Unidad Educativa Calasanz Nombre: Paola Robles Armijos Curso :1ero “a” Bibliografía: .
DR. JORGE MANUEL DIAZ ARMIJOS - cia.uagraria.edu.ec
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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR SISTEMA DE POSTGRADO UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR PROGRAMA DE MAESTRÍA DE PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS TRABAJO DE TITULACIÓN COMO REQUISITO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE MAGÍSTER EN PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS OBTENCIÓN DE PECTINA A PARTIR DE CÁSCARA DE BANANO UTILIZANDO Trichoderma harzianum. DR. JORGE MANUEL DIAZ ARMIJOS GUAYAQUIL, ECUADOR 2018
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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
SISTEMA DE POSTGRADO UNIVERSIDAD AGRARIA DEL
ECUADOR
PROGRAMA DE MAESTRÍA DE PROCESAMIENTO DE
ALIMENTOS
TRABAJO DE TITULACIÓN COMO REQUISITO PREVIO A LA
OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE
MAGÍSTER EN PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS
OBTENCIÓN DE PECTINA A PARTIR DE CÁSCARA DE
BANANO UTILIZANDO Trichoderma harzianum.
DR. JORGE MANUEL DIAZ ARMIJOS
GUAYAQUIL, ECUADOR
2018
ii
SISTEMA DE POSTGRADO UNIVERSIDAD AGRARIA
DEL ECUADOR
CERTIFICACIÓN
Yo: MVZ. Carlos Amador Sacoto, M.Sc., docente de la Universidad Agraria del
Ecuador, en mi calidad de Director CERTIFICO QUE: He revisado el Trabajo de
Titulación, Titulada: OBTENCIÓN DE PECTINA A PARTIR DE
CÁSCARA DE BANANO UTILIZANDO Trichoderma harzianum, la
misma que ha sido elaborada y presentada por el estudiante: Dr. Jorge Manuel
Díaz Armijos; la cual cumple con los requisitos técnicos y legales exigidos por la
Universidad Agraria del Ecuador para este tipo de estudios.
Atentamente,
_________________________
Director de Trabajo de Titulación
Guayaquil, 18 de Octubre de 2017
iii
UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR SISTEMA DE POSTGRADO UNIVERSIDAD AGRARIA DEL
ECUADOR
TEMA:
OBTENCIÓN DE PECTINA A PARTIR DE CÁSCARA DE BANANO
UTILIZANDO Trichoderma harzianum
AUTOR:
DR. JORGE MANUEL DIAZ ARMIJOS
TRABAJO DE TITULACIÓN
APROBADA Y PRESENTADA AL CONSEJO DE POSTGRADO
COMO REQUISITO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE
MAGÍSTER SCIENTIAE EN PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS
TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN
Ing. Ahmed El Salous Khairat, M.Sc. PRESIDENTE
Ing. Yoansy García Ortega, M.Sc. Ing. Cecilia Valle Lituma, M.Sc.
EXAMINADOR PRINCIPAL EXAMINADORA PRINCIPAL
iv
AGRADECIMIENTO
Agradezco a la Universidad Agraria del Ecuador, a su Rectora Ingeniera
Economista: Martha Bucaram de Jorgge, M. Sc y a todos los Docentes que
hicieron posible la culminación del presente trabajo de investigación, y en especial
al MVZ. Carlos Amador Sacoto, M.Sc, Director de tesis por entregar sus
conocimientos, paciencia y compresión que forjaron un espíritu de esfuerzo
motivándome a alcanzar la meta propuesta.
v
DEDICATORIA
A Dios por haberme dado fortaleza para la culminación de mi maestría con éxito.
A todos mis seres queridos que fueron pilar fundamental para cumplir una de mis
metas de mi carrera profesional.
vi
RESPONSABILIDAD
Las conclusiones que aparecen en el presente trabajo de investigación corresponden única y
exclusivamente al autor y sus derechos a la Universidad Agraria del Ecuador.
Dr. Jorge Manuel Diaz Armijos C.I. 070317743-6
vii
RESUMEN
La pectina es un aditivo alimentario reconocido por la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) como un aditivo tipo GRAS (Generally Recognized As Safe), la cual ayuda a relentizar la absorción de glucosa en nuestro cuerpo, por lo cual la presente investigación tiene como objetivo la obtención de pectina a partir de la cáscara de banano maduro, mediante la aplicación de la hidrolisis enzimática de los carbohidratos hidrolizables por las enzimas secretadas por el hongo Trichoderma harzianum. Para el proceso de hidrólisis de la cascara de banano maduro se varió la concentración de sustrato (40 y 50%) y concentración de Inóculo (1 y 1,5%), dando un total de 4 tratamientos y mediante un análisis de varianza (ANOVA) se determinó la influencia que tienen los dos factores en la producción de pectina. Luego de 48 horas de hidrólisis enzimática cuando los parámetros de control se estabilizan, se determinó que si existió diferencia significativa (p˂0,05) entre los 4 tratamientos estudiados y el tratamiento que produjo mayor % de pectina (8,66 ± 0,21%) fue el tratamiento 4 el cual estuvo compuesto por 50% cáscara de banano molida y 1,5 g/L de inóculo. Mediante un análisis sensorial de aceptación /rechazo se determinó que la mermelada elaborada con pectina de cáscara de banano se ve afectada significativamente en el color. En conclusión si es posible la obtención de un porcentaje significativo de pectina a partir de la cáscara de banano maduro.
Palabras claves: Pectina, Cáscara de banano, GRAS, Hidrólisis, Trichoderma harzianum, Inóculo.
viii
SUMMARY
Pectin is a recognized by the Food and Agriculture Organization (FAO) as an additive type GRAS (Generally Recognized As Safe), which helps slow down the absorption of glucose in our bodies food additive, so which this research aims to obtain pectin from the peel of ripe bananas, by applying the enzymatic hydrolysis of the hydrolyzable carbohydrates secreted by the fungus Trichoderma harzianum enzymes. For the hydrolysis process of ripe banana peel substrate concentration (40 to 50%) and concentration of inoculum (1 to 1.5%) was varied, giving a total of 4 treatments and by analysis of variance (ANOVA ) the influence of the two factors in the production of pectin was determined. After 48 hours of enzymatic hydrolysis when the control parameters are stabilized, it was determined that if there was significant difference (P0.05) between 4 treatments studied and treatment produced higher% pectin (8.66 ± 0 21%) was treatment 4 which was composed of 50% ground banana peel and 1.5 g / L of inoculum. Through a sensory analysis of acceptance / rejection it was determined that the jam made from banana peel pectin is significantly affected in color. In conclusion if obtaining a significant percentage of pectin from ripe banana peel it is possible.
