EFECTE DE DIFERENTS CONDICIONS DE CULTIU DURANT LA …

Autora: Clara Arias Sojo

Tutora: Nuria Cañameras Riba

20/09/2021

Treball final de grau

Enginyeria de Sistemes Biològics

EFECTE DE DIFERENTS CONDICIONS DE CULTIU DURANT LA FASE DE

MULTIPLICACIÓ in vitro DE Cannabis sativa L cv. Carmagnola

Efecte de diferents condicions de cultiu durant la fase de multiplicació in vitro de Cannabis sativa L. 1

Resum

En l’estudi realitzat s’analitzen els efectes que poden generar diversos medis de cultiu en la fase de

multiplicació de Cannabis sativa cv. Carmagnola. Els medis de cultiu emprats han estat el medi de

Murashigue i Skoog (1962) i el medi β proporcionat per l’empresa Valenveras S.L., amb l’addició de

l’hormona citoquinínica thidiazuron a diferents concentracions.

S’han realitzat dos assajos, un per a cada medi de cultiu, on s’apliquen diversos tractaments combinant

la concentració de citoquinina, el tipus d’agar i recipient de cultiu utilitzat.

S’han analitzat diversos paràmetres com la longitud, taxa total, taxa viable, pes fresc, pes sec i

contingut hídric dels microbrots obtinguts. També s’han quantificat altres variables com la floració, la

formació de cal·lus, la presencia d’olor i l’aparició d’hiperhidricitat.

D’acord amb resultats obtinguts, s’observa diferents comportaments segons el subcultiu. A més a més,

no es pot establir un medi de cultiu que permeti obtenir taxes elevades de multiplicació.


Resumen

En el estudio realizado se analizan los efectos que pueden generar diversos medios de cultivo en la fase

de multiplicación de Cannabis sativa cv Carmagnola. Los medios de cultivo utilizados han sido el medio

de Murashige y Skoog (1962) y el medio β proporcionado por la empresa Valenveras S.L., con la adición

de la hormona citoquinínica thidiazuron en diferentes concentraciones.

Se han realizado dos ensayos, uno para cada medio de cultivo, donde se aplican diversos tratamientos

combinando la concentración de citoquinina, el tipo de agar y recipiente de cultivo utilizado.

Se han analizado diversos parámetros como la longitud, tasa total, tasa viable, peso fresco, peso seco y

contenido hídrico de los microbrotes obtenidos. También, se han cuantificado variables como la floración,

la formación de calus, la presencia de olor y la aparición de hiperhidricidad.

En los resultados obtenidos, se observan diferentes comportamientos según el subcultivo. Además, no se

puede establecer un medio de cultivo que permita obtener tasas elevadas de multiplicación.


Abstract

The study analyzes the effects that can be generated by various culture media in the multiplication

phase of Cannabis sativa cv. Carmagnola. The culture media used were the Murashigue and Skoog

(1962) medium and the β medium provided by the company Valenveras S.L., with the addition of

thidiazuron in different concentrations.

Two assays have been performed, one for each culture medium, where various treatments are applied

combining the cytokine concentration, the type of agar and culture vessel used.

Various parameters have been analyzed such as the length, total rate, viable rate, fresh weight, dry

weight and water content of the vegetal material obtained. Other variables have also been quantified

such as flowering, callus formation, the presence of scent and the appearance of hyperhydricity.

Acoording to the results obtained, different behaviors are observed depending on the subculture. In

addition, it is not possible to establish a culture medium that allows high rates to be obtained.


Contingut

Índex de figures ...................................................................................................................................... 6

Índex de taules ....................................................................................................................................... 7

Símbols i acrònims .................................................................................................................................. 9

Agraïments ........................................................................................................................................... 10

1. INTRODUCCIÓ ............................................................................................................................... 11

1.1. Origen de l’espècie ................................................................................................................ 11

1.2. Botànica ................................................................................................................................ 11

1.3. Cannabinoides ....................................................................................................................... 12

1.4. Cultivars de cànem i requisits legislatius de cultiu ............................................................... 15

1.5. Cultiu in vitro del Cànem ....................................................................................................... 16

1.6. Motivació de l’estudi............................................................................................................. 18

2. Objectius ....................................................................................................................................... 19

2.1. Objectiu principal .................................................................................................................. 19

2.2. Objectius secundaris ............................................................................................................. 19

3. Material i mètodes ........................................................................................................................ 20

3.1. Material vegetal .................................................................................................................... 20

3.2. Medis base de cultiu ............................................................................................................. 20

3.2.1. Solucions mare .............................................................................................................. 20

3.2.2. Preparació dels medis de cultiu .................................................................................... 22

3.3. Condicions de treball ............................................................................................................ 24

3.4. Assajos de multiplicació ........................................................................................................ 25

3.4.1. Primer assaig ................................................................................................................. 25

3.4.2. Segon assaig .................................................................................................................. 27

3.4.3. Paràmetres de control .................................................................................................. 29

3.4.4. Tractament estadístic .................................................................................................... 30

4. Resultats ........................................................................................................................................ 32

4.1. Assaig de multiplicació medi β .............................................................................................. 32

4.1.1. Longitud ........................................................................................................................ 32

4.1.2. Taxa total....................................................................................................................... 35

4.1.3. Taxa viable..................................................................................................................... 38

4.1.4. Pes fresc ........................................................................................................................ 41

4.1.5. Pes sec ........................................................................................................................... 44

4.1.6. Contingut hídric ............................................................................................................. 47

4.1.7. Presència de flors .......................................................................................................... 49


4.1.8. Presència d’olor ............................................................................................................ 50

4.1.9. Hiperhidricitat ............................................................................................................... 52

4.1.10. Formació de cal·lus ....................................................................................................... 53

4.2. Assaig de multiplicació medi MS ........................................................................................... 55

4.2.1. Longitud ........................................................................................................................ 56

4.2.2. Taxa total....................................................................................................................... 57

4.2.3. Taxa viable..................................................................................................................... 58

4.2.4. Pes fresc ........................................................................................................................ 59

4.2.5. Pes sec ........................................................................................................................... 61

4.2.6. Contingut hídric ............................................................................................................. 62

4.2.7. Presència de flors .......................................................................................................... 63

4.2.8. Presència d’olor ............................................................................................................ 63

4.2.9. Hiperhidricitat ............................................................................................................... 64

4.2.10. Formació de cal·lus ....................................................................................................... 65

5. Discussió dels resultats ................................................................................................................. 66

6. Conclusions ................................................................................................................................... 69

Bibliografia ............................................................................................................................................ 70

Annex estadístic .................................................................................................................................... 76

Assaig de multiplicació medi β .......................................................................................................... 76

Subcultiu A .................................................................................................................................... 76

Subcultiu B .................................................................................................................................... 79

Assaig de multiplicació medi MS ....................................................................................................... 82


Índex de figures

Figura 1 - Esquema general de la biosíntesi de metabòlits primaris i secundaris de C.sativa) ............ 14

Figura 2 - Aplicacions del Cannabis sativa legals i il·legals segons el contingut en THC ....................... 16

Figura 3 - Medi de cultiu preparat en tubs d'assaig i pots de cultiu ..................................................... 23

Figura 4 - Microbrots viables ................................................................................................................ 24

Figura 5 - Esterilitzador per radiació infraroja Sterilbio (J.P. Selecta, S.A.)........................................... 24

Figura 6 - Tubs i pots amb material vegetal a la cambra d'incubació ................................................... 29

Figura 7 - Longitud dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A) ............................................ 33

Figura 8 - Longitud dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B) ............................................ 35

Figura 9 - Taxa total dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A) .......................................... 36

Figura 10 - Taxa total dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B) ........................................ 38

Figura 11 - Taxa viable dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A) ...................................... 39

Figura 12 - Taxa viable dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B) ...................................... 40

Figura 13 - Pes fresc dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A) .......................................... 42

Figura 14 - Pes fresc dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B) .......................................... 43

Figura 15 - Pes sec dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A) ............................................ 45

Figura 16 - Pes sec dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B) ............................................ 46

Figura 17 - Contingut hídric dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A) .............................. 47

Figura 18 - Contingut hídric dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B) .............................. 48

Figura 19 - Material vegetal cultivat en pot i en tub d'assaig ............................................................... 55

Figura 20 - Longitud dels microbrots per a cada tractament (MS) ....................................................... 56

Figura 21 - Taxa total dels microbrots per a cada tractament (MS) ..................................................... 58

Figura 22 - Taxa viable dels microbrots per a cada tractament (MS) ................................................... 59

Figura 23 - Pes fresc dels microbrots per a cada tractament (MS) ....................................................... 61

Figura 24 - Pes sec dels microbrots per a cada tractament (MS) ......................................................... 62

Figura 25 - Contingut hídric dels microbrots per a cada tractament (MS) ........................................... 63


Índex de taules

Taula 1 - Classificació dels components trobats ................................................................................... 12

Taula 2 - Diverses aplicacions farmacològiques de cànnabis medicinal, THC i altres component ....... 13

Taula 3 - Llistat de varietats permeses per a la producció industrial (Comissió Europea,2020) .......... 15

Taula 4 - Composició del medi base de Murashige i Skoog (1992) ....................................................... 21

Taula 5 - Composició del medi β ........................................................................................................... 22

Taula 6 - Longitud (Subcultiu A, Tub) .................................................................................................... 33

Taula 7 - Longitud (Subcultiu A, Pot) ..................................................................................................... 33

Taula 8 - Longitud (Subcultiu B, Tub) .................................................................................................... 34

Taula 9 - Longitud (Subcultiu B, Pot) ..................................................................................................... 34

Taula 10 - Taxa total (Subcultiu A, Tub) ................................................................................................ 36

Taula 11 - Taxa total (Subcultiu A, Pot) ................................................................................................. 36

Taula 12 - Taxa total (Subcultiu B, Tub) ................................................................................................ 37

Taula 13 - Taxa total (Subcultiu B, Pot) ................................................................................................. 37

Taula 14 - Taxa viable (Subcultiu A, Tub) .............................................................................................. 39

Taula 15 - Taxa viable (Subcultiu A, Pot) ............................................................................................... 39

Taula 16 - Taxa viable (Subcultiu B, Tub) .............................................................................................. 40

Taula 17 - Taxa viable (Subcultiu B, Pot) ............................................................................................... 40

Taula 18 - Pes fresc (Subcultiu A, Tub) .................................................................................................. 41

Taula 19 - Pes fresc (Subcultiu A, Pot) .................................................................................................. 41

Taula 20 - Pes fresc (Subcultiu B, Tub) .................................................................................................. 43

Taula 21 - Pes fresc (Subcultiu B, Pot)................................................................................................... 43

Taula 22 - Pes sec (Subcultiu A, Tub) .................................................................................................... 44

Taula 23 - Pes sec (Subcultiu A, Pot) ..................................................................................................... 44

Taula 24 - Pes sec (Subcultiu B, Tub)..................................................................................................... 46

Taula 25 - Pes sec (Subcultiu B, Pot) ..................................................................................................... 46

Taula 26 - Contingut hídric (Subcultiu A, Tub) ...................................................................................... 47

Taula 27 - Contingut hídric (Subcultiu A, Pot) ....................................................................................... 47

Taula 28 - Contingut hídric (Subcultiu B, Tub) ...................................................................................... 48

Taula 29 - Contingut hídric (Subcultiu B, Pot) ....................................................................................... 48

Taula 30 - Percentatge de floració dels propàguls (A) .......................................................................... 49

Taula 31 - Percentatge de floració dels propàguls (B) .......................................................................... 50

Taula 32 - Percentatge de presència d’olor (A) .................................................................................... 51

Taula 33 - Percentatge de presència d’olor (B) ..................................................................................... 51

Taula 34 - Percentatge d'hiperhidricitat (A) ......................................................................................... 52

Taula 35 - Percentatge d'hiperhidricitat (B) .......................................................................................... 53

Taula 36 - Percentatge de formació de cal·lus (A) ................................................................................ 54

Taula 37 - Percentatge de formació de cal·lus (B) ................................................................................ 54

Taula 38 - Longitud (MS) ....................................................................................................................... 56

Taula 39 - Taxa total (MS) ..................................................................................................................... 57

Taula 40 - Taxa viable (MS) ................................................................................................................... 59

Taula 41 - Pes fresc (MS) ....................................................................................................................... 60

Taula 42 - Pes sec (MS) ......................................................................................................................... 61

Taula 43 - Contingut hídric (MS) ........................................................................................................... 62

Taula 44 - Percentatge de presència d’olor .......................................................................................... 64

Taula 45 - Percentatge d'hiperhidricitat ............................................................................................... 64


Taula 46 - Percentatge de formació de cal·lus ...................................................................................... 65


Símbols i acrònims ∆9THC: ∆9 tetrahidrocannabinol

CBD: Cannabidiol

C+P+0: Tractament en pot sense TDZ i agar Comercial

C+P+0,25: Tractament en pot amb 0,25 μM de TDZ i agar Comercial

C+P+0,5: Tractament en pot amb 0,5 μM de TDZ i agar Comercial

C+T+0: Tractament en tub sense TDZ i agar Comercial

C+T+0,25: Tractament en tub amb 0,25 μM de TDZ i agar Comercial

C+T+0,5: Tractament en tub amb 0,5 μM de TDZ i agar Comercial

D+P+0: Tractament en pot sense TDZ i agar Difco

D+P+0,25: Tractament en pot amb 0,25 μM de TDZ i agar Difco

D+P+0,5: Tractament en pot amb 0,5 μM de TDZ i agar Difco

D+T+0: Tractament en tub sense TDZ i agar Difco

D+T+0,25: Tractament en tub amb 0,25 μM de TDZ i agar Difco

D+T+0,5: Tractament en tub amb 0,5 μM de TDZ i agar Difco

EM: Esclerosis múltiple

Intensitat de llum PAR: 60 a 90 μmol m-2s-1

MS: Medi de cultiu de Murashige i Skoog

TDZ: Thidiazuron

THC : Tetrahidrocannabinol


Agraïments

A la Dra. Nuria Cañameras per permetre la meva participació en aquest projecte i ampliar els meus

coneixements sobre el cultiu in vitro gràcies al seu ajut en la direcció i correcció del treball.

A Olga Gener i Carmen Grech per ajudar-me amb el funcionament del laboratori.

A Marta Ginovart Gisbert per resoldre tots els dubtes sobre l’estadística del treball i sempre estar

disponible quan es requereix el seu ajut.

A l’empresa Valenveras S.L. per proporcionar el material vegetal per a poder estudiar el cultiu in vitro de

Cannabis sativa.

A totes les persones que m’han donat suport durant la realització del treball.

I per últim, a la meva família per creure en mi durant tots aquest anys i al meu avi Martín.


1. INTRODUCCIÓ

1.1. Origen de l’espècie

Cannabis sativa és una espècie originaria d’Àsia (Ángeles et al., 2014) i el seu ús per a produir

fibres i confeccionar diversos productes tèxtils data del 4000 aC, mentre que el registre en ús en

la medicina tradicional data de 2700 aC. Posteriorment el seu cultiu es va estendre a l’orient mitjà,

Europa i Amèrica del Sud durant el segle XVI (Waldo, 2006).

D’acord amb el coneixement popular se li ha atribuït propietats, entre d’altres, analgèsiques,

relaxants musculars, antidepressives, hipnòtiques, immunosupressores, antiinflamatòries i

ansiolítiques (Russo, 2007).

Es una planta que es pot aprofitar casi en la seva totalitat ja que proporciona fibres tèxtils,

combustible, pot ser un aliment i també pot ser utilitzada com a font medicinal. La planta va passar

de ser recol·lectada a ser cultivada i s’estudia si va ser el primer exemple de domesticació (Ferrer,

2005). Encara que l’espècie vegetal, com acabem de dir, s’ha cultivat i utilitzat des de fa molt

temps, recentment ha sorgit un gran interès terapèutic i industrial (Ángeles et al., 2014).

Es caracteritza per contenir una gran família de compostos anomenats cannabinoides, els quals

majoritàriament, son sintetitzats per aquesta planta i han despertat un gran interès degut al

descobriment del sistema cannabinoide endogen (Ángeles et al., 2014).

1.2. Botànica

És una planta herbàcia anual, pertanyent a la família Cannabaceae, que s’ha cultivat a gairebé a

totes les parts del món des dels tròpics fins als contraforts alpins (Chandra et al., 2017), de fins a

4 m d’alçada, de tija erecta i fulles palmades estipulades on les inferiors son oposades i les

superiors alternes. Les fulles es troben sobre pecíols de fins 7 cm de llarg. Els seus tricomes

glandulars segreguen una resina com a manera de protegir la planta contra agressions externes.

