EFECTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS DE Ageratina...
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EFECTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS DE Ageratina vacciniifolia SOBRE EL POTENCIAL REGULADOR DE LA FRECUENCIA CARDÍACA Y REGENERADOR DE LA ALETA CAUDAL DEL MODELO ANIMAL PEZ CEBRA CINDY ROCÍO ORTIZ AMADOR UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA BOGOTÁ, 2017
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EFECTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS DE Ageratina vacciniifolia SOBRE EL
POTENCIAL REGULADOR DE LA FRECUENCIA CARDÍACA Y REGENERADOR
DE LA ALETA CAUDAL DEL MODELO ANIMAL PEZ CEBRA
CINDY ROCÍO ORTIZ AMADOR
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ, 2017
EFECTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS DE Ageratina vacciniifolia SOBRE EL
POTENCIAL REGULADOR DE LA FRECUENCIA CARDÍACA Y REGENERADOR
DE LA ALETA CAUDAL DEL MODELO ANIMAL PEZ CEBRA
CINDY ROCÍO ORTIZ AMADOR
DIRECTORA
ZAYRA VIVIANA GARAVITO AGUILAR, PhD.
Profesor Asistente
Departamento de Ciencias Biológicas
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
DIRECTORA
BERTA INÉS DELGADO FAJARDO, PhD.
Profesor Titular
Proyecto Curricular Licenciatura en Química
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ, 2017
A mi negra, la más grande
mujer que he conocido
que me impulsa a luchar
y alcanzar mis sueños
Te amo mami.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco enormemente todo el esfuerzo que ha hecho mi adorada madre en apoyarme para
lograr terminar esta carrera y superar muchos de los obstáculos que se han atravesado en el
camino. A mi hermano que es un gran apoyo cuando he necesitado una palabra de aliento y
me ha brindado su mano amiga en los momentos más necesarios. A mi papá que cada día
hacía el esfuerzo de brindarme su mayor colaboración.
A las personas que llevó en el corazón y más que mis compañeros y amigos son como mis
hermanos, Tatiana, Ana, Andrés, Darcy y Lida. Con ustedes recorrí este hermoso camino de
la enseñanza y aprendizaje. Aprendí que caerse es volverse a levantar y que las adversidades
siempre estarán hay para estropear el camino, pero que al final siempre hay una salida para
superar las dificultades. A la profesora Yurany Moreno que con ese carisma que la
caracteriza, logro plasmar en mí el amor a la ciencia y la bioquímica. A la profesora Berta
Inés Delgado que me enseño el sentido de la responsabilidad, el esfuerzo y la dedicación.
Uno de los mejores ejemplos de ser humano y maestra que ilumino mi camino en la
universidad.
A la profesora Zayra Viviana Garavito que creyó en mí cuando un día inesperadamente decidí
tocar a su puerta. Que con la nobleza que la caracteriza me brindo horas de enseñanza para
culminar exitosamente este trabajo. A la universidad Distrital que me dio incontables
experiencias, fue la casa en la que refugie en el conocimiento. A la universidad de los Andes
y especialmente al Grupo de Investigación de Biología del Desarrollo.
A la profesora Chiara Carazzone, y nuestros compañeros Jerson Benavides y Diego Camelo
por su ayuda con los procesos de extracción de las plantas. A los profesores Jorge Robles,
Ricardo Vera y Milton Hernández de la Universidad Javeriana, por su colaboración con la
colecta e identificación de la planta.
A todas esas lindas y agradables personas que conocí de la mano de este proyecto, Majito,
Cami, Cristián, Laurita, Laura V, Mariana, Andrés y Lucia. Por dejar esa huella que causa la
risa, por su apoyo no solo académico si no emocional, porque con ustedes yo me sentí parte
de una minifamilia. Finalmente a mis chicas Tatiana y Lida que siempre estuvieron hay sin
dudarlo, esas manos amigas incondicionales en esta chocoaventura. Nunca hubiera sido lo
mismo sin su presencia, ustedes que no dudaron un solo instante en mis capacidades y
creyeron en mí hasta el final.
CONTENIDO
RESUMEN ...................................................................................................................... 1
1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 2
2. ANTECEDENTES .......................................................................................................... 4
2.1. Evidencias experimentales de Ageratina vacciniifolia. ........................................... 4
2.2. Evidencias experimentales toxicológicas del pez cebra (Danio rerio) .................... 5
2.3. Evidencias experimentales de la alteración de frecuencia cardiaca y regeneración
de la aleta caudal en pez cebra ............................................................................................ 6
3. JUSTIFICACION............................................................................................................ 8
4. OBJETIVOS.................................................................................................................. 10
4.1. Objetivo general ..................................................................................................... 10
4.2. Objetivos específicos ............................................................................................. 10
5. MARCO TEORICO ...................................................................................................... 11
5.1 Región de páramo .................................................................................................. 11
5.2. Botánica y taxonomía Ageratina vacciniifolia ...................................................... 12
5.3. Modelo toxicológico Artemia Salina ..................................................................... 16
5.4. Descripción general del pez cebra (Danio rerio) ................................................... 16
5.5. Cardiogénesis del pez cebra ................................................................................... 24
5.6. Aleta caudal del pez cebra ..................................................................................... 27
6. HIPOTESIS ................................................................................................................... 29
7. METODOLOGÍA ......................................................................................................... 30
7.1. Obtención material vegetal. ................................................................................... 30
7.2. Cuidado, uso y manipulación animal. .................................................................... 32
7.3. Bioensayo de preliminar con Artemia Salina ........................................................ 33
7.4. Toxicología ............................................................................................................ 34
7.3. Parámetros Morfológicos de la prueba .................................................................. 35
7.4. Modelo de regeneración a la lesión de la aleta caudal ........................................... 36
7.5. Modelo de alteración de la frecuencia Cardiaca .................................................... 37
8. RESULTADOS Y DISCUSION ............................................................................... 39
8.1. Identificación de los metabolitos secundarios presentes en Ageratina
vacciniifolia ...................................................................................................................... 39
8.2. Toxicologia bioensayo Artemia Salina. ................................................................. 40
8.3. Toxicologia bioensayo pez cebra (Danio rerio). ................................................... 42
8.4. Influencia de tiempo de inmersión frente a la mortalidad ..................................... 44
8.5. Efectos morfológicos de los experimentos toxicológicos ...................................... 46
8.6 Evaluación de la regeneración de la aleta caudal........................................................ 53
8.7 Evaluación de la frecuencia cardiaca .......................................................................... 57
9. RECOMENDACIONES ............................................................................................... 60
10. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 60
11. BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................... 63
LISTA DE ABREVIATURAS
CL50 Concentración Letal 50
LOEC Concentración mínima con efecto observado
NOEC Concentración máxima sin efecto observado
mpf minutos post fertilización
hpf horas post fertilización
dpf días post fertilización
m.s.n.m metros sobre el nivel del mar
hpi horas post inmersión
hpa horas post amputación
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Paramos en el mundo. ........................................................................................... 11 Figura 2. Páramo de Cruz Verde. ......................................................................................... 12 Figura 3. Ageratina vacciniifolia. ......................................................................................... 13 Figura 4. Estructuras derivadas del Kaurano ........................................................................ 15 Figura 5. Estadios de desarrollo de la Artemia salina (tomada) [63]. .................................. 16 Figura 6. Diferencias morfológicas del pez cebra. ............................................................... 18 Figura 7. Órganos principales del pez cebra......................................................................... 18 Figura 8.Ciclo de embriogénesis del pez cebra. ................................................................... 19 Figura 9. Periodo cigoto. ...................................................................................................... 19 Figura 10.Segmentaciones celulares a partir del cigoto. ...................................................... 20 Figura 11. Blástula y principios de la epibolia. .................................................................... 20 Figura 12. Estructura de blástula pez cebra. ......................................................................... 21 Figura 13. Movimientos celulares durante la gastrulación del pez cebra. ............................ 22 Figura 14. Aparición de somitas en el pez cebra .................................................................. 22 Figura 15. Estructuras en desarrollo en etapa larval del pez cebra...................................... 23 Figura 16. Formación del corazón del pez cebra .................................................................. 24 Figura 17. Corazón humano y pez cebra ............................................................................. 25 Figura 18.Estructura química de la tricaina .......................................................................... 26 Figura 19. Regeneración de la aleta caudal pez cebra. ......................................................... 28 Figura 20.Resumen metodológico general. .......................................................................... 30 Figura 21. Tasa de mortalidad CL50 para el modelo de artemia salina ............................... 41 Figura 22. Grafica de LC50 para concentraciones de Ageratina vacciniifolia entre 1mg/L y
50mg/L ................................................................................................................................. 42 Figura 23. Gráfico de medias de Fisher de la influencia del tiempo sobre la mortalidad para
Ageratina vacciniifolia. ........................................................................................................ 45 Figura 24. Efectos morfologicos observados a la concentración de 3mg/L. ........................ 47 Figura 25. Posible inhibición del ácido kauranico ............................................................... 48 Figura 26. Crecimiento durante el desarrollo desde 24 hpi hasta 96 hpi de los tratamientos.
.............................................................................................................................................. 50 Figura 27. Efectos morfologicos observados en el estudio toxicológico a una concentración
de 2.5 mg/l. ........................................................................................................................... 51 Figura 28. Tamaño ocular evaluado desde 24hpi hasta 48 hpi. ............................................ 52 Figura 29. Tamaño del vitelo evaluado desde 24 hpi hasta 48 hpi ....................................... 53 Figura 30. Aparición del muñón seguido de la amputación de la aleta caudal .................... 54 Figura 31. Evolución del proceso regenerativo en la aleta caudal desde 72 hpa hasta 120 hpa.
.............................................................................................................................................. 55 Figura 32. Evolución de la longitud regenerada a partir de 72 hpa hasta 120 hpa .............. 56 Figura 33. Correlación mediante la prueba de múltiples rangos en las medias de Fisher .... 57 Figura 34. Evaluación de frecuencia cardiaca Latidos/minuto a cada una de las
concentraciones en mg/L ...................................................................................................... 59 Figura 35. Gráfica de Fisher de homogeneidad entre grupos de concentraciones ............... 59
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación taxonómica de Ageratina vacciniifolia (Benth.) Robert King y Harold
Robinson. .............................................................................................................................. 13
Tabla 2. Metabolitos secundarios producto de intermediarios en rutas primarias en las plantas
[53]. ...................................................................................................................................... 13
Tabla 3. Metabolitos secundarios reportados para el género Ageratina y especie vacciniifolia.
.............................................................................................................................................. 14
Tabla 4. Clasificación de toxicidad según CYTED [65]. ..................................................... 16
Tabla 5. Niveles anestésicos del pez cebra [74], [75]. ......................................................... 26
Tabla 6. Pruebas fitoquímicas utilizadas en la identificación de las familias o grupos de
metabolitos secundarios. ....................................................................................................... 31
Tabla 7. Resultados del analisis fitoquimico preliminar (+) presencia, (-) ausencia............ 39
Tabla 8.Concentraciones usadas para la curva de toxicidad y su respectivo CL50 en Artemia
salina. .................................................................................................................................... 41
Tabla 9. Concentraciones usadas en la curva de toxicidad (LC50). ..................................... 42
Tabla 10. Pruebas de Razón de Verosimilitud para las variables categóricas de la prueba
toxicológica .......................................................................................................................... 43
Tabla 11. Análisis de desviaciones en la regresión logística probit para el LC50 en pez cebra.
.............................................................................................................................................. 43
Tabla 12. Prueba de Bondad de ajuste para chi-cuadrado .................................................... 43
Tabla 13. Análisis de varianza para la mortalidad de Ageratina Vacciniifolia .................... 44
Tabla 14. Prueba de múltiples Rangos para la mortalidad influencia por el tiempo ............ 45
Tabla 15. Evaluaciones morfológicas observadas en el efecto tóxico ocasionado por
Ageratina vacciniifolia. ........................................................................................................ 46
Tabla 16. Concentraciones de metasulfonato de tricaína MS-222 ensayadas ..................... 58
1
RESUMEN
La especie vegetal Ageratina vacciniifolia pertenece a la familia Asteraceae, endémica de
los ecosistemas de Páramos. En la tradición etnobotánica se le han atribuido diversas
propiedades, entre ellas antimicrobiana (acción contra organismos), antifúngica (acción
contra hongos), febrífuga (reducción de la fiebre), antihipertensiva (regulación de la presión
sanguínea) y cardioreparadora (regulación en reparación de tejidos cardiacos). Teniendo en
cuenta que entre las primeras causas de muerte a nivel mundial se destacan las
enfermedades cardiovasculares, las cuales también son enfermedades de alta incidencia en
Colombia, la búsqueda de alternativas farmacológicas es fundamental. De ahí ha empezado
la tendencia de aprovechar la información etnobotánica de las fuentes naturales para
encontrar nuevas alternativas en la búsqueda o remplazo de medicamentos. Es por esto, que
el objetivo de este estudio es indagar si el extracto etanólico total de Ageratina vacciniifolia
posee algún potencial regenerador de la aleta caudal y estabilizador de la frecuencia
cardiaca en el modelo animal pez cebra (Danio rerio).
Aunque la mayoría de bioensayos enfocados a la búsqueda de respuestas biológicas se
desarrollan en modelos in vitro, estos modelos no cuentan con interacciones biológicas
necesarias para estimar los efectos secundarios que pueden ocasionar los componentes de
la planta. Por esta razón la implementación en Colombia del pez cebra como modelo animal
para evaluar la actividad biológica de productos naturales es de gran utilidad.
En este trabajo, se establecieron los valores de toxicidad CL50 siguiendo los protocolos
estándar de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE). Esta
se realizó en dos biomodelos: Artemia salina y larvas de pez cebra. La primera proporciona
una lectura gruesa de toxicidad y en el segundo se pueden detallar además de la toxicidad
los efectos morfológicos en el desarrollo. Este estudio encontró que la Concentración Letal
Media (CL50) para el extracto etanólico de Ageratina vacciniifolia en Artemia salina es
39.07 mg/L mientras que en larvas de pez cebra es 3.37 mg/L. En los efectos morfológicos
tertatogénicos se encontró que la concentración que causa daño más severo es 3 mg/L
generando: microftalmia, edema pericárdico, disminución del ritmo cardiaco, curvatura del
cuerpo, disminución de la longitud del cuerpo, degeneración muscular, falta de respuesta al
toque y necrosis.
Partiendo de una aproximación a la concentración máxima sin efecto observado se
evaluaron los efectos del extracto etanólico de total de Ageratina vacciniifolia frente a la
regeneración de la aleta caudal y la regulación de la frecuencia cardiaca. En la evaluación
del potencial regulador en la regeneración, se encontró que dependiendo de la concentración
se muestran comportamientos bimodales. Mientras que a 2 mg/L se potencia la
regeneración, a 2,5 mg/L se inhibe el proceso regenerativo estimulando la cicatrización con
respecto al control. En relación a la frecuencia cardiaca todas las concentraciones excepto
0.5 mg/L, mostraron reducción con respecto al control.
En conclusión, esta investigación contribuyó con evidencias que respaldan algunos de los
usos etnobotánicos descritos para la especie a partir del extracto etanólico total de Ageratina
2
vacciniifolia. Adicionalmente se estandarizaron metodologías usando el pez cebra para
evaluar la toxicidad, la regeneración y la frecuencia cardiaca aplicable a cualquier otra
sustancia.
Palabras Clave: Toxicología, Frecuencia Cardiaca, Regeneración, Morfología, Ageratina
vacciniifolia
1. INTRODUCCIÓN
En el páramo colombiano se pueden encontrar una gran variedad de especies endémicas
que atraen la atención por sus aplicaciones etnobotánicas, dependientes de sus metabolitos
secundarios. Actualmente, la química de los productos naturales es ampliamente estudiada
con la finalidad de obtener compuestos de uso farmacéutico, logrando identificar las
estructuras de interés. Para esto es necesario la extracción, aislamiento, análisis,
purificación y determinación estructural. Sin embargo, este proceso es prolongado y
paulatino. Es por esto que esta investigación busca un acercamiento inicial en la etapa de
extracción y evaluación con respecto a la contribución a las propiedades biológicas de
Ageratina vacciniifolia, especie endémica de las zonas andinas de alta montaña de
Colombia que se encuentra afectada por las condiciones naturales de paramo (temperatura,
húmeda, radiación solar entre otras) [1].
A partir de la indagación etnobotánica de la especie perteneciente a la familia Asteraceae
(Ageratina vacciniifolia) se han identificado usos en emulsiones para reducir la fiebre,
estimular la irrigación sanguínea en el área de la pelvis o útero, tratar la sífilis y disminuir
los gases en el tubo digestivo [2]. En cuanto a los grupos principales de metabolitos, se han
caracterizado e identificado en esta especie terpenos y flavonoides principalmente. De los
primeros se destacan efectos antioxidantes, antimutagénicos, antitumorales y
antiinflamatorios. De los segundos se sugieren efectos anticancerígenos, antihipertensivos
y cardiorreparadores [3].
Con la finalidad de brindar un soporte científico a las propiedades etnobotánicas, se utilizan
ensayos in vivo e in vitro. El más conocido es el in vitro, en donde los cultivos celulares se
han usado como un sistema para determinar la actividad metabólica. Sin embargo, en estos
bioensayos generalmente cuentan con un solo tipo de células o líneas celulares
inmortalizadas que no reproducen la estructura e interacción celular de un tejido en
respuesta al extracto o sustancia [4] .En contraparte los ensayos in vivo permiten evaluar la
interacción entre múltiples tejidos en un mismo sistema. Para este caso particular nuestro
organismo modelo el pez cebra “Danio rerio” está clasificado como un teleósteo. Posee
varias ventajas como la fácil manipulación, su transparencia en fases embrionarias y su
crecimiento externo. [5] [6]. Otras condiciones relevantes para su selección como modelo
son su corto tiempo de fecundación, permeabilidad, tamaño y bajo costo de manutención.
Las ventajas mencionadas lo han popularizado desde los años 50’s frente a otros modelos
3
usados desde la época (moho de lobo) Dictyostelium discoideum, (Hydra) Hydra
cohelenterata, (mosca de la fruta) Drosophila melanogaster y (la rana con garras) Xenopus
laevis [7]. Entre las acciones en aplicación experimental se conocen usos para examinar
daños o alteraciones morfológicas, efectos teratogénicos o mutagénicos ocasionados por
alguna sustancia tóxica. Gracias, ya que es posible examinar minuciosamente diferentes
aspectos de la actividad biológica de los productos naturales, en este caso particularmente
se evalúo el extracto etanólico total de la especie Ageratina vacciniifolia.
