca Tesis de Agosto 2009 a Diciembre 2009.

AGRADECIMIENTOS PROFESIONALES

En primer lugar a la Dra. Ma. Guadalupe Guerra Sánchez y a la Dra. Ana Niurka

Hernández Lauzardo, por la confianza, el apoyo y la paciencia que me brindaron

durante todo el desarrollo de esta tesis.

A los integrantes del Comité Tutoral

Dra. Ma. Guadalupe Guerra Sánchez

Dra. Ana Niurka Hernández Lauzardo,

Dra. Enriqueta Amora Lazcano

Dra. Ethel García Latorre

Dra. Lourdes Villa Tanaca

Dr. Miguel G. Velázquez del Valle

Por dedicar parte de su tiempo y su entusiasta colaboración en la revisión y

corrección del presente trabajo.

Al Dr. Antonio Peña Díaz, por faci l i tarme las instalaciones de su

laboratorio en Insti tuto de Fisiología Celular de la UNAM, también a

la QFB. Norma Silvia Sánchez y a la Dra. Martha Calahorra Fuertes,

por el apoyo que me brindaron durante la estandarización de las

técnicas que uti l icé en dicho laboratorio.

Al CONACyT, al PIFI y a la Beca Tesis, por la beca recibida durante

la maestría.

AGRADECIMIENTOS PERSONALES

A mi familia

A mis padres Carmen y Rafael, por no dejarme de apoyar nunca, por todo el cariño que me han brindado, por haberme hecho una persona responsable, por todo esto y más este nuevo logro lo comparto con ustedes esperando que vengan muchos más para poderlos seguir disfrutando juntos.

A Bianca por la compañía, la comprensión, el amor, la bonita relación que hemos disfrutado durante todo este tiempo. A Niam por demostrarme que con perseverancia y esfuerzo todos los retos se pueden superar y por ser mi aliciente más grande para culminar esta etapa.

A Jonadab por ser un apoyo constante, aun y cuando no sé diera cuenta, por las platicas que teníamos en las que algunas ocasiones terminamos discutiendo, pero de las cuales aprendía mucho y por supuesto por aguantar la convivencia de los últimos meses.

A mis amigos

Al Klan aunque el tiempo pase y ya no nos reunamos con tanta frecuencia, nuestra amistada se mantiene tan inquebrantable como desde el primer día: Trinidad, Sinuhe, Lorena, Brenda, Carlos, Francisco, Alejandro, Ricardo, Erica, Jaime, Octavio, Cesar, Miguel Alejandro, Perla, Viridiana, Paul, Carmen, etc., por escucharme, apoyarme, estar con migo en los buenos y malos momentos que vivimos y sobre todo por la “sana” diversión que tuvimos durante todo este tiempo.

A mis compañeros de laboratorio

A Leo, Karina, Brenda, Ariana, Selene, Oliver, Josuhe, Karolina, Alejandra, Antonio, Verónica, Griselda, Armando, por su ayuda al momento de resolver dificultades, por las largas pláticas que teníamos y por haber hecho más ameno el trabajo en el laboratorio.

i

ÍNDICE

ÍNDICE………………...…………………………………………………………………………….……… i

ÍNDICE DE ABREVIATURAS...………………………………………………………………….…….... iii

ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………………………………….......... iv

ÍNDICE DE CUADROS.…….……………………………………………………………………….…... v

RESUMEN………….……………………………………………………………………………….….….. vi

ABSTRACT………..……………………………………………………………………………………..... vii

I INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………..... 1

1.1 Rhizopus stolonifer agente causal de pudriciones postcosecha……………………………. 1

1.2 Quitosano, alternativas de control natural…………………………………………….……….. 4

1.3 Mecanismos de acción del quitosano……………………..…………………………………… 6

1.4 Membrana celular.…………………………………………………………..……..................... 8

1.5 Las ATPasas…………………………………………………………………………………….. 10

1.6 Las ATPasas tipo-P…………………………………………………………………………….. 11

ANTECEDENTES……………………………………………………………………………… 14

JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………………………… 15

HIPÓTESIS.…………………………………………………………………………………….. 16

OBJETIVO GENERAL………………………………………………………………………… 17

Objetivos particulares…………………………………………………………………..……….. 17

II MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………………………… 18

2.1 Muestra biológica………………………………………………………………………………… 18

2.2 Solución de quitosano…………………………………….……………………………………... 18

2.3 Medios de cultivo………………………….……………………………………………………. 18

2.4 Condiciones de cultivo y obtención del inóculo fúngico ……………………………………... 19

2.5 Cinética de germinación…………………………………………………………………………. 19

2.6 Variación del pH durante el crecimiento de Rhizopus stolonifer………….......................... 19

2.7 Determinación de la integridad de la membrana de las esporas y micelio ……………….. 19

ii

2.8 Potencial de la membrana plasmática…………………………………………………………. 20

2.9 Salida de Potasio …………….……………………………………………………………......... 20

2.10 Obtención de membranas plasmáticas de R. stolonifer....…………………………………… 21

2.11 Cuantificación de fosfolípidos en la membrana plasmática…………………………………. 22

2.12 Observación de las membranas plasmáticas en el microscopio electrónico…………........ 22

2.13 Concentración de proteínas presentes en las membranas plasmáticas...………............... 22

2.14 Actividad de H+ ATPasa…………………………………………………………………..…….. 23

2.15 Cinética enzimática de la actividad de H+ ATPasa………………………………………........ 24

2.16 Diseño de experimentos y análisis estadístico…………………………………………..……. 24

2 III RESULTADOS……………………………………………………………………………………. 25

3.1 Cinética de germinación…………………………………………………………………………. 25

3.2 Variación del pH durante el crecimiento de Rhizopus stolonifer…………………..………... 26

3.3 Determinación de la integridad de la membrana de las esporas y del micelio……………. 27

3.4 Potencial de la membrana plasmática de esporas de R. stolonifer………………………… 30

3.5 Salida de potasio del micelio provocado por la presencia de quitosano…………………… 31

3.6 Fosfolípidos presentes en la membrana plasmática…………………………………………. 31

3.7 Observación de membranas plasmáticas en microscopio electrónico de transmisión………………………………………………………………………………….......... 32

3.8 Proteínas presentes en las membranas plasmáticas………………...……………………… 33

3.9 Actividad de H+ATPasa………………………………………………………………………….. 33

3.10 Cinética enzimática de la H+ATPasa de la membrana plasmática…………………………. 34

3 IV DISCUSION…...……………………………………………………………………………….….. 36

V CONCLUSIONES..……………………...…………………………………………………….….. 42

4 PERSPECTIVAS……………………………………………………………………………….…. 43

ANEXOS………………………………………………………………………………………..….. 44

REFERENCIAS…...………………………………..………………………………………….….. 47

iii

ÍNDICE DE ABREVIATURAS

AMPc Adenosín monofosfato cíclico

ATP Adenosín trifosfato

BSA Albumina sérica bovina

°C Grados centigrados

CCCP Carbonil cianida m-clorofenilhidrazona

DEAE-D Dietilaminoetil-Dextran

DHS Dihidroestreptomicina

DTT Ditiotreitol

EB Bromuro de etidio

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético

EGTA Ácido etilenglicoltetraacético

h Horas

IM Integridad de membrana

M Molar

mg Miligramos

MM Medio mínimo

mM Minimolar

mL Mililitros

min Minutos

NADP Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidado

NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido

μg Microgramos

μl Microlitros

PDA Agar papa dextrosa

Pi Fosforo inorgánico

PI Ioduro de propidio

PMSF Fenilmetilsulfonil fluoruro

ROS Especies reactivas del oxigeno

RPM Revoluciones por minuto

SIDA Síndrome de inmunodeficiencia adquirida

TEA Trietanolamina

Tris Trishidroximetilaminometano

UV Luz ultra violeta

iv

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Ciclo de vida de Rhizopus stolonifer............................................................................... 2

Figura 2 Esquema simplificado del proceso de desacetilación química de la quitina para obtener quitosano……………………………………………………………………………...

5

Figura 3 Representación esquemática de la estructura de la membrana celular……………. 8

Figura 4 Topología de la H

+ATPasa de la membrana plasmática de S. cerevisiae, basado en

cristalografía de segunda y tercera dimensión. …………………………………………… 12

Figura 5 Cinética de germinación…………………………………………….…………..................... 25

Figura 6 Microfotografía de la cinética de germinación……………………………………………... 26

Figura 7 Efecto del quitosano sobre el pH del medio de cultivo ………………………………..…. 27

Figura 8 Microfotografía del efecto del quitosano sobre la integridad de membrana plasmática de las esporas de Rhizopus stolonifer…………………………………………………….

28

Figura 9 Efecto del quitosano sobre la integridad de membrana plasmática de las esporas de Rhizopus stolonifer. ……………..…………………………………………………..……….

28

Figura 10 Micrografía del efecto del quitosano sobre la integridad de la membrana plasmática del micelio de Rhizopus stolonifer………………………………………………………….

29

Figura 11 Efecto del quitosano sobre el potencial de la membrana plasmática de las esporas de Rhizopus stolonifer. ………………………………………………………………………

30

Figura 12 Efecto del quitosano sobre la salida de K+ de las esporas de Rhizopus stolonifer…… 31

Figura 13 Microfotografía electrónica de transmisión de las membranas plasmáticas (MP) de R. stolonifer………………………………………………………………………………………...

32

Figura 14 Efecto del quitosano sobre la cinética enzimática de la H+ATPasa de membrana plasmática de Rhizopus stolonifer…………………………………………………………...

35

v

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro1 Aplicaciones del quitosano en diferentes áreas……………………………………..…... 6

Cuadro 2 Cuantificación de los mayores complejos lipídicos y esteroles de la membrana celular de dos diferentes hongos (µg mg

-1 proteína)…………………………………….

9

Cuadro 3 Comparación de la sensibilidad a los principales inhibidores de las ATPasas……………………………………………………………………………..............

11

Cuadro 4 Concentración de fosfolípidos calculada a las diferentes muestras de membranas plasmáticas de Rhizopus stolonifer crecido en MM durante 12 h………………………

32

Cuadro 5 Concentración de proteínas cuantificadas a las diferentes muestras obtenidas de Rhizopus stolonifer crecido en MM durante 12 h………………………………………....

