EFECTE DEL TRACTAMENT AMB DIFENILHIDANTOÏNA · Iolanda i el Dr. Villaverde que em van introduir...

Departament de Bioquímica i Biologia Molecular

Efecte del tractament amb difenilhidantoïna sobre el perfil lipoproteic i la susceptibilitat a l’arteriosclerosi en models murídics

M Carme Trocho Muñoz 2003

Departament de Bioquímica i Biologia Molecular

Efecte del tractament amb difenilhidantoïna sobre el perfil lipoproteic i la susceptibilitat a l’arteriosclerosi en models murídics

Memòria per optar al grau de Doctora en Ciències Biològiques

Programa de Doctorat de Bioquímica i Biologia Molecular, bienni 1995-97

Presentada per Na

M Carme Trocho Muñoz

Vist-i-plau dels Directors de Tesi:

La interessada,

M Carme Trocho Muñoz

Barcelona, abril de 2004

Dr. Francisco Blanco Vaca

Servei de Bioquímica i

Institut de Recerca

Hospital de la Santa Creu i Sant Pau

Dr. Joan Carles Escolà i Gil

Institut de Recerca

Hospital de la Santa Creu i Sant Pau

Agraïments

Una tesi doctoral, tal com jo la he viscuda, és més que la memòria d’un

treball científic. És conviure i treballar amb persones que durant uns anys seran

una segona família. És aprendre tant d’ells/elles com de les separates i els

protocols. I és en els agraïments on puc mostrar un bocí d’aquest microscosmos

que he tingut la sort de formar-ne part.

Vull expressar el meu agraïment, en primer lloc, als meus dos directors de

tesi. Al Dr. Francisco Blanco pel seu entusiasme per la ciència, ajut i comprensió

al llarg de tot aquest període pre-doctoral. Al Dr. Joan Carles Escolà (el primer

“Ramón y Cajal” del grup) per dominar el difícil art de ser mestre i amic alhora,

no tinc paraules per agrair tot l’esforç invertit en aquest treball.

Moltes Gràcies al Dr. Francesc Gonzàlez Sastre, com a cap de Servei de

Bioquímica i al Dr. Jordi Ordoñez, com a tutor, pel suport al nostre grup

d’investigació.

Gràcies també a l’Olga Serentill i al Dr. Queraltó per la col·laboració en la

mesura i assesorament sobre la difenilhidantoïna.

Un moltes gràcies emocionat a totes les grans companyes (i company) de

“Rutina”: Rosa Bonet, Òscar i Agus per l’assessorament en l’ús de

l’autoanalitzador Hitachi 911 i la paciència i bon humor que sempre han

mostrat.

Agraeixo especialment els consells de la Carme, Pepi, Rosa Arcelus i Carles.

Són la veu de l’experiència i de la saviduria. Dóna gust escoltar-les (lo) i són, en

definitiva, grans amigues (amic). No voldria oblidar-me de l’Anna i la Rosa

Roig.

Moltes gràcies als encarregats de l’estabulari (Antonia, Jaime i Antonio) per

fer més fàcil la feixuga tasca de manipular els animals amb la seva bona

predisposició.

Un efusiu agraïment als meus companys/es més directes del laboratori. Al

Joan Carles (a part de co-director de tesi) i al Josep (quan hi era) per ser els

meus cicerones en el món de l’arteriosclerosi i els ratolins transgènics. Al Jesús i

al Vicent per fer-me saber que la ciència, la informàtica i el bon humor no estàn

renyits. Sense ells el laboratori no seria el mateix. Als nouvinguts, Carlos, Glòria

i Laura que porten l’empemta de les noves generacions. Als de l’altra costat,

José Luis, Edgar i Sònia, per la seva generositat, bons consells i per aguantar-me

cada dia dient la mateixa frase. Un record afectuós per l’Esther, la Lili i el Paco

perquè també hi èren.

Moltes gràcies a la gent de la Universitat de Barcelona, Jordi, Anna, Cris A,

Cris C, Mar, Rosa…. José Antonio, Xavier Remesar i Marià Alemany. Els inicis

sempre es recorden amb molta ilusió.

Un cordial agraïment pels col·laboradors del CSIC, Núria, Esther, Mati,

Iolanda i el Dr. Villaverde que em van introduir dins el món de l’arteriosclerosi

i la trombosi.

No puc deixar de fer esment als amics incondicionals, aquells que sempre

són allà quan els necessites i que d’una manera o una altra també han patit

aquesta tesi. Gràcies Marga, Edu, Jose, Cris. Gràcies Rosi, Natàlia, Carina,

Carles i Isabel. Gràcies Elisa, Laura, Sílvia i Marjo. Gràcies, Eulàlia, MRosa, Mar

i Mireia.

Finalment, voldria agraïr i dedicar aquesta tesi a la meva família

especialment als meus pares, ara ja avis, al meu marit Santi i a la meva filla Alba

perquè són el suport moral, anímic i logístic que fan que les ilusions es puguin

convertir en realitat.

Dedicat al Santi i l’Alba, els meus dos “Soletes”

Aquesta tesi forma part d’un projecte que ha estat possible, en part, gràcies al

finançament de:

• Projecte SAF98-0097 del Ministeri de Ciència i Tecnologia.

• Xarxa de centres del Fons d’Investigacions Sanitàries (C03-08) sobre

Metabolisme i Nutrició

Índex

i

ÍNDEX

INTRODUCCIÓ................................................................................................................. 2

1 LIPOPROTEÏNES PLASMÀTIQUES ............................................................................................... 3 1.1 Característiques generals de les lipoproteïnes ........................................................................ 3 1.2 Metabolisme de les lipoproteïnes............................................................................................. 5

1.2.1 Quilomicrons ..................................................................................................................................... 5 1.2.2 VLDL ................................................................................................................................................ 6 1.2.3 IDL .................................................................................................................................................... 7 1.2.4 LDL ................................................................................................................................................... 7 1.2.5 Lipoproteïna (a) ................................................................................................................................. 8 1.2.6 HDL................................................................................................................................................... 9

1.3 Apolipoproteïnes .................................................................................................................... 12 1.3.1 Apolipoproteïna A-I......................................................................................................................... 13 1.3.2 Apolipoproteïna A-II ....................................................................................................................... 14 1.3.3 Apolipoproteïna A-IV...................................................................................................................... 15 1.3.4 Apolipoproteïna B-100 .................................................................................................................... 16 1.3.5 Apolipoproteïna B-48 ...................................................................................................................... 17 1.3.6 Apolipoproteïnes C.......................................................................................................................... 17 1.3.7 Apolipoproteïna D ........................................................................................................................... 18 1.3.8 Apolipoproteïna E............................................................................................................................ 18 1.3.9 Apolipoproteïna J............................................................................................................................. 19 1.3.10 Apolipoproteïna (a).......................................................................................................................... 20

1.4 Enzims reguladors del metabolisme lipoproteic .................................................................... 21 1.4.1 Lipoproteïna lipasa (LPL)................................................................................................................ 21 1.4.2 Lipasa hepàtica (LH) ....................................................................................................................... 22 1.4.3 Lecitina:colesterol acil transferasa (LCAT)..................................................................................... 22 1.4.4 Proteïna transferidora d’èsters de colesterol (PTEC) ....................................................................... 23 1.4.5 Proteïna transferidora de lípids 2 (PTL-2) ....................................................................................... 25 1.4.6 Paraoxonasa ..................................................................................................................................... 25

1.5 Receptors del metabolisme lipoproteic .................................................................................. 26 1.5.1 Receptor d’LDL............................................................................................................................... 26 1.5.2 Proteïna relacionada amb el receptor d´LDL (LRP) ........................................................................ 27 1.5.3 Receptor d’VLDL............................................................................................................................ 27 1.5.4 Receptors Scavenger........................................................................................................................ 28 1.5.5 Receptors d´HDL............................................................................................................................. 28 1.5.6 ATP-Binding Cassette transporter A1 (ABC-A1)............................................................................ 29

2 ARTERIOSCLEROSI....................................................................................................................... 30 2.1 Desenvolupament de la lesió arterioscleròtica ...................................................................... 31

3 MODELS MURÍDICS D’HIPERLIPÈMIA I ARTERIOSCLEROSI .............................................. 33 4 TRETS DIFERENCIALS DEL METABOLISME LIPOPROTEIC I EL DESENVOLUPAMENT

D’ARTERIOSCLEROSI EN RATOLINS........................................................................................ 36

Índex

ii

5 FENITOÏNA (PHT) ...........................................................................................................................38 5.1 Estructura i biotransformació ................................................................................................38 5.2 Efectes farmacològics.............................................................................................................40 5.3 Toxicologia .............................................................................................................................41 5.4 Metabolisme de la fenitoïna....................................................................................................41

6 ELS RECEPTORS NUCLEARS I EL METABOLISME LIPÍDIC ..................................................45

HIPÒTESI I OBJECTIUS ..................................................................................50

MATERIALS I MÈTODES ..............................................................................54

1 ANIMALS I GRUPS EXPERIMENTALS........................................................................................55 1.1 Condicions ambientals i d’alimentació ..................................................................................55 1.2 Obtenció i processament de les mostres biològiques..............................................................56

2 TRACTAMENT AMB FENITOÏNA ................................................................................................57 3 DETERMINACIÓ DE DIFERENTS PARÀMETRES BIOQUÍMICS PLASMÀTICS I

TISSULARS ......................................................................................................................................57 4 ANÀLISI I QUANTIFICACIÓ DE L’ÀREA DE LESIÓ ARTERIOSCLERÒTICA ......................59 5 FRACCIONAMENT LIPOPROTEIC PER ULTRACENTRIFUGACIÓ ........................................59 6 MOBILITAT ELECTROFORÈTICA DE L’APOA-I DE RATOLÍ...................................................60 7 CAPACITAT DE LES HDL D’INHIBIR LA MODIFICACIÓ OXIDATIVA DE LES LDL .........61 8 EXPERIMENTS D’EFLUX CEL·LULAR DE COLESTEROL.......................................................61 9 CINÈTICA CATABÒLICA IN VIVO DE LES HDL DE RATOLÍ MARCADES AMB [3H]-

COLESTERIL OLEÏL ÈTER ............................................................................................................62 9.1 Marcatge de les HDL amb [3H]- colesteril oleïl èter .............................................................62 9.2 Cinètica catabòlica in vivo d’HDL de ratolí ..........................................................................64

10 ANÀLISI D’EXPRESSIÓ GÈNICA EN FETGE DE RATOLÍ MITJANÇANT

MICROARRAYS ..............................................................................................................................64 10.1 Extracció d’RNA.....................................................................................................................65 10.2 Preparació i marcatge de l’RNA ............................................................................................65 10.3 Hibridació amb l’Array i escaneig. ........................................................................................65

11 CÀLCULS ESTADÍSTICS I SUPORT INFORMÀTIC .............................................................66

RESULTATS .........................................................................................................................70

1 EFECTE DEL TRACTAMENT AMB FENITOÏNA SOBRE LA SUSCEPTIBILTAT A

L’ARTERIOSCLEROSI....................................................................................................................71 1.1 Models murídics d’arteriosclerosi tipus estria grassa............................................................71

1.1.1 Ratolins C57BL/6 ............................................................................................................................ 71 1.1.2 Ratolins transgènics de la PTEC (Tg PTEC).................................................................................... 75

1.2 Models d’arteriosclerosi avançada ........................................................................................76

Índex

iii

1.2.1 Ratolins knockout d’apoE (apoE-/-) ................................................................................................ 76 1.2.2 Ratolins knockout del receptor d’LDL (rLDL-/-) ............................................................................ 78

2 EFECTE DEL TRACTAMENT AMB FENITOÏNA SOBRE LES CONCENTRACIONS DE

LÍPIDS, GLUCOSA I TRANSAMINASES ..................................................................................... 81 2.1 Models murídics d’arteriosclerosi tipus estria grassa........................................................... 81

2.1.1 Ratolins C57BL/6 ............................................................................................................................ 81 2.1.2 Ratolins transgènics de la PTEC (Tg PTEC) ................................................................................... 87

2.2 Models d’arteriosclerosi avançada........................................................................................ 90 2.2.1 Ratolins knockout d’apoE (apoE-/-) ................................................................................................ 90 2.2.2 Ratolins knockout del receptor d’LDL (rLDL-/-) ............................................................................ 93

3 EFECTE DEL TRACTAMENT AMB FENITOÏNA SOBRE LA COMPOSICIÓ I

METABOLISME DE LES HDL....................................................................................................... 97 3.1 Composició de les HDL ......................................................................................................... 97 3.2 Quantificació de l’apo A-I d’HDL en plasma de ratolí ......................................................... 99 3.3 Protecció de les HDL humanes envers l’oxidació de les LDL............................................. 100 3.4 Eflux de colesterol................................................................................................................ 101 3.5 Catabolisme de les HDL ...................................................................................................... 102

4 PERFILS D’EXPRESSIÓ GÈNICA EN FETGE ........................................................................... 104 4.1 Gens sobreexpressats i reprimits de manera consistent en els ratolins C57BL/6 i rLDL-/-. 104

DISCUSSIÓ........................................................................................................................... 108

1 EFECTE DE LA PHT EN RATOLINS SOBRE LA SUSCEPTIBILITAT A

L´ARTERIOSCLEROSI I EL PERFIL LIPOPROTEIC ................................................................ 109 2 EFECTE DE LA PHT SOBRE LA COMPOSICIÓ DE LES HDL I LA PROTECCIÓ DE LA

MODIFICACIÓ OXIDATIVA DE LES LDL................................................................................ 114 3 EFECTE DE LA PHT SOBRE EL METABOLISME DE LES HDL ............................................ 116 4 MECANISMES POTENCIALS MITJANÇANT ELS QUALS LA PHT POT REDUIR

L’ARTERIOSCLEROSI ................................................................................................................. 119

CONCLUSIONS............................................................................................................. 126

ANNEX........................................................................................................................................ 130

BIBLIOGRAFIA............................................................................................................ 144

Índex

iv

RELACIÓ DE FIGURES Figura 1. Estructura d’una lipoproteïna. ______________________________________ 3

Figura 2. Esquema simplificat del metabolisme lipoproteic en humans. ______________ 6

Figura 3. Evolució de la lesió arterioscleròtica. _______________________________ 30

Figura 4. Estructura i ruta metabòlica de la PHT.______________________________ 39

Figura 5. Àrea mitjana de lesió arterioscleròtica en ratolins de la soca C57BL/6

alimentats amb dieta DRG (mascles i femelles).________________________________ 71

Figura 6. Correlació de les concentracions de PHT amb l’àrea mitjana de lesió

arterioscleròtica i regressió lineal.__________________________________________ 72


alimentats amb dieta tipus Western (femelles)._________________________________ 74




transgènics de la PTEC amb dieta DRG (femelles)._____________________________ 75



Figura 12. Àrea mitjana de lesió arterioscleròtica en ratolins apoE-/- en dieta de

manteniment (femelles i mascles).___________________________________________ 77



Figura 14. Àrea mitjana de lesió arterioscleròtica en ratolins rLDL-/- amb dieta DRG

(femelles i mascles). _____________________________________________________ 79



Figura 16. Fotomicrografies representatives de seccions de l’aorta proximal de ratolins

femella control i tractats amb PHT. _________________________________________ 80

Figura 17. Evolució de la concentració plasmàtica de colesterol total, colesterol d’HDL,

colesterol no HDL , triglicèrids i PHT en ratolins C57BL/6 (mascles i femelles) alimentats

amb dieta DRG durant 12 setmanes. ________________________________________ 83


colesterol no HDL , triglicèrids i PHT en ratolins C57BL/6 femelles alimentats amb dieta

WTD durant 27 setmanes. _________________________________________________ 85

Índex

v


colesterol no HDL , triglicèrids i PHT en ratolins transgènics de la PTEC amb dieta DRG

durant 12 setmanes. ______________________________________________________ 88


colesterol no HDL, triglicèrids i PHT en ratolins apoE-/- (mascles i femelles) en dieta

stàndard durant 12 setmanes._______________________________________________ 91


colesterol no HDL , triglicèrids i PHT en ratolins rLDL-/- (mascles i femelles) en dieta

stàndard durant 9 setmanes.________________________________________________ 94

Figura 22. Composició de les HDL plasmàtiques de ratolins femella tractats amb PHT i

ratolins controls._________________________________________________________ 98

Figura 23. Electroforesi en condicions desnaturalitzants d’apo A-I d’HDL de diferents

grups de ratolins controls (C) i tractats amb PHT (PHT) _________________________ 99

Figura 24. Oxidació de lipoproteïnes in vitro i mobilitat electroforètica relativa. _____ 101

Figura 25. Capacitat d’eflux cel.lular de plasma de ratolins C57BL/6 i rLDL-/- utilitzant

cultius d’hepatòcits Fu5AH._______________________________________________ 102

Figura 26. Corbes d’aclariment de colesteril oleïl èter d’HDL autòlogues marcades de

ratolins de les línies C57BL/6 amb dieta WTD i rLDL-/- amb dieta DRG. ___________ 103

Índex

vi

RELACIÓ DE TAULES Taula 1. Composició de les principals families de lipoproteïnes en humans....................... 4

Taula 2. Caracterització de les apolipoproteïnes en humans ........................................... 13

Taula 3. Paràmetres farmacocinètics de la PHT.............................................................. 40

Taula 5. Concentracions de lípids, glucosa i transaminases en ratolins C57BL/6 (mascles i

femelles) alimentats amb dieta DRG durant 12 setmanes................................................. 81

Taula 6. Correlació entre la concentració de lípids, glucosa o transaminases i l’àrea de

lesió arterioscleròtica en ratolins C57BL/6 (mascles i femelles) alimentats amb dieta DRG

durant 12 setmanes.......................................................................................................... 84

Taula 7. Concentracions de lípids, glucosa o transaminases en ratolins C57BL/6 femelles

alimentats amb dieta WTD durant 27 setmanes. .............................................................. 84

Taula 8. Correlació entre la concentració de lípids, glucosa, transaminases i l’àrea de

lesió arterioscleròtica en ratolins C57BL/6 femelles amb dieta WTD durant 27 setmanes86

Taula 9. Concentracions de lípids, glucosa i transaminases en ratolins transgènics de la

PTEC femelles amb dieta DRG durant 12 setmanes......................................................... 87


lesió arterioscleròtica en ratolins trangènics de la PTEC femelles amb dieta DRG durant

12 setmanes. .................................................................................................................... 89

Taula 11. Concentracions de lípids, glucosa i transaminases en ratolins apoE-/- (mascles i

femelles) amb dieta estàndard durant 12 setmanes. ......................................................... 90


lesió arterioscleròtica en ratolins apoE-/- (mascles i femelles) amb dieta stàndard durant

12 setmanes. .................................................................................................................... 92

Taula 13. Concentracions de lípids, glucosa i transaminases en ratolins rLDL-/- (mascles i

femelles) amb dieta estàndard durant 9 setmanes. ........................................................... 95


lesió arterioscleròtica en ratolins rLDL-/- (mascles i femelles) amb dieta DRG durant 9

setmanes.......................................................................................................................... 96

Taula 15. Estudi d’expressió gènica en fetges de ratolins C57BL/6 i rLDL-/- tractats amb

PHT vs controls............................................................................................................. 105

INTRODUCCIÓ

Introducció

3

1 LIPOPROTEÏNES PLASMÀTIQUES

1.1 Característiques generals de les lipoproteïnes

El transport de lípids en plasma i la seva homeòstasi en les cèl·lules

s’aconsegueix mitjançant l’ajut de partícules lipoproteiques. Aquestes són

estructures macromoleculars micel·lars complexes que tenen un nucli lipídic

altament hidrofòbic, on trobem els èsters de colesterol i els triglicèrids, envoltat

d’una coberta amfipàtica constituïda pel colesterol lliure, els fosfolípids i les

apolipoproteïnes (figura 1). Aquestes cadenes polipeptídiques anomenades

apolipo-proteïnes són elements claus en el metabolisme dels lípids ja que no

només exerceixen una funció estructural sinó que, a més, dirigeixen el

metabolisme de les proteïnes modulant l’activitat de diversos sistemes enzimàtics i

constituint els llocs específics de reconeixement per part de receptors de

membrana.

Figura 1. Estructura d’una lipoproteïna. Diagrama esquemàtic d’un quilomicró.

Les lipoproteïnes estàn sotmeses a processos metabòlics sumament dinàmics en

què es produeixen intercanvis de material lipídic i proteic entre les diferents

Introducció

4

partícules, de manera que aquestes no presenten una estructura estàtica, sinó que

es troben en contínua reorganització.

La classificació de les lipoproteïnes es pot realitzar segons la seva grandària

(mitjançant electroforesi o bé per cromatografia de gel filtració), la seva densitat

hidratada (mitjançant ultracentrifugació) o bé segons la seva composició

apolipoproteica (mitjançant cromatografia d’afinitat). Tradicionalment, les

lipoproteïnes s’han classificat d’acord amb llur densitat hidratada -que alhora és

un reflex de la diferent relació percentual lípid/proteïna- [1] en les següents

famílies (de menor a major densitat): quilomicrons, lipoproteïnes de molt baixa

densitat (VLDL), lipoproteïnes de densitat intermitja (IDL), lipoproteïnes de baixa

densitat (LDL) i lipoproteïnes d’alta densitat (HDL). Amb una densitat entre l’LDL

i l’HDL trobem la lipoproteïna (a) o Lp(a). Les lipoproteïnes, a més, també es

classifiquen en funció de la seva migració electroforètica en un suport d’agarosa.

En aquestes condicions obtenim lipoproteïnes que romanen a l’origen

(quilomicrons), que migren en posició β (LDL), en posició preβ (VLDL) i les que

migren en posició α (HDL).

Taula 1. Composició de les principals families de lipoproteïnes en humans.

Quilomicrons VLDL IDL LDL Lp (a) HDL

Densitat (g/mL) < 0,9 0,9-1,006 1,006-1,019 1,019-1,063 1,050-1,100 1,063-1,210

Grandària (nm) 80-1000 30-80 25-35 18-25 21-28 5-12

Mobilitat electroforètica Origen preβ β/preβ β preβ αComposició:

% Proteïna 1-2 10 15 18 35 40-60

% Colesterol 5 15 35 50 37 20-30

% Triglicèrids 85 55 25 6 7 4-5

% Fosfolípids 8 20 25 26 21 20-30

Apolipoproteïnes pals. B48, Cs, E, A-I, B100, Cs, E B100, E B100 B100, apo(a) A-I,A-II,A-IV, A-II, A-IV D, E, Cs

Lipoproteïnes riques en triglicèrids

Lipoproteïnes riques en colesterol

Introducció

5

1.2 Metabolisme de les lipoproteïnes

1.2.1 Quilomicrons

Els lípids procedents de la dieta són hidrolitzats pels enzims pancreàtics i

travessen la membrana de la cèl·lula intestinal per ser esterificats en el seu interior.

Els lípids resultants juntament amb les apolipoproteïnes apoB-48, apoA-I i apoA-

IV formen els quilomicrons naixents (figura 2). Aquestes partícules acoblades al

reticle endoplasmàtic i remodelades a l’aparell de Golgi són finalment abocades al

sistema limfàtic. La composició d’aquests quilomicrons naixents és: 98% lípids i

2% apolipoproteïnes [2]. Els quilomicrons naixents, a través de la limfa arriben al

sistema circulatori de l’individu, on pateixen un procés de maduració i

posteriorment són eliminats a través d’un receptor hepàtic. Un cop al plasma, els

quilomicrons naixents maduren gràcies a bescanvis amb les HDLs: els

quilomicrons adquireixen apoC-II i apoC-III de les HDLs (necessàries per a

l’activitat Lipoproteïna Lipasa (LPL) ) i apoE, que necessiten per a la seva

interacció amb els receptors cel·lulars. Al seu torn, cedeixen apoAs. Els

quilomicrons madurs, rics en apoC-II , són un bon substrat per l’LPL, que

hidrolitzarà els triglicèrids que contenen el àcids grassos lliures en diversos

teixits. A mesura que el quilomicró perd triglicèrids, l’excés de material de

superfície (apoA-I, apoC i fosfolípids) és transferit a les HDLs o es fa servir per a la

formació de partícules d’HDL naixents [3]. Simultàniament, la proteïna

transferidora d’èsters de colesterol (PTEC) va enriquint el quilomicró amb èsters

de colesterol [4]. Durant aquest procés es perd més apoC-II que apoC-III, de

manera que arriba un moment en que els quilomicrons ja no són un bon substrat

per a l’enzim LPL. Aquesta partícula anomenada quilomicró residual és

relativament rica en colesterol i apoE i serà reconeguda per receptors hepàtics

específics per a l’apoE, com l’LRP (proteïna relacionada amb el receptor d’LDL),

que l’eliminaran de la circulació [5].

Introducció

6

Figura 2. Esquema simplificat del metabolisme lipoproteic en humans.

1.2.2 VLDL

Són sintetitzades pel fetge per mobilitzar les reserves hepàtiques d’àcids grassos

quan la demanda energètica ho requereix. La seva funció és el transport de

triglicèrids endògens des del fetge cap als teixits extrahepàtics. Com els

quilomicrons, són partícules riques en triglicèrids (taula 1), però de mida més

petita. Per a la formació de les VLDLs calen (a més de triglicèrids) fosfolípids,

colesterol i apolipoproteïnes (apoB-100, apoC i apoE) [6]. Un cop les VLDLs

naixents són al plasma capten apoC-II cedida per les HDLs, la qual cosa permet la

hidròlisi dels triglicèrids per l’LPL i l’assimilació, per part dels teixits circumdants,

dels àcids grassos alliberats [3]. Al mateix temps la PTEC transfereix triglicèrids i

apolipoproteïnes de les VLDLs a les HDLs i èsters de colesterol en sentit invers (de

les HDLs cap a les VLDLs). L’acció de l’LPL fa que disminueixi el volum de la

Introducció

7

partícula i que es desprengui material de superfície en excés que s’emprarà per a

la síntesi d’HDLs . Aquestes VLDLs romanents s’anomenen IDLs. La major part

de les IDLs són transformades en LDL per intervenció de la Lipasa hepàtica (LH)

[7] [8]. Una part de les IDL, però, són retirades de la circulació després

d’interaccionar amb receptors hepàtics específics d’apoE.

1.2.3 IDL

La catabolització dels triglicèrids de les VLDL, i la transferència del material de

superfície excedent cap a les HDL dóna com a resultat la formació de les IDL.

Aquestes partícules han perdut la major part de les seves apoC, especialment

l’apoC-II. En canvi, mantenen l’apo B-100 i l’apo-E, les quals actuen com a lligands

específics de receptors cel·lulars. A banda de la participació de l’apoE, l’LH també

actua afavorint la interacció de la IDL amb els receptors cel·lulars implicats

(receptor d’LDL, l’LRP) i proteoglicans. D’aquesta manera, una part de les IDL

serà retirada del compartiment hepàtic mitjançant receptors específics, mentre que

una altra part de les IDL serà metabolitzada per l’acció hidrolítica de l’LH sobre

els triglicèrids i fosfolípids de la partícula. Aquesta hidròlisi, juntament amb la

pèrdua d’apoE donarà com a resultat la generació de partícules LDL. L’IDL és una

proteïna molt aterogènica però rarament la trobem en plasma en quantitats

significativament importants.

1.2.4 LDL

Considerades el principal transportador plasmàtic de colesterol, les LDL

mobilitzen aproximadament el 70% del colesterol des del fetge cap als teixits

perifèrics. Aquestes lipoproteïnes procedeixen majoritàriament del catabolisme de

les IDL [9] malgrat que poden ser sintetitzades directament pel fetge [7]. Les LDL

són reconegudes per receptors cel·lulars específics que reconeixen apoB-100 i

apoE. D’aquesta manera, el colesterol transportat per les LDL pot ser utilitzat per

la major part d’estirps cel·lulars de l’organisme [8]. El fetge retira de la circulació

fins a un 75% de les LDL i la resta va a teixits extrahepàtics. Part del colesterol

Introducció

8

hepàtic s’utilitza per a la síntesi d’àcids biliars i és finalment excretat de

l’organisme. La captació cel·lular de colesterol, depenent de receptor, està

regulada pel contingut en colesterol intracel·lular no esterificat. Quan el pool

intracel·lular de colesterol disminueix, augmenta la seva síntesi endògena

(activació de la síntesi de l’enzim hidroximetilglutaril-CoA reductasa), augmenta

la síntesi de receptors d’LDL i disminueix l’esterificació de colesterol per l’acil

colesterol acil transferasa (ACAT). A l’inrevés, una concentració plasmàtica

elevada de colesterol d’LDL fa que es reprimeixi la síntesi endògena de colesterol i

la de receptors d’LDL mentre es produeix un increment de l’acitvitat ACAT.

Un punt important pel que fa a les LDL és la susceptibilitat d’aquestes

partícules a ser modificades sobretot per oxidació. Les LDL modificades no són

reconegudes pel receptor d’LDL específic i són eliminades de la circulació pels

receptors scavenger dels macròfags, un procés que no està sotmés a un mecanisme

de regulació pel contingut intracel.lular de colesterol. La captació de les LDL

modificades per macròfags està relacionada amb la transformació d’aquests

últims en cèl·lules escumoses.

1.2.5 Lipoproteïna (a)

La lipoproteïna (a) o Lp(a) és el resultat de la unió d’una partícula d’LDL a una

apolipoproteïna específica, l’apo (a), mitjançant un pont disulfur a l’apoB100 [10].

L’apo(a) és una proteïna de síntesi hepàtica i independent de la síntesi d’apoB100.

La formació del pont disulfur es produeix extracel·lularment. No es coneix amb

precisió a través de quin mecanisme s’elimina l’Lp(a) del plasma; és posible que

l’apo(a) es dissociï de l’apoB100 i es metabolitzi l’LDL resultant a través del seu

receptor. Tot i això, es desconeix el lloc de degradació de l’apo (a). L’Lp(a) és un

factor independent de risc cardiovascular i es pensa que podria interferir en el

procés de fibrinòlisi per l’alta homologia que hi ha entre l’apo(a) i el plasminogen

[11].

Introducció

9

1.2.6 HDL

Les lipoproteïnes d’alta densitat són les més petites de totes les lipoproteïnes,

amb un diàmetre entre 5 i 12 nanòmetres. Contenen aproximadament igual

quantitat de lípids que de proteïnes, però són partícules altament heterogenies pel

que fa a la seva mida i densitat de flotació. Tradicionalment les HDL separades

mitjançant ultracentrifugació s’han classificat en: HDL2 (de densitat entre 1,063-

1,125 g/mL) i HDL3 (de densitat entre 1,125-1,210 g/mL). També existeix una

fracció menys densa de les HDL2 amb apoE, anomenada HDL1 tot i que en

humans és quantitativament minoritària. Altra manera de classificar les partícules

d’HDL és mitjançant cromatografia d’immunoafinitat atenent al seu contingut

lipoproteic. Segons aquest criteri obtenim: les LpA-I/A-II (que contenen apoA-I i

apoA-II), les LpA-I (amb apoA-I, però no apoA-II) i les LpA-II, una fracció

minoritària de partícules que només contenen apoA-II [12] [13]. S’ha de remarcar,

però, que en aquesta classificació no es té en compte altres apolipoproteïnes

minoritàries de les partícules d’HDL (C-I, C-II, C-III, A-IV, E, D, J i H) fet que fa

que augmenti encara més llur heterogenicitat apolipoproteica. La separació de les

HDL segons la seva mida es pot realitzar a partir d’una electroforesi en un gel no

desnaturalitzant en gradient de poliacrilamida. D’aquesta manera s’obtenen les

següents poblacions: HDL3c (7,62nm), HDL3b (8,0nm), HDL3a (8,4nm), HDL2a

(9,2nm) i HDL2b (10,6nm) [14].

La síntesi de les HDL es produeix a diferents nivells: hepàtic, intestinal i

plasmàtic. En fetge es sintetitza apoA-I i apoA-II , mentre que en l’intestí prim es

sintetitza l’apoA-I i/o l’apoA-IV; aquestes són secretades a la circulació com a

partícules pobres en lípids (preβ-HDL) o fins i tot com apolipoproteïnes lliures.

Aquestes apolipoproteïnes capten fosfolípids i colesterol de les cèl·lules i

esdevenen partícules discoïdals que evolucionaran posteriorment cap a partícules

esfèriques gràcies a l’acció de la lecitina:colesterol acil transferasa (LCAT), enzim

que catalitza l’esterificació plasmàtica del colesterol, i la proteïna transferidora de

fosfolípids (PTLP o PTL-2) [15] [16]. D’altra banda, també es poden sintetitzar

HDL en plasma durant el catabolisme dels quilomicrons i les VLDL, ja que el

Introducció

10

material de superfície alliberat pot formar partícules d’HDL planes (discoïdals) i

partícules preβ [17]. L’actuació dels enzims i proteïnes transportadores de lípids

sobre les HDL indueixen la dissociació de l’apoA-I d’aquestes lipoproteïnes.

L’apoA-I lliure o pobre en lípids pot formar partícules d’HDL mitjantçant

transport revers de colesterol o passar al filtre glomerular i ser catabolitzada a

nivell tubular pel complex megalina-cubilina (figura 2) [18] [19]. Aquest

catabolisme renal de l’apoA-I lliure explicaria el fet que el seu aclariment del

plasma sigui més ràpid que el de la partícula d’HDL en conjunt.

• Transport revers de colesterol

El procés mitjantçant el qual el colesterol captat per les HDL de les cèl·lules

perifèriques arriba al fetge i és eliminat per les vies biliars, s’anomena transport

revers de colesterol [20]. Aquest procés té una especial rellevància fisiopatològica

en la prevenció de l’aterogènesi [21]

El pas inicial del transport revers de colesterol consisteix en la transferència de

colesterol des de la superfície de les cèl·lules a partícules acceptores (preβ-HDL i

HDL discoïdals). De fet, la major part del colesterol de les cèl·lules perifèriques es

transfereix inicialment a les HDL [22].

S’han proposat dos mecanismes pels quals es produeix l’eflux de colesterol de

les cèl·lules cap a les partícules d’HDL. Un d’ells es tracta d’un procés de difusió,

lent i depenent de receptor a través de la fase aquosa des de les membranes

cel·lulars cap a les HDL o altres molècules acceptores [23]. Aquesta transferència

no es produeix per un lloc d’unió de superfície específic. Es considera que l’estat

físic de les molècules de fosfolípids és un determinant important d’aquesta, de

manera que, disminucions en les llargàries de cadena i augments en el grau

d’insaturació tendeixen a generar partícules acceptores de colesterol lliure més

eficients [24]. Aquest mecanisme difusional també contempla, de manera paral·lela

al transport de colesterol, la coexistència d’un transport de fosfolípids. Aquests

proveeixen la partícula d’HDL de més escorça i, per tant, de major capacitat per

captar colesterol cel·lular.

Introducció

11

El segon mecanisme proposa l’existència d’un transport ràpid , actiu i depenent

del receptor del colesterol i els fosfolípids cel·lulars cap a les HDL. En aquest

mecanisme està implicat l’ABC-A1 (ATP binding cassette), una proteïna reguladora

de l’eflux de colesterol que facilita el transport actiu del colesterol lliure i els

fosfolípids des de l’interior de les cèl·lules cap a les preβ-HDL [25][26]. L’absència

de funcionalitat del gen de l’ABC-A1 bloqueja la transferència activa del colesterol

lliure i de fosfolípids a les apoA-I circulants i com a conseqüència es produïrà un

hipercatabolisme de l’apoA-I i una deficiència d’HDL [27]. Aquesta proteïna,

doncs, juga un paper clau en el transport revers de colesterol.

El colesterol lliure captat s’esterifica gràcies a l’acció única de la LCAT. Se sap

que aquest enzim no és necessari perquè es produeixi el component ràpid i

específic de l’eflux de colesterol que va dirigit en primer lloc a partícules HDL de

mobilitat preβ. En canvi, sí que és indispensable pel component més lent i

inespecífic de l’eflux de colesterol [28].

El destí dels èsters de colesterol formats en HDL és variat. Poden ser: i) captats

pels teixits juntament amb la totalitat de la partícula d’HDL, especialment en fetge

i ronyó, ii) captats de manera selectiva de les HDL per la unió d’aquestes al seu

receptor específic SR-BI (Scavenger Receptor-BI) en fetge, gònades i suprarenals

(aquest procés no implica la captació de la partícula d’HDL per la cèl·lula), iii)

transferits per la PTEC a partícules que contenen apoB-100, i més tard captats

juntament amb aquestes per cèl·lules via receptor-depenent (receptor d’LDL,

receptor d’VLDL, LRP, etc…)(figura 2).

• HDL i l’oxidació lipoproteïca

Un dels efectes protectors contra la progressió de l’arteriosclerosi atribuïts a

l’HDL es basa en la seva capacitat d’inhibir la modificació oxidativa de les LDL

[29][30]. El mecanisme d’inhibició sembla ser de tipus enzimàtic. A través d’algún

tipus d’interacció entre l’HDL i la LDL, diversos enzims associats a l’HDL

(paraoxonasa i acetilhidrolasa del factor activador plaquetari) poden convertir

productes dels àcids grassos oxidats amb propietats proaterogèniques en altres

Introducció

12

que no tenen activitat biològica [31]. Aquesta funció pot ser vital per explicar el

paper anti-aterogènic de l’apoA-I quan s’expressa en ratolins transgènics, ja que en

aquests s’observa un increment de l’activitat dels enzims paraoxonasa i acetil-

hidrolasa del factor plaquetari [32]. Altres mecanismes no enzimàtics que

bloquegen la modificació oxidativa de les LDL estàn mitjançats directament per

l’apoA-I però no per l’apoA-II o l’albúmina [33].

1.3 Apolipoproteïnes

Els components proteics de les lipoproteïnes plasmàtiques es coneixen amb el

nom d’apolipoproteïnes. La seva funció principal és la d’assegurar el transport

lipídic entre els components intra- i extravascular [34]. Les apolipoproteïnes són,

doncs, els components funcionals de les lipoproteïnes ja que determinen tant la

seva estructura com el seu metabolisme. Aquest paper comença des de la síntesi i

secreció de les lipoproteïnes per les cèl·lules específiques, passant per les reaccions

enzimàtiques i transferències lipídiques que pateixen les lipoproteïnes un cop

arriben a la circulació sistèmica i acabant per la unió d’aquestes liproteïnes (un cop

madures) amb els receptors cel·lulars i el seu catabolisme.

El fet que una mateixa apolipoproteïna pugui existir en diferents estats

funcionals en funció del tipus o subtipus de lipoproteïna en que es trobi ha

despertat un enorme interès en esbrinar les propietats moleculars de les

apolipoproteïnes de manera detallada i la relació existent entre la seva estructura i

funció. És ben sabut que les seqüències funcionalment importants tendeixen a

estar molt ben conservades des d’un punt de vista evolutiu. Per determinar si una

determinada regió és probablement part d’un domini funcional important , es

comparen totes les seqüències disponibles de les apolipoproteïnes individuals de

diferents espècies animals i s’analitza el grau d’homologia que presenten [35].

Introducció

13

1.3.1 Apolipoproteïna A-I

L’apolipoproteïna (apo) A-I és el principal component proteic (68% de la massa

proteica) de les HDL. Es troba present en petites quantitats als quilomicrons, però

no a les lipoproteïnes que contenen apoB-100 [36]. L’apo A-I es composa de 243

aminoàcids i té un pes molecular aproximat de 28000 kDa (veure taula 2). Es

sintetitza en fetge i intestí com a producte d’un gen que es troba en la regió q23.3

del cromosoma 11, a prop dels gens de les apoC-II i apoA-IV i del de la insulina

[37]. Aquest gen pertany a una familia de gens que codifiquen apolipoproteïnes

(A-i, A-II, A-IV, E, C-I, C-II i C-III) i que tenen com a característica principal una

gran homologia en la seva estructura composada de 4 exons i 3 introns. L’exò 4

codifica per a moltes sèries repetides que donen lloc a zones d’α-hèlix. Aquestes,

també s’anomenen hèlix amfipàtiques perquè interaccionen amb fosfolípids i

formen dos vessants contraposades, una hidrofòbica i una altra hidrofílica. La

vessant hidrofòbica està en contacte amb les cadenes alifàtiques dels àcids grassos

mentre que la part hidrofílica es troba en contacte amb el medi aquós,

interaccionant amb la part més polar dels fosfolípids [38].

Taula 2. Caracterització de les apolipoproteïnes en humans

Apolipoproteïna Expressió Concentració Pes molecular Pals. lipoproteïnes

(mg/L) (Kda) portadores

ApoA-I Fetge, Intestí prim 1300 28 HDL, QMApoA-II Fetge 400 18 HDL, QMApoA-IV Intestí prim 150 44 HDL, QMApoB48 Intestí prim - 264 QMApoB100 Fetge, Intestí prim 800 520 VLDL, IDL, LDL, Lp(a)ApoC-I Fetge, adrenals 60 6,6 HDL, QM, VLDL,IDLApoC-II Fetge 30 8,9 HDL, QM, VLDL,IDLApoC-III Fetge 120 8,8 HDL, QM, VLDL,IDLApo-D Ronyó, pàncrees, adrenals 100 22 HDLApo-E Fetge, adrenals, cervell, ronyó 50 34 HDL, QM, VLDL,IDLApo-J Fetge, cervell, gònades - 35-40 HDLApo(a) Fetge Variable 300-800 Lp(a)

Després de la seva síntesi, l’apoA-I es denomina pre-pro-apoA-I (forma

precursora d’alt pes molecular). Al passar al citoplasma es convertirà en pro-

Introducció

14

apoA-I. La seva maduració final, però, té lloc en la limfa i el plasma a través de la

digestió del segment “pro” per un enzim convertidor [39].

L’apoA-I té un paper estructural molt important en les HDL: actua com a

lligand del receptor SR-BI i, per tant, participa en la captació per part del fetge i els

teixits esteroidogènics del colesterol transportat per les HDL [40]. D’altra banda és

el principal cofactor de l’enzim LCAT i és capaç d’estimular l’eflux de colesterol in

vitro a partir de cèl·lules extrahepàtiques [41].

La relació de l’apoA-I amb l’arteriosclerosi ha estat àmpliament estudiada. Els

estudis epidemiològics demostren que el risc de patir cardiomiopatia isquèmica

està relacionat de forma inversa amb la concentració d’apoA-I al plasma [42].

Malgrat això, diversos pacients amb deficiències familiars d’apoA-I no

presentaven una major incidència de malaltia coronària que la trobada en una

població control [43].