4
2. ANTECEDENTES
2.1. Evidencias experimentales de Ageratina vacciniifolia.
Ageratina vacciniifolia es una Asteraceae que geográficamente se puede encontrar al norte
de los Andes en Colombia [8] . Esta especie paramuna, mejor conocida en el país como
“chilco o carrasposa” ha sido poco investigada y aún se desconocen sus propiedades sobre
sistemas biológicos. Su descubrimiento se le atribuye a Georgius Bentham en 1839 descrita
como Eupatorium vacciniaefolium [9]. Sin embargo, su género Ageratina fue diferenciado
por primera vez del género Eupatorium en 1970 por Robert King y Harold Robinson,
nombrando 196 especies entre ellas Ageratina vacinniaefolia, actualmente según The
International Plant Names Index el nombre oficial de la especies es Ageratina vacciniifolia
[10]. En estudios realizados por Hernández. M. (2014) encontró diversidad metabólica al
género Ageratina nombrando poliacetilenos, derivados del timol (terpenoides volátiles),
cromenos, triterpenos, benzofuranos, sesquiterpenos, sesquiterpenlactonas, diterpenos y
flavonoides [11]. Además, de acuerdo a estudios realizados por el grupo investigación en
Fitoquímica del Departamento de Química de la Universidad Javeriana (GIFUJ). Se
identificaron para Ageratina vacciniifolia compuestos de naturaleza diterpénica. Entre estas
investigaciones se describe:
Hernández. M. (2014) evaluó la actividad antiinflamatoria con el modelo de
inflamación del tejido subcutáneo de la pata (aponeurosis plantar) en ratas wistar suizas
albinas. La inflamación fue inducida con un mucopolisacarido (pseudosolución de λ-
carragenina) sulfatado extraído del alga marina Chondrus crispu. La evaluación se
realizó por histopatología, el edema (hinchazón del tejido), la congestión vascular (vaso
dilatación) y el infiltrado inflamatorio (Tipo de células inflamatorias presentes en los
tejidos). Se confirmó que la especie Ageratina vacciniifolia posee actividad
antiinflamatoria moderada en comparación al control positivo (tratamiento con
diclofenaco). Además por el análisis de la identificación y elucidación de compuestos
bajo técnicas espectroscópicas se reconoció la presencia de compuestos de naturaleza
diterpénica que fueron postulados por el autor como responsable de esta actividad [11].
Gonzales. A. et al. (2000) estudió la actividad antimicrobiana evaluada en bacterias
gram positivas Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus donde se identificó que los
compuestos activos para la inhibición del crecimiento de la bacteria son de naturaleza
diterpenica especialmente derivados del kaurano [12].
Por último, Pescador. B. (1994) estudió la actividad antifúngica ante Fusarium
oxysporum donde observó que extractos de éter de petróleo y etanol de la especie de
interés tuvieron una acción inhibitoria del crecimiento de este hongo [13].
De acuerdo a los estudios anteriores, se describieron para Ageratina vacciniifolia
flavonoides y diterpenos [2]. Los flavonoides son reconocidos por ser potentes
antioxidantes, reduciendo la formación de radicales libres (aniones de peróxidos o
5
peroxidación lipídica) implicados en la reducción de enfermedades cardiovasculares [14].
Por otro lado, a los terpenos (diterpenos) se les ha atribuido acciones vasodilatadoras en el
sistema vascular [15]. Para la especie de interés teniendo en cuenta lo anterior se propuso
la evaluación de la restauración de la frecuencia cardiaca y la reparación de tejidos que se
explicaran más adelante.
2.2. Evidencias experimentales toxicológicas del pez cebra (Danio rerio)
El pez cebra (Danio rerio) se convirtió rápidamente en los años 60’s en la principal elección
como modelo genético funcional de vertebrados. Inicialmente George Streisinger (1986) en
la Universidad de Oregón realizó un estudio detallado sobre características del pez cebra y
propuso las primeras técnicas de cuidado [16]. Estas publicaciones fueron base para los
avances moleculares realizados por Chirstiane Nusslein Volhard y colaboradores en (1996)
cuando dieron a conocer más de 1200 mutantes del modelo [17]. Gracias a estas
investigaciones se pudo determinar una homología genética del 70% con humanos, 82% de
estos causantes de enfermedades [18]. Es así, que la implementación del modelo es una
gran apuesta para mejorar la comprensión de las funciones detalladas de los mecanismos
específicos de las enfermedades humanas.
En el 2000, Westerfield. M. estandarizó los métodos generales de manipulación y
manutención del bioterio [19]. Kimmel. C. (1995) realizó estudios detallados de las
descripciones morfológicas de las fases del desarrollo embrionario[20]. Aquellos son
referencia anatómica de todas las estructuras del organismo, con lo cual permite establecer
efectos fisiológicos y teratógenicos como respuesta al contactó con sustancias químicas. La
implementación toxicológica del modelo se empezó desde la década de los años 70’s para
identificar sustancias potencialmente nocivas, se aprovechó la fertilización externa, el
número de individuos por desove (n=100), la ausencia de pigmentos y coloración en
estadios tempranos de desarrollo. Ventajas que permitieron observar el proceso a partir de
la división celular de los blastómeros [21]. Con la ayuda del modelo se han probaron un
gran número de productos, entre ellos se destacan: industriales (sulfato de zinc), fungicidas
agrícolas (captan), fármacos (cloranfenicol ), metales pesados (mercurio, cadmio, zinc) [21]
.Compuestos polifenólicos de vino tinto [22] entre otros. Esta evaluación de toxicidad se ha
desarrollado usando parámetros estandarizados como la concentración letal 50 (CL50),
concentración mínima con efecto observado (LOEC) y concentración máxima sin efecto
observado (NOEC) para innumerables tipos de sustancias.
La Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE) es una entidad
internacional que regula y garantiza las directrices para la prueba de productos químicos,
entre ellas el test OCDE 236 (Fish Embryos Acute Toxicity) aplicado con éxito a una amplia
gama de sustancias que presentan diversos modos de acción [23]. De este modo se garantiza
un modelo toxicológico confiable y reproducible en el pez cebra, particularmente para la
indagación de la toxicología en fuentes vegetales del territorio colombiano.
6
2.3. Evidencias experimentales de la alteración de frecuencia cardiaca y
regeneración de la aleta caudal en pez cebra
Gracias a la transparencia de los embriones y al proceso de organogénesis es posible
identificar rápidamente estructuras primarias como el corazón y aleta caudal del pez cebra
[20]. A partir de las 18 horas post fertilización (hpf) el corazón adquiere función y es posible
identificar su movimiento. Sin embargo, este se desarrolla totalmente hasta 48 hpf
adquiriendo su forma definitiva [24]. Pierdomenico. S. et al. (2002) estableció en estudios
clínicos para el aumento de frecuencia cardiaca se está convirtiendo en un factor de
predicción de morbilidad y mortalidad en pacientes con enfermedades cardiovasculares
[25]. E. Schroeder, et al (2003) mencionó que el análisis de la variabilidad de frecuencia
cardiaca es una herramienta no invasiva en la estimación cuantitativa en enfermedades
como la hipertensión o arritmias cardiacas [26]. Aunque la tasa de frecuencia cardiaca es
mayor en el pez cebra (120-180 Latidos/minuto) con relación a la reportada en humanos
(60-90 latidos/minuto), es posible establecer en este modelo cambios en la función de la
tasa de contracción y expansión del corazón [27]. Normalmente cuando el corazón bombea
más frecuentemente se aumenta la presión arterial, si esta condición es persistente, se
denomina hipertensión. En investigaciones de agentes químicos causantes de alteraciones
de la frecuencia cardíaca Wu. M. et al. (2013) evaluó en estadios embrionarios de 1 (hpf)
hasta la etapa larval a 72 (hpf), la acción de contaminantes orgánicos halogenados
Tetrabromobisfenol A, polibromodifeniléteres (PBDE) y hexabromociclododecano
(HBCD) [28]. Por otro lado, Wiley. J. (2012) realizó ensayos in vivo en pez cebra de un
amplio espectro de fármacos entre ellos los antihistaminicos (Terfenadina, astemizol),
antiarritmicos (Quinidina, amiodarona), antibióticos (Eritromicina), antipsicóticos
(Clozapina, haloperidol), anestésicos (lidocaína) y antihipertensivos (verapamilo). De los
cuales encontró que en dosis altas causan aumento de la frecuencia cardíaca, disminuyendo
la actividad del atrio cardíaco [29].
Entre los fármacos con amplio uso en animales acuáticos está el relajante muscular
metasulfonato de tricaína MS-222 aprobado Food and Drug Administration (FDA), EE.UU.
Aplicado en procedimientos de anestesia y eutanasia con la finalidad de disminuir el dolor,
el estrés, facilitar el manejo, la clasificación y limitar el movimiento muscular en múltiples
bioensayos [30]. De Luca. E. (2014) Estableció que este anestésico reduce hasta en un 30%
la tasa de frecuencia cardiaca en larvas de 96 hpf [27].No obstante, existen diferencias
fisiológicas y bioquímicas dependiendo el estadio de desarrollo a evaluar. Rombough. P.
(2007) determinó la dosis letal (CL50) y efectiva (CE50) en diferentes estadios larvales del
pez cebra, identificó que larvas con una edad menor a las 48 hpf pueden ser tolerantes a
concentraciones altas de anestésico, debido a que pueden obtener el oxígeno necesario por
difusión pasiva con el medio [31]. El modelo de evaluación fisiológica del corazón ha sido
ampliamente estudiado en pez cebra, sin embargo, no se encontraron evidencias de
aplicación de con extractos vegetales.
Por otro lado, en comparación a los humanos el pez cebra es uno de los vertebrados más
destacados en cuanto a su potencial regenerativo. Esta regeneración es intrínseca e
independiente en muchos órganos, entre algunos se nombran: aletas, retina, medula espinal,
corazón, hígado, páncreas entre otros [32]. En correlación la especie humana tienen un
7
limitado proceso de regeneración, muchos tratamientos intervienen en la sustitución de la
función de tejido como el uso de un péptido (insulina), maquinas especializadas (diálisis de
riñón) o apoyo (marcapasos) [33]. Uno de los objetivos de esta medicina regenerativa es
buscar pequeñas moléculas que aumenten la capacidad innata de cuerpo humano para lograr
activar procesos regenerativos endógenos. Aunque no se encontraron registros de pruebas
de esta propiedad para fuentes vegetales, es una actividad que aún no se ha estudiado para
Ageratina vacciniifolia. Por otro lado, Hao. K. et al. (2015) reporto un estudio con agua
ozonizada, en donde causo el corte de la aleta a partir de las 72 hpf. Durante la regeneración
se estableció que el proceso de inflamación se mantiene activo, lo que conlleva a una gran
migración de neutrófilos al punto de la lesión estimulando la regeneración del tejido de la
aleta caudal [34]
8
3. JUSTIFICACION
Los páramos colombianos se encuentran ubicados en el mayor sistema montañoso del
continente americano, la cordillera de los Andes. Estos son ecosistemas esenciales ya que
regulan y generan la cantidad de agua necesaria para cubrir nuestras necesidades hídricas.
Contribuyen a la regulación climática al absorber gran cantidad del gas carbónico y poseen
una gran biodiversidad. Específicamente en Colombia, se ha calculado que se encuentran
el 98 % de las especies vegetales de páramo que existen en el mundo [35].
Entre los páramos más representativos de la región andina se destaca el páramo de Cruz-
Verde el cual presenta gran fluctuación de temperaturas entre (2ºC - 18ºC), alta
precipitación anual (600 mm) y elevada radiación solar [36]. Características relevantes que
tienen implicaciones importantes en la síntesis de metabolitos secundarios de las especies
de este ecosistema, entre las que se encuentra nuestra planta de interés Ageratina
vacciniifolia.
En el género Ageratina se han identificado 265 especies según datos de la Global
Compositae [37]. Estas plantas han suscitado mucho interés científico gracias a que
campesinos e indígenas han construido un acervo importante de prácticas y conocimiento
etnobotánico que es conservado por tradición oral [38]. Cada una de las especies
pertenecientes a este género tiene distintas actividades biológicas entre las que se destacan
efectos emolientes (protección de la piel), galactagogos (producción de leche) o anti-
infecciosos [11]. En trabajos descritos por King y Robinson en el libro “Flavonoids of the
sunflower family (Asteraceae)”en 1987se hallaron un número importante de compuestos
fenólicos entre los que se destacó la presencia del kaempferol y la quercetina por su
simplicidad, presentes en la mayoría de las especies del género Ageratina [39]. A estos
metabolitos se les han atribuido propiedades que ayudan a contrarrestar los efectos de
enfermedades cardiovasculares o activar procesos endógenos reparativos. Se cree que
actúan mediante la reducción de radicales libres, estimulación de la reparación de tejidos
cardiacos y regulación de la presión arterial [3]. Teniendo en cuenta que en Colombia la
primera causa de muerte está asociada a enfermedades cardiovasculares o a la insuficiencia
de órganos particulares. El estudio de las plantas de páramo con su potencial regulador o
estimulador podría ayudar en la búsqueda de soluciones.
La Organización mundial de la salud (OMS) estima que por año la tasa de muertes asociada
a estas enfermedades cardiovasculares en el mundo aumenta entre un 15 a 20% y un factor
principal es la hipertensión [40]. Sin embargo, en muchos casos la enfermedad trae consigo
la alteración del funcionamiento de algún órgano llegando a dejar disfunción, trauma o
lesión. En casos extremos el tratamiento definitivo es el trasplante de órganos. En Colombia
estadísticas del Instituto Nacional de Salud en el año 2015 reportaron 1906 trasplantes de
órganos sólidos, con un aumento del 19% en relación al año anterior 2014. El trasplante de
mayor demanda es el de riñón con 768 trasplantes. Por otro lado entre los tejidos más
solicitados se presentan injertos de piel y cardiacos [41]. Se ha estimado que más del 80%
de la población mundial suplen sus necesidades de atención primaria en la medicina
tradicional y particularmente en Colombia esta población asciende aproximadamente al
40% [42],[43]. Por estas razones, es de gran utilidad evaluar sistemáticamente las
9
propiedades potenciales de la especie contribuyendo con evidencias científicas que
respalden los usos tradicionales que se le han dado a Ageratina vacciniifolia [44].
Ya que es poco lo que se conoce de Ageratina vacciniifolia, con la ayuda de la
implementación del pez cebra (Danio rerio), un modelo relativamente nuevo y poco
conocido a nivel nacional. Este trabajo aportara generando metodologías sistemáticas
definidas para posteriores análisis de extractos de fuentes vegetales. Teniendo en cuenta
que Colombia está catalogada como el segundo país en diversidad de plantas y se han
calculado de 30.000 a 41.000 especies en total, de las cuales aproximadamente 1500 son
exclusivas del territorio nacional, la implementación de este modelo animal y la aplicación
de nuevas metodologías serán de gran utilidad [45]. Actualmente en el Laboratorio de
Biología del Desarrollo de la Universidad los Andes se están desarrollando bioensayos para
evaluaciones de actividades biológicas de estos extractos durante el desarrollo embrionario
y larval en el pez cebra. Esta investigación hace parte de una iniciativa que permitirá el
aprovechamiento racional con fines sostenibles, científicos y tecnológicos de las especies
provenientes de la región de páramo, como lo contempla el Plan Nacional de Desarrollo
2014-2018 el cual estimula la investigación para el aprovechamiento racional de sustancias
químicas bajo la normatividad del art. 173 “protección y delimitación de paramos”[46]. De
esta forma, en este trabajo se espera establecer si, el tratamiento con el extracto total de la
especie Ageratina vacciniifolia evidencian actividad en la recuperación de niveles
fisiológicos de frecuencia cardiaca y estimulación de la regeneración de la aleta caudal en
estadios larvales del pez cebra.
10
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Evaluar la actividad biológica del extracto etanólico total de hojas y flores de Ageratina
vacciniifolia, para establecer el efecto sobre el potencial regulador de la frecuencia cardiaca
y estimulador en regeneración de la aleta caudal del modelo animal pez cebra
4.2. Objetivos específicos
1. Identificar los principales grupos de metabolitos secundarios por medio de pruebas
fitoquímicas preliminares al extracto etanólico total de Ageratina vacciniifolia
2. Encontrar la concentración letal media (CL50) al extracto etanólico total de Ageratina
vacciniifolia
3. Determinar si el extracto etanólico total de Ageratina vacciniifolia puede estabilizar los
niveles fisiológicos cardiacos frente al aumento o disminución de la frecuencia cardiaca
en estadios larvales del pez cebra.
4. Establecer el efecto estimulante o inhibitorio de extracto total de Ageratina
vacciniifolia en el proceso regenerativo de la aleta caudal en larvas de pez cebra
11
5. MARCO TEORICO
5.1 Región de páramo
El páramo es uno de los ecosistemas más importante por su función de almacenador y
regulador de agua. A nivel mundial los páramos se localizan en países de la zona tropical
por encima de los 3.000 a 5.000 metros sobre el nivel del mar (Figura 1). Están ubicados
geográficamente entre el límite superior de boque andino hasta las nieves perpetuas,
principalmente la mayor extensión se encuentra en el continente Americano. En Colombia
suman un área equivalente al 1,69% del territorio nacional y se distinguen entre páramos
húmedos y secos. Esta diferencia está ligada a la ubicación geográfica en la cordillera y el
movimiento de los vientos cálidos provenientes del océano pacifico y atlántico con lo cual
se regula la distribución e intensidad de las precipitaciones [1].
Figura 1. Paramos en el mundo.
Páramos de la zona intertropical en el continente Americano y sus equivalentes en África
y Asia (tomada y modificada) [1].
5.1.1. Factores determinantes en el páramo
La altitud es un factor determinante para la existencia de este ecosistema, la mayoría de los
páramos se encuentran sobre la cordillera de los Andes en centro y sur américa. Su clima
es representativo de alta montaña tropical con temperaturas variables desde el frio
congelante a intensos picos de calor durante el día. Este fenómeno está directamente
relacionado con la ubicación terrestre de los Páramos, ya que se encuentran en toda en la
zona tropical los rayos provenientes del sol caen casi perpendiculares (Figura 1). Además
la capa de aire atmosférico en estas zonas es muy delgada lo que ocasiona que la vegetación
posea adaptaciones para soportar estas variaciones [47].