Presenta dos tipus d’inflorescències: masculina i femenina. Les masculines són ramificades, laxes

i amb moltes flors, mentre que, les femenines son denses però amb poques flors (Ángeles et al.,

2014).


1.3. Cannabinoides

Una de les principals característiques d’aquesta espècie vegetal és la capacitat de segregar

components específics terpenofenòlics (cannabinoides o fitocannabinoides) els quals s’han estudiat

rigorosament des del descobriment de l’estructura química del tetrahidrocannabinol també conegut

com THC. Normalment s’obté una concentració més elevada de THC en els tricomes glandulars de les

flors femenines d’algunes varietats.

S’han trobat en total 565 components de cannabinoides, terpens, flavonoides, alcaloides, estilbens,

amides fenòliques i lignanamides, incloent 120 fitocannabionides (ElSohly et al., 2017).

Les característiques principals d’aquests components estan detallades a la Taula 1 (Flores-Sanchez &

Verpoorte, 2008).

Taula 1 - Classificació dels components trobats

Component Funció

Cannabinoides (THC) Interacció amb tot el sistema de receptors

endògens

Terpens ( Òxid de cariofileno) Activitat antibacteriana i antifúngica, agent

anticoagulant amb plaquetes

Flavonoides Activitat farmacològica i regulació de l’acció dels

cannabinoides

Alcaloides Activitat biològica a baixes dosis

Estilbens Actuen com a mecanisme de defensa en la planta i

tenen capacitat farmacològica (antibacteriana,

antiinflamatòria, protecció cardiovascular...)

Amides fenòliques i lignanamides Activitat citotòxica, antiinflamatòria, analgèsica i

antioxidant


La capacitat de sintetitzar diversos metabòlits secundaris (Figura 1) amb característiques molt

peculiars fan que la planta capti molt interès a l’industria farmacèutica (Taula 2) (Flores-Sanchez i

Verpoorte, 2008).

Taula 2 - Diverses aplicacions farmacològiques de cànnabis medicinal, THC i altres component

Producte Component / Ingredient actiu

Prescripció / Efectes clínics Administració Referència / Companyia

Cannabis flors varietat Bedrocan®

Flors seques, 18% ∆9-THC i 0,2% CBD

Espacitat amb dolor de l’EM o lesió medul·lar; nàusees i vòmits, radioteràpia, quimioteràpia i medicació contra el VIH; tractament pal·liatiu del càncer i VIH

Fumar Office of Medicinal Cannabis (OMC)

Cannabis flors varietat Bedrobinol®

Flors seques, 13% ∆9-THC i 0,2% CBD

Espacitat amb dolor de l’EM o lesió medul·lar; nàusees i vòmits, radioteràpia, quimioteràpia i medicació contra el VIH; tractament pal·liatiu del càncer i VIH

Fumar Office of Medicinal Cannabis (OMC)

Marinol® THC sintètic (càpsules)

Nàusees i vòmits per quimioteràpia, pèrdua de gana associada a pèrdua de pes pel VIH

Oral Solvay Pharmaceuticals, Inc.

Sativex® Extracte de Cannabis, 27 mg/mL ∆9-THC i 25 mg/mL CBD

Dolor neuropàtic en EM Oromucosal GW Pharm Ltd.

CesametTM THC (càpsules) Nàusees i vòmits per quimioteràpia contra el càncer

Oral Valeant Pharmaceuticals International

Ajulemic acid (CT-3)

∆8-THC-11-oic acidb analog, CB1 and CB2 agonist

Efecte analgèsic en dolor neuropàtic crònic

Oral Karst et al. (2003)

Dexanabinol (HU-211)

11-OH∆8-THCa analog, N-methyl-D-aspartate antagonist

Neuroprotecció Intravenós Knoller et al. (2002)/Pharmos Ltd.

Rimonabant /Acomplia® (SR141716A)

NPCDMPCH, CB1 selective antagonist

Adjunt a la dieta i a l’exercici físic en tractament d’obesitat o amb sobrepès en pacients amb factors de risc associats a diabetis tipus II

Oral Van Gall et al. (2005); Henness et al. (2006)/ Sanofi-Aventis; Aronne (2007)


(Flores-Sánchez i Verpoorte,

2008).

La utilització de una varietat concreta de Cannabis sativa per a una determinada aplicació

d’interès està relacionada amb la concentració de THC i CBD de la varietat (Chandra et al., 2017).

TIPUS

1

2

3

∆9-THC (> 0,5 %) + CBD (>0,5%)

[CBD]> [∆9-THC]

[∆9-THC]

Droga

Tipus intermig

Fibra

Figura 1 - Esquema general de la biosíntesi de metabòlits primaris i secundaris de C.sativa)


1.4. Cultivars de cànem i requisits legislatius de cultiu

Per a poder cultivar Cannabis sativa per a la producció industrial a qualsevol territori de l’estat

espanyol, s’han de complir els següents requisits (Departament d'Acció Climàtica, Agricultura i

Desenvolupament Rural, 2021) (Figura 2):

És necessari utilitzar llavors certificades de varietats inscrites en el Catàleg comú de varietats

d'espècies de plantes agrícoles de la Unió Europea, o de varietats que compten amb una

autorització provisional de comercialització, segons la Decisió 2004/842/CE3 de la Comissió,

d'1 de desembre de 2004, i que tenen un contingut en el principi estupefaent

tetrahidrocannabinol (THC) menor del 0,2%.

El cultiu només pot destinar-se a l'obtenció de fibra, gra i llavors.

Cal fer la Declaració Agrària (DUN), on s’ha de declarar anualment les parcel·les de l’explotació

i la destinació de la producció. Mitjançant aquest tràmit s’inscriurà l’explotació al REGEPA

(Registre General de la Producció Agrícola).

Existeix un nombre molt elevat de varietats de cànem i per tal de distingir les que es consideren de

tipus marihuana (THC > 0,2%) de les que es poden cultivar industrialment (THC < 0,2%) la Unió Europea

ha establert un llistat de varietats relacionades amb la concentració de THC (Taula 3), i que són les

que es poden cultivar en territori espanyol. Com es pot observar a la Taula 3, la varietat emprada en

aquest treball final de grau, Cannabis sativa cv. Carmagnola, es troba dintre del marc de varietats

permeses a nivell Europeu. Aquesta varietat és una de les més antigues aprovades per la Unió

Europea, ja que resulta interessant pel seu elevat contingut en alfa-cel·lulosa, hemicel·lulosa, lignines

i altres components com proteïnes, pectines i aminoàcids.

Taula 3 - Llistat de varietats permeses per a la producció industrial (Comissió Europea,2020)

Adzelviesi Carmaleonte Fedora 17 Gliana Kompolti Olivia Succesiv

Alive SK Chamaeleon Felina 32 Glyana Lipko Orion 33 Teodora

Armanca Codimono Fibranova Helena Lovrin 110 Purini Tiborszallasi

Asso CS Fibrante Henola Marcello Rajan Tisza

Austa Sk Dacia Secuieni Fibrol Ivory Marina Ratza Tygra

Balaton Delta-405 Fibror 79 KC Bonusz Markant Santhica 23 Uniko B

Beniko Delta-llosa Finola KC Dora Matrix Santhica 27 Uso-31

Bialobrzeskie Dioica 88 Futura 75 KC Virtus MGC 1013 Santhica 70 Villanova

Cannakomp Earlina 8 FC Futura 83 KC Zuzana Mietko Secueieni

Jubileu

Ielkopolskie

Carma Eletta Campana Férimon KCA Borana Monoica Silvana Wojko

Carmagnola Epsilon 68 Glecia Kompolti híbrid TC Muka 76 Sofia Zenit


L’interès en el cultiu del cànem industrial està augmentant ja que permet als agricultors millorar

agronòmicament les condicions de cultiu i alhora pot permetre obtenir un marge brut una mica

més elevat que el d’altres cultius extensius. Quan aquest cultiu s’introdueix en una rotació de

cultius afavoreix que els cereals augmentin el seu rendiment, en torn a un 30% enfront a si aquests

es cultiven en monocultiu (comunicació personal Dr. Gil Gorchs).

(Departament d'Acció

Climàtica,Agricultura i Desenvolupament Rural, 2021).

1.5. Cultiu in vitro del Cànem

La micropropagació in vitro es una tècnica que permet cultivar les espècies vegetals en un entorn molt

controlat (medi de cultiu i condicions ambientals), sota condicions asèptiques per tal d’eliminar

possibles contaminacions exògenes. Segurament, el principal avantatge d’aquesta tècnica de cultiu és

la capacitat d’obtenir un gran nombre de individus en poc temps i en espais més reduïts.

Les condicions de cultiu, especialment el medi, son dissenyades específicament per a realitzar un

creixement òptim de la varietat objecte de multiplicació. Per això, s’estan realitzant diversos estudis

per ajustar les concentracions dels diferents components dels medis de cultiu, principalment els

reguladors de creixement i els nutrients en les diferents fases de la micropropagació.

Figura 2 - Aplicacions del Cannabis sativa legals i il·legals segons el contingut en THC


Els cultius in vitro consten de les següents fases establertes (Murashige, 1974; Debergh & Maene,

1981):

FASE 0 : Selecció del material vegetal de partida.

FASE I: Introducció del material vegetal a condicions de in vitro. L’objectiu és aconseguir

un cultiu de teixit asèptic, mitjançant una solució desinfectant, que permeti eliminar

possibles contaminacions exògens. Es poden utilitzar diversos tipus d’explants (fulles,

nusos, gemes, cèl·lules vegetals, ...). En el cas de voler obtenir un explant lliure de

qualsevol tipus de contaminació (virus, fongs o bacteris) cal iniciar el cultiu emprant àpexs

meristemàtics.

FASE II: Multiplicació del material vegetal. Es comencen a obtenir nous individus i la

tècnica comença a tenir efecte sobre el propàguls cultivats. Durant aquesta fase es poden

anar realitzant subcultius (cada 4 – 6 setmanes) fins a arribar al nombre d’individus

desitjats o fins que arribin a les característiques físiques necessàries per a passar a la

següent etapa.

FASE III: Allargament i arrelament dels individus obtinguts a l’anterior fase per tal de

preparar-los per sotmetre’ls a les condicions de in vivo.

FASE IV: Aclimatació ex vitro del material vegetal.

Richez-Dumanois et al. (1986) van observar que el cultiu in vitro de C. sativa era viable i que la

proliferació de nous microbrots viables es veia afavorida en presència de citoquinines en el medis de

cultiu. La investigació i innovació del cultiu in vitro d’aquesta espècie s’ha continuat realitzant al llarg

del temps i es segueix observant la capacitat de multiplicació que té ja sigui in vitro o ex vitro (Caplan

et al., 2018; Lata et al., 2010; Marzocchi & Caboni, 2020).

La majoria de les investigacions sobre la micropropagació de l’espècie en condicions in vitro es basen

en la millora dels medis de cultiu per potenciar el desenvolupament dels microbrots cultivats i la seva

potencialitat de formar nous individus viables a partir de l’aplicació de reguladors de creixement.

Wróbel et al. (2020) comenten la importància del temps que passa entre subcultius successius, ja que

han observat que en augmentar el nombre de subcultius la capacitat de generació de nous individus

es veu reduïda. També s’ha relacionat l’aparició de hiperhidricitat i formació de cal·lus amb el temps

entre subcultius (Page, 2020).

Una gran proporció dels estudis realitzats utilitzen com a medi de cultiu el formulat per Murashige i

Skoog ja que dona bons resultats per a multiplicar C.sativa.


No obstant, existeixen altres medis de cultiu que donen resultats favorables com el medi B5, MB ,

DKW ( medi de Driver i Kuniyuki). Page et al. (2020) compararen els medis esmentats anteriorment i

determinaren que el material vegetal cultivat en medi DKW proporcionava un nombre major de

individus viables. Monthony et al. (2020) afirmen que es pot mantenir material vegetal durant anys

sense observar mortalitat de microbrots quan s’utilitza medi de cultiu DKW.

La propagació de plantes en condicions in vitro està molt influenciada per factors ambientals o per el

tipus de hormona o regulador de creixement aplicat (Lata et al., 2016). Aquest components químics

són clau per a regular el desenvolupament fisiològic de l’espècie durant la micropropagació (George

et al., 2008). S’ha de realitzar un esforç continu per tal d’identificar nous components amb la capacitat

d’estimular un creixement més òptim i evitar l’aparició de trastorns fisiològics en els cultius in vitro

(Tarkowská et al., 2003).

Azcón-Bieto (2000) comenta que les citoquinines son reguladors de creixement que afavoreixen la

divisió cel·lular i la formació de nous orgànuls en diferents espècies vegetals, d’aquí la seva gran

importància en el cultiu in vitro. En el cas de C.sativa, d’acord amb Lata et al (2009) l’aplicació de una

dosi de 0,5 μM de TDZ permet obtenir taxes elevades de formació de nous microbrots.

1.6. Motivació de l’estudi

Aquest TFG ha estat fruit d’un encàrrec de col·laboració entre l’Escola d’Enginyeria Agroalimentària i

de Biosistemes de Barcelona i l’empresa Valenveras, S.L. Aquesta empresa es dedica a la investigació

de plantes que tenen interès medicinal i/o industrial, entre elles el Cannabis sativa.

Prèviament a la realització d’aquest estudi s’han realitzat dos TFG. Un d’ells realitzat per Fernández

(2021) i l’altre per Mangas (2021). Ambdós TFG van tractar la fase d’establiment del cultiu, amb

l’objectiu de determinar una pauta correcta de desinfecció del material vegetal. També es van estudiar

diferents medis de multiplicació en els primers subcultius establerts.


2. Objectius

2.1. Objectiu principal

L’objectiu principal d’aquest TFG és estudiar l’efecte de diferents medis de cultiu en la fase de

multiplicació in vitro de Cannabis sativa cv. Carmagnola.

2.2. Objectius secundaris

Per tal d’aconseguir l’objectiu principal s’han establert els següents objectius secundaris:

- Avaluar l’efecte d’addicionar agar Difco o Comercial.

- Estudiar la resposta a les diferents concentracions de thidiazuron.

- Observar les possibles variacions en el material vegetal després de diversos subcultius

successius.


3. Material i mètodes

3.1. Material vegetal

L’espècie vegetal emprada en aquest TFG ha estat Cannabis sativa L. cv. Carmagnola i va ser facilitada

per l’empresa Valenveras, S.L. El material facilitat van ser brots apicals. La font d’explantació emprada

van ser les gemes apicals.

Aquest material va ser introduït a condicions de in vitro en el mes d’octubre del 2020 per tal de

realitzar diferents assajos previs als realitzats en aquest TFG. En conseqüència el material emprat en

el nostre estudi havia estat sotmès a una fase d’iniciació i a una fase de multiplicació amb diferents

subcultius. En concret, abans d’iniciar el primer assaig d’aquest TFG, el material vegetal s’havia

subcultivat en dues ocasions en medis de multiplicació formulats amb la solució base de Murashige &

Skoog (1962) o emprant el medi β, el qual havia estat subministrat per l’empresa esmentada i,

emprant diferents tipus i dosis citoquiníniques. L’interval entre subcultius va ser de 5 setmanes.

3.2. Medis base de cultiu

3.2.1. Solucions mare

Els diferents assajos de multiplicació del material vegetal realitzats en aquest TFG s’han formulat a

partir del medi base de cultiu descrit per Murashige & Skoog (1962) i del medi β. El medi β també és

un medi de cultiu que conté macro i microelements. No es coneix la seva formulació específica ja que

es tracta d’un medi comercial de l’empresa Phytoplant Research. Ambdós medis van ser addicionats

amb compostos orgànics (Taules 4 i 5) i ajustats a pH de 5,7-5,8, utilitzant hidròxid sòdic (0,4 N), ja que

previ a l’ajustament els dos medis eren acidòfils. La gelificació del medi es va fer amb agar. El tipus

d’agar així com el regulador de creixement van ser diferents segons l’assaig realitzat.

Per a la realització del medi MS va caldre preparar prèviament les solucions concentrades dels macro

i micronutrients citats (Taula 4). En el cas del medi β (Taula 5) no va ser necessari fer cap preparació

prèvia, ja que l’empresa facilita la formulació del medi a partir de dues solucions mare preparades

(solucions A i B). Aquestes solucions es mantenien refrigerades a 4 °C.