1.3.2 Apolipoproteïna A-II

La concentració plasmàtica d’apoA-II en persones normolipèmiques és

aproximadament 33-35mg/dL, quantitat que representa el 20% de la proteïna

d’HDL i, per tant, la segona apolipoproteïna més abundant en HDL després de

l’apoA-I. El pes molecular és de 18 kDa en humans (taula 2). L’apoA-II s’expressa

exclusivament en fetge (tot i que petites quantitats d’RNA missatger es troben

també a nivell de l’intestí) i el gen ha estat localitzat en la regió q21-23 del

cromosoma 1 [44]. És un dels principals constituents de les HDL i podria actuar

com a modulador de l’LPL i l’LH [45] [46] [47].

La forma plasmàtica més abundant d’apoA-II en plasma humà és un

homodímer de 77 aminoàcids per pèptid, units per un pont disulfur format per la

única cisteïna existent en cada molècula i que es troba en posició 6 [48]. L’apoA-II

es sintetitza en forma de pre-proteïna amb 101 aminoàcids dels quals 18 formen

part del pèptid senyal. Aquest pèptid senyal es perdrà i la proteïna pot sialitzar-se

i/o ciclar-se a l’aparell de Golgi [49]. Aquesta proteïna, però, no arribarà a la seva

Introducció

15

forma madura fins que no s’hagi alliberat, per trencament proteolític, d’un residu

de 5 aminoàcids del seu extrem NH2 terminal tot i que també se la pot trobar

mantenint aquest residu. D’aquesta manera podrien arribar a coexistir fins a nou

isoformes a l’interior cel·lular amb diferents temps de vida mitjana. La proteïna

serà doncs secretada al plasma en diferents estats de maduració [50].

L’apoA-II presenta un elevat percentatge d’hèlix-α a la seva estructura, la qual

cosa fa que presenti una afinitat més alta que l’apoA-I per les monocapes

lipídiques. Així, almenys in vitro, un excés d’apoA-II pot desplaçar l’apoA-I de les

HDL [51].

La forma dimèrica o monomèrica en la qual es trobi l’apoA-II determina

algunes de les seves propietats. En les partícules HDL3, l’apoA-II dimèrica

impedeix que aquestes es converteixin en partícules més petites. L’apoA-II

monomèrica, en canvi, no impedeix aquesta conversió [52].

La funció fisiològica de l’apoA-II està pobrament definida i els seu estudi ha

mostrat resultats contradictoris. S’ha descrit que l’apoA-II pot activar i/o inhibir

l’acció de l’LH [53] [46] [47] i la PTEC i que inhibeix l’LCAT. S’han trobat

determinades subpoblacions de VLDL que contenen apoA-II i que són

relativament resistents a l’acció de l’LPL en individus que presenten la malaltia de

Tangier (hiperlipoproteinèmia tipus V) [54].

Així com les partícules d’HDL riques en apoA-I protegeixen de l’arteriosclerosi,

se sap que les tenen més abundància d’apoA-II són pro-aterogèniques [55].

1.3.3 Apolipoproteïna A-IV

L’apoA-IV és una glicoproteïna de 46 kDa que es troba principalment associada

a HDL i a la fracció no lipoproteïca del plasma en dejuni o a quilomicrons en

situació postprandial [56]. El gen de l’apoA-IV s’expressa majoritàriament a intestí

i fetge i es codifica en el cromosoma 11. El seu gen es troba dins l’agrupació de

gens apoA-I/C-III/A-IV. A diferència de la resta de gens de la família a la qual

Introducció

16

pertany, aquest gen consta de tres exons i dos introns, tot i que conserva la

mateixa estructura [57].

S’han suggerit diverses funcions per l’apoA-IV. En plasma aquesta

apolipoproteïna és desplaçada dels quilomicrons per les aposC. D’aquesta forma

indirecta, l’apoA-IV actuaria com un dels reguladors de l’LPL sobre els

quilomicrons [58].

L’apoA-IV té un efecte estabilitzador de la LCAT i és capaç d’activar l’eflux de

colesterol en experiments amb cultius cel·lulars i, per tant, podria tenir un paper

important en el transport revers de colesterol [59].

En l’absorció de vitamines sembla que també aquesta apolipoproteïna té un

paper destacat. Així, pacients amb deficiència hereditària d’apoA-I/C-III/A-IV

presentaven una deficiència de vitamina E que no presentaven els que tenien

deficiència d’apoA-I/C-III [60].

1.3.4 Apolipoproteïna B-100

El gen que codifica per aquesta apolipoproteïna es troba en el cromosoma 2

(2p24-p23) i s’extén al llarg de 43 Kb. En humans l'apoB-100 es sintetitza

majoritàriament al fetge [61]. El resultat és una una glicoproteïna de 4536

aminoàcids amb un pes molecular de 520 kDa i molt poc soluble en solucions

aquoses [62].

És el principal constituent proteic de les VLDL, IDL, LDL i Lp(a). Es tracta

d’una proteïna rica en residus cisteïna, lisina i arginina. La seva funció principal és

el reconeixement del receptor d’LDL, que permet la internalització i processament

intracel·lular de la partícula d’LDL residus i permet també proveir de colesterol els

teixits perifèrics i el fetge [63]. Els residus lisina i arginina són indispensables per a

la interacció amb el receptor d’LDL i la modificació d’aquests residus (per

glicosilació, peroxidació i/o acetilació) fa que l’afinitat entre lligand i receptor

Introducció

17

disminiueixi fins a desaparéixer. Aquestes modificacions dels residus catiònics

tenen una importància capital en láterogenicitat de les LDL.

1.3.5 Apolipoproteïna B-48

L'apoB-48 i lápoB-100 són el producte dún mateix gen i dún mateix RNA

missatger. En alguns teixits (fonamentalment líntestí) aquest RNA missatger és

modificat a través dún procés dédició en el citoplasma, de manera que el codó

2153 canvia de CAA (que codifica per Glu) a UAA (codó de terminació); així la

proteïna queda truncada durant la traducció i té aproximadament el 48% de la

grandària de l'apoB-100 [64]. El resultat és la síntesi dúna proteïna de 2152

aminoàcids que no conté léxtrem C-terminal de lápoB-100 (on hi ha el lloc dúnió

amb el receptor d´LDL. En humans, l'apoB-48 és la principal proteïna estructural

dels quilomicrons.

1.3.6 Apolipoproteïnes C

Les aposCs humanes (apoC-I, apoC-II i apoC-III) són considerades com a

membres d’una única família de proteïnes amb baixos pesos moleculars i una

purificació coincident. Les apoCs són els constituents proteics dels quilomicrons,

VLDL i HDL [65]. En comparació amb les intensament estudiades apoE, apoB i

apoA-I, les quals juguen papers importants en el desenvolupament

d’hiperlipèmies i arteriosclerosi, menys atenció se li ha donat a les apoCs en el

metabolisme lipoproteic.

Els gens que codifiquen les apoC-I i apoC-II humanes són membres d’un

agrupament gènic d’unes 48Kb situat en el cromosoma 19 el qual també inclou els

gens de l’apoE. El gen de l’apoC-I abarca unes 4,7Kb i s’expressa principalment en

fetge, tot i que també s’ha trobat expressió en pulmons, pell, testicles i melsa, però

en petita quantitat. El gen de l’apoC-II ocupa una regió de 3,4Kb i s’expressa en

fetge i intestí [65].

Introducció

18

El gen de l’apoC-III humana està localitzat en l’agrupament gènic entre els gens

de l’apoA-I i l’apoA-IV en el braç llarg del cromosoma 11 [66] i consta d’unes

3,1Kb. Aquest gen s’expressa en fetge i intestí (en molt poca quantitat) i es troba

controlat per elements activadors i inhibidors que es distribueixen al llarg de

l’agrupament genètic [65].

Des d’un punt de vista funcional les aposCs participen en el metabolisme de les

lipoprotreïnes riques en triglicèrids i en el remodelatge de les HDL mitjançat per

l’LCAT. Durant la lipòlisi dels triglicèrids d’VLDL aquestes aposC poden

intercanviar-se ràpidament entre les VLDL, els quilomicrons i les HDL. Les apoC-I

i II actuen com a cofactors activadors de l’LPL i activen l’LCAT in vitro. L’apoC-I, a

més, inhibeix la hidròlisi de fosfolípids mitjançada per la fosfolipasa A2

(possiblement per un bloqueig d’accès al substrat). D’altra banda , l’apoC-III pot

exercir un efecte inhibidor sobre l’acció de l’LPL i en la captació pel fetge de les

lipoproteïnes riques en triglicèrids. També se li ha atribuït un paper modulador

sobre l’activitat l’LCAT.

1.3.7 Apolipoproteïna D

L’apoD és una glicoproteïna d’uns 30 kDa de pes molecular i de càrrega

polimòrfica [67]. Aquesta apolipoproteïna forma part d’una família de proteïnes

anomenades lipocalines, les quals tenen en comú la funció de transportar

molècules hidrofòbiques de petita grandària en diferents fluids corporals [68].

En plasma l’apoD es troba principalment associada a les partícules HDL i forma

heterodímers amb l’apoA-II i apoB-100 [69] i amb l’LCAT [70]. De totes maneres,

tant la seva funció com la seva capacitat associativa de lípids no roman gens clara.

1.3.8 Apolipoproteïna E

El gen de l´apoE es troba en el cromosoma 19 [71]. Aquesta apolipoproteïna és

sintetitzada en forma pre-apoE amb 317 aminoàcids, dels quals 18 constitueixen

Introducció

19

un pèptid senyal que és eliminat durant la traducció. Un cop sintetitzada, és

sialitzada a láparell de Golgi abans de la seva secreció, i després de la secreció és

desialitzada. La proteïna madura conté 299 aminoàcids i un pes molecular aparent

de 34,2 kDa [72]. La síntesi d'apoE és fonamentalment hepàtica, però també es

dóna en altres teixits extrahepàtics com el ronyó, les glàndules adrenals, el cervell,

lóvari, el pulmó i el múscul [72].

En humans s’han identificat fins a tres formes principals d’aquesta

apolipoproteïna. L’apoE3 és la més comuna, mentre que l’apoE2 i l’apoE4 no són

tan freqüents. Una de cada 100 persones amb genotip E2/E2 desenvolupen

hiperlipoproteïnèmia tipus III [73].

LápoE és un constituent de diferents tipus de lipoproteïnes. Es troba present en

les lipoproteïnes riques en triglicèrids, en les seves partícules residuals

(quilomicrons, VLDL, IDL i LDL) i en una subfracció minoritària de les HDL.

LápoE és un lligand dálta afinitat pels receptors de VLDL i LDL, i per a l’LRP. A

causa de l'àmplia distribució de l'apoE, se li han associat diverses funcions:

modulació de les concentracions plasmàtiques de VLDL i LDL [74], unió de les

partícules riques en triglicèrids als glicosaminoglicans sulfatats de la paret arterial,

afavoridors de lácció de l´LPL i de la triglicèrid-lipasa hepàtica [71], participació

en el transport revers de colesterol mitjantçant un tipus de partícules d´HDL que

contenen únicament apoE [75], regulació de la resposta immunològica i modulació

de la regeneració neuronal [76].

1.3.9 Apolipoproteïna J

Anomenada també clusterina, l’apoJ és una glicoproteïna sulfatada que té 427

aminoàcids i un pes molecular d’entre 35-40 kDa. Al contrari del que succeeix amb

la majoria d’apolipoproteïnes que tenen una síntesi bàsicament intestinal i/o

hepàtica, l’apoJ es sintetitza en una gran varietat de teixits (fetge,cervell, testicles,

ovaris, cor, pulmó, melsa, glàndula mamària, paret aòrtica) [77] [78]. L’apoJ es

troba en el plasma associat majoritàriament a partícules d’HDL (amb apoA-I) [79].

Introducció

20

S’ha demostrat que l’apoJ s’uneix al receptor glicoproteic 330, com ho fan altres

lligands del tipus de la lipoprotein lipasa i l’apoE. Es tracta d’un receptor

estructuralment similar a l’LRP però de distribució tissular diferent ja que

s’expressa fonamentalment en fetge. Donat que l’apoJ augmenta en teixits

lesionats i té una activitat inhibidora del complex C5b-C9, s’ha proposat que

potser l’apoJ quan s’uneix al receptor glicoproteic 330 s’encarrega d’aclarir restes

lipídiques o apoptòtiques [80]. També podria tenir un paper important en el

transport revers de colesterol mitjançant la formació de partícules d’HDL que

contenen apoA-I i apoE [81].

1.3.10 Apolipoproteïna (a)

El gen de l'apo(a) es troba en el cromosoma 6, adjacent al gen del plasminogen i

amb el qual presenta un alt grau d'homologia [82]. Lápo(a) és una glicoproteïna

rica en àcid neuramínic. Aquesta glicoproteïna presenta un domini similar al

kringle 5 del plasminogen i multiples còpies del kringle 4 del plasminogen. Al

plasma trobem diverses isoformes amb un pes molecular comprès entre 400 i 800

kDa [83]. El nombre de còpies del kringle 4 determina la isoforma de la proteïna.

Les isoformes amb un major nombre de repeticions del kringle es troben en menor

concentració al plasma que les isoformes més petites [84].

L'apo(a) es troba únicament a la lipoproteïna (a) (Lp(a)). És tracta dúna

lipoproteïna amb mobilitat preβ i amb una part proteica constituïda per l'apo(a) i

l'apoB-100 unides per un pont disulfur [85]. Malgrat això, altres apolipoproteïnes

com lápoA-I, lápoE i lápoA-II, estan presents a la partícula de Lp(a) [86].

Lélevat grau d´homologia que té amb el plasminogen permet que lápo(a) pugui

competir amb aquest quan súneix al seu receptor endotelial i impedir la seva

acció fibrinolítica. La concentració d'apo(a) plasmàtica es relaciona positivament

amb el risc de patir infart agut de miocardi en individus joves i amb accident

vascular cerebral [87].

Introducció

21

1.4 Enzims reguladors del metabolisme lipoproteic

Les lipoproteïnes un cop secretades són inicialment madurades per l’acció de

certes activitats enzimàtiques plasmàtiques. La funció d’aquests enzims és

extraordinàriament rellevant en el metabolisme de les lipoproteïnes tal i com ho

demostren les deficiències hereditàries d’aquestes proteïnes.

1.4.1 Lipoproteïna lipasa (LPL)

El gen que codifica per l'enzim LPL es troba localitzat en el cromosoma 8 (8p22)

[88]. Es tracta d'una glicoproteïna de 477 aminoàcids i un pes molecular aparent de

64 kDa [89].

L´LPL és el principal responsable de la hidròlisi en plasma dels triglicèrids

transportats pels quilomicrons i les VLDL [90] alliberant àcids grassos lliures i

glicerol com a productes de la reacció. Aquests àcids grassos són aleshores captats

pels diferents teixits i incorporats al metabolisme cel.lular, on són utilitzats com a

substrat energètic (múscul, cor, teixit adipòs marró) reesterificats i reexportats

(glàndula mamària activa) o bé emmagatzemats (teixit adipòs blanc). El lloc

d’acció funcional de l’LPL és la superfície luminal de l’endoteli vascular dels

capil.lars ancorada mitjançant cadenes de glicosamino-glicans del tipus heparan i

dermatan sulfats. Aquesta ubicació funcional explica el ràpid alliberament de

l’LPL a la circulació plasmàtica després de l’administració intravenosa d’heparina

[91].

L’activitat LPL es caracteritza per ser inhibida per concentracions altes de sal

(NaCl 1M) i sulfat de protamina, per tenir un pH òptim alcalí (pH=8,0-8,5) i per

requerir un activador específic: lápoC-II. La seva activitat hidrolítica és depenent

d'una tríada catalítica Ser-His-Asp en la qual la Ser132 juga un paper molt

important [92]. Láctivitat de l´LPL als diversos teixits és diferent i varia segons

léstat nutricional i endocrí de lórganisme [93].

Introducció

22

A més de la seva funció principal, se li atribueixen altres funcions metabòliques

com la de funcionar com a proteïna dádhesió monocitària [94] o bé la de

funcionar associada a l´LRP facilitant la internalització de partícules[95].

1.4.2 Lipasa hepàtica (LH)

El gen que codifica aquest enzim és al cromosoma 15(q15-q22). L´LH és una

glicoproteïna que conté 477 aminoàcids i que és sintetitzada amb un pèptid senyal

addicional de 22 aminoàcids [96].

L´LH, de la mateixa manera que l´LPL, es troba unida a léndoteli capil·lar del

fetge, a les glàndules suprarenals i als ovaris mitjançant un braç glicosaminoglicà,

pot ser alliberada per una injecció d´heparina, i participa en la hidròlisi dels

triglicèrids i fosfolípids transportats per les lipoproteïnes, però no és inhibida per

concentracions salines altes, ni és activada per lápoC-II [97]. El millor substrat per

a l´LH són les lipoproteïnes de densitat intermitja (IDL) i les HDL2. En humans

s´ha pogut observar que láctivitat postheparínica es correlaciona inversament

amb les concentracions de colesterol dÍDL i d´HDL2. La seves accions fosfolipasa

A1 i triglicèrid lipasa són fonamentals en el procés de conversió dÍDL a LDL [98] i

d´HDL2 a HDL3 [99]. Dáquestes últimes sóriginen, probablement, partícules de

molt petita grandària i es provoca la dissociació de molècules dápoA-I [100].

Nombrosos estudis suggereixen també que l´LH pot tenir un paper important

en la retirada plasmàtica de les partícules romanents dels quilomicrons

[101][102][103].

1.4.3 Lecitina:colesterol acil transferasa (LCAT)

L’LCAT és un enzim plasmàtic, de 416 aminoàcids, que es sintetitza en el fetge i

que circula majoritàriament associat a les HDL; és, també, el principal responsable

de la síntesi de la major part dels èsters de colesterol presents en plasma [104].

L’apoA-I és el cofactor apolipoproteic que requereixen les reaccions enzimàtiques

Introducció

23

catalitzades per l’LCAT. Es creu que aquesta apolipoproteïna facilita la interacció

de l’enzim amb la interfase lipídica.

Aquest enzim catalitza l’hidròlisi i transferència d’un àcid gras de la posició sn-

2 de la fosfatidilcolina a la posició 3-β-OH del colesterol, produïnt èster de

colesterol i lisolecitina [105]. També presenta activitat fosfolipasa A2 amb la

fosfatidilcolina com a substrat primari. L’activitat esterificadora de l’enzim fa

insoluble el colesterol lliure sobre el qual actua i contribueix a mantenir el flux de

colesterol des de la membrana plasmàtica cel·lular cap a les HDL. Posteriorment

aquests èsters de colesterol poden ser transferits a les LDL i VLDL gràcies a l’acció

de la PTEC, o bé, transportats directament al fetge per la mateixa partícula d’HDL.

Així doncs, l’acció de LCAT té un paper fonamental en la maduració de les

partícules d’HDL i en el transport revers de colesterol [106]. L’LCAT té també un

paper fonamental en la protecció de l’oxidació de les lipoproteïnes ja que pot

hidrolitzar les fosfatidilcolines oxidades i pot prevenir l’oxidació lipídica in vitro

[107]. Malgrat això, s’ha demostrat que aquests mateixos compostos són inhibidors

de l’activitat LCAT [108].

1.4.4 Proteïna transferidora d’èsters de colesterol (PTEC)

El gen de la PTEC, també anomenat proteïna transferidora de lípids 1 (PTL-1),

es troba en el cromosona 16 (q13) pròxim al gens de l´LCAT i de l´haptoglobina i

consta de 16 exons [109]. La síntesi de la PTEC té lloc a molts teixits: al fetge, a la

melsa, al teixit adipós; i amb baixos nivells déxpressió a líntestí prim, a les

glàndules adrenals, al cervell, al muscul cardíac i a lésquelètic [110]. La proteïna

madura consta de 476 aminoàcids i té un pes molecular aparent de 66-74 kDa

[111]. Léstructura primària de la PTEC té una elevada homologia entre els

primats, així per exemple la PTEC humana és un 95% homòloga a la de la PTEC

del macaco [112].

La funció fisiològica de la PTEC és la de mitjançar el bescanvi d´èsters de

colesterol i triglicèrids entre les diverses lipoproteïnes plasmàtiques i entre

Introducció

24

lipoproteïnes i cèl·lules, tot i que també pot transferir o intercanviar

fosfatidilcolina [104]. El resultat és una transferència neta d'èsters de colesterol des

de les HDL als quilomicrons, VLDL i LDL, i de triglicèrids des dáquestes tres a les

HDL. Dúna banda, l´LH pot hidrolitzar els triglicèrids de les partícules d´HDL i

induir la formació de partícules d´HDL més denses i petites, i provocar un

increment en la dissociació de lápoA-I de la superfície de les HDL [113]. Dáltra

banda, lácció de la PTEC indueix la formació de VLDL i LDL enriquides amb

èsters de colesterol. Aquests èsters de colesterol que han estat transferits a les LDL

poden ser retirats en el fetge i jugar un paper important en el transport revers de

colesterol [114].

La relació de la PTEC amb lárteriosclerosi sembla que pot dependre de la

concentració de colesterol de les partícules de VLDL, LDL i HDL i de la capacitat

dáquestes últimes per a promoure el transport revers de colesterol. Els individus

amb una deficiència genètica de PTEC presenten increments en les concentracions

del colesterol d´HDL, reduccions en el contingut d’èsters de colesterol de les

VLDL i LDL, i una baixa prevalença de malaltia coronària [115]. Tanmateix, els

heterozigots dúna alteració genètica del gen de la PTEC amb unes concentracions

normals del colesterol d´HDL (40-60 mg/dl) presentaven un moderat increment

en la prevalença de malaltia coronària. Aquest mateix treball va demostrar que els

individus amb aquesta deficiència genètica de PTEC i amb unes concentracions

elevades del colesterol d´HDL (>60 mg/dl) presentaven una baixa prevalença de

malaltia coronària [116]. A més, un estudi recent ha demostrat que pacients amb

una deficiència genètica de PTEC i amb una activitat LH reduïda, presentaven un

increment en la prevalença de malaltia coronària, tot i tenir una unes

concentracions elevades del colesterol d´HDL [117]. Dáltra banda, moltes

dislipèmies humanes associades a una major susceptibilitat de patir arteriosclerosi,

presenten concentracions i/o activitats de PTEC augmentades [110].

Introducció

25

1.4.5 Proteïna transferidora de lípids 2 (PTL-2)

El gen que sintetitza aquest enzim es troba al cromosoma 20 [118]. La PTL-2 és

una proteïna de 476 aminoàcids i un pes molecular de 54,7 kDa [119]. La PTL-2 es

sintetitza ovari, timus i placenta, i en menor mesura en altres òrgans.

La PTL-2 transfereix fonamentalment fosfolípids des de les lipoproteïnes que

contenen apoB i des de les membranes cel·lulars cap a les HDL. Més del 50% de

láctivitat transferidora de fosfolípids del plasma és mitjançada per la PTL-2. La

transferència de fosfolípids dúnes partícules d´HDL a altres provoca el

desplaçament de lápoA-I de la superfície de les HDL i la formació de partícules

més petites -partícules preβ-HDL–[120][121]. Els estudis relacionats amb el flux de

colesterol en cultius cel·lulars i la generació de ratolins deficients per la PTL-2

indiquen que la PTL-2 sembla que té un paper important en el transport revers de

colesterol [122][123].

1.4.6 Paraoxonasa

El gen de la paraoxonasa s’ha localitzat per hibridació in situ en el cromosoma 7

[124]. Aquest enzim té un pes molecular de 43-45 kDa i se sintetitza i secreta

fonamentalment a nivell hepàtic. La paraoxonasa pertany al grup de les esterases

tipus A amb capacitat per hidrolitzar diversos compostos organofosforats. En el

plasma es troba associada a HDL, especialment en aquelles partícules que

contenen apoA-I i apoJ [125].

La paraoxonasa és responsable de la disminució de peròxids en LDL causada

per la coincubació amb HDL, i que probablement està mediada per la seva

capacitat d´hidrolitzar fosfolípids oxidats [126]. La paraoxonasa té la capacitat

dínhibir certes respostes cel·lulars, com ládhesió i transmigració de monòcits,

implicades en la gènesi de la lesió arterioscleròtica [127].

Introducció

26

1.5 Receptors del metabolisme lipoproteic

1.5.1 Receptor d’LDL

El gen que codifica per aquest receptor es troba en el cromosoma 19 i té una

longitud de 45 Kb de DNA. El receptor d´LDL és una glicoproteïna de superfície

cel·lular amb 839 aminoàcids distribuïts en cinc dominis: un domini d'unió al

lligand ric en cisteïnes, un domini d´homologia amb el precursor del factor de

creixement epidèrmic, un domini ric en oligosacàrids, un domini transmembrana i

un domini citoplasmàtic [128]. El receptor d´LDL súneix a dues proteïnes

diferents: lápoB-100 de l´LDL i lápoE. Les lipoproteïnes que contenen apoE

(VLDL, IDL, i certes subpoblacions d´HDL) súneixen al receptor d´LDL amb una

afinitat superior que l´LDL, però el saturen abans que lápoB [129].

Aproximadament 45 minuts després de la seva síntesi, els receptors d´LDL

apareixen a la superfície de la cèl·lula, on es desplacen lateralment i es concentren

en llocs específics de la membrana plasmàtica anomenats pous recoberts (de

l’anglés coated pits), els quals estàn formats per una proteïna, la clatrina, situada a

la cara interna de la membrana i que serveix dáncoratge per a un elevat nombre

de receptors (receptor dínsulina, factor de creixement endotelial, transferrina,

etc.). Aquests pous recoberts sínternalitzen períodicament per endocitosi

independentment que hi hagi o no unió del lligand. Les vesícules endocítiques

formades es fusionen i es converteixen en endosomes, en línterior dels quals les

LDL es dissocien del receptor, que és reciclat cap a la membrana. Els èsters de

colesterol transportats per les LDL són degradats a colesterol no esterificat en el

compartiment lisosòmic, i aquest colesterol és incorporat al pool de colesterol

intracel·lular, des del qual serà utilitzat per a la síntesi de membranes cel· lulars o

dáltres molècules. Dáltra banda, l'augment de la concentració intracel·lular de

colesterol provoca la regulació a la baixa de la síntesi del receptor, activa

lésterificació del colesterol mitjançant lénzim acil CoA-colesterol-aciltransferasa i

lémmagatzema en forma d´èsters de colesterol i disminueix láctivitat dún enzim

clau en la síntesi endògena d'esteroids, l’hidroximetilglutaril (HMG) CoA

Introducció

27

reductasa [130]. Els teixits com el fetge, les gònades i les glàndules suprarenals que

requereixen gran quantitat de colesterol com a precursor de les sals biliars o de les

hormones esteroidees, tenen gran quantitat de receptors d´LDL.

1.5.2 Proteïna relacionada amb el receptor d´LDL (LRP)

La proteïna relacionada amb el receptor d´LDL –LRP- (de lánglès LDL receptor

related protein) específic de lápoE és una proteïna molt similar al receptor d´LDL

[131], amb un pes molecular de 600 kDa i que conté 4400 aminoàcids. L´LRP té 4

repeticions de la part extracel.lular del receptor d´LDL, el domini transmembrana i

una part citoplasmàtica més llarga que la del receptor d´LDL. Aquest receptor

séxpressa principalment en el fetge i la seva expressió no està regulada pel

contingut intracel·lular del colesterol.

L´LRP està considerat el receptor dels quilomicrons residuals ja que la inhibició

de la seva activitat per una proteïna antagonista (RAP) provoca l'acumulació de

quilomicrons en plasma [132]. En el procés de retirada dels quilomicrons pel

receptor LRP, aquests pateixen una pre-captura en l'espai sinusoïdal on són

enriquits amb apo E i després són captats pel receptor.

1.5.3 Receptor d’VLDL

El gen del receptor de VLDL es troba en el cromosoma 9 i la seva organització

genètica és molt similar a la del receptor d´LDL. Tot i que aquest receptor és molt

similar estructuralment al receptor d´LDL, la principal diferència radica en el

domini dúnió, que conté 8 repeticions riques en cisteïna en lloc de las 7 que té el

receptor d´LDL. Aquesta diferència permet que el receptor d’VLDL reconegui

específicament lápoE, però no lápoB-100. El receptor de VLDL séxpressa

principalment en múscul i teixit adipós, que són teixits on els àcids grassos són

utilitzats activament com a font energètica. No obstant això, el seu paper fisiològic

exacte no està ben definit [133].

Introducció

28

1.5.4 Receptors Scavenger

Inicialment, dos tipus de receptors scavenger que séxpressaven principalment

en macròfags, van ser clonats i seqüenciats en ratolins, humans i conills

[134][135][136]. Ambdós receptors, anomenats de tipus A (SR-A), són proteïnes

integrals de membrana amb una estructura trimèrica [137] i amb capacitat de

reconèixer LDL modificades. El receptor SR-AI és una proteïna amb un pes

molecular de 220 kDa i 453 aminoàcids. Cada monòmer presenta 6 dominis

estructurals: un domini citoplasmàtic, un domini transmembrana, un domini

espaiador, un domini en α-hèlix, un domini dálta homologia amb el col·lagen i un

domini ric en cisteïna. El receptor SR-AII és molt similar a lánterior amb

léxcepció que no té el domini ric en cisteïna.

Recentment, s´ha caracteritzat un receptor de tipus SR-B que no presenta cap

similitud estructural amb els SR-A. El CD36 és una glicoproteïna de 88 kDa amb

dos dominis transmembrana, dos dominis curts citoplasmàtics i un domini central

extracel·lular [138]. Séxpressa principalment en teixits amb un metabolisme dels

àcids grassos elevat com el múscul i el teixit adipós. Tot i que inicialment es va

caracteritzar basant-se en les seves propietats dúnió a fosfolípids aniònics i LDL

oxidades, recentment s´ha descrit que pot unir partícules natives de VLDL, LDL i

HDL [139].

1.5.5 Receptors d´HDL

El CLA-1 humà i el seu homòleg murídic, el receptor SR-BI, són els primers

receptors rellevants fisiològicament de les partícules d´HDL que s´han identificat.

L´SR-BI és una proteïna similar estructuralment al CD36, que té 509 aminoàcids,

amb un pes molecular de 57 kDa i que presenta una elevada homologia entre

espècies [140]. L´SR-BI séxpressa principalment en el fetge i en els teixits

esteroidogènics, súneix a les partícules d´HDL i facilita el transport selectiu

d’èsters de colesterol cap a línterior de la cèl·lula [141] [142] [143]. L´SR-BI té una

influència crítica en la concentració i en la estructura de les HDL i té un paper

Introducció

29

rellevant en el transport d’èsters de colesterol als teixits esteroidogènics no

placentaris i al fetge, i en la secreció biliar [144] [145].

Recentment, s´ha identificat un nou receptor d´HDL anomenat cubilina, que

s’expressa en lépiteli absortiu del ronyó, de líntestí i de la placenta. Aquest

receptor té la capacitat de mediar léndocitosi d’HDL per a la seva posterior

degradació lisosomal i sembla que pot tenir un paper molt important en la

captació de vitamina B12 per líntestí, en la reabsorció a nivell renal de lápoA-I

del filtrat glomerular i en el transport de colesterol de la mare al fetus [146].

1.5.6 ATP-Binding Cassette transporter A1 (ABC-A1)

La topologia d’aquesta proteïna correspon a una proteïna amb 12 dominis

transmembrana i dos llocs d’unió a ATP intracel·lulars que podrien proporcionar

energia per a la transferència de lligands [147].

L’identificació i caracterització d’aquesta proteïna es va realitzar quan

s’estudiava el gen causant de l’enfermetat de Tangier. Els subjectes afectes

d’aquesta malaltia tenen uns nivells d’HDL extremadament baixos i presenten

acumulacions d’èsters de colesterol donant lloc a hepatoesplenomegàlia,

amígdales de color groc-ataronjat i major risc d’arteriosclerosi [148]. Aquesta

malaltia és deguda a defectes en el gen ABC-A1. Els defectes en la proteïna

resultant d’aquest gen es tradueixen en un eflux defectuós de fosfolípids i

colesterol cel·lular cap a les HDL, per la qual cosa el transport revers de colesterol

queda severament alterat [149].

Introducció

30

2 ARTERIOSCLEROSI

L’arteriosclerosi és un procés patològic multifuncional que afecta a les arteries.

La manifestació de la malaltia a nivell coronari i les seves complicacions

trombòtiques són responsables de més de mig milió de morts a l’any convertint-se

en la malaltia més prevalent de la societat moderna. Observacions clíniques i

patològiques revelen que en el desenvolupament de les síndromes agudes

mediades per trombosi la composició de la placa arterioscleròtica juga un paper

molt més important que la seva grandària (severitat de l’estenosi). Així, plaques

més vulnerables i trombogèniques s’associen amb lesions més riques en lípids,

mentre que les que tenen un alt contingut en col·lagen són plaques dures i fibroses

[150].

Figura 3. Evolució de la lesió arterioscleròtica.

Imatge adaptada de Ross, R.. The New England Journal of Medicine 1999; 340 (2):115-126.

Introducció

31

2.1 Desenvolupament de la lesió arterioscleròtica

Els estudis morfològics han proporcionat importants respostes sobre l’evolució

de la placa d’ateroma [151].

El primer estadi de la lesió (lesió tipus I) només és identificable bioquímicament

i mitjançant microscòpia i consisteix en una acumulació de lipoproteïnes i

macròfags amb petites acumulacions intracel·lulars de lípids en zones susceptibles

a la formació de lesions de la íntima (figura 3). En aquests mateixos punts es

desenvoluparan posteriorment les anomenades estries grasses (lesions tipus II)

caracteritzades per l’acumulació subendoltelial de cèl·lules escumoses (macròfags i

en menor quantitat cèl·lules musculars llises amb acumulació intracel·lular de

lípids). Cada lesió està formada per una o més capes de cèl·lules escumoses

carregades de lípids. En els llocs en que preferentment es troben les estries grasses

es desenvolupen formes de transició cap a la placa avançada. La progressió

d’aquestes plaques s’associa amb una seqüència de canvis que s’inicien amb

l’aparició de lípid extracel·lular que forma una capa íntima molt més pronunciada

(lesió tipus III). L’ extensa acumulació de lípids extracel·lulars i la formació d’un

nucli acel·lular ric en lípids (sobretot colesterol lliure i els seus èsters) són

característics de les lesions de tipus IV. Aquest tipus de lesió es troba habitualment

cap a la tercera dècada de la vida. En les lesions més extenses de tipus IV (que

conjuntament s’anomenen lesions avançades) molts dels canvis patològics

s’extenen a la part adjacent o a través de tota la capa media, de forma que aquesta

pot contenir gran nombre de cèl·lules escumoses. Les lesions de tipus V es

caracteritzen pel fet que les cèl·lules musculars llises migren cap al core lipídic i

proliferen al seu interior, formant una capa sobre la cara luminal d’aquest centre

lipídic. Aquesta lesió es coneix com a fibroateroma. Es produeix més col.lagen i la

placa augmenta la seva grandària, fent que el core lipídic quedi sense perfusió

convertint-se en un maremàgnum de macròfags i cèl·lules mesenquimàtiques

mortes amb abundants cristalls de colesterol lliure. Les lesions que tenen dipòsits

trombòtics visibles amb o sense hemorràgia, a més de lípid i col.lagen, s’anomenen

plaques fibroateromatoses complicades o lesions complexes, i es classifiquen com

Introducció

32

a lesions de tipus VI. En ratolins, el component trombòtic és menys prominent

degut a les diferències en el sistema fibrinolític i l’obstrucció aguda del vas és

relativament poc freqüent [152]. A partir de la cinquena dècada de vida moltes de

les lesions es presenten en un estadi molt avançat i en la seva composició poden

predominar les calcificacions (lesions tipus VII) o el teixit fibrós (lesions tipus

VIII).

Introducció

33

3 MODELS MURÍDICS D’HIPERLIPÈMIA I ARTERIOSCLEROSI

Els estudis que utilitzen animals genèticament modificats (transgènics o

“knockouts”) han permès l’abordatge experimental in vivo de les conseqüències

d’una modificació genètica.

No hi ha dubte que el ratolí ha esdevingut, gràcies a les tècniques d’enginyeria

genètica, el model més àmpliament utilitzat per l’estudi de les lipoproteïnes. El

descobriment i anàlisi de varis gens i rutes cel·lulars específiques han incrementat

el nostre coneixement sobre la fisiopatologia bàsica de les lipoproteïnes i dels

estadis inicials del desenvolupament de la placa [153].

• Ratolins C57BL/6

A principis dels anys 80 Paigen i col·laboradors van descobrir que hi havia

soques de ratolins susceptibles de formar lesió arterioscleròtica quan èren

alimentats amb una dieta rica en greixos i colesterol [154]. Aquestes soques com la

C57BL/6 desenvolupaven lesions amb cèl·lules escumoses en l’espai subendotelial

a prop de les vàlvules aòrtiques, mentre que no ho feien altres soques resistents.

Tot i que aquest model té les seves limitacions (les lesions generades són molt

petites i es troben només a nivell de les vàlvules aòrtiques i, a l’inrevés del que

passa en humans, aquestes estries grasses no progressen cap a plaques fibroses)

els ratolins C57BL/6 han esdevingut un paradigma de sistema control per l’anàlisi

de l’atenuació o potenciació de l’arteriosclerosi en diferents ratolins modificats

genèticament.

• Ratolins deficients en apoE (apoE-/-)

Els ratolins apoE-/- van ser descrits el 1992 i desenvolupen una fenocòpia

d’hiperlipèmia humana tipus III amb una hipercolesterolèmia severa en dieta

estàndard degut a acumulacions de quilomicrons i romanents d’VLDL. A més, els

Introducció

34

ratolins apoE-/- desenvolupen lesions arterioscleròtiques espontànies en la regió

proximal de l’aorta i plaques fibroses disperses a tot el llarg de l’arbre aòrtic en

una distribució similar a l’arteriosclerosi humana [155].

Tot i que l’absència d’apoE es considera una condició realment extrema i de

freqüència bastant rara en humans aquest model s’ha usat abastament per a

l’estudi dels esdeveniments bioquímics i cel·lulars que condueixen a l’iniciació,

progressió, atur i regressió de la placa arterial.

• Ratolins deficients en el receptor d’LDL (rLDL-/-)

Descrit per primer cop en 1993 per Ishibashi et al [156]. En resposta al pinso

normal els ratolins deficients en el receptor d’LDL desenvolupaven una

hipercolesterolemia moderada amb uns nivells de colesterol d’aproximadament

250 mg/dL degut principalment a les acumulacions de colesterol d’LDL. D’altra

banda, però, aquests animals són extremadament sensibles a l’hipercolesterolemia

induïda per dieta . Així, en resposta a dieta rica en greixos tipus “Western”, els

ratolins rLDL-/- desenvolupen hipercolesterolemia severa amb uns nivells de

colesterol d’entre 1000-2000mg/dL i lesions arterioscleròtiques robustes en tot

l’arbre aòrtic [157]. Si aquests animals èren alimentats amb dieta rica en greixos i

amb colat, els nivells de colesterol s’elevaven fins a >1500 mg/dL acompanyats

d’una xantomatosi massiva i lesions arterioscleròtiques severes [158].

• Ratolins transgènics de la PTEC

Els ratolins transgenics del gen de la PTEC tenen una concentració plasmàtica

de colesterol inferior a la dels ratolins controls, degut a un descens de la

concentració de colesterol d’HDL [159].

L’hiperexpressió de PTEC aïllada augmenta les lesions d’arteriosclerosi aòrtica

en ratolins [160]. Aquesta proteïna podria tenir una acció variable sobre l’aparició

d’arteriosclerosi en funció de diverses circumstàncies metabòliques. Per exemple,

una activitat incrementada de PTEC podria tenir un efecte proaterogènic en

Introducció

35

situació de normotrigliceridèmia i antiaterogènic en una situació

d’hipertrigliceridèmia [159] [160].

Introducció

36

4 TRETS DIFERENCIALS DEL METABOLISME LIPOPROTEIC I EL DESENVOLUPAMENT D’ARTERIOSCLEROSI EN RATOLINS

A l´hora de plantejar experiments en el camp del metabolisme lipoproteic i

lárteriosclerosi en ratolins, i déxtrapolar a l´ésser humà la informació obtinguda

en aquests models animals, s´ha de tenir en compte que hi ha algunes diferències

importants entre el metabolisme lipoproteic i el desenvolupament dárteriosclerosi

en humans i en ratolins:

• Mentre que en plasma humà els valors normals de colesterol total oscil.len

entre 150 i 250 mg/dL i la major part dáquest es troba associat a les LDL, en

els ratolins de la majoria de les soques alimentades amb una dieta pobra en

greixos, els valors de colesterol plasmàtic són inferiors a 100 mg/dL i la

major part dáquest es troba associat a la fracció d´HDL. En aquesta situació

els ratolins no desenvolupen cap lesió o bé en desenvolupen dínsignificants

[161] [162].

• Un aspecte de particular interès és que quan els ratolins són alimentats amb

una dieta rica en greixos i colesterol, els nivells de colesterol plasmàtic

augmenten fins a 200-300 mg/dL. Aquest increment és degut a un augment

considerable del colesterol de les partícules que contenen apoB,

majoritàriament de les VLDL. Dáquesta manera i passats uns mesos,

algunes soques de ratolins com la soca C57BL/6 desenvolupen lesions

arterioscleròtiques significatives que majoritàriament es presenten en

léstadi déstria grassa [161] [162].

• En la soca de ratolins C57BL/6, les HDL constitueixen una població

monodispersa dúna grandària aproximada de 9,9 nm [163], la qual cosa

contrasta amb l´heterogeneïtat de les HDL humanes (6.8 a 10 nm).

Introducció

37

• Les apolipoproteïnes majoritàries de les HDL són, com en els humans,

l'apoA-I (60-80 %), i l'apoA-II. En el cas de l'apoA-II del ratolí, l'absència

d'una cisteïna en posició 6 impedeix la formació de ponts disulfur i la

formació dúna estructura dimèrica, com en el cas de l'apoA-II humana. Per

aquest motiu, mentre que en humans la major part de l'apoA-II es troba en

forma dún dímer de 16 kDa, el pes molecular de lápoA-II del ratolí té uns 8

kDa [164].

• Mentre que en humans lénzim editor d’apoB s’expressa exclusivament a

líntestí, els ratolins presenten láctivitat editora tant a l’intestí com al fetge.

Per tant, i en contraposició amb el que es troba en humans, les partícules

lipoproteïques de ratolí que contenen apoB d’origen hepàtic presenten una

elevada proporció dápoB-48 [165].