33

Cuadro 6 Actividad de la H

+ATPasa calculada a las diferentes muestras de membranas

plasmáticas de Rhizopus stolonifer crecido en MM durante 12 h…………………….... 34

Cuadro 7

Valores de la Velocidad máxima y de la Km obtenidos del curso temporal de la actividad de la H

+ATPasa de membrana plasmática de Rhizopus

stolonifer……................................................................................................................. 35

vi

RESUMEN

Rhizopus stolonifer es considerado uno de los principales hongos fitopatógenos

que causan enfermedades postcosecha, es el agente causal de la pudrición

blanda de frutas y hortalizas, ocasionando importantes pérdidas económicas. El

control de este fitopatógeno se ha realizado utilizando fungicidas químicos

sintéticos. Sin embargo, los efectos nocivos que éstos han causado al medio

ambiente, los riesgos que representan para la salud humana y la resistencia que

han generado las cepas fúngicas motivan la búsqueda de alternativas naturales de

control. El quitosano, compuesto natural, biodegradable y no tóxico ha sido

evaluado para controlar las enfermedades potscosecha. El mecanismo de la

actividad antimicrobiana de este polímero no está del todo elucidado. El objetivo

de este trabajo fue estudiar el efecto del quitosano en la funcionalidad de la

membrana plasmática de Rhizopus stolonifer para lo cual se evaluó el efecto del

quitosano en la integridad de la membrana plasmática, se determinaron los

cambios en el pH del medio, potencial de membrana y en la salida de K+.

Adicionalmente, se cuantificaron los fosfolípidos totales y el contenido proteico de

la membrana plasmática en presencia de quitosano y se evaluó el efecto del

polímero en la actividad de la H+ATPasa de la membrana. Los resultados

obtenidos demuestran que el quitosano causa la pérdida de la integridad de la

membrana plasmática de R. stolonifer, afecta el pH del medio de cultivo, el

potencial de membrana y causa la salida K+ del interior celular. Sin embargo,

también se evidencia que no afecta el contenido de fosfolípidos totales pero

disminuye el contenido proteico de la membrana plasmática y la actividad de la H+

ATPasa. Por otra parte, se expone que el polímero disminuye los parámetros

cinéticos (Vmax y Km) de la H+ATPasa. Los resultados del presente estudio

demuestran que el quitosano afecta la funcionalidad de la membrana plasmática

de Rhizopus stolonifer y contribuyen a esclarecer los mecanismos de acción de

este compuesto.

vii

ABSTRACT

Rhizopus stolonifer is considered one of the main pathogens causing postharvest

diseases, is the causative agent of soft rot of fruits and vegetables, causing major

economic losses. Control of this plant pathogen has been conducted using

synthetic fungicides. However, the harmful effects they have caused to the

environment, the risks posed to human health and resistance to fungal strains

generated motivates the search for natural alternatives of control. Chitosan, is a

natural compound, biodegradable and nontoxic has been evaluated for postharvest

disease control. The mechanism of the antimicrobial activity of this polymer is not

fully elucidated. The aim of this work was to study the effect of chitosan on the

functionality of the plasma membrane of Rhizopus stolonifer for which we

evaluated the effect of chitosan on plasma membrane integrity, were determined

pH changes in the culture medium, potential membrane and the K+ efflux.

Additionally, were quantified the total phospholipids and protein content of the

plasma membrane in the presence of chitosan and evaluated the effect of the

polymer in the activity of membrane H+ATPase. The results demonstrated that

chitosan causes loss of plasma membrane integrity of R. stolonifer, affected the pH

of the culture medium, the membrane potential and causes the K+ efflux of the cell.

However, also demonstrated does not affect the total phospholipid content but

decreased the protein content of the plasma membrane and the activity of

H+ATPase. On the other hand, were showed that the polymer decreases the

kinetic parameters (Vmax and Km) of the H+ATPase. The results of this study

show that chitosan affects the functionality of the plasma membrane of Rhizopus

stolonifer and help to elucidate the mechanisms of action of this compound.

Efecto del quitosano en la funcionalidad de la membrana plasmática Rhizopus stolonifer INTRODUCCIÓN

1

INTRODUCCIÓN

1.1 Rhizopus stolonifer, agente causal de pudriciones postcosecha

Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill es considerado uno de los principales

hongos fitopatógenos que provocan enfermedades postcosecha, es el agente

causal de la pudrición blanda de frutas y hortalizas ocasionando importantes

pérdidas económicas. Este hongo pertenece a la Subdivisión: Zygomycotina,

Clase: Zygomycetes, Orden: Mucorales, Género: Rhizopus y Especie: Rhizopus

stolonifer (Agrios, 2001). Esta especie se encuentra ampliamente distribuida en la

naturaleza sobreviviendo de manera saprófita en el suelo y en residuos orgánicos

invadiendo potencialmente los tejidos vegetales. Sus principales características

son: crecimiento rápido, desarrolla un micelio aéreo cenocítico, forma

esporangióforos que presentan en sus puntas esporangios esféricos donde se

alojan las esporangiosporas, las cuales presentan diferentes formas: globosas,

elipsoidales y angulares con superficies lisas o estrías distintivas (Schipper, 1984;

Hernández-Lauzardo et al., 2006).

Las esporas de R. stolonifer pueden sobrevivir largos periodos sin agua y soportar

temperaturas elevadas, germinando sobre tejidos vegetales dañados y generando

rápidamente la maceración de los tejidos y la pudrición de los frutos, provocando

pérdidas considerables en un corto periodo de tiempo (Northover and Zhou, 2002;

Holmes and Stange, 2002).

R. stolonifer tiene la capacidad de reproducirse de forma asexual y sexual (figura

1). La reproducción asexual en los Zygomycetes tiene lugar después de que el

micelio ha experimentado un crecimiento extensivo y es por medio de

esporangiosporas. El esporangióforo es una estructura larga, en cuyo ápice se

forma el esporangio. El esporangio es el productor de esporangiosporas que


2

surgen en la parte apical de la hifa. Las esporas uninucleadas son liberadas

cuando la pared del esporangio se rompe (Alexopoulos et al., 1996; Moore-

Landecker, 1996).

Figura 1.- Ciclo de vida de Rhizopus stolonifer (URL 1).


3

La reproducción sexual se caracteriza por la fusión de gametos morfológicamente

idénticos contenidos en diferentes hifas, una hifa (+) y una hifa (-). La atracción de

las mismas es debida a la producción de hormonas volátiles. Estas sustancias

inducen el contacto de los ápices que se hinchan hasta que se fusionan los

gametangios multinucleados. Primero, el cigoto se rodea de una delgada pared y

dentro del cigoto comienza el desarrollo de la zigospora con una nueva pared más

gruesa. El material que es depositado en la misma, causa que la pared de la

zigospora se engruese y comience a pigmentarse. Las zigosporas maduras son

típicamente oscuras (negra o café). Una vez que empieza la germinación de la

zigospora, al esporangióforo le emerge en la punta un esporangio (Alexopoulos et

al., 1996; Moore-Landecker, 1996).

En la etapa de postcosecha es cuando los hongos provocan el mayor daño a los

cultivos, penetran los frutos dañados y generan la pudrición (González-Aguilar et

al., 2005). R. stolonifer aprovecha las heridas, magulladuras o aberturas naturales

que presentan los tejidos vegetales vivos para infectar, después las hifas secretan

enzimas pectinolíticas que degradan las sustancias pécticas de la lámina media de

las células, ocasionando la pérdida de cohesión entre las células, dado que se

rodean de una sustancia líquida y al momento de aplicar cierta presión pueden

moverse, esto provoca una “pudrición blanda” (Agrios, 2001).

Para controlar la pudrición blanda causada por R. stolonifer usualmente se

emplean diversas estrategias, como cambios físicos en el medio ambiente (bajas

temperaturas o tratamientos de calor), el empleo de atmósferas controladas y las

radiaciones [gamma (γ) y luz ultra violeta (UV)] (Velázquez-del Valle et al, 2008),

además del uso de productos químicos sintéticos como Dicloran, Iprodione,

Fludioxonil y Tebuconazole (Adaskaveg et al., 2002). Sin embargo, esta última

práctica ha provocado diversos problemas como son la resistencia generada por


4

R. stolonifer, daños al medio y a la salud humana, entre otros, conllevando a la

búsqueda de alternativas naturales para controlar las pudriciones ocasionadas por

este fitopatógeno, entre las que se encuentra el control biológico y el empleo del

quitosano (Bautista-Baños et al., 2006).

1.2 Quitosano, alternativa de control natural

La quitina es el segundo biopolímero más abundante en la naturaleza y está

compuesto de monómeros de 2-acetil-amido-2-desoxi-β-D-glucopiranosa (Seyfarth

et al., 2008), es parte de los componentes que constituyen los caparazones de los

crustáceos (cangrejos, camarones, jaibas, etc.), así como de la pared celular de

los hongos, en donde es el componente estructural más importante, debido a que

es el responsable de mantener la forma e integridad de la pared celular (Allan and

Hadwiger, 1979; Martínez and Gonzalbo, 2001).

El quitosano es un derivado de la quitina, es un polímero que está compuesto por

monómeros de 2-acetil-amido-2-desoxi-β-D-glucopiranosa y monómeros

desacetilados de 2-amino-2-desoxi-β-D-glucopiranosa (Seyfarth et al., 2008),

también está presente en la pared celular de algunos hongos (Allan and Hadwiger,

1979). Por medio de una reacción de desacetilación se eliminan al menos el 50%

de sus grupos acetilo y la quitina se convierte en quitosano (figura 2) (Lárez,

2006). El grado de desacetilación del quitosano casi nunca es completo y de esto

dependerán las propiedades químicas, físicas y biológicas del polímero

(Hernández-Lauzardo et al., 2005; Seyfarth et al., 2008). Sus principales ventajas

son que es un producto inocuo, natural, biodegradable y no tóxico (Bautista-Baños

et al., 2006; Lárez, 2006).

La presencia de grupos aminos en la cadena polimérica ha hecho que el quitosano

sea uno de los materiales más versátiles que se estudian desde hace algún

tiempo, por la posibilidad de realizar una amplia variedad de modificaciones, tales


5

como la reacciones de anclaje de enzimas, reacciones de injerto, obtención de

películas entrecruzadas, etc., de las cuales se obtienen materiales con

propiedades adecuadas para aplicaciones inmediatas y futuras en biotecnología,

biomedicina y agricultura (Cuadro 1) (Lárez, 2003).

Figura 2.- Esquema simplificado del proceso de desacetilación química de la quitina para obtener quitosano.

