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Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa

Efecto del pH en la actividad enzimática


• pH– También afecta la forma y por lo tanto la tasa de reacción, cada

enzima tiene un pH óptimo.– Éste está entre pH 6 - 8 para la mayoría de las enzimas.– Sin embargo, las enzimas digestivas en el estómago están

diseñadas para trabajar mejor a pH 2 mientras las del intestino tienen un óptimo a pH 8, ambas se ajustan a su medio ambiente.


Aminoácidos

�no polares

�Polares

�Ácidos

�bases

Las cadenas laterales (grupos R) en aminoácidos pueden ser:

y éstos determinan el comportamiento en agua

Alanina Leucina Valina Isoleucina

Glicina Serina Treonina Asparagina Glutamina

Ác. aspártico Ác. glutámico Cisteína Tirosina

Lisina HistidinaArgenina

Prolina Metionina Fenil alanina Triptofano


De los 20 amino ácidos, 13 tienen dos grupos ionizables, los grupos alfa-carboxilos y los alfa-amino. Los 7 amino ácidos restantes tienen tres grupos ionizables, debido a que su grupo R también puede ser ionizado.

El pH del ambiente del amino ácido y el pK de los grupos ionizables determinarán la carga asociada con un amino ácido.


Aminoácidos más comunes en el sitio activo

Cisteina

Serina

Histidina

Aspartato

Glutamato

Lisina


Ionización de las cadenas lateralesForma que predomina

debajo del pKaForma que predomina

arriba del pKapKa

3.9

Aspartato

1 3162

4.1Glutamato

1 1995

Histidina

6.0

1 25

CH2 COOH CH2 COO

CH2 CH2 COOCH2 CH2 COOH

CH2

N

NH

H

CH2

N

NH


Cisteina

8.4

101

Tirosina

10.1

500 1

CH2 SH CH2 S

CH2 OCH2 OH

Forma que predomina debajo

del pKa

Forma que predomina arriba

del pKa

pKa

Ionización de las cadenas laterales


Lisina

10.5

Arginina

12.5

12601

125890 1

CH2 CH2 CH2 CH2 NH3 CH2 CH2 CH2 CH2 NH2

CH2 CH2 CH2 NH CNH2

NH2

CH2 CH2 CH2 NH CNH

NH2

Forma que predomina debajo del pKa

Forma que predomina arriba del pKapKa

Ionización de las cadenas laterales


Los grupos ionizables en las proteinas frecuentemente tienen valores de pKa perturbados los cuales corresponden al de la identificación del residuo

La perturbación en los pKa es el resultado del hecho de que los grupos ionizables están frecuentemente en un ambiente más hidrofóbico dentro de la proteina y están

involucrados frecuentemente en redes de enlaces hidrógeno


La Quimotripsina es una enzima digestiva que pertenece a la superfamilia de las serin proteasas. Utiliza un residuo activo de serina para llevar a cabo la hidrólisis en el C-terminal de los aminoácidos aromáticos de otras proteínas. La Quimotripsina es una proteas que enlaza el C-terminal de fenilalanina, triptofano y tirosina en cadenas de péptidos. Tiene especificidad por los aminoácidos aromáticos debido a su bolsa hidrofóbica.

El estudio de su cinética proporciona evidencia de Mecanismo Ping-Pong


pH Influences Chymotrypsin Activity

5 6 7 8 9 10 11pH

Relative A

ctivity

Ada

pted

from

Dre

ssle

r &

Pot

ter

(199

1) D

isco

verin

g E

nzym

es,p

.162


Charge R

elay in Active S

ite

Ser195

His 57

Asp 102

H–O–CH2

OC–O -=

Active Ser

H–N N

C C

C

H

H

CH2

Ser195

His 57

Asp 102

-O–CH2

OC–O–H

=

N N–H

C C

C

H

H

CH2

Ada

pted

from

Alb

erts

et a

l (20

02)

Mol

ecul

ar B

iolo

gy o

f the

Cel

l (4e

) p.

158


Imidazole on Histidine Is Affected by pH

H–N N

C C

C

H

H

H+

pH 6 pH 7

+H–N N–H

C C

C

H

H

Inactive+ Ser

195

His 57

Asp 102

H–O–CH2

OC–O -=

H–N N–H

C C-H

C

CH2

H

Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158

Ada

pted

from

Dre

ssle

r &

Pot

ter

(200

0) D

isco

verin

g E

nzym

es,p

.163


http://glencoe.mheducation.com/sites/dl/free/0078759864/383930/BL_11.html


Actividad (pH óptimo) Estabilidad


El efecto de pH sobre la cinética enzimática en solución K1 K2

−

+

−−

+

−

← →

← →

+

+

+

+

2EEEH

H

H

H

donde: E- denota la forma activa de la enzima E y E2- son formas inactivas obtenidas por protonación y desprotonación del sitio activo. El equilibrio ácido base entre las tres especies E, H+, y E-, requiere

1Ke

eh =−+

2

2

Ke

eh =−

−+

Si e0 denota la concentración total de enzima

−− ++= 20 eeee

la fracción activa 0e

ey

−− = y está dado por

−−

−−

++≡

2eee

ey

+

−−

−+

−−

++=

h

eKe

K

eh

ey

2

1

+

+−

++=

h

K

K

hy

2

1

1

1


Tomando logaritmos

++−= +

+−

h

K

K

hy 2

1

1loglog

Vmax esta definida como: catkeV 0max = , además sabemos que 0e

ey

−− = , por lo tanto

+

+−

++==

h

K

K

h

ekyekV cat

cat2

1

00max

1

Por lo tanto graficando log Vmax versus pH debe exhibir el mismo comportamiento que log y- versus pH.


Estimación de pK1 y pK2 más importantes del sitio activo de forma gráfica


POLYMATH Results 06-26-2007 Nonlinear regression (L-M) Model: vmax = kcat*0.003/(1+pH/pk1+pk2/pH) Variable Ini guess Value 95% confidence kcat 2.0E+04 1.998E+04 29.947656 pk1 4.2 3.3031477 0.0064151 pk2 6.2 8.4916206 0.0164501 Nonlinear regression settings Max # iterations = 64 Precision R^2 = 0.9999999 R^2adj = 0.9999999 Rmsd = 6.776E-05 Variance = 5.624E-08 General Sample size = 7 # Model vars = 3 # Indep vars = 1 # Iterations = 7

Estimación de pK1 y pK2 más importantes del sitio activo por regresión no-lineal

+

+−

++==

h

K

K

h

ekyekV cat

cat2

1

00max

1


Ho-Shing Wu, Ming-Ju Tsai. 2004. Kinetics of tributyrin hydrolysis by lipase. Enzyme and Microbial Technology 35: 488–493.

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