• Els ratolins només presenten una única isoforma de lápoE, que per

l’absència de residus cisteïna és similar a lápoE4 humana [166].

• Els ratolins no presenten apo(a) en plasma [167].

• A diferència dels humans, els ratolins pràcticament no presenten activitat

PTEC en el plasma [168].

• Mentre que no es troba activitat LH preheparínica detectable en plasma

humà (es troba lligada a membrana), els ratolins presenten un 40-50% del

total de láctivitat LH, lliure en plasma [169].

• Els ratolins presenten una activitat PTL-2 més elevada en plasma en

comparació a la dels humans [170].

Introducció

38

5 FENITOïNA (PHT)

També anomenada difenilhidantoïna o Dilantin® va ser sintetitzada en 1908 per

Biltz però fins al 1938 no es va utilitzar pel tractament de l’epilèpsia. El

descobriment de la fenitoïna va ser una fita important en el camp de l'epilèpsia pel

fet que aquest fàrmac, a dosis ordinàries, era capaç de tenir una acció

anticonvulsiva sense produir somnolència.

5.1 Estructura i biotransformació

La PHT és un àcid orgànic feble i poc soluble en aigua de nom genèric: 5,5-

difenilhidantoïna (en forma àcida). El seu nom en el Chemical Abstracts ve

classificat com 5,5-difenil-2,4-imidazolidinediona. El seu aspecte és el de una pols

de color blanca, cristal.lina, de gust insípid i inodora. La sal de sodi també es

presenta en forma de cristalls blancs però és lleugerament més higroscòpica i té un

gust bàsic més amargant. Si s’exposa a l’aire, la PHT absorbeix CO2 i allibera l’àcid

lliure. La seva estructura química es mostra en la figura 4. Sembla essencial un

substitutiu 5-fenil o altra de tipus aromàtic per llur activitat contra les convulsions

tònico-clòniques generalitzades. Els substitutius alquil en posició 5 contribueixen a

la sedació, propietat que no té la PHT.

El pes molecular de la PHT com a àcid lliure és de 252,27. El seu metabolisme és

similar en humans adults i en ratolins. Aquesta és eliminada, gairebé

completament, en forma de metabòlits abans de la seva excreció. Menys del 5% de

la dosi administrada s’excreta intacta en orina. La principal ruta metabòlica en

humans és 5-(4-hidroxifenil)-5-fenilhidantoïna (p-HPPH) i dihidrodiol (figura 4 –

fletxes en negreta -) que dona raó del 70-90% de la PHT administrada.

El primer pas d’aquesta ruta, que implica a l’enzim areno oxidasa (A.O.),

exhibeix una cinètica enzimàtica no-linear, la qual cosa comporta efectes

significatius sobre la farmacocinètica clínica del fàrmac. La major part de p-HPPH

Introducció

39

i dihidrodiol en humans són excretats com a (S) enantiòmers i es produeixen a

través d’un intermediari precurssor comú de l’òxid d’arè. En el cas de l’hidrodiol

aquesta reacció està catalitzada per l’epòxid hidrolasa microsomal [171].

L’hidrodiol es transformarà en catecol a través d’una deshidrogenació i finalment

en 3-O-metilcatecol on sembla que està involcrutat l’enzim catecol-O-

metiltransferasa. D’altra banda, el p-HPPH el trobarem en orina conjugat amb

l’àcid glucurònic.

GLUCURONAT

GLUCURONAT

GLUCURONAT

GLUCURONAT GLUCURONAT

HN

NHO O

O

EPÒXID

4,4'-DIHIDROXIFENITOÏNA

HN

NHO O

OH

OH

HN

NHO O

FENITOÏNA

HN

NHO O

OHOCH3

3-O-METILCATECOL

HN

NHO O

OHOH

CATECOL

HN

NHO O

OHOHH

H

DIHIDRODIOL

E.H.

A.O.OH

OH

HN

NHO O

m-HPPH

HN

NHO O

p-HPPH

HN

NO OGLUCURONAT

N-GLUCURONAT

Figura 4. Estructura i ruta metabòlica de la PHT.

Introducció

40

Cal remarcar que la bioactivació de la PHT via areno oxidasa ocorre en els

microsomes hepàtics a nivell del citocrom P450, en les variants CYP2C9/10 [172].

Petites variacions d’aquestes isoformes poden provocar canvis substancials en la

producció de p-HPPH.

Taula 3. Paràmetres farmacocinètics de la PHT.

pKa 8.3

Marge terapeùtic (adults) 40-80 µmol/L

Temps per arribar a Cmax (Dosi Oral única) 4-7 hores

Volum de distribució 0.6 L/Kg

Km 4-59 µmol/L

t ½ (Dosi Oral única) 4-22 hores

Fracció unida a proteïnes (adults) 90%

5.2 Efectes farmacològics

La PHT exerceix una activitat anticonvulsiva sense produir repressió general

del SNC i produeix un bloqueig de la potenciació post-tetànica que afecta a la

transmissió sinàptica de diferents maneres:

• Alteració dels fluxes iònics (sodi, potassi, clor) associats amb

despolarització, repolarització i estabilitat de membrana.

• Captació de calci en els terminals presinàptics i en el metabolisme energètic

del calci.

• Bomba de sodi-potassi depenent d’ATP.

• L’acumulació de nucleòtids cíclics

• Fosforilació de la proteïna sinàptica depenent de calci i alliberament del

transmissor.

Introducció

41

• Estimulació del cerebel.

En models animals d’epilèpsia la PHT anul·la, de manera selectiva, la fase

tònica del patró de les convulsions màximes per electroshock tot i que , per contra,

pot intensificar i perllongar la fase convulsiva clònica residual. La PHT

administrada per via intravenosa inhibeix les convulsions en el model d’activació

induïda [173].

5.3 Toxicologia

La major part dels problemes associats amb l’intoxicació per fàrmacs

antiepilèptics inclou la síndrome d’hipersensibilitat als anticonvulsius i efectes

indesitjables observats durant i després de l’embaraç.

La sobredosi per PHT és debilitadora i presenta algunes caracterítiques

específiques (ex: nistagme, ataxia, somnolència) durant els estadis inicials i/o

lleus. La sobredosi per PHT rarament és fatal i normalment es soluciona

interrompent immediatament el tractament.

Normalment la mesura de la fracció lliure de PHT és l’índex preferit de

l’activitat anticonvulsiva disponible. Nivells de PHT lliure per sota de 2,1 µg/mL

no acostuma a produir neurotoxicitat induïda per PHT.

5.4 Metabolisme de la fenitoïna

La PHT ha d’arribar fins als seus receptors del cervell abans no realitza els seus

efectes eficaços. Això implica:

A/ Moviment de la PHT desde el tracte gastrointestinal fins a la circulació

sanguínea (absorció).

B/ Distribució des de sang i fluids extracel·lulars cap a les cèl·lules, sinapsis i

altres llocs receptors.

Introducció

42

C/ Trànsit des de les membranes cèl·lulars cap a dins les cèl·lules i d’aquí cap a

les organel·les subcel·lulars.

• ABSORCIÓ

L’absorció de PHT des del seu lloc d’entrada en el cos depend del seu pKa i

solubilitat lipídica, del pH del medi on es dissol la PHT, de la seva solubilitat en el

medi i de la seva concentració.

L’absorció de PHT en l’estòmac és molt pobre ja que és insoluble al pH del suc

gàstric (a voltant de 2.0). Donat que la PHT té un pKa de 8.31, aquesta es troba en

l’estòmac en la seva forma no-ionitzada i és absorbida per difusió passiva.

El pas cap al duodè , on la PHT aconsegueix un pH de 7-7.5, la major part del

fàrmac es troba en forma ionitzada i per tant més soluble pel fluid intestinal. Els

àcids biliars, a més, incrementen la solubilitat del fàrmac. La màxima absorció de

PHT es dona a nivell del duodè, ja que és on l’àrea d’absorció és més gran, amb

més vascularització i un fluxe sanguini també més elevat. L’absorció en el ieiú i

íleum és més lenta que en el duodè i és molt pobre en el colon. L’absorció rectal és

escasa o gairebé nul.la [174].

Fins i tot al pH més alt del fluid intestinal la PHT és relativament insoluble i la

seva capacitat de ser absorbida depèn principalment de la taxa a la que pot entrar

en el torrent sanguini i ser emmagatzemada en greix, unir-se a plasma i

constituents dels teixits, ser biotransformada pel fetge i finalment ser excretada en

forma de bilis o orina. Donat que la major part de la PHT en solució es troba en

forma no-ionitzada i és relativament soluble en lípid, aquesta és ràpidament

absorbida a través de les membranes lipídiques de les cèl·lules mucoses del tracte

intestinal; per tant, el pas a través d’aquestes cèl·lules no és un factor limitant. Així

doncs, la dissolució en els fluids gastrointestinals és el procés taxa-limitant en

l’absorció de PHT. Tanmateix, qualsevol factor que interferís la dissolució de PHT

o la solubilitat en els fluids intestinals retrassaria la seva absorció.

Introducció

43

L’absorció de PHT no és uniforme i s’ajusta a un model de cinètica no-lineal ja

que a altes concentracions del fàrmac es produeix una saturació dels enzims que

metabolitzen la PHT. Només a baixes concentracions de PHT es podria aplicar una

cinètica lineal per estimar la seva biodisponibilitat [175].

En humans, després de l’administració oral d’una dosi, s’aconsegueix un pic

d’absorció a les 4-8 h de la seva ingestió, tot i que aquest pic podia oscil.lar entre

les 3 h i les 12 h després de la seva administració. Aquest lapse de temps era més

gran quan la dosi s’incrementava [176].

L’absorció de PHT és més lenta quan s’injecta intramuscularment que quan és

administrada per via oral [177]. Degut a la seva pobre solubilitat en aigua es

produeixen deposicions cristalines de PHT en el múscul que provoquen petites

àrees hemorràgiques al voltant dels cristalls [178], enlentint l’absorció.

• DISTRIBUCIÓ

La PHT s’uneix a proteïnes ràpidament i reversiblement en entrar al sistema

circulatori. En humans el promig d’unió és d’un 90%, a 37oC, tot i que amb l’edat

es dona un lleuger increment de la fracció lliure (no unida) en individus normals.

El sexe, en canvi, no exerceix cap influència sobre la unió a proteïnes plasmàtiques

[179].

Aquesta unió està directament relacionada amb l’albúmina plasmàtica i la

concentració total de bilirrubina. Existeix competència entre la PHT i la bilirrubina

endògena pels llocs d’unió a la molècula d’albúmina [180].

A més de la tiroxina i triiodetironina hi ha altres fàrmacs (àcid valproic, àcid

salicílic, fenilbutazona, sulfafurazol i acetazolamida ) que s’uneixen a aquestes

mateixes proteïnes i competeixen pels llocs d’unió amb la PHT desplaçant-la [181].

També hi ha compostos de caràcter endògen com els àcids grassos i la bilirrubina

que, en nounats, desplacen la PHT de les proteïnes plasmàtiques [182].

Introducció

44

La unió de PHT és veu reduïda en condicions d’urèmia, malaltia hepàtica i

SIDA com a conseqüència d’una disminució de les proteïnes plasmàtiques. Els

esteroides femenins sexuals competeixen amb la PHT per a la seva transformació

pels enzims microsomals del fetge [183].

La vida mitja en plasma ve definida com el temps necessari per a que la

concentració del fàrmac en plasma es redueixi al 50%. En humans, la vida mitja de

la PHT després de l’administració oral de dosis que es trobin dins dels marges

terapèutics es troba al voltant de les 22 h, amb un rang de 7-42 h. Per administració

intravenosa la vida mitja és més curta, amb rangs que van de les 10 a les 15 h. En

nadons i nens la PHT s’elimina a una taxa més alta que en adults (1,2-16,1 h a

dosis baixes i 11,6-31,5 h a dosis més altes quan els nivells plasmàtics es troben

entre 10-20 µg/mL) [184].

La PHT és present en més altes concentracions dins les cèl·lules que en el fluid

extracel·lular, degut a la seva avidesa a unir-se a cèl·lules, emmagatzemar-se en

greix i unir-se a proteïnes plasmàtiques. També es pot trobar en més alta

concentració en cervell, fetge, múscul i greix que en plasma en ratolins, rates, gats i

humans.

La PHT es distribueix en els fluids transcel·lulars com a forma lliure i inclou el

fluid cerebroespinal, saliva, semen, fluids gastrointestinals i bilis. L’excreció en llet

materna sembla que segueix una cinètica de saturació. La barrera placentaria és

creuada lliurement fins arribar a l’equilibri entre la mare i el fetus. La bilis conté

bàsicament metabòlits de la PHT que s’han format en el fetge els quals són

reabsorbits a la sang i excretats en orina [185].

• EXCRECIÓ

La PHT arriba a l’orina a través de la filtració glomerular i la reabsorció tubular,

mentre que el seu metabòlit principal, HPPH, que representa aproximadament el

70% del total de PHT excretada en orina, primer ha de ser glucuroniditzat per

després ser excretat per filtració glomerular i secreció tubular. Una part bastant

Introducció

45

nímia del fàrmac és excretada en femta [185]. La taxa d’excreció depèn de

l’extensió de la unió en plasma i com que en la PHT és molt alta (80-90%),

l’excreció és lenta. En rates, es necessiten unes 48-60 h per a la completa excreció

del fàrmac administrat de forma intravenosa; en humans, en canvi, són necessàries

unes 72-120 h tant si s’administra oralment com de manera intravenosa.

La saturació dels seus llocs d’unió i del seus reservoris és essencial per a que

s’assoleixin uns nivells estables en plasma i cervell.

6 ELS RECEPTORS NUCLEARS i EL METABOLISME LIPÍDIC

Els receptors nuclears funcionen com a factors de transcripció activats per

lligand que regulen l’expressió de gens diana i afecten processos tan dispars com

la reproducció, el desenvolupament i el metabolisme general.

A part dels receptors endocrins clàssics, que fan d’intermediaris de les

hormones esteroidees, tiroïdees i les vitamines A i D, existeixen els anomenats

receptors nuclears orfes. La major part d’aquests receptors orfes estàn implicats en

controlar l’homeostasi lipídica ja que governen la transcripció de tota una familia

de gens involucrada en el metabolisme, emmagatzament, transport i eliminació

dels lípids [186].

Els membres dels receptors nuclears orfes actuen com a heterodímers amb el

receptor retinoide X (RXR). Dins d’aquests podem incloure: els receptors regulats

per l’acció d’àcids grassos (PPARs), dels oxisterols (LXRs), dels àcids biliars (FXR)

i dels xenobiòtics [Receptor de xenobiòtics esteroides/Receptor X Pregnane

(SXR/PXR) i Receptor d’Androstans Constitutiu (CAR)].

• PPARs

Els PPAR (α, γ, δ) són activats per àcids grassos poliinsaturats, eicosanoids, i

diferents lligands sintètics. PPARα actua com a un regulador global del

catabolisme dels àcids grassos. La seva activació promou la transcripció de la

proteïna d’unió a àcids grassos en fetge (FABP) que fa d’amortidora dels àcids

grassos intracel·lulars i condueix els lligands de PPARα cap al nucli [187]. També

Introducció

46

promou l’expressió dels transportadors ABCD2 i ABCD3, que facilitaran el

transport dels àcids grassos cap als peroxisomes, i dels enzims CYPP4A

(CYP=citocrom P450) (catalitzadors del pas final en l’aclariment dels lligands de

PPARα).

PPARγ és el regulador principal de l’adipogènesi tot i que també juga un paper

important en la diferenciació cel·lular, sensibilització a la insulina, arteriosclerosi i

càncer. Els seus principals lligands són àcids grassos, metabòlits de l’àcid

araquidònic, fàrmacs antidiabètics (per exemple tiazolidinediones) i triterpenoids.

PPARγ governa l’expressió de la FABP adipocítica aP2 i de CYP4B1. En macròfags

indueix el transportador ABCA1 a través d’una via indirecta, involucrat en l’eflux

cel·lular de fosfolípids i colesterol a les HDLs [188].

PPARδ podria estar involucrat en el metabolisme lipídic en teixits perifèrics ja

que la seva activació produeix una regulació positiva del transportador ABCA1.

Els seus principals lligands comprenen àcids grassos de cadena llarga i

carboprostaciclina.

• LXR

Els LXR (α, β) actuen com a sensors del colesterol: regulen les elevades

concentracions de esterols i transactiven tot el conjunt de gens implicat en el

transport, catabolisme i eliminació del colesterol.

Mentre que LXRβ és ubicu, LXRα s’expressa principalment en fetge, teixit

adipós, ronyó, intestí, pulmó, adrenals i macròfags. Els LXRs s’activen mitjançant

oxisterols produïts pel mateix organisme. En canvi, poden ser antagonitzats per

agents lipofílics tipus 22(S)-hidroxicolesterol, alguns àcids grassos insaturads i

geranilgeranil pirofosfat [189].

La cascada metabòlica de LXR inclou diferents transportadors d’esterols com

l’ABCA1 (en fetge, intestí, placenta, teixit adipós i melsa), ABCG1 i ABCG4 (en

macròfags), ABCG5 i ABCG8 (en fetge i intestí prim). En rossegadors, l’enzim

CYP7A1 és el principal gen diana implicat amb els LXR. El CYP7A1 codifica per a

l’enzim limitant en la via de biosíntesi d’àcids biliars neutres que és el principal

vehicle d’eliminació del colesterol de l’organisme.

Introducció

47

• FXR

Els lligands biològicament més rellevants per al FXR són certs àcids biliars i els

seus respectius metabòlits conjugats. Aquest receptor s’expressa tot al llarg del

sistema enterohepàtic i actua com a sensor biliar protegint l’organisme de

concentracions excessives d’àcid biliar.

L’activació de FXR produeix una regulació positiva d’ABCB11, un

transportador d’àcids biliars que incrementa el flux i la secreció d’aquestes

molècules a la bilis. Aquesta activació de FXR produeix una repressió de la

transcripció dels gens CYP implicats en la síntesi d’àcids biliars [190].

• CAR and PXR/SXR

Tot i que inicialment es va proposar que CAR era constitutivament actiu, ara se

sap que el fenobarbital i molècules similars produeixen una activació de CAR

mentre que els androstans l’inhibeixen. El fenobarbital indueix l’expressió del

transportador ABCC3 un membre de la subfamília de proteïnes relacionades amb

la resistència a múltiples fàrmacs [191]. En resposta als activadors, CAR indueix

l’expressió de CYP2B.

SXR i el seu ortòleg en rossegadors, el PXR reacciona davant d’esteroides, àcids

biliars i d’una gran varietat de fàrmacs i contaminants medioambientals. SXR, PXR

(i també CAR) s’expressen principalment en fetge i intestí prim.

L’activació de SXR/PXR pels xenobiòtics produeix una inducció de l’expressió

gènica de CYP3A, enzim responsable del metabolisme de més del 60% dels

fàrmacs utilitzats en clínica, i dels transportadors ABCB1 i ABCC2 que regulen

positivament els activadors d’SXR i agents quimioterapèutics com el Taxol.

En conjunt, l’activació xenobiòtica de CAR i SXR/PXR indueix una resposta

global que permet a l’organisme detoxificar-se de substàncies forànies.

Introducció

48

HIPÒTESI I OBJECTIUS

Hipòtesi i Objectius

51

Diversos estudis epidemiològics han demostrat una relació inversa entre el

colesterol d’HDL (cHDL) i la incidència de malaltia coronària. D’aquestes

observacions es va concloure que un increment del 1% en el cHDL estava associat

a una reducció del 3% dels events coronaris [192]. En humans, s’ha demostrat que

el tractament amb anticonvulsius com la PHT redueix la incidència de malaltia

coronària en un 29%, i que aquest efecte podia ser atribuït, en part, a un increment

en el colesterol de HDL [193][194][195].

L´ús de ratolins modificats genèticament ha permès d´obtenir una valuosa

informació sobre l’efecte de determinats tractaments farmacològics en el

metabolisme lipoproteic i la susceptibilitat a l´arteriosclerosi [196][197][198].

Tenint en compte els antecedents sobre el tema, la hipòtesi d’aquest treball és

que el tractament amb PHT indueix un augment dels nivells de colesterol d’HDL i

una reducció de l’àrea d’arteriosclerosi en ratolins.

En base a aquesta hipòtesi, els objectius de la present tesi van ser:

1- Quantificar les lesions arterioscleròtiques en diversos models de ratolí

tractats amb PHT i que desenvolupen lesions del tipus estria grassa o

arteriosclerosi avançada i estudiar si aquest fàrmac té algun efecte

protector sobre el desenvolupament de la lesió.

2- Determinar els mecanismes pels quals actua la PHT sobre el perfil

lipoproteic i avaluar la relació existent entre aquests canvis - especialment

a nivell de les HDL - i el desenvolupament d’arteriosclerosi.

Hipótesis i Objectius

52

MATERIALS I MÈTODES

Materials i Mètodes

55

1 ANIMALS I GRUPS EXPERIMENTALS

Com a animals experimentals vam utilitzar:

• Ratolins de la soca C57BL/6.

• Ratolins transgènics de la proteïna transferidora d’èsters de colesterol

(PTEC) del mico Cinomolgus (macaco) (soca UCTP-20) [199], cedits pel Dr.

George W. Melchior (Department of Molecular Biology Research and

Metabolic Diseases Research, Upjohn Laboratories, Kalamazoo, Michigan,

Estats Units). Els nivells d’activitat PTEC en els ratolins de la línia UCTP-20

van ser de l'ordre d’aproximadament 8 vegades l’activitat PTEC humana.

• Ratolins knockout per l’apoE (apoE-/-). Aquests van ser creats amb amb

129/Ola background i encreuats durant 5 generacions amb ratolins

C57BL/6[200]

• Ratolins knockout pel receptor d’LDL (rLDL-/-). Obtinguts d’un

background mixte C57BL/6J x 129Sv (50% C57BL/6J : 50%129Sv) [201].

Tots els ratolins utilitzats van ser adults d’aproximadament 3 mesos de vida.

1.1 Condicions ambientals i d’alimentació

Els animals es van mantenir en tot moment sota condicions control·lades de

temperatura (22 ± 1 ºC) i d'humitat (entre el 80 % i el 90 %). Els cicles d'il·luminació

de llum/foscor duraven 12 hores i començaven a les 7 del matí.

Els ratolins adults van ser alimentats ad libitum amb:

• Pinso de manteniment o dieta stàndard, específic per a rata-ratolí (Rodent

Toxicology diet, Beekay, B&K Universal). Els ratolins apoE-/- van ser

alimentats amb aquesta dieta durant 12 setmanes.


56

• Dieta rica en greixos i colesterol (que anomenarem dieta DRG). Aquest

pinso específic contenia: 75% dieta manteniment 5015, 1,25 % colesterol, 7,5

% greix i 0,5 % colat sòdic (TD 88051 Harlan Teklad, Madison, WI)

[154][202]. Els animals C57BL/6 i TgPTEC -/- van ser alimentats amb

aquesta dieta durant 12 setmanes i els rLDL-/- durant 9 setmanes.

• Dieta tipus Western (que anomenarem WTD, de l’anglés Western Type Diet)

que contenia un 21% de greix de llet deshidratada ,0,15% colesterol, un

19,5% caseína i un 34% de carbohidrats, principalment sacarosa (TD 88137

Harlan Teklad, Madison, WI). Els ratolins C57BL/6 -/- van ser alimentats

amb aquesta dieta durant 27 setmanes.

L'accés a l'aigua (aigua i/o PHT) també va ser lliure.

Quan els ratolins havien de ser dejunats, el dejuni va consistir en deprivar-los

d’aliment durant un període d’entre 12 i 14 hores però amb lliure accés a l’aigua.

1.2 Obtenció i processament de les mostres biològiques

Els ratolins van ser pesats a l’inici i al final del tractament just abans de ser

sacrificats per sobreanestèsia.

Durant tot el període de tractament la sang es va obtenir en tubs amb EDTA

com a anticoagulant i va ser centrifugada a 12.000 g durant 10 min a 4 ºC per

separar-ne el plasma. El plasma va ser guardat a -80 ºC per a posteriors anàlisis.

També es van extreure diferents teixits que van ser immediatament congelats amb

N2. Quant als teixits congelats, aquests van ser pesats i, en el cas del fetge, quan va

ser necessari, va ser trossejat en fragments d'entre 200 i 300 mg de pes i conservat a

-80 ºC fins al moment de les seves anàlisis.


57

2 TRACTAMENT AMB FENITOÏNA

Es van utilitzar mascles i femelles en tots els grups excepte en els ratolins

C57BL/6 amb dieta WTD i els TgPTEC amb dieta DRG en què només es van

estudiar les femelles. Es va utilitzar un mínim de 7-14 animals per grup i sexe que,

a principi del tractament, van ser agrupats segons el seu pes i concentració de

lípids.

El fàrmac (5,5-diphenyl-2,4-imidazoldinedione. SIGMA, St Louis, MO) es va

afegir a l’aigua de beguda, ajustada a un pH de 10.2, en una concentració de

30mg/mL en els animals tractats (grups PHT). Els animals control bebien aigua

ajustada a pH 10.2 però sense PHT. Setmanalment es mesurava el volum d’aigua

ingerit per individu. Les concentracions de PHT van ser controlats periòdicament

al llarg del tractament en un autoanalitzador TDX/ FLX TM (Abbott Científica,

S.A.).

3 DETERMINACIÓ DE DIFERENTS PARÀMETRES BIOQUÍMICS PLASMÀTICS I TISSULARS

La determinació de les concentracions de colesterol total, colesterol d’HDL,

triglicèrids, àcids grassos lliures, glucosa (Roche Diagnostics, Suïssa) i fosfolípids

(Wako Chemicals, Alemanya) tant en plasma com en les diferents fraccions

lipoproteiques, així com de les activitats transaminases plasmàtiques d’origen

hepàtic es van realitzar mitjançant mètodes enzimàtics i colorimètrics disponibles

comercialment adaptats a un autoanalitzador Hitachi 911 (Roche Diagnostics). El

colesterol de no HDL es va determinar restant el colesterol d’HDL del colesterol

total. Els triglicèrids de cadascuna de les mostres individuals van ser corregits

restant-ne la concentració de glicerol lliure present en el plasma de ratolí (Sigma).

La determinació de la concentració de proteïnes de les fraccions lipoproteiques es

va realitzar segons el mètode de Bradford, utilitzant reactius comercials (Pierce)

[203].


58

Per a quantificació del colesterol d’HDL es va utilitzar un mètode de

precipitació de lipoproteïnes que contenen apoB. Aquest es basa en l'ús d'àcid

fosfotúngstic-MgCl2 (Roche Diagnostics). S’afegeix aquest reactiu en una

proporció 2:1 respecte el volum de mostra i es centrifuga la mostra durant 3 min a

12000 g. Al final del procés, es va recuperar el sobrenedant (on es trobaven les

HDL) i es van quantificar el colesterol.

A continuació, es comenten breument els fonaments de les determinacions

d´aquests paràmetres segons els mètodes comercials emprats. Els coeficients de

variació interassaig van ser en tots els casos aproximadament <10%.

• Colesterol lliure: oxidació per acció de la colesterol oxidasa donant lloc a la

formació de colestenona i H2O2. L´H2O2 reacciona amb la 4-aminoantipirina

i el 4-fenol per acció de la peroxidasa i es produeix una condensació

oxidativa que produeix color vermell detectable a 505 nm.

• Colesterol total: trencament enzimàtic dels èsters de colesterol per acció de

la colesterol esterasa i posterior oxidació del colesterol que dóna lloc a la

formació de H2O2, aquesta per acció de la peroxidasa sofrirà la mateixa

reacció que pel colesterol lliure.

• Triglicèrids: acció de una lipasa lipoproteïca bacteriana que hidrolitza els TG

a glicerol, el qual per reacció oxidativa dóna lloc a dihidroxiacteona fosfat i

H2O2. Aquesta última tindrà la reacció amb la peroxidasa.

• Fosfolípids: reacció amb fosfolipasa D originat-se colina, la qual en presència

de colina oxidasa dóna lloc a betaïna i H2O2. Seguidament, té lloc la reacció

de l´H2O2 amb la peroxidasa.

Es van controlar els paràmetres bioquímics dels ratolins períodicament al llarg

del tractament sempre abans d’un dejuni de 12 hores amb lliure accés a l’aigua de

beguda.


59

4 ANÀLISI I QUANTIFICACIÓ DE L’ÀREA DE LESIÓ ARTERIOSCLERÒTICA

Al final del període de tractament, quan els animals van ser sacrificats, es va

extreure el cor amb l’aorta proximal i es van fer diferents rentats amb NaCl al

0,9%. La part basal del cor juntament amb l’aorta proximal es va incloure en un

motllo amb OCT (Tissue-Tek. Miles, Inc.) i es va congelar inmediatament sobre

una planxa d’acer en contacte amb N2 líquid. Les mostres es van guardar a –80ºC.

Amb l’ajut d’un criostat es van tallar seccions d’aorta, de 10µm de gruix a –

28ºC, sobre portes recoberts amb poly-L-lisina (Sigma, St Louis, MO). Les seccions

es van tallar de manera seqüencial començant just en el punt per sota del sinus

aòrtic i fins al punt de l’aorta en què les vàlvules han desaparegut. Les mostres es

van tenyir amb Oil Red O i es contratenyiren amb Hematoxilina [161].

Amb una càmera de video (TK-C621, JVC) adaptada al microscopi (Olympus-

BX50) i a un monitor ADI microScan 5V/5V+, es van capturar les imatges de

quatre seccions equidistants d’aorta de cada especímen, separades entre elles

80nm, i es va quantificar l’àrea de lesió mitjançant el programa PC Image per

Windows (PC Image,version 2.2.02. Foster Findlay Associates Ltd.). En el cas de

lesions proliferatives, l’àrea avaluada incloïa tota la lesió (des del lumen fins a la

paret del vas) i no només la part grassa. El resultat es va presentar com la mitjana

de l’àrea de lesió d’aquestes quatre seccions per a cada individu.

La quantificació de l’arteriosclerosi es va realitzar a cegues respecte l’origen de

les mostres.

5 FRACCIONAMENT LIPOPROTEIC PER ULTRACENTRIFUGACIÓ

L'aïllament de les lipoproteïnes plasmàtiques en funció de la seva densitat es va

realitzar per ultracentrifugació seqüencial preparativa mitjançant el mètode descrit

per Havel i col·laboradors [1].


60

Totes les lipoproteïnes es van aïllar per flotació a una densitat inferior a aquella

que li correspon (VLDL, d < 1,006 g/ml; IDL, d < 1,019 g/ml; LDL, d < 1,063 g/ml;

HDL, d < 1,21 g/ml) mitjançant la tècnica de la ultracentrifugació seqüencial. Les

ultracentrifugacions es van realitzar a 120.000 g en un rotor TI-45.6 o TFT-55.3,

segons el volum de la mostra, durant 20 hores a 4 ºC. Després de la

ultracentrifugació, les lipoproteïnes es van recollir del sobrenedant i l'infranedant

va ser barrejat fins a l'homogeneïtat. En cada cas, la densitat de l’infranedant es va

ajustar amb l'addició de KBr el càlcul mitjançant l'aplicació de la fòrmula

d'Steinberg [204]. La fase infranedant resultant del procés de separació de totes les

fraccions lipoproteïques rep el nom de plasma lliure de lipoproteïnes (LDP, de

l’anglès lipoprotein-depleted plasma).

Finalment, les diferents fraccions lipoproteiques i l'LDP es van dialitzar amb

tampó 0,1 M PBS [pH 7,4] (10 mM Na2HPO4; 4 mM KH2PO4 [pH 7,4]; 0,15 M NaCl;

2,7 mM KCl). La diàlisi es va realitzar utilitzant 50 volums de tampó al llarg de 2

dies a 4ºC.

6 MOBILITAT ELECTROFORÈTICA DE L’apoA-I DE RATOLÍ

Per determinar si la quantitat d’apoA-I murídica es veia modificada

quantitativament per efecte de la PHT es va utilitzar una electroforesi en gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE) al 15% per separar les proteïnes de la fracció HDL de

cadascuna de les línies de ratolí. Com a control positiu es va utilitzar apoA-I de

ratolí purificada [205]. Com a marcador de pes molecular es va emprar un

marcador d’ampli espectre (BioRad). La cursa electroforètica es va realitzar a un

voltatge constant, a temperatura ambient. El gel es va tenyir amb Blau de

Coomassie R-250 i es va escanejar per analitzar les dades en un densitòmetre Gel-

Doc 2000 (BioRad).


61

7 CAPACITAT DE LES HDL D’INHIBIR LA MODIFICACIÓ OXIDATIVA DE LES LDL

Vam determinar la mobilitat electroforètica relativa de partícules d’LDL

humana oxidades a les quals prèviament havien estat incubades amb HDL de les

diferents línies de ratolí tractats i controls (veure apartat 5) [206]. Aquestes van ser

dialitzades amb PBS en colummes de filtració en gel PD-10 (Pharmacia) per

extreure completament l’EDTA i KBr de les solucions. Es va utilitzar el fosfolípid

com a paràmetre d’estandardització per poguer carregar quantitats similars de

lipoproteïna. L’oxidació va iniciar-se amb 5,5 µmol/L CuSO4 en un tub que

contenia 0,3 mM de fosfolípid d’LDL (equivalent a mM de colesterol total o 250

µg/mL d’apoB) i 0,4 mM de fosfolípid d’HDL (0,5 mL de volum final). Es van

incubar les mostres en absència de llum i a 37ºC durant 2 h 30 min i es va aturar

l’oxidació afegint 50 µM EDTA i 20 µM d’hidroxitoluè butilat (BHT). En un gel

d’agarosa (Midigel) es van carregar alíquotes de 8 µL i es van deixar còrrer durant

40 min a 90 V. Després de dessecar el gel, aquest va ser tenyit amb Negre Sudan.

Es va avaluar la mobilitat electroforètica relativa de les bandes d’LDL amb un

densitòmetre (Gel Doc 2000) i el seu software associat (Quantity One) de BioRad.

La mobilitat electroforètica relativa es va definir com la distància de migració de

l’LDL “problema” respecte l’LDL nativa (a la que assignem valor 0) i l’LDL

completament oxidada (valor 100).

8 EXPERIMENTS D’EFLUX CEL·LULAR DE COLESTEROL

Es van utilitzar cèl·lules Fu5AH d’hepatoma de rata per avaluar la capacitat del

sèrum de ratolí, tractat amb PHT o control, per promoure l’eflux de colesterol en

cultiu. El medi emprat per als experiments va ser el Eagle’s Minimal Essential

Medium (EMEM) (BioWhittaker) per als cultius amb hepatòcits. Aquest medi es va

suplementar amb 0,5% Gentamicina, 5% Sèrum Boví fetal i 1% d’albúmina.


62

L’eflux de colesterol dels hepatòcits Fu5AH de rata en es va determinar

mitjançant el comptatge de la radiactivitat en el medi després d'un període

d'incubació de 4 hores a 37 ºC amb els plasmes de ratolí a una concentració final

del 5 % en el medi de cultiu cultiu, tal i com està descrit [207].

L'eflux de colesterol fraccional es va calcular com la quantitat de comptes

alliberats al medi en relació als comptes totals a cada pou. Totes les

determinacions es van fer per duplicat. Totes les mostres d'un individu van ser

utilitzades en el mateix assaig per assegurar que totes elles estiguessin exposades a

les cèl·lules en un estat idèntic i el control interassaig emprat va consistir en una

barreja de plasmes de ratolins controls. Els coeficients de variació intra- i inter-

assaig assolits van ser 2,3 % i 3,7 %, respectivament.

9 CINÈTICA CATABÒLICA IN VIVO DE LES HDL DE RATOLÍ MARCADES AMB [3H]-COLESTERIL OLEÏL ÈTER

L'aclariment de les HDL in vivo va ser estudiat mitjançant l'ús d'anàlegs no

hidrolitzables, com el colesteril oleïl èter. Aquest compost resulta molt útil per

estudiar el destí d'aquestes lipoproteïnes donat que no és hidrolitzat pels teixits

diana.

9.1 Marcatge de les HDL amb [3H]- colesteril oleïl èter

Les HDL obtingudes de plasma de les diferents línies de ratolí, tractades i

controls, van ser marcades amb [3H]-colesteril oleïl èter (5 µCi/grup) (Amersham)

adaptant el mètode descrit per Morton i Zilversmit [208]. El mètode emprat va

requerir de la presència a la mescla de reacció de marcatge de l'activitat PTEC

parcialment purificada per optimitzar el marcatge de les HDL. La quantitat

d’activitat PTEC utilitzada es va determinar empíricament en funció de la

quantitat de substrat disponible en cada cas.


63

Per a la formació del liposomes es van mesclar 5 µL/grup, 80 µl d’una solució al

0,021 % (p/v) d'hidroxitoluè-butilat en cloroform i 1,8 mg de lecitina d'ou en un

tub de vidre Pyrex de 10 ml de capacitat. A continuació, es va evaporar el solvent

orgànic sota un flux de gas N2, es van addicionar 8 mL de tampó Tris-salí [pH 7,4]

agitant vigorosament durant 10 min, i es va sonicar l’emulsió durant 10 min a < 50

W per obtenir liposomes de lecitina amb colesteril oleïl èter.

La fracció HDL de les diferents línies de ratolí es van incubar amb els liposomes

i amb la PTEC humana parcialment purificada durant 24 hores a 37 ºC en agitació

suau (60 cicles/min).

Després de l'intercanvi, les partícules HDL marcades ([3H]-HDL) es van separar

de les partícules donadores en dos pasos d'ultracentrifugació: en un primer pas, es

van separar els liposomes lliures donadors (que contenien [3H]-colesterol oleïl èter

no associats a les HDL) a una densitat d < 1,063 g/ml i, en un segon pas, les

partícules [3H]-HDL a una densitat d < 1,21 g/ml.

Les fraccions [3H]-HDL es van desalinitzar mitjançant cromatografia de filtració

en gel utilitzant columnes PD-10 (Pharmacia) amb tampó 0,1 M PBS [pH 7,4] i es

va determinar el contingut lipídic i proteic de la fracció [3H]-HDL. Les [3H]-HDL

de les diferents línies de ratolí es van aliquotar i conservar congelades a -80 ºC fins

al moment de la seva utilització.

La puresa i el volum d'elució de les partícules [3H]-HDL de les diferents línies

de ratolins, així com les seves característiques físico-químiques (grandària i

càrrega de partícula), es van avaluar mitjançant l'anàlisi electroforètica utilitzant

gels en gradient discontinu de poliacrilamida 2−3 % (Lipofilm, Sebia) i gels

d'agarosa Midigel Lipo (Biomidi), respectivament. Paral·lelament, a les HDL

marcades pretenyides amb Negre Sudan es van córrer mostres d'HDL natives de

les mateixes línies, també pretenyides, és a dir, no sotmeses a marcatge ni

manipulació alguna. Aquestes anàlisis van demostrar que el marcatge no va

afectar ni a la grandària, ni a la càrrega elèctrica de la partícula.


64

9.2 Cinètica catabòlica in vivo d’HDL de ratolí

La cinètica d'aclariment de les [3H]-HDL es va iniciar amb la injecció

intraperitoneal de 500.000 cpm per ratolí en 100 µl de 0,1 M PBS [pH 7,4] (∼ 20 µg

de proteïna HDL per ratolí, ∼ 10.000 cpm/µg de proteïna HDL). La massa d'HDL

injectada va ser sempre < 5 % de l'HDL total de ratolí. La sang va ser recollida en

tubs Eppendorf amb EDTA als temps indicats i la radiactivitat en 50 µl de plasma

es va determinar en un comptador β. Es van realitzar extraccions a 1, 3, 6 i 24 h

després de la injecció. La radiactivitat en plasma es va definir gràficament com el

tant per 1 respecte la quantitat total de la radiactivitat injectada. Per a cada grup, n

= 3−4. Les dades es van ajustar a una corba exponencial d'aclariment i es van

calcular les taxes catabòliques fraccionals (TCF) com a l’invers de l’àrea sota la

corba (GraphPad Prism v3.0. GraphPad Software, Inc. San Diego. USA).

Per verificar que la radiactivitat va continuar present en HDL i no en cap altra

fracció lipoproteica, es van prendre alíquotes puntuals de plasma a diferents

temps després de la injecció i es van aplicar en un gel d'agarosa. Després de la

cursa electroforètica es van recuperar les diferents fraccions lipoproteiques i es van

extreure els lípids. El residu lipídic de cadascuna de les fraccions lipoproteiques

separades en gel d'agarosa es va resuspendre en líquid de cintil·lació i es va

determinar la radiactivitat associada a cadascuna de les bandes. El resultat va

mostrar que la radiactivitat romanent en plasma sempre va estar majoritàriament

associada a la fracció HDL (> 85 %).

10 ANÀLISI D’EXPRESSIÓ GÈNICA EN FETGE DE RATOLÍ MITJANÇANT MICROARRAYS

Es va fer una anàlisi de l’expressió gènica en fetge de ratolins de les soques

C57BL/6 (dieta WTD) i rLDL-/- (dieta DRG) tractats amb PHT i controls. Per a

aquest fi es va emprar la plataforma Genechip® d’Affymetrix a través de

l’empresa Medplant Genetics (Biscaia). A continuació, es detalla la informació

tècnica sobre el protocol del treball realitzat.


65

10.1 Extracció d’RNA

Es va aillar l’RNA total de fetge dels ratolins utilitzant el mètode d’aïllament

d’RNA amb Trizol (Gibco/BRL). Aquest va ser purificat en columnes de Rneasy

Mini Kit spin (Quiagen). La concentració d’RNA es va determinar

espectrofotomètricament i es va realitzar una electroforesi en gel d’agarosa a l’1%.

Per confirmar la integritat de l’RNA.

10.2 Preparació i marcatge de l’RNA

Es va sintetitzar DNA de doble cadena usant Superscript Choice System

(GIBCO/BRL). Van ser necessaris 10 µg d’RNA total en la reacció de transcripció

reversa per sintetitzar un cDNA(-) amb un encebador que contenia polydT i les

seqüències de reconeixement de la polimerasa T7 d’RNA. Al cDNA de doble

cadena es va fer una extracció de fenol-cloroform seguit d’una precipitació amb

etanol. El cDNA es va resuspendre en 12 µL d’aigua lliure de RNAses i es van usar

10 µL d’aquest cDNA com a motllo per a la transcripció in vitro en presència de

UTP i CTP biotinilats per generar RNA antisentit marcat. La reacció de

transcripció in vitro es va realitzar usant Enzo BioArray High Yield RNA

Transcript Labelling Kit (Enzo Diagnostics). L’RNA marcat va ser purificat a

través de columnes Rneasy Mini Kit spin (Quiagen) i es va quantificar

espectrofotomètricament.

