Efecto de toxinas proteicas vegetales sobre células tumorales en cultivo.

Autor: Jorge Quirce Amarillo.

Tutores: Juan Carlos Sacristán

Lucía Citores González.

Fecha: Marzo de 2019.

Índice.

u  1. Introducción.

u  2. Objetivos.

u  3. Métodos.

u  4. Resultados.

u  5. Conclusiones.

Introducción Cultivos celulares

u  Definición.

u  Clasificación.

RIPs

u  Definición.

u  Clasificación.

u  Actividad enzimática.

u  Interacción de RIPs con las

células.

u  Aplicaciones RIPs.

u  Ricina.

u  Nigrina b.

Nigrina b

Ricina

RIPs no tóxicas

RIPs tóxicas

Sambucus nigra

Ricinus communis

Las RIPs inhiben irreversiblemente la síntesis de proteínas en la etapa de elongación

Actividad enzimática N-glicosidasa Depurinación específica del rRNA 28S en eucariontes

Interacción de RIPs con las células

RIP tipo 1

RIP tipo 2

Muerte celular

RIPs pueden conducir a la apoptosis celular.

Protrusiones en la membrana y colapso nuclear

Célula normal Destrucción de la célula

Aplicaciones RIPs

u  Papel biológico.

Agentes de defensa frente a virus, hongos o insectos.

u  Aplicaciones.

•  Agrícolas: efecto sobre agentes patógenos de las plantas.

•  Terapéuticas: inmunoconjugados para la terapia contra el cáncer o enfermedades como el SIDA.

Ricina

Ø  Definición. Ø  Antecedentes.

Nigrina B

Ø  Definición. Ø  Antecedentes.

Objetivos u  Caracterizar las proteínas vegetales nigrina b y ricina estructuralmente

mediante electroforesis.

u  Estudiar las actividades que presentan las proteínas: actividad lectina y actividad inhibidora de síntesis de proteínas.

u  Estudiar la toxicidad de las proteínas en células tumorales en cultivo.

u  Obtener una visión del funcionamiento celular y entender el mecanismo de muerte celular inducido por la ricina y nigrina b.

u  Aprender los principios básicos de los cultivos celulares y el manejo de materiales y equipos del laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular.

Metodología

Ensayo de viabilidad

WST1

Ensayo de aglutinación

Observación al microscopio

SDS-PAGE

Síntesis de proteínas en lisados de reticulocitos de conejo dirigida por mensajero de la luciferasa

Cultivos celulares

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Detección de actividad aglutinante de eritrocitos

Ricina Nigrina b

Síntesis de proteínas en lisados de reticulocitos de conejo dirigida por mensajero de la luciferasa

Mix

Lisado de reticulocitos de conejo

luminómetro

Vector de expresión- gen de la luciferasa

Transcripción: 10 min 30ºC Traducción: 30 min 30ºC

Preparación de cultivos celulares

u  Descongelación de las líneas celulares. (-190ºC a 37ºC).

u  Cultivo de células tumorales. (37ºC, 5% CO2, 95% O2,

cada lunes y viernes)

Ensayo de viabilidad sobre células HeLa y COLO 320.

24, 48, 72 h

ELISA reader multiskan

Deshidrogenasas mitocondriales transforman WST1 en sal de formazán.

Brefeldina A y Galactosa. COLO 320.

(405 nm).

RESULTADOS Caracterización estructural. Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS Nigrina b

58600 Da

Ricina 61130 Da

26300 32300

29510 31620

2 cadenas 1 de mayor peso molecular. Similares pesos moleculares.

ricina

nigrina

Caracterización funcional. Actividad aglutinante en eritrocitos (Cadena B)

Ricina: 0,113 µg/mL. Nigrina b: 0,226 µg/mL.

Capacidad de aglutinación semejante.

Actividad inhibidora de síntesis de proteínas (Cadena A)

IC50 Ricina: 1,3 ng/mL. (10-11 M) Nigrina b: 1,4 ng/mL Capacidad inhibidora semejante.

IC50 48 horas (M) COLO 320 HeLaRicina 2,4x10-14 3,1x10-13Nigrina b 4x10-8 1,5x10-8

Toxicidad de las RIPs sobre las células tumorales humanas en cultivo. Muerte celular

Células COLO 320 Células HeLa

COLO320 más sensibles por receptores de membrana. A mayor tiempo mayor toxicidad. Ricina más tóxica.

Efecto de la galactosa en la citotoxicidad de la ricina y la nigrina.

La cadena B lectina se une a galactosa por mayor afinidad.

Efecto de la Brefeldina A en la toxicidad de la ricina y nigrina

Ricina entra por Golgi. Nigrina b no.

Actividad apoptótica Mecanismos de muerte celular inducido por ricina y nigrina en células HeLa.

Cambios morfológicos

48 horas. Concentración: 10-13 M x400 aumentos.

Conclusiones.

1. La masa molecular de la nigrina b determinada mediante SDS-PAGE es 58600 Da y de la ricina es de 61130 Da. Ambas son proteínas diméricas, formadas por dos cadenas polipeptídicas unidas por un puente disulfuro.

2. La nigrina b y la ricina poseen una cadena B con similar actividad aglutinante de eritrocitos. 3. La nigrina b y la ricina poseen una cadena A con similar actividad inhibidora de síntesis de proteínas con un IC50 de 2x10-11 M en un extracto acelular de reticulocitos de conejo. 4. A pesar de que ambas inhiben la síntesis de proteínas en extractos acelulares a concentraciones similares, la ricina es de 100000 a 1000000 de veces más tóxica que la nigrina b en células COLO y HeLa, indicando que la ricina es capaz de translocar a través de la membrana para alcanzar los ribosomas citosólicos con mucha más eficacia que la nigrina. 5. El grado de citotoxicidad de ambas proteínas depende de la dosis de toxina y del tiempo de incubación, siendo las células COLO 320 más sensibles que las células HeLa a las toxinas.   6. Ambas toxinas entran en la célula uniéndose a receptores que contienen galactosa.   7. Ricina y nigrina b siguen rutas intracelulares distintas. La ricina para acceder a los ribosomas citosólicos sigue una ruta intracelular que implica al aparato de Golgi mientras que la nigrina no.   8. La ricina y la nigrina inducen apoptosis en ambas líneas celulares.