Key words: Pectin, banana peel, GRAS, hydrolysis, Trichoderma harzianum, inoculum.
ix
ÍNDICE DE CONTENIDOS
INTRODUCCIÓN. ................................................................................................... 1
Caracterización del Tema. ...................................................................................... 1
Planteamiento de la Situación Problemática. .......................................................... 3
Justificación e Importancia del Estudio. .................................................................. 3
Delimitación del problema. ...................................................................................... 4
Objetivos. ................................................................................................................ 5
Objetivo General: .................................................................................................... 5
Objetivos Específicos: ............................................................................................. 5
Hipótesis. ................................................................................................................ 6
Aporte Teórico. ........................................................................................................ 6
Aplicación Práctica. ................................................................................................. 8
CAPÍTULO 1 ......................................................................................................... 10
MARCO TEÓRICO ............................................................................................... 10
1.1 Estado del Arte. ........................................................................................ 10
1.2. Bases científicas y teóricas de la temática. ............................................. 11
1.2.1. Cáscara de banano maduro. .................................................................... 11
1.2.1.1. Composición Química. ............................................................................ 12
1.2.1.2. Uso de la Cáscara de Banano Maduro. .................................................. 14
1.2.2. Pectinas. ................................................................................................. 16
1.2.2.1. Composición de la Pectina. ..................................................................... 17
1.2.2.3. Propiedades Fisicoquímicas de la Pectina. ............................................. 19
1.2.3 Métodos de Obtención de las Pectinas de la Cascara de Banano
Maduro.……………………………………………………………………………………22
1.2.4. Microorganismo utilizado en la extracción de pectina. ............................ 25
1.2.4.1. Trichoderma harzianum. ......................................................................... 25
1.2.4.2. Clasificación Científica. ........................................................................... 26
1.2.4.3. Ciclo de Vida. .......................................................................................... 26
x
1.2.4.4. Mecanismo de Acción. ............................................................................ 27
1.2.4.5. Temperatura de Incubación. ................................................................... 27
CAPÍTULO 2 ......................................................................................................... 28
ASPECTOS METODOLÓGICOS ......................................................................... 28
2.1. Métodos. ................................................................................................. 28
2.1.1 Modalidad y Tipo de Investigación. ........................................................ 28
2.1.2. Métodos. ................................................................................................. 28
2.2. Variables. ................................................................................................ 28
2.2.1. Variable Independiente. .......................................................................... 28
2.2.2. Variable Dependiente. ............................................................................. 28
2.2.3. Operacionalización de las Variables. ...................................................... 29
2.3. Estadística Inferencial. ............................................................................ 30
2.4. Población y Muestra. ............................................................................... 30
2.4.1. Población. ............................................................................................... 30
2.4.2. Muestra. .................................................................................................. 30
2.5. Técnicas de Análisis de Datos. ................................................................ 30
2.5.1. Proceso de Obtención de la Pectina. ................................................. 31
2.5.1.1 Pre Tratamiento. ...................................................................................... 31
2.5.1.2. Extracción de la Pectina y Acondicionamiento Final. ........................ 32
2.5.2. Caracterización de la Pectina. ............................................................. 32
2.5.2.1. Determinación de Carbohidratos Totales. .............................................. 32
2.5.2.2. Determinación de Lignina. ...................................................................... 33
2.5.2.3. Determinación del Grado de Esterificación. ........................................... 34
2.5.2.4. Grado de Gelificación. ............................................................................ 34
2.5.2.5. Porcentaje de Metoxilos. ........................................................................ 35
2.5.2.6. pH........................................................................................................... 35
2.5.2.7. Humedad. ................................................................................................ 35
2.5.2.8. Cenizas Totales..................................................................................... 36
xi
2.5.2.9. Viscosidad Relativa. .............................................................................. 36
2.5.2.10. Acidez Titulable. .................................................................................... 37
2.5.2.11. Solubilidad. ............................................................................................ 38
2.5.3. Análisis Sensorial. ................................................................................. 38
2.5.3.1. Prueba de Aceptación/Rechazo. ........................................................... 38
2.6. Diseño Experimental. ............................................................................ 40
2.7. Cronograma de Actividades. ................................................................. 42
RESULTADOS. .................................................................................................... 43
Caracterización Fisicoquímica. ............................................................................. 43
Caracterización Microbiológica. ............................................................................ 43
Medición del pH Durante la Hidrólisis Enzimática de la Cáscara de Banano para la
Obtención de Pectina. ........................................................................................... 44
Medición de Oxígeno Disuelto Durante el Tiempo de Hidrólisis Enzimática. ........ 45
Grado de Gelificación ............................................................................................ 47
Análisis Sensorial. ................................................................................................. 48
Prueba de Hipótesis .............................................................................................. 51
DISCUSIÓN .......................................................................................................... 52
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. ....................................................... 54
BIBLIOGRAFÍA CITADA ...................................................................................... 56
ANEXOS ............................................................................................................... 65
APÉNDICES ......................................................................................................... 78
xii
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo N° 1. Selección de la materia prima. .......................................................... 67
Anexo N° 2. Tratamiento térmico de las cáscaras de banano (Escaldado)……….67
Anexo N°3. Molienda de la cáscara de banano………………………………………68
Anexo N°4. Pesado de la cáscara molida………………….…………………………68
Anexo N°5. Pesado de las conidias del hongo Trichoderma harzianum para la
inoculación en la solución acuosa de cáscaras de banano maduro……………….69
Anexo N°6. Medición del pH del hidrolizado de cáscaras para la obtención de
pectina…………………………………………………………………………………….69
Anexo N°7. Separación mediante filtración de los residuos de cáscara de banano
no hidrolizados…………………………………………………………………………...70
Anexo N°8. Secado de la pectina………………………………………………………70
Anexo N°9. Molienda de los residuos seco del proceso de hidrólisis……………...71
Anexo N°10. Tamizado de la pectina de cascara de banano……………………….71
Anexo N°11. Envasado de la pectina de cáscara de banano………………………72
Anexo N° 12. Estructura del Almidón .................................................................... 71
Anexo N° 13. Fórmula Química de la Celulosa ..................................................... 72
Anexo N° 14. Fórmula Química de la Hemicelulosa ............................................. 72
Anexo N° 15. Fórmula Química de la Lignina ....................................................... 73
Anexo N° 16. Fórmula Química de la Pectina ....................................................... 73
Anexo N° 17. Trichoderma Conidias (esporas asexuales) ................................... 74
Anexo N° 18. Diagrama del Proceso de Obtención de la Pectina ........................ 74
Anexo N° 19. Diagrama de Flujo para la Obtención de Pectina……………………76
Anexo N° 20. Análisis de las Medias a un Nivel de Confianza del 95% ................ 75
Anexo N°21. Glosario de Terminos…………………………………………………...77
Anexo N°22. Certificado del trabajo de campo realizado en el Laboratorio de
Tecnología Farmacéutica I de la Unidad Académica de Ciencias Químicas y de la
Salud de la Universidad Técnica de Machala. ……………………………………….79
xiii
ÍNDICE DE APÉNDICES
Tabla N° 1. Composición Química de la Cáscara de Banano Maduro .................. 80
Tabla N° 2. Diseño de las Condiciones de la Hidrólisis Enzimática de la Cáscara
de Banano
Maduro……………………………………………………………………......... ............ 80
Tabla N° 3. Modelo de la Prueba Dicotómica ………………………………………..81
Tabla N° 4. Clasificación científica del hongo Trichoderma harzianum…..……….81
1
INTRODUCCIÓN.