10.3 Hibridació amb l’Array i escaneig.

El cRNA va ser fragmentat en un tampó de fragmentació (tampó 5x: Tris-

acetate 200 mM a pH 8,1/ KOAc 500 mM/ MgOAc 150 mM) i hibridat en els

microarrays en 200 µL de solució d’hibridació que contenia 15 µg de la mostra

marcada en tampó Mes 1x (Mes 0,1 M / NaCl 1,0 M /EDTA 20 mM /Tween 20

0,01%), 0,1 mg/mL DNA d’esperma d’arengada, 0,5 mg/mL BSA, 50 pM control

d’oligonucleòtids B2 i controls d’hibridació eucariòtics 1x (bioB, bioC, bioD, cre)

(Affymetrics). Els arrays Test3 (Affymetrix) van ser hibridats abans de l’expressió


66

dels arrays per confirmar la integritat del cRNA. En tots els casos la relació

GADPH 3’/5’ era inferior a 1,1. Les mostres es van hibridar en arrays de genoma

murídic U74Av2 (Affymetrics). Aquest array comprén unes 6000 seqüències

caracteritzades funcionalment en la base de dades Unigene de ratolí (Build 74) i

uns 6000 clusters EST.

Els arrays es van fer rotar a 60rpm durant 16h a 45ºC. Després de l’hibridació,

els arrays es van rentar primerament amb SSPE-T 6x (NaCl 0,9 M / NaH2PO4 60

mM / EDTA 6 mM /Tween 20 0,01%) a 25ºC en una estació de fluids

(Affymetrics) durant 10 cicles de 2 barreges/cicle i després amb Mes 0,1M/ NaCl

0,1 M/ Tween 20 0,01% a 59ºC durant 4 cicles de 15 barreges/cicle. Es van tenyir

els gels amb un conjugat de ficoeritrina-streptavidina (Molecular Probes), seguit

per 10 cicles de rentat amb 5 barreges/cicle amb SSPE-T 6x. A fi d’incrementar els

senyals, els arrays es van tenyir novament amb solució d’anticòs Anti-

streptavidina durant 10min a 25ºC seguit d’una tinció de 10min amb el conjugat

de ficoeritrina-streptavidina. Després de 15 cicles de rentat (4 barreges/cicle), els

arrays van ser escanejats amb un escaner confocal (Affymetrix). Les imatges

resultants es van analitzar amb el software Microarray Suite 5.0 (Affymetrix).

11 CÀLCULS ESTADÍSTICS I SUPORT INFORMÀTIC

Els resultats són presentats com la mitjana aritmètica acompanyada de l'error

estàndard. Quan l'error va ser petit, no va quedar representat a les figures, ja que

es va considerar inclós en el símbol. El nivell de significació es va representar amb

l’asterisc “*” amb P < 0,05.

Quan ha interessat comparar els grups de dades, per conèixer en quin grau les

diferències van ser significatives estadísticament, es va aplicar el test no

paramètric de comparació de mitjanes de poblacions diferents de la U de Mann-

Whitney segons el tipus d'experiment. Quan la població de dades es va ajustar a

una distribució normal, les comparacions de les mitjanes dels diferents grups es

van dur a terme mitjançant el test t d’Student. La correlació entre variables


67

quantitatives es va realitzar mitjançant anàlisis de regressió lineal després

d’agrupar les dades dels diferents grups d’animals. En el cas de la determinació de

lípids de les lipoproteïnes obtingudes per ultracentrifugació només es van

acceptar aquells resultats en què la suma del valor tant de colesterol com de

triglicèrids de les fraccions lipoproteiques no va ser diferent per més d'un 20 %

d’aquell valor determinat en el plasma.

RESULTATS

Resultats

71

1 EFECTE DEL TRACTAMENT AMB FENITOÏNA SOBRE LA SUSCEPTIBILTAT A L’ARTERIOSCLEROSI

1.1 Models murídics d’arteriosclerosi tipus estria grassa

1.1.1 Ratolins C57BL/6

• Dieta rica en greixos i colat (DRG)

Es va estudiar l’efecte de la fenitoïna sobre l’àrea de lesió arterioscleròtica en

ratolins de la soca C57BL/6 sotmesos a una dieta rica en greixos, colesterol i colat

(DRG) durant un període de 12 setmanes tant en mascles com en femelles.

La dieta DRG va induir en aquest model de ratolí la formació de lesions de

tipus estria grassa principalment localitzades en la base de les vàlvules aòrtiques

(figura 16).

CONTROL PHT CONTROL PHT

0

10000

20000

30000

40000

50000 FEMELLES MASCLES

P=0,005*

(23.48±6.77µM) (29.39±6.82µM)

P=0,23

Àrea

mitja

na d

e le

sió

( µm

2 )

Figura 5. Àrea mitjana de lesió arterioscleròtica en ratolins de la soca C57BL/6 alimentats amb dieta DRG (mascles i femelles). Cada punt representa la mitjana de l’àrea de lesió de 4 seccions d’aorta proximal d’un individu sacrificat a les 12 setmanes de tractament. La mitjana de grup s’indica amb una barra horitzontal. Grup control (ο, ), grup PHT (• , ). Els valors entre parèntesi expressen el valor mitjà ± SEM de la concentració plasmàtica de fenitoïna en aquell grup. * Significativament diferent (P<0.05).

Resultats

72

Els grups “PHT” (veure figura 5) (femelles amb n=12 i mascles amb n=11) van

rebre el tractament a través de l’aigua de beguda ajustada a un pH=10.2 i en una

concentració de 30mg/100mL. Els grups anomenats “control” (femelles amb n=11

i mascles amb n=10) bevien aigua ajustada al mateix pH alcalí que els anteriors.

Mentre que en mascles l’àrea mitjana de lesió dels tractats amb PHT (44.64 ± 45

µm2 (2807 ± 2329 µm2) no era significativament diferent de la dels controls, en

femelles el grup PHT presentava una disminució de l’àrea de lesió

d’aproximadament 9 vegades respecte del grup control (1673 ± 1490 µm2 grup

PHT vs 15470 ± 4524 µm2 grup control).

L’estudi de correlació i regressió lineal entre la concentració de PHT i l’àrea de

lesió aòrtica es mostra a la figura 6. Tant en femelles com en mascles es va trobar

un coeficient de correlació negatiu entre las concentracions de PHT i l’àrea mitjana

de lesió però només en el cas de les femelles aquesta relació va ser significativa

(P<0.02).

0 10 20 30 40 50

0

10000

20000

30000

40000

50000r=-0.46 P=0.02

FEMELLES

Concentració de PHT (µM)

Àrea

mitj

a de

lesi

ó ( µ

m2 )

0 10 20 30 40 50

0

10000

20000

30000

40000

50000MASCLES

P=0.12r=-0.26


Àrea

mitj

a de

lesi

ó ( µ

m2 )

Figura 6. Correlació de les concentracions de PHT amb l’àrea mitjana de lesió arterioscleròtica i regressió lineal. Cada punt en negreta (rodona per femella i quadrat per mascle) representa la mitjana de concentració de PHT a 4, 8 i 12 setmanes de tractament. Els punts buits corresponen als ratolins del grup control (amb un valor de PHT=0). En femelles n=23 i en mascles n=21. El coeficient calculat correspon a la r de Pearson.

Resultats

73

• Dieta rica en greixos tipus Western (WTD)

Una crítica freqüent a la dieta DRG és que té efectes proinflamatoris i

hepatotòxics que podrien interferir en els estudis de susceptibilitat a

l’arteriosclerosi. Per aquest motiu es va estudiar quin era l’ efecte de la PHT sobre

l’àrea de lesió arterioscleròtica en ratolins femella de la soca C57BL/6 alimentats

amb una dieta tipus Western (enlloc de la dieta DRG anterior) durant 27 setmanes.

La dieta WTD indueix en els animals C57BL/6 obesitat, resistència a insulina i

lesions del tipus estria grassa sense alterar notablement la funció hepàtica

Així, mentre que els individus control (n=7) presentaven una àrea mitjana de

lesió de 23250 ± 5324µm2, els ratolins sotmesos a tractament (n=15) la lesió

disminuïa significativament fins a un mitjana de 10130 ± 2099µm2.

La reducció de l’àrea de lesió en els ratolins alimentats amb dietaWTD i tractats

amb PHT (figura 8) no va ser tant accentuada com la que vam trobar en els

ratolins alimentats amb dieta DRG i tractats amb el fàrmac (figura 5).

Quan es va correlacionar la concentració de PHT mitjana de cada animal amb

l’àrea de lesió (figura 9) es va trobar una relació inversament i estadísticament

significativa (P<0.05) entre aquests dos paràmetres. La correlació obtinguda amb

aquesta dieta és del mateix ordre de magnitud que la obtinguda en els ratolins

alimentats amb dieta DRG.

Resultats

74

CONTROL PHT

0

10000

20000

30000

40000

50000P=0,01*

(18.9±2.0 µM)

FEMELLESÀr

ea m

itjana

de

lesi

ó (m

m2 )

Figura 8. Àrea mitjana de lesió arterioscleròtica en ratolins de la soca C57BL/6 alimentats amb dieta tipus Western (femelles). Cada punt representa la mitjana de l’àrea de lesió de 4 seccions d’aorta proximal d’un individu sacrificat a les 27 setmanes de tractament. La mitjana de grup s’indica amb una barra horitzontal. Grup control (ο), grup PHT (• ). El valor entre parèntesi expressa el valor mitjà ± SEM de la concentració plasmàtica de fenitoïna en aquell grup. * Significativament diferent (P<0.05).

Figura 9. Correlació de les concentracions de PHT amb l’àrea mitjana de lesió arterioscleròtica i regressió lineal. Cada punt en negreta representa la mitjana de concentració de PHT a 9, 18 i 27 setmanes de tractament. Els punts buits corresponen als ratolins del grup control (amb un valor de PHT =0). n=22. El coeficient calculat correspon a la r de Pearson .

0 10 20 30 40 50

0

10000

20000

30000

40000

50000


Àrea

mitj

a de

lesi

ó ( µ

m2 ) r=-0.44 P=0.03

FEMELLES

Resultats

75

1.1.2 Ratolins transgènics de la PTEC (Tg PTEC)

La PTEC no es troba en ratolins, però si en humans, i és un important

determinant del metabolisme lipoproteic d’aquests últims.

Seguint el mateix protocol que en els ratolins C57BL/6 amb dieta DRG, els

ratolins transgènics de la PTEC van desenvolupar lesions tipus estria grassa a les

12 setmanes d’estar alimentats amb una dieta rica en greixos i colesterol (figura

10). Paral.lelament al que vam obtenir en els dos grups anteriors de ratolins es van

trobar diferències significatives entre els animals femelles controls i els tractats

amb PHT (àrees de lesió mitjanes 19230 ± 1958 (n=7) i 8524 ± 2878 µm2 (n=10)

respectivament). A diferència dels ratolins C57BL/6, els animals transgènics de la

PTEC van presentar menor dispersió dels seus valors individuals, tot i que l’àrea

mitjana de lesió és molt similar. El valor mitjà de PHT (22 ± 3.9 µM) en aquest

grup no difereix significativament del que vam trobar en els altres dos grups de

ratolins tractats amb PHT mesurats anteriorment.

CONTROL PHT

0

10000

20000

30000

40000

50000

(22.0±3.9 µM)

P=0,01*

FEMELLES

Àrea

mitja

na d

e le

sió

( µm

2 )

Figura 10. Àrea mitjana de lesió arterioscleròtica en ratolins de la soca C57BL/6 transgènics de la PTEC amb dieta DRG (femelles). Cada punt representa la mitjana de l’àrea de lesió de 4 seccions d’aorta proximal d’un individu sacrificat a les 12 setmanes de tractament. La mitjana de grup s’indica amb una barra horitzontal. Grup control (ο), grup PHT (• ). El valor entre parèntesi expressa el valor mitjà ± SEM de concentració de fenitoïna en aquell grup. * Significativament diferent (P<0.05).

Resultats

76

Després d’aplicar un test de regressió lineal entre la la concentració de PHT i

l’àrea de lesió arterioscleròtica no es van trobar diferències significatives entre

aquests dos paràmetres en aquest grup, tot i que es manté la tendència a

correlacionar negativament.

Figura 11. Correlació de les concentracions de PHT amb l’àrea mitjana de lesió arterioscleròtica i regressió lineal. Cada punt en negreta representa la mitjana de concentració de PHT a 4, 8 i 12 setmanes de tractament. Els punts buits corresponen als ratolins del grup control (amb un valor de PHT = 0). n=17. El coeficient calculat correspon a la r de Pearson.

1.2 Models d’arteriosclerosi avançada

La patogènia de les lesions del tipus estria grassa difereix notablement de

l’evolució de les lesions més avançades del tipus fibroproliferatiu.

Conseqüentment es va determinar l’efecte del fàrmac en dos models animals

que presentaven lesions més severes i avançades i amb uns nivells de colesterol

d’HDL reduïts.

1.2.1 Ratolins knockout d’apoE (apoE-/-)

A ratolins deficients en apoE, mascles i femelles, alimentats amb una dieta

estàndard durant 12 setmanes se’ls va administrar aigua a pH 10.2 al grup

“control” i aigua amb PHT a concentració 30 mg/100 mL al grup “PHT”.

Resultats

77

La concentració de PHT d’alguns ratolins femella va ser molt baixa. Per aquest

motiu es van subclassificar els grups tractats en: animals amb baixa concentració

de PHT (grup ↓PHT) i animals amb alta concentració de PHT (grup ↑PHT). El

punt que separava aquests dos subgrups va ser la mediana de la concentració de

PHT de tot el grup (figura 12).

Els ratolins apoE-/-, de la mateixa manera que els C57BL/6 amb dieta DRG,

presenten dimorfisme sexual respecte l’àrea de lesió arterioscleròtica. Les femelles

controls tenen aproximadament el doble de lesió que els mascles (461600 ± 39170

vs 209800 ± 20990 µm2).

Es van trobar diferències significatives dins dels grups femella tractats amb

PHT. Els ratolins ↓PHT presentaven 1,43 vegades més lesió que els ratolins ↑PHT

(àrees de lesió: ↓PHT 511600 ± 566000 µm2 vs ↑PHT 357100 ± 29580 µm2).

0

200000

400000

600000

800000

1000000FEMELLES MASCLES

CONTROL CONTROL↓PHT ↑PHT ↓PHT ↑PHT(7.1±1.1µM) (16.2±3.8µM) (35.3±2.3µM)(14.9±2.1µM)

P=0.07

P=0.03*

P=0.76

P=0.33P=0.47 P=0.24

Àrea

mitja

na d

e le

sió

( µm

2 )

Figura 12. Àrea mitjana de lesió arterioscleròtica en ratolins apoE-/- en dieta de manteniment (femelles i mascles). Cada punt representa la mitjana de l’àrea de lesió de 4 seccions d’aorta proximal d’un individu sacrificat a les 12 setmanes de tractament. La mitjana de grup s’indica amb una barra horitzontal. Grup control (ο, ), grup ↓PHT (• , ), grup ↑PHT (• , ). El valor entre parèntesi expressa el valor mitjà ± SEM de la concentració plasmàtica de fenitoïna en aquell grup. * Significativament diferent (P<0.05).

Resultats

78

En mascles les àrees mitjanes de lesió eren molt similars entre els ratolins

controls i tractats.

L’estudi de correlació va mostrar una tendència negativa entre la concentració

de PHT i l’arteriosclerosi molt més accentuada en femelles que en mascles tot i que

en cap dels dos sexes va ser estadísticament significativa.

0 10 20 30 400

200000

400000

600000

800000r=-0.30 P=0.10

FEMELLES


Àrea

mitj

a de

lesi

ó ( µ

m2 )

0 10 20 30 400

200000

400000

600000

800000r=-0.15 P=0.29

MASCLES


Àrea

mitj

a de

lesi

ó ( µ

m2 )

Figura 13. Correlació de les concentracions de PHT amb l’àrea mitjana de lesió arterioscleròtica i regressió lineal. Cada punt en negreta (rodona per femella i quadrat per mascle) representa el valor mitjà de concentració de PHT a 4, 8 i 12 setmanes de tractament en els animals del grup PHT. Els punts grisos són el subgrup ↓PHT i els punts negres representen els ↑PHT. Els punts buits corresponen als ratolins del grup control (amb un valor de PHT=0). En femelles n=19 i en mascles n=17. El coeficient calculat correspon a la r de Pearson .

1.2.2 Ratolins knockout del receptor d’LDL (rLDL-/-)

De la mateixa manera que els ratolins apoE-/-, els ratolins rLDL-/- tractats amb

PHT es van subdividir en grups ↓PHT i grups ↑PHT.

Els ratolins Knockout del rLDL femella alimentats amb dieta DRG durant 9

setmanes va presentar una disminució significativa de l’àrea de lesió

d’aproximadament 1,6 vegades en el grup d’animals que tenien altes

concentracions de PHT respecte dels ratolins control (àrea mitjana de lesió:187600

± 212200 µm2 pel grup ↑PHT vs 298600 ± 36490 µm2 pel grup control). No es van

trobar, en canvi, diferències entre el grup control i el grup ↓PHT (273000 ± 36040

Resultats

79

µm2) ni entre els dos subgrups de PHT, tot i que en aquest segon cas es va obtenir

una P=0,06. (figura 14)

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000FEMELLES MASCLES

CONTROL CONTROL↓PHT ↑PHT ↓PHT ↑PHT(9.6±0.8µM) (15.5±1.3µM) (29.1±2.8µM)(27.4±2.8µM)

P=0.04* P=0.21

P=0.06 P=0.05*

P=0.66 P=0.32

Àrea

mitja

na d

e le

sió

( µm

2 )

Figura 14. Àrea mitjana de lesió arterioscleròtica en ratolins rLDL-/- amb dieta DRG (femelles i mascles). Cada punt representa la mitjana de l’àrea de lesió de 4 seccions d’aorta proximal d’un individu sacrificat a les 9 setmanes de tractament. La mitjana de grup s’indica amb una barra horitzontal. Grup control (ο, ), grup ↓PHT (• , ), grup ↑PHT (• , ). El valor entre parèntesi expressa el valor mitjà ± SEM de la concentració plasmàtica de fenitoïna en aquell grup. * Significativament diferent (P<0.05).

0 10 20 30 40 500

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000r=-0.39 P=0.03

FEMELLES


Àrea

mitj

a de

lesi

ó ( µ

m2 )

0 10 20 30 40 500

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000r=-0.14 P=0.25

MASCLES

Concentració de PHT ( µM)

Àrea

mitj

a de

lesi

ó ( µ

m2 )

Figura 15. Correlació de les concentracions de PHT amb l’àrea mitjana de lesió arterioscleròtica i regressió lineal. Cada punt en negreta (rodona per femella i quadrat per mascle) representa el valor mitjà de concentració de PHT a 3, 6 i 9 setmanes de tractament en els animals del grup PHT. Els punts grisos són el subgrup ↓PHT i els punts negres representen els ↑PHT. Els punts buits corresponen als ratolins del grup control (amb un valor de PHT=0). En femelles n=19 i en mascles n=17. El coeficient calculat correspon a la r de Pearson.

Resultats

80

En mascles, el subgrup ↑PHT mostra una àrea de lesió mitjana

significativament més baixa que el subgrup ↓PHT (188200 ± 14530 vs 464400 ±

122800 µm2). No obstant això, quan es comparava l’àrea de lesió del grup control

amb els grups tractats no es van obtenir canvis estadísticament significatius.

L’àrea de lesió va correlacionar negativament amb la concentració de PHT (r=-

0.39, P<0.03) en femelles.

CONTROL PHT

C57BL/6

Figura 16. Fotomicrografies representatives de seccions de l’aorta proximal de ratolins femella control i tractats amb PHT. Totes les lesions van ser tenyides amb Oil Red O i contratenyides amb Hematoxilina. L’augment en totes les imatges és el mateix. Barra=200µm. Mentre els ratolins C57BL/6 mostren lesions tipus estria grassa (fletxes) de mida petita, els animals rLDL-/- presenten lesions fibroproliferatives severes amb calcificacions i dipòsits multicapa de cèl. escumoses (fletxes). En els diferents grups s’observa una disminució de l’àrea del lesió del grup tractat respecte del control.

Resultats

81

2 EFECTE DEL TRACTAMENT AMB FENITOÏNA SOBRE LES CONCENTRACIONS DE LÍPIDS, GLUCOSA I TRANSAMINASES

2.1 Models murídics d’arteriosclerosi tipus estria grassa

Es van estudiar en els models de ratolí que desenvolupaven estries grasses les

modificacions plasmàtiques de les concentracions de lípids, glucosa i

transaminases que va induir el tractament amb PHT.

2.1.1 Ratolins C57BL/6

• Dieta rica en greixos i colat (DRG)

L’evolució del perfil lipídic en aquests animals s’observa en la figura 17. En

femelles, la PHT produeix un augment significatiu a les 12 setmanes de tractament

dels nivells de colesterol total, colesterol d’HDL (cHDL) i colesterol de no HDL

(1,58, 1,65 i 1,57 vegades respectivament). Els mascles que rebien PHT mostraven

uns nivells de colesterol total augmentats 1,25 vegades a les 8 i 12 setmanes

respecte dels controls i en el cas del colesterol de no-HDL aquest augment només

es donava a les 8 setmanes de tractament.

Taula 5. Concentracions de lípids, glucosa i transaminases en ratolins C57BL/6 (mascles i femelles) alimentats amb dieta DRG durant 12 setmanes. Cada valor correspon al valor mig ± SEM de la mesura obtinguda a 4, 8 i 12 setmanes de tractament. * Diferències significatives (P<0.05) respecte dels ratolins controls

Resultats

82

Quan es va calcular la mitjana dels tres punts (taula 5) només el cHDL es va

veure significativament augmentat en les femelles PHT respecte del grup control

(1,55 vegades aproximadament) ja que és l’únic paràmetre que augmentava

consistentment a les 8 i 12 setmanes. Els mascles, en canvi, mostraven un augment

significatiu del colesterol total degut, sobretot, a un increment en la concentració

de colesterol de no-HDL de gairebé 1,3 vegades (taula 5).

Els canvis en la concentració de triglicèrids diferien entre mascles i femelles

(figura 17). De fet, els valors al punt 0 també èren diferents i els triglicèrids dels

mascles gairebé doblaven els de les femelles. Mentre que en femelles no vam

trobar diferències significatives entre els ratolins tractats i els no tractats, en

mascles els triglicèrids del grup PHT estàven significativament disminuïts en tots

els punts del tractament.

El perfil de PHT es va mantenir relativament estable al llarg del tractament tot i

que els mascles mostraven les concentracions més altes d’aquest fàrmac en plasma

(figura 17).

La concentració de glucosa (taula 5) va disminuir de manera significativa en els

grups tractats amb PHT 1,4 vegades en femelles i 1,3 vegades en mascles respecte

dels grups control.

El tractament amb PHT incrementava les transaminases de manera significativa

tant en femelles com en mascles (excepte l’ALT de mascles que no arribava a tenir

significativitat)(taula 5).

Quan es va correlacionar els paràmetres lipídics, glucosa o transaminases amb

l’àrea de lesió (taula 6) vam obtenir uns coeficient de correlació positius i

significatius entre la concentració de glucosa de les femelles (r=0,54) o la

concentració de triglicèrids dels mascles (r=0,70) i l’àrea de lesió. En mascles es va

trobar una tendència a relacionar positivament la glucosa amb l’àrea de lesió tot i

que no arribava a tenir significativat.

Resultats

83

1

2

3

4

5

6

7

8

9

*

1

2

3

4

5

6

**

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

*

*

��

��

��

0 4 8 120

10

20

30

40

��

��

��

0 4 8 12

Coles

terol

(mM)

Coles

terol

HDL (

mM)

Coles

terol

no-H

DL (m

M)

*

*

*

Setmanes de tractament

PHT

(µM

)

FEMELLES MASCLES

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

* * *Trig

licèr

ids

(mM

)

Figura 17. Evolució de la concentració plasmàtica de colesterol total, colesterol d’HDL, colesterol no HDL , triglicèrids i PHT en ratolins C57BL/6 (mascles i femelles) alimentats amb dieta DRG durant 12 setmanes. Les barres blanques corresponen al grup control mentre que les barres negres corresponen al grup PHT. Cada barra representa la mitjana ± SEM de grup per a aquell paràmetre. El valors del punt 0 setmanes representen els valors basals del individus. La concentració de PHT correspon només als individus del grup tractat. * Diferències significatives (P<0.05) respecte dels ratolins controls.

Resultats

84

Taula 6. Correlació entre la concentració de lípids, glucosa o transaminases i l’àrea de lesió arterioscleròtica en ratolins C57BL/6 (mascles i femelles) alimentats amb dieta DRG durant 12 setmanes. L’àrea de lesió arterioscleròtica de cada ratolí és el resultat de la mitjana de l’àrea de lesió de 4 seccions d’aorta proximal d’un individu sacrificat a les 12 setmanes de tractament. Els valors dels diferents paràmetres plasmàtics s’han obtingut com a valor mitjà de les concentracions a 4, 8 i 12 setmanes de tractament. El coeficient calculat correspon a la r de Pearson. La taula mostra el valor de la probabilitat en cada cas. *Diferències significatives (P<0.05) respecte dels ratolins controls.

• Dieta rica en greixos tipus Western (WTD)

Quan els ratolins femella van ser sotmesos a una dieta rica en greixos sense

colat durant 27 setmanes, el tractament amb PHT va induir una evolució del perfil

lipídic notablement diferent de la que va donar amb dieta DRG.

Taula 7. Concentracions de lípids, glucosa o transaminases en ratolins C57BL/6 femelles alimentats amb dieta WTD durant 27 setmanes. Cada valor correspon al valor mig ± SEM de la mesura presa a 9, 18 i 27 setmanes de tractament. * Diferències significatives (P<0.05) respecte dels ratolins controls.

Resultats

85

FEMELLES

1

2

3

4

5

* **

1

2

3

4

5

6

**

1

2

3

4

5

*

��

��

��

0 9 18 270

10203040

Col

este

rol (

mM

)C

oles

tero

l HD

L (m

M)

Col

este

rol n

o-HD

L (m

M)


PHT

( µM

)

0.5

1.0

1.5

2.0

* * *

Trig

licèr

ids

(mM

)

Figura 18. Evolució de la concentració plasmàtica de colesterol total, colesterol d’HDL, colesterol no HDL , triglicèrids i PHT en ratolins C57BL/6 femelles alimentats amb dieta WTD durant 27 setmanes. Les barres blanques corresponen al grup control mentre que les barres negres corresponen al grup PHT. Cada barra representa la mitjana ± SEM de grup per a aquell paràmetre. El valors del punt 0 setmanes representen els valors basals del individus La concentració de PHT correspon només als individus del grup tractat. * Diferències significatives (P<0.05) respecte dels ratolins controls.

Resultats

86

Els nivells totals de colesterol dels animals que rebien PHT estaven disminuïts

1,4 vegades quan es van comparar amb el grup control. Això es va donar durant

tot el tractament (figura 18). Aquesta reducció es va traduir en una disminució,

estadísticament significativa en la mitjana dels tres punts, tant del colesterol

d’HDL com del de no HDL (reducció d’1,40 i 1,45 vegades respectivament) (taula

7).

La concentració de triglicèrids en els ratolins del grup PHT disminuïa també

des dels inicis del tractament de manera significativa i es mantenia a aquests

nivells fins acabar l’experiment (figura 18).

En conjunt, la concentració mitjana de triglicèrids dels ratolins tractats es reduïa

a la meitat del valor que van presentar els ratolins control (taula 7).

La dieta WTD en ratolins de la soca C57BL/6 indueix resistència a la insulina i

concentracions elevades de glucosa (aproximadament 11 mM en les femelles en

dieta WTD respecte a 8 mM dels animals amb dieta DRG). El tractament amb

PHT, però, no va tenir cap influència sobre la concentracions de glucosa en

aquests animals (taula 7).

Taula 8. Correlació entre la concentració de lípids, glucosa, transaminases i l’àrea de lesió arterioscleròtica en ratolins C57BL/6 femelles amb dieta WTD durant 27 setmanes El valor de l’àrea de lesió arterioscleròtica de cada ratolí és el resultat de la mitjana de l’àrea de lesió de 4 seccions d’aorta proximal d’un individu sacrificat a les 27 setmanes de tractament. Els valors dels diferents paràmetres plasmàtics s’han obtingut com a valor mitjà de les concentracions a 9, 18 i 27 setmanes de tractament. El coeficient calculat correspon a la r de Pearson. La taula mostra el valor de la probabilitat en cada cas. *Diferències significatives (P<0.05) respecte dels ratolins controls.

Resultats

87

Les transaminases van disminuir significativament en els ratolins que rebien

PHT (1,67 vegades en el cas de l’ALT i 1,43 vegades per a l’AST) (taula 7).

Respecte l’àrea de lesió arterioscleròtica, es va trobar una correlació positiva i

significativa amb el colesterol total i el colesterol d’HDL (r=0,45, en els dos casos) i

l’ALT (r=0,46) (taula 7).

2.1.2 Ratolins transgènics de la PTEC (Tg PTEC)

Els ratolins transgènics de la PTEC femella alimentats amb dieta DRG durant 12

setmanes i tractats amb PHT van presentar un perfil lipídic al llarg del tractament

similar al dels ratolins C57BL/6 amb dieta DRG (taula 9 i figura 19). Tot i així, en

els animals TgPTEC la concentració mitjana dels tres períodes, tant pels lípids com

per la glucosa, era inferior (en animals tractats i en controls) a la que van presentar

les femelles de la soca C57BL/6 (taula 9).

Taula 9. Concentracions de lípids, glucosa i transaminases en ratolins transgènics de la PTEC femelles amb dieta DRG durant 12 setmanes. Cada valor representa el valor mitjà ± SEM de la mesura presa a 4, 8 i 12 setmanes de tractament. * Diferències significatives (P<0.05) respecte dels ratolins controls

Resultats

88

1

2

3

4

5

*

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

��

��

��

0 4 8 120

10203040

Col

este

rol (

mM

)C

oles

tero

l HD

L (m

M)

Col

este

rol n

o-HD

L (m

M)


PHT

( µM

)

FEMELLES

0.5

1.0

1.5

Trig

licèr

ids

(mM

)

Figura 19. Evolució de la concentració plasmàtica de colesterol total, colesterol d’HDL, colesterol no HDL , triglicèrids i PHT en ratolins transgènics de la PTEC amb dieta DRG durant 12 setmanes. Les barres blanques corresponen al grup control mentre que les barres negres corresponen al grup PHT. Cada barra representa la mitjana ± SEM de grup per a aquell paràmetre. El valors del punt 0 setmanes representen els valors basals del individus La concentració de PHT correspon només als individus del grup tractat. * Diferències significatives (P<0.05) respecte dels ratolins controls.

Resultats

89

Les concentracions plasmàtiques de lípids, glucosa i transaminases dels ratolins

TgPTEC tractats amb PHT no van diferir significativament de les concentracions

que van presentar els ratolins control. Malgrat tot, les concentracions plasmàtiques

de glucosa i transaminases tendien a augmentar en els ratolins tractats amb PHT

(taula 9).

No es van trobar correlacions significatives entres les concentracions de lípids,

glucosa o transaminases i l’àrea de lesió (taula 10).

Taula 10. Correlació entre la concentració de lípids, glucosa, transaminases i l’àrea de lesió arterioscleròtica en ratolins trangènics de la PTEC femelles amb dieta DRG durant 12 setmanes. El valor de l’àrea de lesió arterioscleròtica de cada ratolí és el resultat de la mitjana de l’àrea de lesió de 4 seccions d’aorta proximal d’un individu sacrificat a les 12 setmanes de tractament. Els valors dels diferents paràmetres plasmàtics s’han obtingut com a valor mitjà de les concentracions a 4, 8 i 12 setmanes de tractament. El coeficient calculat correspon a la r de Pearson. La taula mostra el valor de la probabilitat en cada cas. *Diferències significatives (P<0.05) respecte dels ratolins controls.

Resultats

90

2.2 Models d’arteriosclerosi avançada

Els ratolins apoE-/- amb dieta stàndard es caracteritzen per presentar una

hipercolesterolèmia severa degut a l’acumulació de quilomicrons romanents i

VLDLs. Els rLDL-/- amb dieta DRG, generen també una hipercolesterolèmia

important però en aquesta cas degut a acumulacions de colesterol d’LDL.

2.2.1 Ratolins knockout d’apoE (apoE-/-)

El grup de femelles amb els valors baixos de PHT és el que va presentar més

variacions en les concentracions de lípids al final del període de tractament.

El grup ↓PHT de femelles va presentar unes disminucions significatives del

valor mitjà de colesterol total i colesterol de no-HDL (1,27 vegades) i del colesterol

d’HDL (1,4 vegades) respecte del ratolins controls (taula 11).

Taula 11. Concentracions de lípids, glucosa i transaminases en ratolins apoE-/- (mascles i femelles) amb dieta estàndard durant 12 setmanes. Cada valor representa el valor mitjà ± SEM de la mesura presa a 4, 8 i 12 setmanes de tractament. * Diferències significatives (P<0.05) respecte dels ratolins controls.

Quan la PHT es trobava a més altes concentracions es va observar també una

tendència a la disminució dels colesterols de les diferents lipoproteïnes tant en

mascles com en femelles, tot i que només va ser significatiu en el cas del cHDL de

les femelles (taula 11).

Resultats

91

Col

este

rol (

mM

)C

oles

tero

l HD

L (m

M)

Col

este

rol n

o-HD

L(m

M)


PHT

( µM

)

FEMELLES MASCLES

2

4

6

8

10

12

*

1

2

3

4

5

2

4

6

8

10

12

��

��

��

0 4 8 120

1020304050

ND

��

��

��

��

0 4 8 12

ND

*0.5

1.0

1.5

Trig

licèr

ids

(mM

)

Figura 20. Evolució de la concentració plasmàtica de colesterol total, colesterol d’HDL, colesterol no HDL, triglicèrids i PHT en ratolins apoE-/- (mascles i femelles) en dieta stàndard durant 12 setmanes. Les barres blanques corresponen al grup control mentre que les barres grises i negres corresponen al grup PHT a concentracions baixes i altes respectivament. Cada barra representa la mitjana ± SEM de grup per a aquell paràmetre. El valors del punt 0 setmanes, representen els valors basals del individus. La concentració de PHT correspon només als individus del grup tractat (a l’esquerra, baixes concentracions i a la dreta, altes concentracions). * Diferències significatives (P<0.05) respecte dels ratolins controls.

Resultats

92

Els valors mitjans dels triglicèrids, la glucosa i les transaminases dels grups

PHT no van presentar canvis consistents quan es van comparar amb el grup

control (taula 11).

En femelles, l’evolució del perfil lipídic al llarg del tractament amb PHT (figura

20) va presentar una tendència a la disminució de les concentracions de colesterol

total, cHDL i colesterol de no-HDL respecte els controls tot i que només arribava a

tenir significació en el cas del colesterol total a les 8 setmanes de tractament en el

grup ↓PHT.

Només en mascles es va detectar un increment a les 8 setmanes dels triglicèrids

en els ratolins ↑PHT respecte dels control (figura 20).

Taula 12. Correlació entre la concentració de lípids, glucosa, transaminases i l’àrea de lesió arterioscleròtica en ratolins apoE-/- (mascles i femelles) amb dieta stàndard durant 12 setmanes. El valor de l’àrea de lesió arterioscleròtica de cada ratolí és el resultat de la mitjana de l’àrea de lesió de 4 seccions d’aorta proximal d’un individu sacrificat a les 12 setmanes de tractament. Els valors dels diferents paràmetres plasmàtics s’han obtingut com a valor mitjà de les concentracions a 4, 8 i 12 setmanes de tractament. El coeficient calculat correspon a la r de Pearson. La taula mostra el valor de la probabilitat en cada cas. *Diferències significatives (P<0.05) respecte dels ratolins controls.

A les 8 setmanes de tractament els mascles presentaven concentracions de PHT

entre 4 i 6 vegades superiors a les que presentaven les femelles. En canvi, a les 12

setmanes de tractament únicament els mascles del grup ↑PHT tenien 1,2 vegades

més quantitat del fàrmac en plasma que les femelles (figura 20).

Resultats

93

La taula 12 ens mostra l’absència de correlacions significatives entre l’àrea de

lesió i la concentració de lípids, glucosa o transaminases tant en mascles com en

femelles.

2.2.2 Ratolins knockout del receptor d’LDL (rLDL-/-)

En els ratolins deficients en el rLDL amb dieta DRG durant 9 setmanes trobem

que la PHT exerceix alteracions importants sobre el perfil lipídic.

Les femelles (figura 21) dels ratolins del grup ↓PHT van mostrar una forta

tendència a la disminució de la concentració de colesterol total i el colesterol de

no-HDL a les 3, 6 i 9 setmanes de tractament respecte dels ratolins control.

Aquesta tendència però no arribava a ser significativa. En canvi, sí que hi que es

va veure una disminució significativa d’ aquests paràmetres quan es va comparar

la mitjana de grup (↓PHT) amb el grup control (reducció d’1,17 vegades del

colesterol total i del colesterol de no HDL respecte els controls) (taula 13).

Les concentracions altes de PHT (per sobre de 20 µM) en femelles reduïren les

concentracions de colesterol total i colesterol de no HDL de manera significativa a

les 3, 6 i 9 setmanes. A més, la PHT va induir en aquests tres períodes un augment

de la concentració de cHDL, que arribava a ser significatiu a les 9 setmanes de

tractament (figura 21). La mitjana en la concentració d’aquests paràmetres

corrobora les significacions anteriors amb un augment d’1,7 vegades el colesterol

d’HDL i una disminució d’1,3 i 1,8 vegades el colesterol total i el colesterol de no

HDL respectivament (taula 13).

Els mascles del grup ↓PHT van presentar una disminució significativa del

cHDL a les 6 setmanes de tractament respecte del control (figura 21). Tot i així, els

mascles no van mostrar cap altra tendència definida respecte de la variació dels

colesterols pel tractament amb PHT.

Resultats

94

10

20

30

40

50

60

** *

1

2

3

4

5

* * *

10

20

30

40

50

60

** *

��

��

��

��

��

��

0 3 6 90

1020304050

*

��

��

��

��

��

��

0 3 6 9

Col

este

rol (

mM

)C

oles

tero

l HD

L (m

M)

Col

este

rol n

o-HD

L(m

M)


PHT

( µM

)

FEMELLES MASCLES

0.5

1.0

1.5

2.0

* ** *

Trig

licèr

ids

(mM

)

Figura 21. Evolució de la concentració plasmàtica de colesterol total, colesterol d’HDL, colesterol no HDL , triglicèrids i PHT en ratolins rLDL-/- (mascles i femelles) en dieta stàndard durant 9 setmanes. Les barres blanques corresponen al grup control mentre que les barres grises i negres corresponen al grup PHT a concentracions baixes i altes respectivament. Cada barra representa la mitjana ± SEM de grup per a aquell paràmetre. El valors del punt 0 setmanes representen els valors basals del individus. La concentració de PHT correspon només als individus del grup tractat (a l’esquerra, baixes concentracions i a la dreta, altes concentracions). * Diferències significatives (P<0.05) respecte dels ratolins controls.

Resultats

95

Taula 13. Concentracions de lípids, glucosa i transaminases en ratolins rLDL-/- (mascles i femelles) amb dieta estàndard durant 9 setmanes. Cada valor correspon al valor mitjà ± SEM de la mesura presa a 3, 6 i 9 setmanes de tractament. * Diferències significatives (P<0.05) respecte dels ratolins controls.

Els triglicèrids, en mascles i femelles, van experimentar una marcada i

significativa disminució a les 9 setmanes de tractament amb PHT (a altes i baixes

dosis) respecte dels controls (figura 21). Quan es van avaluar els valors mitjans de

triglicèrids de les 3, 6 i 9 setmanes en aquests animals, només les femelles ↑PHT

van mostrar una disminució significativa de la concentració (44%) respecte dels

controls (taula 13).

La glucosa estava disminuïda en els ratolins del grup ↓PHT (taula 13), però

només en el cas de les femelles, la disminució arribava a ser significativa. A

concentracions altes de PHT no hi havien diferències apreciables.

Les transaminases augmentaven de manera moderada, en femelles, tant a altes

com a baixes concentracions de PHT (taula 13). En canvi, en mascles es produïa

una disminució controlada de les transaminases que només en concentracions

altes de PHT l’AST arribava a ser significativa.

Els nivells de colesterol, glucosa o transaminases i l’àrea de lesió (taula 14) va

correlacionar positivament i amb significació en el cas del colesterol total i

colesterol de no-HDL en femelles i va tenir una correlació negativa pel colesterol

d’HDL en mascles i femelles.

Resultats

96

Taula 14. Correlació entre la concentració de lípids, glucosa, transaminases i l’àrea de lesió arterioscleròtica en ratolins rLDL-/- (mascles i femelles) amb dieta DRG durant 9 setmanes. El valor de l’àrea de lesió arterioscleròtica de cada ratolí és el resultat de la mitjana de l’àrea de lesió de 4 seccions d’aorta proximal d’un individu sacrificat a les 9 setmanes de tractament. Els valors dels diferents paràmetres plasmàtics s’han obtingut com a valor mitjà de les concentracions a 3, 6 i 9 setmanes de tractament. El coeficient calculat correspon a la r de Pearson. La taula mostra el valor de la probabilitat en cada cas. * Diferències significatives (P<0.05) respecte dels ratolins controls.

Resultats

97

3 EFECTE DEL TRACTAMENT AMB FENITOÏNA SOBRE LA COMPOSICIÓ I METABOLISME DE LES HDL

Un cop estudiat els perfil dels diferents lípids , glucosa i transaminases en

presència de la PHT vam volguer focalitzar el present treball en la influència que

podria tenir aquest fàrmac sobre l’HDL tant a nivell de composició com d’activitat.

3.1 Composició de les HDL

A fi d’avaluar canvis en la composició de les HDLs entre els ratolins controls i

els tractats amb PHT es va partir d’una barreja de plasmes de cadascuna de 4

línees diferents d’animals al final del període de tractament. Es van utilitzar les

HDL dels grups de ratolins femella ja que èren els grups que presentàven amb

més consistència l’efecte antiaterogènic de la PHT. Tot i així, es va descartar els

ratolins C57BL/6 amb dieta DRG degut a que la PHT incrementava

l’hepatotoxicitat de la dieta. Les lipoproteïnes es van separar per ultracentrifugació

seqüencial i es va analitzar el contingut lipídic i proteic de les HDL (figura 22).