Taula 4 - Composició del medi base de Murashige i Skoog (1992)

Sal Mineral Pes (mg/L)

NH4NO3

KNO3

1650

1900

HBO3

KI

Na2MoO4 · 2 H2O

CoCl2 · 6 H2O

6,2

0,83

0,25

0,025

KH2PO4 170

CaCl2 · 2 H2O 440

MgSO4 · 7 H2O 370

MnSO4 · 4 H2O

ZnSO4 · 7 H2O

CuSO4 · 5 H2O

22,3

8,6

0,025

Na2EDTA

FeSO4 · 7 H2O

37,3

27,8

Tiamina ( Vitamina B1) 0,5

Piridoxina ( Vitamina B6 ) 0,5

Àcid nicotínic 0,5

Glicocol·la 2

Inositol 100

Sacarosa 30000


Taula 5 - Composició del medi β

Sal Mineral Pes (mg/L)

Fórmula β (A) -

Fórmula β (B) -

Tiamina ( Vitamina B1) 0,5

Piridoxina ( Vitamina B6 ) 0,5

Àcid nicotínic 0,5

Glicocol·la 2

Inositol 100

Sacarosa 30000

3.2.2. Preparació dels medis de cultiu

La pauta que es segueix per a preparar cada medi de cultiu és:

1. Afegir 250 mL d’aigua destil·lada per cada litre de cultiu a preparar en un vas de precipitat.

2. Col·locar el vas de precipitat damunt d’una agitador magnètic.

3. Introduir en el vas de precipitat un imant que permeti una agitació constant.

4. Afegir les diverses solucions mare que contenen els components bàsics del medis de cultiu al

vas de precipitat.

5. Afegir el regulador de creixement amb la concentració corresponent.

6. Homogeneïtzar la solució i amb l’ajut d’un matràs aforat enrasar al volum final de medi.

7. Ajustar el pH del medi utilitzant el pH-metre (CRISON model dígit 501). La resolució del aparell

és de 0,01 unitats de pH amb un error de mesura ≤ 0,005. El pH dels medis ha d’estar comprès

entre el valors de 5,7-5,8. Per fer l’ajust en el cas de l’assaig amb medi β, medi amb un pH

molt àcid (pH < 3) cal afegir varies gotes de NaOH 2 N, l’ajust final es fa, al igual que en els

medis MS, amb d’una solució de NaOH de 0,4 N.

8. Pre-escalfar el medi de cultiu en una font de calor (microones) fins arribar a uns 60 °C.


9. Afegir el compost gelificant (agar: dosis i tipus variable segons tractament) al medi i escalfar

al microones fins arribar a 90 °C.

10. Homogeneïtzar correctament el medi després d’haver afegit l’agar.

11. Repartir el medi de cultiu en tubs d’assaig i pots. Per a als tubs d’assaig s’introdueixen 15 mL

de medi/ tubs d’assaig, es tapen amb els taps d’alumini corresponents (Sero-Taps de la marca

J.P. Selecta S.A.). Per als pots es posen 100 mL de medi / pot, es tapen amb el tap corresponent

i es cobreixen amb film plàstic d’embalatge resistent a l’autoclau.

12. Esterilitzar el medi de cultiu amb una autoclau vertical Presoclave II 30 LA de la marca J.P.

Selecta, S.A. Les condicions han de ser:

- Temperatura 121 °C

- Pressió de vapor 1 bar

- Temps 20 minuts

13. Deixar refredar a temperatura ambient els tubs i pots un cop finalitzat el procés

d’esterilització. Els tubs amb el medi de cultiu cal inclinar-los (45 °) per tal d’evitar l’acumulació

de gotes d’aigua en tota la superfície del medi com a conseqüència de la condensació del

vapor d’aigua. Amb aquesta precaució, l’aigua de condensació només s’acumula en un punt

més baix de la superfície del medi.

14. El medi abans de la seva utilització es deixa reposar, una vegada gelificat, durant 24 h a una

temperatura de 20 °C (Figura 3).

Figura 3 - Medi de cultiu preparat en tubs d'assaig i pots de cultiu


3.3. Condicions de treball

En tots els assajos les condicions de treball són les mateixes.

Tota manipulació del material vegetal cal fer-la en un entorn estèril per a minimitzar la possibilitat de

contaminar-lo amb fongs o bactèries exògenes, és a dir, presents en el ambient i per això es fa sota

condicions de flux laminar (Figura 4).

Totes les eines que s’utilitzen (pinces, bisturís, paper de filtre, paper mil·limetrat) son esterilitzades a

l’autoclau i desprès son emprades en condicions de flux laminar.

La cambra de flux laminar disposa d’esterilitzadors per radiació infraroja Sterilbio (J.P. Selecta, S.A.)

que faciliten mantenir les pinces i bisturís en condicions estèrils, ja que aquests aparells permeten

sotmetre l’esmentat material a una temperatura de 900 °C (Figura 5). Un temps d’esterilització de 5 s

a 8 s evita contaminacions bacterianes o fúngiques. Cal treballar amb varis jocs de pinces i bisturís, ja

que després d’aquest procés cal deixar refredar-los, abans d’utilitzar-les en el material vegetal, fins a

temperatura ambiental.

Cal connectar la cambra de flux laminar uns 30 min abans de ser utilitzada per assegurar que l’aire que

circula es estèril, després es neteja les superfícies amb una solució d’etanol al 70 %. La major part del

material que s’introdueix dins la cambra de flux laminar, normalment és prèviament ruixat amb una

la solució d’etanol.

Figura 4 - Microbrots viables Figura 5 - Esterilitzador per radiació infraroja Sterilbio (J.P. Selecta, S.A.)


3.4. Assajos de multiplicació

En aquest TFG es van realitzar dos assajos consecutius de micropropagació, és a dir, de multiplicació

del material vegetal en condicions de cultiu in vitro.

Aquests assajos han estat producte de la continuació d’un estudi anterior on es va avaluar l’efecte de

dos medis base de cultiu i diferents tipus de citoquinines. L’espècie i varietat vegetal van ser les

emprades en aquest TFG.

A partir dels resultats obtinguts a l’anterior TFG, (Mangas, 2021), s’han formulat els dos assajos

d’aquest TFG. Per això el regulador de creixement emprat ha estat el thidiazuron (TDZ) , ja que és la

citoquinina que havia permès un millor desenvolupament i taxa de multiplicació (Mangas, 2021).

El TDZ s’ha utilitzat per micropropagar una amplia gamma d’espècies llenyoses a causa de la seva gran

capacitat per estimular la proliferació i regeneració de brots (Huetteman & Preece, 1993; Lu, 1993).

En el dos assajos busquem ajustar la concentració de la citoquinina, veure quins resultats obtenim

utilitzant dues classes d’agar (comercial o Difco-Bacto) i les diferències de multiplicar en tubs o pots

de cultiu.

A l’anterior estudi es va realitzar el cultiu in vitro de Cannabis sativa emprant dosis de 0,25, 0,5 i 1 μM

de TDZ (Mangas, 2021). En aquest treball s’utilitza les dosis 0, 0,25 i 0,5 μM de TDZ per tal de

determinar si per a una concentració més baixa d’hormona citoquinínica s’obtenen millors resultats

en el creixement del material vegetal.

Per tal d’aconseguir suficient estoc per a iniciar l’assaig, va ser necessari fer un subcultiu entre l’assaig

de Mangas (2021) i el nostre (representant un tercer subcultiu) per poder formular la totalitat dels

tractaments. En conseqüència els nostres assaigs van representar un quart i cinquè subcultiu.

3.4.1. Primer assaig

a) Tractaments

L’assaig consta de 12 tractaments, tots ells formulats amb medi β.

3 concentracions de TDZ × 2 tipus d’agar × 2 tipus de contenidor = 12 tractaments

● Tres concentracions TDZ:

- 0 μM

- 0,25 μM

- 0,5 μM


● Dos tipus d’agar:

- Agar Comercial de la marca Scharlau

- Agar Difco-Bacto

● Tipus de recipient on es cultiva:

- Tub d’assaig de vidre

- Pot de vidre

El material emprat va ser:

- Tubs d’assaig (1 propàgul/tub d’assaig) : 24 tubs/tractament = 24 propàguls/tractament

- Pots de vidre: 3 pots/tractament. En cada pot s’inserien 8 propàguls; 8 × 3 = 24

propàguls/tractament

El material vegetal que va ser necessari per a fer l’assaig amb els 12 tractaments fou:

Material vegetal per tubs d’assaig:

6 𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑠 ·24 𝑝𝑟𝑜𝑝à𝑔𝑢𝑙𝑠

𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡= 144 𝑝𝑟𝑜𝑝à𝑔𝑢𝑙𝑠

Material vegetal per pots:

6 𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑠 ·3 𝑝𝑜𝑡𝑠

𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡·

8 𝑝𝑟𝑜𝑝à𝑔𝑢𝑙𝑠

𝑝𝑜𝑡= 144 𝑝𝑟𝑜𝑝à𝑔𝑢𝑙𝑠

Per a dur a terme l’assaig vam necessitar 288 propàguls.

b) Medi de cultiu

Per a cada concentració hormonal es va necessitar:

- Tubs d’assaig: 24 tubs de 15 mL cada tub i per a dos tipus diferent d’agar.

Volum de medi β per a una concentració de TDZ, dos tipus d’agar i en tub:

24 𝑡𝑢𝑏𝑠/𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡 ·15 𝑚𝐿

1 𝑡𝑢𝑏· 2 𝑡𝑖𝑝𝑢𝑠 𝑑′𝑎𝑔𝑎𝑟 = 720 𝑚𝐿/𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡

- Pots: 3 pots amb 100 mL de medi i per a dos tipus d’agar.

Volum de medi β per a una concentració hormonal, dos tipus d’agar i en pot:

3 𝑝𝑜𝑡𝑠/𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡 ·100 𝑚𝐿

1 𝑝𝑜𝑡· 2 𝑡𝑖𝑝𝑢𝑠 𝑑′𝑎𝑔𝑎𝑟 = 600 𝑚𝐿/𝑡𝑟𝑎𝑐𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡

Per a una concentració hormonal van ser necessaris 1320 mL de medi de cultiu, per tant, per a tres

concentracions de citoquinina diferent es necessitaren 3960 mL.


c) Selecció del material vegetal

Es van introduint un a un els 288 micropropàguls, procedents dels microbrots obtinguts en l’estudi

anterior, aleatòriament en els tubs i pots de cultiu de cada tractament. No es va agafar cap microbrot

que hagués iniciat el procés de floració, ja que per aquest estudi no ens interessava que la floració

pogués distorsionar els resultats.

Els tubs d’assaig amb els nous propàguls es van col·locar a les gradetes corresponents i juntament amb

els pots es van traslladar a la cambra d’incubació on van estar durant 5 setmanes en les següents

condicions de cultiu:

- Temperatura: 24 °C ± 1

- Intensitat de llum : 60 a 90 μmol m-2s-1

- Fotoperíode : 16 hores de llum i 8 hores de foscor

- Tipus de llum: Fluorescent Grolux

Aquest assaig es va repetir 2 vegades fent dos subcultius successius.

3.4.2. Segon assaig

a) Tractaments

L’assaig consta de 6 tractaments, tots ells formulats amb medi MS.

3 concentracions de TDZ × 1 tipus d’agar × 2 tipus de contenidor = 6 tractaments.

Tres concentracions TDZ:

- 0 μM

- 0,25 μM

- 0,5 μM

Tipus d’agar:

- Agar Comercial de la marca Scharlau

Tipus de recipient on es fa el cultiu:

- Tub d’assaig de vidre

- Pot de vidre

El material emprat va ser:

- Tubs d’assaig (1 propàgul/tub d’assaig): 24 tubs/tractament 24 propàguls/tractament


- Pots de vidre: 3 pots/tractament. En cada pot s’introdueixen 8 propàguls 8 × 3= 24

propàguls/tractament.

El material vegetal que es va necessitar per a realitzar l’assaig:

Material vegetal per tubs d’assaig:

3 𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑠 ·24 𝑝𝑟𝑜𝑝à𝑔𝑢𝑙𝑠

𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡= 𝟕𝟐 𝒑𝒓𝒐𝒑à𝒈𝒖𝒍𝒔

Material vegetal per pots:

3 𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑠 ·3 𝑝𝑜𝑡𝑠

𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡·

8 𝑝𝑟𝑜𝑝à𝑔𝑢𝑙𝑠

𝑝𝑜𝑡= 𝟕𝟐 𝒑𝒓𝒐𝒑à𝒈𝒖𝒍𝒔

En total es necessitava 144 propàguls per aquest assaig.

b) Medi de cultiu

Per a cada concentració hormonal es va necessitar:

- Tubs d’assaig: 24 tubs de 15 mL cadascun

Volum de medi MS per a cada concentració de TDZ i per un tipus d’agar

24 𝑡𝑢𝑏𝑠/𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡 ·15 𝑚𝐿

𝑡𝑢𝑏= 𝟑𝟔𝟎 𝒎𝑳/𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒂𝒎𝒆𝒏𝒕

- Pots: 3 pots de 100 mL

Volum de medi MS per a cada concentració de TDZ i per un tipus d’agar

3 𝑝𝑜𝑡𝑠/𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡 ·100 𝑚𝐿

𝑝𝑜𝑡= 𝟑𝟎𝟎 𝒎𝑳/𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒂𝒎𝒆𝒏𝒕

Per a una concentració hormonal es van necessitar 660 mL de medi de cultiu, per tant, per a tres dosis

de citoquinina es necessitaren 1980 mL.

c) Selecció del material vegetal

Es va introduir un a un els 144 propàguls, procedents dels microbrots obtinguts a partir del tercer

subcultiu del material vegetal de l’estudi anterior, aleatòriament en els tubs i pots de cultiu

corresponents a cada tractament. Com a l’anterior assaig descrit, no es van utilitzar com a font de

multiplicació aquells microbrots que haguessin iniciat el procés de floració.

Els tubs d’assaig amb els nous propàguls obtinguts es van col·locar a les gradetes corresponents i amb

els pots de cultiu es van traslladar a la cambra d’incubació on van estar 5 setmanes amb les següents

condicions de cultiu (Figura 6):


- Temperatura: 24 °C ± 1

- Intensitat de llum: 60 a 90 μmol m-2s-1

- Fotoperíode: 16 hores de llum i 8 hores de foscor

- Tipus de llum: Fluorescent Grolux

Aquesta assaig a diferència de l’anterior només es va realitzar un cop.

3.4.3. Paràmetres de control

Per a cada repetició dels assaigs es van analitzar diversos paràmetres per tal de quantificar la influència

de cada tractament en el creixement de les plantes.

Longitud

Es va mesurar l’alçada de cada microbrot obtingut. Per a mesurar la longitud s’ha utilitzat paper

mil·limetrat.

Taxa de multiplicació viable i total

La taxa de multiplicació és la quantitat de microbrots que poden formar un individu nou, com a taxa

viable s’entén els microbrots que es poden utilitzar per a obtenir un nou individu, mentre que per a

taxa total s’inclouen fragments que poden ser utilitzats per a generar nous individus i els que per

certes característiques no s’utilitzen per multiplicar el material.

Figura 6 - Tubs i pots amb material vegetal a la cambra d'incubació


Pes sec i Pes fresc

Pes del material vegetal després de realitzar una deshidratació d’aquest a una temperatura de 80 °C

durant 24 hores. La biomassa fresca del material vegetal es mesura quan es treuen els propàguls de

la cambra de cultiu. S’utilitza una balança de precisió de la marca Scaltec model SPB32 amb una

resolució de 0,1 mg i una capacitat màxima de 120 g.

Contingut d’aigua

El percentatge d’aigua que té cada propàgul obtingut a partir de la mesura del pes sec i pes fresc.

Degut a que possiblement es va produir una rehidratació del material vegetal un cop tret de l’estufa

pel pas del temps mentre es pesaven els propàguls, s’obtenen valors de contingut d’aigua molt

diversos i amb desviacions molt diferents. Com a conseqüència el programari estadístic emprat no ha

pogut fer les proves estadístiques correctament i s’ha optat per no realitzar per aquest paràmetre les

comparacions dels percentatges de contingut hídric entre tractaments aplicats.

Hiperhidricitat

La hiperhidricitat és una alteració morfològica força comuna quan es multiplica teixit vegetal in vitro.

Aquesta alteració fa que es produeixin certs desordres a nivell fisiològic. Normalment, aquest

paràmetre està vinculat a una acumulació excessiva d’aigua en el teixit.