Caracterización del Tema.
La sociedad realiza diferentes actividades productivas de las cuales se
generan una serie de desechos sólidos, líquidos o gaseosos que pueden tener
efectos negativos sobre el ambiente y la salud humana. Entre ellos, los residuos
sólidos son importantes porque generan efectos tóxicos significativos y
frecuentemente se depositan en lugares donde la población humana puede estar
expuesta.
La Provincia de El Oro, posee grandes extensiones de tierras agrícolas
dedicadas al cultivo de banano, donde las frutas “rechazadas” que no cumplen los
indicadores de calidad para su exportación son aprovechadas de diversas
maneras. Una de las empresas que aprovecha esta materia prima es DIANA-
FOOD ECUADOR S A, la cual está ubicada en la Parroquia La Peaña en el cantón
Pasaje de la Provincia de El Oro, donde se obtienen, entre otros productos, puré y
harina de banano, que genera alrededor de 300 toneladas métricas por semana
de cáscara de banano maduro. Estos residuos agroindustriales se convierten en
un gran problema no sólo ambiental sino económico, ya que en algunos casos la
misma empresa tiene que asumir altos costos de disposición de éstos.
El desconocimiento de los efectos de la contaminación ambiental, la
ausencia de medios suficientes para su tratamiento, así como las malas prácticas
medioambientales, han tenido como consecuencia el vertido o depósito
incontrolado de estos residuos, lo que a su vez origina la contaminación
progresiva de muchos suelos.
La solución es buscar medidas de mitigación como lo son el reciclaje de los
residuos mediante un proceso de degradación controlado, evitando así el uso
indiscriminado de contaminantes ocasionando un cambio irreversible en el
ambiente y en la calidad de vida.
2
Actualmente aún es mínimo el aprovechamiento de los desechos orgánicos
en la industria del banano, por lo que, el destino final de la cáscara, origina
además de la contaminación del suelo, problemas tales como: plagas, malos
olores, proliferación de roedores y contaminación de las fuentes de agua.
Los desechos agroindustriales son ricos en materiales lignocelulósicos lo
cual los convierte en una excelente fuente de materia prima para la obtención de
pectina, fibra, glucosa, etc. Mediante la utilización de procesos biotecnológicos es
posible hidrolizar estos desechos a sus monómeros y de esta forma puedan ser
utilizados como aditivos alimentarios, que debidamente procesados son capaces
de mejorar la calidad física, química, reológica y biológica de los alimentos donde
se la adicione enriqueciendo la flora bacteriana y como adsorbente intestinal
desde hace muchos años. Además, se le han atribuido ciertos efectos
beneficiosos para la prevención del cáncer, sobre todo colon rectal.
Recientemente un equipo de investigadores halló en estudios de laboratorio
que ciertos componentes de la pectina se unen y quizás, inhiben una proteína que
facilitaría la diseminación del cáncer en el organismo. Al parecer, ciertos azúcares
en la pectina se unen a la galectina 3, una proteína sobre la superficie de las
células tumorales que favorece el crecimiento celular y se disemina en el
organismo. Esa unión, a la vez, permitiría que la pectina inhiba la galectina-3 y,
por lo tanto, retrase o incluso revierta la diseminación de las células tumorales.
Las pectinas también proporcionan superficies cargadas que regulan el pH y
el balance iónico.
Además, la modificación enzimática representa un proceso más atractivo
que aquel en el que agentes químicos son utilizados para disminuir el grado de
metoxilación de las pectinas, además de ser altamente específico y llevado a cabo
bajo condiciones menos severas de reacción como las utilizadas en la
modificación química (Correa, y otros 1999).
3
Planteamiento de la Situación Problemática.
El sector agroindustrial de la provincia de El Oro necesita desarrollar
métodos biotecnológicos que le permitan proteger el medio ambiente y de esta
forma poder aprovechar los residuos que se generan en la agroindustria y de esta
manera seguir siendo competitivo en las actividades que realizan, mediante el
incremento de la productividad y la racionalización de los recursos del productor.
La empresa DIANA-FOOD ECUADOR S A ubicada en la Parroquia La
Peaña del cantón Pasaje en la Provincia de El Oro, dedicada a la industrialización
del banano maduro, genera aproximadamente 300 toneladas de cáscara de
banano semanales proveniente del proceso de deshidratación del banano maduro
para la producción de puré y harina de banano. Al existir grandes volúmenes de
desechos las empresas optan por depositar estos desechos en lugares no
destinados para el efecto y cercano a lugares habitados provocando la
proliferación de insectos, aves y roedores que se convierten en vectores para la
transmisión de microorganismos patógenos para el ser humano, que además
generan lixiviados que contaminan a las fuentes de agua subterránea, generan
malos olores, afectan el paisajismo, y contaminan el suelo. Al existir gran cantidad
de cáscara de banano proveniente del uso de la pulpa, la presente investigación
tuvo como objetivo obtener pectina a partir de esta abundante materia prima y de
esta manera darle utilidad a este subproducto rico en carbohidratos totales los
cuales son hidrolizables a monómeros que componen la pectina.
Justificación e Importancia del Estudio.
A través de esta investigación, se plantea una alternativa al sector
agroindustrial de la provincia de El Oro, un proceso biotecnológico rentable sobre
esta técnica de Producción Más Limpia (PML) como es el aprovechamiento de
4
desechos sólidos agroindustriales para la obtención de pectina a partir de cáscara
de banano maduro.
Existen procesos físicos, químicos y biológicos para obtener pectina a partir
de residuos celulósicos, con relativa rentabilidad para su aplicación industrial. En
nuestro país, así como otros países productores de esta musácea existen residuos
celulósicos abundantes, los cuales ricos en celulosa hasta un 15 %, por lo cual se
planteó implementar herramientas biotecnológicas como es la hidrolisis enzimática
de la cáscara, con el fin de obtener pectina a partir de cascaras de banano para su
uso alimenticio. El desarrollo del diseño experimental se empleó como variables,
concentración de inóculo (Trichoderma harzianum), concentración de sustrato
(cáscara de banano) para la hidrólisis de la celulosa y hemicelulosa a sus
componentes como ácido galacturonicos y otros azucares que forman la pectina.
En investigaciones similares se ha obtenido un rendimiento de 80%, lo que
resulta prometedor ya que el costo de la materia prima para este proceso solo
implica el acopio, molienda y transporte. La cáscara de banano por sus
características físico - químicas, puede obtenerse el 15% del total. Los
beneficiarios mayoritarios sin duda serán los empresarios o emprendedores que
se encuentran inmersos en esta actividad agroindustrial ya que recibirían un rubro
adicional por kilogramo de banano. Además se protegería el medio ambiente ya
que al ser aprovechado este desecho agroindustrial (cáscara de banano) no
causaría un impacto ambiental negativo por lixiviados generados por la
descomposición.
