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18CIMEL 2012, Volumen 17, Número 1

EFECTO DE GENTIANELLA ALBOROSEA EN ESTEATOSIS HEPÁTICA NO ALCOHÓLICA INDUCIDA POR DIETA HIPERLIPÍDICA EN RATAS HOLTZMAN HEMBRAS

Ugaz-Soto, L.1,2; Zafra-Tanaka, JH.1,2; Tapia Vicente, María E.1

1 Estudiante de Medicina Humana – Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos; Lima, Perú2 Sociedad Científica San Fernando. Facultad de Medicina. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.

CIMEL 2012; (17)1:18-23

RESUMENObjetivo: Determinar el efecto del extracto de Gentianella alborosea como tratamiento contra esteatosis hepática no alcohólica (EHNA) inducida por dieta hiperlipídica en ratas Holtzman hembras. Métodos: Diseño: Estudio experimental incompleto. Lugar: Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú. Participantes: Ratas Holtzman hembras. Intervenciones: Se utilizó 32 ratas repartidas en 4 grupos (n=8) distribuidos aleatoria-mente: grupo control negativo, control positivo con dieta hiperlipídica, dosis 1 (35 mg/kg) y dosis 2 (70 mg/kg). Se indujo EHNA con dieta hiper-lipídica (Carbohidratos: 26%, Lípidos: 59% y Proteínas: 15% Calorías) durante un período de 21 días, ad libitum. Luego, se administró el extracto acuoso de Gentianella alborosea por 4 días. Finalmente, se extrajeron los hígados para evaluar las alteraciones histopatológicas del parénquima hepático. Principales medidas de resultados: Se realizó el conteo microscópico de hepatocitos afectados con macrovacuolas, y los resultados fueron comparados mediante las pruebas de ANOVA (p<0,05) y HSD de Tukey (p<0,05). Resultados: Se encontró diferencias significativas (p<0.05) en el porcentaje de hepatocitos afectados entre los grupos dosis 1 (3.25 ± 2.27) y el control positivo (7.50 ± 3.76). Además, no se encontró diferencia significativa entre los grupos dosis 1 y dosis 2. Conclusiones: No se pudo determinar el efecto de Gentianella alborosea sobre la esteatosis hepática no alcohólica inducida por dieta hiperlipídica en ratas Holtzman hembra, por lo que se recomiendan estudios posteriores.Palabras Clave: Hígado graso, Gentianella.

EFFECT OF GENTIANELLA ALBOROSEA ON NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE INDUCED WITH HIGH-FAT DIET IN FEMALE HOLTZMAN RATS

ABSTRACTObjective: To determine the effect of the extract of Gentianella alborosea as a treatment for non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) induced by high-fat diet in female Holtzman rats. Methods: Design: An incomplete experimental study was developed. Location: National University of San Marcos, Lima, Peru. Participants: Female Holtzman rats. Interventions: 32 rats were divided into 4 groups: control -, control +, dose 1 (35mg/kg) and dose 2 (70mg/kg. NAFLD was induced by high-fat diet (carbohydrates: 26%, lipids: 59% and protein: 15% calories) for a period of 21 days, ad libitum. Then aqueous extract of Gentianella alborosea was administered for 4 days. Finally, the livers were removed to evaluate the histopatho-logical alterations of liver parenchyma.Main outcome measures: We performed microscopic counting of hepatocytes affected by single large lipid droplets, and the results were compared using ANOVA (p <0.05) and Tukey’s HSD (p <0.05).Results: We found significant differences (p <0.05) in the percentage of hepatocytes affected between dose 1 (3.25 ± 2.27) and positive control groups (7.50 ± 3.76). Furthermore, no significant difference was found between dose 1 and dose 2 groups. Conclusion: We did not found any effect of the extract of Gentianella alborosea as a treatment for NAFLD. We strongly recommend further studies.Keywords: Fatty Liver, Gentianella, High-fat diet.