Es va quantificar la presència d’hiperhidricitat en cada assaig en observar el fenomen durant la

multiplicació del material vegetal i en realitzar els diversos controls dels paràmetres. Aquest

paràmetre s’ha expressat com al percentatge de propàguls que presenten teixit vitrificat respecte el

nombre total de propàguls obtinguts al tractament que s’està estudiant.

Altres paràmetres

Durant el desenvolupament del cultiu s’observa que alguns propàguls han iniciat el procés de floració,

fan olor o han format cal·lus.

3.4.4. Tractament estadístic

Amb les dades obtingudes després de realitzar ambdós assajos, es fa l’anàlisi de variància (ANOVA)

per tal de demostrar si n’hi ha diferències significatives entre els tractaments aplicats per cada


paràmetre de control. Realitzant el tractament estadístic, es va arribar a la conclusió que per tal

d’obtenir resultats coherents a partir de les proves estadístiques s’havien de tractar per separat les

dades obtingudes segons el tipus de recipient de cultiu emprat.

En dur a terme aquesta separació de dades, ja es pot aplicar l’anàlisi de variància (ANOVA) per poder

determinar si hi ha diferències significatives, amb un nivell de significança del 5 %.

Abans de poder realitzar l’ANOVA, es necessita fer una prova de variància per a comprovar si es pot

assumir igualtat de variàncies o no per a les variables a estudiar amb un nivell de significança del 5 %.

En el cas de poder assumir igualtat de variàncies, es realitzar una ANOVA de dos factors (concentració

de thidiazuron, el tipus de gelificant aplicat i la interacció dels dos factors) i el seu comparador de

mitjanes corresponent. Si almenys una variància no és igual, no es pot assumir igualtat de variàncies i

per tant, es realitza la prova Welch-ANOVA d’un factor (tractament aplicat) i amb el seu separador de

mitjanes Games-Howell.

A l’annex es troben les taules obtingudes en les diverses proves estadístiques realitzades per cada

variable.

El tractament estadístic de les dades s’ha realitzat amb el programa Minitab 18.

En el cas dels paràmetres com la hiperhidricitat, presència de flors, olor i formació de cal·lus es va

considerar que no era necessari realitzar un estudi estadístic de les dades obtingudes. En ser

paràmetres detectats en fer els controls del cultius només s’expressen a partir del percentatge de

propàguls que presenten teixit vitrificat, han florit, fan olor o en els quals se ha format un cal·lus

respecte el material vegetal obtingut a cada tractament. No és un objectiu d’aquest estudi determinar

quina concentració de thidiazuron indueix més l’aparició d’hiperhidricitat, fomenta més la floració del

material o la formació de cal·lus. L’estudi de la influència del tipus d’hormona i dosi emprada en el

cultiu in vitro respecte aquest paràmetres pot ser objecte d’estudi en treballs futurs.


4. Resultats

4.1. Assaig de multiplicació medi β

A continuació, i per cadascuna de les variables controlades, es comenten els resultats obtinguts en els

dos subcultius successius (A i B) realitzats en medi de multiplicació β.

4.1.1. Longitud

a) Subcultiu A

Per tal d’analitzar les dades obtingudes a partir del material vegetal desenvolupat en tubs d’assaig, es

realitza una prova de variàncies per comprovar si es pot assumir igualtat de variàncies. Per aquest

tipus de recipient de cultiu, es pot assumir que les dades tenen variància igual (valor p ≥ 0,05) (Taula

A.1).

Es dur a terme una anàlisi de la variància o ANOVA amb dos factors amb els resultats obtinguts dels

propàguls cultivats en tub, no es troben diferències significatives per a cap dels factors (concentració

de thidiazuron i tipus d’agar) (valor p ≥ 0,05) (Taula A.2). Com es pot observar a la Taula 6, les longituds

dels microbrots desenvolupats en tub d’assaig s’han estabilitzat.

Al igual que el material vegetal cultivat en tub d’assaig, les dades obtingudes a partir dels propàguls

desenvolupats en pot, presenten variàncies iguals (valor p ≥ 0,05) (Taula A.3). En canvi, en realitzar

l’ANOVA de dos factors corresponent, s’observa que hi ha diferències significatives entre els resultats

obtinguts com a conseqüència de la interacció entre la dosi de citoquinina i tipus de gelificant utilitzat

(valor p ≤ 0,05) (Taula A.4). El respectiu comparador de mitjanes afirma que els microbrots

desenvolupats en medis de cultiu formulats amb agar Difco són més allargats, a excepció del material

vegetal obtingut amb aquest agar i amb una dosi de 0,5 μM de TDZ que en presenten una longitud

inferior al igual que els propàguls obtinguts amb agar Comercial sense citoquinina (Taula 7) (Figura 7).


Taula 6 - Longitud (Subcultiu A, Tub) Taula 7 - Longitud (Subcultiu A, Pot)

Tractament Tub Longitud (cm) Tractament Pot Longitud (cm)

D+T+0 1,3 ± 0,4 a D+P+0 1,7 ± 0,4 a

D+T+0,25 1,5 ± 0,5 a D+P+0,25 1,6 ± 0,4 a

D+T+0,5 1,5± 0,4 a D+P+0,5 1,0 ± 0,2 b

C+T+0 1,4 ± 0,4 a C+P+0 1,1 ± 0,4 b

C+T+0,25 1,5 ± 0,3 a C+P+0,25 1,2 ± 0,2 ab

C+T+0,5 1,3± 0,5 a C+P+0,5 1,4 ± 0,4 ab

Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les mitjanes fan

referència a els nivells de significació, les mitjanes que comparteixen lletra no són significativament diferents. Utilitzant el

mètode de Tukey amb un nivell de significança del 5 % es comparen les mitjanes obtingudes del material vegetal desenvolupat

en tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mateix mètode per a separar les mitjanes.

C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)

Figura 7 - Longitud dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A)


b) Subcultiu B

En relació al subcultiu B i pel material desenvolupat en tub d’assaig, la prova de variància indica que

no es pot assumir igualtat de variàncies (valor p ≤ 0,05) (Taula A.21), la prova Welch-ANOVA demostra

que hi ha diferències significatives entre tractaments (valor p ≤ 0,05) (Taula A.22). Els microbrots

desenvolupats en medi gelificat amb agar Comercial en presència de 0,5 μM de TDZ són més allargats

que els desenvolupats amb el mateix gelificant però amb dosis inferiors de TDZ. A més a més,

s’observa una tendència, encara que no sigui significativa, a obtenir microbrots més allargats emprant

gelificant Difco (Taula 8).

En el cas d’utilitzar pots de cultiu, tampoc es pot assumir variàncies iguals (valor p ≥ 0,05) (Taula A.23),

en realitzar una ANOVA de dos factors (concentració de TDZ i tipus de gelificant aplicat), s’observen

diferències significatives per el tipus de gelificant aplicat (valor p ≤ 0,05) (Taula A.24). Els microbrots

desenvolupats en medi de cultiu formulat amb agar Difco són més allargats en comparació al material

vegetal obtingut amb tractaments on s’ha emprat agar Comercial (Taula 9) (Figura 8).

Taula 8 - Longitud (Subcultiu B, Tub) Taula 9 - Longitud (Subcultiu B, Pot)

Tractament Tub Longitud (cm) Tractament Pot Longitud (cm)

D+T+0 1,3 ± 0,4 ab D+P+0 1,3 ± 0,4 a

D+T+0,25 1,5 ± 0,6 ab D+P+0,25 1,3 ± 0,4 a

D+T+0,5 1,4 ± 0,7 ab D+P+0,5 1,5 ± 0,5 a

C+T+0 1,2 ± 0,3 b C+P+0 1,1 ± 0,2 b

C+T+0,25 1,2 ± 0,4 b C+P+0,25 1,2 ± 0,4 b

C+T+0,5 1,6 ± 0,5 a C+P+0,5 1,3 ± 0,3 b



mètode Games-Howell amb un nivell de significança del 5 % es comparen les mitjanes obtingudes del material vegetal

desenvolupat en tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mètode Tukey amb un nivell de significança del

5 % per a separar les mitjanes.



4.1.2. Taxa total

La taxa de multiplicació total indica la quantitat de individus nous que es poden desenvolupar a partir

del propàguls obtingut en realitzar el cultiu in vitro incloent aquells microbrots que per certes

característiques no es poden emprar com a material vegetal de multiplicació.

Aquest paràmetre s’expressa com a possibles nous individus per propàgul obtingut en el cultiu in vitro

realitzat.

a) Subcultiu A

En el cas del material vegetal crescut en tub d’assaig, no es pot assumir que totes les variàncies són

iguals segons la prova de variància realitzada (valor p ≤ 0,05) (Taula A.5), la prova Welch-ANOVA indica

que no s’observen diferències significatives entre els tractaments aplicats (valor p ≥ 0,05) (Taula A.6).

No obstant, les dosis més elevades de TDZ presenten una tendència a formar un major nombre de

nous rebrots (Taula 10).

Les dades obtingudes a partir del material vegetal obtingut en pot, no presenten variància igual (valor

p ≤ 0,05) (Taula A.7), segons la prova Welch-ANOVA es poden observar diferències significatives entre

els tractaments (valor p ≤ 0,05) (Taula A.8), el material vegetal tractat amb agar Difco i amb una dosi

hormonal de TDZ de 0,5 μM presenta una capacitat de formar nous individus més reduïda que els

Figura 8 - Longitud dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B)


propàguls desenvolupats amb el mateix tipus d’agar però amb una concentració hormonal de 0,25

μM (Taula 11).

També per aquesta variable i tipus de recipient, s’observa en general, que els tractaments amb Difco

sense presència hormonal o a dosis baixes indueixen més formació de nous individus enfront de l’agar

Comercial (Figura 9).

Taula 10 - Taxa total (Subcultiu A, Tub) Taula 11 - Taxa total (Subcultiu A, Pot)

Tractament Tub Taxa total Tractament Pot Taxa total

D+T+0 2,5 ± 0,8 a D+P+0 4,3 ± 2,8 ab

D+T+0,25 3,0 ± 0,9 a D+P+0,25 4,8 ± 1,2 a

D+T+0,5 3,5 ± 1,4 a D+P+0,5 2,0 ± 0,8 b

C+T+0 2,8 ± 0,4 a C+P+0 2,3 ± 2,3 ab

C+T+0,25 2,2 ± 1,2 a C+P+0,25 3,6 ± 1,0 ab

C+T+0,5 4,2 ± 2,5 a C+P+0,5 3,5 ± 0,5 ab


referència a els nivells de significació, les mitjanes que comparteixen lletra no són significativament diferents. Utilitzant el mètode

Games-Howell amb un nivell de significança del 5 % es comparen les mitjanes obtingudes del material vegetal desenvolupat en

tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mateix mètode per a separar les mitjanes.


Figura 9 - Taxa total dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A)


b) Subcultiu B

En el cas de cultivar en tubs d’assaig, no es pot assumir que les variàncies de les dades obtingudes

siguin totes iguals segons la prova de variància realitzada (valor p ≤ 0,05) (Taula A.25), per tant, es

realitza la prova Welch-ANOVA on s’observen diferències significatives entre els tractaments aplicats

(valor p ≤ 0,05) (Taula A.26). El material vegetal obtingut emprant gelificant Difco presenta una taxa

total superior a la obtinguda amb agar Comercial, a excepció feta del material obtingut amb aquest

tipus de gelificant a elevada concentració (0,5 μM de TDZ) (Taula 12).

Les dades recollides a partir del material vegetal cultivat en pot, presenten variància diferent segons

la prova de variància realitzada (valor p ≤ 0,05) (Taula A.27), s’observen diferències significatives entre

tractaments (valor p ≤ 0,05) indicades per la prova Welch-ANOVA (Taula A.28). El comportament quan

es cultiva en pots es diferent al observat quan es cultiva en tub d’assaig. La taxa total de multiplicació

resulta superior en el material obtingut en agar Comercial a 0,25 i 0,5 μM de TDZ enfront d’una menor

taxa obtinguda en medis sense TDZ per a qualsevol tipus de gelificant (Taula 13) (Figura 10).

Taula 12 - Taxa total (Subcultiu B, Tub) Taula 13 - Taxa total (Subcultiu B, Pot)

Tractament Tub Taxa total Tractament Pot Taxa total

D+T+0 1,7 ± 0,7 b D+P+0 2,0 ± 1,2 c

D+T+0,25 4,4 ± 3,2 a D+P+0,25 4,7 ± 2,8 ab

D+T+0,5 4,5 ± 3,3 a D+P+0,5 5,5 ± 3,6 ab

C+T+0 1,8 ± 1,1 b C+P+0 3,2 ± 2,1 bc

C+T+0,25 2,5 ± 1,7 ab C+P+0,25 6,1 ± 3,3 a

C+T+0,5 3,6 ± 2,1 a C+P+0,5 6,5 ± 3,0 a




desenvolupat en tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mateix mètode per a separar les mitjanes.



4.1.3. Taxa viable

a) Subcultiu A

Segons la prova de variància realitzada per aquesta variable, es pot assumir que les dades obtingudes

tenen totes una variància igual (valor p ≥ 0,05) (Taula A.9), per tant, es realitza una anàlisi de la

variància (ANOVA) amb dos factors (concentració de TDZ, el tipus d’agar emprat i la interacció dels

dos factors).

L’ANOVA indica que pel material vegetal cultivat en tub d’assaig, només es troben diferències

significatives (valor p ≤ 0,05) per la concentració de citoquinina aplicada (Taula A.10), s’observa que

la concentració hormonal de 0,5 μM de TDZ afavoreix la formació de nous microbrots viables (Taula

14) (Figura 11).

En el cas d’utilitzar pots com a recipient de cultiu (Taula 15), també es pot assumir que les variàncies

de les dades són iguals segons la prova de variància realitzada (valor p ≥ 0,05) (Taula A.11), l’ANOVA

no indica diferències significatives per a cap dels dos factors ni la seva interacció (valor p ≥ 0,05) (Taula

A.12).

Figura 10 - Taxa total dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B)


Taula 14 - Taxa viable (Subcultiu A, Tub) Taula 15 - Taxa viable (Subcultiu A, Pot)

Tractament Tub Taxa viable Tractament Pot Taxa viable

D+T+0 1,8± 0,7 b D+P+0 3,2 ± 2,5 a

D+T+0,25 2,7 ± 1,0 b D+P+0,25 4,0 ± 1,8 a

D+T+0,5 3,2 ± 1,2 a D+P+0,5 2,0 ± 0,8 a

C+T+0 2,5 ± 0,5 b C+P+0 1,2 ± 2,8 a

C+T+0,25 1,3 ± 1,2 b C+P+0,25 3,2 ± 1,8 a

C+T+0,5 3,0 ± 1,5 a C+P+0,5 2,7 ± 0,8 a




en tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mateix mètode per a separar les mitjanes.


b) Subcultiu B

La prova de variància realitzada tant per el material vegetal cultivat en tub d’assaig com en pot, indica

que no es pot assumir igualtat de variàncies (valor p ≤ 0,05) (Taula A.29 i A.31). La prova Welch-

ANOVA d’aquesta variable, i per aquest subcultiu (Taula A.30), ens indica que hi ha diferències

significatives entre tractaments (valor p ≤ 0,05). En concret, s’observa que la taxa viable dels

Figura 11 - Taxa viable dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A)


microbrots desenvolupats en tubs d’assaig amb agar Difco a una concentració 0,5 μM de TDZ és

superior a l’obtinguda pels microbrots generats en medis de cultiu sense regulador de creixement per

a qualsevol gelificant (Taula 16).

En el cas de cultivar en pots de cultiu, també s’observen diferències significatives (valor p ≤ 0,05)entre

tractaments en fer la prova Welch-ANOVA corresponent (Taula A.32). En general, s’observen que les

majors taxes viables es donen en presència de regulador de creixement i per qualsevol dels gelificants

utilitzats. En general, a major concentració citoquinínica major taxa de multiplicació (Taula 17) (Figura

12).

Taula 16 - Taxa viable (Subcultiu B, Tub) Taula 17 - Taxa viable (Subcultiu B, Pot)

Tractament Tub Taxa viable Tractament Pot Taxa viable

D+T+0 0,4 ± 0,7 c D+P+0 0,6 ± 0,9 c

D+T+0,25 2,7 ± 2,9 ab D+P+0,25 2,9 ± 3,0 ab

D+T+0,5 2,9 ± 2,6 a D+P+0,5 4,5 ± 3,8 a

C+T+0 0,5 ± 0,9 bc C+P+0 2,0 ± 1,6 bc

C+T+0,25 1,3 ± 1,4 abc C+P+0,25 3,8 ± 1,9 a

C+T+0,5 2,4 ± 1,9 ab C+P+0,5 4,5 ± 2,8 a






Figura 12 - Taxa viable dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B)


4.1.4. Pes fresc

a) Subcultiu A

La prova de variància realitzada tant per el material vegetal cultivat en tub d’assaig com en pot, indica

que no es pot assumir igualtat de variàncies (valor p ≤ 0,05) (Taula A.13 i A.15).