Delimitación del problema.
Para la realización de ésta investigación, se utilizó cáscara de banano
maduro, proveniente de la industria DIANA-FOOD ECUADOR S. A., ubicada en la
provincia de El Oro, cantón Pasaje, parroquia la Peaña. Las enzimas digestoras
5
(celulosas) producidas por el hongo (Trichoderma harzianum) fueron adquiridas
de la empresa biotecnología Ecuabiologica. C.Ltda. A través de un proceso
biotecnológico se hidrolizó la celulosa y hemicelulosa presente en la cáscara de
banano para la obtención de pectina. Sin Embargo el desarrollo de la
investigación se la realizó en el Laboratorio de Tecnología Farmacéutica I de la
Unidad Académica de Ciencias Químicas y de la Salud de la Universidad Técnica
de Machala, la cual se encuentra ubicada en el Km 5 ½ vía a Pasaje con las
siguientes coordenadas: Latitud 3º17´07.19", Longitud 79º54´46.17".
Formulación del problema.
¿Los desechos agroindustriales a partir cascara de banano se puede
aprovechar para obtener pectina?
Objetivos.
Objetivo General:
Obtener pectina a partir de cáscara de banano maduro mediante la
utilización de Trichoderma harzianum.
Objetivos Específicos:
Determinar las características físico químicas y microbiológicas de la
cáscara de banano maduro como materia prima.
Evaluar la efectividad del Trichoderma harzianum en hidrólisis
enzimática.
Determinar el grado de gelificación de la pectina a obtenerse.
Comparar mediante una prueba sensorial la pectina comercial con la
pectina obtenida.
6
Hipótesis.
Es posible la obtención de un porcentaje significativo de pectina a partir de
la hidrólisis enzimática de cáscara de banano maduro utilizando el hongo
Trichoderma harzianum.
Aporte Teórico.
La pectina es reconocida por la Organización de las Naciones Unidas
para la Alimentación y la Agricultura (FAO) como un aditivo seguro el cual no
tiene restricciones de uso, la cual es un hidrocoloide fundamental en el
procesamiento de los alimentos ya que crea y modifica la textura de compotas,
jaleas y mermelada.
Para el desarrollo de este estudio se considerara la caracterización de la
materia prima, ya que el grado de madurez demuestra cambios en la composición
química interna del fruto y en su textura, estos cambios están asociados con la
solubilización progresiva y despolimerización de las sustancias pépticas,
evolucionando con el tiempo de forma gradual de protopectinas insolubles a
pectinas solubles por acción de la enzima pectino-esterasa. La etapa intermedia
que corresponde a la sustancia llamada pectina es de utilidad en la industria por
tener la capacidad de formar geles en presencia de azúcar, ácido y agua en
proporciones adecuadas.
El tipo de fruta es un factor predominante para obtener una mayor cantidad
y calidad de pectina, cuando el fruto es madurado naturalmente y bajo condiciones
de cosecha adecuadas la calidad de la pectina se ve reflejada en el color del
producto final y en los grados de metoxilos que se obtiene, ya que la actividad
enzimática no ha degradado a este compuesto. Dependen también de la parte del
fruto que se utilice y de la tecnología empleada en el proceso de obtención. En
frutos sin madurar la mayor cantidad de material péptico es insoluble en agua, la
7
cantidad y la solubilidad aumentan con la madurez; esto genera cambios en la
firmeza del fruto.
Las sustancias que componen la pectina son conocidas por contribuir a la
adhesión entre las células y al mecanismo de fuerza de la pared celular, a través
de su habilidad para formar geles estabilizantes, y tienen también un importante
papel en el crecimiento de las células de las plantas.
Adicionalmente a estas importantes funciones fisiológicas, estos
polisacáridos estructurales tienen también otras funciones, entre ellas, el que
estén involucrados en las interacciones entre plantas y agentes patógenos; la
cantidad y la naturaleza de la pectina son determinantes para la estructura de los
frutos y vegetales durante su crecimiento, madurez, almacenamiento y
procesamiento; adicionalmente ellas tienen un importante papel como fibra
nutricional, y pueden tener interesantes propiedades terapéuticas.
La obtención de pectina utilizando organismos vivos como el hongo
Trichoderma harzianum ya que es un hongo productor de enzimas celulosas. La
aplicación de este método biotecnológico tiene 2 objetivos principales:
a) La obtención de enzimas celulosas para su utilización directa en hidrólisis
de material lignocelulosico.
b) La obtención hidrólisis de almidones, celulosa, hemicelulosa y látex de las
cáscaras de banano maduro para obtener la pectina.
La aplicación de la biotecnología moderna recurriremos al empleo de
métodos y técnicas enzimáticas con el objeto de conseguir mejoras en la calidad o
en el rendimiento del procesos, por ejemplo la obtener una pectina limpia libre de
compuestos químicos nocivos para la salud y el medio ambiente como lo son el
empleo de ácido clorhídrico para la obtención de pectinas. La Biotecnología tiene
aplicación en muchas áreas y actividades, por ejemplo:
8
a) elaboración de alimentos y bebidas: pan, derivados de la leche, cerveza
y vino.
b) fabricación de medicamentos, vacunas y otras sustancias de aplicación
terapéutica, que sirven para curar enfermedades, pero no son
medicamentos, como la hormona del crecimiento.
c) control de contaminación ambiental.
d) producción de energía (biocombustibles).
Entre las principales ventajas de la aplicación de métodos biotecnológicos
se tienen:
- Rendimiento superior: mediante los OGM (organismos genéticamente
modificados) el rendimiento de los cultivos aumenta, dando más alimento por
menos recursos, disminuyendo las cosechas perdidas por enfermedad o plagas
así como por factores ambientales.
- Mejora en la nutrición: se puede llegar a introducir vitaminas y proteínas
adicionales en alimentos así como reducir los alérgenos y toxinas naturales.
Aplicación Práctica.
La pectina tiene numerosas aplicaciones en la industria alimentaria como
espesante, texturizador, emulsificante y estabilizador. También tiene un importante
campo de aplicación en productos de la industria farmacéutica y de cosméticos. El
polímero puede extraerse a partir de subproductos de la industria alimentaria y
una de las fuentes principales son las cáscaras de banano.
Se desea a través de este trabajo, poner a disposición de la empresa
agroindustrial DIANA FOOD S.A. ubicada en la Parroquia La Peaña perteneciente
al Cantón Pasaje, Provincia de El Oro, un estudio de “OBTENCIÓN DE PECTINA
9
A PARTIR DE CÁSCARA DE BANANO UTILIZANDO Trichoderma harzianum”,
para el aprovechamiento de estos desechos sólidos agroindustriales.