Col lliure FosfolipidTriglicèrid Col ester

Proteïna

CONTROL

PHT

2,96

20,65

0,22

17,73

58,44

3,55

24,71

0,07

19,9

51,76

0

10

20

30

40

50

60

C57BL/6

Resultats

98

Col lliure Fosfolipid Triglicèrid Col ester Proteïna

CONTROL

PHT

9,81

25,79

0,43

16,74

47,23

4,5715,75

0,57

20,06

59,05

0

10

20

30

40

50

60

TgCETP

Col lliureFosfolipid

TriglicèridCol ester

P roteïna

CONTROL

alta PHT

8,92

29,29

0,32

17,15

44,32

9,68

31,22

0

17,17

41,94

0

10

20

30

40

50

60

rLDL-/-

Col lliureFosfolipid

TriglicèridCol ester

P roteïna

CONTROL

alta PHT

8,91

23,77

1,92

18,25

47,15

8,27

27,78

1,34

18,32

44,29

0

10

20

30

40

50

60

Apo E -/-

Figura 22. Composició de les HDL plasmàtiques de ratolins femella tractats amb PHT i ratolins controls. Els valors estàn expressats com a %. Soca C57BL/6 amb dieta WTD durant 12 setmanes. TgPTEC amb dieta DRG durant 12 setmanes. ApoE-/- amb dieta stàndard durant 12 setmanes. rLDL-/- amb dieta DRG durant 9 setmanes. En els ratolins apoE-/- i rLDL-/- es va seleccionar els grups ↑PHT.

Resultats

99

Únicament els ratolins TgPTEC van presentar canvis pronunciats en la

composició de les HDL quan van ser tractats amb PHT. Aquests ratolins amb dieta

DRG van presentar un percentatge de fosfolípids i colesterol lliure augmentat 1,6 i

2,15 vegades respectivament vers els controls.

3.2 Quantificació de l’apo A-I d’HDL en plasma de ratolí

1 2 3 4 5 6 7 8203115 93

48

34

28

21

7

std

rLDL-/- apoE-/- Tg-PTEC C57 (WTD)

MarcadorPM

PHT

KDa

apoA-I

PHT PHT PHTC C C C

Relació PHT/C 2,54 0,84 1,20 0,67

Figura 23. Electroforesi en condicions desnaturalitzants d’apo A-I d’HDL de diferents grups de ratolins controls (C) i tractats amb PHT (PHT) (rLDL-/- amb dieta DRG, apoE-/- amb dieta stàndard, TgPTEC amb dieta DRG i C57BL/6 amb dieta WTD). Std: Stàndard d’apoA-I de ratolí. Marcador PM: marcador de pes molecular d’ampli espectre. El grup PHT en els ratolins rLDL-/- i apoE-/- fa referència als grups ↑PHT.

Per determinar si la concentració d’apoA-I d’HDL murídica va ser modificada

pel tractament amb PHT es va realitzar una electroforesi en gel de poliacrilamida

(SDS-PAGE) (figura 23) de les HDLs provinents de pools de plasmes de ratolí de

cadascun dels grups problema. Es tracta d’un tipus d’anàlisi semiquantitativa on

Resultats

100

valorem el quocient: intensitat de banda de ratolins tractats amb PHT respecte

ratolins control en els diferents grups de ratolins.

S’observa una relació directa entre els quocients d’apoA-I dels diferents grups

estudiats i la variació de la concentració de colesterol d’HDL produïda pel fàrmac.

Els ratolins rLDL-/- i TgPTEC que presentaven uns augments significatius de

colesterol d’HDL d’1,7 i 1,26 vegades respecte dels animals control, eren els que

presentaven els quocients d’apoA-I més alts (2,54 i 1,20 respectivament). D’altra

banda, els grups tractats amb PHT que presentaven reduccions de colesterol

d’HDL significatives respecte dels control (1,26 vegades en el cas dels apoE-/- i

1,40 vegades en el cas del C57BL/6) van mostrar els nivells més baixos del

quocient d’apoA-I murídica (0,84 i 0,67 respectivament).

3.3 Protecció de les HDL humanes envers l’oxidació de les LDL

Vam estudiar la capacitat de les HDL del animals tractats amb PHT d’inhibir la

modificació oxidativa de les LDL. Per això, es va fer un assaig d’oxidació de

lipoproteïnes afegint les HDL problema a LDL humanes (figura 24). Es va definir

la mobilitat electroforètica relativa de cada grup problema com la distància de

migració de les LDL respecte de l’LDL nativa i l’LDL completament oxidada.

Els ratolins C57BL/6 amb dieta WTD, els apoE-/- i els rLDL-/- no mostraven

diferències entre els grups tractats i els control respecte a la protecció a l’oxidació

de les LDL per part de les HDL. En canvi, les HDLs dels ratolins TgPTEC tractats

amb PHT oferien 2,24 vegades més protecció que els seus homòlegs sense

tractament.

Resultats

101

��

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

LDLnativa ApoE-/- (DM)

Tg-PTEC (DRG)

C57BL/6 (WTD)

rLDL-/-(DRG)

ControlPHT

LDLox

Oxi

daci

ó re

lativ

a (%

)

Figura 24. Oxidació de lipoproteïnes in vitro i mobilitat electroforètica relativa. LDLnativa i LDLoxidada fan referència als patrons d’oxidació (0 i 100% respectivament). Les columnes clares dels diferents grups fan referència als grups controls i les columnes negres als grups PHT. Dades expressades en % respecte als patrons.

3.4 Eflux de colesterol

La capacitat del plasma de ratolins per mitjançar l’eflux de colesterol va ser

estudiada emprant cultius cel·lulars d’hepatoma de rata (Fu5AH) (figura 25). Per

fer l’estudi es va utilitzar un representant del model d’arteriosclerosi tipus estria

grassa (C57BL/6 amb dieta WTD) i un grup representatiu d’arteriosclerosi

avançada (rLDL-/- amb dieta DRG). A més, aquests dos models presentaven

disminució i elevació, respectivament del cHDL després de ser tractats amb PHT.

L’eflux de colesterol en els ratolins C57BL/6 amb dieta WTD va resultar ser

d’un 25% més baix (P<0,01) en els animals tractats amb PHT que en els controls.

En el cas dels ratolins deficients en rLDL es va obtenir una disminució de l’eflux

de colesterol del 32% (P<0,01), en els ratolins tractats amb ↑PHT.

Resultats

102

C57BL/6 ( WTD) rLDL-/- (DRG)0

10

20

30

40

50controlPHT

*

*

Eflu

x de

col

este

rol (

%)

Figura 25. Capacitat d’eflux cel.lular de plasma de ratolins C57BL/6 i rLDL-/- utilitzant cultius d’hepatòcits Fu5AH. L’eflux fraccional de colesterol és el resultat de dividir les cpm alliberades al medi per les cpm totals (cpm alliberades al medi + cpm contingudes a les cèl·lules) i expressar-ho com a %. Cada barra correspon a la mitjana ± SEM de deteminacions de 4+4 mostres (per a C57BL/6 -control i PHT-) i 5+5 mostres (per a rLDL-/-) i per duplicat. * Diferències significatives (P<0,01) respecte els ratolins control.

3.5 Catabolisme de les HDL

Donat que l’augment d’HDL en plasma pot ser degut tant a una síntesi

augmentada d’HDL com a un catabolisme disminuït d’aquestes partícules, o

ambdues coses alhora, es va examinar l’aclariment d’HDL autòlogues marcades

amb colesteril oleïl èter tritiat ([3H]-HDL), un marcador de la vida mitjana de la

partícula d’HDL, després d’haver estat injectades als ratolins. L’aclariment de

plasma de les ([3H]-HDL) autòlogues va ser significativament més ràpid, tot i que

no en tots els punts, en els ratolins tractats amb PHT (figura 26) que en els ratolins

controls dels dos grups estudiats (C57BL/6 en dieta WTD i rLDL-/- en dieta

DRG). La taxa catabòlica fraccional (TCF) va estar significativament augmentada

en els grups que rebien el fàrmac tant en C57BL/6 com en rLDL-/- (un 59% i un

32% respectivament; P<0,05) respecte dels grups control (inserts de la figura 26).

Resultats

103

C57BL/6 ( dieta WTD)

0 6 12 18 24

0.0

0.5

1.0

*

temps (h)

Acla

rimen

t de

cole

ster

ilol

eïl è

ter d

'HD

L

rLDL-/- (dieta DRG)

0 6 12 18 24

* * *

temps (h)

CONTROL PHT0.0

0.1

0.2

0.3

0.4 *

TCF

cHD

L (fr

acci

ó/h)

CONTROL PHT0.0

0.1

0.2

0.3

0.4*

TCF

cHD

L (fr

acci

ó/h)

Figura 26. Corbes d’aclariment de colesteril oleïl èter d’HDL autòlogues marcades de ratolins de les línies C57BL/6 amb dieta WTD i rLDL-/- amb dieta DRG. Els ratolins van ser injectats intraperitonealment amb [3H]-colesteril oleil èter d’HDL i es van extreure 50µL de sang per la vena de la cua als temps indicats. Ratolins control (ο), ratolins PHT (• ). Els inserts mostren la Taxa Catabòlica Fraccional (TCF) de cada grup ( en fracció /h). El càlcul de TCF es detalla a Material i Mètodes. Per cada grup n=4. * Diferències significatives (P<0,05) respecte dels ratolins control.

Resultats

104

4 PERFILS D’EXPRESSIÓ GÈNICA EN FETGE

4.1 Gens sobreexpressats i reprimits de manera consistent en els ratolins C57BL/6 i rLDL-/-.

L’extracció i purificació d’RNA de fetge dels ratolins C57BL/6 (en dieta WTD) i

rLDL-/- (en dieta DRG) tractats amb PHT va permetre, usant la tecnologia

Genechip de Affymetrix de genoma murídic, estudiar l’expressió de 12000

gens de ratolí, en un sol assaig i en presència o absència del fàrmac.

En l’apartat de Resultats d’aquesta tesi es presenten només aquells gens que

s’expressaven i es reprimien de manera consistent en els dos grups de ratolins

estudiats, independentment del valor de la ràtio, i que podrien explicar, en part,

l’efecte antiaterogènic de la PHT en els dos grups de ratolins (taula 15).

La taula 15 mostra en el panel superior un total de 11 gens comunment

sobreexpressats en els animals tractats amb PHT, dels quals només un correspon a

una seqüència RIKEN. Els més importants i abundants, són els que fan referència

al citocrom P450 (subunitats 2b10, 2c37 i 1a2) i a diferents subunitats de la glutatió

S-transferasa ( α2 (Yc2), α4, µ2 i µ3).

Vam obtenir un total de 21 gens consistenment reprimits per l’efecte de la PHT

en els dos grups de ratolins. Des d’un punt de vista quantitatiu (ràtio ≤ ½ en els

dos grups), el syndecan 4 (un proteoglicà de membrana relacionat amb processos

d’adhesió i migració cel·lular) i la β-actina citoplasmàtica (proteïna del

citoesquelet) són els gens que mostren més consistència en ésser reprimits pel

fàrmac.

Resultats

105

Taula 15. Estudi d’expressió gènica en fetges de ratolins C57BL/6 i rLDL-/- tractats amb PHT vs controls. Els gens s’han classificat de major a menor seguint la ràtio de C57BL/6 i considerant que els valors s’expressen en tant per 1. S’han afegit els codis de les bases de dades “Unigene” i “Gene Bank” per a una millor identificació del gen i les seves característiques.

Codi Unigene Ratio C57BL/6 Ratio rLDL -/- Nom Gene Bank nºMm.14177 9,80 16,00 cytochrome P450 2b10 gb:M21856Mm.2662 2,83 1,60 glutathione S-transferase, alpha 4 gb:L06047Mm.37199 2,46 2,30 glutathione S-transferase, mu 3 gb:J03953Mm.37199 2,46 3,70 glutathione S-transferase, mu 3 gb:J03953Mm.38963 2,46 1,90 cytochrome P450, 2c37 gb:AF047542Mm.14460 2,46 3,50 aldo-keto reductase family 1, member B7 gb:J05663Mm.182227 2,30 1,70 85% homolog. Human PTDO12-like gb:AW060190Mm.15537 2,14 1,50 cytochrome P450, 1a2 gb:X04283Mm.197422 2,14 2,00 glutathione S-transferase, alpha 2 (Yc2) gb:J03958Mm.182227 1,90 1,50 RIKEN cDNA 4931406C07 gene gb:AI255972Mm.14601 1,70 2,00 glutatione S-transferase, mu-2 gb:J04696

Codi Unigene Ratio C57BL/6 Ratio rLDL -/- Nom Gene Bank nºMm.3815 0,35 0,30 syndecan 4 gb:D89571Mm.297 0,44 0,30 actin, beta, cytoplasmic gb:M12481Mm.1311 0,47 0,70 murinoglobulin 1 gb:M65736Mm.181880 0,50 0,60 endoplasmatic reticulum D2 gb:AW123408Mm.12823 0,60 0,60 transducin-like enhancer of split 1 gb:U61362Mm. 5274 0,60 0,50 Cu-Zn superoxide dismutase gb:M35725Mm.10865 0,60 0,70 urate oxidase gb:M27695Mm.2020 0,60 0,70 cysteine-rich protein 2 gb:D88792Mm.8038 0,60 0,90 homolog. Human ZAP-70 kinase gb:AI386093Mm.88850 0,60 0,70 Zinc-Iron transporter -like gb:AA606878Mm. 300 0,70 0,50 carbonic anhydrase 3 gb:AJ006474Mm.10169 0,70 0,80 thiopurine methyltransferase gb:AF037044Mm.4603 0,70 0,70 scavenger receptor class B, member 1 gb:U37799Mm. 2856 0,70 0,60 interleukin 6 receptor, alpha gb:X51975Mm.2121 0,70 0,80 P27 gb:AI841894Mm.160237 0,70 0,70 Murinoglobulin-3 gb:M65237Mm.28548 0,70 0,50 lipin 1 gb:AI846934Mm.13020 0,80 0,50 Rho A2 gb:AI846668Mm.18522 0,90 0,70 carnitine palmitoyltransferase 1 gb:AF017175Mm.141443 0,90 0,70 lactate dehydrogenase 1-A gb:M17516Mm.41853 0,90 0,70 DNAse 2 alpha gb:AW120896

Estudi d'expressió gènica en fetges de ratolins C57BL/6 i rLDL-/- tractats amb PHT vs Controls Gens comuns sobreexpresats

Gens comuns reprimits

Degut a què els dos grups de ratolins van presentar un gran nombre de

seqüències sobreexpressades o reprimides de forma no consistent s’ha afegit un

annex amb els resultats globals dels dos grups. D’aquest gens, es van seleccionar

aquells que en el grup PHT es sobreexpressaven en una ràtio de ≥ 2 o es reprimien

≤ ½ respecte dels controls en les dues línies d’animals estudiades (veure Annex).

Resultats

106

En aquestes condicions, els fetges dels ratolins C57BL/6 en dieta WTD i tractats

amb PHT sobreexpressaven un total de 60 gens i se’n reprimien 204. Els ratolins

deficients en rLDL tractats amb PHT van donar un total de 397 gens

sobreexpressats i 59 gens reprimits.

DISCUSSIÓ

Discussió

109

1 EFECTE DE LA PHT EN RATOLINS SOBRE LA SUSCEPTIBILITAT A L´ARTERIOSCLEROSI I EL PERFIL LIPOPROTEIC

Els resultats d’aquest estudi demostren que els ratolins tractats amb PHT

desenvolupen lesions arterioscleròtiques en la base de l´aorta menys extenses que

les dels ratolins control. Amb tot, el tractament amb PHT no va reduir de forma

consistent l’àrea de lesió en tots els grups i els resultats obtinguts varien en funció

del sexe i del tipus de lesió.

El desenvolupament d’aquestes lesions es va reduir de forma consistent,

únicament, en els ratolins femella. Les bases d’aquestes diferències entre sexes en

els ratolins tractats amb PHT no es coneixen. Tanmateix, diversos treballs previs

han demostrat diferències importants en la formació i evolució de les lesions entre

ratolins femelles i mascles la soca C57BL/6 [161] [209]. A més, la resposta cel·lular

immune en ratolins models d’arteriosclerosi, com l’apoE-/-, varia en funció del

sexe [210] [211] i, per exemple, la suplementació dietètica de magnesi en aquest

tipus de ratolí redueix l’arteriosclerosi en femelles, però no en mascles [212]. Per

tant, és possible que determinats tractaments dietètics i/o farmacològics (com la

PHT) poguessin induir una resposta més accentuada en els ratolins femella de la

soca C57BL/6 que en els ratolins mascle.

L’efecte protector de la PHT en els ratolins femella va ser més pronunciat en els

animals que desenvolupen lesions del tipus estria grassa que en els animals que

desenvolupen arteriosclerosi madura. A més, l’efecte antiaterogènic de la PHT en

els ratolins que desenvolupaven lesions més avançades requeria concentracions

elevades del fàrmac.

Els ratolins C57BL/6 femella alimentats amb la dieta DRG i tractats amb PHT

van ser el model de ratolí que presentava l’efecte antiaterogènic de la PHT més

accentuat. Tanmateix, els ratolins d’aquest grup tractats amb PHT van presentar

elevades concentracions de transaminases que reflecteixen un augment important

Discussió

110

del dany hepatocel·lular. Aquesta alteració hepàtica podria haver influït sobre la

gliconeogènesi i interferir en els estudis d’arteriosclerosi. El fet que els ratolins

tractats amb PHT presentin una reducció de la concentració de glucosa i que

aquesta correlacioni amb l’àrea de lesió és consistent amb aquesta hipòtesi. Amb

tot, el tractament amb PHT en els altres dos grups de ratolins femella alimentats

amb la DRG (transgènics de PTEC i rLDL-/-), únicament, va incrementar les

transaminases de forma moderada en els ratolins rLDL-/-, i va reduir les lesions

arterioscleròtiques en ambdós grups sense alterar les concentracions plasmàtiques

de glucosa. A més, els ratolins C57BL/6 alimentats amb la WTD i tractats amb

PHT van presentar una reducció de l’àrea d’arteriosclerosis similar a la dels

ratolins transgènics de la PTEC i superior a la dels rLDL-/-, i una reducció

moderada de les transaminases. En conjunt, aquests resultats suggereixen que

l’acció de la PHT sobre el desenvolupament d’arteriosclerosi no esta directament

relacionada amb el model de ratolí ni amb el tipus de dieta aterogènica utilitzada.

La reducció en la incidència de malaltia coronària que presenten els pacients

epilèptics va ser atribuida en part a un increment en el cHDL [213] [214]). Tot i que

no tots els estudis han trobat que la PHT incrementi el cHDL [215], dos dels

estudis prospectius i ben controlats amb un seguiment superior a un mes en

pacients epilèptics amb el cHDL baix han trobat que la PHT incrementa el cHDL

en aproximadament un 11% [216] [194].

La concentració elevada de cHDL en ratolins també redueix el

desenvolupament d´arteriosclerosi [217] [162]. La PHT va incrementar

significativament el cHDL en dos dels grups de ratolins femelles (C57BL/6 i rLDL-

/- ambdós alimentats amb la dieta DRG). No obstant això, únicament en els

ratolins rLDL-/- el cHDL va correlacionar inversament amb l’àrea de

arteriosclerosi. En ratolins C57BL/6, el tractament farmacològic amb agonistes del

receptor nuclear RXR (“retinoid X receptor”), com els rexinoids, pot induir dany

hepàtic i incrementar el cHDL [218]. Aquest mecanisme podria explicar, en part,

l’increment del cHDL d’aquests dos grups de ratolins femelles tractats amb PHT

que presenten les transaminases elevades. Malgrat tot, dos dels grups de ratolins

Discussió

111

femella (C57BL/6 amb WTD i apoE-/-) tractats amb PHT van presentar una

reducció significativa del cHDL, i en un d’ells el cHDL correlacionava

positivament i significativament amb l’àrea d’arteriosclerosi. Per tant, els nostres

resultats no revelen canvis consistents en l’efecte de la PHT sobre el cHDL.

Una concentració insuficient de PHT podria explicar l’absència d’un efecte

consistent de la PHT sobre el cHDL [215] i el desenvolupament d’arteriosclerosi en

aquests models animals. La concentració plasmàtica de PHT en els diferents grups

de ratolins és inferior al rang terapèutic establert en humans (40-80 µM). No

obstant això, el rang terapèutic òptim pels ratolins és sensiblement inferior al

trobat en humans: 9-36 µM [219] [220]. A més, en un dels estudis controlat

mencionat anteriorment, els pacients tractats amb PHT i que presentaven un

increment del cHDL del 12% tenien concentracions plasmàtiques de PHT que

oscil·laven entre 16 i 33 µM [216]. En qualsevol cas, i exceptuant els ratolins apoE-

/- i rLDL-/- amb concentracions de PHT↓, les concentracions de PHT trobades en

tots els grups de ratolins d’aquest estudi serien suficient per induir efectes similars

de la PHT sobre el cHDL i el desenvolupament d’arteriosclerosi. En conjunt, els

nostres resultats descarten la possibilitat que l’efecte antiaterogènic de la PHT en

els ratolins femella estigui directament relacionat amb el cHDL.

Cal destacar el fet que en la majoria dels grups ratolins femelles, el tractament

amb PHT tendia a reduir el colesterol de no HDL (VLDL+LDL), tot i que en molts

dels grups aquest canvi no va ser significatiu ni dosi dependent. Tampoc no vam

trobar correlacions significatives i consistents entre el colesterol de no HDL i l’àrea

d’arteriosclerosi en la majoria dels grups. Conseqüentment, l’influència d’aquesta

tendència sobre l’àrea d’arteriosclerosi seria mínima.

La conjunció d’aquests resultats suggereix que l´acció de la PHT sobre

l´arteriosclerosi en aquests models animals no està directament relacionada amb la

concentració del colesterol de les diferents lipoproteïnes. També és molt probable

que els canvis inconsistents observats en perfil lipoproteic dels diferents grups de

ratolins tractats amb PHT siguin conseqüència de l’efecte diferencial de la

Discussió

112

interacció fàrmac-dieta sobre la funció hepàtica dels diferents models de ratolí

analitzats i/o de mecanismes compensatoris diferencials en els models animals

avaluats.

Les diferències en la patogènesi de les lesions del tipus estria grassa i de

l’arteriosclerosi avançada podrien explicar les diferències observades en l’efecte de

la PHT sobre els diferents tipus de lesions. Les alteracions en la funció endotelial i

en l’acumulació de monòcits, macròfags i limfòcits tenen un paper rellevant en

l’inici de la lesió. I les estries grasses evolucionen fins a lesions avançades

mitjançant la migració i proliferació de cèl·lules musculars llises [221]. És possible

que la PHT actui directament sobre les cèl·lules de la paret vascular, i que la

relació quantitativa dels diferents tipus cel·lulars en els diferents estadis de la lesió

determini la capacitat antiaterogènica de la PHT en ratolins. Així, la PHT podria

induir efectes antiinflamatoris en les cèl·lules endotelials, els monòcits, els

macròfags i/o els limfòcits, i, en canvi, tenir una influència menor sobre les

cèl·lules musculars llises. Aquest fet explicaria un menor efecte protector de la

PHT en els models d’arteriosclerosi avançada i, especialment, en les apoE-/-

femella que rebien el tractament amb PHT als 3 mesos d’edat en què ja han

desenvolupat lesions fibroproliferatives [209]. De fet, en estudis realitzats en

ratolins apoE-/-, s’ha trobat que l’injecció d’anticossos del receptor estimulador de

macròfags c-fms, la teràpia gènica amb apoE, i la deficiència de fibrinogen

redueixen la formació d’estries grasses, però no influeixen notablement en el

desenvolupament de les lesions arteriosclèrotiques en un estadi més avançat [222]

[223].

En la majoria dels grups de ratolins femella el desenvolupament d´aquestes

lesions és dependent de la dosi de PHT. La reducció en l´arteriosclerosi observada

en ratolins tractats amb PHT podria ser un potencial mecanisme que expliqués la

reducció en el risc de malaltia coronaria que presenten els pacients humans

tractats amb anticonvulsius [224] [225]. No obstant això, altres processos –de

forma dependent i/o independent de l’esmentada reducció d’arteriosclerosi- com

l’estabilització de la placa, una reducció en la trombogenicitat de la lesió o una

Discussió

113

reducció en la susceptibilitat a la trombosi, també podrien estar implicats en la

reducció d’infarts de miocardi observada en individus tractats amb PHT [221].

Discussió

114

2 EFECTE DE LA PHT SOBRE LA COMPOSICIÓ DE LES HDL I LA PROTECCIÓ DE LA MODIFICACIÓ OXIDATIVA DE LES LDL

L’expressió i/o inactivació de gens clau del metabolisme de les HDL (apoA-I,

SR B-I, ABC-A1) en ratolins modificats genèticament s’ha associat amb canvis en el

cHDL i en la susceptibilitat a l’arteriosclerosi [217] [162] [226] [227] [228] [229]

[230]. Malgrat tot, algunes modificacions genètiques en ratolins han demostrat un

efecte sobre la composició de les HDL i el transport revers de colesterol o sobre la

capacitat de les HDL d’inhibir la modificació oxidativa de les LDL, que poden

alterar el desenvolupament d’arteriosclerosi sense modificacions en el cHDL [231]

[232] [233] [234] [235].

A fi d’avaluar aquesta possibilitat, es van aïllar per ultracentrifugació les HDL a

partir de pools dels individus dels 4 grups de ratolins femelles amb l’efecte

antiaterogènic de la PHT més pronunciat (es va descartar el grup de femelles

C57BL/6 alimentat amb la dieta DRG ja que el tractament amb PHT accentuava

l’hepatotoxicitat de la dieta), es va determinar composició de les HDL, el contingut

d’apoA-I, i la capacitat de les HDL d´inhibir la modificació oxidativa de les LDL.

No es van trobar canvis consistents en la composició de les HDL aïllades per

ultracentrifugació i la concentració d’apoA-I va canviar en els 4 grups en relació

directa amb el cHDL. Cal destacar que els ratolins transgènics de PTEC femella

tractats amb PHT van presentar un increment notable en la concentració de

colesterol lliure i fosfolípids de les HDL. És probable que aquests canvis puguin

explicar la capacitat augmentada de les HDL d’aquests ratolins d’inhibir la

modificació oxidativa de les LDL [236]. En canvi, les HDL dels altres 3 grups de

ratolins femella tractats amb PHT no van alterar la suceptibilitat a l’oxidació de les

LDL. Aquests resultats són consistents amb els resultats del perfil d’expressió

génica dels fetges dels ratolins C57BL/6 alimentats amb la dieta tipus Western i

dels ratolins rLDL-/- alimentats amb la dieta DRG. Els dos gens que codifiquen

Discussió

115

els enzims principals d’HDL implicats en la protecció de la modificació oxidativa

de les LDL com són la paraxonasa I i l´acetilhidrolasa del factor activador

plaquetari [233] [234] [235] no es van trobar diferencialment espressats en els

rLDL-/- i, únicament, la paraxonasa I es va trobar un 1,4 vegades reprimida en els

C57BL/6 alimentats amb la dieta WTD i tractats amb PHT.

Conseqüentment, la reducció de l’àrea de lesió arterioscleròtica que presenten

aquests models de ratolins tractats amb PHT no sembla que sigui deguda a

alteracions en la composició de les HDL i/o a una capacitat augmentada per part

d’aquestes d’inhibir la modificació oxidativa de les LDL.

Discussió

116

3 EFECTE DE LA PHT SOBRE EL METABOLISME DE LES HDL

L’eflux de colesterol des de les cèl·lules perifèriques cap a les HDL és el primer

estadi en el transport revers de colesterol i és clau per l’homeostasi del colesterol.

En el present estudi, l’eflux de colesterol va ser determinat en mostres de plasma

de dos dels grups de ratolins femella (ratolins C57BL/6 alimentats amb la dieta

WTD i rLDL-/- alimentats amb la dieta DRG) utilitzant cèl·lules de hepatoma de

rata [232]. L’eflux de colesterol al plasma dels ratolins tractats amb PHT va ser

significativament inferior que el del ratolins control. Aquests resultats són

consistents amb la deficiència del cHDL que presenten els ratolins C57BL/6

alimentats amb la dieta Western i tractats amb PHT, però contrasten amb

l’increment del cHDL que presenten els rLDL-/- tractats. Aquest mètode estudia

in vitro l’eflux a través de la fase aquosa des de les membranes cel·lulars cap a les

HDL. Amb tot, les cèl·lules d’hepatoma de rata no han estat exposades a

concentracions elevades de PHT que podrien alterar l’expressió d’ABC-A1, i

induir el transport actiu i ràpid del colesterol cap a les HDL in vivo [230]. En aquest

sentit, els fetges dels ratolins rLDL-/- tractats amb PHT van presentar un

pronunciat augment (2,5 vegades) de l’expressió hepàtica d’ABC-A1; i el

tractament amb PHT dels ratolins C57BL/6 va provocar una repressió notable (1,9

vegades) en l’expressió d’ABC-A1. Això, podria ser important per tal d’explicar les

diferències en el cHDL que es van trobar en els dos grups de ratolins tractats.

També és posible que la sobreexpressió diferencial (més de 5 vegades) del gen de

la lipoprotein lipasa (LPL) pogués contribuir a l’increment del cHDL que

presenten els ratolins rLDL-/- tractats amb PHT [237]. Per tant, no sembla existir

una relació directa entre la PHT i l’expressió hepàtica d’ABC-A1 en aquests

models de ratolí. Els canvis inconsistents en l’expressió d’aquest gen per part de la

PHT poden ser deguts a l´existència de mecanismes compensatoris diferents en els

dos models de ratolí analitzats.

Discussió

117

En humans, el tractament amb anticonvulsius incrementa en aproximadament 8

vegades la concentració plasmática de 4β-hidroxicolesterol, probablement a través

de citocrom (CYP) P450 3A4 [238], i aquest és un bon activador del receptor

nuclear LXR (“liver X receptor”) α que regula un nombre important de gens

implicats en el metabolisme lipoproteic amb efectes antiaterogènics [239]. En

contrast, els canvis inconsistents en l’expressió d’ABC-A1 i la LPL, i en l’eflux de

colesterol no semblen indicar un procés comú d’activació de l’LXRα [240] en els

dos grups de ratolins tractats amb PHT. És possible que part d´aquestes

diferències siguin degudes a les diferències en el procès de metabolització de la

PHT entre ratolins i humans. Per exemple, en humans els principals CYPS

implicats en la detoxificació de la PHT són el CYP2C9 i el 2C29 [241]. En canvi, el

CYP 2B10 (homòleg al 2B6 humà) sembla ser el principal enzim implicat en el

metabolisme de la PHT en aquests models de ratolí.

L’últim pas del transport revers de colesterol és l’aclariment del colesterol

derivat de les cèl·lules a través del fetge mitjançant l’acció de receptors específics

d’HDL. Per estudiar l’aclariment del colesterol de les partícules d’HDL, aquestes

es van marcar amb colesteril oleïl éter tritiat i es va avaluar la taxa d’aclariment en

els dos tipus de ratolins mencionats anteriorment. El tractament amb PHT va

incrementar de forma consistent la taxa catabòlica fraccional de les HDL en els dos

models de ratolí estudiats. L’SR-BI és el principal receptor fisiològicament

rellevant que es coneix, implicat en en la captació selectiva dels èsters de colesterol

pel fetge, glàndules adrenals i ovaris [228]. Tanmateix, l’expressió d’SRB-I en fetge

estava reprimida de forma consistent i significativa en els dos models de ratolí

tractats amb PHT. El fet que aquests canvis no estiguin causats per un augment en

l’expressió d’SR-BI, suggereix que pot haver altres receptors implicats en la

captació del cHDL o que in vivo la interacció de les HDL dels ratolins tractats amb

PHT promogui un augment en la transferencia d’èsters de colesterol via SR-BI al

fetge i/o a altres teixits esteroidogènics. Tampoc no es van trobar alteracions en

l’expressió de la cadena β de l’ATP sintasa que ha estat recenment descrita com un

receptor potencialment implicat en l’aclariment hepàtic de les partícules d’HDL

Discussió

118

[242]. La reducció en l’expressió d’SR-BI trobada en ratolins podria explicar

l’increment del cHDL trobat en pacients humans tractats amb fàrmacs

anticonvulsius [216] [194]. Amb tot, aquests canvis serien proaterogènics [228]

[229] i no podrien explicar la reducció de la incidència de malaltia coronària

descrita en pacients epilèptics ni l’efecte antiaterogènic de la PHT en ratolins.

En conjunt, tots aquests resultats suggereixen que la PHT pot alterar de forma

consistent el metabolisme de l’HDL en els dos models de ratolí avaluats. La

reducció en l’eflux de colesterol dels ratolins tractats amb PHT resultaria en una

disminució del transport revers de colesterol. En canvi, l’increment en l’aclariment

del colesterol esterificat d’HDL promouria el transport revers de colesterol en els

ratolins tractats amb PHT. No obstant això, els mecanismes responsables

d’aquestes alteracions són desconeguts i no poden ser explicats per canvis

consistents en l’expressió dels gens hepàtics que se saben estàn implicats en el

metabolisme de les HDL. Conseqüentment, els nostres resultats tampoc no poden

descartar totalment que l’ efecte antiaterogènic de la PHT en els dos models de

ratolí estigui, en part, relacionat amb un increment del transport revers de

colesterol.

Discussió

119

4 MECANISMES POTENCIALS MITJANÇANT ELS QUALS LA PHT POT REDUIR L’ARTERIOSCLEROSI

Els resultats del perfil d’expressió génica demostren que hi ha un nombre

important de gens alterats en la seva expressió com a conseqüència del tractament

amb PHT. L’anàlisi d’alguns gens hepàtics sobreexpressats o reprimits de forma

consistent suggereix potencials mecanismes, que si es donessin en les artèries,

podrien explicar l’efecte antiaterogènic de la PHT en aquests models de ratolí.

La majoria dels citocroms P450 (CYP) són majoritàriament expressats en fetge.

Dades recents suggereixen que l’expressió diferencial de CYPs en les cèl·lules

musculars llises i les cèl·lules endotelials de la paret arterial té un paper clau en la

regulació del to vascular [243] [244]. Molts d’aquests CYPs són capaços de

metabolitzar l’àcid araquidònic i transformar-lo en una sèrie d’àcids

epoxieicosatrienòics (EETs) estereoespecífics: els 5,6-, 8,9-, 11-12, 14,15-EETs [243].

Aquests EETs promouen múltiples respostes biològiques que és poden atribuir a

la seva capacitat d’activar un nombre important de vies de senyalització

intracel·lular en les cèl· lules musculars llises i endotelials [245]. L´11,12 EET

sembla tenir propietats antiinflamatories ja que la introducció exògena d’aquest

EET en ratolins estimulats amb TNFα o cèl·lules endotelials, és capaç de reprimir

l’expressió d'NF-kB i de VCAM-1, i poden ajudar a mantenir la paret vascular en

un estat antiaterogènic [246]. L´11,12 EET també té la capacitat d’inhibir la

migració de les cèl·lules musculars llises [247]. El CYP 2C9 és un dels principals

enzims involucrats en el metabolisme de la PHT en humans [241].

Conseqüentment, un increment de l’expressió del CYP2C9 en les cèl·lules de la

paret arterial podria induir la fomació de 11,12-EET i explicar l’efecte

antiaterogènic d’aquest anticonvulsiu [244] [248]. Tanmateix, les conseqüències de

l’activació endògena del CYP2C9 en cèl·lules endotelials són radicalment oposades

a les observades amb la introducció dels EETs en aquest tipus cel·lular [246] [249]

[250]. Aquesta aparent contradicció és probablement deguda al fet que l’expressió

endotelial del CYP2C9 genera augments substancials de radicals lliures derivats

Discussió

120

del oxígen que suprimirien l’efecte antiinflamatori dels EETs [249]. Aquestes

dades suggereixen un paper rellevant del CYP2C9 en la regulació de la homeostasi

i el to vascular en humans però, les condicions fisiopatològiques en les que aquest

enzim está activat i els mecanismes d’acció d’aquest en la paret vascular encara no

han estat ben definits [251].

A diferència dels humans, el CYP 2B10 sembla ser el principal enzim implicat

en el metabolisme de la PHT en aquests models de ratolí. Aquest CYP pot influir

de forma diferent en el perfil metabòlic de l’àcid araquidònic dels ratolins [252] i,

per tant, en el patró de resposta de la paret vascular d’aquests animals en

comparació al de humans. No es pot descartar totalment que l’efecte

antiaterogènic de la PHT en els nostres ratolins estigui associat a un increment en

l’expressió del CYP2B10. Diversos estudis han demostrat que el receptor orfe

nuclear CAR (“constitutive androstane receptor”) indueix la transcripció del

CYP2B10 murídic o del seu homòleg huma 2B6 en resposta al tractament amb

fenobarbital [253] [254], amb efectes potencialment antiaterogènics [255]. És més,

el CYP2C9 també està regulat mitjançant l’acció del CAR en humans [256]. La

repressió consistent del gen de la carnitin palmitoïl transferasa 1 (CPT1A), un dels

principals enzims control·lat per CAR, també és consistent amb un procés

d’inducció del CAR en resposta a la PHT (253). El CAR heterodimeritza amb el

receptor RXR i pot controlar l’expressió d’un nombre important de gens hepàtics,

alguns dels quals codifiquen enzims clau en la regulació de processos fisiològics

com la detoxificació cel·lular dels aldèhids, l’oxidació dels àcids grassos i la

gluconeogènesi [253] [186] [257]. Amb tot, els sistemes de regulació de l'activació

del CAR i de molts dels gens controlats per ell són encara desconeguts.

Recenment, s'ha demostrat que l'activació del CAR requereix de la cooperació d'un

coactivador del PPAR ("peroxisome proliferator activated receptor") γ [258], i són

ben coneguts, els efectes antiinflamatoris i antiaterogènics dels agonistes del PPAR

γ [218].

És important destacar la relació existent entre l’expressió del CYP2B10 i la

metabolització de les hormones esteroidals. El 17β-estradiol (E2) indueix

Discussió

121

l’expressió del CYP2B10 [259] i aquesta expressió està regulada per CAR [(260)].

En canvi, els andrògens reprimeixen l’activitat de CAR a concentracions

fisiològiques [259]. Per tant, el CAR podria tenir un paper rellevant en la regulació

de gens hepàtics controlats pel E2. I el tractament amb E2 té efectes

antiinflamamtoris i redueix l'arteriosclerosi en ratolins models d’arteriosclerosi

com el rLDL-/- i l’apoE-/- (261). Aquest fet podria explicar una resposta

antiaterogènica de la PHT media per CAR més accentuada en els ratolins femella

que en els ratolins mascle. És més, l’E2 inhibeix la formació d’estries grasses, però

no la progressió de lesions fibroproliferatives, en apoE-/- [262], i això podria

ajudar a explicar l’efecte més protector de la PHT sobre les estries grasses.

Alguns dels gens sobreexpressats i reprimitis estan implicats en la regulació de

l’estrés oxidatiu. El Cu-Zn superòxid dismutasa és un dels principals enzims

implicats en la eliminació dels anions superòxid. Tanmateix, una reducció en la

expressió d’aquest enzim té molt poca influència en el desenvolupament

d’arteriosclerosi dels ratolins C57BL/6 [263]. En canvi, la inducció de les GST

(glutathione S-transferase) en les cèl·lules de la paret vascular podria protegir-les

de l’estrés oxidatiu i tenir efectes antiaterogènics [264] [265], encara que les

conseqüències d’aquests processos no estàn clarament definides [266].

Un dels canvis més consistent i accentuat en els ratolins tractats amb PHT és la

repressió dels gen syndecan 4 i el de la β actina. El sindecan-4 s’expressa de forma

ubiqua [267] i s’ha demostrat que és el principal proteoglicà responsable de

l’adhesió cel·lular mediada per la fibronectina [268]. A més, l’expressió localitzada

de syndecan-4 es relaciona directament amb el reclutament i reorganització

d’altres proteïnes del citoesquelet [269] [270] [271]. D’altra banda, diversos treballs

indiquen que el syndecan 4 estimula la proliferació de fibroblasts, limfòcits,

monòcits i cèl·lules musculars llises [269] [272] [273] [274], i que el seu efecte

podria ser mediat per l’acció de GTPases de la familia Rho, com Cdc42 i RhoA

[275]. A més, les estatines protegeixen a les cèl·lules endotelials dels efectes de la

trombina i l´LDL oxidada mitjançant l’inhibició de les Rho-GTPases [276] [277]; i la

reducció de l'expressió de Cdc42 retarda l’acumulació intracel·lular de lipids [278].

Discussió

122

També s'ha suggerit la possibilitat que el Cdc42 actui en coordinació amb l'ABC-

A1 i que aquest pogués incrementar el transport revers de colesterol des de

macròfags i/o altres teixits perifèrics cap al fetge [278][279)]. En resum, una

reducció en l’expressió de sindecan 4, β actina i RhoA en les cèl·lules de la paret

vascular podria reduir la disfunció endotelial, la migració i el reclutament de

cèl·lules inflamatòries, i l’acumulació de lípids implicats en la formació de les

lesions arterioscleròtiques [221]. Aquesta hipòtesi és consistent amb el resultats de

diversos estudis experimentals que ja han demostrat una relació directa entre

l’expressió de syndecan 4 o Rho i l’aterogènesi [276] [277], l´angiogènesi [274] [280]

o la incidència d’infarts de miocardi [281] [282].

La repressió moderada d’altres gens en els ratolins tractats amb PHT també

podria induir efectes antiinflamatoris en la paret vascular. El receptor de

l’interleukina 6 (rIL6) és un receptor específic de l’IL6 i la seva interacció promou

múltiples respostes biològiques. El principal efecte biològic de l’IL6 és la

proliferació i diferenciació dels limfòcits T i macròfags [211] [283]. La ZAP70

kinase també regula l’activació de les cèl·lules T [284]. I la reducció en la activació

de les cèl·lules T redueix l’area arteriosclerosi en ratolins [285].

La proteïna rica en cisteïna-2 és un membre d’una família de proteïnes

anomenades LIM que s’expressa preferencialment en les cèl·lules musculars llises

de les arteries i regula la seva proliferació [286]. Una reducció en la seva expressió

podria inhibir la migració d’aquest tipus cel·lular que té un paper rellevant en el

desenvolupament de les lesions fibroproliferatives [221].