12
5.1.2. Páramo de Cruz Verde
En Colombia, los páramos húmedos están ubicados en la cordillera oriental, parte de ellos
se encuentran en los cerros orientales Bogotanos. Región que corresponde al páramo de
Cruz Verde (Figura 2). Este páramo pertenece al complejo de Cruz Verde-Sumapaz y está
ubicado a 10 km de Bogotá vía Choachi (Cundinamarca). El páramo de Cruz Verde se
encuentra a una altura de (3200-3600 msnm) y se clasifica como páramo bajo. Su
temperatura media es de 8,4°C, precipitación promedio de 1.200 milímetros (mm), alto
contenido de materia orgánica, gran retenedor y almacenador de agua, lo cual favorece a la
vegetación presente de la zona[47] presenta en su mayoría especies de tipo arbustiva con
matorrales de la familia Asteraceae entre las que se encuentran los géneros Pentacalia y
Ageratina [11].
Figura 2. Páramo de Cruz Verde.
Elevación montañosa en ascenso al Páramo de Cruz verde, costado oriental de los cerros
Bogotanos (Autor)
5.2. Botánica y taxonomía Ageratina vacciniifolia
El género Ageratina pertenece a la familia Asteraceae (Tabla 1). Las especies de este género
reciben el de chilco, carrasposa, pulisa, jarilla, salvio amargo o almadruz. Se encuentran
principalmente en Centro y Suramérica, especialmente en México, aunque se han
encontrado al oriente de los Estados Unidos, el Occidente de la India y en la zona
meridional del Brasil [10]. Dentro del género Ageratina se destacan propiedades biológicas
de las especies, Ageratina adenophora (antimicrobianas) acción contra microrganismos
[48] , Ageratina pichinchensis (emoliente) tratamiento contra heridas [49] y Ageratina
petiolaris (antihiperglucémico) disminución de niveles de glucosa en sangre[50].
La especie Ageratina vacciniifolia crece en el subpáramo de la cordillera oriental de los
Andes alrededor de la Sabana de Bogotá [9]. Se caracteriza por ser un arbusto ramificado de
no más de 1m de altura, sus ramas son cilíndricas opuestas serradas y ovaladas. Las
inflorescencias presentan corimbos terminales con capítulos oblongos con 5 a 6 flores. Sus
cabezuelas son moradas de olor agradable, corola tubulosa, ovario cuneado y linear, estilo
glabro y estigma bipartido (Figura 3).
13
Tabla 1. Clasificación taxonómica de Ageratina vacciniifolia (Benth.) Robert King y Harold
Robinson.
Figura 3. Ageratina vacciniifolia.
Cabezuelas rosa pálidas y capitulecencias terminales con flores semiblancas de la especie
vacciniifolia (Autor).
5.2.1. Metabolitos secundarios
Los metabolitos secundarios son especies químicas producidas en las plantas paralelamente
a las rutas primarias metabólicas (Tabla 2). No tienen ninguna función esencial en su
desarrollo y crecimiento, pero son muy importantes en la especialización de cada especie
dando origen a la Quimiotaxonomía [51]. Su origen en las células vegetales se ha
determinado como respuesta a estímulos del entorno. Entre ellos se destacan, variaciones
térmicas, lumínicas o protección y defensa contra organismos patógenos o plagas como
hongos, bacterias, virus, nematodos e insectos entre otros [52].
Tabla 2. Metabolitos secundarios producto de intermediarios en rutas primarias en las
plantas [53].
PRIMARIO INTERMEDIARIO SECUNDARIO
Carbohidratos Monosacáridos Glucosa,
fructosa
Glicósidos, Azúcares
modificados, Ac. Urónicos
heparina
Proteínas Aminoácidos Alcaloides, taninos,
fenilpropanos, cumarinas
Lípidos Ácidos grasos Policétidos, terpenos,
esteroles, triterpenos
Reino: Plantae
Phylum: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Asterales Familia: Asteraceae
Género: Ageratina
Especie: Ageratina vacciniifolia
14
PRIMARIO INTERMEDIARIO SECUNDARIO
Ácidos nucleicos Bases Tetra-pirroles, alcaloides
imperfectos
5.2.2. Metabolitos secundarios reportados en Ageratina vacciniifolia.
King y Robinson (1970) reportaron la existencia de flavonoides tipo flavonol (Kaempferol
y Quercetina) para el genero Agertina [39]. Mientras que Pescador. B. (1994) reporto para
Ageratina vacciniifolia diterpenos de tipo kaurano (Tabla 3) [13].
Tabla 3. Metabolitos secundarios reportados para el género Ageratina y especie
vacciniifolia.
GRUPOS
PRINCIPALES
METABOLITO
SECUNDARIOS
FUNCIÓN BIOLÓGICA
Flavonoides Kaempferol
Anticancerígena inhibe la
angiogénesis (Formación de vasos
sanguíneos) [54]. Regula el
metabolismo de lípidos y se
considera (anti-obesidad)
[55].Además se ha determinado
funciones anti-oxidantes, anti-
inflamatorias. Por otro lado induce
la apoptosis y la inhibición de la
metástasis [56].
Quercetina
Se ha comprobado que es usado
como agente terapéutico
preventivo contra enfermedades
neurodegenerativas como el
Parkinso`s y Alzheimer´s [57].
Además tienen una actividad
protectora frente a la agregación
plaquetaria (anti-trombótico),
promoción de la relajación del
musculo liso cardiovascular (anti-
arrítmicos, anti-
hipertensivos)[58].
Terpenos
(diterpenos)
Kaurano Se describe que los diterpenos tipo
kaurano pueden ser compuestos
comprometedores en la
quimioprevención, estos poseen
una fuerte acción antimicrobiana y
antifúngica [13]. Por otro lado se
ha descrito como hipotensor ya
15
GRUPOS
PRINCIPALES
METABOLITO
SECUNDARIOS
FUNCIÓN BIOLÓGICA
que tienen efecto en la relajación
del musculo liso y efectos
citotóxicos [15]. Por último se ha
determinado con propiedades
antipireticas y antiinflamatorias,
relacionado con las propiedades
etnobotánicas que se le describen a
la especie vacciniifolia [59].
Pescador. B. (1994) del grupo investigación en Fitoquímica del Departamento de Química
de la Universidad Javeriana (GIFUJ). Logro aislar e identificar compuestos pertenecientes
a la familia de los Kauranos [60]. Diterpenos glucosilados (β-D-glucopiranosil ester del
ácido (-) 9,15- dihidroxi -16-en-kauran-19-oico) y (β-D-glucopiranosil ester del ácido (-)
17(β-glucopiranosiloxil)- 16- hidroxi-kauran-19-oico) (Figura 4) [13].
A.
B.
C.
D.
Figura 4. Estructuras derivadas del Kaurano
El Kaurano es un ditérpeno tetra cíclico que se caracteriza por poseer 20 carbones en su
núcleo estructural. A) Ácido Ent- Kaur-9(11), 16-en-19-oico, B) (β-D-glucopiranosil éster
del ácido (-) 17(β glucopiranosiloxil)- 16- hidroxi-kauran-19-oico), C) (β-D-glucopiranosil
OH
O
CH3
CH3
CH3
CH3
OHOH
OH
OH
O
O
OH
O
CH3
CH3
O
O
CH3
CH3
CH3
CH3
Glu
OH
OHOH
O
O
O
O
CH3
CH3
Glu
CH3
CH3CH3
CH3
16
éster del ácido ) 9,15- dihidroxi -16-en-kauran-19-oico), D) β-D-glucopyranosil éster del
Ácido(-)-17-(β-xilopiranosa)-19-oico [11],[13],[61].
5.3. Modelo toxicológico Artemia Salina
Esta especie es un microcrustaceo del orden anostaca (sin caparazón), su habita se encuentra
a temperatura entre un rango 25-30 ºC, salinidad 5-150 ups (unidades prácticas de
salinidad), oxigeno por encima de (2 mg/L) y buenas condiciones de iluminación.
Encontrándose principalmente en el Caribe y Norteamérica. Alcanza su edad adulta entre
20-30 días de eclosión, mientras que en su etapa larval se denomina nauplius entre 24 o 48
horas de eclosión (Figura 5). Son fuente de alto valor nutricional proteico para muchas
especies acuáticas aplicándose en acuicultura [62].
Figura 5. Estadios de desarrollo de la Artemia salina (tomada) [63].
Mayer. (1982) utilizo el modelo en el desarrollo de la investigación fitoquímica preliminar,
ya que es una búsqueda rápida, confiable y reproducible de la toxicidad aguda (Tabla 4) y
bioactividad citotóxica de los compuestos metabólicos [64]
Tabla 4. Clasificación de toxicidad según CYTED [65].
NIVEL TÓXICO CLASIFICACIÓN CONCENTRACIÓN (mg/L)
I Extremadamente tóxico 1-10
II Altamente tóxico 10-100
III Moderadamente tóxico 100-500
IV Ligeramente tóxico 500-1000
V Prácticamente no tóxico 1000-1500
V Relativamente inocuo >1500
5.4. Descripción general del pez cebra (Danio rerio)
El (Danio rerio) es un pequeño pez nativo de arroyos y ríos del norte y centro de la India,
el nombre de su género Danio proviene de'' dhani '' que significa (campo de arroz).
Pertenecen a la familia Cyprinidae peces teleósteos (Tabla 5). Se encuentra el noreste de la
India, Bangladesh y Myanmar[7].
17
Tabla 5. Clasificación taxonómica de pez cebra (Danio rerio)
Ambiente: En su habitad se puede encontrar en aguas dulces poco profundas de flujo
muy lento, por lo general tienen tendencia a defender territorio y sus ciclos de
reproducción en estado natural son estacionales dependientes de la cantidad de alimento
disponible, su expectativa de vida es de 3-4 años en cautiverio de lo contrario vive
alrededor de 2 años [66].
Reproducción: La etapa adulta y la madurez sexual se alcanzan a los 3 meses de edad,
en etapas larvales todos los individuos de la especie desarrollan gónadas. Desde la
semana 5-7 empieza un ciclo intersexual, en el cual los ovarios se convierten en
testículos dando lugar a la diferenciación de machos y hembra. Este proceso es
dependiente del suministro de alimento ya que los especímenes con un menor
crecimiento tienden a ser los machos. Por otro lado la hembra puede desovar cada 2-3
días, el cortejo se inicia con la persecución del macho empujándola a un sitio de desove
y provocando vibraciones cerca al poro genital. El desove se produce con el primer
estimulo luminoso e inmediatamente son fertilizadas las ovas por el macho. El diámetro
del huevo es de 0,7 milímetros (mm) [7], [66]
Comportamiento: Es un pez sociable, no es agresivo, es activo, rápido y diurno,
muestra un comportamiento gregario en donde el grupo interactúa junto sin una
dirección planificada, son omnívoros, pueden alimentarse de microrganismo como la
Artemia franciscana [66].
5.4.1. Morfología del pez cebra
Los machos son generalmente más delgados y de color más oscuro que las hembras (Figura
6). Poseen un patrón longitudinal de cinco rayas azules o franjas blancas a lo largo de los
lados de su cuerpo y en las aletas anal y caudal. Los machos se ven un poco más de color
amarillo marrón que las hembras las cuales, a su vez tienen el vientre más abultado y de
color más claro [7]
Reino: Animalia
Filo: Chordata
Clase: Actinopterygii
Orden: Cypriniformes
Familia: Cyprinidae
Género: Danio
Especie: D. rerio
18
Figura 6. Diferencias morfológicas del pez cebra.
A) El macho de la especie Danio rerio es más alargada y su coloración es amarilla, B) La
hembra es más ancha en la parte pectoral y su coloración es rosada (tomada y modificada)
[67].
El cuerpo del pez es fusiforme,
puede alcanzar una longitud en etapa
de adulta entre 4-5 centímetros (cm),
poseen mandíbula alargada y fina, la
mandíbula inferior es mucho más
protuberante lo que causa que su
boca apunte hacia arriba [7]. El
desarrollo es rápido, los primordios
de todos sus órganos principales
están formados a las 48 hpf y se
desarrolla completamente entre 5-6
días (Figura 7, A). Sus huesos no
poseen cavidad medular, las
funciones hematopoyéticas las suple
la parte anterior y posterior de los
riñones [68]. En general los órganos
del pez cebra conservan una alta
homología con respecto a los del ser
humano a excepción del riñón
(Figura 7, B).
Figura 7. Órganos principales del pez cebra.
A) Órganos en desarrollo en etapa larval, su longitud es entre 3-4 mm, B) Los órganos son
altamente conservados con los humanos, excepto que el riñón cumple función
hematopoyética, puede alcanzar 4-5 cm.
19
5.4.2. Estadios de desarrollo (embrión- larva- adulto)
Al igual que otros peces, el pez
cebra pasa por fases larvarias y
juveniles hasta llegar a su etapa
adulta. Estos se definen como
adultos desde los 90 días después
de la fertilización dpf (Figura 8).
En un principio tienen una
longitud total promedio de 2 a 3
cm cuando se crían en
condiciones ideales, pero seguirá
creciendo durante el período de
vida de 2-3 años alcanzando
tamaños de 4-5 cm en condiciones
favorables [7]
Figura 8.Ciclo de embriogénesis del pez cebra.
El embrión de pez cebra se desarrolla a partir del blastodermo, alcanzando su etapa larval
al finalizar el proceso de organogénesis [5].
5.4.3. Estadio embrionario, cigoto ((0- 0,75h)
En este periodo se producen las divisiones celulares desde la fertilización, la primera
división se produce 0,5 hpf con lo cual se incrementa el espacio entre el cigoto y el corión
[20]. Este organismo se alimenta principalmente en etapas embrionarias por su vitelo (polo
vegetal) mientras que toda la actividad metabólica se desarrolla en el espacio de división
celular (polo animal) lo que más tarde se denominara blastodisco (figura 9).
Figura 9. Periodo cigoto.
A partir del blastodisco se inician las divisiones meroblásticas discoidales para formar el
blastodermo (tomada y modificada) [69].
20
5.4.4. Clivaje (0,75-2,25 h)
Se producen 6 divisiones celulares exponenciales a partir del cigoto, regularmente cada 15
minutos (Figura 10). Estas segmentaciones se denominan meroblásticas ya que tienen lugar
solamente en el polo animal, además son discoidales debido a que sólo el citoplasma del
blastodisco va a dar origen al embrión. Al alcanzar un total de 64 células se forma un
casquete conocido como blastodermo [20].
Figura 10.Segmentaciones celulares a partir del cigoto.
Las divisiones celulares se producen por mitosis, hasta alcanzar las 64 células o
blastómeros (tomada y modificada) [69].
5.4.5. Blástula (2,25 h- 5,25h)
Se produce la formación del blastodermo por el proceso de segmentación que dará origen
al embrión. Esta etapa se caracteriza porque el embrión presenta forma circular- elipsoide,
desde las 2,75 hpf (512 células) se forma una capa sincital (YSL) por la interacción entre
las células del margen entre el polo animal y vegetal (Figura 11) que más tarde en el
desarrollo se desplazaran envolviendo las partes más superficiales dejando al vitelo
envuelto. Por otro lado está capa enviará señales para dar inicio a la etapa de gastrulación
y se cree que cumplen funciones de regulación en la nutrición provista por el vitelo [20],
[70].
Figura 11. Blástula y principios de la epibolia.
El termino blástula se usa para referirse al periodo en el que el blastodisco adquiere forma
elipsoide (tomada y modificada) [69].
Las células superficiales del blastodermo denominadas células de la envoltura (EVL)
formaran la capa gruesa epitelial que estará presente hasta el desarrollo tardío (Figura 12)
[70].
21
Figura 12. Estructura de blástula pez cebra.
Durante la división a 266 células se da la diferenciación de las células de la capa sincital
vitelínica y la capa celular de la envoltura sobre el blastodermo (tomada) [70].
5.4.5. Gastrulación (5,25h-10,33h)
En este estadio se producen todos los procesos fundamentales que darán inicio a la
morfogénesis a partir de las capas germinales (Figura 13, C). El blastodermo es capaz de
cubrir el vitelo gracias a movimientos de involución y convergencia que darán paso a un
engrosamiento llamado anillo germinal. La capa interna de este anillo es llamada hipoblasto
y la superficial epiblasto. Posteriormente, estas células serán llevadas por extensión hacia
el lado dorsal del embrión formando el escudo embrionario (Figura 13, A, B). Del
hipoblasto se genera la capa del mesodermo, precursora de la notocorda y las somitas. Por
otro lado del epiblasto se genera el ectodermo y las células neuronales, mientras el
endodermo se origina de las blastomeras más marginales de la blástula [20], [70]
22
Figura 13. Movimientos celulares durante la gastrulación del pez cebra.
A) Formación del hipoblasto ingreso de células desde el epiblasto (6horas), B) Vista de
cerca, C) 90% de epibolia (9 hpf) el mesodermo rodea el vitelo, entre el endodermo y
ectodermo D) Finalización gastrulación (tomada y modificada) [70].
5.4.6. Segmentación (10.33h-24h)
Se empiezan a desarrollar un conjunto definido de somitas secuencialmente del tronco a la
cola adyacentes a la notocorda, posteriormente estas se alargaran y adquieren forma de “v”
(Figura 14). Por otro lado es posible observar los primordios de la vesícula ótica, vesícula
óptica y vesícula de kupffler , el vitelo y la cola se vuelven más prominentes y alargan el
embrión, además se pueden observan los primeros movimientos corporales y diferencias
morfológicas [20].
Figura 14. Aparición de somitas en el pez cebra El proceso de somitogénesis se produce consecutivamente con el desprendimiento proporcional de
la cola del vitelo (tomada y modificada) [69].
23
5.4.7. Pharyngula y organogénesis (24h-48h)
Durante el estadio se produce el mayor gasto metabólico del desarrollo, evidenciando con
mayor facilidad la morfología básica de diversos vertebrados. Inicialmente la notocorda
enviará señales para la formación y maduración de estructuras esenciales del desarrollo.
Entre ellas el tubo neural, las somitas, la morfogénesis del cerebro y el desprendimiento de
la cola del vitelo (Figura 15, A). Paralelamente se desarrolla la funcionalidad de los
principales órganos, entre ellos el corazón que es el primero en adquirir función. Aparecen
los primordios de las branquias, la mandíbula y las aletas (Figura 15, B). Por último el
embrión también empieza a mostrar signos conductuales a sensibilidad táctil y movimientos
coordinados rítmicos de natación [20]
Figura 15. Estructuras en desarrollo en etapa larval del pez cebra
A) Pez cebra en estado larval 31 hpf, se observa claramente la estructura cerebral y los
primordios de las aletas caudal y dorsal. B) Estadio larval de 48 hpf, se observa un
enderezamiento notable de la cabeza en dirección a las manecillas del reloj. C) Estadio
larval de 72 hpf, la organogénesis se ha desarrollado completamente [20].