De llegar a ser ejecutado este proyecto estaremos aportando al cambio de
la matriz productiva, ya que dará valor agregado a un subproducto y mejorara la
economía del agricultor ya que mejorara el precio de esta fruta. Todas estas
acciones tienen como aplicación práctica promover actividades que permitan una
producción sostenible, que disminuyan el impacto ambiental, lo que sin duda
mejora la calidad de vida de la población y se mejoran las condiciones para el
desarrollo económico de esta zona.
La obtención de pectina a partir de cáscara de banano por métodos
biotecnológicos como la hidrólisis enzimática utilizando el hongo Trichoderma
harzianum no implica grandes inversiones en lo que se refiere a equipamiento,
debido a que el proceso se desarrolla a temperatura ambiente en condiciones
aerobias.
10
CAPÍTULO 1
MARCO TEÓRICO
1.1. Estado del Arte.
Los procesos biotecnológicos para la obtención de metabolitos o productos
de interés industrial se encuentran en el inicio de la curva tecnológica, cuyos
límites parecen ser ilimitados debido a la gran cantidad de recursos biológicos de
los que se dispone en nuestro país (Ecuador).
“La pectina es un polisacárido que se encuentra en la pared celular y en las
laminillas medias de las células vegetales” (Swamy y Muthukumarappan 2017).
“Este éster metilado es una macromolécula de ácido poligalacturónico, que puede
estar metil-esterificado en C-6, y puede estar O-acetilado en el O-2 y / u O-3”
(Kermani, y otros 2014).
“La pectina contiene unidades de (1,4α) ácido galacturónico 1,4
entrelazadas entre 17 monosacáridos diferentes” (Wenjun, y otros 2015, Zarifeh, y
otros 2017). “Entre los monosacáridos, incluidos L-ramnosa, L-arabinosa, D-
galactosa y D-xilosa “ (Santos, Espeleta y Branco 2013).
“El grado de pureza de la pectina está dado por el porcentaje de ácido
galacturonico” (H. Pereira, y otros 2016). “La pectina natural se obtiene a partir de
cáscaras de fruta, o también considerados subproductos del proceso de
fabricación de jugo” (Oni, y otros 2015).
“La pectina se usa como emulsionante, texturizador, espesante y
estabilizador en la industria de alimentos y bioprocesos” (Zahra, y otros 2015) .
“En la elaboración de alimentos se emplea como gelificante agente que forma
parte en la preparación de jaleas y mermelada debido a los múltiples
funcionalidades” (Pereira, Oliveira y Cacalvantes 2016, Ganesh, y otros 2016).
“La pectina es beneficiosa para la salud, al reducir el colesterol en la sangre
y reducir los lipoproteínas de baja densidad lipoproteína (LDP) que causa
enfermedades del corazón” (Oliveira, y otros 2017).
11
“La bioactividad de las pectinas radica en la propiedad acida, la cual es
otorgada por la materia prima de donde provienen como naranja, lima, limón y
pomelos” (Kaya, y otros 2014). “Esta propiedad es importante porque disminuye la
tasa de digestión de las cadenas cortas de amilosa y amilopectina de los
almidones y evita la hidrólisis de estas sustancias y por ende la presencia de su
principal monómero como lo es la glucosa” (Yeming, y otros 2017).
“La creciente demanda industrial de pectinas con diferentes capacidades
para gelificar o estabilizar productos aumenta la necesidad de pectinas de
diferentes tipos o derivados con propiedades adaptadas” (Vriesmann, Teófilo y
Oliveira 2012). “Una de las alternativas para cubrir estas demandas es el
aprovechamiento de la cascara de banano para la obtención de pectina” (Rebello,
y otros 2014, Tibolla, Pelissari y Menegalli 2014).
“A nivel mundial se producen alrededor de 100 millones de toneladas de
pectina” (The World Banana Forum. 2014).
“Trichoderma harzianum es ampliamente conocidos por su producción de
enzimas (β -1, 3 glucanase), toxinas y antibióticos” (Houda, y otros 2016).
1.2. Bases científicas y teóricas de la temática.
La aplicación de la biotecnología en la industria alimentaria integra los
conocimientos científicos de ciencias básicas como la biología, física, química y
microbiología, mediante estos métodos podemos aplicar organismos vivos como
los hongos para obtener monómeros o nuevos compuesto de valor nutricional o
económico para el ser humano.
1.2.1. Cáscara de banano maduro.
La cáscara de banano maduro en la provincia de El Oro, proveniente en
gran parte de las industrias que procesan esta fruta para la obtención de puré,
jugos y deshidratado de banano, las cuales son: DIANA FOOD S. A. e INBORJA
S.A, que desechan aproximadamente 600 toneladas semanales.
12
1.2.1.1. Composición Química.
La composición química, fluctúa de acuerdo a la interacción de factores
específicos del cultivar, del estado de maduración, las condiciones ambientales y
las prácticas agrícolas empleadas, además del tratamiento postcosecha (Afanador
2005; Arvanitoyannis y Mavromatis 2009).
La cáscara de banano transforma alrededor del 90% de su almidón a
azúcares aproximadamente 12 días después de su cosecha; un contenido de
hasta 14,6 de azúcares en base seca ha sido encontrado. El contenido de fibra en
la cáscara es de 13% en base seca: Los principales componentes de la cáscara
son: celulosa (25%), hemicelulosa (15%) y lignina (60%), (Alvarado & Gomez,
2013).
Por su parte, Sharrock y Lusty (2000) encontraron que los niveles de
almidón en banano verde son del orden del 20%, y van disminuyendo hasta 1%-
2% en banano completamente maduro, al mismo tiempo los azúcares solubles
aumentan de 1% a 20%. La cáscara de banano es una fuente potencial de pectina
(ANON, 2002). A continuación en la Apéndice N°1 se describe la composición
química de la cascara de banano maduro.
Almidón: El almidón es un polisacárido, que al estar constituido por
numerosas unidades de un solo tipo de monosacáridos, unidos entre sí por
enlaces glucosídicos, recibe el nombre de “homopolisacárido”. Este polímero de
glucosa representa la mayor reserva de hidratos de carbono en los tubérculos de
la planta y el endosperma de semillas, y es el polisacárido digerible más
abundante e importante (Editorial El Ateneo. López y Suárez 2002).
La composición del almidón está determinada genéticamente, y este
polisacárido debe sus propiedades funcionales a sus dos componentes
moleculares principales, amilosa y amilopectina, así como a la organización física
13
de las macromoléculas en la estructura del gránulo (Bello, Méndez y Acevedo
2006).
Celulosa: La celulosa es una cadena lineal con moléculas de anillos de
glucosa (C6H10O5) ligada a través de un enlace covalente de oxígeno al C1 de un
anillo de glucosa y al C4 del anillo adyacente (Azizi y Col, 2005).