Tot i que la prova Welch-ANOVA demostra que no hi ha diferències significatives en la biomassa fresca

obtinguda en els diferents tractaments realitzats en tub d’assaig (valor p ≥ 0,05) (Taula A.14), si

s’observa una tendència a presentar un major pes fresc el material vegetal desenvolupat en medi de

cultiu amb solidificat Difco (Taula 18).

En el cas dels microbrots desenvolupats en pots de cultiu, la prova Welch-ANOVA corresponent indica

que hi ha diferències significatives (valor p ≤ 0,05) segons el tractament aplicat (Taula A.16), s’observa

la mateixa tendència que l’obtinguda en tubs d’assaig. A més a més, en aquest tipus de recipient, el

material desenvolupat en medis de multiplicació formulats amb agar Difco i en presència d’hormona

són diferents a la resta de tractaments, llevat del tractament formulat amb Difco sense hormona

(Taula 19) (Figura 13).

Taula 18 - Pes fresc (Subcultiu A, Tub) Taula 19 - Pes fresc (Subcultiu A, Pot)

Tractament Tub Pes fresc (g) Tractament Pot Pes fresc (g)

D+T+0 0,4297 ± 0,2213 a D+P+0 0,6070 ± 0,2510 ab

D+T+0,25 0,4054 ± 0,1181 a D+P+0,25 1,0070 ± 0,4770 a

D+T+0,5 0,5990 ± 0,3310 a D+P+0,5 0,8972 ± 0,0876 a

C+T+0 0,3740 ± 0,2870 a C+P+0 0,5055 ± 0,1091 c

C+T+0,25 0,2545 ± 0,0713 a C+P+0,25 0,5320 ± 0,2550 bc

C+T+0,5 0,2717 ± 0,1449 a C+P+0,5 0,5165 ± 0,1603 c







b) Subcultiu B

La prova de variància realitzada tant per els propàguls cultivats en tub d’assaig com en pot, indica que

no es pot assumir igualtat de variàncies (valor p ≤ 0,05) (Taula A.33 i A.35).

La prova Welch-ANOVA indica que hi ha diferències significatives (valor p ≤ 0,05) en la biomassa fresca

obtinguda en els diferents tractaments realitzats en tub d’assaig (Taula A.34). El material vegetal

obtingut a partir d’aplicar la concentració de 0,5 μM de TDZ amb agar Difco presenta un major pes

fresc (0,8950 g) que la resta de tractaments, a excepció feta, del tractament formulat amb 0,25 μM de

TDZ amb el mateix tipus d’agar (Taula 20).

Emprant pots de cultiu, s’observen diferències significatives entre tractaments segons la prova Welch-

ANOVA (valor p ≤ 0,05) (Taula A.36), el material desenvolupat en medis de multiplicació formulats

amb solidificant Difco són diferents a la resta de tractaments en contenir una major biomassa fresca,

a excepció feta, del material obtingut amb agar Comercial a dosi alta de TDZ (0,5 μM) (Taula 21) (Figura

14).

Figura 13 - Pes fresc dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A)


Taula 20 - Pes fresc (Subcultiu B, Tub) Taula 21 - Pes fresc (Subcultiu B, Pot)

Tractament Tub Pes fresc (g) Tractament Pot Pes fresc (g)

D+T+0 0,4535 ± 0,2255 b D+P+0 0,9032 ± 0,2314 a

D+T+0,25 0,7930 ± 0,5350 ab D+P+0,25 1,0504 ± 0,3908 a

D+T+0,5 0,8950 ± 0,5100 a D+P+0,5 0,9541 ± 0,3808 a

C+T+0 0,4880 ± 0,2198 b C+P+0 0,4329 ± 0,1949 c

C+T+0,25 0,4541 ± 0,2499 b C+P+0,25 0,5101 ± 0,2495 bc

C+T+0,5 0,5198 ± 0,3362 b C+P+0,5 0,7630 ± 0,3321 ab






Figura 14 - Pes fresc dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B)


4.1.5. Pes sec

a) Subcultiu A

La prova de variància realitzada pel material vegetal cultivat en tub d’assaig especifica que es pot

assumir que les dades presenten variàncies iguals (valor p ≥ 0,05) (Taula A.17), en canvi, per els

microbrots desenvolupats en pots de cultiu, les dades presenten variàncies diferents (valor p ≤ 0,05)

(Taula A.19).

En el cas dels tubs d’assaig no s’observen diferències significatives per a cap dels dos factors

(concentració de TDZ i tipus d’agar emprat) segons l’ANOVA realitzada (valor p ≥ 0,05) (Taula A.18).

No obstant, es pot observar una certa tendència a obtenir més biomassa seca quan el gelificant és

agar Difco. Tot i que el programari estadístic ha determinat que els tractaments no són prou diferents,

a la Taula 22 es pot observar que els microbrots obtinguts amb una dosi de citoquinina de 0,5 μM amb

agar Difco presenta un pes sec major en comparació amb el tractament amb la mateixa dosi hormonal

però amb gelificant Comercial (Figura 15).

Quan el recipient són pots de cultiu, l’anàlisi estadística Welch-ANOVA realitzat indica que no hi ha

diferències significatives entre tractaments (valor p ≥ 0,05) (Taula A.20). No obstant, al igual que el

material vegetal desenvolupat en tub d’assaig, es pot apreciar que els tractaments amb gelificant Difco

presenten una biomassa seca una mica més elevada que els tractaments on s’ha emprat agar

Comercial (Taula 23).

Taula 22 - Pes sec (Subcultiu A, Tub) Taula 23 - Pes sec (Subcultiu A, Pot)

Tractament Tub Pes sec (g) Tractament Pot Pes sec (g)

D+T+0 0,0393 ± 0,0166 a D+P+0 0,0520 ± 0,0166 a

D+T+0,25 0,0373 ± 0,0143 a D+P+0,25 0,0803 ± 0,0320 a

D+T+0,5 0,0503 ± 0,0252 a D+P+0,5 0,0665 ± 0,0093 a

C+T+0 0,0425 ± 0,0342 a C+P+0 0,0453 ± 0,0056 a

C+T+0,25 0,0275 ± 0,0146 a C+P+0,25 0,0610 ± 0,0297 a

C+T+0,5 0,0283 ± 0,0143 a C+P+0,5 0,0441 ± 0,0169 a




en tub d’assaig. En el cas del material cultivat en pot s’utilitza el mètode Games-Howell per a separar les mitjanes, amb un

nivell de significança del 5 %.



b) Subcultiu B

Les dues proves de variància realitzades per a cada tipus de recipient de cultiu emprat, indiquen que

no es pot assumir igualtat de variàncies (valor p ≤ 0,05) (Taula A.37 i A.39).

L’anàlisi Welch-ANOVA determina que no hi ha diferències significatives (valor p ≥ 0,05) en la

biomassa seca obtinguda en els diferents tractaments realitzats en tub d’assaig (Taula A.38). No

obstant, s’observa que els tractaments que contenen Difco en presència de TDZ tendeixen a

desenvolupar una major biomassa seca que la resta de tractaments (Taula 24) (Figura 16).

En canvi, segons l’anàlisi Welch-ANOVA de les dades obtingudes a partir del material desenvolupat en

pots de cultiu, hi ha diferències significatives entre tractaments (valor p ≤ 0,05) (Taula A.40). S’obté

major biomassa seca en els tractaments que contenen agar Difco. No obstant, aquests tractaments

no es poden diferenciar amb els tractaments formulats amb agar Comercial en presència d’hormona

(Taula 25).

Figura 15 - Pes sec dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A)


Taula 24 - Pes sec (Subcultiu B, Tub) Taula 25 - Pes sec (Subcultiu B, Pot)

Tractament Tub Pes sec (g) Tractament Pot Pes sec (g)

D+T+0 0,0522 ± 0,0301 a D+P+0 0,0889 ± 0,0236 a

D+T+0,25 0,0683 ± 0,0348 a D+P+0,25 0,0876 ± 0,0293 a

D+T+0,5 0,0732 ± 0,0363 a D+P+0,5 0,0845± 0,0319 a

C+T+0 0,0488 ± 0,0187 a C+P+0 0,0499± 0,0191 b

C+T+0,25 0,0496 ± 0,0204 a C+P+0,25 0,0801 ± 0,0453 ab

C+T+0,5 0,0526 ± 0,0252 a C+P+0,5 0,0726 ± 0,0341 ab






Figura 16 - Pes sec dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B)


4.1.6. Contingut hídric

a) Subcultiu A

El percentatge d’aigua és aparentment més elevat en els microbrots obtinguts en pots de cultiu que

en tub d’assaig. En el cas de cultivar en tubs d’assaig, els percentatges d’aigua han oscil·lat entre 88,6

% i 91,5 % (Taula 26). En el cas d’utilitzar pots com a recipient de cultiu en aquestes condicions de

cultiu, el contingut hídric oscil·la entre 90,7 % i 95,1 % (Taula 27) (Figura 17).

Taula 26 - Contingut hídric (Subcultiu A, Tub) Taula 27 - Contingut hídric (Subcultiu A, Pot)

Tractament Tub Contingut aigua (%) Tractament Pot Contingut aigua (%)

D+T+0 89,7 ± 3,3 D+P+0 91,1 ± 1,1

D+T+0,25 89,5 ± 2,6 D+P+0,25 91,7 ± 1,2

D+T+0,5 91,4 ± 0,9 D+P+0,5 92,6 ± 0,6

C+T+0 88,6 ± 2,2 C+P+0 90,7 ± 1,6

C+T+0,25 89,8 ± 3,1 C+P+0,25 95,1 ± 4,7

C+T+0,5 89,4 ± 0,8 C+P+0,5 91,6 ± 2,1

Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la desviació estàndard. Per aquesta variable s’ha considerat que no era

necessari comparar les mitjanes. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron

(μM)

Figura 17 - Contingut hídric dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu A)


b) Subcultiu B

En aquest subcultiu els percentatges d’aigua calculats en els microbrots desenvolupats en tub

d’assaig són molt similars entre tractaments i oscil·len entre el 88 % i el 91,6 % (Taula 28). En el

cas de cultivar en pot el rang és lleugerament més ample ja que el contingut hídric es situa entre

82,4 % i el 92,5 % (Taula 29).

En general, els percentatges més elevats s’han obtingut en tractaments formulats amb agar Difco

(Figura 18).

Taula 28 - Contingut hídric (Subcultiu B, Tub)

Taula 29 - Contingut hídric (Subcultiu B, Pot)

Tractament Tub Contingut aigua (%) Tractament Pot Contingut aigua (%)

D+T+0 89,2 ± 3,8 D+P+0 90,0 ± 1,0

D+T+0,25 90,7 ± 1,6 D+P+0,25 91,5 ± 0,7

D+T+0,5 91,6 ± 2,5 D+P+0,5 90,9 ± 1,4

C+T+0 89,5 ± 1,4 C+P+0 88,02 ± 1,4

C+T+0,25 88,0 ± 2,4 C+P+0,25 82,4 ± 9,2

C+T+0,5 88,4 ± 3,5 C+P+0,5 92,5 ± 6,2

Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la desviació estàndard. Per aquesta variable s’ha considerat que no era

necessari comparar les mitjanes. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de

thidiazuron (μM)

Figura 18 - Contingut hídric dels microbrots per a cada tractament (Subcultiu B)


4.1.7. Presència de flors

a) Subcultiu A

En general, no és freqüent observar formació de flors durant la fase de multiplicació. No obstant en

aquest primer assaig, on el material ja portava quatre subcultius en condicions in vitro s’ha pogut

quantificar l’aparició de flors en tots els tractaments que no contenien citoquinina i també en els

microbrots desenvolupats en pot de cultiu i amb agar Difco (Taula 30).

Taula 30 - Percentatge de floració dels propàguls (A)

Subcultiu A

C+T+0 38,9 D+T+0 23,5

C+T+0,25 0,0 D+T+0,25 0,0

C+T+0,5 0,0 D+T+0,5 0,0

C+P+0 18,8 D+P+0 4,2

C+P+0,25 0,0 D+P+0,25 18,2

C+P+0,5 0,0 D+P+0,5 7,1

Els valors obtinguts representen el percentatge de presència de

propàguls florits contra l’absència d’aquests respecte el nombre

total de propàguls obtinguts a cada tractament. C: Agar Comercial

D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de

thidiazuron (μM)

b) Subcultiu B

Degut a la presència de flors en alguns microbrots obtinguts en el subcultiu A, es va procurar no

utilitzar-los com a propàguls per iniciar el subcultiu B. No obstant en aquest subcultiu s’ha

incrementat, respecte el subcultiu A, el percentatge de material florit en els tractaments realitzats

en tub d’assaig. En canvi, s’ha aconseguit reduir fins a no obtenir cap microbrot florit en els

tractaments formulats amb agar Difco i cultivats en pot (Taula 31).


Taula 31 - Percentatge de floració dels propàguls (B)

Subcultiu B

C+T+0 47,6 D+T+0 53,8

C+T+0,25 21,2 D+T+0,25 11,1

C+T+0,5 27,6 D+T+0,5 4,3

C+P+0 25,0 D+P+0 0,0

C+P+0,25 8,3 D+P+0,25 0,0

C+P+0,5 0,0 D+P+0,5 0,0

Els valors obtinguts representen el percentatge de presència de

propàguls florits contra l’absència d’aquests respecte el nombre

total de propàguls obtinguts a cada tractament. C: Agar Comercial

D: Agar Difco T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de

thidiazuron (μM)

4.1.8. Presència d’olor

a) Subcultiu A

En aquest primer assaig, en realitzar els controls dels paràmetres definits pel material vegetal obtingut

en el cultiu in vitro, quan s’obrien els tubs d’assaig i pots de cultiu es va olorar l’olor característic del

Cannabis sativa. Per tal de quantificar aquest paràmetre, es va realitzar un recompte dels propàguls

cultivats en tubs d’assaig i pot que feien olor. Es va obtenir el percentatge de propàguls que feien olor

respecte el total de propàguls obtinguts en el cultiu in vitro per a cada tractament aplicat. En general,

per aquest subcultiu i pels recipients vinculats amb agar Difco es quantifiquen més propàguls que fan

olor (Taula 32).

Per aquest paràmetre no es realitza una anàlisis estadística degut a que es quantifiquen el propàguls

que fan olor respecte el total de propàguls obtinguts, no es busca estudiar quin tractament fomenta

l’olor dels propàguls o quin grau de potencialitat té aquesta olor.


Taula 32 - Percentatge de presència d’olor (A)

Subcultiu A

C+T+0 11,1 D+T+0 29,4

C+T+0,25 0,0 D+T+0,25 5,0

C+T+0,5 5,3 D+T+0,5 12,5

C+P+0 31,3 D+P+0 29,2

C+P+0,25 10,0 D+P+0,25 27,3

C+P+0,5 8,3 D+P+0,5 85,7

Els valors obtinguts representen el percentatge de propàguls que

fan olor respecte el nombre total de propàguls obtinguts a cada

tractament. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P:

Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)

b) Subcultiu B

En aquest subcultiu, ha incrementat el nombre de propàguls que feien olor desenvolupats en tubs

d’assaig, mentre que per els pots de cultiu, el nombre de propàguls que feien olor s’ha reduït.

En el cultiu anterior, el tractament en pot amb agar Difco i 0,5 μM de TDZ presentava un 85,7 % de

propàguls que feien olor respecte el nombre total de propàguls obtinguts en el cultiu, a diferència

d’aquest subcultiu, pel mateix tractament el percentatge de nombre de propàguls que fan olor es del

16,7 % (Taula 33).

Taula 33 - Percentatge de presència d’olor (B)

Subcultiu B

C+T+0 61,9 D+T+0 76,9

C+T+0,25 45,5 D+T+0,25 72,2

C+T+0,5 44,8 D+T+0,5 73,9

C+P+0 12,5 D+P+0 23,8

C+P+0,25 4,2 D+P+0,25 43,8

C+P+0,5 0,0 D+P+0,5 16,7

Els valors obtinguts representen el percentatge de propàguls que

fan olor respecte el nombre total de propàguls obtinguts a cada

tractament. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig P:

Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)


4.1.9. Hiperhidricitat

a) Subcultiu A

La hiperhidricitat és una alteració morfològica força comuna quan es multiplica teixit vegetal in vitro.