24
5.4.8. Eclosión, estadio larval (48h-21d)
El embrión continúa creciendo a aproximadamente a la misma velocidad de antes, la
morfogénesis básica se ha completado a las 48 hpf y se han alineado en un solo eje la cabeza
y la cola. Algunas de las características más notables en su desarrollo son los
empaquetamientos musculares somitas, la aleta caudal, la extensión del vitelo y el corazón
(Figura 15, C). La coloración característica de la especie es notable a los 30-40 dpf [20].
5.5. Cardiogénesis del pez cebra
El corazón es el primer órgano en formarse en vertebrados porque su correcto
funcionamiento es esencial en los procesos de organogénesis, ya que transporta el oxígeno
a los tejidos. Básicamente este órgano es un conducto modificado, una bomba que hace
posible la circulación sanguínea gracias a su capacidad de contraerse y expandirse. Sin
embargo, En estadios larvales de 5-6 dph el sistema circulatorio no es esencial, ya que
pueden sobrevivir realizando difusión pasiva para tomar el oxígeno del medio. Es así que
esta característica permite analizar los daños cardiovasculares en el desarrollo logrando que
los embriones sobrevivan [24].
Su desarrollo empieza con la especificación de células progenitoras para el miocardio y el
endocardio, se han identificado que existen dos tipos de células del miocardio (auriculares
y ventriculares), las células progenitoras aparecen cuando el embrión adquiere su formación
de blástula (Figura 12) a las 5 hpf. (Figura 16, A).
Figura 16. Formación del corazón del pez cebra
A)Diferenciación de la células auriculares y ventriculares que posteriormente darán origen
al discocardíaco B) Aparición de las cámara del corazón aurícula (polo venoso) y
ventrículo (polo arterial) [24].
25
La diferenciación cardiogénica se da a partir de las etapas medias y finales de la
somitogénesis, en donde el tejido miocárdico se expande por la diferenciación de los
miocitos auriculares y miocitos ventriculares y las células endocárdicas (Figura 16, A).
En las 22 hpf, se da la formación de una estructura conocida como disco cardíaco, la cual
durante la morfogénesis se transforma en un tubo cardíaco. El tubo está completamente
formado a las 28 hpf y por primera vez se observan las dos cámaras del corazón. La aurícula
se observa de color naranja (polo venoso), mientras que el ventrículo es de color purpura
(polo arterial) (figura 16, B).
A las 36 hpf se da un proceso de torsión cardíaca en donde se produce un desplazamiento
del ventrículo a la línea media en donde es visible el canal aurícula-ventricular (AV). El
corazón está totalmente formado a las 48 hpf y su forma se observa en “S”, Por otro lado
se produce la diferenciación de células pro-epicárdicas extracardíacas que formaran el
marcapasos presente en la curvatura interior de la aurícula cerca al (polo venoso) [24].
5.5.1. Paralelismo entre el sistema cardiovascular humano y pez cebra.
El pez cebra cuenta con un sistema vascular totalmente especializado, el flujo sanguíneo es
regulado por dos cámaras, en comparación a los humanos que tienen 4 cámaras (Figura 17,
A). La sangre desoxigenada entra a la aurícula o atrio, mientras que el ventrículo la bombea
a través del bulbo arterioso a la aorta ventral para ser distribuida por las branquias
oxigenarla y posteriormente distribuirla por el cuerpo (Figura 17, B). Tanto en el pez como
el humano, el ventrículo se encarga de bombear la sangre para oxigenarla, mientras que la
aurícula la distribuye por todo el cuerpo [71].
Figura 17. Corazón humano y pez cebra
A). El corazón humano está dividido en dos aurículas y dos ventrículos B) El corazón del
pez cebra posee un ventrículo y una aurícula. Estructuras análogas en cuanto a su
funcionamiento [72].
26
5.5.2. Frecuencia cardiaca
La medición de los latidos del corazón es importante en la evaluación de la función cardiaca
ya que este puede ser un indicio de alteración en el sistema cardiaco. Su evaluación se da
como el número de pulsaciones por unidad de tiempo. En los seres humanos la tasa normal
es de 60-90 latidos/minuto, en cambio en el pez cebra esta misma tasa es de 120-180
Latidos/minuto. Uno de los fármacos más usados en peces cebra es el agente anestésico
(Tabla 5) metasulfonato de tricaína MS-222 (figura 18) [27].
Figura 18.Estructura química de la tricaina
Conocido también como metanosulfonato de tricaína, éster de 3- aminobenzoico etílico del
ácido o MS-222.
De acuerdo a la literatura este anestésico es un 𝛽- Bloquedor que actúa en el receptor del
musculo esquelético al cual se une la acetil-colina y desencadena un potencial de acción
iónico de Na+, K+ y Ca2+ ocasionando la contractibilidad del musculo esquelético. Sin
embargo, también se le ha atribuido causar pérdida de conciencia mediante efectos
supresores al sistema nervioso periférico y central del pez cebra. En cuanto a la función
cardiaca se ha observado que a altas concentraciones causa alteraciones de la frecuencia
cardíaca.[73].
Los niveles de sedación, anestesia y eutanasia se caracterizan en seis niveles descritos por
International Zebrafish Medaka Course (IZMC) descritos en la (Tabla 5) [74].
Tabla 5. Niveles anestésicos del pez cebra [74], [75].
ESTADIO
ANESTESICO DESCRIPCIÓN COMPORTAMIENTO DE LOS PECES ADULTOS
0 Normal Natación activa, respuesta a estímulos externos, equilibrio
normal, tonalidad normal
I.1 Leve sedación Natación continúa voluntaria, ligera pérdida de respuesta
a los estímulos visuales y táctiles, tasa opercular normal,
equilibrio normal, tonalidad muscular normal.
I.2 Sedación
profunda
Reduce la velocidad de natación voluntaria, movimientos
descoordinados: pérdida total a respuesta de estímulos
visuales y táctiles, leve disminución del movimiento
opercular, equilibrio normal, tono muscular disminuido y
todavía responde a cambio posicionales inducidos por
presión.
27
ESTADIO
ANESTESICO DESCRIPCIÓN COMPORTAMIENTO DE LOS PECES ADULTOS
II.1 Narcosis ligera Fase de excitación que aumenta la tasa opercular, perdida
del tono muscular y natación errática. Responde a muy
fuertes cambios estímulos táctiles y vibracionales.
II.2 Narcosis
profunda
Se pierde el equilibrio y tono muscular completamente,
disminuye la velocidad de movimiento opercular
disminuye de nuevo, disminución de la frecuencia
cardiaca. Responde únicamente a una punción táctil fuerte
o estímulos vibratorios.
III.1 Anestesia leve Responde a la presión táctil más profunda, mayor pérdida
mayor de la tasa opercular y frecuencia cardiaca.
III.2 Anestesia
profunda
Perdida completa del sentido del dolor y reactividad
(respuesta a toque), relajación muscular completa, tasa
opercular y frecuencia cardiaca mucho más lentas
IV Colapso medular Colapso irreversible medular: se detiene el movimiento
opercular y el latido es ausente, la muerte es ocasionada
por paro cardiaco y hipoxia.
Nota: Las anteriores etapas de sedación dependen del tiempo de exposición al anestésico.
5.6. Aleta caudal del pez cebra
Muchas especies de vertebrados, especialmente los humanos tienen un potencial
regenerativo muy bajo en comparación a otros vertebrados. Caso del pez cebra, el cual
presenta esta capacidad desde estadios tempranos de sus etapas larvales.Entre sus
extremidades más destacadas se encuentran la aleta dorsal y caudal (Figura 15, B), los
primordios aparecen desde las 28 hpf. Las membranas de la aleta dorsal y caudal se
extienden para cubrir el extremo anterior y posterior de notocorda (Figura 15, C). Su
estructura es simple, se compone de células mesénquimales provenientes de la capa
germinal mesodermal y las células epiteliales que recubren la parte interna y externa del
cuerpo. Los cartílagos y radios se desarrollan en etapas adultas [32]. Para su evaluación se
debe cortar toda la aleta caudal y no es esencial para la viabilidad del pez.
5.6.1. Mecanismo de regeneración de la aleta caudal
Al generar la lesión de la aleta caudal, las células epiteliales comienzan a contraerse dentro
de los 10 minutos post-amputación (mpa) ocasionando una estructura conocida como
muñón que persiste hasta 3 hpa, el primer paso para generar el cierre de la herida. La
superficie de la lesión se encontrara cubierta de células epiteliales a las 6 horas post-
amputación (hpa) estas formaran una capa celular fuertemente empaquetada a las 24 hpa
denominada epitelio de la herida (Figura 19, B) [32].
28
El mecanismo de la proliferación celular se activa a partir de las células mesenquimales que
son inducidas debajo del muñón formando una estructura denominada blastema, este se
mantiene activo hasta el final de la regeneración (Figura 19, A). La regeneración se lleva a
cabo a partir del lado más proximal de la lesión y avanza hasta la parte más distal con una
regeneración total de aproximadamente 3 días post-amputación (dpa). Por otro lado
mientras se da el procesos de regeneración el crecimiento de la aleta es acorde es acorde al
estadio (Figura 19, B) [32].
Figura 19. Regeneración de la aleta caudal pez cebra.
Amputación y formación de las principales estructuras en la regeneración B) secuencias
de el desarrollo de la aleta caudal durante su desarrollo hasta las 96 horas [76].
29
6. HIPOTESIS
El Extracto etanólico total de Ageratina vacciniifolia tienen actividad biológica asociada a
la estabilización de la frecuencia cardiaca y modulación del proceso regenerativo de la aleta
caudal en estadios larvales de pez cebra Danio rerio.
30
7. METODOLOGÍA
Figura 20.Resumen metodológico general.
Este diagrama de flujo resume todos los pasos que se utilizaron para la identificación
fitoquímica y las pruebas toxicológicas realizadas en pez cebra en este trabajo.
7.1. Obtención material vegetal.
La recolección se realizó en el páramo andino de Cruz verde, vía Choachi - Cundimarca
en las coordenadas 4°35'39"N - 74°02'01.3"W, localizado a una altitud entre (3300- 3500
m.s.n.m). El material vegetal maduro comprendió flores, tallos y hojas de la especie
Ageratina vacciniifolia de la parte alta del arbusto (Figura 3). La planta fue recolectada
durante los meses de floración septiembre-octubre 2015. El secado se llevó a cabo a
temperatura ambiente por 3 días y posteriormente se molieron aproximadamente a un
tamaño de 20 micras. El peso del material vegetal molido fue 148g. Un espécimen
representativo se prensó y posteriormente se confirmó su identidad taxonómica a través del
herbario de la Universidad de los Andes (Anexo 1). La metodología se presenta en detalle
en la Figura 20.
7.1.1. Obtención de extracto Etanólico e identificación de los grupos principales de
metabolitos.
Se realizó maceración en frío para evitar degradar los compuestos orgánicos. El material
vegetal macerado (148 g) fue cubierto en su totalidad con etanol al 96%. El proceso se
realizó en un frasco de vidrio sellado con agitación diaria, filtración y rota-evaporación cada
3 días. La rota-evaporación se realizó en el equipo (Buchi R-219), en condiciones de 40ºC
Recolección
Mezcla de hojas y
flores
Secado y molido
Extracción con
Etanol 96%
(maceración en frío)
Prueba de toxicidad
(OCDE 236)
Pruebas
fotoquímicas
Preliminares
Flavonoides
Antocianidinas
Taninos-
SaponinasTerpenos-
Esteroides
Quinonas
Alcaloides
Cumarinas
Glucósidos
cardiotónicos
Distribución
Curvas de 5 puntos
(c/u con 5
embriones). Blanco
Agua y Blanco de
solvente
Exposición
(Desde 8hpf hasta96
hpf)
Observación cada 24
hpi
Parámetros de lectura
Coagulación
sanguínea
Somitas
Cola
Látidos
Cardíacos
31
y 175 mbar. El extracto total se acumuló en un frasco protegido de la luz, obteniéndose
(36,6 g) de extracto total seco. El etanol se recuperó y se reutilizo nuevamente en las
siguientes suspensiones del material vegetal. La extracción se concluyó una vez se observó
una coloración tenue del extracto. Por último, se realizó una filtración con carbono activado
para eliminar excesos de clorofila.
A partir de este extracto total se realizó un stock inicial para cada bioensayo de 500 mg/L
(25 mg del extracto disueltos en 0,5 ml de DMSO y aforados a 50 ml con agua de huevo
(Anexo 3). Las soluciones de cada bioensayo se realizaron de forma independiente a partir
de este stock.
La identificación de metabolitos secundarios presentes en la muestra se llevó a cabo por
pruebas cualitativas colorimétricas. Estas permiten identificar por diferenciación de color
los grupos principales de metabolitos secundarios que podrían estar en Ageratina
vacciniifolia como se muestra en la Tabla 6.
Tabla 6. Pruebas fitoquímicas utilizadas en la identificación de las familias o grupos de
metabolitos secundarios.
GRUPO DE METABOLITOS
SECUNDARIOS
PRUEBA QUÍMICA OBSERVACIONES
POSITIVAS
Flavonoides
Shinoda Rojo, magenta, violeta, azul.
chalconas y auronas no dan
coloración
Rosenheim Rojo antocianidinas, marrón
catequinas
Antocianidinas Leucoantocianidinas Rojo, marrón catequinas
Taninos
Tricloruro férrico Soluciones verdes, azules o
negras
Acetato de plomo formación de un precipitado
blanco o turbidez
Gelatina – Sal Formación de precipitado
terpenos Liebermann – Burchard Coloraciones rojas, rosa, púrpura
o azul
Quinonas Borntrager-Krauss De rosado a rojo intenso
Alcaloides Dragendorff Precipitado naranja
Mayer Precipitado blanco amarillento
Cumarinas Hidroxamato férrico Coloración violácea
Glucósidos Cardíotonicos Baljet Naranja-rojiza
32
GRUPO DE METABOLITOS
SECUNDARIOS
PRUEBA QUÍMICA OBSERVACIONES
POSITIVAS
Tollens Espejo de plata
Antrona Interface azul-verdosa
Molish Interface violeta
7.2. Cuidado, uso y manipulación animal.
Los animales se manipularan bajo las directrices de las directivas de la Comunidad Europea
(86/609/EEC y 2003/65/EC), la normativa colombiana (Ley 84 de 1989), el estatuto
nacional de protección de los animales, (resolución 8430 de 1993) título V investigación
biomédica con animales y los requerimientos del Comité Institucional y Uso de Animales
de Laboratorio (CICUAL-UNIANDES). El número de aprobación del proyecto expedido
por el CICUAL es FUA_16-021 (Anexo 2).
7.2.1. Condiciones de mantenimiento del pez cebra.
La manipulación de los animales se llevó a cabo bajo los estándares internacionales
adoptados, modificados y aplicados por el Laboratorio de Biología del Desarrollo
(BIOLDES) de la universidad de los Andes. Los ejemplares que se utilizaron fueron de tipo
silvestre pertenecientes a las líneas AB, TAB5 y TL de las que dispone el Laboratorio. Los
animales se mantuvieron a condiciones constantes de temperatura de 28,5 ºC, con un ciclo
horario de 14/10 (Luz/oscuridad), conductividad entre 500-800 𝜇𝑠, pH de 7,2-7,8 con
recambios diarios del 10% del volumen de agua en un sistema de recirculación de agua
automatizado, Aquaneering Inc ®. Dada la altura de Bogotá el sistema también se
suplementa con un proveedor de oxígeno medicinal que permite alcanzar concentraciones
de oxígeno entre 6,5-8,5 mg/L en todo el sistema. En cuanto a la alimentación de los
animales esta se llevó a cabo dos veces al día y se realizó con 2g de micro-crustaceos
(Artemia salina) suplementada con gránulos y hojuelas de Sera ® copos vipan y copépodos
para todo el sistema que alberga aproximadamente 1000 animales.
7.2.2. Obtención de embriones de pez cebra.
Ejemplares adultos de las cepas silvestres (macho y hembra) fueron trasferidos a una jaula
de apareamiento la noche anterior a la obtención de los embriones. La jaula de apareamiento
contenía agua extraída del mismo sistema que se encuentra en las condiciones descritas en
el numeral 7.2.1.
La liberación de los huevos (desove) es producido aproximadamente 30 minutos después
del primer estimulo luminoso, al terminar el ciclo de oscuridad. Una vez liberados por la
hembra el macho procede a fertilizarlos con su esperma. Los huevos se colectan en cajas
33
de Petri y son mantenidos en la incubadora a 28.5 ºC en agua de huevo como se describió
en el Anexo 3.
Posteriormente a las 2 hpf, los huevos se observaron bajo un estereoscopio (Motic DM143).
Los no fertilizados y los que se encuentran en malas condiciones se descartaron, los demás
se sometieron a decorionación manual a partir de las 6 hpf.
7.2.3. Germinación de Artemia Salina
Este protocolo es estándar y se utiliza diariamente en el laboratorio BIOLDES. Inicialmente
se pesan 30 g de sal marina Crystal Sea® Marinemix y se disuelven en 800 ml de agua
potable. Esta solución es trasladada a un artemiero que garantiza iluminación, aireación
constante y temperatura de 25,5 ºC. Los huevos o quistes (Estado larval de la artemia) se
obtuvieron de Brine Shrimp Direct (Ogden, Utah) y fueron sometidos a decapsulación en
un recipiente de plástico con 15 ml de una solución NaClO 5%, NaOH 2N saturada con sal
marina. Esta mezcla se llevó a la incubadora durante 15 minutos a 28,5ºC. Al retirarse se
filtró y lavó 4 veces con agua potable. La mezcla de decapsulación y artemia es inactivada
por máximo 1 minuto con la adición de 2-3 ml de HCl 4%. Se eliminó el exceso de ácido
con 4 lavados con agua potable. Los quistes se trasfirieron al artemiero para que
eclosionaran por 24 horas. Para el ensayo de toxicología con el modelo artemia los quistes
se dejan crecer hasta las 48 hpf.
7.3. Bioensayo de toxicidad con Artemia Salina
Para este bioensayo se obtuvo la Artemia como se describe en el numeral 7.2.3 de esta
metodología. A las 48 horas de germinación, se revisó la eclosión de los nauplios o quistes
bajo el estereoscopio (Motic DM143) y se seleccionaron aquellos que estuvieran en la
misma etapa de desarrollo.
La solución concentrada (stock 500 mg/L) se realiza como se describe en el numeral 7.1.1.