Se considera que es uno de los componentes más abundantes de la
biomasa vegetal que es degradada por una serie de microorganismos mediante la
acción de varias enzimas no asociadas en complejos, como en los hongos
filamentosos y en algunos actinomicetos o formando un complejo denominado
"celulosoma", como en los clostridios y en bacterias del rumen (Murashima et al.,
2002; Lynd et al., 2002; Fengel, D. 2003). Estas enzimas han sido ampliamente
estudiadas en hongos mesófilos, tales como Trichoderma reesei (Lynd et al.,
2002).
La celulosa posee dos estructuras una cristalina (organizada) y otra amorfa.
Las cepas de celulosa son “empaquetados” denominados fibrillas de celulosa.
Estas fibrillas de celulosa son en su mayoría independientes y débilmente
vinculados a través de uniones de hidrógeno (Laureano, y otros 2005). La celulosa
está compuesta de restos de ß glucopiranosa y es el componente principal de las
paredes de las células vegetales, en donde se encuentra asociada a la
hemicelulosa, pectina y lignina (Córdoba, 2005).
Hemicelulosa: Es ampliamente distribuida en las plantas, incluye las
sustancias que rellenan los espacios existentes entre las fibrillas de celulosa en
las paredes celulares vegetales, por lo que actúan como material de soporte para
mantener las células juntas. La hemicelulosa está constituida por pentosas y
hexosas distribuidas de forma ramificada y lineal conformando polímeros tipo
polisacáridos denominados no-celulósicos. La hemicelulosa tiene un peso
molecular menor que la celulosa y contiene como azúcares constitutivos a la
xilosa, arabinosa, galactosa, manosa, glucosa, ácido glucurónico y ácido
galacturónico (Córdoba, 2005).
14
La hemicelulosa sirve de conexión entre la lignina y las fibras de celulosa y
da toda la rigidez a la red de celulosa, hemicelulosa y lignina (Laureano, y otros
2005).
Lignina: Es un polímero heterogéneo constituido por 3 unidades de
aromáticos derivados del alcohol p-hidroxicinamilico: el coniferilico, el sinapilico y
el p-coumarilico, precursores a su vez del guayacol, el siringol y el hidroxifenol,
unidas por enlaces aril-eter (β–O–4), aril-aril y carbono-carbono (Cα-Cβ)
principalmente (Dekker et al, 2002, Martínez et al, 2005).
La forma estructural de la lignina no ha sido definida como la de otros
componentes de cáscara de banano naturales tales como celulosa y proteínas,
debido a la complejidad que afecta su aislamiento, análisis de la composición, y la
caracterización estructural. El problema de una definición precisa para la lignina se
asocia con la naturaleza de sus múltiples unidades estructurales, las cuales no
suelen repetirse de forma regular, dado que la composición y estructura de la
lignina varían dependiendo de su origen y el método de extracción o aislamiento
utilizado (Lu y John 2010).
La lignificación de las paredes celulares en especial del xilema y el
esclerenquima imparte rigidez y dureza a estos tejidos. Por lo tanto, cuando un
vegetal se encuentra maduro, ésta se hace más rica en lignina y pierde
progresivamente la capacidad de retener agua (Fennema, 2003).
1.2.1.2. Uso de la Cáscara de Banano Maduro.
La cáscara de banano maduro proveniente de la extracción de la pulpa, ya
sea de forma casera como industrial, en la actualidad este subproducto se la
utiliza como materia prima para la elaboración de biol, bioetanol, jarabes
glucosados y compost los mismos que vuelven a ser utilizados como fuentes de
energía renovables. Una de las ventajas de utilizar desechos de banano como
15
suplemento alimenticio es que se reducen considerablemente los costos en
relación al aumento de peso de los animales (Castro 1994).
Así, la agroindustria bananera produce una gran cantidad de residuos
lignocelusicos, ya que de la planta solamente se aprovecha el fruto, teniendo que
prescindir de las demás partes de la planta: seudotallo, hojas y pinzote o raquis
(parte de la planta que sostiene los gajos de frutos). Debido a que estos materiales
están constituidos 23 por fibras lignocelulósicas, se podrían utilizar como materia
prima para la obtención de celulosa. O en la obtención de materiales compuestos
con lo que se les proporcionaría un valor agregado a dichos residuos.
Investigaciones donde se utiliza este subproducto, como el realizado en la
Universidad Federal de São Carlos (2011), cuando se deshidratan y se trituran
hasta polvo, esta biomasa tienen la capacidad de absorber metales pesados de
una manera eficaz y barata. El método brasileño se aprovecha para la limpieza de
uno de los principios básicos de la química: los opuestos se atraen. En la cáscara
de plátano existen un gran 24 números de moléculas con carga negativa. Estás
moléculas tienen un gran poder de absorción sobre la carga positiva de los
metales pesados ( Universidad Federal de São Carlos 2011).
Alrededor del 95% de los residuos que se generan en la producción de
banano no son aprovechados eficientemente por el agricultor, ya que su
producción la enfoca principalmente en la comercialización para la exportación o
en mínimo porcentaje como opción alimenticia para el hogar, por lo que después
de usar el fruto destina lo restante a abono para la cosecha.
El uso de la fruta de rechazo es importante para aquellos países que no
poseen potencial alimenticio, en costa rica utilizan el rechazo de banano para la
fabricación del puré, sin embargo esta actividad genera otro desecho, el cual
constituye el 33% del volumen del banano procesado.
Lo cual esto se refiere a la cascara del banano maduro que se lo utiliza para
la alimentación animal (Lopez y Ralda 1999).
16
1.2.2. Pectinas.
Las pectinas son un grupo heteropolisacarido estructurales que contienen
sobre todo unidades de ácido galacturónico. Estos compuestos están presentes
en las paredes celulares primarias y en laminilla media de las células
parenquimatosas de muchas plantas, donde están frecuentemente asociadas con
otros componentes de la pared celular, tales como la celulosa, hemicelulosa y
lignina, y son responsables de la firmeza de algunos productos. La disolución de
los compuestos de dicha pared celular, sobre todo de las pectinas se ha
relacionado con el ablandamiento de diversas especies vegetales (Stephen,
Phillips y Wiliams 2006, Badui 2006, A. Ferreira 2007) .
La calidad y cantidad de pectina que se pueda obtener de los frutos
dependen de la especie y del tipo de fruta, de la cantidad que el fruto contienen
naturalmente, del grado de maduración en la cosecha, de las condiciones de
transporte y de la actividad enzimática después de la recolección y desde luego,
del proceso de extracción. Depende también de la parte del fruto que se utilice y
de la tecnología empleada en el proceso de obtención.
En los frutos sin madurar la mayor cantidad del material péptico es
insoluble en agua, la cantidad y la solubilidad aumenta con la madurez; esto
genera cambios en la firmeza del fruto (A. Ferreira 2007, Stephen, Phillips y
Wiliams 2006).
Uno de los métodos para obtener la pectina cítrica, es la hidrolisis acida
que ofrece un alto rendimiento. Para realizar este método se debe hacer un
estudio de la clasificación o el tipo de planta del banano maduro y por ende la
cantidad de pectina, depende de las diferentes variables del cultivo, como la
composición de la tierra, la intensidad y tiempo de exposición a la luz solar, y la
familia genética a la cual pertenece (Cayón, y otros 2004).