En la agricultura, se ha utilizado quitosano con diversos grados de polimerización

para cubrir frutos, verduras o raíces y prevenir el ataque por hongos y bacterias

durante la fase postcosecha con el propósito de alargar la vida de anaquel del

producto (Gonzalez-Aguilar et al., 2005; Hernández-Muñoz et al., 2006). El

carácter fungicida y/o fungistático que presenta el quitosano se ha demostrado en

una gran variedad de hongos entre los cuales se encuentran: Alternaria alternata,

Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Botrytis cinérea, Colletotrichum

gloeosporioides, Fusarium acuminatum, Fusarium graminearum, Fusarium

oxysporum, Micronectriella navils, Mucor spp. Penicillum sp., Pyricularia grisea,

Rhizotonia solani y Rhizopus stolonifer (Ait-Barka et al., 2004; Bautista-Baños et

al., 2004; Hernández-Lauzardo et al., 2005; 2007 Pacheco et al., 2008; Rabea et

al., 2005)

NaOH (40%) Temperaturas altas


6

Cuadro 1.- Aplicaciones del quitosano en diferentes áreas.

Área Aplicación

Química analítica

En cromatografías, intercambiadores de iones, absorción

de iones de metales pesados y absorción de ácidos,

fabricación de electrodos específicos para metales, etc.

Biomedicina

Membrana de hemodiálisis, suturas biodegradables,

sustitutos artificiales de piel, agente cicatrizante en

quemaduras, sistemas liberadores de fármacos (insulina),

transporte de agentes anticancerígenos, tratamiento de

tumores, control del virus del SIDA, etc.

Industrias

Del papel, textil, alimentaría (soporte para inmovilización de

enzimas en la producción de maltosa, espesante en

alimentos, agente de oxidación controlada, agente

preservante).

Agricultura

Recubriendo semillas para su conservación durante el

almacenamiento, sistemas liberadores de fertilizantes, en

formulación de pesticidas, como agente bactericida y

fungicida para la protección de plántulas.

Tratamiento de agua

Como agente floculante, agente coagulante, tratamientos

de flotación para la remoción de aceite de pescado en

agua, remoción de metales, remoción de surfactantes.

Tomado de Lárez, 2003.

1.3 Mecanismo de acción del quitosano

El mecanismo de la actividad antimicrobiana del quitosano y sus derivados no está

completamente elucidado, pero se cuenta con una amplia información del efecto

que tienen las soluciones acuosas de quitosano frente a una diversa variedad de

microorganismos, incluyendo bacterias, levaduras y hongos filamentosos (Allan

and Hadwiger, 1979; Guo et al., 2006; Seyfarth et al., 2008). Lo que sugieren la


7

mayoría de las investigaciones es que las cargas positivas en el grupo NH3+ del

monómero de glucosamina a pH <6.3 permite la interacción con las cargas

negativas de la membrana celular formando complejos polielectrolitos, lo cual

altera la permeabilidad de la membrana, interfiriendo con el crecimiento, las

funciones fisiológicas normales y provocando la fuga de constituyentes

intracelulares (Rabea et al., 2003; Kim and Rajapakse, 2005).

Otros estudios atribuyen el efecto antifúngico del quitosano a diferentes causas

(concentración, polimerización, acetilación, tiempo de incubación, etc.) pero de

todas formas existe un factor en común alrededor del cual versan todas las

explicaciones y es el relacionado con la naturaleza policatiónica de la molécula de

quitosano, la cual le confiere propiedades biológicas y fisiológicas únicas (Liu et

al., 2004). Como esta es una de las propuesta más aceptadas, existen grupos de

investigadores que se han dado a la tarea de utilizar compuesto derivados de la

quitina o similares en estructura pero con una diferencia principal no tener grupos

NH3+ en el monómero, obteniendo como resultados actividades antifúngicas muy

bajas, lo que sugiere que el carácter policatión del quitosano es crucial para tener

una alta actividad antifúngica (Seyfarth et al., 2008).

Estudios recientes avalan que el quitosano penetra a la célula fúngica mediante un

proceso dependiente de energía y permeabiliza y afecta diferentes tipos de células

de Neurospora crassa, resultando las esporas más sensibles al quitosano que las

hifas (Palma-Guerrero et al., 2009). Adicional a estos efectos, estudios por

microscopía electrónica han evidenciado efectos del quitosano sobre las

estructuras de hongos filamentosos, como lesiones, distorsiones y retracción de

las hifas, con alteración morfológica de organelos (Liu et al., 2007). Además

existen otro reporte donde se estudió por microscopía electrónica de barrido y de

transmisión las esporas de R. stolonifer obtenidas de diferentes tratamientos con

quitosano y las imágenes de los resultados mostraron que el quitosano provocó

cambios en la ornamentación y en la profundidad de la crestas de las esporas

(Hernández-Lauzardo et al., 2008).


8

1.4 Membrana Celular

La membrana celular de los organismos eucariotas es la parte externa de la célula

que envuelve al citoplasma, es la que permite el intercambio entre la célula y el

medio que la rodea. La célula no puede funcionar apropiadamente y permanecer

viva a menos que su membrana regule el intercambio de compuestos. Las

membranas biológicas están compuestas por una bicapa lipídica de

aproximadamente 7.5 nm de grosor y está constituidas básicamente por lípidos,

proteínas y carbohidratos (proporciones aproximadas 50%, 40% y 10%,

respectivamente) (figura 3).

Figura 3.- Representación esquemática de la estructura de la membrana celular (URL2).

La mayor parte de los lípidos que se encuentran en las membranas de eucariotas

son fosfoglicerolípidos (fosfolípidos), esfingolípidos, glicoglicerolípidos y esteroles.

Los fosfolípidos son los elementos estructurales más importantes de las

membranas biológicas. Las membranas plasmáticas también poseen

carbohidratos unidos a proteínas (glicoproteínas) y a los lípidos (glicolípidos)

(Daum et al., 1998). Cada uno de estos componentes, es característico de las

membranas biológicas, y las proporciones en que están presentes varían

Esterol


9

enormemente. La relación existente entre los lípidos y las proteínas de membrana

suele variar dependiendo del tipo celular estudiado (Cuadro 2). Por tanto, se

considera que la mayor parte de la estructura de las membranas depende de los

fosfolípidos y las funciones de las proteínas (Hernández et al., 1994).

Cuadro 2.- Cuantificación de los mayores complejos lipídicos y esteroles de la membrana

celular de dos diferentes hongos.

Penicillium cyclopium

(µg mg-1 proteína)

Ustilago maydis

(µg mg-1 proteína)

Fosfatidiletanolamida 74.07 ± 3.93 43.92 ± 5.18

Fosfatidilcolina 26.85 ± 0.31 40.08 ± 7.19

Ergosterol 84.37 ± 4.13 73.82 ± 7.00

Tomado de Hernández et al., 1994.

Las proteínas de membrana realizan ciertas actividades y de acuerdo a su función

pueden ser divididas en: estructurales, para unirse al citoesqueleto, receptores de

membrana, para recibir y transducir señales y transportadoras para acarrear iones

y nutrientes. Otra de las funciones importantes de la membrana es la de

compartamentalizar las células originándose así los diferentes tipos de organelos.

Cada uno de éstos se puede identificar por medio de enzimas específicas o

marcadoras.

En la membrana plasmática de los hongos la cantidad de proteínas puede ser

variable. Entre las enzimas más fácilmente reconocidas se encuentra la

H+ATPasa. Existen un gran número de proteínas de membrana en hongos

relacionados tanto con la señalización como con el transporte de electrones. Por

ejemplo la adenilato ciclasa que produce AMPc a partir de ATP es un componente


10

importante en las cascadas de transducción de señales (Jain et al., 2003), la

oxidasa de NADPH en la mitocondria, oxida al NADP con el oxígeno molecular y

participa en la formación de peróxido de hidrógeno generando especies reactivas

de oxígeno (ROS) (Paraje et al., 2009).

1.5 Las ATPasas

Las ATPasas de membrana son esenciales para la captura de nutrientes como

amino ácidos y azucares, además participan de manera importante en la

regulación del pH interno, hidrolizan el 25% del adenosín-trifosfato (ATP)

producido por la célula y acoplan la energía liberada con el transporte activo de

iones, generando un gradiente iónico que es aprovechado para el transporte de

nutrientes y de otros iones. El ATP es la forma de energía química rápidamente

utilizable, se sintetiza en la glucólisis y en la fosforilación oxidativa, se hidroliza en

procesos como la síntesis de proteínas, ácidos nucleicos y como ya se menciono

en el transporte activo (Bowman et al., 1988; Guerra-Sánchez et al., 1995).

Las ATPasas se distinguen por su composición de subunidades, la presencia o

ausencia de un intermediario fosforilado, por la sensibilidad a inhibidores

específicos, por la estequiometria ión/ATP y por la fisiología de sintetizar o

hidrolizar ATP (Pedersen and Carafoli, 1987). Las ATPasas de membrana de

acuerdo a su composición proteica, localización celular, función y mecanismo de

acción se han clasificado en tres grupos: F-ATPasas (F1/F0 o mitocondriales), V-

ATPasas (vacuolares) y P-ATPasas (fosforilables) (Van Der Rest et al., 1995).

Una de las principales herramientas que más han servido para caracterizar a las

diferentes ATPasas, son los inhibidores específicos de cada tipo de ATPasa

(Cuadro 3).


11

Cuadro 3. Comparación de la sensibilidad a los principales inhibidores de las ATPasas.

Inhibidor V-ATPasa F- ATPasa P-ATPasa

Vanadato NI NI 1 µM

Azida de sodio NI 30 µM NI

Nitrato de potasio 50 mM NI NI

Los valores son constantes de inhibición. NI.- no inhibe. Adaptado de Blasco et al., 1981; Bowman et al., 1978; Guerra-Sánchez et al., 1995.

1.6 Las ATPasas tipo-P

Las ATPasas tipo-P o ATPasas de protones (H+ATPasa) son una familia

importante de proteínas de membrana plasmática que acoplan la hidrólisis de ATP

para el transporte activo de cationes a través de la membrana celular de hongos,

algas, protistas y algunas plantas vasculares (Blasco et al., 1981; Portillo et al.,

2000). La familia de las ATPasas tipo-P puede subdividirse en dos grupos

basándose en la especificidad del catión (McDonald et al., 1984). Los miembros

del grupo P1 transportan metales pesados tales como el Cu+2, Cd+2, y Hg+2,

mientras que los miembros del otro grupo (P2) transportan un amplio número de

cationes monovalentes y divalentes incluyendo H+, Na+, K+, Mg2+ y Ca2+.