Excepto que el aforo final no se realizó con agua de huevo. Para efecto del ensayo y la
viabilidad de la artemia salina se afora con agua salada (37mg/ml). A partir de esta solución
se prepararon soluciones independientes de concentraciones decrecientes de 150, 120, 100,
80, 60, 50, 40, 35, 20, 10, 5 y 1 mg/L del extracto total de Ageratina vacciniifolia.
Posteriormente se adicionaron 5ml de cada concentración en viales estériles de vidrio y se
transfirieron a cada vial 10 nauplios. Para cada concentración analizada se realizaron 3
réplicas. Durante el bioensayo se garantizaron las condiciones descritas en el numeral 7.2.3.
Pasadas 24 horas de inmersión en los extractos se contó el número de nauplios vivos en
cada muestra bajo el estereoscopio Motic DM143. En total se monitorearon 42 muestras
teniendo en cuenta el control de DMSO 1% y el control de Agua salada. Para estimar el
CL50 en este modelo, se realizó el procesamiento estadístico en el programa statgraphics
Centurión usando un análisis probit.
Es importante mencionar que el modelo de artemia salina contribuye con las 3R (Remplazo,
Reducción y Refinamiento) para el uso de animales de laboratorio. Dado que es un patrón
34
de referencia frente a la toxicidad de compuestos activos, permite delimitar el rango de
concentraciones a usar en el bioensayo de toxicidad en pez cebra.
7.4. Bioensayo de toxicidad en pez cebra
Esta evaluación se realizó bajo las directrices internacionales de la Organización para la
Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE), adoptada el 26 julio de 2013 denominado
ZFET (Fish Embryo Acute Toxicity)[23].
7.4.1. Exposición al extracto vegetal.
Para garantizar la variabilidad genética de los individuos utilizados en los ensayos, los
ejemplares silvestres sometidos a reproducción fueron de diferentes cepas como se
mencionó anteriormente en el numeral 7.2.1. Además, se mezclaron los huevos de por lo
menos tres cruces o parejas de parentales y se seleccionaron al azar. Los embriones entraron
en contacto con soluciones (50, 20, 12, 10, 8, 6, 5, 4.8, 4.6, 4.5, 4.4, 4.2, 4, 3.8, 3.5, 3.4, 3,
2.5, 2 y 1 mg/L) del extracto vegetal a partir de las 10 hpf.
En una placa de 24 pozos se disponen 3 pozos para cada concentración con 6 embriones
cada uno para un total de 18 embriones incluyendo el control respectivo del solvente usado,
es decir DMSO 1% (50 µl de DMSO a 99.9% de pureza aforados a 5 ml con agua de huevo)
y el control de agua de huevo, el cual no contenía ni solvente, ni extracto.
Para cada bioensayo se utilizaron un total de 126 embriones y se realizaron al menos 3
repeticiones. Se tuvo en cuenta que la concentración más elevada debe causar el 100% de
la mortalidad de los embriones, mientras que la concentración más baja no debe causar
ninguna mortalidad ni efecto observable. Cada ensayo tenía la duración de 96 hpf con
observación y recambio de sustancia de inmersión (soluciones de extracto) cada 24 horas.
7.4.2. Parámetros de lectura y puntos finales.
Se establece la muerte de los embriones de pez cebra durante el transcurso del bioensayo y
al terminar la exposición de los extractos vegetales usando los siguientes criterios:
Coagulación: Este daño puede dar indicios de una toxicidad aguda, se puede producir a
pocas horas de inmersión o en algún otro momento durante la duración del ensayo (24,
48, 72 y 96 hpf).
Alteración en la formación de las somitas: Este daño se observa a partir de las 10 hpf
(somitogénesis) siendo fundamental para el proceso de desarrollo y supervivencia del
embrión (24, 48, 72 y 96 hpf).
35
Desprendimiento de la cola: En el desarrollo normal del embrión la cola debe
desprenderse del vitelo a partir de las 18 hpf. Su registro se puede observar claramente
a las 24 hpf.
Ausencia de ritmo cardiaco: El latido del corazón se puede registrar desde las 48 hpf,
aunque es detectable desde las 28 hpf [24]. Su registro se puede tomar (48, 72 y 96 hpf)
Se utiliza el porcentaje de embriones de pez cebra muertos sobre el total para cada
concentración para establecer el CL50, es decir, la concentración letal que provoca la
muerte del 50% de los embriones tratados.
Nota: Se consideró letalidad cuando se manifestaron simultáneamente por lo menos con 3
de los parámetros establecidos de punto final.
7.3. Parámetros Morfológicos de la prueba
Esta prueba se llevó a cabo a partir del valor del CL50 obtenido de la prueba toxicológica.
Se evaluaron 6 concentraciones menores a la concentración letal (0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 y 3
mg/L). Se observaron los cambios morfológicos a las 24, 48, 72 y 96 hpf iniciando la
exposición a las soluciones del extracto, al finalizar la gastrulación, a partir de las 10 hpf.
Los parámetros que se tuvieron en cuenta para la evaluación morfológica se detallan en la
tabla 7. La observación correspondiente se realizó a partir de las imágenes adquiridas en un
estereoscopio Leica MDG33 en diferentes magnificaciones (32X-80X) con resolución
2592x1944.
Tabla 7. Parámetros de evaluación para el bioensayo de morfología
Criterios de malformación presentes en embriones de pez cebra
Parámetros cualitativos Parámetros cuantitativos
a) Pigmentación
incompleta/anormal
b) Diámetro ocular: Alteraciones en el
desarrollo ocular
c) Falta de latido cardíaco
d) Hemorragias (cefálicas,
circulación)
e) Alteración de la motilidad
(Respuesta al toque)
f) Edema pericárdico g) Extensión de la yema: Deformación de la
yema
h) Defectos en somitogénesis
i) Necrosis (ojos, cloaca,
cavidad del cuerpo)
j) Deformación tubo neural
k) Malformaciones
craneofaciales
l) Longitud Total: Alteraciones en el
crecimiento y desarrollo
36
Criterios de malformación presentes en embriones de pez cebra
m) Curvatura del cuerpo
(lordosis, Escoliosis, cifosis)
n) Degeneración muscular
o) Otolitos
Para cada concentración se registraron 5 embriones incluidos el control de solvente DMSO
1% y el control de agua de huevo. La medición de los parámetros morfométricos se realizó
con la ayuda del software de dominio público Image J [77]. El análisis estadístico de la
morfometría se realizó por el arreglo ANOVA multifactorial en el paquete estadístico
Statgraphics.
7.4. Bioensayo de regeneración de la aleta caudal
La evaluación de la regeneración de la aleta caudal se llevó a cabo siguiendo el protocolo
descrito por Lisse. T. et al. (2015) Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-
lapse Brightfield Stereomicroscopy [78].
7.4.1. Sedación, inmovilización y lesión de las larvas
Los embriones de 72 hpf fueron anestesiados por inmersión en una solución de Tricaína a
concentración de 0,168mg/mL. Se transfirieron en una gota de la solución a una lámina de
vidrio (porta-objetos). Antes de realizar el corte, la larva se posicionó de perfil, el corte de
la aleta caudal se realizó bajo el estereoscopio Motic DM143 con la ayuda de una cuchilla
Minora®. El tamaño de la larva a 72 hpf es aproximadamente de 2,5 milímetros
(2500micras). La lesión causada fue de aproximadamente 200-300 micrómetros (8-10% de
su longitud total). Se evitó comprometer los paquetes musculares caudales (Figura 19).
7.4.2. Exposición al extracto
Se utilizaron soluciones independientes por debajo del CL50 de 3,3mg/L. Específicamente
se usaron soluciones de (1 ,1.5, 2 ,2.5 mg/L). Las larvas se colocaron en contacto con la
solución del extracto por inmersión. Se usaron 3 larvas por concentración en pocillos
independientes incluyendo los controles de solvente y agua de huevo. Se realizaron 2
repeticiones. El total de larvas utilizadas fueron (n=36). El ensayo tuvo una duración de 48
horas post-amputación, es decir se realizaron observaciones hasta las 120 hpf. Se
registraron 4 puntos de observación: 72 hpf (Antes de la amputación), 72 hpf (Post-
amputación), 96 hpf (24 horas post-amputación), 120 hpf (48 horas post-amputación) con
recambio de sustancia de inmersión (soluciones de extracto) cada 24 horas.
7.4.3. Observación de las larvas
La evolución de la regeneración de la aleta caudal se realizó por toma de imágenes en el
estereoscopio Leica MDG33 en diferentes magnificaciones (32X-80X) con resolución
37
1024x768 cada 24 horas post-amputación y de inmersión en la solución del extracto. Para
el registro fotográfico la inmovilización se realizó como se describió en el numeral 7.4.1.
Toma longitud total
72hpf
Corte de la aleta caudal
72 hpf
Toma longitud regenerado
96 y120 hpf
Figura 21. Esquema de evaluación para la toma de las medidas del regenerado
La medición de los parámetros morfométricos se realizó con la ayuda del software de
dominio público Image J [77]. Inicialmente se determinó la longitud total de cada una de
las larvas a 72 hpf, luego se realiza un corte lo más homogéneo posible al terminar los
paquetes musculares. Este servirá de referencia para determinar la longitud del regenerado
que se observó hasta las 120 hpf como lo muestra la Figura 21. El análisis estadístico de la
morfometría se realizó por ANOVA multifactorial en el paquete estadístico Statgraphics.
7.5. Bioensayo de regulación de la frecuencia Cardiaca
Para evaluar la frecuencia cardiaca se emplearon embriones de 2 dpf. La obtención de
huevos de cepas silvestres AB, TAB 5 y TL se realizó como se describe en el numeral 7.2.2.
El registro de los latidos cardiacos se hizó por 12 segundos y se estimó la frecuencia por
minuto multiplicando por 5. Para establecer los valores de referencia de la frecuencia
cardiaca se realizó un video bajo el estereoscopio Leica MDG33 a magnificación 80X con
resolución 2592x1944 de cada individuo antes de su exposición a la solución del extracto.
De este modo se obtuvieron registros individuales de referencia para un total de (n=36)
larvas.
7.5.1. Estandarización de concentraciones anestésicas y Determinación de tiempo
El metasulfonato de tricaína (MS-222) es un fármaco anestésico capaz de generar
disminución de la frecuencia cardiaca. Produce efectos diferenciales de acuerdo a la dosis
que pueden estar sujetos al estadio de desarrollo, tamaño y estado metabólico. Es por esto
que fue necesario establecer las condiciones de este bioensayo para determinar la
concentración de uso y el tiempo de inmersión de los individuos en la tricaína para lograr
inducir el efecto sin causar la muerte.
38
Los cambios en la dosificación dependen esencialmente de la maduración de las estructuras
branquiales y el hígado durante las etapas de desarrollo de acuerdo a lo establecido en
International Zebrafish Medaka Course (IZMC). Las dosis reportadas para larvas de 4-7
días de los diferentes procedimientos de aplicación son:
sedación (0,01 mg/ml).
anestesia (0,168mg/ml).
Eutanasia (0,2-0,3 mg/ml).
Dado que el bioensayo inicia a las 48 hpf y no hay datos específicos del efecto de la tricaína
en este estadio de desarrollo se evaluaron concentraciones a partir de los datos reportados
para larvas de 4-7 dpf. Se realizó una curva de tricaína con las siguientes concentraciones
(0.2, 0.3, 0.5, 0.6, 1, 1.5, 2 mg/mL) control de solvente y agua de huevo. Se usó una placa
de 24 pocillos en donde había 2 réplicas por concentración y (3 embriones por pozo) para
un total de (n=54) larvas. En todos los casos se utilizaron larvas decorionadas previamente.
La presencia del corión y el nivel de desarrollo puede generar tolerancia a altas
concentraciones de tricaína hasta (1000mg/L) en larvas de 1-2 dpf [74].
7.5.2. Exposición a las soluciones del extracto
A partir de la solución stock descrita en el numeral 7.1.1. Se realizaron soluciones
independientes por debajo del CL50 3,3 mg/L de (0.5, 1, 1.5, 2, y 2.5 mg/L). El bioensayo
se realizó en una placa de 24 pocillos (1 embrión por pozo y 2 réplicas (n= 36)). La
evaluación se realizó a embriones en estado larval de 48 hpf. Inicialmente se realiza la
inmersión en tricaína hasta alcanzar el nivel de narcosis-profunda con una dosis de 1,5
mg/ml. Posteriormente se sumergieron 2 horas en las soluciones del extracto Ageratina
vacciniifolia, cada hora se tomó la frecuencia cardiaca de todos los individuos del ensayo.
39
8. RESULTADOS Y DISCUSION
8.1. Identificación de los metabolitos secundarios presentes en Ageratina vacciniifolia
La confirmación de la identificación taxonómica de la especie Ageratina vacciniifolia la
realizó el herbario de la Universidad de los Andes. El número de clasificación de catálogo
es (ANDES-H 8807) (Anexo 1). De acuerdo con la cantidad de extracto etanólico seco total
de Ageratina vacciniifolia obtenido (36,6g), el porcentaje de rendimiento fue de 0,247 %
(Anexo 3). La marcha fitoquímica preliminar (Anexo 4) sugiere presencia de flavonoides,
taninos, cumarinas, terpenos y glucósidos cardiotónicos y se resume en la Tabla 8.
Tabla 8. Resultados del análisis fitoquímico preliminar (+) presencia, (-) ausencia.
Grupo de metabolitos
secundarios Prueba química Ageratina vacciniifolia
Flavonoides
Shinoda +
Rosenheim +
Leucoantocianidinas -
Taninos
Cloruro Férrico +
Acetato de Plomo +
Gelatina – Sal -
Naftoquinonas-Antraquinonas Borntrager-Krauss -
Saponinas Rosenthaler -
Cumarinas Hidroxamato férrico +
Terpenos – Esteroides Liebermann – Burchard +
Alcaloides
Dragendorff -
Valser -
Mayer -
Glucósidos Cardiotónicos
Baljet +
Tollens -
Antrona +
Los resultados de este trabajo concuerdan con descripciones previas en la presencia de
flavonoides y terpenos para la especie. Los autores Bohm y Stuessy (2001) catalogan a los
flavonoides como marcadores taxonomicos en la familia Asteraceae a la que pernece
nuestra especie de estudio [39]. Estos fueron reportados la primera vez por King y Robinson
40
(1970) en marchas fitoquimicas de especies del genero Ageratina, incluida Ageratina
vacciniifolia [10]. En relación a los terpenos, las publicaciones de Pescador B. (1994),
Torrenegra R. et al; (1999) y Hernández. M. (2014) reportaron para la especie compuestos
metabólicos de tipo diterpénico, especificamente derivados del Kaurano [61],[11],[13].
Pedrozo. J. (2001) encontró triterpenos como friedelina, acetatos de amirina, taraxerol,
además de los kaurenoides, de los cuales el compuesto mayoritario es el ácido kauranico
(ácido-kaur-16-en-19-oico).
La prueba de hidroxamato ferrico arrojo resultados positivos para cumarinas, lo cual
coincide con lo reportado por Pedrozo. J. (2001) quien al realizar una serie de
fraccionamientos a estructuras foliales con cloroformo identifico en estos extractos la
presencia de la cumarina escoporona en Ageratina vacciniifolia [79].
Algunos metabolitos secundarios encontrados en este estudio fueron los taninos y los
glucósidos cardiotónicos que no han sido reportados previamente para la especie. En el
analisis fitoquímico se obtuvieron resultados positivos para taninos en las pruebas de
cloruro férrico y acetato de plomo. Sin embargo investigaciones Del vitto y Penatti (2009)
han reportado ausencia de taninos en la familia Asteraceae [80]. En relación a los glucosidos
cardiotónicos, las pruebas de Baljet y Antrona fueron positivas para Ageratina vacciniifolia.
Sin embargo estas pruebas no son concluyentes. Por otro lado, los resultados para las
pruebas Dragendorff, Valser y Meyer para identificar Alcaloides fueron negativas para la
especie. No obstante, estudios Del vitto y Penatti (2009) reportaron la existencia de
alcaloides tipo pirrolizidínicos en la familia Asteraceae[80].
Los resultados de la composición de metabolitos secundarios pueden relacionarse
fácilmente con los usos etnobotanicos que se le han dado a la especie. Por ejemplo, Garcia
y Matulevich (2011) mencionaron que polifenoles como los taninos están implicados en
acciones de defensa contra organismos patogenos, entre ellos se detacan los parasitos y los
hongos [81]. La presencia de estos compuestos en Ageratina vacciniifolia daría soporte a
las actividades etnobotanicas descritas para la especie como antidiarreicos, antimicrobiano
y antifungico [53]. Casamitjana. N. (2002) destacó entre las funciones farmacológicas de
los glucósidos cardiotónicos, su poder de estimular el sistema cardiaco. La presencia de este
tipo de compuestos en la especie de estudio, justificaría las propiedades como
cardioregulador y antihipertensivo que se han descrito en estudios etnobotánicos [82].
8.2. Toxicologia bioensayo Artemia Salina.
El CL50 que se obtuvo para Ageratina vacciniifolia en este bioensayo fue 39.076 mg/L
(figura 20). El monitoreo se llevó a cabo para doce concentraciones entre 1 y 150 mg/L
(tabla 8). Todos los resultados se compararon contra un blanco de agua salada y uno de
solvente (DMSO 1%) ya que la naturaleza del extracto es hidrofóbica.
41
Tabla 9.Concentraciones usadas para la curva de toxicidad y su respectivo CL50 en Artemia
salina.
La curva de toxicidad indicó que la categoría a la que pertenece el extracto crudo de
Ageratina vacciniifolia es II (10-100 mg/L), es decir, altamente tóxica, según la
clasificación de toxicidad CYTED definida por A. Sanchez (2005) [65]. Si además se
considera que el tiempo de exposición fue de 24 horas también se puede sugerir que la
sustancia produce manifestaciones toxicas agudas.
Figura 21. Tasa de mortalidad CL50 para el modelo de artemia salina
El arreglo estadístico que se uso fue un análisis probit el cual arrojo un valor-P de 1x10-
3y es estadísticamente significativo con un nivel de confianza de 95%.
El CL50 obtenido tras el ensayo es (39.076 mg/L), el cual es un indicador de citotoxicidad
celular pero no advierte una actividad fisiológica o biológica. Meyer. B. (1994) y
Pisutthanan. S. (2004) establecieron que concentraciones menores de 250 mg/L se
consideran significativamente activas con un alto potencial en la investigación
farmacológica contra el ataque de células malignas [83], [84]. Por su parte, Pedrozo. J.