Els nostres resultats contrasten amb els d´un treball publicat recentment i

realitzat en embrions de ratolins de la soca SWV/Fnn exposats a nivells de PHT

teratogènics [287]. El perfil d’expressió génica de la regió craniofacial d’aquests

embrions ha demostrat un increment de l’expressió dels receptors de l’àcid

retinoic α, β y γ, i de l’expressió dels factors de creixement IGF-2, TGFα i β1 en els

embrions exposats a la PHT [287]. Els nostres ratolins tractats amb PHT no van

presentar canvis consistents en l’expressió d’aquests gens. Aquestes diferències

Discussió

123

són probablement degudes a les diferents dosis utilitzades, l’edat i soca dels

animals, els teixits avaluats o la via d´administració de la PHT. A més, aquest

estudi únicament va avaluar l’expressió de 36 gens candidats a alterar el

desenvolupament embrionari (amb macroarrays) i la majoria dels gens estudiats

en els models de ratolí del nostre estudi no estaven inclosos.

S’hade tenir en compte que el microchip (microarray U74A) utilitzat en el

nostre estudi permet avaluar l’expressió d’aproximadament 12.000 gens de ratolí.

Aquest microarray inclou la majoria dels gens coneguts que estàn implicats en el

metabolisme lipoproteic. Malgrat tot, l'anàlisi complerta del perfil d'expressió

gènica dels ratolins tractats amb PHT implicaria l'hibridació dels dos microarrays

addicionals U74B i C i, per tant, no es pot descartar la implicació de altres gens en

l'efecte antiaterogènic de la PHT. Amb tot, són necessaris més estudis que avaluin

l’efecte de la PHT sobre el perfil d’expressió gènica i la composició cel·lular i

proteica de les arteries d’aquests models animals. En aquest sentit, l’aplicació

combinada de les tecnologies de genòmica i proteòmica a les cèl·lules de la paret

vascular pot permetre la identificació de noves proteïnes implicades en l’efecte

protector de la PHT sobre l'arteriosclerosi en aquests animals.

En resum, el tractament amb PHT redueix el desenvolupament de lesions del

tipus estria grassa i d’arteriosclerosi avançada en ratolins models d’aquesta

malaltia independentment dels canvis en la concentració del cHDL. La repressió

consistent de determinats gens hepàtics implicats en processos inflamatoris i de

proliferació, adhesió i migració cel·lular podria proveir un mecanisme potencial

que, si es donés en les arteries, podria explicar l’efecte antiaterogènic de la PHT.

CONCLUSIONS

Conclusions

127

1. Els ratolins femella tractats amb PHT, però no els mascles, desenvolupen

lesions arterioscleròtiques en la base de l´aorta menys extenses que les dels

ratolins control. L’efecte protector de la PHT en els ratolins femella va ser més

pronunciat en els animals que desenvolupaven lesions del tipus estria grassa

que en els animals que desenvolupaven arteriosclerosi avançada.

2. La reducció de l’àrea de lesió arterioscleròtica que presenten aquests models de

ratolins femella tractats amb PHT és independent de la concentració del

colesterol d’ HDL i del colesterol de no HDL. Tampoc no sembla que sigui

deguda a alteracions en la composició de les HDL.

3. Respecte a algunes de les propietats antiaterogèniques de les HDLs dels

animals tractats amb PHT:

a/ Els resultats d’eflux de colesterol in vitro i de cinètica catabòlica in vivo

de les HDLs no aporten cap prova concluent sobre l’existència d’un

augment del transport revers de colesterol. Tanmateix, l’expressió

diferencial hepàtica d’alguns gens podria indicar l’existència de canvis en el

trànsit intracel·lular de colesterol.

b/ No es va trobar cap augment consistent de la capacitat per part de les

HDL d’inhibir la modificació oxidativa de les LDL.

4. En les dues soques d’animals estudiades, els canvis d’expressió consistents de

deteminats gens hepàtics implicats en processos inflamatoris, de proliferació,

adhesió i migració cel·lular podria ser un mecanisme potencial que - si es donés

en l’aorta proximal - explicaria l’efecte antiaterogènic de la PHT.

Annex

131

Codi Unigene Ratio Nom Gene Bank nºMm.14177 9,85 Cytochrome P450, 2b10 gb:M21856Mm.27723 8,00 Feminization 1 homolog.a (C. Elegans) gb:AF064447Mm.13000 3,03 Histidine ammonia lyase gb:L07645Mm.200695 2,83 torsin family 2, member A gb:AI841457Mm.2662 2,83 glutathione S-transferase, alpha 4 gb:L06047Mm.23995 2,46 hepcidin antimicrobial peptide gb:AI255961Mm.2011 2,46 glutathione S-transferase, mu 1 gb:J03952Mm.29651 2,46 RIKEN cDNA 1110030L07 gene gb:AW047363Mm.37199 2,46 glutathione S-transferase, mu 3 gb:J03953Mm.37199 2,46 glutathione S-transferase, mu 3 gb:J03953Mm.38963 2,46 expressed sequence AT2 66900 gb:AF047542Mm.41683 2,46 RIKEN cDNA 0610012G03 gene gb:AI845963Mm.14460 2,46 aldo-keto reductase family 1, member B7 gb:J05663Mm.24118 2,30 glutathione S-transferase, theta 2 gb:X98056Mm.12194 2,30 Proteasome (prosome macropain) 26S subunit non-ATPase, 3 gb:M25149Mm.182227 2,30 RIKEN cDNA 4931406C07 gene gb:AW060190Mm.29483 2,30 RIKEN cDNA 1600025H15 gene gb:AI842734Mm.25044 2,30 flightless I homolog (Drosophila) gb:C79694Mm.181562 2,30 adhesion regulating molecule 1 gb:AW123694Mm.3863 2,30 P450 (cytochrome) oxidoreductase gb:D17571Mm.28161 2,30 zinc finger protein 36, C3H type-like 2 gb:M58564Mm.21961 2,30 ATPase, H+ transporting, lysosomal (vacuolar proton pump), subunit 1 gb:AI646638Mm.6919 2,14 dynactin 1 gb:U60312Mm.15537 2,14 cytochrome P450, 1a2, aromatic compound inducible gb:X04283Mm. 28585 2,14 thyroid hormone responsive SPOT14 homolog (Rattus) gb:X95279Mm. 1491 2,14 FXYD domain-containing ion transport regulator 1 gb:AF091390Mm.104363 2,14 cytochrome P450, 2d9 gb:M27168Mm.27839 2,14 Hypothetical protein MGC6696 gb:AI787713Mm.3308 2,14 tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein gb:AW046650Mm.34570 2,14 RNA polymerase 1-3 (16 kDa subunit) gb:AI853173Mm. 174372 2,14 cytochrome P450, 2d10 gb:M24263Mm.28668 2,14 coatomer protein complex, subunit epsilon gb:AI844701Mm.43831 2,14 lectin, galactose binding, soluble 1 gb:X15986Mm.197422 2,14 glutathione S-transferase, alpha 2 (Yc2) gb:J03958Mm.3322 2,14 histocompatibility 2, class II, locus Mb1 gb:U35330Mm.26600 2,14 RIKEN cDNA 6330505C01 gene gb:AA822296Mm.4609 2,00 peroxisomal biogenesis factor 14 gb:AI881987Mm.120807 2,00 carboxylesterase 3 gb:AW226939Mm.2011 2,00 glutathione S-transferase, mu 1 gb:AI841270Mm.1262 2,00 cytochrome P450, 17 gb:M64863Mm.14781 2,00 cytochrome P450, 2a4 gb:M19319Mm.15093 2,00 solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 1-like gb:AF028739Mm.20889 2,00 cytochrome P450, 8b1, sterol 12 alpha-hydrolase gb:AF090317Mm.18634 2,00 RIKEN cDNA 1810024J13 gene gb:AI838735Mm.28242 2,00 RIKEN cDNA 2810428I15 gene gb:AI854550Mm.90587 2,00 enolase 1, alpha non-neuron gb:AI841389Mm.41170 2,00 Kruppel-like factor 13 gb:AW125783Mm.19143 2,00 aminolevulinic acid synthase 1 gb:M63245Mm.202653 2,00 expressed sequence AI132487 gb:AI173533Mm.29141 2,00 RIKEN cDNA 0710008N11 gene gb:AA674669Mm.24495 2,00 RIKEN cDNA 2410015A15 gene gb:AW049776Mm.38011 2,00 brain protein I3 gb:X61454Mm.28896 2,00 serologically defined colon cancer antigen 28 gb:AW049732Mm.29080 2,00 RIKEN cDNA 1810074H01 gene gb:AA683966Mm.30080 2,00 eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 4 (delta, 44 kDa) gb:U70733Mm.3105 2,00 zinc finger protein, multitype 1 gb:AF006492Mm.35727 2,00 RAB11B, member RAS oncogene family gb:L26528Mm.41890 2,00 RIKEN cDNA 2010315L10 gene gb:AI835662Mm.22045 2,00 cytochrome P450 CYP4F13 gb:AI462001Mm.5129 2,00 steroid sulfatase gb:U37545

Canvis d'expressió gènica en fetges de ratolins C57BL/6 en dieta WTD tractats amb PHT vs Controls Gens sobreexpresats

Annex

132

Codi Unigene Ratio Nom Gene Bank nºMm.1761 0,05 CDC-like kinase gb:M38381Mm.168 0,07 interferon-related developmental regulator 1 gb:V00756Mm.293 0,07 protein phosphatase 3, catalytic subunit, alpha isoform gb:J05479Mm.4582 0,08 c-mer proto-oncogene gb:U21301Mm.28513 0,08 trans-acting transcription factor 3 gb:AF062567Mm.25148 0,09 RIKEN cDNA 5730403E06 gene gb:AI845108Mm.36742 0,09 decysin 1, ADAM-like gb:AJ242912Mm.491 0,09 RIKEN cDNA 3110043021 gene gb:AI840585Mm.200516 0,09 phosphotidylinositol transfer protein, beta gb:AI747899Mm.142195 0,10 RIKEN cDNA 2210008F15 gene gb:AF006465Mm.1940 0,10 colony stimulating factor 2 receptor, beta 2, low-affinity gb:M29855Mm.24794 0,13 RIKEN cDNA 2410001E19 gene gb:AA895984Mm.18459 0,13 fibroblast growth factor inducible 14 gb:U42386Mm.27337 0,14 RIKEN cDNA A030007L17 gene gb:AI854331Mm.27074 0,14 RIKEN cDNA 2610019N13 gene gb:AW122195Mm.18072 0,15 calcitonin gene-related peptide-receptor component protein gb:AF028242Mm.24778 0,15 calpain 7 gb:AJ012475Mm.4511 0,15 RIKEN cDNA 8430437G11 gene gb:AI846313Mm.34447 0,15 vomeronasal 2, receptor, 15 gb:AF011425Mm. 136604 0,18 nuclear factor, interleukin 3, regulated gb:U83148Mm.46746 0,18 RIKEN cDNA 2010306G19 gene gb:AA763918Mm.196617 0,19 glycoprotein 49 A gb:M65027Mm.9488 0,19 CDC like kinase 4 gb:AF033566Mm.1231 0,19 cysteine rich protein 61 gb:M32490Mm.35796 0,19 ecotropic viral integration site 5 gb:U53586Mm. 582 0,20 fatty acid binding protein 4, adipocyte gb:M20497Mm.903 0,20 B-cell translocation gene 2, antiproliferative gb:M64292Mm.21331 0,20 RIKEN cDNA 4930451A13 gene gb:AW213777Mm.34106 0,20 expressed sequence AI467657 gb:AI553024Mm.21288 0,20 Ell-related RNA polymerase II, elongation factor gb:AI197161Mm.4449 0,22 endonuclease 6 gb:AW123127Mm.200941 0,25 serum amyloid A 2 gb:U60438Mm.1263 0,25 serine (or cysteine) proteinase inhibitor gb:M33960Mm.28750 0,25 ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat gene, X chromosome gb:AJ002730Mm.123225 0,25 pleckstrin homology, sec 7 and coiled/coil domains, binding protein gb:AI120844Mm.28687 0,25 moesin gb:AI839417Mm. 5043 0,25 FBJ osteosarcoma oncogene gb:V00727Mm.41935 0,25 RIKEN cDNA 1200003F12 gene gb:AW124271Mm.46401 0,25 Son cell proliferation protein gb:AA673981Mm.29095 0,27 complement component 9 gb:X05475Mm.28719 0,27 WD-40-repeat-containing protein with a SOCS box 1 gb:AF033186Mm. 3644 0,27 Fatty acid Binding protein 7, brain gb:U04827Mm.21300 0,29 insulin-like growth factor binding protein 1 gb:X81579Mm.15675 0,29 ephrin A1 gb:U90662Mm.22459 0,29 expressed sequence AI265322 gb:AA755234Mm.27311 0,29 Protein-tyrosine phosphatase PTEN gb:AI848984Mm.29163 0,29 calpastatin gb:AB026997Mm.196201 0,31 maternal embryonic message 3 gb:U47024Mm.193041 0,31 RIKEN cDNA 111003 0N06 gene gb:AW259500Mm.2706 0,33 activating transcription factor 3 gb:U19118Mm. 9537 0,33 Lipocalin 2 gb:X81627Mm.117992 0,33 ABC7 mouse gb:AW124239Mm.31362 0,33 expressed sequence AA986712 gb:AA790291Mm.175661 0,33 RIKEN cDNA 1110036C17 gene gb:AW123191Mm.10160 0,33 expressed sequence AA960172 gb:AW045426Mm.21446 0,33 RIKEN cDNA 1190008F14 gene gb:AI848671Mm. 2899 0,33 Preproen Kephalin 1 gb:M55181Mm.3131 0,33 dihydrolipoamide dehydrogenase gb:U73445Mm.43213 0,33 splicing factor proline/glutamine rich gb:AA690583Mm.4027 0,33 homeo box A4 gb:AV279579

Canvis d'expressió gènica en fetges de ratolins C57BL/6 en dieta WTD tractats amb PHT vs Controls Gens reprimits

Annex

133

Mm.3242 0,35 glycerol kinase gb:U48403Mm.34775 0,35 pyruvate dehydrogenase E1 alpha 1 gb:M76727Mm.3815 0,35 syndecan 4 gb:D89571Mm.88200 0,35 CD72 antigen gb:J04170Mm.196770 0,35 Bc12a1b gb:U23778Mm.21759 0,35 RAB12, member RAS oncogene family gb:AI848325Mm.4452 0,35 aryl-hydrocarbon receptor gb:M94623Mm.98914 0,35 Major histocompatibility 2, Q region locus 1b gb:U96752Mm.3996 0,35 conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase gb:U12473Mm.2165 0,38 serum amyloid P-component gb:M23552Mm.9925 0,38 isocitrate dehydrogenase 1 (NADP+), soluble gb:AF020039Mm.196666 0,38 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 5 gb:D45850Mm.19130 0,38 RIKEN cDNA 1110059L23 gene gb:AI852098Mm.20925 0,38 G1 to S phase transition protein 1 homolg gb:AB003502Mm.46754 0,38 RIKEN cDNA 5033402L14 gene gb:AW060684Mm.28919 0,38 destrin gb:AB025406Mm.171292 0,38 RIKEN cDNA 2010200I23 gene gb:AW122573Mm.20450 0,38 nucleosome binding protein 1 gb:AB018374Mm.2904 0,38 zinc finger protein 216 gb:AF062071Mm.1775 0,38 hematological and neurological expressed sequence 1 gb:U90123Mm.87857 0,38 Bc12a1d gb:U23781Mm.179252 0,38 Nd1-pending gb:AI854285Mm.24655 0,38 RIKEN cDNA 1110059E24 gene gb:AI854226Mm.88548 0,38 ESTs gb:AA682038Mm.218648 0,38 ESTs gb:C77009Mm.10709 0,41 UDP-glucose dehydrogenase gb:AF061017Mm.14087 0,41 complement component 4 binding protein gb:M17122Mm.1098 0,41 GPI-anchored membrane protein 1 gb:U18773Mm.22505 0,41 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 12 gb:AF064635Mm.14173 0,41 orosomucoid 2 gb:M12566Mm.24805 0,41 RIKEN cDNA 2210415M14 gene gb:AI526902Mm.22435 0,41 golgi phosphoprotein 3 gb:AW060175Mm.512 0,41 WW domain binding protein 5 gb:U92454Mm.8534 0,41 epidermal growth factor receptor gb:AW049716Mm.227 0,41 RIKEN cDNA 1110004F14 gene gb:AI843901Mm.21762 0,41 RIKEN cDNA 1200006L06 gene gb:AW046006Mm.15125 0,41 stromal cell derived factor receptor 1 gb:D50463Mm.21203 0,41 zinc-finger protein 265 gb:AI835041Mm.25 0,41 growth arrest specific 2 gb:M21828Mm.24169 0,41 CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP), related sequence 1 gb:U19891Mm.202804 0,41 expressed sequence AI255215 gb:AW046449Mm.30097 0,41 proteasome (prosome, macropain) subunit, alpha type 1 gb:AI836804Mm.38211 0,41 ESTs, weakly similar to neurofilament triplet M protein (C. elegans) gb:AW125453Mm.36894 0,41 transcription factor 12 gb:X64840Mm.196322 0,41 EST X83313 gb:AW214136Mm.19187 0,44 prothymosin alpha gb:X56135Mm.213045 0,44 RIKEN cDNA 2610209F03 gene gb:AW046194Mm.297 0,44 actin, beta, cytoplasmic gb:M12481(Mm.56804) 0,44 Ig Kappa chain V-V region MOPC21 (precurssor) gb:M80423Mm.205096 0,44 absent in melanoma 1 gb:AA711704Mm.1591 0,44 phosphatase and tensin homolog gb:U92437Mm.25306 0,44 RAB9, member RAS oncogene family gb:AB027290Mm.25311 0,44 RIKEN cDNA 1810015C04 gene gb:AW122893Mm.25575 0,44 matrin 3 gb:AI835367Mm.28107 0,44 ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2 gb:AW122933Mm.28398 0,44 fatty acid binding protein 2, intestinal gb:M65034Mm.3619 0,44 cathepsin S gb:AJ223208Mm.21545 0,44 tryptophan 2,3-dioxygenase gb:AI194855Mm.10283 0,44 pyruvate dehydrogenase kinase 4 gb:AJ001418Mm.13081 0,44 sterol-C5-desaturase homolog (S. cerevisae) gb:AB016248Mm.13123 0,44 glycophorin gb:M26385Mm.157101 0,44 RIKEN cDNA C330007P06 gene gb:AW047329Mm.30805 0,44 RIKEN cDNA 4930568P13 gene gb:AA756506Mm.23961 0,44 actinin, alpha1 gb:AI195392Mm.28057 0,44 RIKEN cDNA 1110064N10 gene gb:AW124599Mm.12236 0,44 zinc finger protein 207 gb:AB013357Mm.123110 0,44 beta-spectrin2,non-erythrocytic gb:M74773Mm.22262 0,44 Cluster Incl M74123:Mus musculus gb:M74123Mm.201174 0,44 expressed sequence C81487 gb:AI850140Mm.27954 0,44 RIKEN cDNA C330006A16 gene gb:AI843294

Annex

134

Mm.88188 0,47 DEAD/His box polypeptide 3 gb:L25126Mm.90115 0,47 lysophospholipase 1 gb:AA840463Mm.1193 0,47 glutamyl aminopeptidase gb:M29961Mm.18553 0,47 murinoglobulin 2 gb:M65238Mm.2404 0,47 dual specificity phosphatase 1 gb:X61940Mm.68157 0,47 ESTs, Highly similar to YSPL-1 form 1 [M.musculus] gb:AV222871Mm.183022 0,47 DNA segment, Chr 8, Brigham & Women's Genetics 1112 expressed gb:AV269118Mm.1311 0,47 murinoglobulin 1 gb:M65736Mm.20921 0,47 immunoglobulin superfamily, member 4 gb:AF061260Mm.21679 0,47 RIKEN cDNA 1300002F13 gene gb:AW212475Mm.202187 0,47 expressed sequence AA959686 gb:L04966Mm.2567 0,47 elongation of very long chain fatty acids-like 2 gb:AI317360Mm.28777 0,47 expressed sequence AI115446 gb:AW125273Mm.28830 0,47 pre-B-cell colony-enhancing factor gb:AI852144Mm.28909 0,47 protein tyrosine phosphatase 4a1 gb:U84411Mm.2692 0,47 CD53 antigen gb:X97227Mm.40620 0,47 RIKEN cDNA 9130415E20 gene gb:AI848868Mm.28972 0,47 expressed sequence T25534 gb:AI842674Mm.28026 0,47 Mus muscukus, clone Image:3979323, mRNA gb:AI845225Mm.28083 0,47 CD164 antigen gb:AB014464Mm.2849 0,47 heat shock protein, 74kDa, A gb:D17666Mm.3487 0,47 ribosomal protein L30 gb:K02928Mm.715 0,47 hemopoietic cell kinase gb:J03023Mm.17873 0,47 ESTs gb:AI536457Mm.21567 0,47 S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A) gb:M83218Mm.27463 0,47 expressed sequence AI851288 gb:AI122079Mm.4215 0,47 catalase 1 gb:AV083603Mm.14352 0,47 Sel1 (suppressor of lin-12) 1 homolog (C. elegans) gb:AF063095Mm.25065 0,47 DNA segment, Chr 9, ERATO Doi 306, expressed gb:C80249Mm.3057 0,47 reelin gb:U24703Mm.42040 0,47 adenylate kinase 4 gb:AW061337Mm.171374 0,47 hypothetical protein 19,5KDa gb:AI851206Mm.18300 0,47 hypothetical protein MGC7980 gb:D88533Mm.4962 0,50 tumor differentially expressed 1 gb:L29441Mm.214950 0,50 actin, alpha1, skeletal muscle gb:M12347Mm.6775 0,50 ornithine decarboxylase antizyme inhibitor gb:AF032128Mm.918 0,50 heat shock 70kD protein 5 (glucose-regulated protein, 78kD) gb:AJ002387Mm.9653 0,50 growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma gb:AF055638Mm.5938 0,50 expressed sequence C80049 gb:AI505453Mm.182434 0,50 hypothetical protein MGC37588 gb:AI551087Mm.143817 0,50 NIMA (never in mitosis gene a)-related expressed kinase 7 gb:AW124633Mm.2168 0,50 hemolytic complement gb:M35525Mm.157900 0,50 RIKEN cDNA 130000 7C21 gene gb:M26005Mm.4046 0,50 membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 2 gb:AA797989Mm.144420 0,50 RIKEN cDNA 0610038P07 gene gb:AW227650Mm.22242 0,50 expressed sequence AW112037 gb:AW123061Mm.4290 0,50 EST AI2 65272 gb:AI840118Mm.200491 0,50 expressed sequence C78922 gb:AF077861Mm.34774 0,50 RIKEN cDNA 3110004O18 gene gb:AI157548Mm.22421 0,50 telomerase binding protein, p23 gb:AB024935Mm.27216 0,50 hypothetical protein MGC28180 gb:AI851365Mm.29820 0,50 BCL2/adenovirus E1B 19 kDa-interacting protein 3-like gb:AF067395Mm.196173 0,50 actin, gamma, cytoplasmic gb:M21495Mm.29008 0,50 interferon-inducible GTPase gb:AJ007971Mm.30105 0,50 coagulation factor XIII, beta subunit gb:D10071Mm.28336 0,50 RIKEN cDNA 0610010I20 gene gb:AI844043Mm.4095 0,50 inactive X specific transcripts gb:L04961Mm.424 0,50 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 3 polypeptide gb:U59761Mm.154651 0,50 Riken cDNA 2310015K15 gene gb:AW120626Mm.16453 0,50 peroxisomal membrane protein 3, 35 kDa gb:AF031128Mm.21064 0,50 RIKEN cDNA 2900001O04 gene gb:AI848207Mm.188953 0,50 RIKEN cDNA 4933436C10 gene gb:AI843747Mm.37216 0,50 zinc fingers and homeoboxes protein 1 gb:Z54200Mm.1260 0,50 protein (NM23A) (nucleoside diphosphate kinase) gb:AV216468Mm.4554 0,50 lysosomal-associated protein transmembrane 5 gb:AV356071Mm.34408 0,50 glycoprotein 49B gb:U05265Mm. 1000 0,50 myosin light chain, alkali, fast skeletal muscle gb:X12973Mm.1358 0,50 mannose-6-phosphate receptor, cation dependent gb:X56831Mm.14546 0,50 troponin T3, skeletal, fast gb:L48989Mm.6478 0,50 mus musculus, clone IMAGE: 4489220, mRNA gb:AI836915

Annex

135

Codi Unigene Ratio Nom Gene Bank nºMm. 218669 36,76 transcription elongation factor A (SII) 1 gb:D00925Mm.203947 21,11 RIKEN cDNA 4930558F19 gene gb:AA690863Mm.23897 18,38 ESTs gb:AI839232Mm.215120 17,15 interferon activated gene 202A gb:M31418Mm.142195 17,15 RIKEN cDNA 2210008F15 gene gb:AF006465Mm.14177 16,00 cytochrome P450 2b10 gb:M21856Mm.19804 16,00 spastic paraplegia 4 homolog (human) gb:AI851408Mm.676 14,93 activating transcription factor 1 gb:M63725Mm.135092 13,00 Mus musculus, clone IMAGE:4486259 mRNA gb:AI594427Mm.18974 12,13 GA repeat binding protein, alpha gb:AW226540Mm.41891 12,13 RIKEN cDNA 2310034L04 gene gb:AI839116Mm.32505 12,13 M.musculus, Similar to zinc finger protein 281 gb:AI850113Mm.597 11,31 platelet-activating factor acetylhydrolase 1b, alpha1 subunit gb:AV249855Mm.28932 10,56 RIKEN cDNA A030003K02 gene gb:AW124129Mm.6718 9,85 interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1 gb:U43084Mm.2821 9,85 RIKEN cDNA 4930578F06 gene gb:AV349142Mm.1803 9,85 TRAF family member-associated Nf-kappa B activator gb:U59864Mm.203936 9,19 RIKEN cDNA 4921532K09 gene gb:AA759910Mm.12921 8,57 baculoviral IAP repeat-containing 6 gb:Y17267Mm.21288 8,57 ELL-related RNA polymerase II, elongation factor gb:AI197161Mm.796 8,57 SAC1-like (S. cerevisiae) gb:AW123983Mm.12831 8,00 RIKEN cDNA 3830421F13 gene gb:AI849991Mm.22699 8,00 Mus musculus plasma selenoprotein P gene complete cds gb:AF021345Mm.27041 7,46 mitogen activated protein kinase kinase kinase 3 gb:U43187Mm.196502 6,96 RIKEN cDNA 1700025B18 gene gb:U13839Mm.3856 6,96 deoxythymidylate kinase gb:AW121709Mm.92529 6,96 ubiquilin 2 gb:AI836406Mm.21013 6,50 chemokine (C-X-C motif) ligand 1 gb:J04596Mm.42201 6,50 Hus1 homolog (S. pombe) gb:Y16894Mm.28235 6,50 ring finger protein 7 gb:AI843444Mm.28513 6,06 trans-acting transcription factor 3 gb:AF062567Mm.6250 5,66 prominin gb:AF039663Mm.1514 5,66 lipoprotein lipase gb:AA726364Mm.21331 5,66 RIKEN cDNA 4930451A13 gene gb:AW213777Mm.22383 5,66 hypothetical protein DKFZP566A1524 gb:AA981015Mm.21203 5,66 zinc finger protein 156 gb:AI835041Mm.176927 5,66 RIKEN cDNA 2610301I15 gene gb:AW045358Mm.218761 5,66 splicing factor, arginine/serine-rich 10 gb:U14648Mm.3446 5,66 deoxycytidine kinase gb:X77731Mm.218777 5,28 RIKEN cDNA1810012N18 gene gb:AI839212Mm.31051 5,28 RIKEN cDNA 2610003J05 gene gb:AW123032Mm.218657 5,28 cerebellar postnatal development protein 1 gb:AI843178Mm.41935 5,28 RIKEN cDNA 1200003F12 gene gb:AW124271Mm.28954 5,28 ras homolog gene family, member U gb:AV246963Mm.21013 4,92 chemokine (C-X-C motif) ligand 1 gb:J04596Mm.3368 4,92 serine protease inhibitor 6 gb:AI838923Mm.486 4,59 lysosomal membrane glycoprotein 2 gb:AI747194Mm. 218669 4,59 transcription elongation factor A (SII) 1 gb:D00925Mm.2655 4,59 quaking gb:U44940Mm.1674 4,59 ATP synthase, mitochondrial F0 complex, subunit f2 gb:AI843947Mm.29344 4,59 tumor differentially expressed 1, like gb:AI834772Mm.33669 4,59 claudin 1 gb:AF072127Mm.3373 4,59 cofilin 2, muscle gb:L29468Mm.10709 4,29 UDP-glucose dehydrogenase gb:AF061017Mm.2165 4,29 serum amyloid P-component gb:M23552Mm.6590 4,29 sulfotransferase-related protein SULT-X2 gb:AF026075Mm.158 4,29 expressed sequence AW125043 gb:AW125043Mm.25228 4,00 ring finger protein 11 gb:AB024427Mm.23893 4,00 expressed sequence AA122571 gb:AA122571Mm.27448 4,00 neuropilin gb:AF079528

Canvis d'expressió gènica en fetges de ratolins rLDL-/- en dieta DRG tractats amb PHT vs Controls Gens sobreexpresats

Annex

136

Mm.6824 3,73 amine N-sulfotransferase gb:AF026073Mm.2655 3,73 quaking gb:AI846695Mm.37199 3,73 glutathione S-transferase, mu 3 gb:J03953Mm.42154 3,73 Trif pending gene gb:AW209763Mm.24765 3,73 expressed sequence AW540162 gb:AW123623Mm.1059 3,73 mitogen activated protein kinase kinase 1 gb:L02526Mm.28872 3,73 RAB5A, member RAS oncogene family gb:AI841377Mm.27432 3,73 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 9 gb:AI835630Mm.195384 3,73 DNA segment, Chr 16, ERATO Doi 536, expressed gb:AW210370Mm.44244 3,73 CREBBP/EP300 inhibitory protein gb:AI844939Mm.141945 3,48 transcription elongation factor A (SII) 1 gb:M18209Mm.14460 3,48 aldo-keto reductase family 1, member B7 gb:J05663Mm.200941 3,48 serum amyloid A 2 gb:U60438Mm.157101 3,48 RIKEN cDNA C330007P06 gene gb:AW047329Mm.21754 3,48 choline phosphotransferase 1 gb:AW212131Mm.90115 3,48 lysophospholipase 1 gb:AI875934Mm.4848 3,48 Fyn proto-oncogene gb:M27266Mm.22252 3,48 RIKEN cDNA 4432405K22 gene gb:AI037493Mm.2389 3,48 myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia gb:AW122024Mm.32357 3,48 RIKEN cDNA 1700065A05 gene gb:AI315698Mm.10681 3,48 osteoblast specific factor 2 (fasciclin I-like) gb:D13664Mm.4695 3,48 N-acetyltransferase 2 (arylamine N-acetyltransferase) gb:U37249Mm.18652 3,48 spermine synthase gb:AF031486Mm.4296 3,48 synovial sarcoma translocation, Chromosome 18 gb:X93357Mm.915 3,48 interleukin 2 receptor, alpha chain gb:M26271Mm.13081 3,48 sterol-C5-desaturase homolog (S. cerevisae) gb:AB016248Mm. 148800 3,25 serum amyloid A1 gb:M13521Mm.18502 3,25 oxysterol binding protein-like 1A gb:AB017026Mm.18705 3,25 vacuolar protein sorting 4b (yeast) gb:U10119Mm. 123110 3,25 beta-spectrin 2, non-eryhrocytic gb:M74773Mm.21446 3,25 RIKEN cDNA 1190008F14 gene gb:AI848671Mm.22660 3,25 expressed sequence AA959686 gb:L04966Mm.28909 3,25 protein tyrosine phosphatase 4a1 gb:U84411Mm.30670 3,25 spermatid perinuclear RNA binding protein gb:AI838709Mm.21173 3,25 RIKEN cDNA 2310015N07 gene gb:AA684456Mm.2128 3,25 S100 calcium binding protein A9 (calgranulin B) gb:M83219Mm.203866 3,25 expressed sequence AA589382 gb:AA657044Mm.3380 3,25 kinesin family member 5B gb:U86090Mm.3792 3,25 hippocampus abundant gene transcript 1 gb:D88315Mm.29192 3,25 asparaginyl-tRNA synthetase gb:AW125874Mm.35796 3,25 ecotropic viral integration site 5 gb:U53586Mm.182149 3,25 7-dehydrocholesterol reductase gb:AF057368Mm.19187 3,03 prothymosin alpha gb:X56135Mm.21567 3,03 S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A) gb:M83218Mm.1514 3,03 lipoprotein lipase gb:M63335Mm.28021 3,03 expressed sequence AW228608 gb:AI849416Mm.16767 3,03 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 gb:AF073993Mm.14173 3,03 orosomucoid 2 gb:M12566Mm.171292 3,03 RIKEN cDNA 2010200I23 gene gb:AW122573Mm.29702 3,03 DNA segment, Chr 3, University of California 1 gb:AI843466Mm.3057 3,03 reelin gb:U24703Mm.27218 3,03 MORF-related gene X gb:AA529583Mm.38445 3,03 tropomodulin 3 gb:AI846797Mm.21288 3,03 ELL-related RNA polymerase II, elongation factor gb:AI197161Mm.30163 3,03 Mus musculus, clone IMAGE:4952607, mRNA gb:AI853226Mm.116866 3,03 Zinc finger protein S11-6 gb:AB020542Mm. 6388 3,03 Heat shock protein 70kDa 1 gb:AF109906Mm.7952 3,03 paternally expressed gene 3 gb:AF038939Mm.7719 3,03 B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 gb:M64068Mm.16453 3,03 peroxisomal membrane protein 3, 35 kDa gb:AF031128Mm.37216 3,03 zinc fingers and homeoboxes protein 1 gb:Z54200Mm.734 3,03 neuroblastoma ras oncogene gb:AI843682Mm.26147 3,03 ESTs gb:AA710439Mm.153895 3,03 expressed sequence C79248 gb:C79248

Annex

137

Mm.28580 3,03 X-linked myotubular myopathy gene 1 gb:AF073996Mm.204670 3,03 thioredoxin domain containing gb:AW125079Mm.684 2,83 cathepsin C gb:U74683Mm.213045 2,83 hypothetical protein MGC 37309 gb:AW046194Mm.2021 2,83 expressed sequence AI788959 gb:AI788959Mm.18555 2,83 expressed sequence AU019331 gb:AI848367Mm.90115 2,83 lysophospholipase 1 gb:AV358770Mm.1989 2,83 spinocerebellar ataxia 2 homolog (human) gb:AV276058Mm.18472 2,83 RIKEN cDNA 2300001E01 gene gb:AI836423Mm.199211 2,83 expressed sequence AW557906 gb:AF096285Mm.30108 2,83 ARP2 actin-related protein 2 homolog (yeast) gb:AW214159Mm.3460 2,83 CD14 antigen gb:X13333Mm.141945 2,83 RIKEN cDNA 5730591C18 gene gb:AJ223782Mm.15383 2,83 tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11b gb:U94331Mm.3036 2,83 RIKEN cDNA 4921515A04 gene gb:AI642098Mm.29859 2,83 eukaryotic translation initiation factor 2, subunit 2 gb:AW125491Mm.30177 2,83 DNA segment, Chr 11, ERATO Doi 603, expressed gb:AW046672Mm.204646 2,83 M.musculus adult male hippocampus cDNA gb:AV152244Mm.12155 2,83 syntaxin binding protein 3 gb:U19521Mm.196153 2,83 cAMP-regulated guanine nucleotide exchange factor II gb:AF115480Mm.180052 2,83 ubiquitin-conjugating enzyme E2D 2 gb:U62483Mm.6478 2,83 Mus musculus, clone IMAGE:4489220, mRNA gb:AI836915Mm.3140 2,83 multiple PDZ domain protein gb:AI854351Mm.89572 2,83 similar to CGI-83 protein gb:AI841387Mm.3259 2,83 nuclear transcription factor-Y beta gb:X55316MM. 34405 2,83 caspase 3, apoptosis related cysteine protease gb:U54803Mm.35815 2,83 Rho-associated coiled-coil forming kinase 2 gb:U58513Mm.4168 2,83 solute carrier family 12, member 2 gb:U13174Mm.173831 2,83 solute carrier family 30 (zinc transporter), member 5 gb:AW045974Mm.2073 2,64 expressed sequence AW109744 gb:AA690483Mm.1894 2,64 CD1d1 antigen gb:M63695Mm.20722 2,64 expressed sequence AU022875 gb:AA866655Mm.144420 2,64 RIKEN cDNA 0610038P07 gene gb:AW227650Mm.4426 2,64 Cd63 antigen gb:D16432Mm.21848 2,64 basic leucine zipper and W2 domains 1 gb:AI852534Mm. 1843 2,64 heat shock protein, 86 kDa 1 gb:J04633Mm.2055 2,64 matrix metalloproteinase 12 gb:M82831Mm.29769 2,64 RIKEN cDNA 2310050K10 gene gb:AI846078Mm.182227 2,64 RIKEN cDNA 4931406C07 gene gb:AI255972Mm.29868 2,64 ATPase lysosomal (vacuolar proton pump)V1 gb:AW121246Mm.27432 2,64 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 9 gb:AW120711Mm.27897 2,64 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily A, member 1 gb:AF055664Mm.28026 2,64 Mus musculus clone IMAGE: 3979323, mRNA gb:AI845225Mm.28405 2,64 serum/glucocorticoid regulated kinase gb:AW046181Mm.3845 2,64 hypothetical protein MGC18745 gb:AI845886Mm.3879 2,64 hypoxia inducible factor 1, alpha subunit gb:AF003695Mm.4480 2,64 retinoblastoma binding protein 6 gb:U28789Mm.22362 2,64 histocompatibility 47 gb:AW125865Mm.212945 2,64 Mus musculus, simikar to f-box only protein 8 gb:AI844932Mm.141993 2,64 muscleblind-like (Drosophila) gb:AI854802Mm.532 2,64 lisophospholipase 1; phospholipase 1a; lisophospholipase 1 gb:AA816121Mm.142363 2,64 RIKEN cDNA 2810036L13 gene gb:AA981725Mm.21299 2,64 expressed sequence AW549877 gb:AW121745Mm.27276 2,64 ESTs gb:AA204579Mm.28596 2,64 expressed sequence C85108 gb:AW124843Mm.67938 2,64 Cleavage stimulation factor, 3' Pre-RNA subunit 2 gb:AI850965Mm.205421 2,64 hypothetical protein L0C213817 gb:AI132380Mm.23961 2,64 actinin alpha 1 gb:AI195392Mm.25148 2,64 RIKEN cDNA 5730403E06 gene gb:AI845108Mm.28285 2,64 RIKEN cDNA 2700023B17 gene gb:AI840773Mm.4452 2,64 aryl-hydrocarbon receptor gb:M94623Mm.3069 2,64 Ras and Rab interactor 2 gb:AI835968Mm.12892 2,64 ubiquitin-activating enzyme E1C gb:AF077330Mm.20764 2,64 cytochrome P450, 2c29 gb:D17674

Annex

138

Mm.20927 2,64 transforming growth factor beta 1 induced transcript 4 gb:X62940Mm.201712 2,64 expressed sequence AI132306 gb:AW124363Mm.30122 2,64 expressed sequence AA536743 gb:AA623587Mm.2862 2,64 RIKEN cDNA 5730414C17 gene gb:AA823202Mm.153637 2,64 similar to RAS GTPase-activating protein 1 gb:AI846922Mm.22417 2,64 chromosome segregation 1-like (S. cerevisiae) gb:AW123099Mm.26609 2,64 DNA segment, Chr 8, ERATO Doi 69, expressed gb:AA543502Mm.69751 2,46 peptidase 4 gb:U51014Mm.46804 2,46 mus castaneus Ig K chain gene, C-region, 3 end gb:M80423Mm.12166 2,46 expressed sequence AU018108 gb:AA619207Mm.24236 2,46 hypothetical protein 3830408603 gb:AW046060Mm.24505 2,46 expressed sequence AI848330 gb:AI848330Mm.24086 2,46 Mus musculus, clone IMAGE:3985067, mRNA gb:AI846109Mm.9925 2,46 isocitrate dehydrogenase 1 (NADP+), soluble gb:AF020039Mm.7233 2,46 RIKEN cDNA 4930447D24 (Mus musculus) gb:AA733664Mm.176233 2,46 ESTs gb:AV032952Mm.21149 2,46 postsynaptic protein Cript gb:AI838759Mm.193688 2,46 origin recognition complex, subunit 3-like (S. Cerevisiae) gb:AW124052Mm.203911 2,46 expressed sequence AA407887 gb:AA600542Mm.369 2,46 ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 1 gb:AI845514Mm.25612 2,46 tissue factor pathway inhibitor 2 gb:D50586Mm.31879 2,46 RIKEN cDNA 6330549H03 gene gb:AW060250Mm.204990 2,46 similar to CG4946 gene product gb:AI465845Mm.2956 2,46 CD9 antigen gb:L08115Mm.29648 2,46 degenerative spermatocyte homolog (Drosophila) gb:Y08460Mm.25575 2,46 matrin 3 gb:AI835367Mm.3131 2,46 dihydrolipoamide dehydrogenase gb:U73445Mm.321 2,46 secreted phosphoprotein 1 gb:X13986Mm.23263 2,46 RIKEN cDNA 0610041E09 gene gb:AW049570Mm. 3879 2,46 hipoxia inducible factor 1, alpha subunit gb:Y09085Mm.3527 2,46 cyclin G2 gb:U95826Mm.6509 2,46 single-stranded DNA binding protein 1 gb:AA881160Mm.8294 2,46 von Hippel-Lindau binding protein 1 gb:U96760Mm.89927 2,46 signal recognition particle 9 kDa gb:X78304Mm.24003 2,46 expressed sequence AW061234 gb:AW061234Mm.24475 2,46 ESTs, Moderately similar to sorting nexin 13 [H.sapiens] gb:AW227027Mm.203935 2,46 DNA segment, Chr 16, Brigham & Women's Genetics 1543 expressed gb:AI573367Mm.22627 2,46 epidermal growth factor receptor pathway substrate 15 gb:AW124983Mm.24647 2,46 expressed sequence AW538430 gb:AI842065Mm.18157 2,46 axotrophin gb:AW212859Mm.41046 2,46 ESTs, Weakly similar to down-regulated by Ctnnb1 gb:AI891514Mm.12481 2,46 centrin 3 gb:Y12474Mm.143141 2,46 eukaryotic translation initiation factor 1A gb:AF026481Mm.19992 2,46 Traf and Tnf receptor associated protein gb:AW228036Mm.21740 2,46 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1 gb:Y14196Mm.25122 2,46 expressed sequence AA408985 gb:AI604013Mm.199964 2,46 DNA segment, Chr 10, ERATO Doi 438, expressed gb:AI839117Mm.140158 2,46 cytochrome P450, 51 gb:AW122260Mm.180776 2,46 RIKEN cDNA 2610318618 gene gb:AI845463Mm.4596 2,46 zinc finger protein 97 gb:L20450Mm.5341 2,30 defensin beta 1 gb:AF003525Mm.22485 2,30 RIKEN cDNA 2610311I19 gene gb:AI842264Mm.21515 2,30 zinc finger RNA binding protein gb:AI846060Mm.22526 2,30 RIKEN cDNA 2310004B05 gene gb:AI845798Mm.2154 2,30 Max interacting protein 1 gb:L38822Mm.193041 2,30 RIKEN cDNA 1110030N06 gene gb:AW259500Mm.29866 2,30 Mus musculus, clone MGC:27590 IMAGE:4501468, complete cds gb:AI846422Mm.790 2,30 TPA regulated locus gb:M23568Mm.27171 2,30 adaptor-related protein complex AP-3, sigma 1 subunit gb:AF084575Mm.196666 2,30 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 5 gb:D45850Mm.196201 2,30 maternal embryonic message 3 gb:U47024Mm.12665 2,30 cullin 3 gb:AI840051Mm. 18041 2,30 calmodulin 2 gb:M27844