Estructuralmente en Saccharomyces cerevisiae las H+ATPasa están constituidas

por una cadena polipeptédica de 100 KDa, este peso es similar al de las

H+ATPasa de otros hongos (Ferrerira et al., 2001). En S. cerevisiae la H+ATPasa

representa entre el 7-10% de las proteínas totales de la membrana plasmática. Se

encuentran alrededor de 106 enzimas por cada célula, generando un flujo de

protones que oscila entre 106 a 107 protones por segundo por célula (Serrano,

1988). El gradiente electroquímico que genera la H+ATPasa es utilizado por

acarreadores secundarios para transportar nutrientes como aminoácidos y

azucares, por mecanismos de cotransporte con el protón y para mover cationes


12

como Na+ y Ca2+ por antitransporte con el protón (Goffeau and Slayman, 1981).

Además, este gradiente de potencial electroquímico se utiliza en la regulación del

pH citosólico, el balance osmótico, la tolerancia a los metales pesados, etc.

(Weissman, 2000).

Las H+ATPasas están unidas a la membrana plasmática por 8-10 segmentos

transmembranales. La mayor parte de la cadena polipeptídica se encuentra en el

citosol incluyendo los extremos amino y carboxilo terminal y dos asas

citoplasmáticas de gran tamaño (figura 4) (Ferrerira et al., 2001).

Figura 4.- Topología de la H

+ATPasa de la membrana plasmática de S. cerevisiae, basado en

cristalografía de segunda y tercera dimensión. N y C terminales se encuentran en el citoplasma. Las líneas en zig-zag representan las regiones que se consideran estructuras secundaria del tipo α-hélice. Tomado de Ferrerira et al., 2001.

La región amino terminal es la que menos conserva la estructura primaria y

también es la que más varía en el número de residuos de aminoácidos que la

integran, hasta 115 en las ATPasas de protones de los hongos (Serrano, 1988).

Exterior

Interior


13

Estudios cinéticos detallados han confirmado que las ATPasas presentan dos

estados conformacionales (E1 y E2) durante su ciclo de reacción (Nakamoto et al.,

1989), además de que forman un intermediario fosforilado con el fosfato gamma

del ATP, llamado aspartil-fosfato (Bowman et al., 1978; Hubbard et al., 1986);

Cabe resaltar que el vanadato puede sustituir al fosfato uniéndose a la enzima con

gran afinidad por lo que la ATPasa queda inhibida.

Las H+ATPasas de hongos y plantas se regulan tanto a nivel transcripcional como

a nivel postraduccional (Portillo, 2000). En S. cerevisiae y S. pombe la actividad

enzimática depende de las condiciones de crecimiento (Serrano, 1988). Algunos

factores que incrementan la actividad de la enzima son las fuentes de carbono

fermentables, también existen agentes estresantes como las temperaturas

supraóptimas, los choques térmicos, la disminución de las fuentes de carbono o

de nitrógeno, las altas concentraciones de etanol, de metales, de sales o la

acidificación del medio de cultivo, que se han reportado como activadores de la

enzima (Eraso and Gancedo, 1987; Benito et al., 1992; Hernández et al., 2002).

Efecto del quitosano en la funcionalidad de la membrana plasmática Rhizopus stolonifer ANTECEDENTES

14

ANTECEDENTES

El efecto antifúngico del quitosano en el desarrollo in vitro de Rhizopus stolonifer

ha sido demostrado mediante la inhibición del crecimiento micelial, la esporulación

y germinación de este fitopatógeno. En ese mismo trabajo se demostró que

quitosanos de diferentes pesos moleculares afectan la forma y la ornamentación

de las esporas de R. stolonifer (Hernández-Lauzardo et al., 2008).

Investigaciones previas han demostrado que la inhibición de crecimiento que

genera el quitosano en contra de R. stolonifer depende del medio de cultivo,

siendo mayor en medios ricos como PDA, además de que el fenómeno es

proporcional al aumento en la concentración que se utiliza (datos no publicados).

Otros estudios realizados con R. stolonifer en medio mínimo líquido evidencian

que el quitosano incrementa la liberación de proteínas y de compuestos que

absorben a 260 y 280 nm, aumenta el consumo de glucosa y la actividad

hexocinasa alterando el metabolismo celular (Guerra-Sánchez et al., 2009).

Investigaciones recientes indican que el quitosano afecta a R. stolonifer

incrementado el consumo de oxigeno, lo cual está relacionado con el aumento en

el numero de mitocondrias que presentan de forma normal las esporas. Otros

cambios que se identificaron en este trabajo fueron que hay un aumento en las

actividades de la isocitrato deshidrogenasa, la citocromo c oxidasa y la ATP

sintetasa, componentes importantes de la cadena respiratoria mitocondrial, por lo

que también se ve modificada (datos no publicados).

Efecto del quitosano en la funcionalidad de la membrana plasmática Rhizopus stolonifer JUSTIFICACIÓN

15

JUSTIFICACIÓN

Los hongos fitopatógenos causan pérdidas cuantiosas durante el transporte y

almacenamiento de los productos hortofrutícolas. El uso de compuestos

antifúngicos biodegradables y no tóxicos como el quitosano representa una

alternativa natural para extender la vida de anaquel de estos productos, sin causar

daños al ambiente y a la salud humana. Se ha demostrado que el quitosano afecta

e inhibe el desarrollo de diferentes hongos fitopatógenos, entre ellos Rhizopus

stolonifer. El mecanismo de acción de este polímero no ha sido del todo elucidado.

La propuesta más apoyada es la que involucra el carácter policatiónico de la

molécula, que provoca alteraciones en la permeabilidad de la membrana

plasmática generando la salida de componentes del interior de la célula. Sin

embargo, son escasos los estudios que involucran el efecto del quitosano en la

estructura y función de los principales componentes de la membrana. Por lo

anterior, en esta investigación se propone estudiar el efecto del quitosano en la

funcionalidad de la membrana plasmática de R. stolonifer.

Efecto del quitosano en la funcionalidad de la membrana plasmática Rhizopus stolonifer HIPÓTESIS

16

HIPÓTESIS

El quitosano podría afectar la funcionalidad de la membrana plasmática de

Rhizopus stolonifer provocando cambios en la concentración de fosfolípidos y

proteínas de la membrana y en la actividad de la H+ATPasa.

Efecto del quitosano en la funcionalidad de la membrana plasmática Rhizopus stolonifer OBJETIVOS

17

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Estudiar el efecto del quitosano en la funcionalidad de la membrana plasmática de

Rhizopus stolonifer.

OBJETIVOS PARTICULARES

Evaluar el efecto del quitosano en la integridad de la membrana plasmática en

esporas de R. stolonifer.

Determinar los cambios en el pH del medio, potencial de membrana y salida de

potasio por efecto del quitosano.

Comparar la concentración de fosfolípidos totales de la membrana plasmática en

ausencia y presencia de quitosano.

Cuantificar el contenido de proteínas en la membrana plasmática del hongo

cultivado con y sin quitosano.

Determinar los cambios en la actividad de la H+ATPasa de la membrana

plasmática por la presencia de quitosano.

Efecto del quitosano en la funcionalidad de la membrana plasmática Rhizopus stolonifer MATERIAL Y MÉTODOS

18

MATERIAL Y MÉTODOS

2.1 Muestra biológica

Se utilizó un aislado de Rhizopus stolonifer (R3) la cual fue obtenida de frutos de

jitomate (Lycopersicon esculentum Mill) del tipo “Saladette” en el Estado de

Morelos (Hernández-Lauzardo et al., 2006).

2.2 Solución de quitosano

Se preparó una solución concentrada de quitosano [10 mg mL-1] de bajo peso

molecular (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) pesando 2 g de quitosano en una

balanza analítica, se disolvió en 100 mL de agua destilada más 2 mL de ácido

acético y se dejó homogenizar por agitación constante durante 24 h. Transcurrido

el tiempo se ajustó el pH en un potenciómetro a 5.6 adicionando NaOH al 1 N. Se

filtró la solución con una gasa de algodón y se aforó a 200 mL con agua destilada.

Se esterilizó en autoclave a 121ºC durante 15 min. A partir de la solución madre

de quitosano se obtuvo la concentración evaluada [2 mg mL-1] (Guerra et al.,

2009).

2.3 Medios de cultivo

Se empleó agar papa dextrosa (PDA) (Bioxon) (anexo) para mantener y propagar

el aislado utilizado en este estudio. El medio mínimo (MM) líquido ajustado a pH

5.6 se usó para determinar el efecto del quitosano sobre el crecimiento de R.

stolonifer (Guerra et al., 2009).

Medio mínimo: glucosa 10 g L-1; NH4NO3 3 g L-1; solución de sales y elementos trazas 62.5 mL L-1.

Solución de sales: KH2PO4 16 g L-1; Na2SO4 4 g L-1; KCl 8 g L-1; MgSO4 2 g L-1; CaCl2 1 g L-1; Elementos traza 8 mL L-1.

Elementos trazas: H3BO3 60 mg L-1; MnCl2-4H2O 140 mg L-1; ZnCl2 400 mg L-1; Na2MoO4-2H2O 40 mg L-1; FeCl3-6H2O 100 mg L-1; CuSO4-5H2O 400 mg L-1.


19

2.4 Condiciones de cultivo y obtención del inóculo fúngico

El aislado de Rhizopus stolonifer (R3) se cultivó en medio PDA a 25 ± 2 °C

durante 96 h. Para obtener el inóculo se tomaron discos de 5 mm de diámetro o se

prepararon suspensiones de esporas (1X106 esporas mL-1) (anexo) según fuera el

caso.

2.5 Cinética de germinación

Se inoculó 1 mL de las suspensiones de esporas (1X106 esporas mL-1) del aislado

R3 en 100 mL de MM. Se incubaron durante 0, 3, 4, 5 y 6 h en agitación constante

(140 rpm) a 25 ± 2 °C de forma independiente. Las células se observaron en un

microscopio óptico a 40X. Se observaron varios campos al azar y se contaron 100

esporas. Se consideró como espora germinada en el momento que su tubo

germinal fuera igual o mayor al diámetro de la espora (El Ghaouth et al., 1992).