17
1.2.2.1. Composición de la Pectina.
Su estructura básica se compone de unidades repetitivas de ácido α-D-
galacturónico con uniones (1-4) (Figura 3). La ramnosa también puede estar
presente en la cadena principal de la pectina en un 10%, junto con las cadenas
laterales que contienen pequeñas cantidades de azúcares neutros como
galactosa, arabinosa y xilosa (Aspinall, 1982 y Córdoba, 2005). Los grupos
metílicos esterificados en el grupo carboxilo de la cadena principal determinan el
tiempo y velocidad relativa de melificación y la fuerza del gel de pectina. El grado
de metilación (GM) se utiliza como criterio para su clasificación en bajo metoxilo
(LM) o alto metoxilo (HM) (Córdoba, 2005).
Las pectinas varían dependiendo los tipos de frutas, en las cáscaras de
banano se incrementa el contenido de metoxilo y poder de gelificación, así como
también en la presencia y las posiciones de otros grupos orgánicos como amidas y
etoxilo. Además varía la longitud de la cadena de los ácidos y los componentes
involucrados en su estructura, lo cual disminuye su propiedad de fluir. Desde el
punto de vista del contenido de metoxilo, o sea del número de grupos carboxilos
esterificados con metanol, se distinguen dos tipos, pectinas de alto metoxilo y
pectinas de bajo metoxilo (Ferreira, 2007).
1.2.2.2. Estructura y Composición.
La columna vertebral de la pectina está compuesta por unidades
enlazadas (α1-4) del ácido galacturónico interrumpidos por enlaces simples (α1-
2) de residuos de ramnosa.
Los grupos carboxilos de las unidades del ácido galacturónico están
parcialmente esterificados por metanol, lo cual define el contenido de metoxilo
en una pectina dependiendo de la fuente y el modo de extracción. El grado de
esterificación (GE) está definido por la relación de residuos de ácido
galacturónico metilesterificados con el total de unidades de ácido
galacturónico presentes en la muestra de pectina.
18
El número y distribución de los grupos estermetílicos a lo largo de la
molécula juegan un papel importante en la solubilidad, propiedades de
espesamiento, capacidad de gelificación, que son condiciones requeridas para
las propiedades finales del gel, y también sobre la firmeza y cohesión de los
tejidos de las plantas (Fennema 2003, Stephen, Phillips y Wiliams 2006) .
Teóricamente, una pectina puede tener un contenido de metoxilo del 16%,
pero en la práctica se han encontrado que contiene alrededor del 14%. Por esta
razón se ha fijado el 7% de contenido de metoxilo (50% de esterificación con
metanol) como la línea divisoria para diferenciar las categorías de pectina sobre
la base del contenido de metoxilo (A. Ferreira 2007).
Desde el punto de vista del contenido de metoxilo, se distinguen dos tipos
de pectina:
Pectinas de Alto Metoxilo (PAM): Son las que poseen un valor
superior al 50% de los grupos carboxilo del ácido galacturónico del polímero
se encuentran esterificados con metanol. Las pectinas son capaces de formar
geles en medios de pH entre 2.8 y 3.5 y un porcentaje de sólidos solubles
(azúcar) entre 60 y 70 °Brix (A. Ferreira 2007).
La adición del azúcar en un alimento que contiene pectina, ejerce un
efecto “deshidratante” sobre los polímeros, lo que ocasiona que se favorezcan a
la solubilidad y la interacción entre polisacárido-polisacárido de manera
hidrófoba, y se cree una estructura tridimensional que rodea las moléculas de
azúcar (sacarosa), las cuales son fuertemente hidratadas (Badui 2006).
Las pectinas gelificación rápida se utilizan en productos como mermeladas
donde se quiere asegurar la distribución uniforme de las partículas de fruta
presentes en suspensión (Córdoba, 2005).
Las pectinas de alto metoxilo pueden subdividirse en dos grupos: las
de gelificación rápida, que tienen un tiempo de gelificación menor a cinco
19
minutos y un grado de esterificación con metanol entre 68 y 75%, y las de
gelificación lenta, que tienen un tiempo de gelificación mayor de cinco minutos y
un grado de esterificación con metanol entre 60 y 68 % (Ferreira, 2007).
Pectinas de Bajo Metoxilo (PBM): Son aquellas en las cuales menos del
50% de los grupos hidroxilo están esterificadas con metanol. Para la
formación del gel requieren la presencia de cationes divalentes, generalmente
se emplea el calcio. En este caso la formación del gel ocurre por la formación de
enlaces de dichos cationes con moléculas de pectina adyacentes formando una
red tridimensional con los grupos carboxilo de la pectina (Badui 2006, A. Ferreira
2007).
En este caso los geles se pueden obtener entre pH 1,0 a pH 7,0 o aún
superior; el pH no afecta la textura del gel ni el intervalo de sólidos solubles y
puede fluctuar entre 0 y 80% pero la presencia de calcio (40 y 100 ppm) es el
factor predominante en la formación del gel. Si no hay calcio no se produce
gelificación, aunque también se puede emplear magnesio en este proceso.
La cantidad de calcio necesaria depende de la cantidad de sólidos solubles
así: para 30% de sólidos solubles se requieren de 40 a 100 ppm de calcio y para
45% de sólidos solubles de 20 a 40 ppm de calcio (Fennema 2003). Las pectinas
de gelificación lenta se utilizan para productos de confitería, dulces (Córdoba,
2005).
Las pectinas de bajo metoxilo pueden dividirse en tres grupos: las de
gelificación rápida que poseen una alta reactividad con iones calcio y contienen
un grado de esterificación aproximadamente del 30%; las de gelificación media,
que poseen una reactividad intermedia con iones de calcio y contiene un grado
de esterificación aproximada del 32%; y por último, las de gelificación lenta
que poseen una reactividad media con iones calcio y contienen un grado de
esterificación aproximada del 35% (Gaviria y López 2005).
1.2.2.3. Propiedades Fisicoquímicas de la Pectina.
20
Solubilidad.
El agua es el mejor solvente para las pectinas también es soluble en
formamida, dimetilformamida y glicerina caliente (Acosta 1984). La pectina es
insoluble en solventes orgánicos y en soluciones de detergentes cuaternarios,
polímeros, proteínas cationes polivalentes; éstos agentes se emplean para
precipitar la pectina de las soluciones después de un proceso de hidrólisis por
tratamiento de la materia prima (Rincon 1990).
Acidez.
Las pectinas son neutras en su estado natural, en solución tiene carácter
ácido el cual depende del medio y del grado de esterificación. El pH de la
soluciones de pectina varía entre 2.8 y 3.4 como función del grado de
esterificación. La pectina tiene una constante de disociación de 0.1 a 10x10-4 a
19ºC (Cayón, y otros 2004).
Viscosidad.