INTRODUCCIÓN

La enfermedad del hígado graso no alcohólico es el tras-torno hepático más común en países desarrollados, lle-gando a afectar del 20 al 40% de la población en general1, aumentando la prevalencia entre un 57,5 a 74 % en perso-nas obesas. En la población de niños normales , la preva-lencia se encuentra alrededor del 2,6 % y siendo de 22,5 a 52,8 % en niños obesos.2

Entre los factores de riesgo que se asocian con mayor fre-cuencia a EHNA se encuentran la obesidad, la diabetes mellitus tipo 2 y la dislipidemia.3 La EHNA presenta una

amplia variedad de trastornos histológicos y clínicos, los cuales comprenden desde la esteatosis hepática no alco-hólica y la esteatohepatitis no alcohólica hasta fibrosis se-vera del tejido hepático y cirrosis hepática.2,4

A nivel latinoamericano no se han registrado estudios so-bre la prevalencia de EHNA, a pesar de que se conoce que la dieta es altamente rica en hidratos de carbono y grasas saturadas, lo que conllevaría al desarrollo de obesidad y alteraciones en el metabolismo lipídico hepático.5,6

A pesar de su importancia clínica, no existe terapia efec-tiva demostrada contra EHNA, sin embargo es recomen-

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dado el control de factores de riesgo. Actualmente, la me-dicina tradicional está adquiriendo mayor importancia como alternativa terapéutica, es por ello que se evaluó el “hercampuri” (Gentianella alborosea), planta de la medici-na folclórica peruana. El hercampuri es una planta cono-cida por su acción detoxificante del hígado y como ayuda terapéutica en la pérdida de peso, siendo considerada una planta hepatoprotectora.7-9 La familia Gentianaceae es la tercera familia más utilizada para tratar males hepáticos y de vesícula biliar por curanderos del Norte del Perú.10 En un estudio realizado en tres centros asistenciales de Lima, se halló que el 42% de personas consideran que conocen algún tratamiento con hierbas medicinales para la enfer-medad hepática, de estos el 19% utilizarían hercampuri para tal fin.11

El hercampuri es una planta que contiene una serie de principios activos, dentro de los cuales se puede destacar la acción de las sustancias amargas, que estimulan la se-creción de bilis y reduce los niveles de colesterol en sangre, por ello se considera energizante a nivel hepático debido a que ayuda a balancear el metabolismo.8,12 Además se ha identificado su propiedad como antioxidante.13

El objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto del extracto acuoso de Gentianella alborosea en EHNA inducida por dieta hiperlipídica en ratas Holtzman hem-bras.

MATERIALES Y METODOS

Se desarrolló un estudio experimental incompleto con 32 ratas Holtzman hembras con peso de 200 g. adquiridas en el Instituto Nacional de Salud. Para obtener el extracto acuoso de Gentianella alborosea se secó la muestra con estufa a 45ºC, luego fue colocada a baño maría cerrada a 80ºC en un litro de agua pura durante tres horas, se procedió a filtrar con algodón y después con papel filtro whatman 3 para cumplir con estándares farmacopea eu-ropea de partículas extrañas 6.0 (2,3,5) Posteriormente se concentró en rotavapor a 500 mL y se procedió a agregar 500 mL alcohol etílico 70% para observar decantación de azúcares y algunos polisacáridos. Finalmente se filtró con papel filtro Whatman 45 y se extrajo el alcohol con rotava-por hasta obtener una muestra de 500 mL que fue diluida hasta 750 mL con agua destilada.

La composición de la dieta hiperlipídica fue adaptada del trabajo de Gauthier en el que se determinó que luego de

dos semanas de inducción se lograba una concentración de lípidos en el hígado del 200%, además no se hallaron di-ferencias entre la segunda y sexta semana.14 La adaptación a ingredientes de fácil acceso se realizó con colaboración del departamento de Bioquímica de la Facultad de Me-dicina de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (tabla 1). Los ácidos grasos de la dieta se administraron en la siguiente proporción: 37% de grasas saturadas, 47% de grasas monosaturadas y 16% de grasas poliinsaturadas. La inducción con esta dieta se llevó a cabo durante 21 días.

Luego de cinco días de aclimatación se determinó el peso corporal y se conformaron de manera aleatoria cuatro grupos: control negativo, control positivo, dosis 1 y dosis 2, cada grupo se encontraba conformado por ocho ratas. El grupo control negativo no recibió ni inducción ni trata-miento, el grupo control positivo sólo recibió dieta hiper-lipídica14,15 (tabla 1), y los grupos dosis 1 y dosis 2 recibie-ron dieta hiperlipídica durante 21 días. Posteriormente se retiro la dieta hiperlipídica y se administró ratina ad libi-tum a todas las ratas. El extracto se administró en concen-traciones de 35 y 70 mg/kg por canulación durante cuatro días a los grupos dosis 1 y dosis 2, respectivamente.16

Finalizado el período de inducción y tratamiento, se pro-cedió a evaluar la inducción de esteatosis hepática y el efecto terapéutico del extracto en razón a los criterios clí-nicos, anatomopatológicos e histopatológicos.