2.6 Variación del pH durante el crecimiento de Rhizopus stolonifer


R3 en 100 mL de MM en presencia de quitosano [2 mg mL-1]. Los testigos no

contenían quitosano. Se incubaron durante 0, 3, 6 y 12 h en agitación constante

140 rpm a 25 ± 2 °C de forma independiente. Se colectó el medio de cultivo y se

centrifugó a 8000 rpm, para eliminar las esporas y se determinó el pH del medio

de cultivo, en un potenciómetro previamente calibrado con dos estándares de pH

(3 y 7).

2.7 Determinación de la integridad de la membrana de las esporas y micelio


R3 en MM en presencia de quitosano [2 mg mL-1]. Los testigos no contenían

quitosano. Se incubaron durante 4, 5 y 6 h en agitación constante (140 rpm) a 25

± 2 °C de forma independiente. Se recolectaron las esporas y se centrifugó a 8000

rpm, se lavó con un regulador de fosfatos (50 mM Na2HPO4) pH 7.0 para eliminar


20

residuos del medio de cultivo. A las esporas se les adicionó ioduro de propidio a

10 µg mL-1, se incubó durante 5 min a 25 ± 2°C. Las esporas se lavaron con el

mismo regulador para eliminar restos del colorante. Las células se observaron en

un microscopio de fluorescencia (40X). Se observaron 3 campos aleatorios y se

contaron el total de esporas y la cantidad de esporas teñidas (Liu et al., 2007).

La integridad de la membrana se calculó con la siguiente fórmula:

MI (%) = No. de esporas totales – No. de esporas teñidas × 100

No. de esporas totales

2.8 Potencial de la membrana plasmática

Se inoculó 10 mL de las suspensiones de esporas (1X106 esporas mL-1) del

aislado R3 en 100 mL de MM en presencia de quitosano [2 mg mL-1]. Los testigos

no contenían quitosano. Se incubaron durante 6 h en agitación constante (140

rpm) a 25 ± 2 °C. Las esporas se lavaron en 2 ocasiones con agua destilada

estéril, al final las esporas se resuspendieron en agua destilada. El potencial de la

membrana plasmática de las esporas de R. stolonifer se estableció siguiendo la

fluorescencia del DiSC3(3) (Peña et al., 1984). La determinación se realizó en 1.8

mL de regulador (MES 10 mM pH 6.0/TEA), 0.02 mL (glucosa 1 M), 0.05 mL

(CaCl2 10 mM), 0.002 mL (CCCP 10 mM). El trazo se inició por la adición de

0.01mL (1X106 esporas) de una suspensión de esporas germinadas.

Posteriormente, a los 50 segundos de trazo se añadió 0.005 mL de cianina 0.1

mM, por último se adicionó 0.03 mL de KCl2 2 M a los 300 segundos. La

fluorescencia se registró a 540-590 nm.

2.9 Salida de Potasio


R3 en 100 mL de MM. Se incubaron durante 12 horas a 25 ± 2°C en agitación

constante (150 rpm). El micelio se lavo 2 veces con agua destilada estéril, al final


21

el micelio se resuspendió en agua destilada (mL g-1). En la cámara de ensayo se

colocó un electrodo selectivo de iones potasio, 3.95 mL de regulador (MES 2 mM

pH 6.6/Tris, glucosa 10 mM) y 0.05 mL de la suspensión celular. El trazo se inició

y se dejó que se estabilizara, después de 40 segundos se adicionó 1 mL de

quitosano de una solución concentrada [10 mg mL-1] para obtener una

concentración final de 2 mg mL-1. En el caso del testigo, se inició el trazo y nunca

se adicionó quitosano, se dejo trascurrir el mismo tiempo que en el otro ensayo.

Las lecturas se registraron en una computadora en donde se observó la salida del

ion potasio.

2.10 Obtención de membranas plasmáticas de R. stolonifer

Suspensiones de esporas de 1 mL del aislado R3 fueron inoculadas en matraces

con 100 mL de MM con quitosano [2 mg mL-1]. Los testigos no contenían

quitosano. Se incubaron a 25 ± 2 °C en agitación constante (140 rpm) durante 12

h. Se colectó la biomasa y se sometió a una digestión con enzimas líticas durante

3h a 30 °C. El rompimiento mecánico se realizó en presencia de inhibidores de

proteasas y estabilizadores de proteína para asegurar la integridad de la

membrana (1 M Sorbitol pH 7.4/Tris base, 50 mM KH2PO4, 1 mM EDTA, 1mM

PMSF, 5 mM DTT). El homogenado se centrifugó a 4000 rpm a 4 °C durante 5 min

y el extracto crudo se sometió a una centrifugación diferencial, se centrifugó a

8000 rpm a 4 °C durante 15 min y se continuó con una ultracentrifugación a 35000

rpm a 4 °C durante 1 h, para obtener una fracción de membranas plasmáticas

crudas, las cuales se resuspendieron en 0.5 mL de regulador (1 mM EGTA pH

7.2/Tris base). Para la purificación de las membranas plasmáticas crudas se utilizó

un gradiente discontinuo de glicerol (80, 70, 55 y 40%), preparado en un regulador

(10mM Tris pH 7, 1mM EDTA, 0.5% Azolectina) y se centrifugó a 35000 rpm a 4

°C durante 3 h. Se recuperaron las bandas y se lavaron utilizando el regulador de

EGTA. El marcador de membranas plasmáticas que se utilizó fue la actividad de la

H+ ATPasa.


22

2.11 Cuantificación de fosfolípidos en la membrana plasmática.

La cuantificación de los fosfolípidos presentes en las membranas plasmáticas

comenzó con la extracción de los fosfolípidos en la cual se utilizó con una mezcla

de cloroformo/etanol (2:1), con la que re realizaron tres lavados, se recuperó la

fase orgánica de cada uno de los lavados en un solo vial, después el total de la

fase orgánica se sometió a una evaporación con nitrógeno hasta sequedad (Folch

et al., 1957). Posteriormente el residuo se resuspendió en metanol y se cuantificó

el fosforo total presente en los fosfolípidos utilizando el método de Fiske–

Subbarow modificado (Dryer et al., 1957).

2.12 Observación de las membranas plasmáticas en el microscopio

electrónico.

La observación en el microscopio electrónico de transmisión (Transmission

Electron Microscope JEM-1010), se realizó utilizando las membranas plasmáticas

purificadas, se colocó aproximadamente 20-25 µg de proteína de membrana en

unas rejillas de cobre que contenían una membrana de Formvar como soporte, se

incubaron las rejillas durante 5 min a 25 ± 2°C en ambiente húmedo.

Posteriormente se agregó ácido fosfotúngstico al 0.5% y se incubaron las rejillas

durante 30 seg, se retiró la solución del ácido y se dejaron secar la muestras

durante 90 min. Para posteriormente observarse al microscopio electrónico de

transmisión

2.13 Concentración de proteínas presentes en las membranas plasmáticas

La concentración de proteínas se determinó por el método de Lowry (Kit-comercial

500-0114 BioRad) (Lowry et al., 1951), utilizando albúmina sérica bovina (BSA)

como proteína estándar. Para determinar la concentración de proteínas se

construyó una curva tipo con una solución concentrada de BSA (0.5 mg mL-1).

Para elaborar la curva tipo (anexos) diferentes volúmenes de la solución de BSA y

los reactivos A y B del kit comercial fueron mezclados en un Vortex y se incubaron

a 25 ± 2 °C durante 10 min. Para realizar la lectura se utilizó un espectrofotómetro


23

a una longitud de onda de 655 nm, se ajustó a 0 con el blanco de reactivos.

Posteriormente, se interpolaron las lecturas de absorbencia obtenidas para cada

muestra en la curva tipo y se convirtieron las absorbencias en g L-1. La curva

tipo se realizó por duplicado para aumentar el grado de confianza.

Para cuantificar las proteínas presentes en las muestras de membranas se utilizó

0.002 mL de cada una de las muestras en diferentes tubos. Se adicionaron los

reactivos A y B del kit comercial y se mezclaron en Vortex, se dejaron incubando

durante 10 min. Se leyeron en un espectrofotómetro a 655 nm, donde se ajustó a

0 con el blanco de reactivos. Finalmente, se realizaron los cálculos para convertir

las concentraciones en mg mL-1.

2.14 Actividad de H+ ATPasa

La actividad de la enzima se realizó utilizando membranas plasmáticas purificadas

en presencia de azida de sodio para inactivar a las ATPasas mitocondriales. La

mezcla de reacción constaba de 5 mM ATP, 5 mM MgCl2, 10mM PIPES, 5 mM

Azida de sodio, 5 mM PEP, 0.005mL de Piruvato cinasa (por cada 1mL de mezcla

de reacción que se preparó), se ajustó a pH 6.7/Tris base y 28 – 30 µg de proteína

de membrana. La reacción se inició con la adición de la proteína, se incubó por 10

min a 30 °C y se detuvo con 0.01 mL de TCA 30% en un baño de hielo para evitar

la hidrólisis del ATP residual. El fosfato liberado por la enzima se midió utilizando

el método de Fiske–Subbarow modificado (Dryer et al., 1957), en el que el Pi en el

medio reacciona con el molibdato de amonio formando un complejo fosfo-

molibdato de amonio, produciendo el complejo azul de molibdeno, que absorbe a

660 nm. Se utilizó fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4•H20) como estándar (1

µmol Pi/0.5 mL).Para elaborar la curva tipo diferentes volúmenes de una solución

de fosfato de sodio monobásico y los reactivos se mezclaron en Vortex y se

incubaron en hielo durante 10 min. Para realizar la lectura se utilizó un

espectrofotómetro a una longitud de onda de 660 nm, se ajustó a 0 con blanco de

reactivos. Posteriormente, se interpolaron las lecturas de absorbencia obtenidas

para cada muestra en la curva tipo y se convirtieron las absorbencias en nmolPi

L-1. La curva tipo se realizó por duplicado para aumentar el grado de confianza.


24

2.15 Cinética enzimática de la actividad de H+ ATPasa

La cinética enzimática se realizó utilizando membranas plasmáticas purificadas.

Se utilizó una solución madre de ATP-Mg a concentración de 24 mM, el cual se

varió dependiendo del ensayo, también se empleó un regulador de reacción (100

mM MES pH 5.7/Tris base, 10 mM MgCl2, 10 mM PEP y 10 mM NaN3) y 28 – 30

µg de proteína de membrana. La reacción se inició con la adición de la enzima, se

incubó por 10 min a 30 °C y se detuvo con 0.01 mL de TCA 30% en un baño de

hielo. El fosfato liberado por la enzima se medió utilizando el método de Fiske–

Subbarow modificado (Dryer et al., 1957).