Annex

139

Mm.6772 2,30 LIM domain only 7 gb:AW047919Mm.21846 2,30 ubiquitin-like 3 gb:AW120725Mm.29101 2,30 RIKEN cDNA 2410004M09 gene gb:AI746846Mm.14609 2,30 aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A7 gb:U96401Mm.22749 2,30 cDNA sequence BC005537 gb:AI854300Mm.27311 2,30 expressed sequence AI848984 gb:AI848984Mm.40620 2,30 RIKEN cDNA 9130415E20 gene gb:AI848868Mm.146516 2,30 RIKEN cDNA 2310075C12 gene gb:AA914105Mm.27218 2,30 MORF-related gene X gb:AB025049Mm.37199 2,30 glutathione S-transferase, mu 3 gb:J03953Mm.28240 2,30 expressed sequence AT841960 gb:AI841960Mm.3487 2,30 ribosomal protein L30 gb:K02928Mm.42230 2,30 cytochrome P450, 26, retinoic acid A1 gb:Y12657Mm.4095 2,30 inactive X specific transcripts gb:L04961Mm.423 2,30 RIKEN cDNA 6720457D02 gene gb:AI850887Mm.21761 2,30 interferon alpha responsive gene, 15 kDa gb:AI853475Mm.14253 2,30 RIKEN cDNA 5730525G14 gene gb:AW210346Mm.1909 2,30 guanylate nucleotide binding protein 3 gb:AW047476Mm.26610 2,30 RIKEN cDNA 3110027H23 gene gb:AI931876Mm.24025 2,30 stromal antigen 2 gb:AI846890Mm.25366 2,30 ring finger protein 44 gb:AI850285Mm.196325 2,30 hypothetical protein LOC231386 gb:AW046691Mm.29138 2,30 cysteine and histidine-rich domain-containing, zinc-binding protein 1 gb:AW122453Mm.196332 2,30 tRNA nucleotidyl transferase, CCA-adding, 1 gb:AI845321Mm.99066 2,30 ESTs gb:AV332872Mm.30652 2,30 ESTs gb:AA615831Mm.27673 2,30 DNA segment, Chr 6, Wayne State University 176, expressed gb:AA733372Mm.35820 2,30 coproporphyrinogen oxidase gb:D16333Mm.27431 2,30 Tnf receptor-associated factor 3 gb:U21050Mm.1626 2,30 tumor necrosis factor receptor superfamily, member 6 gb:M83649Mm.46724 2,30 poliovirus receptor-related 3 gb:AI891912Mm.6775 2,14 ornithine decarboxylase antizyme inhibitor gb:AF032128Mm.4266 2,14 integral membrane protein 2B gb:U76253Mm.88188 2,14 DEAD/H (aspartate-glutamate-alanine-aspartate/ His) box polypeptide 3 gb:L25126Mm.918 2,14 heat shock 70kD protein 5 (glucose-regulated protein, 78kD) gb:AJ002387Mm.18856 2,14 mitogen-activated protein kinase 6 gb:AI844810Mm.135114 2,14 expressed sequence AA408225 gb:AI853217Mm.3009 2,14 sulfotransferase, hydroxysteroid preferring 2 gb:L27121Mm.465 2,14 chemokine (C-X-C motif) ligand 12 gb:L12029Mm.22435 2,14 golgi phosphoprotein 3 gb:AW060175Mm.24485 2,14 expressed sequence AA408298 gb:AI846811Mm.3965 2,14 signal transducing adaptor molecule (SH3 domain and ITAM motif) 1 gb:U43900Mm.14802 2,14 H19 fetal liver mRNA gb:X58196Mm.16323 2,14 eukaryotic translation initiation factor 4A2 gb:X12507Mm.22409 2,14 chloride intracellular channel 4 (mitochondrial) gb:AI849533Mm.22547 2,14 N-acylsphingosine amidohydrolase 1 gb:AW124297Mm.25 2,14 growth arrest specific 2 gb:M21828Mm.25903 2,14 Ngfi-A binding protein 1 gb:U47008Mm.28777 2,14 expressed sequence AI115446 gb:AW125273Mm.200858 2,14 RIKEN cDNA 2410129E14 gene gb:M28739Mm.24086 2,14 Mus musculus, clone IMAGE:3985067, mRNA gb:AI850801Mm.203905 2,14 expressed sequence AU021838 gb:AA607053Mm.24703 2,14 RIKEN cDNA 1110001C20 gene gb:AW121960Mm.29675 2,14 thioredoxin-like 2 gb:AI840882Mm.29008 2,14 interferon-inducible GTPase gb:AJ007971Mm.27695 2,14 RIKEN cDNA 2700079K05 gene gb:AI848056Mm.28083 2,14 CD164 antigen gb:AB014464Mm.336 2,14 septin 2 gb:D49382Mm.30166 2,14 cytochrome b-type NAD (P) H oxidoreductase gb:AW045597Mm.36769 2,14 sarcolemmal-associated protein gb:AW124175Mm.38241 2,14 interleukin 1 receptor-associated kinase 1 gb:U56773Mm.28765 2,14 RIKEN cDNA 1810049E02 gene gb:AI844979Mm.3996 2,14 conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase gb:U12473Mm.4154 2,14 interleukin 10 receptor, beta gb:U53696

Annex

140

Mm.4218 2,14 transducer of ErbB-21 gb:D78382Mm.156583 2,14 carbonic anhydrase-like sequence 1 gb:X61397Mm.2904 2,14 zinc finger protein 216 gb:AF062071Mm.10160 2,14 mus musculus, clone IMAGE:5037053, mRNA, partial cds gb:AW045426Mm.6250 2,14 prominin gb:AF039663Mm.28767 2,14 C-reactive protein, petaxin related gb:X13588Mm.196617 2,14 glycoprotein 49 A gb:M65027Mm.23222 2,14 striatin, calmodulin binding protein 3 gb:AW124985Mm.25743 2,14 hypothetical protein MGC6821 gb:AI005782Mm.347 2,14 RIKEN cDNA 1810007M14 gene gb:AI098965Mm.46856 2,14 PRKC, apoptosis, WT1, regulator gb:AA260005Mm.29966 2,14 polypyrimidine tract binding protein 2 gb:AW228429Mm.182959 2,14 protein disulfide isomerase-related protein gb:AI842377Mm.22621 2,14 procollagen, type I, alpha 1 gb:U03419Mm.193526 2,14 cold shock domain protein A gb:D14485Mm.30162 2,14 secreted modular calcium binding protein 2 gb:AA980164Mm.3037 2,14 a disintegrin and metalloprotease domain 10 gb:AI836959Mm.3797 2,14 nucleosome assembly protein 1-like 1 gb:X61449Mm.28550 2,14 RIKEN cDNA 2610016F04 gene gb:AW048644Mm.2863 2,14 intergral membrane protein 1 gb:L34260Mm.18516 2,00 H3 histone, family 3B gb:X13605Mm.8211 2,00 praja1, RING-H2 motif containing gb:U06944Mm.8655 2,00 complement component factor h gb:M12660Mm.197422 2,00 glutathione S-transferase, alpha 2 (Yc2) gb:J03958Mm.90115 2,00 lysophospholipase 1 gb:AA840463Mm.1193 2,00 glutamyl aminopeptidase gb:M29961Mm.26580 2,00 Mus musculus, clone MGC: 28542 IMAGE:4194872, mRNA, complete cds gb:AI181346Mm.227 2,00 RIKEN cDNA 1110004F14 gene gb:AI843901Mm.18675 2,00 hipoxanthine guanine phosphoribosyl transferase gb:K01515Mm.10211 2,00 ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 5 gb:AJ238636Mm.14601 2,00 glutathione S-transferase, mu 2 gb:J04696Mm.200491 2,00 expressed sequence C78922 gb:AF077861Mm.15571 2,00 amyloid beta (A4) precursor protein gb:U82624Mm.1603 2,00 retinoblastoma binding protein 7 gb:U35142Mm.104747 2,00 immunoglobulin kappa chain variable 28 (V28) gb:M18237Mm.17035 2,00 hypothetical protein, MNCb-1213 gb:AI853728Mm.196149 2,00 RIKEN cDNA 1110008E19 gene gb:AI852001Mm.22409 2,00 chloride intracellular channel 4 (mitochondrial) gb:AI845237Mm.22505 2,00 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 12 gb:AF064635Mm.27331 2,00 mouse complement factor H-related protein mRNA, complete cds gb:M29010Mm.24231 2,00 small acidic protein gb:AB025407Mm.24584 2,00 RIKEN cDNA 4930579A11 gene gb:AW122274Mm.24703 2,00 RIKEN cDNA 1110001C20 gene gb:AI854214Mm.24805 2,00 RIKEN cDNA 2210415M14 gene gb:AI526902Mm.25311 2,00 RIKEN cDNA 1810015C04 gene gb:AW122893Mm.2591 2,00 RNA binding motif protein 3 gb:AB016424Mm.25149 2,00 ubiquitin specific protease 14 gb:AW060186Mm.28149 2,00 RIKEN cDNA 3110003A17 gene gb:AA833425Mm.28370 2,00 expressed sequence AA673513 gb:AW125109Mm.27123 2,00 expressed sequence AI891629 gb:AI891629Mm.2756 2,00 high mobility group nucleosomal binding domain 1 gb:X53476Mm.27606 2,00 RIKEN cDNA 1200002G13 gene gb:AW120643Mm.27646 2,00 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2 gb:AF052453Mm.30069 2,00 DNA segment, Chr 6, ERATO Doi 772, expressed gb:AI843287Mm.30097 2,00 proteasome (prosome, macropain) subunit, alpha type 1 gb:AI836804Mm.30929 2,00 peroxiredoxin 1 gb:AI118194Mm.27933 2,00 26S proteasome-associated pad1 homolog gb:Y13071Mm.28327 2,00 RIKEN cDNA 2510049I19 gene gb:AW258842Mm.35820 2,00 coproporphyrinogen oxidase gb:D16333Mm.35844 2,00 growth arrest specific 5 gb:AI849615Mm.3619 2,00 cathepsin S gb:AJ223208Mm.141187 2,00 trans-golgi network protein 2 gb:AA614914Mm.182053 2,00 ubiquilin 1 gb:AA517835Mm.3529 2,00 capping protein alpha 2 gb:U16741

Annex

141

Mm.212 2,00 RIKEN cDNA 1110013G13 gene gb:AA691185Mm.36894 2,00 transcription factor 12 gb:X64840Mm.52067 2,00 ubiquitin carboxyl-terminal esterase L5 gb:AI838853Mm.20236 2,00 expressed sequence AW552990 gb:D63679Mm.24109 2,00 ESTs, weakly similar to protein phosphatase 1C; tymocyte (M. musculus) gb:AW124735Mm.24208 2,00 interleukin 13 receptor,alpha1 gb:AA608387Mm.2984 2,00 silica-induced gene 41 gb:X80232Mm.30255 2,00 H2A histone family, member Y gb:AA646966Mm.14860 2,00 Annexin A1 gb:M69260Mm.1810 2,00 connective tissue growth factor gb:M70642Mm.205855 2,00 DNA segment, Chr 13, Wayne State University 123, expressed gb:AI854202Mm.29159 2,00 DNA segment, Chr 4, Brigham & Women's Genetics 0593 expressed gb:AW047399Mm.24745 2,00 Basic Leucine zipper and W2 domains 2 gb:AW060951Mm.27829 2,00 hypothetical protein L0C230249 gb:AW049625Mm.29822 2,00 heterochromatin protein 2, binding protein 3 gb:AW124376Mm.30728 2,00 cyclic AMP phosphoprotein, 19 kDa gb:AJ005983Mm.24083 2,00 TAR DNA binding protein gb:AW210064Mm.139115 2,00 zinc finger protein 131 gb:AI047791

Annex

142

Codi Unigene Ratio Nom Gene Bank nºMm.3459 0,14 D site albumin promoter binding protein gb:AW047343Mm.297 0,23 actin beta, cytoplasmic gb:J04181Mm.3815 0,27 syndecan 4 gb:D89571Mm.297 0,31 actin, beta, cytoplasmic gb:M12481Mm.173818 0,31 ESTs, Weakly similar to I48689 gene NK10 protein-mouse gb:AI158971Mm.27506 0,33 RIKEN cDNA 0610039N19 gene gb:AW047688Mm.181709 0,35 regulator of G-protein signaling 16 gb:U94828Mm.38344 0,35 novel nuclear protein 1 gb:U79774Mm.10633 0,38 3-hydroxy-3methylglutaryl-coenzyme A synthase 2 gb:U12791Mm.116761 0,38 carbonic anhydrase 5a, mitochondrial gb:X51971Mm.28370 0,38 expressed sequence AA673513 gb:AI846236Mm.39099 0,38 zinc finger protein 358 gb:AI847547Mm.22248 0,41 insulin-like growth factor binding protein 4 gb:X76066Mm.205266 0,41 acetyl-coenzyme a acyltransferase gb:AI530403Mm.2900 0,41 flavin containing monooxygenase 3 gb:U87147Mm.133851 0,41 mytochondrial ribosomal protein L12 gb:AW124432Mm.28994 0,41 SEC14-like2 (s.cerevisiae) gb:AW061265Mm.18561 0,41 cysteine and histidine rich 1 gb:AA790056Mm.6994 0,44 hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase type II gb:U96116Mm.18561 0,44 cysteine and histidine rich 1 gb:AA790056Mm.141020 0,44 sarcosine dehydrogenase gb:AI839995Mm.43841 0,44 expressed sequence AI647584 gb:AI647548Mm.104295 0,47 solute carrier family 10 (sodium/bile acid cotransporter family), member 1 gb:U95132Mm.6716 0,47 histocompatibility 2, class II antigen A, beta 1 gb:M21932Mm.3077 0,47 nuclear receptor subfamily 1, group I, member 3 gb:AI132241Mm.67919 0,47 v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family gb:L36435Mm.1373 0,47 peroxisome proliferator activated receptor alpha gb:X57638Mm.18064 0,47 glucose-6-phosphatase, catalytic gb:U00445Mm.219457 0,47 mitochondrial acyl-coA thioesterase 1 gb:Y14004Mm.20396 0,47 carnitine acetyltransferase gb:X85983Mm.153372 0,47 BRCA1 associated protein gb:AI854472Mm.2626 0,47 amino-terminal enhancer of split gb:L12140Mm.28585 0,47 thyroid hormone responsive SPOT14 homolog (Rattus) gb:X95279Mm.300 0,47 carbonic anhydrase 3 gb:AJ006474Mm.3470 0,47 retinoid X receptor alpha gb:X66223Mm.21983 0,47 betaine-homocysteine methyltransferase gb:AF033381Mm.28548 0,47 lipin 1 gb:AI846934Mm.4292 0,47 TGFB inducible early growth response gb:AF064088Mm.4350 0,47 mouse carboxyesterase gb:L11333Mm.20873 0,47 trinucleotide repeat containing 11 (THR-associated protein) gb:AF071310Mm.82938 0,47 ESTs, Weakly similar to T17365 serine/threonine protein kinase - rat gb:AW121616Mm.2661 0,47 thymidine kinase 1 gb:X60980Mm.4387 0,47 Bcl-associated death promoter gb:L37296Mm.5274 0,50 superoxide dismutase 1, soluble gb:M35725Mm.757 0,50 ras homolog gene family, member A2 gb:AI846668Mm.7329 0,50 guanidinoacetate methyltransferase gb:AF010499Mm.14099 0,50 hematopoietic zinc finger protein 385 gb:AI848518Mm.10669 0,50 glycerol phosphate dehydrogenase 1 cytoplasmic adult gb:M25558Mm.12194 0,50 proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3 gb:M25149Mm.88367 0,50 glial cell line derived neurotrophic factor family receptor alpha 1 gb:AF014117Mm.38011 0,50 brain protein I3 gb:X61454Mm.28994 0,50 SEC14-like2 (s.cerevisiae) gb:AI172965Mm.2820 0,50 galactokinase gb:AB027012Mm.3135 0,50 insuline -like growth factor binding protein, acid labile subunit gb:U66900Mm.35833 0,50 dodecenoyl-coenzymeA delta isomerase gb:Z14050Mm.141936 0,50 insulin-like growth factor binding protein 2 gb:X81580Mm.4341 0,50 poliovirus receptor-related 2 gb:M80206Mm.1262 0,50 cytochrome P450, 17 gb:M64863Mm.34088 0,50 RIKEN cDNA 1110027L01 gene gb:AW045710

Canvis d'expressió gènica en fetges de ratolins rLDL-/- en dieta DRG tractats amb PHT vs Controls Gens reprimits

BIBLIOGRAFIA

Bibliografia

145

[1] Havel RJ, Eder HA, Bragdon JH. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest 1955; 34:1345-1353.

[2] Rachmilewitz D, Albers JJ, Saunders DR, Fainaru M. Apoprotein synthesis by human duodenojejunal mucosa. Gastroenterology 1978; 75:677-682.

[3] Tall AR, Green PHR, Glickman RM, Riley JW. Metabolic fate of chylomicron phospholipids and apoproteins in the rat. J Clin Invest 1979; 64:977-989.

[4] Sammet D, Tall AR. Mechanism of enhancement of cholesteryl ester transfer protein activity by lipolysis. J Biol Chem 1985; 260:6687-6697.

[5] Herz J, Hamann U, Rogne S, Myklebost O, Gausepohl H, Stanley KK. Surface location and high affinity for calcium of a 500 kDa liver membrane protein closely related to the LDL-receptor suggest a phisyological role as a lipoprotein receptor. EMBO J 1988; 7:4199-4207.

[6] Nestruck AC, Rubestein D. The synthesis of apolipoproteins of very low density lipoproteins isolated from Golgi aparatus of rat liver. Can J Biochem 1976; 54:617-628.

[7] Packard CJ, Munro A, Lorimer AR, Gotto AM, Shepherd J. Metabolism of apolipoprotein B in large triglyceride-very-low density lipoproteins of normal and hypertriglyceridemic subjects. J Clin Invest 1984; 74:2178-2192.

[8] Goldstein JL, Hobbs HH, Brown JL. Familial Hypercholesterolemia. A: The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (editors). McGraw-Hill Book Co, New York; 1995; 1981-2020.

[9] Havel RJ, Hamilton RL. Hepatocytic lipoprotein receptors and intracel.lular lipoprotein catabolism. Hepatology 1988; 8:1689-1704.

[10] Marcovina SM, Morrisett JD. Structure and metabolism of lipoprotein (a). Curr Opin Lipidol 1995; 6:136-145.

[11] Utermann G. Lipoprotein (a). A: The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (editors). McGraw-Hill Book Co, New York; 1995; 1881-1912.

[12]Beckaerd ED, Alaupovic P, Knight-Gibson C, Norum CA, Ayrault-Jarrier MJ. Isolation and partial characterization of lipoprotein A-II (LpA-II) particles of human plasma. Biochim Biophys Acta 1992; 1126:105-113.

[13]Fruchart JC, Ailhaud G, Bard JM. Heterogeneity of high density lipoprotein particles. Circulation 1993; 87:III22-III27.

[14] Skinner ER. High-density lipoprotein subclasses. Curr Opin Lipidol 1994; 5:241-247.

Bibliografia

146

[15]von Eckardstein A, Huang Y, Wu S, Sarmandi AS, Schwarz S, Steinmetz A, Assmann G. Lipoproteins containing apolipoprotein A-IV but not apolipoprotein A-I take up and esterify cell-derived cholesterol in plasma. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1995; 15:1755-1763.

[16] Czarnecka H, Yokoyama S. Lecithin:cholesterol acyltransferase reaction on cellular lipid release by free apolipoprotein-mediated efflux. Biochemistry 1995; 34: 4385-4392.

[17] Heizmann C, Kirchgessner T, Kwiterovitch PO, Ladias JA, Derby C, Antonarakis SE, Lusis AJ. DNA polimorphism haplotypes of the human lipoprotein lipase gene: possible association with high density lipoprotein levels. Human Genet 1991; 86:578-584.

[18] Hammad SM, Stefansson S, Twal WO, Drake CJ, Fleming P, Remaley A, Brewer HB Jr, Argraves WS. Cubilin, the endocytic receptor for intrinsic factor-vitamin B12 complex, mediates high-density lipoprotein holoparticle endocytosis. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:10158-10163.

[19] Kozyraki R, Fyfe J, Kristiansen M, Gerdes C, Jacobsen C, Cui S, Christensen EI, Aminoff M, de la Chapelle A, Krahe R et al. The intrinsic factor-vitamin B12 receptor, cubilin is a high affinity apolipoprotein A-I receptor facilitating endocytosis of high density lipoprotein. Nature Med 1999; 5:656-661.

[20] Barter P. High-density lipoproteins and reverse cholesterol transport. Current Opin Lipidol 1993; 4:210-217.

[21] Badimon JJ, Badimon L, Fuster V. Regression of atherosclerotic lesions by high density lipoprotein plasma fraction in the cholesterol-fed rabbit. J Clin Invest 1990; 85:1234-1241.

[22] Francone OL, Fielding CJ, Fielding PE. Distribution of cell derived cholesterol among plasma lipoproteins: a comparison of three techniques. J Lipid Res 1990; 31:2195-2200.

[23] Fielding CJ, Fielding PE. Molecular physiology of reverse cholesterol transport. J Lipid Res 1995; 36:211-228.

[24] Davidson WS, Gillotte KL, Lund-Katz S, Johnson WJ, Rothblat GH, Philips MC. The effect of high density lipoprotein phospholipid acyl chain composition on the efflux of cellular free cholesterol. J Biol Chem 1995; 270:5882-5890.

[25] Hayden MR, Clee SM, Brooks-Wilson A, Genest J Jr, Attie A, Kastelein JJP. Cholesterol efflux regulatory protein, Tangier disease and familial high density lipoprotein deficiency. Curr Opin Lipidol 2000; 11:117-122.

[26] McNeish J, Aiello RJ, Guyot D, Turi T, Gabel C, Aldinger C, Hoppe KL, Roach ML, Royer LJ, de de Wet J et al. High density lipoprotein deficiency and foam cell accumulation in mice with targeted disruption of ATP-binding cassette transporter-1. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 4245-4250

Bibliografia

147

[27] Tall AR, Jiang XC, Luo Y, Silver D. 1999 George Lyman Duff memorial lecture: lipid transfer proteins, HDL, metabolism, and atherogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1991; 2:73-80.

[28] Czarnecka H, Yokoyama S. Regulation of cellular cholesterol efflux by lecithin:cholesterol acyltransferase reaction through nonspecific lipid exchange. J Biol Chem 1996; 271: 2023-2028.

[29] Mackness MI, Durrington PN. HDL, its enzymes and its potential to influence lipid peroxidation. Atherosclerosis 1995; 115: 243-253.

[30] Banka CL. High density lipoprotein and lipoprotein oxidation. Curr Opin Lipidol 1996; 7: 139-142.

[31] Watson AD, Navab M, Hama SY Sevanian A, Prescott SM, Stafforini DM, McIntyre TM, Du BN, Fogelman AM, Berliner JA. Effect of platelet activating factor acetylhydrolase on the formation and action of minimally oxidiced low density lipoprotein. J Clin Invest 1995; 96:2882-2891.

[32] De Geest B, Stengel D, Landeloos M, Lox M, Le Gat L, Collen D, Holvoet P, Ninio E. Effect of overexpression of human apoA-I in C57BL/6 and C57BL/6 apoE-deficient mice on 2 lipoprotein-associated enzymes, platelet-activating factor acetylhydrolase and paraoxonase. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000; 20: e68-e75.

[33] Navab M, Yama SY, Cooke CJ, Anantharamaiah GM, Chaddha M, Jin L, Subbanagounder G, Faull KF, Reddy ST, Miller NE, Fogelman AM. Normal high density lipoprotein inhibits three steps in the formation of mildly oxidized low density lipoprotein: step 1. J Lipid Res 2000; 41:1481-1494.

[34] Zannis VI, Kardassis D, Ogami K, Hadzopoulou-Cladaras M, Cladaras C. Transcriptional regulation of the human apolipoprotein genes. Adv Exp Med Biol 1991; 285:1-23.

[35] Li W-H, Tanimura M, Luo Ch-Ch, Datta S, Chan L. The apolipoprotein multigene familiy: biosynthesis, structure, structure-function relationships, and evolution. J Lipid Res 1988; 245-271.

[36] Jackson RL, Morrissett JD, Gotto AM. Lipoprotein structure and metabolism. Physiol Rev 1976; 56:259-316.

[37] Rees A. Shoulders CC, Stocks J, Baralle FE, Galton DJ. DNA polymorphism adjacent to human apoprotein A-I: relation to hypertriglyceridemia. Lancet 1983; 2: 444-446.

[38] Pownall HJ, Bick D, Gotto AM, Jr. Thermodynamics of lipid-protein association. J Biol Chem 1981; 256: 9849-9854.

[39] Zannis VI, Karathanasis SK, Kentman HT, Goldberger R, Breslow JL. Intracellular and extracellular processing of human apolipoprotein A-I. Secreted apolipoprotein A-I isoprotein 2 is a propeptide. Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80: 2574-2578.

Bibliografia

148

[40] Aron L, Jones S, Fielding CJ. Human plasma lecithin:cholesterol acyltransferase. Characterization of a cofactor-dependent phopholipase activity. J Biol Chem 1978; 253: 7220-7226.

[41] Chiesa G, Parolini C, Canavesi M, Colombo N, Sirtori CR, Fumagalli R, Franceschini G, Bernini F. Human apolipoproteins A-I and A-II in cell cholesterol efflux. Studies with transgenic mice. Arterioscl Thromb Vasc Biol 1998; 18:1417-1423.

[42] Miller GJ, Miller NE. Plasma high-density-lipoprotein concentration and the development of ischaemic heart disease. Lancet 1975; 1: 16-19.

[43] Assman G, von Ecchardstein A, Brewer HB Jr. Familial high density lipoprotein deficiency: Tangier disease. A: The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (editors). McGraw-Hill Book Co, New York; 1995:2053-2072.

[44] Middelton-Price HR, Van den Berghe JA, Scott J, Knott TJ, Malcom S. Regional chromosomal localization of apoA-II to 1q21-q23. Human Genet 1988; 79: 283-285.

[45] Boisfer E, Lambert G, Atger V, Tran NQ, Pastier D, Benetollo C, Trottier JF, Beaucamps I, Antonucci M, Laplaud M et al. Overexpression of human apolipoprotein A-II induces hypertriglyceridemia due to defective very low density lipoprotein hydrolysis. J Biol Chem 1999; 274: 11564-11572.

[46] Weng W, Brandenburg NA, Zhong SB, Halkias J, Wu L, Jiang XC, et al. ApoA-II maintains HDL levels in part by inhibition of hepatic lipase: studies in apoA-II and hepatic lipase double knock-out mice. J Lipid Res 1999; 40:1064-1070.

[47] Mowri HO, Pastch W, Smith LC, Gotto AM Jr, Pastch JR. Different reactivitites of high-density-lipoprotein 2 subfractions with hepatic lipase. J Lipid Res 1992; 33:1269-1279.

[48] Brewer HB, Lux SE, Ronan R, John KM. Amino acid sequence of human apoLp-GluII (ApoA-II), an apolipoprotein isolated from the high density lipoprotein complex. Proc Natl Acad Sci USA 1972; 69: 1304-1308.

[49] López J, Roghani A, Bertrand J, Zanni E, Kalopissis A, Zannis VI, Chambraz J. Intracellular early and late modifications of human apolipoprotein A-II. Effect of glutamine-+1 to leucine substitution. Biochemistry 1994; 33:4056-4064.

[50] Hussain MM, Zannis VI. Intracellular modification of human apolipoprotein A-II (apoAII) and sites of apoAII mRNA synthesis: comparison of apoAII with apoCII and apoCIII isoproteins. Biochemistry 1990; 209-217.

[51] Scanu AM, Lagocki P, Chung J. Effect of apolipoprotein A-II on the structure of high-density lipoproteins: relationship to activity of lecithin:cholesterol acyltransferase in vitro. N Y Acad Sci 1980; 348: 160-173.

Bibliografia

149

[52] Calabresi L, Banfi C, Sirtori CR, Franceschini G. Apolipoprotein A-II modulates HDL remodeling in plasma. Biochim Biophys Acta 1992; 1124:195−198.

[53] Mowri HO, Pastch J R, Gotto AM Jr, Pastch W. Apolipoprotein A-II influences the substrate properties of human HDL2 ad HDL3 for hepatic lipase. Arterioscl Thromb Vasc Biol 1996; 16: 755-762.

[54] Alaupovic P, Knight-Gibson C, Wang C-S, Downs D, Koren E, Brewer HB Jr, Gregg RE. Isolation and characterization of an apoA-II-containing lipoprotein (LP-A-II:B complex) from plasma very low density lipoproteins of patients with Tangier disease and type V hyperlipoproteinemia. J Lipid Res 1991; 32:9−19.

[55] Blanco-Vaca F, Escolà-Gil JC, Martín-Campos J, Julve J. Role of apoA-II in lipid metabolism and atherosclerosis: advances in the study of an enigmatic protein. J Lipid Res 2001; 42: 1727-1739.

[56] McCombs RJ, Mercadis DE, Ellis J, Weinberg RB. Attenuated hypercholesterolemic response to a high-cholesterol diet in subjects heterozygous for the apolipoprotein A-IV-2 allele. N Engl J Med 1994; 331: 706-710.

[57] Li W-H, Tanimura M, Luo C-C, Datta S, Chan L. The apolipoprotein multigene family: biosynthesis, structure-function relationships, and evolution. J Lipid Res 1988; 29:245−271.

[58] Golberg I, Scheraldi CA, Yakoub LK, Saxena U, Bisgaier LC. Lipoprotein apoCII activation of lipoprotein lipase. Modulation of apolipoprotein A-IV. J Biol Chem 1990; 265: 4266-4272.

[59] Steinmetz A, Uterman G. Activation of lecithin:cholesterol acyltransferase by human apolipoprotein A-IV. J Biol Chem 1985; 260: 2258-2264.

[60] Ordovas J M, Cassidy D K, Civeira F, Bisgaier C L, Schaefer E J. Familial apolipoprotein A-I, C-III and A-IV deficiency in premature atherosclerosis due to deletion of a gene complex on chomosome 11. J Biol Chem 1989; 264:16339−16342.

[61] Kane J P, Hardman D A, Paulus H E. Heterogeneity of human apolipoprotein B: isolation of new species from human chylomicrons. Proc Natl Acad Sci USA 1980; 77: 2465-2469.

[62] Ginsberg HN. Synthesis and secretion of apolipoprotein B from cultured liver cells. Curr Opin Lipidol 1995; 6:275−280.

[63] Weisgraber KH, Innerarity TL, Mahley RW. Role of the lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem 1978; 253: 9053-9062.

[64] Chen S H, Habib G, Yang CY, Gu ZW, Lee BR, Weng SA, Silberman SR, Cai SJ, Deslypere JP, Rosseneu M, et al. Apolipoprotein B-48 is the product of a

Bibliografia

150

messenger RNA with an organ-specific in-frame codon. Science 1987; 238: 363-366.

[65] Jong MC, Hofker MH, Havekes LM. Role of apoCs in lipoprotein metabolism. Functional differences between apoC-I, apoC-II and apoC-III. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999; 19:472-484.

[66] Karathanasis SK. Apolipoprotein multigen family: tandem organization of human apolipoprotein A-I, C-III and A-IV genes. Proc Natl Acad Sci USA 1985; 82:6374-6378.

[67] McConathy WJ, Alaupovic P. Isolation and partial characterization of apolipoprotein D: a new protein moiety of the human plasma lipoprotein system. FEBS Lett 1973; 37:178-82.

[68] Drayna DT, McLean JW, Wion KL, Trent JM, Drabkin HA, Lawn RM. Human apolipoprotein D gene: gene sequence, chromosome localization and homology to the α2-globulin superfamily. DNA 1987; 6:199-204.

[69] Blanco-Vaca F, Via DP, Yang C, Massey JB, Pownall HJ. Characterization of disulfide-linked heterodimers containing apolipoprotein D in human plasma lipoproteins. J Lipid Res 1992; 33:1785−1796.

[70] Fielding PE, Fielding CJ. A cholesteryl ester transfer complex in human plasma. Proc Natl Acad Sci USA 1980; 77:3327-3330.

[71] Mahley RW. Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding role in cell biology. Science 1988; 240:622−630.

[72] Lui CT, Yu Y, Wu SY, Chan L. Immunoreactive apolipoprotein E is a widely distributed cellular protein: immunohistochemical localization of apolipoprotein E in baboon tissues. J Clin Invest 1986; 78:947-958.

[73] Mahley RW, Nathan BP, Bellosta S, Pitas R. Apolipoprotein E: impact of cytoskeletal stability in neurons and the relationship to Alzheimer's disease. Curr Opin Lipidol 1995; 6:86−91.

[74] Davignon J, Gregg R E, Sing C F. Apolipoprotein E polymorphims and atherosclerosis. Arteriosclerosis 1988; 8: 1-16.

[75] Huang Y, von Eckardstein A, Wu S, Maeda N, Assmann G. A plasma lipoprotein containing only apolipoprotein E with gamma-mobility on electrophoresis releases cholesterol from cells. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 1834-1838.

[76] Mahley RW, Innerarity TL, Rall SC, Weisgraber KH, Taylor JM. Apolipo-protein E: genetic variants provide insights into its structure and function. Curr Opin Lipidol 1990; 1: 87-95.

[77] Ishikawa Y, Akasaka Y, Ishii T, Komiyama K, Masuda S, Asuwa N, Choi-Miura NH, Tomita M. Distribution and synthesis of apolipoprotein J in the atherosclerotic aorta. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998; 18:665−672.

Bibliografia

151

[78] De Silva HV, Harmony LAK, Stuart WD, Gil CM, Robbins J. Apolipoprotein J: structure and tissue distribution. Biochemistry 1990a; 29:5380−5389.

[79] Jenne DE, Tschopp J. Molecular structure and functional characterization of a human complement cytolysis inhibitor found in blood and seminal plasma: identity to sulphated glycoprotein 2, a constituent of rat testis fluid. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:7123-7127.

[80] Kounnas MZ, Loukinova EB, Stefensson S, Harmony JAK, Brewer BH, Strickland DK, Argraves WS. Identification of glycoprotein 330 as an endo-cytic receptor for apolipoprotein J/clusterin. J Biol Chem 1995; 270: 13070-13075.

[81] De Silva HV, Stuart WD, Duvic CR, Wetterau JR, Ray MJ, Ferguson DG, Albers HW, Smith WR, Harmony JAK. A 70 kDa apolipoprotein designated apoJ: is a marker for subclasses of human plasma high density lipoproteins. J Biol Chem 1990b; 265:13240−12247.

[82] McLean JW, Tomlinson JE, Kuang WJ, Eaton DL, Chen EY, Fless GM, Scanu AM, Lawn RM. cDNA sequence of human apolipoprotein (a) is homologous to plasminogen. Nature 1987; 330:132−137.

[83] Gaubatz JW, Ghanem KI, Guevara J Jr, Nava ML, Patsch W, Morrisett JD. Polymorphic forms of human apolipoprotein (a): inheritance and relationship of their molecular weights to plasma levels of lipoprotein (a). J Lipid Res 1990; 31: 603-613.

[84] Lackner C, Cohen JC, Hobbs HH. Molecular definition of the extreme size polymorphism in apolipoprotein (a) gene. Hum Mol Genet 1993; 2: 933-940.

[85] Gaubatz JW, Heideman C, Gotto AM Jr, Morrisett JD, Dahlen GH. Human lipoprotein (a). Structural properties. J Biol Chem 1983; 258:4582-4589.

[86] Blanco-Vaca F, Gaubatz JW, Bren N, Kottke BA, Morrisett JD, Guevara J. Identification and quantification of apolipoproteins in addition to apo(a) and apoB-100 in human lipoprotein (a). Chem Phys Lipids 1994; 67/68:35-42.

[87] Sandkamp M, Funke H, Shulte H, Kohler E, Assmann G. Lipoprotein (a) is an independent risk factor for myocardial infraction at a young age. Clin Chem 1990; 36:695-698.

[88] Mattei MG, Etienne J, Chuat JC, Nguyen V, Brault D, Bernheim Galibert F. Assignment of the human lipoprotein lipase (LPL) gene to chromosome band 8p22. Cytogenet Cell Genet 1993; 63:45-46.

[89] Wion K L, Kirchgessner T D, Lusis A D, Schotz M C, Lawns R M. Human lipoprotein lipase complementary DNA sequence. Science 1987; 235:1638-1641.

[90] Wang Ch-S, Hartsuck J, McConathy WJ. Structure and functional properties of lipoprotein lipase. Biochim Biophys Acta 1992; 1123:1-17.

Bibliografia

152

[91]Bengtsson G, Olivercrona T, Hook M, Riensenfeld J, Lindahl U. Interaction of lipoprotein lipase with native and modified heparin-like polysaccharides. Biochem J 1980; 189: 625-633.

[92]Faustinella F, Smith LC, Semenkovich CF, Chan L. Structural and functional roles of highly conserved serines in human lipoprotein lipase. Evidence that serine 132 is essential for enzyme catalysis. J Biol Chem 1991; 266: 9481-9485.

[93]Saxena U, Witte LD, Goldberg I. Release of endothelial cell lipoprotein lipase by plasma lipoproteins and free fatty acids. J Biol Chem 1989; 264:4349-4355.

[94]Obunike JC, Paka S, Pillariseti S, Goldberg IJ. Lipoprotein lipase can function as a monocyte adhesion protein. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997; 17:1414-1420.

[95]Beisiegel U, Krapp A, Weber W, Olivecrona G. The role of alpha2M receptor/LRP in chylomicron remnant metabolism. A: Biology of alpha 2-macroglobulin, its receptor and related proteins. W Borth, RD Feinmann, SL Gonias, JP Quigley, DK Strickland (editors). Annals of New York Academy of Science. The New York Academy of Science, New York 1994; vol 737: 53-69.

[96]Martin GA, Bush SJ, Meredith GD, Cardin AD, Blankenship DT, Mao SJ, Rechtin AE, Woods CW, Racke MM, Schafer MP, et al. Isolation of cDNA sequence of human postheparin plasma hepatic triglyceride lipase. J Biol Chem 1988; 263: 10907-10914.

[97]Olivecrona G, Olivecrona T. Triglyceride lipases and atherosclerosis. Curr Opin Lipidol. 1995; 6:291-305.

[98]Breckenridge W C, Little J A, Alaupovic P, Wang CS, Kuksis A, Kakis G, Lindgren F, Gardiner G. Lipoprotein abnormalities associated with a familial deficiency of hepatic lipase. Atherosclerosis 1982; 45:161-179.

[99]Hopkins GJ, Barter PJ. Role of triglyceride-rich lipoproteins and hepatic lipase in determining the particle size and composition of high density lipoproteins. J Lipid Res 1987; 27:1265-1277.

[100]Clay MA, Newnham HH, Barter PJ. Hepatic lipase promotes a loss of apolipoprotein A-I from triglyceride-enriched human high density lipoproteins during incubation in vitro. Arteriosclerosis 1991; 11:415-422.

[101]Daggy BP, Bensadoun A. Enrichment of apolipoprotein B48 in the LDL density class following in vivo inhibition of hepatic lipase. Biochim Biophys Acta 1986; 877:252-261.

[102]Chang S, Borensztajn J. Hepatic lipase function and the accumulation of beta-very-low-density lipoproteins in the plasma of cholesterol-fed rabbits. Biochem J 1993; 293:745-750.

[103]Shafi S, Brady SE, Bensadoun A, Havel RJ. Role of hepatic lipase in the uptake and processing of chylomicron remnants in rat liver. J Lipid Res 1994; 35:709-720.

Bibliografia

153

[104]Glomset JA. The plasma lecithin:cholesterol acyltransferase reaction. J Lipid Res 1968; 9:155-167.

[105]Yang C-Y, Manoogian D, Pao Q, Lee F-S, Knapp RD, Gotto Jr. AM, Pownall HJ. Lecithin:cholesterol acyltransferase: functional regions and a structural model of the enzyme. J Biol Chem 1987; 262:3086-3091.

[106]Castro GR, Fielding CJ. Early incorporation of cell-derived cholesterol into pre-beta-migrating high-density lipoprotein. Biochemistry 1988; 27:25-29.

[107]Vohl M-C, Neville TA, Kumarathsan R, Braschi S, Sparks L. A novel lecithin-cholesterol acyltransferase antioxidant activity prevents the formation of oxidized lipids during lipoprotein oxidation. Biochemistry 1999; 38: 5976-5981.

[108]Bielicki JK, Forte TM, McCall MR. Minimally oxidized LDL is a potent inhibitor of lecithin:cholesterol acyltransferase activity. J Lipid Res 1996; 37:1012-1021.