(2001) estableció un potencial farmacológico contra hongos filamentosos como Fusarium
oxysporum causante del deterioro de raíces en plantas, hongos dermatofitos como
Trichophyton mentagrophytes que puede parasitar en el cabello, piel o uñas, bacterias gram
positivas como Staphylococcus aureus causante de graves afecciones de mucosa,
Mycobacterium tuberculosis, causante de tuberculosis y graves complicaciones como la
meningitis o neumonía [79].
Planta (Ageratina vacciniifolia)
Órgano
planta Fracción
Etanólica Concentraciones mg/L CL50 (mg/L)
Categoría
de toxicidad
Hojas y
flores
Extracto
crudo 1 5 10 20 35 40 50 60 80 100 120 150 39.076 mg/L
Altamente
tóxico
42
8.3. Toxicologia bioensayo pez cebra (Danio rerio).
La curva de toxicología frente al modelo pez cebra se realizó a partir del CL50 que se
obtuvo utilizando el modelo de artemia salina. Las concentraciones de la curva fueron de 1
a 50 mg/L del extracto total de Ageratina vacciniifolia (Tabla 9). Se realizaron al menos 2
repeticiones para cada concentración (21 concentraciones en total) evaluadas con sus
respectivos controles.
Tabla 10. Concentraciones usadas en la curva de toxicidad (LC50).
Planta Concentraciones mg/L
vacciniifolia 0 1 2 2,5 3 3,4 3,5 3,8 4 4,2 4,4 4,5 4,6 4,8 5 6 8 10 12 20 50
De acuerdo a la cantidad de vivos y muertos obtenidos para cada experimento (Anexo 5),
se realizó un análisis Probit por el programa estadístico StatGraphics. Esta prueba es un
modelo de regresión logística en el cual la variable dependiente (CL50) se puede ver
afectada por factores cuantitativos, en este caso la cantidad de vivos-muertos, repeticiones
y replicas.
Para Ageratina vacciniifolia el CL50 en el bioensayo de pez cebra es de 3.37 mg/L como
se evidencia en la figura 25. Es decir, concentraciones por encima de este CL50 causan
muertes progresivas hasta alcanzar el 100% de muertes. El intervalo de 90 a 100% de
muertes corresponde a concentraciones de 5 mg/L a 6 mg/L respectivamente.
Concentraciones de prueba mayores a 10 mg/L causan la mayor tasa de mortalidad.
Figura 22. Grafica de LC50 para concentraciones de Ageratina vacciniifolia entre 1mg/L
y 50mg/L
El arreglo estadístico que se uso fue un análisis probit el cual arrojo un valor-P de 1x10-
3y es estadísticamente significativo con un nivel de confianza de 95%.
43
De acuerdo a los datos obtenidos por el modelo estadístico Probit, para Ageratina
vacciniifolia se deduce que hay diferencias significativas en la tasa de mortalidad (CL50)
dependiendo la concentración usada del extracto. Así, el efecto es estadísticamente
significativo con un nivel de confianza del 95%. De acuerdo a los datos estadísticos y la
prueba de chi-cuadrado (𝝀𝟐) las variables categóricas de concentración, repetición y
replicación son comparables. La variable con mayor distribución es la replicación como lo
muestra la tabla 11.
Tabla 11. Pruebas de Razón de Verosimilitud para las variables categóricas de la prueba
toxicológica
Factor Chi-Cuadrada Gl Valor-P
Concentración (mg/L) 290,151 1 0,0000
Repetición 9,62875 4 0,0472
Replicación 5,26096 2 0,0720
Aunque el factor de la replicación fue el que obtuvo un valor de distribución mayor de
acuerdo a la tabla 12 el valor-P del residuo en el análisis de desviaciones es de 0,0193.
Como el valor es menor a un (α=0,05), indica que hay una relación estadísticamente
significativa entre las variables.
Tabla 12. Análisis de desviaciones en la regresión logística probit para el LC50 en pez
cebra.
Para comprobar si este modelo probit es el que más se ajusta a la población de datos de
Ageratina vacciniifolia se realizó la prueba de chi-cuadrado de bondad de ajuste (tabla 13)
donde se comparan los datos probabilísticos experimentales frente a los teóricos arrojados
por el (𝝀𝟐). Los datos arrojados del chi-cuadrado tabulado es 6,29404 y 3 grados de libertad
con un *valor-P de 0,0981466. Al ser este valor mayor a (α=0,05) el modelo es el adecuado
con un nivel de confianza del 95%.
Tabla 13. Prueba de Bondad de ajuste para chi-cuadrado
Probit CIERTO CIERTO FALSO FALSO
Clase Logit n Observado Esperado Observado Esperado
1 menor que 0,0174007 132 28,0 32,8913 104,0 99,1087
2 0,0174007 a 0,796864 132 89,0 88,6822 43,0 43,3178
3 0,796864 a 1,36907 132 119,0 112,498 13,0 19,5016
4 1,36907 a 4,92419 132 127,0 129,573 5,0 2,42712
5 4,92419 o mayor 114 114,0 114,0 0,0
Total 642 477,0 165,0
Chi-cuadrada = 6,29404 con 3 g.l. *valor-P = 0,0981466
Fuente Desviación Gl Valor-P
Modelo 320,841 7 0,0000
Residuo 130,25 99 0,0193
Total (corr.) 451,091 106
44
El arreglo estadístico es el más indicado para la población de datos obtenidos para esta
prueba. La prueba de bondad de ajuste arrojo un valor-P por encima de 0,05 con lo cual se
puede concluir que la variable concentración está afectando directamente a la tasa de
mortalidad CL50. Por otro parte no se encuentran diferencias significativas entre las
repeticiones de cada ensayo. Aunque si se encuentran diferencias estadísticas para las
replicaciones, esto podría explicarse por la heterogeneidad genética de las poblaciones de
peces usado en los ensayos. Evidenciándose en cambios en la Absorción, Distribución,
Metabolismo y Excreción de las sustancias presentes en el extracto.
Los bajos valores obtenidos de CL50 con el modelo de artemia salina y el pez cebra para el
extracto total de Ageratina vacciniifolia sugieren que los metabolitos secundarios que
presenta esta especie son altamente tóxicos. Estos pueden estar relacionados con las
actividades citotóxicas reportadas previamente para la especie. Estudios previos como el
de Costa-Lotufo et al. (2002) han evaluado el potencial citotóxico del ácido kauránico
purificado frente a diferentes líneas celulares de cáncer a concentraciones de 30 mM [85].
Dado que Pedrozo J. (2001) reportó el Kaurano como uno de los metabolitos más
abundantes en la especie, se podría sugerir que este metabolito es uno de los responsables
del efecto citotóxico observado.
8.4. Influencia del tiempo de exposición frente a la mortalidad
Este análisis estadístico se realizó con el fin de determinar en qué ventana de tiempo se
daba la mayor mortalidad de peces frente a las soluciones del extracto de Ageratina
vacciniifolia. Se tuvieron en cuenta los cuatro tiempos de observación (24, 48,72 y 96).
Para empezar, se realizó la prueba estadística ANOVA multifactorial. Esta permite
relacionar el factor tiempo directamente con la tasa de mortalidad, la cual se ejecutó en el
programa Statgraphics. De acuerdo a lo arrojado por este análisis se determinó que el
tiempo y la concentración tienen efectos estadísticamente significativos sobre la mortalidad
con un 95 % de nivel de confianza y sus valor-P 0,000, como se muestra en la tabla 14. Por
otro lado se observa que las covariables analizadas no son estadísticamente significativas y
no tienen efecto en la tasa de mortalidad.
Tabla 14. Análisis de varianza para la mortalidad de Ageratina Vacciniifolia
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
COVARIABLES
Repetición 0,0286706 1 0,0286706 0,64 0,4243
Replicación 0,0156992 1 0,0156992 0,35 0,5543
EFECTOS
PRINCIPALES
A:Tiempo 23,024 3 7,67467 171,25 0,0000
B:Concentración 22,7176 19 1,19566 26,68 0,0000
RESIDUOS 17,7021 395 0,0448154
TOTAL (CORREGIDO) 63,7605 419
45
Posteriormente se realizó el análisis de medias de Fisher (LSD), para conocer en que
ventana de tiempo específicamente se causa la mayor tasa de mortalidad. De esta forma es
posible conectar la acción del extracto en el desarrollo de los embriones de pez cebra en el
tiempo. De acuerdo a los datos estadísticos mostrados en la tabla 15, se observa que la tasa
de mortalidad se mantiene constante en el tiempo y es proporcional al tiempo de exposición.
En la figura 26 aparecen las medias de cada uno de estos datos para cada uno de los tiempos
observados (24, 48,72 y 96)
Figura 23. Gráfico de medias de Fisher de la influencia del tiempo sobre la mortalidad
para Ageratina vacciniifolia.
La tasa de mortalidad se mide de 0 a 1, siendo 0 la mayor tasa de mortalidad y 1 la menor
tasa de mortalidad, este arreglo estadístico se denomina medias de Fisher a un nivel de
confianza del 95%
No hay una diferencia significativa en la tasa de mortalidad en los intervalos de tiempo
evaluados, lo cual sugiere una actividad citotóxica general. Esto significa que podría estar
afectando cualquier tipo de célula durante las diferentes etapas del desarrollo, provocando
daños considerables que conllevan a anomalías en el funcionamiento que finalmente
terminan el deterioro del embrión.
Tabla 15. Prueba de múltiples Rangos para la mortalidad influencia por el tiempo
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites
24 - 48 * -0,220635 0,0574401
24 - 72 * -0,428571 0,0574401
24 - 96 * -0,628571 0,0574401
48 - 72 * -0,207937 0,0574401
48 - 96 * -0,407937 0,0574401
72 - 96 * -0,2 0,0574401
* indica una diferencia significativa.
El ingreso de los metabolitos secundarios que están presentes en Ageratina vacciniifolia,
tienen rutas de ingreso rápidas en el embrión. Esto debido a que hasta los 5 dpf, la larva
46
realiza intercambio por vía dérmica de nutrientes, oxígeno y materiales en su ambiente por
difusión pasiva [20]
8.5. Influencia de la exposición al extracto frente a la morfología del animal.
Se efectuó el análisis de los efectos morfológicos y/o teratogénicos durante el desarrollo del
embrión de pez cebra causados por la exposición al extracto etanólico de Ageratina
vacciniifolia. Se realizó a una curva de 6 concentraciones (0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 y 3 mg/L) por
debajo del CL50 obtenido (3,3 mg/L) en la prueba toxicológica. La evaluación se realizó a
las 24, 48, 72 y 96 hpi de acuerdo con los parámetros mencionados en la metodología cuyos
resultados se resumen en la tabla 16.
Tabla 16. Evaluaciones morfológicas observadas en el efecto tóxico ocasionado por
Ageratina vacciniifolia.
Criterios de malformación presentes en embriones de pez cebra
a) Pigmentación incompleta/anormal
Tiempo de exposición (hpi)
24 48 72 96
- - - -
b) Falta de latido cardíaco - - - +(1)
c) Hemorragias (cefálicas, circulación) - + + +
d) Alteración de la motilidad (Respuesta al toque) +(2) +(2) +(2) +(2)
e) Edema pericárdico - +(1) +(1) +(1)
f) Defectos en somitogénesis - - - -
g) Alteraciones en el desarrollo ocular - - +(3) +(3)
h) Necrosis (ojos, cloaca, cavidad del cuerpo) - - +(1) +(1)
i) Deformación tubo neural - - - -
j) Malformaciones craneofaciales - - +(1) +(1)
k) Deformación de la yema - - +(1) +(1)
l) Curvatura del cuerpo (lordosis, Escoliosis,
cifosis)
- - +(1) +(1)
m) Degeneración muscular - - +(1) +(1)
n) Otolitos - - - -
o) Retraso en el crecimiento y desarrollo - - - - (1)Efectos morfológicos observados individuos de 3mg/L. (2)Efectos morfológicos observados en todas las concentraciones. (3)Efectos morfológicos observados a partir de la concentración de 1.5 mg/L.
Al realizar el análisis morfológico en diferentes tiempos, la concentración con mayor
cantidad de efectos teratogénicos observados fue 3mg/L. Esto era de esperarse de acuerdo
a la curva de toxicidad realizada en el modelo pez cebra. Para esta concentración, los efectos
fueron letales a partir de las 72 hpi.
47
En la concentración de 3 mg/L, se observaron efectos morfológicos teratogénicos (Figura
27, A). Las larvas muestran retraso en el desarrollo, deformación de la yema, microftalmia,
degeneración muscular, necrosis, malformaciones craneofaciales y edema pericárdico
evidentes hasta las 72 hpi (Figura 27, F) previo a su muerte.
A las 24 hpi se evidencia retraso en el desarrollo, alteraciones en la morfología de la yema,
y microftalmia (Figura 27, B).
A las 48 hpi uno de los efectos observados es la aparición de hemorragia pericárdica
(porción ventral anterior de la yema). Posteriormente a las 72 hpi se expande la región que
rodea al corazón, es decir, se produce un edema pericárdico. Se observan deformaciones en
el ventrículo y la aurícula, disminución del flujo sanguíneo y bradicardia (descenso en la
contracción de la frecuencia). Además, no se produce el desarrollo de las estructuras
mandibulares que normalmente son evidentes a partir de las 72 hpf. Este último, se ha
especulado es causado en parte por el edema pericárdico afectando la formación de los
derivados de los arcos faríngeos como la mandíbula.
Figura 24. Efectos morfologicos observados a la concentración de 3mg/L.
(A, C, E) individuo control monitoreado desde 24-72 hpi. (B, D, E) individuo sometidos a
inmersión con extracto total de Ageratina vacciniifolia a una concentración de 3 mg/L.
48
Entre los daños más severos (D, E) se observó m) Degeneración muscular, c) Hemorragia
vascular, g) alteraciones oculares, h) necrosis craneocefalica, j) malformación
craneofacial, e) edema pericárdico k) deformación de la yema
Otra de las alteraciones observadas a las 48 hpi es la degeneración muscular. Esta es
evidente no solo por el deterioro en la apariencia, sino además por la ausencia de respuesta
al toque. Dou. Y. (2006) afirma que la respuesta del músculo a impulsos de alta frecuencia
(186 Hz - equivalente al estímulo que genera el toque), es un efecto contráctil rápido [86].
Esta respuesta se manifiesta en el escape del animal una vez recibe el estímulo. De esta
forma, la pérdida de la función muscular puede analizarse por cambios en los patrones de
nado en respuesta a un estímulo tactíl. Budick. S. (2000) afirma que la respuesta de escape
está estrechamente relacionada a la actividad del sistema neuro-muscular [87]. En esta
actividad intervienen elementos musculares, nerviosos y de señalización celular. Es posible
entonces que los componentes del extracto estén afectando la integridad de alguno de estos
elementos o un conjunto de ellos causando el deterioro de la actividad motora.
Los efectos relacionados con alteraciones cardiacas y la degeneración o perdida de actividad
muscular, evaluada por la respuesta al toque, podrían justificarse por la presencia de los
compuestos de tipo kaurano en el extracto. Según Tirapeli. C. (2010) los kauranos causan
la disminución de la frecuencia cardiaca probablemente a través de la inhibición del
receptor de dihidropiridina (DHPR) o de alteraciones en los mecanismos de ingreso de
calcio extracelular necesarios para la contracción muscular.
Figura 25. Posible inhibición del ácido kauranico
Proceso de acoplamiento de excitación y contracción muscular llevada a cabo por células
cardiacas y esqueléticas (tomado y modificado)[88].
Según Juárez. J. (2006) para iniciar el movimiento muscular, los canales de Ca2+ tipo L
perciben la despolarización de la membrana celular. Esta despolarización activa el receptor
dihidropiridina (DHPR) el cual permite la entrada de pequeñas cantidades de Ca2+ al
citoplasmas. Esta elevación de la concentración de Ca2+ es detectada por los receptores
49
denominados RyR. Estos receptores permitirán la liberación del Ca2+ almacenado en el
retículo sarco/endoplasmático hasta alcanzar una concentración intracelular máxima de
Ca2+ de [1µM] que desencadena la cascada responsable por del movimiento contráctil en
los músculos [15], [88]. La falta de movimiento de la musculatura puede generar atrofia de
las estructuras ocasionando también alteraciones en la morfología corporal como la
lordosis.
La citotoxicidad del extracto de la planta se manifiesta con daños que producen necrosis en
las larvas expuestas. Esta necrosis es evidente en la yema, el cerebro y paquetes musculares.
La primera empieza a visualizase como una malformación del saco vitelínico desde las 24
hpi (Figura 27, B). Posteriormente a las 48 hpi (Figura 27, D) el tejido puede considerarse
muerto. En cuanto al cerebro se observaron malformaciones desde las 48 hpi (Figura 27,
D). La elevación del cerebro medio no ocurre y la evaluación a las 72 hpi (Figura 27, F)
muestra daño necrótico de esta estructura. También alteraciones en la señalización celular
podrían contribuir a la necrosis observada. Es probable que este daño se produzca desde el
inicio de la exposición al extracto a las 10 hpf y sea la causa de encontrar retraso en el
desarrollo. Al no encontrarse en óptimas condiciones la integridad del tejido la larva no
puede suplir exitosamente sus necesidades de nutrición.
Por último, la microftalmia puede producirse por alteraciones en la migración de los
precursores ópticos durante el desarrollo ocular. Proceso que según H. Gutierrez puede
verse afectado por que la proliferación y migración de las células al campo óptico ocurre
desde 11-13 hpf y la retinogénesis sucede desde 24-48 hpf [89].
En contraste a los individuos tratados con una concentración de 3 mg/L, las concentraciones
de 0.5, 1,1.5, 2, 2.5 mg/L no muestran efectos morfológicos aparentes como se indica en la
figura 28 para una concentración de 2.5 mg/L. Sin embargo, haciendo evaluaciones
morfométricas se pudo establecer microftalmia (Figura 28, B) la cual se evidencia desde la
concentración de 1,5 mg/L.
Teniendo en cuenta que no existen efectos morfológicos evidentes en el desarrollo de las
larvas a concentraciones menores de 2,5 mg/L se realizaron análisis estadísticos de la
longitud, el tamaño ocular y el tamaño del vitelo en estas concentraciones para determinar
si existían efectos adversos que no pueden ser detectados a simple vista.
50
Figura 26. Crecimiento durante el desarrollo desde 24 hpi hasta 96 hpi de los
tratamientos.
El arreglo estadístico que se uso fue un ANOVA multifactorial el cual arrojo un valor-P de
0,4458. Con lo cual es tiempo y las concentraciones evaluadas no afectan el desarrollo de
global de los individuos observados. Nivel de confianza de 95%.