2.16 Diseño de experimentos y análisis estadístico

Los experimentos se realizaron mediante un diseño completamente al azar. Los

datos se procesaron mediante un análisis de varianza de una vía con el paquete

estadístico Sigma Stat versión 2.0.

Efecto del quitosano en la funcionalidad de la membrana plasmática Rhizopus stolonifer RESULTADOS

25

RESULTADOS

3.1 Cinética de germinación

Los resultados obtenidos para el aislado R3 se muestran en la figura 5. Se

observa que existe un periodo en el que las esporas no germinan (0 a 3 h). A las

4 h inició la germinación, observándose un 15 % de esporas germinadas, después

a las 5 h este porcentaje aumentó hasta un 70 %. Posteriormente, a las 6 h se

evidenció un porcentaje de germinación del 88 %. Este porcentaje se incrementó

cuando se realizó la cuantificación a las 7 h, mostrándose un máximo del 91 % de

germinación.

Figura 5.- Cinética de germinación. Porcentaje de germinación de las esporas Rhizopus stolonifer cultivado en medio mínimo con agitación constante a temperatura de 25 ± 2 °C. La barra representa la desviación estándar de 3 repeticiones.


26

En la figura 6 se observa la germinación de esporas de R. stolonifer, la elongación

del tubo germinal (4, 5 y 6 h) y la ramificación del micelio después de 7 h de

incubación en medio mínimo.

Figura 6.- Microfotografía de la cinética de germinación. Germinación de esporas de Rhizopus stolonifer cultivadas en medio mínimo durante 7 h en agitación constante a temperatura de 25 ± 2 °C. 400X.

3.2 Variación del pH durante el crecimiento de Rhizopus stolonifer

Los resultados obtenidos con el aislado R3 se muestran en la figura 7. Se observa

que el testigo provocó una acidificación gradual del medio de cultivo durante el

periodo de incubación. Cuando se cultivó al hongo en presencia de 2 mg mL-1 de

quitosano se observó que no hay una acidificación del medio, a las 12 h de

incubación el pH disminuyó a 5.4, prácticamente se mantiene el pH original de 5.6.

En cambio, en el tratamiento testigo el pH disminuyó a partir de las 6 h de

incubación obteniéndose un pH de 5.3. A las 9 h de incubación el pH disminuyó a

4.7 y a las 12 h de incubación el valor de pH fue de 3.5.


27

Figura 7.- Efecto del quitosano sobre el pH del medio de cultivo. Determinación del pH del medio mínimo con y sin quitosano a diferentes tiempos de incubación de Rhizopus stolonifer cultivado en agitación constante a temperatura de 25 ± 2 °C. La barra representa la desviación estándar de 3 repeticiones.

3.3 Determinación de la integridad de la membrana de las esporas y del

micelio.

En la figura 8 se observan las esporas de R. stolonifer teñidas con ioduro de

propidio. Se demuestra que la tinción es selectiva y solo penetra el compuesto a

las esporas que tienen afectada su integridad por efecto del quitosano.

En la figura 9 se observa que el porcentaje de integridad de membrana (%IM) en

las esporas del testigo se mantiene casi constante (95 %) durante todo el tiempo

de incubación. En cambio, cuando el hongo fue cultivado en presencia de 2 mg

mL-1 de quitosano, el porcentaje IM disminuye conforme aumenta el tiempo de

exposición de 4, 5 y 6 h, siendo de 85.68, 76.31 y 62.65, respectivamente para las

muestras en MM.


28

Figura 8.- Microfotografía del efecto del quitosano sobre la integridad de membrana plasmática de las esporas de Rhizopus stolonifer. Las esporas de Rhizopus stolonifer fueron incubadas en medio mínimo en ausencia y presencia de quitosano [2 mg mL

-1] incubadas en

agitación constante a 25 ± 2 ºC y teñidas con ioduro de propidio. (A) Fluorescencia, filtro de rodamina. (B) Luz visible. 400X.

Figura 9.- Efecto del quitosano sobre la integridad de membrana plasmática de las esporas de Rhizopus stolonifer. Las esporas fueron incubadas en medio mínimo en ausencia y presencia de quitosano [2 mg mL

-1] en agitación constante a temperatura de 25 ± 2 °C. La barra representa la

desviación estándar de 3 repeticiones.


29

En la figura 10 se observa el micelio de R. stolonifer teñido con ioduro de propidio.

Esta figura demuestra que la penetración del colorante al micelio es selectiva y

que este efecto se mantiene por lo menos hasta las 12 horas de incubación.

Figura 10.- Micrografía del efecto del quitosano sobre la integridad de la membrana plasmática del micelio de Rhizopus stolonifer. El micelio de Rhizopus stolonifer crecido en presencia (A y B) y ausencia (C y D) de quitosano [2 mg mL

-1] durante 12 h en medio mínimo con

agitación constante a 25 ± 2 ºC teñido con ioduro de propidio. (A y C) Fluorescencia, filtro de rodamina. (B y D) Luz visible. 400X.


30

3.4 Potencial de la membrana plasmática de esporas de R. stolonifer

En la figura 11 se observan los cambios de fluorescencia de DiSC3(3) de las

esporas incubadas en presencia y ausencia de quitosano. En los resultados

obtenidos con el aislado R3 testigo se observó un aumento en la fluorescencia, lo

que indica la existencia de un potencial de membrana plasmática producido por la

H+ATPasa.

En cambio, las esporas tratadas con quitosano mostraron un comportamiento

diferente al de las esporas testigo. Se observó un incremento en la fluorescencia,

aunque de menor intensidad, también se comprobó la existencia del potencial

adicionando KCl y se observó como disminuye la fluorescencia aunque en menor

proporción comparado con el testigo.

Figura 11.- Efecto del quitosano sobre el potencial de la membrana plasmática de las esporas de Rhizopus stolonifer. Las esporas de Rhizopus stolonifer fueron incubadas en medio mínimo durante 6 h en ausencia y presencia de quitosano [2 mg mL

-1] en agitación constante a 25

± 2 ºC. El trazo representa el promedio de 3 repeticiones.


31

3.5 Salida de potasio del micelio provocado por la presencia de quitosano.

Los resultados con el aislado R3 se muestran en la figura 12. Se observa que en

el trazo correspondiente al testigo no hubo salida del ion potasio que se

encontraba dentro del micelio del hongo durante el tiempo que se estableció el

ensayo. En cambio, cuando al micelio se le adicionó un pulso de quitosano, los

niveles de potasio comenzaron a aumentar y este fenómeno se mantuvo durante

todo el experimento.

Figura 12.- Efecto del quitosano sobre la salida de K+ de las esporas de Rhizopus stolonifer.

Las esporas de Rhizopus stolonifer fueron incubadas en medio mínimo durante 6 h en ausencia y presencia de quitosano [2 mg mL

-1] en agitación constante a 25 ± 2 ºC.

3.6 Fosfolípidos presentes en la membrana plasmática.

Los resultados obtenidos se presentan en el cuadro 4. Se observa que no existen

diferencias estadísticas entre la concentración de fosfolípidos totales de las

membranas plasmáticas del testigo comparada con la concentración de

fosfolípidos cuantificada a las membranas plasmáticas tratadas con quitosano

[2 mg mL-1].


32

Cuadro 4.- Concentración de fosfolípidos calculada a las diferentes muestras de

membranas plasmáticas de Rhizopus stolonifer crecido en medio mínimo durante 12 h.

Muestra Concentración de Fosfolípidos (µmolPi mg proteína -1)*

Membranas sin quitosano 1.111 ±0.520 a

Membranas con quitosano 1.185 ±0.635 a

*Los valores están seguidos por la desviación estándar de la media de 3 repeticiones. Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas de acuerdo a la prueba de rangos múltiples de Tukey p< 0.05

3.7 Observación de membranas plasmáticas en microscopio electrónico de

transmisión.

Se observó en el microscopio electrónico de transmisión las membranas

plasmáticas utilizando una tinción negativa, lo que confirma que nuestro método

de obtención de membranas es efectivo (figura 13).

Figura 13.- Microfotografía electrónica de transmisión de las membranas plasmáticas (MP) de R. stolonifer. El hongo fue incubado en medio mínimo durante 12 h en (a) ausencia y (b) presencia de quitosano [2 mg mL

-1] en agitación constante a 25 ± 2 ºC.


33

3.8 Proteínas presentes en las membranas plasmáticas.

Los resultados obtenidos con el aislado R3 se exponen en el cuadro 5. El testigo

presentó una concentración de proteína mayor (1.608 mg mL-1) comparado con la

concentración de proteínas cuantificada en las diferentes muestras del problema

(0.980 mg mL-1). Lo que indica que existe un 49 % menos de la proteína que

normalmente se presenta en la membrana plasmática del hongo.

Cuadro 5.- Concentración de proteínas cuantificadas a las diferentes muestras obtenidas

de Rhizopus stolonifer crecido en medio mínimo durante 12 h.

Muestra Concentración de Proteínas

(mg mL-1)*

Membranas sin quitosano 1.608 ±0.274 a

Membranas con quitosano 0.980 ±0.364 b


3.9 Actividad de H+ATPasa.

Los resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 6. Estos resultados indican

que la actividad de la enzima H+ATPasa es superior en el testigo comparado con

las actividades de los tratamientos con quitosano [2 mg mL-1]. Cabe resaltar, que

en las muestras de membrana que estuvieron en contacto con el polímero, la

actividad específica (0.479 μmolPi min-1 mg-1) se redujo aproximadamente en un

25 % comparado con el testigo (0.636 μmolPi min-1 mg-1) y la actividad total de los

membranas plasmáticas problemas (0.247 μmolPi min-1 mL-1) también se redujo

en un 50 % aproximadamente, comparado con la actividad total cuantificada a las

membranas plasmáticas testigo (0.514 μmolPi min-1 mL-1).


34

Cuadro 6.- Actividad de la H+ATPasa calculada a las diferentes muestras de membranas

plasmáticas de Rhizopus stolonifer crecido en medio mínimo durante 12 h.