Aquesta alteració fa que es produeixin certs desordres a nivell fisiològic. Normalment, està vinculada

a una acumulació excessiva d’aigua en el teixit (Gao et al., 2018; Liu et al., 2017; Van den Dries et al.,

2013).

En aquest primer assaig es va detectar presència de teixit vitrificat, és a dir, hiperhidratat, en tots els

tractaments. En general, s’observa un major percentatge de material vitrificat quan el recipient de

cultiu han estat pots (> 16 %), enfront del cultivat en tub d’assaig (>5,3 %) (Taula34).

Taula 34 - Percentatge d'hiperhidricitat (A)

Subcultiu A

C+T+0 16,7 D+T+0 58,8

C+T+0,25 5,3 D+T+0,25 20,0

C+T+0,5 10,5 D+T+0,5 8,3

C+P+0 68,8 D+P+0 25,0

C+P+0,25 35,0 D+P+0,25 54,5

C+P+0,5 16,7 D+P+0,5 85,7

Els valors obtinguts representen el percentatge de propàguls amb

teixit vitrificat respecte el nombre total de propàguls obtinguts a

cada tractament. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig

P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)

b) Subcultiu B

En realitzar la repetició de l’assaig, es continua detectant presencia de teixit vitrificat en la majoria

dels tractaments.

Com s’ha observat per la variable d’aroma, el percentatge de material vegetal vitrificat augmenta quan

s’ha desenvolupat en tub d’assaig. En el cas dels microbrots desenvolupats en medis formulats sense

hormona, en el subcultiu A, presentaven uns percentatge de hiperhidricitat de 16,7 % per agar


Comercial i 58,8 % per agar Difco, en aquest subcultiu han incrementat fins 76,2 % per el gelificant

Comercial i 92,3 % per en Difco (Taula 35).

En general, pel material vegetal multiplicat en pots de cultiu s’ha reduït el percentatge de teixit

vitrificat.

Taula 35 - Percentatge d'hiperhidricitat (B)

Subcultiu B

C+T+0 76,2 D+T+0 92,3

C+T+0,25 48,5 D+T+0,25 50,0

C+T+0,5 27,6 D+T+0,5 52,2

C+P+0 0,0 D+P+0 71,4

C+P+0,25 0,0 D+P+0,25 50,0

C+P+0,5 4,2 D+P+0,5 27,8


teixit vitrificat respecte el nombre total de propàguls obtinguts a

cada tractament. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub d’assaig

P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)

4.1.10. Formació de cal·lus

a) Subcultiu A

La formació de cal·lus a la base del microbrot durant la fase de multiplicació depèn, principalment , de

l’espècie vegetal i de la relació fitohormonal. El tipus de cal·lus format en el nostre assaig corresponia

a un cal·lus molt poc aparent i que en cap cas va generar-se a partir d’ell microbrots adventicis ja que

tots els microbrots obtinguts en aquest assaig han estat axil·lars. La formació de cal·lus s’ha quantificat

a partir del recompte del nombre de propàguls amb cal·lus respecte el nombre total de propàguls

obtinguts en el cultiu in vitro per cada tractament emprat.

En general, quan els medis de cultiu han estat formulats sense presència de citoquinina, la formació

de cal·lus ha estat nul·la o reduïda (Taula 36).


Taula 36 - Percentatge de formació de cal·lus (A)

Subcultiu A

C+T+0 0,0 D+T+0 0,0

C+T+0,25 26,3 D+T+0,25 0,0

C+T+0,5 15,8 D+T+0,5 33,3

C+P+0 12,5 D+P+0 8,3

C+P+0,25 55,0 D+P+0,25 72,7

C+P+0,5 75,0 D+P+0,5 78,6


cal·lus respecte el nombre total de propàguls obtinguts en el cultiu

in vitro per cada tractament. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub

d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)

b) Subcultiu B

Respecte a la formació de cal·lus, s’observa un augment en tots els tractaments, especialment en els

medis sense regulador de creixement on anteriorment la formació de cal·lus era pràcticament nul·la.

En canvi, en aquest subcultiu els percentatges determinats han superat el 17 % (Taula 37).

Taula 37 - Percentatge de formació de cal·lus (B)

Subcultiu B

C+T+0 19,0 D+T+0 38,5

C+T+0,25 45,5 D+T+0,25 38,9

C+T+0,5 17,2 D+T+0,5 26,1

C+P+0 43,8 D+P+0 100,0

C+P+0,25 87,5 D+P+0,25 100,0

C+P+0,5 100,0 D+P+0,5 100,0


cal·lus respecte el nombre total de propàguls obtinguts en el cultiu

in vitro per cada tractament. C: Agar Comercial D: Agar Difco T: Tub

d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)


A la Figura 19 es mostra el cultiu in vitro del material vegetal en els diferents tipus de recipients

emprats i a la cambra de incubació.

4.2. Assaig de multiplicació medi MS

El segon assaig realitzat consta de 6 tractaments que es caracteritzen per utilitzar només agar

comercial i medi MS. Únicament s’utilitza agar comercial en aquest segon assaig perquè es va

contaminar més de la meitat del material vegetal en realitzar el cultiu in vitro per a obtenir material

vegetal uniforme per a fer aquest segon assaig. En reduir-se el material vegetal disponible es va optar

per només emprar agar Comercial en la formulació del medi de cultiu.

El tractament estadístic de les dades d’aquest assaig s’ha realitzat de la mateixa manera que per

l’assaig de multiplicació de medi β, primer es dur a terme una prova de variància de les dades i segons

si es pot assumir o no igualtat de variància es passa a realitzar una anàlisi de la variància (ANOVA) o

una prova Welch-ANOVA per tal de identificar si hi ha diferències significatives (valor p ≤ 0,05) entre

els tractaments aplicats.

A diferència de l’assaig amb medi β, els cultius realitzats en medi MS només s’ha emprat el gelificant

Comercial, per tant, en el tractament estadístic s’ha substituït el factor del tipus d’agar utilitzat pel

tipus de recipient de cultiu emprat.

Figura 19 - Material vegetal cultivat en pot i en tub d'assaig


4.2.1. Longitud

La prova de variància corresponent a la variable longitud dels microbrots obtinguts en medi de cultiu

MS, permet assumir igualtat de variància per a les dades obtingudes durant l’assaig (valor p ≥ 0,05)

(Taula A.41).

Degut a que la prova de variància permet assumir igualtat de variàncies, es realitza una ANOVA de 2

factors (concentració de TDZ i tipus de recipient) obtenint diferències significatives entre els

microbrots desenvolupats en tub d’assaig i pot de cultiu (valor p ≤ 0,05) (Taula A.42).

Com es pot observar a la Taula 38, el material vegetal multiplicat en pot de cultiu, presenta propàguls

més allargats en comparació dels desenvolupats en tub d’assaig (Figura 20).

Taula 38 - Longitud (MS)

Tractament Longitud (cm)

C+T+0 1,2 ± 0,3 b

C+T+0,25 1,3 ± 0,5 b

C+T+0,5 1,5 ± 0,4 b

C+P+0 1,6 ± 0,4 a

C+P+0,25 1,4 ± 0,2 a

C+P+0,5 1,6 ± 0,3 a

Les dades es mostren expressades amb la mitjana ± la

desviació estàndard. Les lletres que acompanyen a les

mitjanes fan referència a els nivells de significació, que

comparteixen lletra no són significativament diferents.

S’ha utilitzat el mètode Tukey per a comparar les mitjanes,

amb un nivell de significança del 5 %. C: Agar Comercial T:

Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de

thidiazuron (μM)

Figura 20 - Longitud dels microbrots per a cada tractament (MS)


4.2.2. Taxa total

En el cas de la variable taxa total dels microbrots, la seva corresponent prova de variància demostra

que les dades obtingudes presenten igualtat de variància (valor p ≥ 0,05) (Taula A.43). Es realitza una

ANOVA de dos factors (concentració de thidiazuron i tipus de recipient de cultiu) per tal d’observar si

cap dels dos factors influeix en la capacitat de generació de nous individus a partir del material vegetal

cultivat.

Com a resultat de l’ANOVA, es demostra que tan sòls hi ha diferències significatives relacionades amb

la concentració de citoquinina aplicada al medi de multiplicació (valor p ≤ 0,05) (Taula A.44).

S’observa que el material vegetal multiplicat en medis amb concentracions 0,25 μM i 0,5 μM de TDZ

conté una major capacitat de formació de nous individus (Taula 39).

Tot i que no hi presenten diferències significatives pel tipus de recipient de cultiu emprat(valor p ≥

0,05) (Taula A.44), en general, el material vegetal crescut en pot de cultiu en presencia de concentració

hormonal tendeix a formar més microbrots nous (Figura 21).

Taula 39 - Taxa total (MS)

Tractament Taxa total

C+T+0 2,2 ± 0,9 b

C+T+0,25 2,8 ± 1,4 a

C+T+0,5 2,7 ± 1,1 a

C+P+0 2,3 ± 0,8 b

C+P+0,25 3,1 ± 1,5 a

C+P+0,5 3,4 ± 1,6 a








thidiazuron (μM)


4.2.3. Taxa viable

En relació a la taxa viable, la prova de variància indica que es pot assumir igualtat de variància, (valor

p ≥ 0,05) (Taula A.45), alhora de continuar analitzant estadísticament els resultats obtinguts.

Segons l’ANOVA de 2 factors realitzada, s’observa un comportament similar als resultats de la variable

anterior. Només s’observen diferències significatives per la concentració de TDZ aplicada al medi de

cultiu (valor p ≤ 0,05) (Taula A.46), independentment del tipus de recipient utilitzat.

El material vegetal multiplicat en medis de cultiu formats per concentracions de 0,25 μM i 0,5 μM de

TDZ afavoreixen la formació de nous microbrots viables (Taula 40) (Figura22).

Figura 21 - Taxa total dels microbrots per a cada tractament (MS)


Taula 40 - Taxa viable (MS)

Tractament Taxa viable

C+T+0 1,0 ± 1,0 b

C+T+0,25 1,7 ± 0,9 a

C+T+0,5 1,3 ± 1,2 a

C+P+0 0,6 ± 0,8 b

C+P+0,25 2,1 ± 2,0 a

C+P+0,5 1,7 ± 1,4 a








thidiazuron (μM)

4.2.4. Pes fresc

La prova de variància corresponent a la biomassa fresca del material vegetal cultivat, permet assumir

igualtat de variància en les posteriors proves estadístiques (valor p ≥ 0,05) (Taula A.47).

Figura 22 - Taxa viable dels microbrots per a cada tractament (MS)


L’ANOVA de 2 factors (concentració de TDZ i tipus de recipient de cultiu emprat) indica que hi ha

diferències significatives entre tractaments segons la concentració de regulador de creixement

aplicada en el medi de cultiu i el tipus de recipient de cultiu utilitzat (valor p ≤ 0,05) (Taula A.48). No

obstant, la interacció dels dos factors no afecta a la biomassa fresca que contenen els microbrots

obtinguts (valor p ≥ 0,05) (Taula A.48).

En el cas de la concentració hormonal aplicada, el material vegetal multiplicat en medis de cultiu amb

una dosi hormonal de 0,5 μM de TDZ presenten major biomassa fresca que els microbrots cultivats

amb dosi baixa de TDZ o sense (Taula 41).

Segons el tipus de recipient de cultiu utilitzat, aquells microbrots desenvolupats en pots de cultiu

tendeixen a contenir major biomassa fresca que els cultivats en tub d’assaig (Figura 23).

A la Taula 41, es mostra la separació de mitjanes per els dos factors, les lletres negres representen la

comparació de mitjanes entre el tipus de recipient de cultiu utilitzat. En canvi, les lletres de color blau

indiquen la separació de mitjanes en relació a la concentració de citoquinina aplicada en el medi de

cultiu.

Taula 41 - Pes fresc (MS)

Tractament Pes fresc (g)

C+T+0 0,3644 ± 0,1567 b b

C+T+0,25 0,3787 ± 0,2161 b ab

C+T+0,5 0,4380 ± 0,1964 b a

C+P+0 0,4295 ± 0,1266 a b

C+P+0,25 0,5762 ± 0,1988 a ab

C+P+0,5 0,6027 ± 0,1872 a a






amb un nivell de significança del 5 %. C: Agar Comercial

T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de

thidiazuron (μM)


4.2.5. Pes sec Al igual que la variable anterior, la prova de variància per a la biomassa seca del material vegetal,

permet assumir igualtat de variància (valor p ≥ 0,05) (Taula A.49). Al realitzar l’ANOVA de 2 factors

(concentració de TDZ i tipus de recipient) per aquesta variable, s’observa un comportament similar a

l’obtingut per la biomassa fresca, cal remarcar que només hi ha diferències significatives pel tipus de

recipient de cultiu utilitzat (valor p ≤ 0,05) (Taula A.50). El material vegetal multiplicat en pots de

cultiu presenta de nou un major pes sec respecte els microbrots desenvolupats en tub d’assaig (Taula

42) (Figura24).

Taula 42 - Pes sec (MS)

Tractament Pes sec (g)

C+T+0 0,0310 ± 0,0110 b

C+T+0,25 0,0341 ± 0,0163 b

C+T+0,5 0,0353 ± 0,0123 b

C+P+0 0,0374 ± 0,0128 a

C+P+0,25 0,0430 ± 0,0133 a

C+P+0,5 0,0447 ± 0,0138 a








thidiazuron (μM)

Figura 23 - Pes fresc dels microbrots per a cada tractament (MS)

b

ab


4.2.6. Contingut hídric

Els percentatge d’aigua obtinguts son molt similars en els dos tipus de recipient de cultiu utilitzat. En

el cas dels microbrots desenvolupats en tubs d’assaig, el contingut d’aigua oscil·la entre 90,5 % i el

91,6 %, mentre que en pots de cultiu, s’obté un rang de contingut hídric entre 91,2 % i el 92,5 % (Taula

43) (Figura 25).

Taula 43 - Contingut hídric (MS)

Tractament Contingut aigua (%)

C+T+0 91,6 ± 1,0

C+T+0,25 90,5 ± 2,4

C+T+0,5 91,6 ± 0,9

C+P+0 91,2 ± 2,2

C+P+0,25 92,5 ± 0,6

C+P+0,5 92,5 ± 0,4


desviació estàndard. Per aquesta variable s’ha considerat

que no era necessari comparar les mitjanes. C: Agar

Comercial T: Tub d’assaig P: Pot de cultiu 0; 0,25; 0,5:

dosi de thidiazuron (μM)

Figura 24 - Pes sec dels microbrots per a cada tractament (MS)


4.2.7. Presència de flors

A diferència de l’assaig amb medi β, el material vegetal multiplicat en medi MS no presenta floració

per a cap dels tractaments aplicats.

4.2.8. Presència d’olor

Al igual que l’assaig en medi β i per els subcultius A i B, s’ha quantificat el nombre de propàguls que

feien olor desenvolupats en tubs d’assaig i pots de cultiu respecte el nombre total de propàguls

obtinguts per cada tractament.

En aquest assaig, es va quantificar un major percentatge de propàguls que feien olor respecte

l’obtingut al subcultiu A multiplicat en medi β, però inferior al nombre de propàguls que feien olor en

el subcultiu B.

Els percentatges de nombre de propàguls que feien olor cultivats en tubs d’assaig oscil·len entre el 5,0

% i el 47,1 %, mentre que en pot de cultiu els percentatges de propàguls que feien olor van ser de

l’ordre de 0,0 % fins 21,4 % (Taula 45).

Figura 25 - Contingut hídric dels microbrots per a cada tractament (MS)


Taula 44 - Percentatge de presència d’olor

MS

C+T+0 47,1

C+T+0,25 35,0

C+T+0,5 5,0

C+P+0 0,0

C+P+0,25 14,3

C+P+0,5 21,4

Els valors obtinguts representen el percentatge de

propàguls que fan olor respecte el nombre total de

propàguls obtinguts a cada tractament. C: Agar Comercial


thidiazuron (μM)

4.2.9. Hiperhidricitat

El material vegetal multiplicat en medi MS també presenta teixit vitrificat en tots els tractaments

aplicats. S’observa una tendència a que el material vegetal cultivat en pot presenti més microbrots

vitrificats que en tub d’assaig. En el cas dels tractaments sense hormona, es detecta el major

percentatge de teixit vitrificat en el material vegetal cultivat en pot (76,9 %) (Taula 46).