Estadística: El criterio clínico evaluado fue peso de la rata en gramos. Dentro de los criterios anatomopatológicos fueron analizados el color, la consistencia, el aspecto y el peso del hígado en gramos. El criterio histopatológico utilizado fue el porcentaje de hepatocitos con macrova-cuolas que se obtuvo a partir del análisis con el programa J-microvision de las láminas histológicas preparadas con la coloración hematoxilina-eosina.17,18

Los datos fueron procesados utilizando el programa SPSS versión 19.0. Se realizó el análisis del porcentaje de hepa-tocitos con macrovacuolas por grupos mediante la prueba de ANOVA y post hoc para variables independientes, con un p <0,05 de significancia estadística.

RESULTADOS

Se analizaron los datos de 30 ratas Holtzman hembra con un peso de 192 ±15,6 g. Los resultados clínicos y anato-mopatológicos se encuentran resumidos en la Tabla 2. No

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se encontró diferencia significativa entre los grupos res-pecto a peso del hígado e índice de peso del hígado/peso de rata.

Las medias del porcentaje de macrovacuolas de los grupos control negativo, control positivo, dosis 1 y dosis 2 fueron 4,26 ± 1,73; 7,46 ± 3,77; 3,04 ± 2,37 y 4,47 ± 2,04; respecti-vamente (gráfico 1). Se utilizó la prueba de Kolmogorov – Smirnov que determinó que los datos seguían una distri-bución normal (p = 0,748) por lo que se realizó la prueba de ANOVA y se determinó que existían diferencias entre grupos (p = 0,020).

Mediante la prueba post hoc de Tukey, se halló diferencias estadísticamente significativas entre los grupos control positivo y dosis 1 (p=0,013). Sin embargo, no se encon-tró diferencias entre los grupos control negativo y control positivo (p=0,100) ni entre los grupos dosis 1 y dosis 2 (p=0,708).

DISCUSIÓN

La evaluación del compromiso hepático se realizó con una escala histológica validada,17 razón por la cual no se utilizaron pruebas como AST o ALT. Por ello se optó, de forma similar a otros estudios, por formar un grupo con-trol negativo y otro control positivo de manera tal que se puede comparar el efecto de la dieta, ya que no era posible el realizar una medición basal.16,19,20 Aun así es recomen-

dable realizar la medición de enzimas como ALT y AST ya que pueden brindar información adicional y pueden ser utilizadas como medición basal.

Dentro de las técnicas utilizadas para el estudio histológi-co de esteatosis se encuentran el uso de la tinción Sudan III, para la observación de lípidos, lo que facilita la identi-ficación de micro y macrovacuolas lipídicas en compara-ción con la H-E. Mediante esta técnica se ha podido de-mostrar la acción de agentes hepatoproctectores como la Silybina, la cual previene la progresión a esteatohepatitis con efectos superiores a la rosiglitazona.20

El análisis estadístico no determinó diferencia significa-tiva entre los grupos control negativo y control positivo. El modelo de experimental de dieta hiperlipídica por 21 días ha demostrado la ventaja de presentar cambios meta-bólicos que simulan lo que sucede en el hombre como la resistencia a insulina. Empero, posee como limitación la presentación de una respuesta variable del grado de estea-tosis, fibrosis e inflamación. Además varía de acuerdo a la cepa del animal de experimentación, así, las ratas Sprague Dawley muestran mayor predisposición. Ello podría ha-ber influenciado en los hallazgos histológicos, los cuales se encontraron presentes al momento del análisis histopa-tológico sin llegar a ser significativos. Se recomienda es-tudios con un número mayor de animales y con una cepa más susceptible.21

Tabla 1. Composición de la dieta hiperlipídica

Porcentaje de calorías Peso en g para 100 gCarbohidratos (Maizena) 26% 36 g.Lípidos (aceite de girasol) 59% 34 g.Proteínas (Proteina de soya) 15% 20 g.Fibra (salvado de trigo) 5 g.Vitaminas y minerales (Vitathon) 2 cápsulas

Tabla 2. Características clínicas y anatomopatológicas de acuerdo a los grupos

Peso de rata (mg)

µ± s

Peso del hígado (mg)

µ± s

Índice peso hígado/peso rata

µ± sControl negativo 202,13 ± 14,21 7,38 ± 1,06 0,0366 ± 0,0055Control positivo 202,00 ± 6,80 8,00 ± 0,53 0,0396 ± 0,0024Dosis 1 179,25 ± 9,94 7,00 ± 0,53 0,0391 ± 0,0029Dosis 2 183,25 ± 15,03 7,25 ± 1,39 0,0394 ± 0,0054

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Gráfico 1. Porcentaje de macrovacuolas por grupo

Gráfico 2. Histopatología

(A) Control negativo: Se observa la poca presencia de macrovacuolas , así como algunas venas centrolobulillares congestivas. (B) Control positivo: Se evidencia la presencia de múltiples macro vacuaolas en el corte histológico. (C) Dosis 1: Se observan algunas macro vacuolas , así como numerosos hepatocitos no afectados. (D) Dosis 2: Se aprecia una menor cantidad de hepatocitos afecta-dos con macrovacuales. Fotografías al aumento de 400X.