Muestra Actividad específica

(μmolPi min-1 mg-1)*

Actividad total

(μmolPi min-1 mL-1)*

Membranas sin quitosano 0.636 ±0.063 a 0.514 ±0.112 a

Membranas con quitosano 0.479 ±0.095 b 0.247 ±0.120 b


3.10 Cinética enzimática de la H+ATPasa de la membrana plasmática.

En la figura 14 se muestran los resultados obtenidos con el aislado R3 donde se

comparan las dos cinética enzimática de las diferentes H+ATPasa, con y sin

tratamiento de quitosano [2 mg mL-1]. Se puede observar que cuando se utilizaron

las membranas testigo la cinética alcanzo una Vmax de 0.496 μmolPi min-1 mg-1,

en cambio, cuando se utilizaron las membranas tratadas con quitosano la Vmax

disminuyó a 0.361μmolPi min-1 mg-1 (Cuadro 7), lo que indica que existe una

reducción del 25 % de la actividad específica de la H+ATPasa, provocada por la

presencia del quitosano. Un fenómeno similar ocurrió con la Km, las membranas

plasmáticas testigo presentaron un valor de Km de 0.330 mM ATP, sin embargo,

las membranas plasmáticas problemas presentaron un valor de Km de 0.192 mM

ATP (Cuadro 7), lo que refleja una reducción del 42 % aproximadamente.


35

[ATP] mM

0 1 2 3 4

Act.

Espe

cific

a (U

mg-

1)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Figura 14.- Efecto del quitosano sobre la cinética enzimática de la H+ATPasa de membrana

plasmática de Rhizopus stolonifer. El hongo fue incubado en medio mínimo durante 12 h en (•) ausencia y (◦) presencia de quitosano [2 mg mL

-1] en agitación constante a 25 ± 2 ºC. La barra

representa la desviación estándar de 3 repeticiones.

Cuadro 7.- Valores de la Velocidad máxima y de la Km obtenidos del curso temporal de la

actividad de la H+ATPasa de membrana plasmática de Rhizopus stolonifer.

Muestra Vmax

(μmolPi min-1 mg-1)*

Km

(mM ATP)*

Membranas sin quitosano 0.496 ±0.033 a 0.330 ±0.042 a

Membranas con quitosano 0.361 ±0.011b 0.192 ±0.017 b


Efecto del quitosano en la funcionalidad de la membrana plasmática Rhizopus stolonifer DISCUSIÓN

36

DISCUSIÓN

Rhizopus stolonifer es un fitopatógeno que produce pérdidas económicas debido

a que causa la pudrición blanda en productos hortofrutícolas. Tradicionalmente, el

control de este hongo se ha realizado empleando fungicidas químicos sintéticos,

pero los riesgos que implica su uso para el medio ambiente y la salud humana

unido a la resistencia que se ha generado a los químicos sintéticos han conllevado

a la búsqueda de diferentes alternativas naturales para su control entre las que se

encuentra el quitosano (Triphathy and Dubey, 2004; Velázquez-del Valle et al.,

2008).

En esta investigación, se estudió el efecto del quitosano sobre la integridad de la

membrana plasmática de las esporas y previamente se determinó la cinética de

germinación de las mismas, encontrándose resultados coincidentes con los

reportados en la literatura (Van-Etten et al., 1974). La cinética de germinación que

se estableció bajo estas condiciones de cultivo e incubación para R. stolonifer

evidenció que las esporas comenzaron a germinar a las 4 h de incubación,

obteniéndose un porcentaje máximo de germinación (91%) a las 7 h de

incubación. Los resultados del pH del medio de cultivo reflejaron que disminuye en

el medio donde se cultiva el hongo sin quitosano, mostrándose la acidificación del

mismo, por el contrario, la adición del polímero abatió esta tendencia de

acidificación, manteniéndose estable el pH durante las 12 h de incubación. Este

efecto podría deberse a que el quitosano induce la salida de compuestos que

neutralizan la acidez del medio o también podría afectar la salida de protones al

medio de cultivo, estas hipótesis no han sido demostradas en estudios previos

incluso este efecto por acción del quitosano no se ha reportado a la fecha.

Con relación a la integridad de la membrana de R. stolonifer, se observó que la

misma se afectó en presencia de quitosano [2 mg mL-1], obteniéndose un


37

porcentaje de integridad de membrana de 62.65 a las 6 h de incubación, lo que

sugiere que hay cambios en la permeabilidad de la membrana. Estos resultados

concuerdan con los ya reportado por Liu et al., (2007), donde ellos observan como

la integridad de membrana también disminuye en los hongos Botrytis cinerea y

Penicillium expansum, siendo más sensible P. expansum (aún comparando a los

tres hongos). Adicionalmente, otras investigaciones demostraron que el quitosano

permeabilizó y penetró la membrana plasmática de diferentes células fúngicas

(hifas, esporas y tubos germinales) mediante un proceso dependiente de energía

(ATP), los autores sugirieron que el polímero interactuó con los componentes

externos de la membrana provocando cambios conformacionales que implicaron la

formación de poros (Palma-Guerrero et al., 2008; 2009). En investigaciones

recientes se propone a la membrana plasmática como el principal blanco de

acción del quitosano en hongos (Park et al., 2008), otros autores como Rabea et

al., (2003) y Eikenes et al., (2005) plantean que el quitosano interacciona con la

membrana plasmática de las célula alterando la permeabilidad de dicha estructura.

Además, existen resultados que aportan evidencia acerca de que el quitosano [2.5

mg mL-1] permeabilizó diferente tipos de células fúngicas (levaduras, conidios y

micelio) con las que estuvo en contacto durante 24 h (Park et al., 2008).

Una vez demostrado el cambio en la permeabilidad de la membrana plasmática

del hongo, se estudiaron las variaciones en el potencial de la membrana

plasmática de dicho hongo, esto por la relación que hay entre la permeabilidad, el

bombeo de protones y la generación del potencial de membrana. Los resultados

demostraron que existieron variaciones en el potencial de la membrana plasmática

cuando el hongo estuvo en contacto con el quitosano, la intensidad del potencial

de la membrana que se generó es menor comparado con el testigo, este resultado

puede deberse a que la H+ATPasa que es la principal encargada del bombeo de

protones y generación del potencial de membrana no esté funcionando de forma

normal, existen reportes en los que se demostró que la actividad de la H+ATPasa

de plantas fue inhibida por el quitosano (Amborabé et al., 2008). En este estudio

se debe tener en cuenta que la integridad de la membrana está disminuida y la


38

permeabilidad está alterada, lo que puede provocar que no se genere un potencial

de membrana óptimo. Es importante destacar que no existen reportes previos en

hongos filamentosos del efecto del quitosano sobre el potencial de membrana, en

este estudio se demuestra su afectación.

Con este trabajo se demuestra que el quitosano afecta funciones básicas de la

membrana plasmática de R. stolonifer, por lo que se evaluó si esté fenómeno

estaba provocando la salida de moléculas propias del citosol del hongo. El K+ es

un elemento casi exclusivo del interior de las células, está involucrado en el

balance osmótico entre la célula y el medio que la rodea, también juega un papel

en el control del pH intracelular, participa en el potencial de membrana, funciones

enzimáticas, entre otros. Su medición es aparentemente sencilla, gracias a la

existencia de electrodos específicos para el K+. Los resultados evidenciaron la

salida de K+ de las esporas íntegras de R. stolonifer después de haberles

adicionado una cantidad conocida de quitosano. Esto sugiere que el polímero

afecta la membrana plasmática de tal forma que provocó la liberación de K+, lo

que podría explicarse por la activación de distintos canales, por los cuales se da la

salida de K+ de la célula, también existe la posibilidad de que los canales que se

pudieran estar activando sean canales de potasio dependientes de voltaje. Estos

resultados se pueden apoyar con los reportados por Enríquez-Freire et al., (1999)

donde este grupo de trabajo demostró la salida de K+ de la levadura S. cerevisiae

cuando estuvo en contacto con 4 compuestos catiónicos (dietilaminoetil-dextran

DEAE-D, dihidroestreptomicina DHS, cloruro de terbio y bromuro de etidio EB), los

autores afirmaron que la salida de K+ inducida por los compuestos catiónicos no

se deriva de un efecto generalizado debido a su interacción con la cargas

negativas de la membrana plasmática de la levadura, sino que parece depender

de diferentes mecanismos propios de cada agente, aunque para la mayoría de

ellos el fenómeno parece implicar la interacción de las cargas negativas de la

membrana plasmática con las cargas positivas de los compuesto. De igual forma,

se explica la que la salida de K+ se debe dar por la activación de canales

dependientes o no de voltaje. Existen otros trabajos (Thevissen et al., 1996; 2003)


39

donde se demuestra que otro tipo de compuestos catiónicos como son las

defensinas producidas por plantas, tienen el mismo efecto sobre los células

fúngicas (Neurospora crassa), provocando la liberación de K+. Las defensinas

afectan la permeabilidad de la membrana plasmática, debido a una interacción

entre las defensinas y los fosfolípidos de la membrana, resaltando que las

interacciones más fuertes se dan específicamente con los esfingolípidos, que son

los fosfolípidos que presentan la mayor carga negativa en la membrana

plasmática. Estos autores también coinciden en que la salida de K+ tiene que estar

mediada por la activación de canales de potasio y de sistemas de antiporte K+/H+

(Thevissen et al., 1996). Todos estos efectos en los cuales está involucrado la

salida incontrolada de K+ a lo que conlleva es a inducir alteraciones en el

crecimiento celular y en el desarrollo de los organismos (Zhao et al., 2008), lo cual

se pudo observar microscópicamente y macroscópicamente en R. stolonifer

después de haber sido cultivado en presencia de quitosano (resultados no

mostrados).

En este trabajo, al cuantificar los fosfolípidos totales de la membrana plasmática

de R. stolonifer no se encontraron cambios en la concentración de los mismos. Sin

embargo, en reportes previos se demostró que en bicapas lipídicas sintéticas, el

quitosano logró disgregar a los fosfolípidos al grado de generar poros de un gran

tamaño, debido a las fuertes interacciones hidrofóbicas, electrostáticas y dipolos

que se establecieron entre el quitosano y las colas de los fosfolípidos (Fang et al.,

2001; Pavinatto et al., 2007). En este estudio, aunque la membrana está siendo

afectada por la presencia del quitosano, se podría inferir que esta estructura se

mantiene en una biosíntesis constante y reparándose continuamente, para

permitirle al hongo seguir sobreviviendo a pesar del estrés que el quitosano le está

causando.