[109]Aouizerat BE, Allayee H, Cantor RM, Dallinga-Thie GM, Lanning CD, de Bruin TWA, Lusis, AJ, Rotter JI. Linkage of a candidate gene locus to familial combined hyperlipidemia. Lecithin:cholesterol acyltransferase on 16q. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999; 19:2730-2736.

[110]Tall AR. Plasma cholesteryl ester transfer protein. J Lipid Res 1993; 34:1255-1274.

[111]Hesler CB, Swenson TL, Tall AR. Purification and characterization of a human plasma cholesteryl ester transfer protein. J Biol Chem 1987; 262:2275-2282.

[112]Pape ME, Castle CK, Murray RW, Funk GM, Hunt CE, Marotti KR, Melchior GW. ApoB metabolism in the cynomolgus monkey: Evidence for post-transcriptional regulation. Biochim Biophys Acta 1999; 1086:326-334.

[113]Golberg I, Scheraldi CA, Yakoub LK, Saxena U, Bisgaier LC. Lipoprotein apoCII activation of lipoprotein lipase. Modulation of apolipoprotein A-IV. J Biol Chem 1990; 265:4266-4272.

[114]Francone OL, Gurakar A, Fielding C. Distribution and functions of lecithin:cholesterol acyltransferase and cholesteryl ester transfer protein in plasma lipoproteins. J Biol Chem 1989; 264:7066-7072.

[115]Inazu A, Brown ML, Hesler CB, Agellon LB, Koizumi J, Takata K, Maruhama Y, Mabuchi H, Tall A R. Increased high density lipoprotein levels caused by a common cholesteryl-ester transfer gene mutation. N Engl J Med 1990; 323:1234-1238.

[116]Zhong S, Sharp DS, Grove JS, Bruce C, Katsuhiko Y, Curb JD, Tall AR. Increased coronary heart disease in Japanese-American men with mutations in the cholesteryl ester transfer protein gene despite increased HDL. J Clin Invest 1996; 97:2917-2923.

Bibliografia

154

[117]Hirano K-I, Yamashita S, Nakajima N, Arai T, Maruyama T, Yoshida Y, Ishigami M, Sakai N, Kameda-Takemura K, Matsuzawa Y. Genetic cholesteryl ester transfer protein deficiency is extremely frequent in the Omagari area of Japan. Arterioscler Thromb Vasc. Biol 1997; 17:1053-1059.

[118]Whitmore TE, Day JR, Albers JJ. Localization of the human phospholipid transfer protein gene to chromosome 20q12-q13.1. Genomics 1995; 28:599-600.

[119]Day JR, Albers JJ, Lofton-Day CE, Gilbert TL, Ching AFT, Grant FJ, O’Hara PJ, Marcovina SM, Adolphson JL. Complete cDNA encoding the human plasma phospholipid transfer protein from human endothelial cells. J Biol Chem 1994; 269:9388-9391.

[120]Tu AY, Nishida HI, Nishida T. High density lipoprotein conversion mediated by human plasma phospholipid transfer protein. J Biol Chem 1993; 268:23098-23105.

[121]Von Eckardstein A, Jauhiainen M, Huang Y, Metso J, Langer C, Pussinen P, Wu S, Ehnholm C, Assmann G. Phospholipid transfer protein mediated conversion of high density lipoproteins generates pre-β1-HDL. Biochim Biophys Acta 1996; 1301:255-262.

[122]Syvänne M, Castro G, Dengremont C, De Geitere C, Jauhiainen M, Ehnholm C, Michelagnoli S, Franceschini G, Kahri J, Taskinen MR. Cholesterol efflux from Fu5AH hepatoma cells induced by plasma of subjects with or without coronary artery disease and non-insulin-dependent diabetes: importance of LpA-I:A-II particles and phopholipid transfer protein. Atherosclerosis 1996; 127:245-253.

[123]Jiang XC, Bruce C, Mar J, Lin M, Ji Y, Francone OL, Tall AR. Targeted mutation of plasma phospholipid transfer protein gene markedly reduces high-density lipoprotein levels. J Clin Invest 1999; 103: 907-914.

[124]Humbert R, Adler DA, Distecke CM, Hasset C, Omiecinsky CJ, Furlong CE. The molecular basis of the human serum paraoxonase activity polymorphism. Nature Genet 1993; 3: 73-76.

[125]Kelso GJ, Stuart WD, Richter RJ, Furlong CE, Jordan-Starck TC, Harmony J AK. Apolipoprotein J is associated with paraoxonase in human plasma. Biochemistry 1994; 33: 832-839.

[126]Mackness MI, Mackness B, Durrington PN, Connelly PW, Hegele RA. Paraoxonase: biochemistry, genetics and relationship to plasma lipoproteins. Curr Opin Lipidol 1996; 7:69-76.

[127]Watson AD, Berliner JA, Hama SY, La Du BN, Faull KF, Fogelman AM, Navab M. Protective effect of high density lipoprotein associated paraoxonase. Inhibition of the biological activity of minimally oxidized low density lipoprotein. J Clin Invest 1995; 96: 2882-2891.

Bibliografia

155

[128]Yamamoto T, Davis CG, Brown MS Schneider WJ, Casey ML, Goldstein JL, Russell DW. The human LDL receptor: A cisteine rich protein with multiple Alu sequences in its mRNA. Cell 1984; 39:27-38.

[129]Innearity TL, Mahley RW. Enhanced binding by cultured human fibroblasts of apoE containing lipoproteins as compared either low density lipoproteins. Biochemistry 1978; 17:1440-1447.

[130]Brown MS, Goldstein JL. Receptor-mediated control of cholesterol metabolism. Science 1976; 191:150-154.

[131]Herz J, Hamann U, Rogne S, Myklebost O, Gausepohl H, Stanley KK. Surface location and high affinity for calcium of a 500 kDa liver membrane protein closely related to the LDL-receptor suggest a physiological role as a lipoprotein receptor. EMBO J 1988; 7:4199-4207.

[132]Willnow E, Sheng Z, Ishibashi S, Herz J. Inhibition of hepatic chylomicron remnant uptake by genen transfer of a receptor antagonist. Science 1994; 264:1471-1474.

[133]Sakai J, Hishino A, Takahashi S, Miura Y, Ishii H, Suzuki H, Kawarabayasi Y, Yamamoto T. Structure, chromosome location, and expression of the human very low density lipoprotein receptor gene. J Biol Chem 1994; 269:2173-2181.

[134]Freeman M, Ashkenas J, Rees DJG, Kingsley DM, Copeland NG, Jenkins N A, Krieger M. An ancient, highly conserved family of cysteine-rich protein domains revealed by cloning type I and type II murine macrophage scanvenger receptors. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87:8810-8814.

[135]Matsumoto A, Naito M, Itakura H, Ikemoto S, Asaoka H, Hayakaa I, Kanamori H, Aburatani H, Takaku F, Suzuki H, Kobari Y, Miyai T, Takahashi K, Cohen EH, Widro R, Housman DE, Kodama T. Human macrophage scavenger receptors: primary structure, expression, and localization in atherosclerotic lesions. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87:9133-9137.

[136]Bickel PE, Freeman MW. Rabbit aortic smooth muscle cells express inducible macrophage scavenger receptor messanger RNA that is absent from endothelial cells. J Clin Invest 1992; 90:1450-1457.

[137]Kodama T, Freeman M, Rohrer L, Zabrecky J, Matsudaira P, Krieger M. Type I macrophage scavenger receptor contains α-helical and collagen-like coiled coils. Nature 1990; 343:531-535.

[138]Abumrad N, Coburn C, Ibrahimi A. Membrane proteins implicated in long-chain fatty acid uptake by mammalian cells: CD36, FATP and FABPm. Biochim Biophys Acta 1999; 1441:4-13.

Bibliografia

156

[139]Calvo D, Gómez-Coronado D, Suarez Y, Lasunción MA, Vega MA. Human CD36 is a high affinity receptor for the native lipoproteins HDL, LDL, and VLDL. J Lipid Res 1998; 39:777-788.

[140]Williams DL, Connelly MA, Temel RE, Swarnakar S, Philips MC, de la Llera-Moya M, Rothblat GH. Scavenger receptor BI and cholesterol trafficking. Curr Opin Lipidol 1999; 10:329-339.

[141]Temel RE, Trigatti B, DeMattos RB, Azhar S, Krieger M. Scavenger receptor class B, type I (SR-BI) is the major route for the delivery of high density lipoprotein cholesterol to the steroidogenic pathway in cultured mouse adrenocortical cells. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:13600-13605.

[142]Rigotti A, Trigatti B, Babitt J, Penman M, Xu S, Krieger M. Scavenger receptor BI: a cell surface receptor for high density lipoprotein. Curr Opin Lipidol 1997; 8:181-188.

[143]Rigotti A, Trigatti BL, Penman M, Rayburn H, Herz J, Krieger M. A targeted mutation in the murine gene encoding the high density lipoprotein (HDL) scavenger receptor class B type I reveals its key role in HDL metabolism. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:12610-12615.

[144]Krieger M, Kozarsky K. Influence of the HDL receptor SR-BI on atherosclerosis. Curr Opin Lipidol 1999; 10:491-497.

[145]Krieger M. Charting the fate of the “good cholesterol”: identification and characterization of the HDL receptor SR-BI. Ann Rev Biochem 1999; 68:523-558.

[146]Moestrup SK, Kozyraki R. Cubilin, a high-density lipoprotein receptor. Curr Opin Lipidol 2000; 11:133-140.

[147]Rust S, Rosier M, Funke H, Real J, Amoura Z, Piette HC, Deleuze JF, Brewer HB, Duverger N, Denèfle P et al. Tangier disease is caused by mutations in the gene encoding ATP-binding cassette transporter 1. Nature Genetics 1999; 22:352-355.

[148]Leal-Luna A, Blanco-Vaca F, Gómez-Gerique JA, Pérez-Gallofré A, Franco Peral M, Fabiani-Romero F. Enfermedad de Tangier: estudio del primer caso español. Medicina Clin 1989; 93:301-303.

[149]Orso E, Broccardo C, Kaminski WE, Bottcher A, Liebisch G, Drobnik W, Gotz A, Chambenoit O, Diederich W, Langmann T et al. Transport of lipids from Golgi to plasma membrane is defective in Tangier disease patients and ABC-1 deficient mice. Nat Genet 2000; 24:192-196.

[150]Fernández-Ortiz A, Badimon JJ, Falk E, Fuster V, Meyer B, Mailhac A, Weng D, Shah PK, Badimon L. Characterization of the relative thrombogenicity of atherosclerotic plaque components: implications for consequences of plaque rupture. J Am Coll Cardiol 1994; 23(7): 1562-1569.

Bibliografia

157

[151]Stary HC, Chandler AB, Dinsmore RE, Fuster V, Glagov S, Insull W, Rosenfeld ME, Schwartz CJ, Wagner WD, Wissler RW. A definition of advanced types of atherosclerotic lesions and a histological classification of atherosclerosis. Circulation 1995; 92:1512-1531.

[152]Lijnen HR, VanHoef V, Beelen V and Mahley RW. Characterization of the murine plasma fibrinolytic system. Eur J Biochem 1994; 224:863-871.

[153]Fazio S, Linton McR F. Mouse models of hyperlipidemia and atherosclerosis. Frontiers in Bioscience 2001; 6:515-525.

[154]Paigen B, Morrow A, Brandon C, Mitchell D, Holmes PA. Variation in susseptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice. Atherosclerosis 1985; 57:65-73.

[155]Nakashima Y, Plump AS, Raines EW, Breslow JL, Ross R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb 1994; 14:133-140.

[156]Ishibashi S, Brown MS, Goldstein JL, Gerard RD, Hammer RE, Herz J: Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest 1993; 92:883-893.

[157]Tangirala RK, Rubin EM, Palinski W. Quantitation of atherosclerosis in murine models: correlation between lesions in the aortic origin and in the entire aorta, and differences in the extent of lesions between sexes in LDL receptor-deficient and apolipoprotein E-deficient mice. J Lipid Res 1995; 36:2320-2328.

[158]Ishibashi S, Goldstein JL, Brown MS, Herz J, Burns DK: Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice. J Clin Invest 1994; 93: 1885-1893.

[159]Marzal-Casacuberta A, Escolà-Gil JC, Julve-Gil J, González–Sastre F, Blanco-Vaca F. Modificación genética de los animales de laboratorio (II): metabolismo lipoproteico y arteriosclerosis. Clin Invest. Arterioscler 1998; 10: 78-87.

[160]Marotti KR, Castle CK, Boyle TP, Lin AH, Murray RW, Melchior GW. Severe atherosclerosis in transgenic mice expressing simian cholesterol ester tranfer protein. Nature 1993;93: 4114:4119.

[161]Paigen B, Morrow PA, Holmes PA, Mitchell D, Williams RA. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis 1987; 68:231-240.

[162]Breslow JL. Mouse models of atherosclerosis. Science 1996; 272:685-688.

[163]Schultz JR, Rubin EM. The properties of HDL in genetically engineered mice. Curr Opin Lipidol 1994; 5:126-137.

Bibliografia

158

[164]Forguez P, Chapman MJ, Rall SC, Camus MC. The lipid transport system in the mouse, Mus musculus, isolation and characterization of apolipoproteins B, A-I, A-II, and C-III. J Lipid Res 1984; 25:954-966.

[165]Teng B, Blumenthal S, Forte T, Navaratnam N, Scott J, Gotto AM, Chan L. Adenovirus-mediated gene transfer of rat apolipoprotein B mRNA editing protein in mice virtually eliminates apoprotein B-100 and normal low density lipoprotein production. J Biol Chem 1994; 269:23395-23404.

[166]Rajavashisth TB, Kaptein JS, Rene KL, Lusis A J. Evolution of apolipoprotein E: mouse sequence and evidence for an 11-nucleotide ancestral unit. Proc Natl Acad Sci USA 1985; 82: 8085-8089.

[167]Lawn RM, Wade DP, Hammer RE, Chiesa G, Verstuyff JG, Rubin EM. Atherogenesis in transgenic mice expressing the human apolipoprotein (a). Nature 1992; 360:670-672.

[168]Tall AR. Plasma cholesteryl ester transfer protein. J Lipid Res 1993; 34: 1255-1274.

[169]Olivecrona T, Bengtsson-Olivecrona G. Lipoprotein lipase and hepatic lipase. Curr Opin Lipidol 19934:187-196.

[170]Tu AY, Nishida HI, Nishida T. High density lipoprotein conversion mediated by human plasma phospholipid transfer protein. J Biol Chem 1993; 268:23098-23105.

[171]Chow SA, Fischer LJ. Phenytoin metabolism in mice. Drug Metab Dispos 1982; 10:156-160.

[172]Veronese ME, Doecke CJ, Mackenzie PI, Mcmanus ME, Miners JO, Rees DL, Gasser R, Meyer UA, Birkett DJ. Site-directed mutation studies of human liver cytochrome P-450 isoenzymes in the 2C subfamily. Biochem J 1993; 289:533-538.

[173] Bruni J. Phenytoin. A: A textbook for the Clinical Application of Therapeutic Drug Monitoring. Taylor WJ, Diers Caviness MH (editors): Abbott Laboratories, Diagnostic Division Irving, Texas, 1986; pp 253-267.

[174] Meinardi H, Kleijn E, van der Meijer JWA, van Rees H. Absortion and distribution of antiepileptic drugs. Epilepsia 1975; 16:353-365.

[175] Jusko WJ, Koup JR, Alvan G. Non-linear assessment of phenytoin bioavailabilitay. J Pharmacokinet Biopharm 1976; 4:327-349.

[176]Jung D, Powell JR, Walson P, Perrier D. Effect of dose on phenytoin absorption. Clin Pharmacol Ther 1980; 28:479-485.

[177] Wilder BJ, Ramsay RE. Oral and intramuscular phenytoin. Clin Pharmacol Ther 1976; 19:360-364.

[178] Wilensky AJ, Lowden JA. Inadequate serum levels after intramuscular administration of diphenylhydantoin. Neurology (Minneap) 1973; 23:318-324.

Bibliografia

159

[179] Hooper WD, Bochner F, Eadie MJ, Tyrer JH. Plasma protein binding of diphenylhydantoin. Effects of sex hormones, renal and hepatic disease. Clin Pharmacol Ther 1973; 15:276-282.

[180] Lunde PKM, Anders R, Yaffe SJ, Lund L, Sjoqvist F. Plasma protein binding of diphenylhydantoin in man. Interactions with other drugs and the effect of temperature and plasma dilution. Clin Pharmacol Ther 1970; 11:846-855.

[181] Lightfoot RWJr, Christian CL. Serum protein binding of thyroxine and diphenylhydantoin. J Clin Endocrinol Metab 1966; 16:305-308.

[182] Shoeman EW, Azarnoff DL. Diphenylhydantoin potency and plasma protein binding. J Pharmacol Exp Ther 1975; 195:83-85.

[183] Porter RJ, Layzer RB. Plasma albumin concentration and diphenylhydantoin in man. Arch Neurol 1975; 32:298-303.

[184] Dodson WE. Phenytoin kinetics in children. Clin Pharmacol Ther 1980; 27:704-707.

[185] Noach EL, Woodbury DM, Goodman LS. Studies on absortion, distribution, fate and excretion of 4-C14 labeled diphenylhydantoin. J Pharmacol Exp Ther 1958; 122:301-314.

[186] Chawla A, Repa JJ, Evans RM, Mangelsdorf DJ. Nuclear Receptors and Lipid Physiology: Opening the X-files. Science 2001; 294 (Nov. 30):1866-1870.

[187] Wolfrum C, Borrmann CM, Borchers T, Spener F. Fatty acids and hypolipidemic drugs regulate peroxisome proliferator-activated receptors alpha - and gamma-mediated gene expression via liver fatty acid binding protein: a signaling path to the nucleus. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 2323-2328.

[188]Way JM, Harrington WW, Brown KK, Gottschalk WK, Sundseth SS, Mansfield TA, Ramachandran RK, Willson TM, Kliewer SA. Comprehensive messenger ribonucleic acid profiling reveals that peroxisome proliferator-activated receptor gamma activation has coordinate effects on gene expression in multiple insulin-sensitive tissues. Endocrinology 2001; 142(3):1269-77.

[189]Gan X, Kaplan R, Menke JG, MacNaul K, Chen Y, Sparrow CP, Zhou G, Wright SD, Cai TQ. Dual mechanisms of ABCA1 regulation by geranylgeranyl pyrophosphate. J Biol Chem 2001; 276(52):48702-8.

[190]Sinal CJ, Tohkin M, Miyata M, Ward JM, Lambert G, Gonzalez FJ. Targeted disruption of the nuclear receptor FXR/BAR impairs bile acid and lipid homeostasis. Cell 2000; 102(6):731-44.

[191]Wei P, Zhang J, Egan-Hafley M, Liang S, Moore DD. The nuclear receptor CAR mediates specific xenobiotic induction of drug metabolism. Nature 2000; 407 (6806):920-3.

[192] Backer G, Bacquer D, Konitzer M: Epidemiological aspects of high density lipoprotein cholesterol. Atherosclerosis 1998, 137: S1-S6.

Bibliografia

160

[193] Muuronen A, Kaaste M, Nikkilä EA, Tolppanen E-M. Mortality from ischaemic Heart disease among patients using anticonvulsive drugs: a case-control study. Brit Med J 1985. 291:1481-83.

[194] Miller M, Burgan RG, Osterlund L, et al. A prospective, randomized trial of phenytoin in nonepileptic subjects with reduced HDL cholesterol. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1995; 15: 2151-21

[195] Goerdt C, Keith M, Rubins HB. Effects of phenytoin on plasma high-density lipoprotein cholesterol levels in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. J Clin Pharmacol 1995; 35: 767-775

[196] Shah PK, Kaul S, Nilsson J, Cercek B. Exploiting the Vascular Protective Effects of High-Density Lipoprotein and its Apolipoproteins. An idea Whose Time for Testing Is Coming, Part I. Circulation, 2001; 104:2376-2383.

[197] Shah PK, Kaul S, Nilsson J, Cercek B. Exploiting the Vascular Protective Effects of High-Density Lipoprotein and its Apolipoproteins. An idea Whose Time for Testing Is Coming, Part II. Circulation, 2001; 104:2498-2502.

[198] Krause BR, Auerbach BJ. Reverse cholesterol transport and future pharmacological approaches to the treatment of atherosclerosis. Curr Opin Investig Drugs, 2001; 2 (3): 375-81.

[199] Marotti KR, Castle CK, BoYle TP, Lin AH, Murray RW, Melchior GW. Severe atherosclerosis in transgenic mice expressing simian cholesteryl ester transfer protein. Nature 1993; 364:73-75.

[200] Escolà-Gil JC, Julve-Gil J, Marzal-Casacuberta A, Ordoñez-Llanos J, González Sastre F, Blanco-Vaca F. Expression of human apolipoprotein A-II in apoE deficient mice induces features of familial combined hyperlipemia. Journal Lipid Res 2000; 40: 1328-1338.

[201] Ishibashi S, Brown MS, Goldstein JL, Gerard RD, Hammer RE, Herz J: Hipercholesterolemia in Low Density Lipoprotein Receptor Knockout Mice and its Reversal by Adenovirus-mediated Gene Delivery. J Clin. Invest 1993; 92:883-893.

[202] Paigen B, Mitchell D, Reue K, Morrow A, Lusis AJ, Leboeuf RC. Ath-1, a gene determining atherosclerosis susceptibility and high densisty lipoprotein levels in mice. Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84:3763-3767.

[203] Bradford MA. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye-binding. Anal Biochem 1976; 72:248-54

[204]Steinberg KK, Cooper GR, Graiser SR, Rosseneu M. Some considerations of methodology and standardization of apolipoprotein A-I immunoassays. Clin Chem 1983; 29:415-426.

Bibliografia

161

[205]Sánchez-Lomares F. Desarrollo de un método de inmunodifusión radial para la determinación de apoA-I de ratón. Aplicación al estudio de ratones transgénicos para la apoA-II humana. Tesina de licenciatura,1995. UAB

[206] Gowri MS, Deneys R, Van der Westhuyzen, Bridges SR, Anderson JW. Decreased protection by HDL from poorly controlled type 2 diabetic subjects against LDL oxidation may be due to the abnormal composition of HDL. Arterioscl Thromb Vasc Biol 1999; 19:2226-2233.

[207]De la Llera-Moya M, Atger V, Paul JL, Fournier N, Moati N, Giral P, friday KE, Rothblat GH. A cell culture for screening human serum for ability to promote cellular cholesterol efflux: relationships between serum components and efflux, esterification and transfer. Arterioscler Thromb 1994; 14:1056-1065.

[208]Morton RE, Zilversmit DB. A plasma inhibitor of triglyceride and cholesteryl ester transfer activities. J Biol Chem 1981; 256:1192-1199.

[209]Qiao J-H, Xie P-Z, Fishbein J, Kreuzer T A, Drake L, Demer L L, Lusis A J. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1994; 14:1480-1497.

[210]Caligiuri G, Nicoletti A, Zhou X, Tornberg I, Hansson GK. Effects of sex and age on atherosclerosis and autoimmunity in apoE-deficient mice. Atherosclerosis 1999; 145:301-8.

[211]Sukovich DA, Kauser K, Shirley FD, DelVecchio V, Halks-Miller M, Rubanyi GM. Expression of interleukin-6 in atherosclerotic lesions of male ApoE-knockout mice: inhibition by 17beta-estradiol. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998; 18:1498-505.

[212]Ravn HB, Korsholm TL, Falk E. Oral magnesium supplementation induces favorable antiatherogenic changes in ApoE-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21:858-62.

[213]Luoma PV, Sotaniemi EA, Pelkonen RO, Myllyla VV. Plasma high-density lipoprotein colesterol and hepatic cytochrome P-450 concentrations in epileptics undergoing anticonvulsant treatment. Scand J Clin Invest 1980; 40: 163-67.

[214]Nikkila EA, Kaste M, Ehnholm C, Viikari J. Elevation of high-density lipoprotein in patients treated with phenytoin. Acta Med Scand 1978; 204:517-20.

[215]McKenney JM, Petrizzi KS, Briggs GC, Wright JT. The effect of low-dose phenytoin on high density lipoprotein cholesterol. Pharmacology 1992; 12: 183-88.

[216]Goerdt C, Keith M, Rubins HB. Effects of phenytoin on plasma high-density lipoprotein cholesterol levels in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. J Clin Pharmacol 1995; 35: 767-775.

Bibliografia

162

[217]Rubin EM, Krauss RM, Sprangler EA, Vertuyft J, Clift SM. Inhibition of early atherosclerosis in transgenic mice by human apolipoprotein A-I. Nature 1991; 353: 265-67.

[218]Claudel T, Leibowitz MD, Fievet C, Tailleux A, Wagner B, Repa JJ, Torpier G, Lobaccaro JM, Paterniti JR, Mangelsdorf DJ et al. Reduction of atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice by activation of the retinoid X receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98:2610-5.

[219]Finnell RH. Phenytoin-induced teratogenesis: a mouse model. Science 1981; 211:483-84

[220]Hartsfield JK, Holmes LB, Morel JG. Phenytoin embryopathy: effect of epoxide hydrolase inhibitor on phenytoin exposure in utero in C57BL/6J mice. Biochem Mol Med 1995; 56: 131-143.

[221]Libby P. Inflammation in atherosclerosis. Nature 2002; 420:868-74

[222]Murayama T, Yokode M, Kataoka H, Imabayashi T, Yoshida H, Sano H, Nishikawa S, Nishikawa S, Kita T. Intraperitoneal administration of anti-c-fms monoclonal antibody prevents initial events of atherogenesis but does not reduce the size of advanced lesions in apolipoprotein-E deficient mice. Circulation 1999; 99:1740-6.

[223]Hasty AH, McRae FL, Brandt SJ, Babaev VR, Gleaves LA, Fazio S. Retroviral gene therapy in apoE-deficient mice: ApoE expression in the artery wall reduces early foam cell lesion formation. Circulation 1999; 99:2571-6.

[224]Erilä, T: Mortality of patients with epilepsy in Finland 1967-1973. Acta Univ Tamperensis Ser A. 1982; 145:1-16.

[225]Muuronen A, Kaaste M, Nikkilä EA, Tolppanen E-M. Mortality from ischaemic Heart disease among patients using anticonvulsive drugs; a case-control study. Brit Med J 1985; 291:1481-83.

[226]Voyiaziakis E, Goldberg I, Plump AS, Rubin EM, Breslow JL, Huang L-S. ApoA-I deficiency causes both hypertriglyceridemia and increased atherosclerosis in human apoB transgenic mice. J Lipid Res 1998; 39:313−321.

[227]Kozarski KF, Donahee MH, Rigotti A, Iqbal SN, Edelman ER, Krieger M. Overexpression of the HDL receptor SR-BI alters plasma HDL and bile cholesterol levels. Nature 1997; 387:414−417.

[228]Krieger M, Kozarsky K. Influence of the HDL receptor SR-BI on atherosclerosis. Curr Opin Lipidol 1999; 10:491−497.

[229]Braun A, Trigatti BL, Post MJ, Sato K, Simons M, Edelberg JM, Rosenberg RD, Schrenzel M, Krieger M. Loss of SR-BI expression leads to the early onset of occlusive atherosclerotic coronary artery disease, spontaneous myocardial infarctions, severe cardiac dysfuntion, and premature death in apolipoprotein E-deficient mice. Circ Res 2002; 90: 270-276.

Bibliografia

163

[230]Joyce CW, Amar MJ, Lambert G, Vaisman BL, Paigen B, Najib-Fruchart J, Hoyt RF Jr, Neufeld ED, Remaley AT, Fredrickson DS, Brewer HB Jr, Santamaria-Fojo S. The ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1) modulates the development of aortic atherosclerosis in C57BL/6 and apoE-knockout mice. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:417-22.

[231]Schultz JR, Verstuyft JG, Gong EL, Nichols AV, Rubin EM. Protein composition determines the anti-atherogenic properties of HDL in transgenic mice. Nature 1993; 365:762−764.

[232]Castro G, Nihoul LP, Dengremont C, de Geitère C, Delfy B, Tailleux A, Fievet C, Duverger N, Denèfle P, Fruchart J-C et al. Cholesterol efflux, lecithin-cholesterol acyltransferase activity, and pre-β particle formation by serum from human apolipoprotein A-I and apolipoprotein A-I/apolipoprotein A-II transgenic mice consistent with the latter being less effective for reverse cholesterol transport. Biochemistry 1997; 36:2243−2249

[233]Shih DM, Gu L, Xia YR, Navab M, Li W-F, Hama S, Castellani LW, Furlong CE, Costa LG, Fogelman AM et al. Mice lacking paraxonase are susceptible to organophosphate toxicity and atherosclerosis. Nature 1998; 394:284-87

[234]Tward A, Xia YR, Wang XP, Shi YS, Park C, Castellani LW, Lusis AJ, Shih DM. Decreased atherosclerosic lesion formation in human paraoxonase transgenic mice. Circulation 2002; 106:484-90.

[235]Quarck R, De Geest B, Stengel D, Mertens A, Lox M, Theilmeier G, Michiels C, Raes M, Bult H, Colleen D et al. Adenovirus-mediated gene transfer of human platelet-activating factor-acetylhydrolase prevents injury-induced neointima formation and reduces spontaneous atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation 2001; 103:2495-2500.

[236]Navab M, Hama SY, Hough GP, Hedrick CC, Sorenson R, La Du BN, Kobashigawa JA, Fonarow GC, Berliner JA, Laks H, Fogelman AM. High density associated enzymes: their role in vascular biology. Curr Opin Lipidol. 1998; 9:449-56

[237] Yagyu H, Ishibashi S, Chen Z, Osuga J, Okazaki M, Perrey S, Kitamine T, Shimada M, Ohashi K, Harada K et al. Overexpressed lipoprotein lipase protects against atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice. J Lipid Res 1999; 40: 1677-1685.

[238]Bodin K, Bretillon L, Aden Y, Bertilsson L, Broome U, Einarsson C, Diczfalusy U. Antiepileptic drugs increase plasma levels of 4β-hydroxycholesterol in humans: evidence for involvement of cytochrome p450 3A4. J Biol Chem 2001; 276: 38685-89.

[239]Edwards PA, Kast HR, Anisfeld AM. Bareing it all: the adoption of LXR and FXR and their roles in lipid homeostasis. J Lipid Res 2002; 43: 2-12.

Bibliografia

164

[240]Venkateswaran A, Laffite BA, Joseph SB, Mak PA, Wilpitz DC, Edwards PA, Tontonoz P. Control of cellular cholesterol efflux by the nuclear oxysterol receptor LXRα. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97:12097-12102.

[241]Tanaka E. Clinically significant pharmacokinetic drug interactions between epileptic drugs. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics 1999; 24:87-92.

[242]Martínez LO, Jacquet S, Esteve J-P, Rolland C, Cabezón E, Champagne E, Pineau T, Georgeaud V, Walker JE, Tercé F et al. Ectopic β-chain of ATP synthase in an apolipoprotein A-I receptor in hepatic HDL endocytosis. Nature 2003; 421: 75-79.

[243]Fleming I. Cytochrome P450 enzymes in vascular homeostasis. Circ Res 2001; 89:753-62

[244]Fisslthaler B, Hinsch N, Chataigneau T, Popp R, Kiss L, Busse R, Fleming I. Nifedipine increases cytochrome P4502C expression and endothelium-derived hyperpolarizing factor mediated responses in coronary arteries. Hypertension 2000; 36:270-5.

[245]Roman RJ. P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function. Physiol Rev 2002; 82: 131-85.

[246]Node K, Huo Y, Ruan X, Yang B, Spiecker M, Ley K, Zeldin DC, Liao JK. Anti-inflammatory properties of cytochrome P450 epoxygenase-derived eicosanoids. Science 1999; 285:1276-79.

[247]Sun J, Sui X, Brdbury A, Zeldin DC, Conte S, Liao JK. Inhibition of vascular smooth muscle cell migration by cytochrome P450 epoxygenase-derived eicosanoids. Circ Res 2002; 90:1020-27.

[248]Rifkind AB, Lee C, Chang TK, Waxman DJ. Arachidonic acid metabolism by human cytochome P450s 2C8, 2C9, 2E1, and 1A2; regioselective oxygenation and evidence for a role for cyp2C enzymes in arachidonic acid epoxygenation in human liver microsomes. Arch Biochem Biophys 1995; 320:380-9.

[249]Fleming I, Michaelis UR, Bredenkötter. D, Fisslthaler B, Deghani F, Brandes RP, Busse R. Endothelium-derived hyperpolarizing factor synthase (cytochrome P450 2C9) is functionally significant source of reactive oxygen species in coronary arteries. Circ Res 2001; 88:44-51.

[250]Potente M, Michaelis R, Fisslthaler B, Busse R, Fleming I. Cytochrome P450 2C9-induced endothelial cell proliferation involves induction of mitogen-activated protein (MAP) kinase phosphatase-1, inhibition of the c-jun N-terminal kinase, and up-regulation of cyclin D1. J Biol Chem 2002; 277:15671-676

[251]Fleming I. To move or not to move? Cytochrome P450 products and cell migration. Circ Res 2002; 90: 936-38.

Bibliografia

165

[252]Luo G, Zeldin DC, Blaisdell JA, Hodgson E, Goldstein JA. Cloning and expression of murine cyp2cs and their ability to metabolise arachidonic acid. Arch Biochem Biophys 1998; 357:45-57.

[253]Ueda A, Hamadeh HK, Webb HK, Yamamoto Y, Sueyoshi T, Afshari CA, Lehmann JM, Negishi M. Diverse roles of the nuclear orphan receptor CAR in regulating hepatic genes in response to Phenobarbital. Mol Pharmacol 2002; 61:1-6.

[254]Sueyoshi T. The repressed nuclear receptor CAR responds to phenobarbital in activating the human cyp2B6 gene. J Biol Chem 1999; 274: 6043-46.

[255]Salvador RA, Atkins C, Haber S, Kozma C, Conney C. Effect of Phenobarbital and chlorcyclizine aon the development of atheromatosis in the cholesterol- fed rabbit. Biochem Pharmacol 1970; 19:1975-81.

[256]Ferguson SS, LeCluyse EL, Negishi M, Goldstein JA. Regulation of human CYP2C9 by the constitutive androstane receptor: discovery of a new distal binding site. Mol Pharmacol. 2002; 62:737-46.

[257]Yamamoto Y, Kawamoto T, Negishi M. The role of nuclear receptor CAR as a coordinate regulador of hepatic gene expresión in defense aginst chemical toxicity. Arch Biochem Biophys 2003; 409:207-11.

[258]Shiraki T, Sakai N, Kanaya E, Jingami H. Activation of Orphan Nuclear Constitutive Androstane Receptor Requires Subnuclear Targeting by Peroxisome Proliferator-activated Receptor gamma Coactivator-1alpha. A possible link between xenobiotic response and nutritional state. J Biol Chem 2003; 278(13):11344-50.

[259]Nemoto N, Sakurai J. Glucocorticoid and sex hormones as activating or modulating factors for expression of Cyp2b-9 and Cyp2b-10 in the mouse liver and hepatocytes. Arch Biochem Biophys. 1995; 319:286-92.

[260]Kawamoto T, Kakizaki S, Yoshinari K, Negishi M. Estrogen activation of the nuclear orphan receptor CAR (constitutive active receptor) in induction of the mouse Cyp2b10 gene. Mol Endocrinol. 2000; 14:1897-905.

[261]Hodgin JB, Maeda N. Minireview: estrogen and mouse models of atherosclerosis. Endocrinology. 2002; 143:4495-501.

[262]Rosenfeld ME, Kauser K, Martin-McNulty B, Polinsky P, Schwartz SM, Rubanyi GM. Estrogen inhibits the initiation of fatty streaks throughout the vasculature but does not inhibit intra-plaque hemorrhage and the progression of established lesions in apolipoprotein E deficient mice. Atherosclerosis. 2002 ;164:251-9.

[263]Sentman M-L, Brännström T, Westerlund S, Laukkanen MO, Ylä-Hertuala S, Basu S, Marklund SL. Extracellular superoxide dismutase deficiency and atherosclerosis in mice. Arterioscl Thromb Vasc Biol 2001; 21:1477-82.

Bibliografia

166

[264]Kashfi K, Rimarachin JA, Weksler BB, Dannenberg AJ. Differential induction of gluthatione S-transferase in rat aorta versus liver. Biochem Pharmacol 1994; 47:1903-07.

[265]Misra P, Srivastava SK, Singhal SS, Awasthi YC, Boor PJ. Gluthatione S-transferase 8-8 is localizated in smooth muscle cells of rat aorta and is induced in an experimental model of atherosclerosis. Toxicol Appl Pharmacol 1995; 133:27-33.

[266]Lapenna D, de Gioia S, Ciofani G, Mezzeti A, Ucchino S, Calafiore AM, Napolitano AM, Di Ilio C, Cuccurulo F. Glutathione-related antioxidant defenses in human atherosclerotic plaques. Circulation 1998; 97:1930-1934.

[267]Woods A, Couchman JR. Syndecan 4 heparan sulfate proteoglycan is a selectively enriched and widespread focal adhesion component. Mol Biol Cell 1994; 5:797-805.

[268]Bass MD, Humphries MJ. Cytoplasmic interactions of syndecan-4 orchestrate adhesion receptor ang growth factor receptor signalling. Biochem J 2002; 368:1-15.

[269]Woods A,Longley RL, Tumova S, Couchman JR. Syndecan 4 binding to the high affinity heparin-binding domain of fibronectin drives focal adhesion formation in fibroblasts. Arch Biochem Biophys 2000; 374:66-72.

[270]Baciu PC, Saoncella S, Lee H, Denhaz D, Leuthardt D, Goetink PF. Syndemos, a protein that interacts with the cytoplasmic domain of syndecan-4, mediates cell spreading and cytoskeletal organization. J Cell Sci 2000; 113:315-24.

[271]Longley RL, Woods A, Fleetwood A, Cowling GJ, Gallagher JT, Couchman JR. Control of morphology, cytoskeleton and migration by syndecan-4. J Cell Sci 1999; 112:3421-31.

[272]Cizmeci-Smith G, Langan E, Youkey J, et al. Syndecan-4 is a primary-response gene induced by basic fibroblast growth factor and arterial injury in vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997; 17: 172-180.

[273]Kaneider NC, Reinisch CM, Dunzendorfer S, Romisch J, Wiederman CJ. Syndecan-4 mediates antithrombin-induced chemotaxis of human peripheral blood lymphocytes and monocytes. J Cell Sci 2002; 115: 227-36.

[274]Echtermeyer F, Streit M, Wilcox-Adelman S, Saoncella S, Denhez F, Detmar M, Goetinck PF. Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4. J Clin Invest 2001; 107: R9-14.

[275]Saoncella S, Echtermeyer F, Denhez F, Nowlen JK, Mosher DF, Robinson SD, Hynes RO, Goetinck PF. Syndecan-4 signals cooperatively with integrins in a rho-dependent manner in the assembly of focal adhesions and actin stress fibers. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 2805-2810.

Bibliografia

167

[276]van Niew Amerogen GPN, Vermeer MA, Negre-Aminou P, Lankelma J, Emeis JJ, van Hinsbergh VW. Simvastatin improves disturbed endotelial barrier function. Circulation 2000; 102:2803-9

[277]Essler M, Retzer M, Bauer M, Hemskerk JM, Aepfelbacher M, Siess W. Estimulation of platelets and endothelial cells by middly oxidized LDL proceeds through activation of lisophosphatidic acid receptors and the rho/rho kinase pathway. Inhibition by lovastatin. Ann Y Acad Sci 2000; 905: 282.

[278]Tsukamoto K, Kirano K Yamashita S, Sakai N, Ikegami C, Zhang Z, Matsuura F, Hiraoka H, Matsuyama A, Ishigami M et al. Retarded intracellular lipid transport associated with reduced expression of cdc42, a member of Rho-GTPases, in human aged skin fibroblasts. A possible function of cdc42 in mediating intracellular lipid transport. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22: 1899-1904.

[279]Tsukamoto K, Hirano K, Tsujii K, Ikegami C, Zhongyan Z, Nishida Y, Ohama T, Matsuura F, Yamashita S, Matsuzawa Y.ATP-binding cassette transporter-1 induces rearrangement of actin cytoskeletons possibly through Cdc42/N-WASP. Biochem Biophys Res Commun 2001; 287:757-65.

[280]Sawada N, Itoh H, Ueyama K, et al. Inhibition of rho-associated kinase results in suppression of neointimal formation of balloon-injured arteries. Circulation 2000; 101: 2030-2033.

[281]Li J, Brown LF, Laham RJ, Volk R, Simons M. Macrophage-dependent regulation of syndecan gene expression. Circ Res 1997; 81:785-96.

[282]Kojima T, Takagi A, Maeda M, Segawa T, Shimizu A, Yamamoto K, Matsushita T, Saito H. Plasma levels of syndecan (ryudocan) are elevated in patients with acute myocardial infarction. Thromb Haemost 2001; 85: 793-9.

[283]Rincon M, Anguita J, Nakamura T, Fikrig E, Flavell RA. Interleukin (IL)-6 directs the differentiation of IL-4 producing CD4+ T cells. J Exp Med 1997; 185:461-69.

[284]Arpaia E, Shahar M, Dadi H, Cohen A, Roifman CM. Defective T cell receptor signaling and CD8(+) thymic selection in humans lacking Zap-70 kinase. Cell 1994; 76: 947-958.

[285]Emeson E, Shen M, Bell C, Qureshi A. Inhibition of atherosclerosis in CD4 T-cell-ablated and nude (nu/nu) C57BL/6 hyperlipidemic mice. Am J Pathol 1996; 149:359-66

[286]Yet SF, Folta SC, Jain MK, Hsieh CM, Maemura K, Layne MD, Zhang D, Marria PB, Yoshizumi M, Chin MT et al. Molecular cloning, characterization, and promotor analysis of the mouse crp2/SmLim gene. Preferential expression of its promoter in the vascular smooth muscle cells of transgenic mice. J Biol Chem 1998; 273: 10530-37.

Bibliografia

168

[287]Gelineau-van waes J, Bennet GD, Finnell R. Phenytoin-induced alterations in craniofacial gene expression. Teratology 1999; 59:23-34.

EFECTE DEL TRACTAMENT AMB DIFENILHIDANTOÏNA · Iolanda i el Dr. Villaverde que em van introduir...

Documents

Transcript of EFECTE DEL TRACTAMENT AMB DIFENILHIDANTOÏNA · Iolanda i el Dr. Villaverde que em van introduir...