De acuerdo con el análisis estadístico, la longitud de las larvas no tiene diferencias
estadísticamente significativas con respecto al blanco con un valor-P de 0,4458 y un 95%
de confianza (Anexo 6). En los diferentes intervalos de tiempo a las concentraciones
evaluadas fue posible observar un crecimiento uniforme durante todo el proceso de
monitoreo (Figura 27).
Interacciones y 95,0% Intervalos de Confianza
Tiempo
2,4
2,7
3
3,3
3,6
3,9
Lo
ng
itu
d t
ota
l (m
m)
24 48 72 96
Concentración
0
0,5
1
1,5
2
2,5
51
Figura 27. Efectos morfologicos observados en el estudio toxicológico a una
concentración de 2.5 mg/l.
(A, C, E, G) individuo control monitoreado desde 24-96 hpi. (B, D, F, H) individuos
sometidos a inmersión con extracto total de Ageratina vacciniifolia a una concentración
de 2.5 mg/L entre los daños más severos se encuentra la presencia de edema pericárdico a
las 48 horas, sin embargo se recupera a las 72 horas.
Estos resultados fueron corroborados por medio de un análisis de medias de Fisher. En este
análisis por medio de la prueba de múltiples rangos se determinó que existe una
52
homogeneidad en el crecimiento de las larvas en todas las concentraciones, sin que existan
diferencias mayores a 0,03 mm entre los tratamientos y el blanco (Anexo 6).
Figura 28. Tamaño ocular evaluado desde 24hpi hasta 48 hpi.
El arreglo estadístico que se uso fue un ANOVA multifactorial el cual arrojo un valor-P de
1x10-5. De acuerdo a estos datos el tiempo y la concentración si son estadísticamente
significativas con respecto al tamaño ocular. Nivel de confianza de 95%.
En cuanto al tamaño ocular, de acuerdo con el análisis estadístico, existen diferencias
significativas en el tamaño del ojo al aplicar diferentes concentraciones del extracto con
respecto al blanco (Anexo 6). Según la prueba de múltiples rangos, existe homogeneidad
en el crecimiento ocular en las concentraciones de 0,5 y 1 mg/L con respecto al blanco. Sin
embargo, concentraciones por encima de 1,5 mg/L evidencian tamaños oculares
significativamente más bajos con respecto al blanco, siendo 2,0 y 2,5 mg/L las
concentraciones donde el efecto es más evidente con diferencias de 0,06 y 0,08 mm2
respectivamente como se muestra en figura 28. Este efecto es posible observarlo desde las
24 hpi y se mantiene hasta el final de la evaluación a las 96 hpi. La reducción en el tamaño
ocular es un efecto conocido como microftalmia.
Finalmente, al evaluar el tamaño del vitelo del pez, durante cada uno de los intervalos de
tiempo y a distintas concentraciones, se halló que no existen diferencias estadísticamente
significativas entre el blanco y los tratamientos evaluados, como se observa en la figura 29.
Estos resultados están en concordancia con la prueba de múltiples rangos, según la cual las
medias del área del vitelo en cada una de las concentraciones son homogéneas con el blanco
(Anexo 6). Este efecto sugiere que el gasto de nutrientes es equivalente en cada uno de los
Tiempo de inmersión ( hpi)
Tam
añ
o o
cu
lar
( m
m2 )
Interacciones y 95,0% Intervalos de Confianza
28
38
48
58
68
78
24 48 72 96
Concentración mg/L00,511,522,5
53
tiempos evaluados en el experimento independiente de la concentración del extracto a la
cual fueron sometidas las larvas.
Figura 29. Tamaño del vitelo evaluado desde 24 hpi hasta 48 hpi
El arreglo estadístico que se uso fue un ANOVA multifactorial el cual arrojo un valor-P de
0,3736. Con lo cual el tiempo y las concentraciones evaluadas no afectan el área del vitelo
de los individuos observados con respecto al blanco. Nivel de confianza de 95%.
Teniendo en cuenta esta evaluación morfológica se decide utilizar la concentración máxima
sin efecto observado 2.5 mg/L y soluciones por debajo de este valor 0.5, 1,1.5, 2 mg/L para
las pruebas de actividades biológicas: regeneración de la aleta caudal y evaluación
frecuencia cardiaca. Estos ensayos se describen a continuación.
8.6 Evaluación de la regeneración de la aleta caudal
Para evaluar si las soluciones del extracto total de Ageratina vacciniifolia tenía alguna
estimulación reparadora sobre los tejidos, se realizó un ensayo de regeneración sobre la
aleta caudal en estadios larvales, aprovechando que este proceso no demora más de 4 días
[32].
Las aletas de estadios larvales de pez cebra se componen principalmente por células
epiteliales que logran regenerarse de tal manera que se restaura la estructura tal cual como
estaba originalmente. La regeneración según Agnieszka. A. (2012) se caracteriza por una
secuencia de eventos:
Interacciones y 95,0% Intervalos de Confianza
Tiempo (hpi)
0,1
0,14
0,18
0,22
0,26
0,3
0,34
Áre
a d
el
vit
elo
24 48 72 96
Concentración mg/L00,511,522,5
54
a). Inicialmente se produce una respuesta inflamatoria en la cual migran al sitio de lesión
varias células de sistema inmune (neutrófilos, monocitos, macrófagos) que son atraídas por
las citosinas liberadas por células del área lesionada [90].
Figura 30. Aparición del muñón seguido de la amputación de la aleta caudal
Inicio del proceso de regeneración con la aparición del muñón a los 10 minutos post-
amputación (mpa).
b). Inmediatamente, células que están en la zona de corte principalmente epiteliales,
realizan el cierre de la herida por contracción celular, generando una estructura denominada
muñón como se observa en la figura (30, B).
c) En corto tiempo se desencadena la proliferación celular. Aún se desconoce de dónde
provienen las células que restauran el tejido. Se proponen dos modelos, el primero indica
que las células epiteliales presentes comienzan a des-diferenciarse y entran a ciclo celular
para realizar la mitosis. El segundo afirma que se ocasiona una migración celular de otros
tejidos hasta el punto de la lesión. Sin importar la fuente, estas células empiezan a colonizar
el borde de la herida en un proceso de aglomeración de células indiferenciadas denominada
blastema como se muestra en la figura (31, C, G y K ) [32].
d). A partir de la proliferación celular, la regeneración de la aleta caudal procede
rápidamente. El proceso de proliferación es activo y se termina hasta remodelar la estructura
amputada (Figura 31, D y H). En paralelo a la proliferación celular se observa re-
epitelialización en el borde de la estructura en regeneración, a esto se conoce como tejido
de granulación (Figura 31, C y D).
La regeneración en presencia de diferentes soluciones del extracto Ageratina vacciniifolia
muestra un comportamiento bimodal. En una concentración de 2 mg/L presento un efecto
estimulador del proceso regenerativo como se muestra en la figura (31, F, G y H). Mientras
que a 2.5 mg/L presento un efecto inhibitorio de la regeneración generando solo
cicatrización primaria. Este se evidencia en el cierre de la herida, aparición del blastema y
permanencia en este esté estado como se muestra en la figura (31, J, K y L). Las
concentraciones por debajo de 2 mg/L no tuvieron ningún efecto comparados con el control.
55
Figura 31. Evolución del proceso regenerativo en la aleta caudal desde 72 hpa hasta 120
hpa.
(A, B, C, D) individuo control monitoreado desde 72-120 hpa. (E, F, G, H) individuos
sometidos a inmersión con soluciones del extracto total de Ageratina vacciniifolia a una
concentración de 2.0 mg/L en proceso de re-epitelialización. (I, J, K, L) individuo sometido
a una concentración 2.5 mg/L observándose una tasa de regeneración mayor en 72 y 96
hpa.
56
Entre los metabolitos descritos para Ageratina vacciniifolia King y Robinson (1970)
identificaron la presencia de quercetina y kaemferol. Estudios posteriores de estos
metabolitos en otra especie, por Fernandes. E et.al (2016) mostraron efectos sobre la
proliferación celular y reparación (cita fernandes). Específicamente, encontraron
proliferación aumentada y reparación eficiente frente a procesos de cicatrización de
fibroblastos primarios de rata en un bioensayo in vitro de la reparación de la herida (wound
healing –scratch- assay). Así, estos metabolitos podrían ser los responsables del aumento
en el potencial regenerativo a 2 mg/L para Ageratina vacciniifolia. Este efecto también
puede estar ligado a la disminución de radicales libres que inhiben procesos apoptoticos
celulares. Dado que la concetración en la que se estima se encuentran estos flavonoides en
Ageratina vaccciniifolia es baja, es posible observar estos efectos a 2 mg/L. Probablemente
la concentración relativa por debajo de este valor no sea sufiente para mostrar efectos
observables de estimulación en la regeneración, mientras que a 2.5 mg/L inhibe este proceso
como se muestra en la figura 32. Estos hallazgos pueden ser de gran utilidad para la
prevención de enfermedades degenerativas o el envejecimiento prematuro a las
concetraciones adecuadas [39]. Lo anterior se soporta por los datos morfométricos de este
proceso de regeneración, el cual se evaluó midiendo el tamaño del regenerado como se
indicó en la metodología de este trabajo.
Figura 32. Evolución de la longitud regenerada a partir de 72 hpa hasta 120 hpa
El arreglo estadístico que se uso fue un ANOVA multifactorial el cual arrojo un valor-P
0,0024. Con lo cual la concentración y el tiempo son estadísticamente significativas. Nivel
de confianza de 95%.
Interacciones y 95,0% Intervalos de Confianza
Tiempo de inmersión ( hpi )
-5
5
15
25
35
45
Lo
ng
itu
re
ge
ne
rad
a (
mm
)
72 96 120
Concetración mg/L0
1
1,52
2,5
57
De acuerdo al análisis estadístico las soluciones del extracto etanólico de Ageratina
vacciniifolia muestran diferencias estadísticamente significativas de acuerdo al (Anexo 7).
A los diferentes intervalos de tiempo y las concentraciones evaluadas de acuerdo a la prueba
de medias de Fisher es posible observar que 2 mg/L es la que presenta mayor regeneración.
Esto medido en términos de la longitud regenerada hasta las 120 hpa en comparación al
blanco. Existe homogeneidad estadística, es decir no hay efecto, con respecto a la longitud
regenerada en las concentraciones 1, 1.5 mg/L. Finalmente, la concentración de 2.5 mg/L
inhibe el proceso regenerativo. A pesar de que se evidencia algún crecimiento, las
características del tejido evaluado no corresponden a un proceso de regeneración si no a un
proceso de cicatrización con tendencia a la fibrosis.
Figura 33. Correlación mediante la prueba de múltiples rangos en las medias de Fisher
El arreglo estadístico que se uso fue un ANOVA multifactorial para prueba de rangos
múltiples el cual arrojo un valor-P 0,0024 y es estadísticamente significativo con un nivel
de confianza de 95%.
8.7 Evaluación de la frecuencia cardíaca
Para establecer si las soluciones del extracto etanólico de Ageratina vacciniifolia pueden
regular la frecuencia cardiaca en estadios larvales de pez cebra, se evaluó el ritmo cardiaco
en presencia de tricaína.
Inicialmente se realizó una prueba de estandarización para establecer cuál era la
concentración en la que se mantenía constante la frecuencia cardiaca y se mantenía inmóvil
la larva sin causar su muerte. En tabla 17 se establece cual es el valor de la frecuencia
cardiaca en los tiempos en los que se llevó a cabo el experimento.
0 1 1,5 2 2,5
Medias y 95,0% de Fisher LSD
Concentración mg/L
13
15
17
19
21
23
Lo
ng
itu
reg
en
era
da (
mm
)
58
Tabla 17. Concentraciones de metasulfonato de tricaína MS-222 ensayadas
Concentración de
Tricaína
Frecuencia Cardiaca Latidos/ minuto
*0 horas **1 hora **2 horas
0,168 mg/mL
(anestesia)
125 125 125
0,2 mg/mL (Eutanasia) 126 125 124
0,3 mg/mL (Eutanasia) 125 125 126
0,5 mg/mL 127 125 126
0,6 mg/mL 126 124 125
1 mg/mL 121 122 123
1.5 mg/mL 118 115 121
2 mg/mL 110 112 118
*Toma basal de frecuencia cardiaca de los individuos
** Tiempo inmersión a al anestésico
De acuerdo a las frecuencias descritas anteriormente se escogió una concentración que
disminuyera moderadamente la frecuencia cardiaca (1.5 mg/mL) comparada con la dosis
anestésica (0,168 mg/mL). Esto permite tener un rango dinámico para evaluar las
propiedades de la sustancia en un ámbito inhibidor o estimulador en cuanto al valor de la
frecuencia cardiaca normal. Schroeder. E. et al. (2003) afirma que la frecuencia cardiaca es
una herramienta no invasiva para estimar cuantitativamente la función cardiaca y su posible
relación con las enfermedades cardiovasculares [26].
En el ensayo de ritmo cardiaco se analizaron 5 concentraciones del extracto etanólico (0.5,
1, 1.5, 2, y 2.5 mg/L), las cuales no presentaron efectos morfológicos observables, los datos
se contrastaron contra un blanco de agua y del vehículo utilizado (DMSO).
En la evaluación del ritmo cardiaco se encontró que las concentraciones (1, 1.5, 2, y 2.5
mg/L) reducen la frecuencia cardiaca con respecto al blanco tratado con el anestésico
tricaína y el blanco del solvente DMSO. La concentración de 0,5 mg/L inicialmente produjo
la disminución de la frecuencia cardiaca igual a los demás tratamientos, pero a medida que
transcurrió el tiempo de evaluación la frecuencia cardiaca se restauró al nivel de los
controles como lo muestra la figura 34.
59
Figura 34. Evaluación de frecuencia cardiaca Latidos/minuto a cada una de las
concentraciones en mg/L
El arreglo estadístico que se uso fue un ANOVA multifactorial el cual arrojo un valor-P
0,3275. Con lo cual se determinó que la concentración afecta directamente la frecuencia
cardiaca pero no el tiempo. Nivel de confianza de 99,99%.
El tiempo de exposición no tuvo un efecto estadísticamente significativo sobre la variable
dependiente con un valor-P de 0,3275 con un 95 % nivel de confianza (Anexo 8).
Teniendo en cuenta la prueba de múltiples rangos para la frecuencia, existe homogeneidad
con el blanco solamente para la concentración de 0,5 mg/L. Las concentraciones de 1 a 2,5
mg/L del extracto tienen diferencias significativas con respecto al blanco. A pesar de no
tener diferencias significativas frente al control la concentración de 0,5 mg/L muestra una
tendencia similar a las concentraciones más altas.
Figura 35. Gráfica de Fisher de homogeneidad entre grupos de concentraciones
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Medias y 95,0% de Fisher LSD
Concentración mg/L
100
110
120
130
140
Fre
cu
en
ia L
ati
do
s/m
inu
to
60
El arreglo estadístico que se uso fue un ANOVA multifactorial para prueba de rangos
múltiples el cual arrojo un valor-P 0,0024 de y es estadísticamente significativo con un
nivel de confianza de 95%.
Rodríguez. L. (2007) resaltó la importancia pronostica de la frecuencia cardiaca como
evaluación inicial de fallo en sistema cardiaco [91]. Schroeder, ha estimado que el aumento
del ritmo cardiaco puede aumentar la función arterial. Al corazón producir más pulsaciones
por minuto, aumenta la cantidad de flujo sanguíneo que recorre el sistema circulatorio,
dando como resultado un aumento en la presión arterial. Sin embargo la condición debe ser
permanente para denominarlo hipertensión [26]. De acuerdo a los resultados obtenidos en
este estudio frente el extracto de Ageratina vacciniifolia en concentraciones de 1 a 2.5 mg/L,
esta causa una disminución de la frecuencia cardiaca. Este efecto puede ser el responsable
de las propiedades anti-hipertensivas descritas etnobotánicamente para la especie. Sin
embargo, es necesario ampliar estas propiedades con otras investigaciones.
El metabolito que podría estar contribuyendo a la regulación de la frecuencia cardiaca son
los compuestos tipo kaurano. Previamente Tirapeli. C. (2010) estableció que estos
compuestos, extraídos e identificados por B.Pescador (1994) en la especie Ageratina
vaccinifolia, pueden estar inhibiendo los canales tipo L de cacio (Ca 2+) . Esto afecta la
contractibilidad del corazón ocasionando que se disminuya la frecuencia cardiaca [15]. Esto
debido a según el potencial de acción cardiaco da como resultado la apertura y cierre
secuencial de los receptores de los canales iónicos a través de la membranas plasmáticas de
los Miocitos [92]. Finalmente, si los músculos tanto lisos o estriados, no tiene la capacidad
de contraerse, en el sistema circulatorio se obtendrá un efecto vasodilatador. Según los
estudios de Tirapelli. C. (2010) con kauranos se sabe que estos compuestos producen
efectos vasodilatadores reductores de la frecuencia cardiaca que están asociados a la
propiedad anti-hipertensivas.
En resumen, este estudio permitió ampliar la base científica en cuanto a las propiedades
etnobotánicas descritas para Ageratina vacciniifolia. Se confirmaron efectos en la
modulación de la frecuencia cardiaca, potencialización de la regeneración y efecto
citotóxicos.
9. CONCLUSIONES
La implementación de esta investigación es un inicio en la búsqueda de nuevas prácticas
metodológicas para establecer posibles potenciales biológicos que se encuentren ocultos en
la riqueza de la flora colombiana. La implementación del modelo animal pez cebra, es una
herramienta de gran utilidad, gracias a que es posible elaborar distintas metodologías de
análisis enfocadas a los requerimientos investigativos. Específicamente en este proyecto se
buscaba establecer parámetros toxicológicos y morfológicos básicos frente a la exposición
del extracto total de Ageratina vacciniifolia, una especie del páramo. En el estudio
toxicológico el CL50 que se obtuvo fue 3.3mg/L lo cual implica que es de una categoría
61
altamente toxica. Para la evaluación morfológica en concentraciones por debajo del CL50
se determinó que la concentración de 3 mg/L es la que presenta mayor acumulación de
efectos teratógenicos.
En relación al estudio de la regeneración de la aleta caudal fue necesario evaluar en qué
etapa de desarrollo se llevaba cabo la tasa más estable de regeneración. Se determinó que
72 hpf era la edad indicada para desarrollar el experimento con una duración de 3 días. Al
contrastar el proceso regenerativo contra el control se estableció que la concertación de
extracto total de Ageratina vacciniifolia que estimula la regeneración de la aleta es 2 mg/L,
mientras que a 2.5 mg/L se observó que la remodelación del miembro se detiene dando paso
a un proceso de cicatrización. Esto indica un efecto bimodal del extracto total de la especie.