Taula 45 - Percentatge d'hiperhidricitat

MS

C+T+0 52,9

C+T+0,25 35,0

C+T+0,5 55,0

C+P+0 76,9

C+P+0,25 42,9

C+P+0,5 35,7


propàguls amb teixit vitrificat respecte el nombre total de

propàguls obtinguts a cada tractament. C: Agar Comercial


thidiazuron (μM)


4.2.10. Formació de cal·lus

La formació de cal·lus va ser major en el material vegetal multiplicat en medis de cultiu formulats amb

dosis de 0,25 μM i 0,5 μM de TDZ, sobretot en els microbrots desenvolupats en tub d’assaig.

En el cas dels propàguls obtinguts en pots de cultiu, només es va formar cal·lus (64,3 %) quan la

concentració hormonal era elevada ( 0,5 μM TDZ) (Taula 47).

Taula 46 - Percentatge de formació de cal·lus

MS

C+T+0 17,6

C+T+0,25 30,0

C+T+0,5 20,0

C+P+0 0,0

C+P+0,25 0,0

C+P+0,5 64,3


propàguls amb cal·lus respecte el nombre total de

propàguls obtinguts en el cultiu in vitro per cada

tractament. C: Agar Comercial T: Tub d’assaig P: Pot de

cultiu 0; 0,25; 0,5: dosi de thidiazuron (μM)


5. Discussió dels resultats

Els assajos de multiplicació avaluats en aquest TFG es van realitzar a partir de material vegetal que

portava un cert temps cultivat en condicions de in vitro. Se sap que per a algunes espècies l’efecte

subcultiu, és a dir, a quants repicats ha estat sotmès el cultiu té incidència en el desenvolupament dels

nous microbrots (Rodrigues et al., 1998; Ibáñez et al., 2003; Ghareeb & Taha, 2018; Mangas, 2021).

Els assajos realitzats en aquest TFG són la continuació dels iniciats per Mangas (2021). Els seus assajos

corresponien a la iniciació del cultiu i als repicats segon i tercer, mentre que els duts a terme en els

nostres assajos corresponen al quart i cinquè subcultiu.

Cannabis sativa és una espècie vegetal amb una forta dominància apical (Smýkalová et al., 2019), que

fa que les taxes de multiplicació no siguin molt elevades. Les longituds obtingudes en el nostre assaig

en tub de cultiu (quart i cinquè subcultiu) són més similars a les obtingudes per Mangas (2021) en el

tercer subcultiu que en el segon subcultiu. Segurament, aquesta similitud ens indicaria que a partir

del tercer subcultiu les longituds dels microbrots tendeixen a estabilitzar-se i que podrien permetre

afavorir lleugerament les taxes de multiplicació.

La presència de citoquinines, en general promou la formació de brots i inhibeix l’elongació de la tija

(Huetteman & Preece, 1993). En diversos articles sobre la micropropagació de Cannabis sativa,

s’indica aquest comportament (Lata et al., 2009 a, 2009 b, 2016) i Mangas (2021) coincideixen al

afirmar que una de les millors hormones per micropropagar aquesta espècie és el TDZ i que no és

convenient utilitzar concentracions que superin el 0,5 μM de TDZ. No obstant, Wang et al. (2009)

indiquen bones taxes de micropropagació a una dosi de 0,9 μM de TDZ. Segurament, la concentració

d’hormona a utilitzar depèn entre d’altres factors del genotip utilitzat (Monthony et al., 2020; Galán-

Ávila et al., 2021). En el nostre estudi les taxes viables obtingudes, que refereixen al número de nous

propàguls amb els que es pot iniciar el següent subcultiu, no han estat relativament elevades. Els

nostres resultats no difereixen gaire dels obtinguts per Mangas (2021) en el tercer subcultiu, on va

obtenir valors propers a 2 per a les mateixes concentracions hormonals que les emprades en el nostre

estudi (0, 0,25 i 0,5 μM de TDZ). En el nostre assaig la taxa viable va ascendir fins a 3 en el tractament

que contenia 0,5 μM de TDZ. En el cas de la taxa total, taxa que representa la potencialitat del

propàgul, però que sovint degut a la mesura dels nous microbrots aquests no es poden individualitzar

fàcilment per obtenir nous propàguls, va ser superior a les obtingudes per Mangas (2021) en el tercer

subcultiu, ja que cap dels tractaments assajats en el seu cas va superar una taxa total de 3,5 enfront a

unes taxes de 4 i 4,5 obtingudes en el quart i cinquè subcultiu en medis de cultiu formulats amb 0,5

μM de TDZ.


En el quart subcultiu en el medi β les taxes més altes obtingudes van ser en torn a 3. En el cinquè

subcultiu, en el cas de cultivar en pot, van incrementar fins a 4,5. En canvi, per els tractaments

formulats en MS (quart subcultiu) les taxes van ser més baixes. Altres autors que han utilitzat altres

varietats en medis que contenien sals MS, com és el cas de l’equip de Lata et al. (2009) van obtenir

taxes molt superiors a les nostres, mentre que les obtingudes pel grup de Mestinšek-Mubi et al.

(2020), es situaren en valors en torn a 1,7, més similars als obtinguts en el nostre assaig formulat amb

aquest tipus de sals minerals.

En general, s’ha observat un major pes sec dels microbrots obtinguts en pot que en tub. Aquest fet cal

vincular-lo a unes majors taxes viables obtingudes en aquest tipus de recipient. En el nostre cas, un

major pes no pot ser atribuït a una major longitud de microbrots, ja que pel que respecta a aquest

paràmetre no es van donar diferències significatives entre tractaments. El fet de cultivar en tub,

segurament implica que el material vegetal no pugui desenvolupar-se en el seu màxim potencial, a

més a més, el contacte dels brots amb les parets del tub pot provocar variacions morfològiques

(Kodym & Leeb, 2019; Murphy & Adelberg, 2021).

A diferència de Mangas (2021) vam detectar presència d’olor en tots els tractaments assajats, mentre

que l’esmentada autora pel segon subcultiu no va detectar aquest aroma en medis formulats amb TDZ

ni amb medis formulats a partir de sals de Murashigue i Skoog, però si que va detectar certa presència

d’olor en el tercer subcultiu. La comparació dels dos assajos sembla indicar que a mesura que

augmenten els successius repicats es detecta més presència d’olor. La manifestació d’olor en el cas de

C.sativa es deguda a la síntesi de diferents terpens en els tricomes. Sembla ser que les citoquinines

poden estimular la formació de tricomes i que Cannabis sativa és una espècie que de per sí,

superficialment ja desenvolupa una gran quantitat de pèls o tricomes. Wang et al. (2019) per

Arabidopsis van descriure que un dels factors que afectava al desenvolupament de tricomes eren les

citoquinines.

En relació a la floració, aquesta ha augmentat entre els dos subcultius realitzats en el primer assaig

d’aquest TFG, ja que s’ha detectat major presència floral en el quart subcultiu que en el cinquè.

Observació similar ha estat feta per Mangas (2021) entre el segon i tercer subcultiu, quan els medis

de cultiu contenien BAP o KIN, però no en presència de TDZ. Tant els nostres resultats com el obtinguts

per Mangas (2021), respecte a la incidència de floració en relació al contingut mineral dels medis de

cultiu, semblen indicar que els medis MS presenten nul·la o baixa incidència de floració. El fet en que

en el nostre estudi, el TDZ hagi comportat formació de flors, segurament ho podem relacionar amb

un major nombre de subcultius sofert pel material vegetal. Està referenciat que la presència de certes

citoquinines, com per exemple el TDZ, afavoreixen en condicions in vitro la floració (Montero-Carmona


& Jiménez, 2009). Quan es micropropaga plantes, el fet de que apareixen flors ha de considerar-se un

aspecte negatiu, ja que segons Cuba-Díaz et al. (2014), per l’espècie Colobanthus quitensis, aquest fet

comportà una disminució de la formació de nous microbrots.

Quan s’utilitzen tècniques de micropropagació per a multiplicar material vegetal, és aconsellable

avaluar diferents subcultius, ja que sovint s’observen diferències entre ells. En el cas de Cannabis

sativa, Page et al. (2020) indiquen que al llarg dels subcultius es produeix una disminució de la taxa

viable de multiplicació, augmenta la hiperhidricitat i la formació de cal·lus.

Una de les problemàtiques més observades quan es multiplica material vegetal in vitro és l’aparició

de problemes de hiperhidricitat. Aquesta problemàtica cal relacionar-la amb una alteració dels teixits

vegetals que fa que aquests esdevinguin translúcids, suculents i/o vitris (Earle & Langhans, 1975;

Debergh, 1983; Ziv et al., 1983). Aquesta anomalia afecta no sols a la morfologia de la planta sinó

també a la seva fisiologia i fa que esdevingui un material no viable. Aquest material ha de ser descartat

i no es apte per seguir obtenint nous microbrots a partir d’ell (Debergh et al., 1981).

Sovint la hiperhidricitat es relaciona en un alt contingut d’humitat relativa en el recipient de cultiu (Ziv

et al., 1987; Ivanova & van Staden, 2010). En el nostre estudi es va manifestar una major hiperhidricitat

quan l’agent gelificant era agar Difco. En la manipulació del medi de cultiu, després de la seva

gelificació, vàrem observar que els solidificats amb agar Difco presentaven una menor consistència.

Aquest fet segurament va contribuir a que es produís una major evaporació de l’aigua continguda en

els medis, augmentant així la humitat relativa dins dels recipients de cultiu. La utilització de pots de

vidre amb tapa i protegits amb film plàstic, per evitar la seva obertura, ocasiona sovint major

condensació d’aigua en relació a la baixa condensació que sovint s’observa quan es cultiva en tubs

d’assaig, ja que aquests es tapen amb uns taps especials que faciliten l’intercanvi gasos entre el tub i

la cambra de cultiu, però alhora evitant possibles entrades d’organismes infecciosos. En el quart

subcultiu es va observar major vitrificació en cultiu en pot que en cultiu en tub d’assaig. Aquest

comportament no es va observar en el cinquè subcultiu. Tot hi aquests fenòmens de vitrificació, en

general, els resultats obtinguts en la taxa de multiplicació indiquen que es més interesant, sobretot a

partir del cinquè subcultiu, emprar pots de cultiu.

En relació a la formació de cal·lus, en el nostre assaig hem detectat major presència en el cinquè

subcultiu que en el quart. Aquest fet també va ser observat per Mangas (2021), que va observar la

formació de cal·lus en el tercer subcultiu.

Un factor que podria intervenir en els canvis observats entre el quart i cinquè subcultiu, podria

relacionar-se amb el contingut hormonal endogen del material vegetal. Normalment, aquest


contingut hormonal no és analitzat pels grups de recerca que treballen en micropropagació, ja que les

concentracions són molt inferiors a les que s’addicionen en els medis de cultiu de forma exògena. El

grup de Smýkalová et al. (2019) van realitzar un estudi analitzant continguts hormonals endògens. al

llarg de diferents subcultius, i van veure que es les concentracions variaven i que no s’establia cap

pauta generalitzada en el conjunt de les varietats assajades de C. sativa.

6. Conclusions

Les principals conclusions obtingudes al finalitzar el treball son les següents:

- No s’ha pogut establir un medi de multiplicació que permetés obtenir taxes viables de

multiplicació elevades.

- La utilització de pots com a recipient de cultiu permet, generalment, que el material vegetal

desenvolupi una millor taxa de multiplicació i un major pes sec.

- Els percentatges d’olor, de floració i formació de cal·lus augmenten a mesura que es realitzen

els successius repicats i formulats amb medi β en presència de TDZ.

- La floració dels microbrots en medi MS és baixa o pràcticament nul·la.

- L’aparició d’hiperhidricitat augmenta amb els subcultius successius provocant una

intensificació de microbrots no viables i propàguls amb teixit vegetal vitrificat.


Bibliografia

Ángeles, G. E., Brindis, F., Niizawa, S. C.; & Ventura, R. (2014). Cannabis sativa L., una planta singular.

Revista mexicana de ciencias farmacéuticas, 1-6.

http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S1870-01952014000400004&script=sci_arttext

Azcón-Bieto, J.; & Talón, M. (2000). Fundamentos de fisiología vegetal. McGrawHill Interamericana,

Madrid, 651 pp.

https://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/FundamentosdeFisiologiaVegetal2008Az

con..pdf

Caplan, D., Stemeroff, J., Dixon, M., & Zheng, Y. (2018). Vegetative propagation of Cannabis by stem

cuttings: effects of leaf number, cutting position, rooting hormone and leaf tip removal.

Canadian Journal of Plant Science, 98(5). DOI: 10.1139/cjps-2018-0038

Chandra, S., Lata, H., & ElSohly, M. A. (2017). Cannabis sativa L. Botany and Biotechnology. Springer

Verlag, Cham, Suïssa, 474 pp. DOI:10.1007/978-3-319-54564-6

Comissió Europea (2020). Common catalogue of varieties of agricultural plant species.

https://ec.europa.eu/food/system/files/2021-02/plant-variety-catalogues_agricultural-

plant-species.pdf

Cuba-Díaz, M., Acuña, D., Cordero, C. M., & Klagges, M. (2014). Optimización de parámetros para la

propagación in vitro de Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl. Gayana Botánica, 71(1), 58-67.

DOI:https://dx.doi.org/10.4067/S0717-66432014000100009

Debergh, P. C. (1983). Effects of agar brand and concentration on the tissue culture medium.

Physiologia Plantarum, 59(2), 270-276. DOI: 10.1111/j.1399-3054.1983.tb00770.x

Debergh, P., Harbaoui, Y., & Lemeur, R. (1981). Mass propagation of globe artichoke (Cynara

scolymus): Evaluation of different hypotheses to overcome vitrification with special

reference to water potential. Physiology Plantarum, 53(2), 181-187.

Debergh, P. C. and L. J. Maene. 1981. A scheme for commercial propagation of ornamental plants by

tissue culture. Science Horticulturae, 14, 335–345.

Departament d'Acció Climàtica, Agricultura i Desenvolupament Rural (2021). Cultiu del Cànem.

http://agricultura.gencat.cat/ca/ambits/agricultura/cultiu-canem/

Earle, E. D., & Langhans, R. W. (1975). Carnation propagation from shoot tips cultured in liquid

medium. HortScience, 10, 608-610.

Elsohly, M. A., Mehmedic, Z., Foster, S., Gon, C., Chandra, S., & Church, J. C. (2016). Changes in

Cannabis Potency Over the Last 2 Decades (1995-2014): Analysis of Current Data in the

United States. Biological Psychiatry, 79(7), 613-619. DOI:10.1016/j.biopsych.2016.01.004

ElSohly, M. A., Radwan, M. M., Gul, W., Chandra, S., & Galal, A. (2017). Phytochemistry of Cannabis

sativa L. Progress in the Chemistry organic products, 103, 1-36. DOI:10.1007/978-3-319-

45541-9_1

Fernández, Y. (2021). Efecto de la composición del medio de cultivo en la micropropagación de tres

variedades de Cannabis sativa L. (Trabajo de fin de grado). Universitat Politècnica de

Catalunya. https://upcommons.upc.edu/handle/2117/348971


Ferrer, C. (2005). La biblia del Cannabis. Ed: Carena editors, València, 156 pp.

Flores-Sanchez, I., & Verpoorte, R. (2008). Secondary metabolism in Cannabis. Phytochemistry

Reviews, 7, 615-639. DOI:10.1007/s11101-008-9094-4

Galán-Ávila, A., Gramazio, P., Ron, M., & Herraiz, F. J. (2021). A novel and rapid method for

Agrobacterium-mediated production of stably transformed Cannabis sativa L. plants.

Industrial Crops and Products, 170. DOI: 10.1016/j.indcrop.2021.113691

Gao, H., Li, J., Ji, H., An, L., & Xia, X. (2018). Hyperhydricity-induced ultrastructural and physiological

changes in blueberry (Vaccinium spp.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 133, 65-76.

DOI:10.1007/s11240-017-1361-x

George, E. F., Hall, M. A., & Klerk, G. D. (2008). Plant Growth Regulators II: Cytokinins, their

analogues and antagonists. Plant Propagation by Tissue Culture. Ed: Springer, Dordrecht,

Basingstoke, Regne Unit, 502 pp. DOI: 10.1007/978-1-4020-5005-3_6

Ghareeb, Z. F., & Taha, L. S. (2018). Micropropagation protocol for Antigonon leptopus an important.

Journal og Genetic Engineering and Biotechnology, 16(2), 669-675.