Una vez que se demostró que el quitosano estaba alterando la membrana

plasmática in situ e in vivo, se decidió trabajar con las membranas aisladas para

determinar algunos otros parámetros que podrían estar afectados por la presencia


40

del quitosano. Resultados previos demostraron que se liberan proteínas al medio

de cultivo cuando el hongo crece en presencia de quitosano (Guerra-Sánchez et

al., 2009). Sin embargo, se desconoce si estas proteínas son propias o no de la

membrana plasmática. Los resultados de este estudio mostraron que

efectivamente existe una disminución en la concentración de proteínas presentes

en la membrana plasmática de R. stolonifer cuando el hongo se incubó en

presencia de quitosano. Este fenómeno pudo deberse a la desestabilización o

disminución en la integridad de la membrana plasmática provocando la liberación

no controlada de péptidos y/o proteínas membranales, otra posible explicación es

que la mayoría de las proteínas transmembranales (H+ATPasa, Gas1p) se

encuentran asociadas a las “Balsas lipídicas” del Inglés “lipid rafts” ricas en

esfingolípidos y ergosterol (Ferrerira et al., 2001), las cuales podrían ser afectadas

por las interacciones con el quitosano provocando el desprendimiento de péptidos

y/o proteínas que estaban ancladas a la membrana plasmática. Adicionalmente,

una tercera explicación podría ser que la presencia del polímero inhiba la síntesis

de algunas proteínas de la membrana, se desconoce la causa de este fenómeno

pero el efecto del quitosano es evidente.

Estos resultados justificaron que se realizara la determinación de la actividad

enzimática de una de las proteínas más importantes de la membrana plasmática,

la H+ATPasa. Se realizó la determinación de la actividad de la H+ATPasa de

membrana plasmática de R. stolonifer, los resultados mostraron que tanto la

actividad específica como la actividad total de la H+ATPasa se ven disminuidas un

25 y 50 % respectivamente, cuando el hongo es cultivado en presencia de

quitosano. Estos resultados están muy relacionados con la disminución en la

concentración de proteínas presentes en la membrana celular y con la explicación

que se propuso del porque podría ocurrir ese fenómeno. Estos resultados

concuerdan con los estudios que ya existen en los cuales se evidenció que el

quitosano inhibió la actividad de la H+ATPasa, demostrándose una vez más que la

membrana plasmática, aunque de la células vegetales en este caso, también es el

principal blanco de acción de este polímero (Amborabé et al., 2008). Otros


41

reportes señalan que la desorganización de lípidos de membrana de S. cerevisiae

provocados por altas concentraciones de cobre están involucrados en la disipación

del gradiente electroquímico producido por la H+ATPasa, afectando la

funcionalidad y disminuyendo la actividad de la enzima, generando la acidificación

citosolica del hongo (Fernandes et al., 1998). Lo que podría estar ocurriendo en el

caso de este estudio, aclarando que aquí el quitosano es el agente que provoca la

desorganización en la membrana plasmática.

Otros resultados interesantes que se obtuvieron de la H+ATPasa, fueron sus

valores de Vmax y de Km. Ambos parámetros fueron inhibidos por la presencia del

quitosano durante la incubación del hongo. Los valores de Vmax y de Km

disminuyeron en un 25 y 42 % respectivamente, lo que podría deberse a los

cambios en la permeabilidad, a los cambios en el potencial de membrana, a la

disminución del contenido de proteínas de la membrana, a la desorganización de

los fosfolípidos, entre otros factores. Existe un reporte previo que señala que en

mutantes de S. cerevisiae a las que les eliminaron los 18 últimos amino ácidos del

extremo carboxilo terminal de la proteína H+ATPasa, la mutación provocó que las

levaduras presentaran una disminución en el valor de la Km comparada con las

levaduras silvestres. En ese mismo trabajo lograron generar una mutante a la que

le eliminaron los primeros 27 aminoácidos del extremo amino terminal, de la

proteína H+ATPasa. Esta mutación provocó que la levadura presentara una Vmax

menor comparada con las levaduras silvestres (Mason et al., 1998). Lo que

podría sugerir que en este caso el quitosano esté afectando la integridad de la

membrana plasmática, sobre todo a las balsas lipídicas y esto a su vez afectaría a

la H+ATPasa, liberándolas, fragmentándola y generando enzimas que no trabajen

adecuadamente.

Los resultados obtenidos en esta investigación, demuestran el efecto antifúngico

del quitosano sobre el hongo fitopatógeno R. stolonifer expresado a través de las

afectaciones a la funcionalidad de la membrana plasmática del hongo

fitopatógeno, aspecto que contribuye a esclarecer el mecanismo de acción del

quitosano y que podría repercutir en desarrollar mejores estrategias de control del

fitopatógeno.

Efecto del quitosano en la funcionalidad de la membrana plasmática Rhizopus stolonifer CONCLUSIONES

42

CONCLUSIONES

La presencia del quitosano causa la pérdida de integridad de la

membrana plasmática de las esporas de R. stolonifer.

El pH del medio, el potencial de membrana y la salida de K+ de las

esporas se afectan por la presencia del quitosano.

El quitosano no afecta el contenido de fosfolípidos totales de la

membrana plasmática del micelio de R. stolonifer.

El quitosano ocasiona la disminución de las proteínas de la

membrana plasmática del micelio de R. stolonifer.

La actividad de la H+ ATPasa y sus parámetros cinéticos (Vmax y

Km) disminuyen por efecto del quitosano.

Efecto del quitosano en la funcionalidad de la membrana plasmática Rhizopus stolonifer Perspectivas

43

PERSPECTIVAS

Estudiar el efecto del quitosano y de agentes permeabilizantes conocidos

(digitonina, TritonX-100, tolueno, etc.) en la permeabilización de las células

fúngicas.

Investigar la actividad de enzimas claves que estén involucradas en la síntesis y el

recambio de fosfolípidos como lo son las fosfolipasas (A, C y D), debido a que

podría estar acelerada la síntesis o el recambio, lo cual contribuiría a explicar que

las membranas no presentan alteraciones en los resultados de fosfolípidos totales.

Cuantificar los fosfolípidos de la membrana plasmática del hongo, en condiciones

naturales y bajo la presencia de quitosano. Esto ayudaría a comprobar si existen

cambios en la cantidad y variedad de los fosfolípidos a causa del quitosano, lo que

podría estar provocando interacciones electrostáticas más fuertes entre el

quitosano y la membrana.

Comprobar si el quitosano penetra a las células de R. stolonifer (hifas y/o esporas)

y demostrar su localización celular. Esto se podría realizar utilizando microscopia

confocal y marcando al quitosano con algún compuesto fluorescente, lo que

permitiría profundizar las investigaciones sobre alguna de las estructuras a la cual

el quitosano se uniera.

Con respecto al estudio de la H+ATPasa, se podría continuar con la búsqueda de

la proteína en los sobrenadantes (medio de cultivo), para lo cual se tendría que

implementar un método de purificación y concentración. Esto ayudaría a

comprobar si esta proteína de membrana está siendo liberada al medio como

consecuencia de la presencia del quitosano. Adicionalmente, se podría demostrar

si se altera la expresión de la proteína por la presencia de quitosano.

Efecto del quitosano en la funcionalidad de la membrana plasmática Rhizopus stolonifer Anexos

44

ANEXOS

Agar Papa Dextrosa (PDA) (BIOXON) PDA en polvo 39 g Agua destilada 1000 mL Preparación: Pesar 39 g de agar papa dextrosa en polvo en una balanza analítica,

disolver en 500 mL de agua destilada, calentar a ebullición por 1 minuto con

agitación periódica, después aforar a 1000 mL con agua destilada y esterilizar en

autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Esperar a que enfríen un poco y en

condiciones de esterilidad, verter el medio a las placas Petri estériles, dejar

solidificar a temperatura ambiente y almacenarlas en refrigeración hasta su uso.

Curva tipo de albumina sérica bovina por el método de Lowry

BSA ( L) Reactivo A

( L)

Reactivo B

( L)

Concentración

final ( g/ L)

0 100 800 0

10 100 800 5

20 100 800 10

40 100 800 20

60 100 800 30

Solución de Albúmina Sérica Bovina (BSA) 0.5 mg/mL

BSA 0.005 g

Agua destilada 10 mL

Preparación: Pesar 0.0005 g de BSA en una balanza analítica, disolver

perfectamente en 10 mL de agua destilada. Separar en viales en volúmenes de 1

mL y congelar hasta su uso, cada vial se utiliza una sola ocasión.


45

Curva tipo de fosforo para la actividad de H+ATPasa por el método de Fiske–Subbarow.

NaH2PO4•H20

( L)

TCA 8.3%

( L)

Molibdato de

Amonio ( L)

Elon 0.05%

( L)

Concentración

final (nmolPi L-1)

0 250 250 250 0

20 250 250 250 40

40 250 250 250 80

50 250 250 250 100

60 250 250 250 120

Concentración de ATP empleado para la cinética enzimática. Solución madre de ATP-Mg a concentración de 24 mM

ATP

( L)

Concentración de

ATP (mM)

Regulador de

reacción ( L)

0.0 0.00 250.0

2.6 0.25 247.4

5.2 0.50 244.8

7.8 0.75 242.2

10.4 1.00 239.6

13.0 1.25 237.0

15.6 1.50 234.4

20.8 2.00 229.2

31.2 3.00 218.8

41.6 4.00 208.4

Hidróxido de Sódio 1 N NaOH 10 g Agua destilada 250 mL Preparación: Pesar 10 g de NaOH en una balanza analítica, disolver con agua destilada y aforar a 250 mL.


46

Suspensión de Esporas

Para preparar la suspensión de esporas se necesitan una caja de Petri que tenga

un crecimiento del hongo entre el 90-100%, este se logra con 4 días de

incubación, adicionar 10 mL de agua destilada estéril con el fin de empapar las

esporas de Rhizopus stolonifer, con una varilla de vidrio flameada previamente,

frotar toda la superficie de la caja de Petri, recuperar el volumen directamente en

un vaso de precipitados y agregar otros 10 mL de agua destilada estéril, para

tener una suspensión de esporas en 20 mL. Una vez preparada utilizarse

inmediatamente. Para conocer la cantidad de esporas es necesario realizar el

conteo de esporas en una cámara de conteo (Neubauer), de esta manera se sabe

cantidad de esporas que se están inoculando por mililitro de suspensión utilizada.

Efecto del quitosano en la funcionalidad de la membrana plasmática Rhizopus stolonifer BIBIOGRAFÍA

47

BIBLIOGRAFÍA

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