En el estudio de la frecuencia cardiaca era necesario contar con una sustancia control que
fuera capaz de mantener estable este parámetro sin afectar la viabilidad. En este caso de
decidió el uso tricaína un anestésico de uso en animales acuáticos. La dosis que se estableció
como control fue de 1.5mg/mL y aunque está muy alejada de la dosis anestésica 0,168
mg/mL permite un rango dinámico amplio para la evaluación, tanto de la inhibición como
de la estimulación de la frecuencia cardiaca. Al realizar la prueba con el extracto total de
Ageratina vacciniifolia se estableció que la concentración que normaliza la frecuencia
cardiaca frente al control es 0.5 mg/L, mientras que concentraciones de 1,1.5, 2 y 2.5 mg/L
la disminuyen. Al igual que la evaluación de la regeneración, dependiendo de la dosis el
efecto sobre la frecuencia cardiaca también se considera bimodal.
10. RECOMENDACIONES
De acuerdo a lo obtenido en la marcha fotoquímica, que arrojó resultados positivos para
compuestos polares (flavonoides, polifenoles), polaridad media (glucósidos
cardiotónicos) y apolares (terpenos), se recomienda hacer fraccionamiento por el
método liquido/ liquido. Este método permite una extracción por gradientes de
polaridad sin afectar la muestra. Para su fraccionamiento se propone utilizar solventes
apolares (éter de petróleo/ hexano) seguidos de solventes de polaridad media
(diclorometano/cloroformo/etanol) y polares (agua/ acetato de etilo). Por último, se
debe realizar una derivatización de los componentes más polares.
Para poder establecer cuáles de los componentes pueden ser responsables de las
propiedades encontradas para la especie, es necesario realizar nuevamente los ensayos
con las fracciones del extracto. También si es posible con los compuestos puros, para
contrastar y/o refinar los resultados.
Debido a que se obtuvieron diferencias significativas en las repeticiones arrojadas por
el análisis estadístico de la prueba de toxicología y la evaluación morfológica es
recomendable establecer cruces de parentales de la misma cepa para reducir la
variabilidad de la población.
62
Con la finalidad de obtener mayor información sobre el mecanismo de acción de los
compuestos tipo kaurano. Es indispensable realizar pruebas de efecto morfológico y de
frecuencia cardiaca, utilizando el kaurano purificado y así poder comparar los efectos
obtenidos por el extracto total de Ageratina vacciniifolia y los efectos del kaurano puro.
63
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69
ANEXO 1
70
ANEXO 2
71
ANEXO 3
FORMULAS
DESCRIPCIÓN FORMULA Calculo
Porcentaje de
rendimiento
𝑔 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜
100 𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑓𝑟𝑒𝑠𝑐𝑜
36,6𝑔
148𝑔= 0,247
DMSO 1%
𝑉𝑜𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
𝑉𝑜𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑖𝑐𝑖 * 100
50 𝑚𝑙
100= 0.5 𝑚𝐿 ∗
1000 𝜇𝐿
1𝑚𝐿 = 500 𝜇𝐿
Stock de sales
𝐺𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 * 100
40 g sal marina
1L agua destilada∗ 100
= 4%
Agua de huevo 𝑉𝑜𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
𝑉𝑜𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑖𝑐𝑖 * 100 + 20 µL azul de
metileno
1.5 𝑚𝐿 𝑠𝑡𝑜𝑐𝑘 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑙𝑒𝑠
1 𝐿 𝐴𝑔𝑢𝑎 𝑑𝑒𝑠𝑡𝑖𝑙𝑎𝑑𝑎 ∗
100 =0,15 %
PREPARACIÓN SOLUCÓN TRICAÍNA
Preparación de solución de solución de la Buffer 1M Tris –HCl
1. El buffer de Tris-HCl se presenta en forma de polvo de panreac (cat. # A3452), para la
preparación de una concentración 1M se agregan 15.14g de Tris-HCl en 100ml de agua
DD.
2. Se ajusta el pH ≅ 7 con un apropiado volumen de NaOH concentrado.
3. La solución se somete a autoclave y se almacena a temperatura ambiente.
Preparación de la solución stock de tricaína MS-222:
La preparación de esta solución se basó en lo descrito en la sesión de protocolos del libro
del pez cebra 4ª edición en línea [19].
1. La tricaína metasulfonato MS-222 o 3-amino benzoico acidethylester se presenta en
forma de polvo de sigma (cat. # A-5040) Para la preparación de una concentración de
4mg/ml se agregan 400 mg de tricaína en 97,9 ml de Agua DD y 2.1 ml de Tris-HCl
1M.
2. Esta solución debe almacenarse en el congelador a -20°C, se distribuyen en tubos
Eppendorf en alícuotas de 1ml para optimizar el uso de solución fresca ya que se la luz
y factores ambientales pueden descomponerla rápidamente.
72
ANEXO 4
RESULTADOS DE LA MARCHA FITOQUIMICA COLORACIONES
Grupo de metabolitos secundarios Prueba química Imagen
Flavonoides
Shinoda
Rosenheim
Leucoantocianidinas
Taninos Cloruro Férrico
Acetato de Plomo +
Gelatina – Sal
Quinonas
Naftoquinonas-Antraquinonas
Borntrager-Krauss
Cumarinas Hidroxamato férrico
Saponinas Rosenthaler
73
Terpenos – Esteroides Liebermann - Burchard
Alcaloides Dragendorff
Mayer
Esteroides Valser
Cardiotónicos
Baljet
Tollens
Antrona
74
ANEXO 5
REPETICIONES, REPLICAS Y CANTIDAD DE VIVOS Y MUERTOS POR
CADA CONCENTRACIÓN
concentración Repetición Replicación Vivos Muertos LC50 Total
0 1 1 6 0 0 6
0 2 1 6 0 0 6
1 1 1 6 0 0 6
1 1 2 6 0 0 6
1 1 3 6 0 0 6
1 2 1 6 0 0 6
1 2 2 6 0 0 6
1 2 3 6 0 0 6
2 1 1 6 0 0 6
2 1 2 6 0 0 6
2 1 3 4 2 0,33333333 6
2,5 1 1 6 0 0 6
2,5 1 2 6 0 0 6
2,5 1 3 6 0 0 6
3 1 1 2 4 0,66666667 6
3 1 2 3 3 0,5 6
3 1 3 4 2 0,33333333 6
3 2 1 3 3 0,5 6
3 2 2 0 6 1 6
3 2 3 1 5 0,83333333 6
3 3 1 5 1 0,16666667 6
3 3 2 5 1 0,16666667 6
3 3 3 6 0 0 6
3,4 1 1 3 3 0,5 6
3,4 1 2 3 3 0,5 6
3,4 1 3 4 2 0,33333333 6
3,5 1 1 1 5 0,83333333 6
3,5 1 2 2 4 0,66666667 6
3,5 1 3 4 2 0,33333333 6
3,8 1 1 2 4 0,66666667 6
3,8 1 2 2 4 0,66666667 6
3,8 1 3 3 3 0,5 6
4 1 1 2 4 0,66666667 6
4 1 2 0 6 1 6
4 1 3 1 5 0,83333333 6
4 2 1 2 4 0,66666667 6
75
concentración Repetición Replicación Vivos Muertos LC50 Total
4 2 2 1 5 0,83333333 6
4 2 3 3 3 0,5 6
4 3 1 2 4 0,66666667 6
4 3 2 1 5 0,83333333 6
4 3 3 0 6 1 6
4,2 1 1 2 4 0,66666667 6
4,2 1 2 0 6 1 6
4,2 1 3 1 5 0,83333333 6
4,2 2 1 0 6 1 6
4,2 2 2 0 6 1 6
4,2 2 3 0 6 1 6
4,4 1 1 2 4 0,66666667 6
4,4 1 2 0 6 1 6
4,4 1 3 0 6 1 6
4,5 1 1 1 5 0,83333333 6
4,5 1 2 0 6 1 6
4,5 1 3 0 6 1 6
4,6 1 1 2 4 0,66666667 6
4,6 1 2 1 5 0,83333333 6
4,6 1 3 0 6 1 6
4,6 2 1 0 6 1 6
4,6 2 2 0 6 1 6
4,6 2 3 0 6 1 6
4,8 1 1 3 3 0,5 6
4,8 1 2 0 6 1 6
4,8 1 3 1 5 0,83333333 6
5 1 1 1 5 0,83333333 6
5 1 2 0 6 1 6
5 1 3 0 6 1 6
5 2 1 2 4 0,66666667 6
5 2 2 2 4 0,66666667 6
5 2 3 3 3 0,5 6
5 3 1 0 6 1 6
5 3 2 1 5 0,83333333 6
5 3 3 0 6 1 6
5 4 1 0 6 1 6
5 4 2 0 6 1 6
5 4 3 0 6 1 6
5 5 1 0 6 1 6
5 5 2 0 6 1 6
76
concentración Repetición Replicación Vivos Muertos LC50 Total
5 5 3 0 6 1 6
6 1 1 0 6 1 6
6 1 2 0 6 1 6
6 1 3 0 6 1 6
8 1 1 0 6 1 6
8 1 2 0 6 1 6
8 1 3 0 6 1 6
8 2 1 0 6 1 6
8 2 2 0 6 1 6
8 2 3 0 6 1 6
8 3 1 0 6 1 6
8 3 2 0 6 1 6
8 3 3 0 6 1 6
10 1 1 0 6 1 6
10 1 2 0 6 1 6
10 1 3 0 6 1 6
10 2 1 0 6 1 6
10 2 2 0 6 1 6
10 2 3 0 6 1 6
10 3 1 0 6 1 6
10 3 2 0 6 1 6
10 3 3 0 6 1 6
12 1 1 0 6 1 6
12 1 2 0 6 1 6
12 1 3 0 6 1 6
20 1 1 0 6 1 6
20 1 2 0 6 1 6
20 1 3 0 6 1 6
50 1 1 0 6 1 6
50 1 2 0 6 1 6
50 1 3 0 6 1 6
77
ANEXO 6
Análisis de varianza para longitud total (mm)
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
COVARIABLES
repetición 0,0220575 1 0,0220575 2,05 0,1541
Replicación 0,0128052 1 0,0128052 1,19 0,2770
EFECTOS PRINCIPALES
A:Concentración 0,0515366 5 0,0103073 0,96 0,4458
B:Tiempo 25,8472 3 8,61573 799,44 0,0000
INTERACCIONES
AB 0,163847 15 0,0109231 1,01 0,4426
RESIDUOS 2,13389 198 0,0107772
TOTAL (CORREGIDO) 34,9489 223
Valor-P = 0.05
Pruebas de múltiples rangos para longitud total (mm)
Concentración Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
2,5 16 3,24721 0,0263162 X
2 32 3,26632 0,0183727 X
1,5 24 3,27415 0,0212965 X
0,5 32 3,28734 0,0184902 X
0 72 3,29562 0,0125797 X
1 48 3,29818 0,0159593 X
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites
0 - 0,5 0,00827808 0,0444912
0 - 1 -0,00256391 0,0413308
0 - 1,5 0,0214713 0,0485135
0 - 2 0,0293008 0,0441237
0 - 2,5 0,0484098 0,0568626
0,5 - 1 -0,010842 0,0480437
0,5 - 1,5 0,0131932 0,0555267
0,5 - 2 0,0210227 0,0512707
0,5 - 2,5 0,0401317 0,0634414
1 - 1,5 0,0240352 0,0532702
1 - 2 0,0318647 0,047767
1 - 2,5 0,0509737 0,0622005
1,5 - 2 0,00782949 0,0554937
1,5 - 2,5 0,0269385 0,0662453
2 - 2,5 0,019109 0,063408
Análisis de varianza para tamaño ocular
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
COVARIABLES
Repetición 0,000361277 1 0,000361277 19,22 0,0000
Replicación 0,0000136618 1 0,0000136618 0,73 0,3949
EFECTOS PRINCIPALES
A:Concentración mg/L 0,00168758 5 0,000337516 17,96 0,0000
B:Tiempo (dpi) 0,0160536 3 0,00535119 284,70 0,0000
INTERACCIONES
78
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
COVARIABLES
AB 0,000414279 15 0,0000276186 1,47 0,1195
RESIDUOS 0,00372154 198 0,0000187956
TOTAL (CORREGIDO) 0,0277571 223
Pruebas de múltiples rangos para tamaño ocular
Concentración mg/L Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
2,5 16 0,0454521 0,001099 X
2 32 0,0470592 0,00076727 X
1,5 24 0,0495961 0,000889373 X
1 48 0,0520963 0,000666484 X
0,5 32 0,0522582 0,000772177 X
0 72 0,053815 0,000525347 X
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites
0 - 0,5 0,00155683 0,00185801
0 - 1 0,00171874 0,00172603
0 - 1,5 * 0,00421891 0,00202599
0 - 2 * 0,00675577 0,00184267
0 - 2,5 * 0,00836294 0,00237466
0,5 - 1 0,000161909 0,00200637
0,5 - 1,5 * 0,00266208 0,00231887
0,5 - 2 * 0,00519894 0,00214113
0,5 - 2,5 * 0,00680611 0,0026494
1 - 1,5 * 0,00250017 0,00222464
1 - 2 * 0,00503704 0,00199482
1 - 2,5 * 0,0066442 0,00259758
1,5 - 2 * 0,00253687 0,00231749
1,5 - 2,5 * 0,00414403 0,0027665
2 - 2,5 0,00160717 0,002648
Análisis de Varianza para longitud de vitelo
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
COVARIABLES
Repetición 0,0803411 1 0,0803411 128,30 0,0000
Replicación 0,0000561952 1 0,0000561952 0,09 0,7648
EFECTOS PRINCIPALES
A:Concentración mg/L 0,00335879 5 0,000671759 1,07 0,3767
B:Tiempo (hpi) 0,746685 3 0,248895 397,48 0,0000
INTERACCIONES
AB 0,00927537 15 0,000618358 0,99 0,4698
RESIDUOS 0,123985 198 0,000626185
TOTAL (CORREGIDO) 1,13367 223
Prueba de múltiples rangos para longitud de vitelo
Concentración mg/L Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
0,5 32 0,192487 0,00445697 X
0 72 0,19353 0,00303228 X
1,5 24 0,196431 0,00513342 X
2,5 16 0,198294 0,00634338 X
2 32 0,200374 0,00442865 X
1 48 0,203129 0,00384692 X
79
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites
0 - 0,5 0,00104318 0,0107244
0 - 1 -0,00959929 0,00996258
0 - 1,5 -0,0029012 0,0116939
0 - 2 -0,00684431 0,0106358
0 - 2,5 -0,00476433 0,0137064
0,5 - 1 -0,0106425 0,0115807
0,5 - 1,5 -0,00394437 0,0133844
0,5 - 2 -0,00788749 0,0123585
0,5 - 2,5 -0,0058075 0,0152922
1 - 1,5 0,00669809 0,0128405
1 - 2 0,00275498 0,011514
1 - 2,5 0,00483496 0,0149931
1,5 - 2 -0,00394312 0,0133765
1,5 - 2,5 -0,00186313 0,0159681
2 - 2,5 0,00207998 0,0152842
80
ANEXO 7
Análisis de Varianza para Regenerado - Suma de Cuadrados Tipo III
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
COVARIABLES
Repetición 0,000151443 1 0,000151443 9,53 0,0028
Replicación 0,0000070922 1 0,0000070922 0,45 0,5061
EFECTOS PRINCIPALES
A:Concentración 0,000287363 4 0,0000718407 4,52 0,0024
B:Tiempo 0,0132644 2 0,0066322 417,19 0,0000
INTERACCIONES
AB 0,00022167 8 0,0000277088 1,74 0,1014
RESIDUOS 0,00125587 79 0,0000158971
TOTAL (CORREGIDO) 0,0166132 95
Pruebas de Múltiple Rangos para Regenerado por Concentración
Método: 95,0 porcentaje LSD
Concentración Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
1 18 0,0143733 0,000946577 X
2,5 18 0,0154408 0,000946577 X
1,5 15 0,0160289 0,00105162 X
0 33 0,0165021 0,00076441 X
2 12 0,0204529 0,00118713 X
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites
0 - 1 0,00212884 0,0024804
0 - 1,5 0,000473176 0,00268702
0 - 2 * -0,00395077 0,00293551
0 - 2,5 0,0010613 0,0024804
1 - 1,5 -0,00165566 0,00278346
1 - 2 * -0,00607961 0,00297954
1 - 2,5 -0,00106754 0,00264539
1,5 - 2 * -0,00442395 0,00308754
1,5 - 2,5 0,000588122 0,00278346
2 - 2,5 * 0,00501207 0,00297954
81
ANEXO 8
Análisis de Varianza para Frecuencia Latidos/minuto - Suma de Cuadrados Tipo III
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
COVARIABLES
Repetición 1763,12 1 1763,12 15,90 0,0001
Replicación 42,0139 1 42,0139 0,38 0,5398
EFECTOS PRINCIPALES
A:Concentración mg/L 2328,26 5 465,652 4,20 0,0018
B:Tiempo (horas) 250,778 2 125,389 1,13 0,3275
INTERACCIONES
AB 1215,41 10 121,541 1,10 0,3743
RESIDUOS 9534,87 86 110,871
TOTAL (CORREGIDO) 14150,9 105
Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual
Pruebas de Múltiple Rangos para Frecuencia Latidos/minuto por Concentración mg/L
Método: 95,0 porcentaje LSD
Concentración mg/L Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
2,5 18 112,378 2,48763 X
2 18 113,767 2,48763 XX
1 18 114,323 2,48763 XX
1,5 16 115,502 2,66139 XX
0,5 18 119,878 2,48763 XX
0 18 126,865 2,6593 X
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites
0 - 0,5 6,9863 7,327
0 - 1 * 12,5419 7,327
0 - 1,5 * 11,3623 7,63893
0 - 2 * 13,0974 7,327
0 - 2,5 * 14,4863 7,327
0,5 - 1 5,55556 6,97734
0,5 - 1,5 4,37595 7,21233
0,5 - 2 6,11111 6,97734
0,5 - 2,5 * 7,5 6,97734
1 - 1,5 -1,1796 7,21233
1 - 2 0,555556 6,97734
1 - 2,5 1,94444 6,97734
1,5 - 2 1,73516 7,21233
1,5 - 2,5 3,12405 7,21233
2 - 2,5 1,38889 6,97734