DOI:10.1016/j.jgeb.2018.03.008

Huetteman, C. A., & Preece, J. E. (1993). Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue

culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 33, 105-119. DOI: 10.1007/BF01983223

Ibáñez, A., Valero, M., & Morte, A. (2003). Influence of cytokinins and subculturing on proliferation.

Anales de Biología, 25, 81-90. https://www.um.es/analesdebiologia/numeros/25/PDF/09-

INFLUENCE.pdf

Ivanova, M., & van Staden, J. (2010). Natural ventilation effectively reduces hyperhydricity in shoot

cultures of Aloe polyphylla Schönland ex Pillans. Plant Growth Regulation, 60(2), 143-150.

DOI: 10.1007/s10725-009-9430-8

Kodym, A., & Leeb, C. J. (2019). Back to the roots: protocol for the photoautotrophic

micropropagation of medicinal Cannabis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 138, 399-402.

DOI: 10.1007/s11240-019-01635-1

Lata, H., Chandra, S., Khan, I. A., & ElSohly, M. A. (2009). Propagation through alginate encapsulation

of axillary buds of Cannabis sativa L. — an important medicinal plant. Physiology and

Molecular Biology of Plants, 15, 79-86. DOI: 10.1007/s12298-009-0008-8

Lata, H., Chandra, S., Khan, I., & ELSohly, M. A. (2009). Thidiazuron-induced high-frequency direct

shoot organogenesis of Cannabis sativa L. In vitro cellular & developmental biology-Plant, 45,

12-19. DOI: 10.1007/s11627-008-9167-5

Lata, H., Chandra, S., Khan, I., & ElSohly, M. A. (2010). High frequency plant regeneration from leaf

derived callus of high Δ9-tetrahydrocannabinol yielding Cannabis sativa L. Planta Medica,

76(14), 1629-1633. DOI:10.1055/s-0030-1249773

Lata, H., Chandra, S., Techen, N., Khan, I., & ElSohly, M. A. (2016). In vitro mass propagation of

Cannabis sativa L.: A protocol refinement using novel aromatic cytokinin meta-topolin and

the assessment of eco-physiological, biochemical and genetic fidelity of micropropagated

plants. Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants, 3, 18-26. DOI:

10.1016/j.jarmap.2015.12.001


Liu, M., Jiang, F., Kong, X., Tian, J., Wu, Z., & Wu, Z. (2017). Effects of multiple factors on

hyperhydricity of Allium sativum L. Scientia Horticulturae, 217, 285-296.

DOI:10.1016/j.scienta.2017.02.010

Lu, C. (1993). The use of thidiazuron in tissue culture. In vitro cellular & developmental biology-plant,

29, 92-96. DOI: 10.1007/BF02632259

Mangas, S. (2021). Estudio del efecto de diferentes citoquininas para la propagación in vitro de

Cannabis sativa L. variedad carmagnola ( Trabajo de Fin de Grado). Universitat Politècnica de

Catalunya. https://upcommons.upc.edu/handle/2117/349218

Marzocchi, S., & Caboni, M. F. (2020). Effect of harvesting time on hemp (Cannabis sativa L.) seed oil

lipid composition. Italian Journal of Food Science, 32(4), 1018-1029. DOI: 10.14674/IJFS.1898

Mestinšek-Mubi , S., Svetik , S., Flajšman, M., & Murovec , J. (2020). In vitro tissue culture and

genetic analysis of two high-CBD medical cannabis (Cannabis sativa L.) breeding lines.

Genetika, 52, 925-941. DOI: 10.2298/GENSR2003925M

Montero-Carmona, W., & Jiménez, V. M. (2009). Floración in vitro - revisión de literatura ,

Biotecnología Vegetal, 9(1), 3-18.

https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/302/html

Monthony, A., Kyne, S., Grainger, C., & Jones, A. (2020). Recalcitrance of Cannabis sativa to de novo

regeneration; a multi-genotype replication study. PLoS ONE 16(8): e0235525. DOI:

10.1371/journal.pone.0235525

Murashige, T. (1974). Plant propagation through tissue cultures. Anual review plant Physiology,

25,135-166. DOI: 10.1146/annurev.pp.25.060174.001031

Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with Tobacco

tissue cultures. Physiologia Plantarum, 3(15), 473-497. DOI: 10.1111/j.1399-

3054.1962.tb08052.x

Murphy, R., & Adelberg, J. (2021). Physical factors increased quantity and quality of

micropropagated shoots of Cannabis sativa L. in a repeated harvest system with ex vitro

rooting. In vitro cellular & developmental biology-plant. DOI: 10.1007/s11627-021-10166-4

Page, S., Monthony, A., & Jones, A. (2020). DKW basal salts improve micropropagation and

callogenesis compared to MS basal salts in multiple commercial cultivars of Cannabis sativa.

Biorxiv. DOI: 10.1101/2020.02.07.939181

Richez-Dumanois, C., Braut-Boucher, F., Cosson, L., & Paris, M. (1986). Multiplication végétative in

vitro du chanvre (Cannabis sativa L.) Agronomie, EDP Sciences, 6(5), 487- 495.

https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00884901/document

Rodrigues, P., Tulmann Neto, A., Cassieri Neto, P., & Mendes, B. (1998). Influence of the number of

subcultures on somaclonal variation in micropropagated Nanicão (Mussa spp., AAA GROUP).

Acta Horticulture, 490, 469-474. DOI:10.17660/ActaHortic.1998.490.49

Russo, E. B. (2007). History of Cannabis and its preparations in saga, science, and sobriquet.

Chemistry & biodiversity, 4(8), 1614-1648. DOI: 10.1002/cbdv.200790144

Smýkalová, I., Vrbová, M., Cvečková, M., Plačková, L., Žukauskaitė, A., Zatloukal, M., Hrdlička J.,

Plíhalová L., Doležal K., Griga, M. (2019). The effects of novel synthetic cytokinin derivatives

https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/302/html

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235525

https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00884901/document


and endogenous cytokinins on the in vitro growth responses of hemp (Cannabis sativa L.)

explants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 139, 381-394. DOI: 10.1007/s11240-019-

01693-5

Tarkowská, D., Doležal, K., Tarkowski, P., Åstot, C., Holub, J., Fuksová, Schmülling T., Sandberg G.,

Strnad M. (2003). Identification of new aromatic cytokinins in Arabidopsis thaliana and

Populus × canadensis leaves by LC-(+)ESI-MS and capillary liquid chromatography/frit–

fast atom bombardment mass spectrometry. Physiologia Plantarum, 117(4), 579-590.

DOI:10.1034/j.1399-3054.2003.00071.x

van den Dries, N., Gianni, S., Czerednik, A., Krend, F. A., & de Klerk, G. M. (2013). Flooding of the

apoplast is a key factor in the development. Journal of Exprimental Botany, 64(16), 5221-

5230. DOI:10.1093/jxb/ert315

Waldo, A. (2006). History of Cannabis as a medicine: a review. Brazilian Journal of Psychiatry, 28(2),

153-157. DOI: 10.1590/S1516-44462006000200015

Wang, R., He, L., Xia, B., & Tong, J. (2009). A micropropagation system for cloning of hemp (Cannabis

sativa L.) by shoot tip culture. Pakistan Journal of Botany, 41(2), 603-608.

Wang, Z., Yang, Z., & Li, F. (2019). Updates on molecular mechanisms in the development of

branched trichome in Arabidopsis and nonbranched in cotton. Plant Biotechnology Journal,

17, 1706-1722. DOI: 10.1111/pbi.13167

Wróbel, T., Dreger, M., Wielgus, K., & Slomski, R. (2020). Modified nodal cuttings and shoot tips

protocol for rapid regeneration of Cannabis sativa L. Journal of Natural Fibers. DOI:

10.1080/15440478.2020.1748160

Ziv, M., Meir, G., & Halevy, A. H. (1983). Factors influencing the production of hardened glaucous

carnation plantlets in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2, 55-60.

Ziv, M., Schwartz, A., & Fleminger, D. (1987). Malfunctioning stomata in vitreous leaves of carnation

(Dianthus caryophyllus) plants propagated in vitro; Implications for hardening. Plant Science,

52, 127-134. DOI: 10.1016/0168-9452(87)90114-2


Índex taules annex

Taula A. 1- Prova de variància Longitud (Subcultiu A, Tub d'assaig) .................................................... 76

Taula A. 2 - ANOVA de 2 factors Longitud (Subcultiu A, Tub d'assaig) ................................................. 76

Taula A. 3 - Prova de variància Longitud (Subcultiu A, Pot) .................................................................. 76

Taula A. 4 - ANOVA de 2 factors Longitud (Subcultiu A, Pot) ............................................................... 76

Taula A. 5 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu A, Tub d'assaig) .................................................. 76

Taula A. 6 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu A, Tub d'assaig) .............................................. 76

Taula A. 7 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu A, Pot) ................................................................ 77

Taula A. 8 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu A, Pot) ............................................................ 77

Taula A. 9 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu A, Tub d'assaig) ................................................ 77

Taula A. 10 - ANOVA de 2 factors Taxa viable (Subcultiu A, Tub d'assaig) ........................................... 77

Taula A. 11 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu A, Pot) ............................................................ 77

Taula A. 12 - ANOVA de 2 factors Taxa viable (Subcultiu A, Pot).......................................................... 77

Taula A. 13 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu A, Tub d'assaig) ................................................. 78

Taula A. 14 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu A, Tub d'assaig) ............................................. 78

Taula A. 15 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu A, Pot) ................................................................ 78

Taula A. 16 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu A, Pot) ............................................................ 78

Taula A. 17 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu A, Tub d'assaig) .................................................... 78

Taula A. 18 - ANOVA de 2 factors Pes sec (Subcultiu A, Tub d'assaig) .................................................. 78

Taula A. 19 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu A, Pot) .................................................................. 78

Taula A. 20 - Prova Welch-ANOVA Pes sec (Subcultiu A, Pot) .............................................................. 79

Taula A. 21 - Prova de variància Longitud (Subcultiu B, Tub d'assaig) .................................................. 79

Taula A. 22 - Prova Welch-ANOVA Longitud (Subcultiu B, Tub d'assaig) .............................................. 79

Taula A. 23 - Prova de variància Longitud (Subcultiu B, Pot) ................................................................ 79

Taula A. 24 - ANOVA de 2 factors Longitud (Subcultiu B, Pot) ............................................................. 79

Taula A. 25 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu B, Tub d'assaig) ................................................ 79

Taula A. 26 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu B, Tub d'assaig) ............................................ 79

Taula A. 27 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu B, Pot) .............................................................. 80

Taula A. 28 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu B, Pot) .......................................................... 80

Taula A. 29 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu B, Tub d'assaig) .............................................. 80

Taula A. 30 - Prova Welch-ANOVA Taxa viable (Subcultiu B, Tub d'assaig) .......................................... 80

Taula A. 31 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu B, Pot) ............................................................ 80

Taula A. 32 - Prova Welch-ANOVA Taxa viable (Subcultiu B, Pot) ........................................................ 80

Taula A. 33 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu B, Tub d'assaig).................................................. 80

Taula A. 34 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu B, Tub d'assaig) ............................................. 81

Taula A. 35 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu B, Pot) ................................................................ 81

Taula A. 36 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu B, Pot) ............................................................ 81

Taula A. 37 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu B, Tub d'assaig) .................................................... 81

Taula A. 38 - Prova Welch-ANOVA Pes sec (Subcultiu B, Tub d'assaig) ................................................ 81

Taula A. 39 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu B, Pot) .................................................................. 81

Taula A. 40 - Prova Welch-ANOVA Pes sec (Subcultiu B, Pot) .............................................................. 81

Taula A. 41 - Prova de variància Longitud (MS) .................................................................................... 82

Taula A. 42 - ANOVA de 2 factors Longitud (MS) .................................................................................. 82

Taula A. 43 - Prova de variància Taxa total (MS) .................................................................................. 82

Taula A. 44 - ANOVA de 2 factors Taxa total (MS) ................................................................................ 82

Taula A. 45 - Prova de variància Taxa viable (MS) ................................................................................ 82

Taula A. 46 - ANOVA de 2 factors Taxa viable (MS) .............................................................................. 82


Taula A. 47 - Prova de variància Pes fresc (MS) .................................................................................... 83

Taula A. 48 - ANOVA de 2 factors Pes fresc (MS) .................................................................................. 83

Taula A. 49 - Prova variància Pes sec (MS) ............................................................................................ 83

Taula A. 50 - ANOVA de 2 factors Pes sec (MS) .................................................................................... 83


Annex estadístic

Assaig de multiplicació medi β

Subcultiu A

Taula A. 1- Prova de variància Longitud (Subcultiu A, Tub d'assaig)

Taula A. 2 - ANOVA de 2 factors Longitud (Subcultiu A, Tub d'assaig)

Taula A. 3 - Prova de variància Longitud (Subcultiu A, Pot)

Taula A. 4 - ANOVA de 2 factors Longitud (Subcultiu A, Pot)

Taula A. 5 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu A, Tub d'assaig)

Taula A. 6 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu A, Tub d'assaig)


Taula A. 7 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu A, Pot)

Taula A. 8 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu A, Pot)

Taula A. 9 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu A, Tub d'assaig)

Taula A. 10 - ANOVA de 2 factors Taxa viable (Subcultiu A, Tub d'assaig)

Taula A. 11 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu A, Pot)

Taula A. 12 - ANOVA de 2 factors Taxa viable (Subcultiu A, Pot)


Taula A. 13 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu A, Tub d'assaig)

Taula A. 14 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu A, Tub d'assaig)

Taula A. 15 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu A, Pot)

Taula A. 16 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu A, Pot)

Taula A. 17 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu A, Tub d'assaig)

Taula A. 18 - ANOVA de 2 factors Pes sec (Subcultiu A, Tub d'assaig)

Taula A. 19 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu A, Pot)


Taula A. 20 - Prova Welch-ANOVA Pes sec (Subcultiu A, Pot)

Subcultiu B

Taula A. 21 - Prova de variància Longitud (Subcultiu B, Tub d'assaig)

Taula A. 22 - Prova Welch-ANOVA Longitud (Subcultiu B, Tub d'assaig)

Taula A. 23 - Prova de variància Longitud (Subcultiu B, Pot)

Taula A. 24 - ANOVA de 2 factors Longitud (Subcultiu B, Pot)

Taula A. 25 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu B, Tub d'assaig)

Taula A. 26 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu B, Tub d'assaig)


Taula A. 27 - Prova de variància Taxa total (Subcultiu B, Pot)

Taula A. 28 - Prova Welch-ANOVA Taxa total (Subcultiu B, Pot)

Taula A. 29 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu B, Tub d'assaig)

Taula A. 30 - Prova Welch-ANOVA Taxa viable (Subcultiu B, Tub d'assaig)

Taula A. 31 - Prova de variància Taxa viable (Subcultiu B, Pot)

Taula A. 32 - Prova Welch-ANOVA Taxa viable (Subcultiu B, Pot)

Taula A. 33 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu B, Tub d'assaig)


Taula A. 34 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu B, Tub d'assaig)

Taula A. 35 - Prova de variància Pes fresc (Subcultiu B, Pot)

Taula A. 36 - Prova Welch-ANOVA Pes fresc (Subcultiu B, Pot)

Taula A. 37 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu B, Tub d'assaig)

Taula A. 38 - Prova Welch-ANOVA Pes sec (Subcultiu B, Tub d'assaig)

Taula A. 39 - Prova de variància Pes sec (Subcultiu B, Pot)

Taula A. 40 - Prova Welch-ANOVA Pes sec (Subcultiu B, Pot)


Assaig de multiplicació medi MS

Taula A. 41 - Prova de variància Longitud (MS)

Taula A. 42 - ANOVA de 2 factors Longitud (MS)

Taula A. 43 - Prova de variància Taxa total (MS)

Taula A. 44 - ANOVA de 2 factors Taxa total (MS)

Taula A. 45 - Prova de variància Taxa viable (MS)

Taula A. 46 - ANOVA de 2 factors Taxa viable (MS)


Taula A. 47 - Prova de variància Pes fresc (MS)

Taula A. 48 - ANOVA de 2 factors Pes fresc (MS)

Taula A. 49 - Prova variància Pes sec (MS)

Taula A. 50 - ANOVA de 2 factors Pes sec (MS)

EFECTE DE DIFERENTS CONDICIONS DE CULTIU DURANT LA …

Documents

Transcript of EFECTE DE DIFERENTS CONDICIONS DE CULTIU DURANT LA …