A B

C D

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Si bien la dieta se adaptó y preparó basada en otros estu-dios, no fue adquirida de fábrica,6,14,21 esto podría haber hecho que no se logre el grado de esteatosis esperado, ya que la procedencia del lípido es capaz de alterar los hallaz-gos histológicos.

Se ha reportado que la Gentianella alborosea a dosis de 35mg/kg disminuye la necroinflamación hepática, pero no regenera el tejido hepático en un modelo de esteato-sis hepática no alcohólica inducida con tetracloruro de carbono. Los efectos producidos con esta metodología de inducción es distinta a la inducida con dieta hiperlipídica, a pesar de ello, los componentes antioxidantes pueden ju-gar un rol importante.16 Se recomienda realizar estudios posteriores donde se analice el efecto producido por la in-tervención durante un tiempo más prolongado.

Se han realizado diversos estudios para evaluar posibles tratamientos farmacológicos para la esteatosis hepática no alcohólica entre los cuales se pueden rescatar la pioglita-zona y el ezetimibe, el cual atenúa las manifestaciones his-tológicas y bioquímicas. La pioglitazona actúa como un sensibilizador a la insulina y tiene efecto disminuyendo los niveles de insulina y atenuando así la esteatosis hepáti-ca. Por su parte el ezetimibe ha demostrado disminución de esteatosis y fibrósis hepática mediante su rol de inhi-bidor de proteínas transmembrana que se encargan de la absorción a nivel intestinal de colesterol19,22 El hercampuri disminuye la absorción a nivel intestinal de grasas debido a que contiene inhibidores de lipasa.23 Estos compuestos no han sido motivo de nuestro estudio debido a que para extraerlos se necesita una solución lipofílica.

Otros principios activos del Hercampuri y su mecanismo de acción en la esteatosis hepática no han sido estudiados a profundidad. Sin embargo comparte su actividad como antioxidante con el jugo de zahanoria morada, el té verde y la proteína de soya. Estos compuestos no pudieron ser evaluados en el análisis cualitativo realizado al extracto que utilizamos.

Son pocos los estudios existentes sobre tratamiento complementario con otras plantas en esteatosis hepática. Se demostró que la proteína de soya mejora la función hepática en ratas con EHNA inducida por dieta hiper-lipídica, disminuyendo los niveles de lípidos en sangre e hígado, aumentando la capacidad antioxidante y mejo-rando la resistencia a la insulina.24 Liu et al. también en-contró propiedades antilipogénicas en las raíces del loto

en ratones db/db.25 Estudios con el té verde han demos-trado que este ejerce un efecto a diversos niveles a través de sus catequinas. Así actúa a nivel intestinal disminu-yendo la absorción de lípidos y glucosa, en adición es un antioxidante y posee actividad antiinflamatoria. Además aumenta la sensibilidad a la insulina reduciendo la sínte-sis de lípidos.26 Además existen estudios sobre el jugo de zanahoria morada que posee un efecto antiinflamatorio en el hígado graso inducido por dieta hiperlipídica. Los compuestos a los que se atribuye la acción son los carote-noides,27 entre ellos las antocianinas que actuarían como antioxidantes.

En nuestro estudio no se pudo determinar el efecto de Gentianella alborosea sobre la esteatosis hepática no alco-hólica inducida por dieta hiperlipídica en ratas Holtzman hembra. Ante el uso frecuente de plantas medicinales, entre ellas el Hercampuri, para tratar males hepáticos se recomiendan estudios posteriores en los cuales se pueda determinar el efecto que estos poseen y los compuesto in-volucrados.

Correspondencia:Ugaz Soto, Leonardo MCalle Presbítero Garcia Villón cdra.6 s/n Torre L Dpto. 1507 Cercado de Lima, PerúCorreo-e: leous89@hotmail.com

Recibido: 20-07-2012Aprobado: 29-12-2012

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