Las pectinas forman soluciones viscosas en agua, ésta propiedad depende
del grado de polimerización de la pectina, el pH, la temperatura, la concentración
y la presencia de electrolitos.
En las pectinas con alto grado de esterificación, la viscosidad por efecto de
su presencia aumenta al aumentar el peso molecular, los grupos laterales y la
concentración de la pectina en solución. El calcio y otros iones polivalentes
aumentan la viscosidad de las soluciones de pectinas y algunas pectinas de bajo
metodillo pueden gelificar si la concentración de calcio supera un cierto límite
(Cayón, y otros 2004).
Poder de melificación en geles de pectina.
Para las pectinas con alto metoxilo, se considera que a un pH de 3.4 por lo
menos un 40% de los ésteres metílicos están desesterificados y por lo tanto será
21
difícil lograr la formación de un gel estable con presencia de concentraciones de
65% de azúcares. Un exceso en la concentración del azúcar puede producir
cristalización en el almacenamiento. En el caso de las pectinas de bajo metoxilo,
los geles son menos rígidos y se pueden trabajar con menos sólidos solubles, no
dependen tanto del pH, de hecho se pueden obtener buenos geles entre valores
de pH de 2,5 y 6,5, pero requieren calcio en una concentración adecuada que
varía entre 0,01 y 0,1% p/p en base húmeda. Una mayor concentración de calcio
puede conducir una sinéresis excesiva. Los geles de pectina son unas
estructuras acuosas en el cual los polímeros están completamente disueltos y
homogéneo. Unas partes de la cadena molecular están unidos por cristalización
limitada en donde el agua, el azúcar y otros solutos de los alimentos convergen
entre sí, para formar una red tridimensional.
Longitud de las Cadenas.
Determina la consistencia del gel y está por lo tanto íntimamente relacionada con
el poder gelificante.
Peso Molecular.
Debido a la complejidad de su estructura el peso molecular de la pectina
está comprendido entre 50.000 y 180.000 daltons (Sinha y Kumria, 2001).
Acción de las Bases.
La adición de NaOH forma primero las sales de carácter ácido, luego los
pectinatos neutros y por último se produce el fenómeno de metoxilación o sea
desdoblamiento de los ésteres metílicos. Los grupos éster pueden ser separados
de la molécula aun a baja temperatura, sin despolimerización.
Acción de los Ácidos.
Las soluciones acidas solubilizan la protopectina, por esta razón se utiliza
medio ácido controlado en la extracción de la pectina; incrementan la velocidad
22
de separación de los metoxilos, si su efecto es prolongado se afectan los enlaces
glicosídicos 1 – 4 y se pueden romper y formar sustancias inhibidoras del
proceso como el ácido luvulinico e hidroximetilfurfural, esto ocurre a un pH
fuertemente ácido, temperaturas altas y tiempos largos de exposición al acido, se
produce la descarboxilación con formación de CO2 y furfural (MC Cready y
Owens 1944). A bajas temperaturas predomina la saponificación y altas
temperaturas la despolimerización (Walton y Sinclair 1984).
Acción de las Enzimas.
Sobre estos compuestos puede actuar la enzimas tales como:
pectinmetilesterasa (PME) y la poligaractunosa (PG). La PME rompe los enlaces
de los grupos carboxilo esterificados con metanol, liberando los grupos ácidos y
el metanol, y la PG hidroliza las uniones del ácido galacturónico, reduciendo la
masa molar, cambiando así todas las propiedades que debe tener este producto.
Estas enzimas pectinolíticas son secretadas por hongos y bacterias, para
obtener industrialmente pectinas con propiedades especiales, tales como el
grado alimenticio o farmacéutico (Contreras, Banda y Montañez 2003).
1.2.3 Métodos de Obtención de las Pectinas de la Cascara de Banano
Maduro.
La extracción de pectina de la cáscara de banano mediante hidrólisis ácida
es el principal y más utilizado procedimiento industrial de obtención de ésta, a
pesar que en los últimos años se están realizando estudios de extracción de
pectina por métodos enzimáticos y microbiológicos.
El proceso ácido, consiste en someter a las cascaras a un tratamiento
hidrotermico en medio ácido, luego se filtra y purifica, para separar la pectina
presente del resto de compuestos de la cáscara, para luego deshidratarla y
reducir su tamaño de partícula hasta tener un fino polvo, soluble y listo para ser
utilizado como agente gelificante en la industria. En la actualidad se utilizan varios
23
métodos de obtención de pectina, a escala industrial el más utilizado es la
hidrólisis ácida.
Hidrolisis Enzimática de la Cáscara de Banano para la Obtención de Pectina.
Según Rivadeneira y Cáceres (1999) uno de los métodos más inocuos para la
obtención de pectina en el cual no se utilizan sustancias químicas para la
obtención de este producto, es la bioconverción mediante la utilización de enzimas
producidas por el hongo Trichoderma harzianum, cuyo proceso se desarrolla de la
siguiente manera:
Recepción de la Materia Prima.- Esta etapa del proceso consiste en seleccionar
la cáscara de banano maduro según el criterio práctico de evaluación de estado
de madurez y estado de descomposición, es decir, en óptimo estado de madurez,
sanos y sin daños mecánicos.
Tratamiento de la Materia Prima.- La cáscara se lava con agua potable y
posteriormente, se realiza lavados sucesivos con agua destilada a 60°C, con el fin
de eliminar restos de pulpa, látex e impurezas presentes sobre la superficie. Luego
del lavado, el agua excedente del material se escurre y se tritura este material en
una licuadora industrial, con el propósito de aumentar el área superficial de
contacto con el hongo y facilitar así el proceso de extracción de la pectina.
El material triturado se coloca en un tamiz para lavarlo con agua destilada y
seguidamente, se transfiere a una tela de liencillo donde se presiona para extraer
la mayor cantidad de agua.
Inactivación de Enzimas Pépticas.- Con el fin de aumentar la eficiencia del
proceso de extracción se inactiva térmicamente las enzimas pépticas, usando la
proporción de un litro de agua por cada 300 gramos de la cascaras trituradas,
luego se calienta la mezcla a 95-98ºC por 15 minutos. Una vez inactivadas las
enzimas, responsables de la hidrólisis de grupos éster metílicos (pectinesterasas)
que inducen a la formación de metanol y por ende pectinas de bajo metoxilo; así
24
como, las poligalacturonasas que rompen los enlaces glucosídicos entre las
moléculas poligalactrurónicas, despolimerizando la cadena a fracciones más
cortas hasta llegar al monómero del ácido poligaracturónico (Carbonell, Costell y
Durán 1990). Transcurrido este tiempo, la mezcla se filtra y lava con agua
destilada hasta detectar en el agua de desecho cero sólidos solubles totales
(°Brix), medidos con un refractómetro.
El exceso de humedad en el material se elimina utilizando una tela de
lienzo, y luego se somete a un proceso de deshidratación a 60ºC hasta alcanzar
peso constante, inmediatamente se tritura y envasa herméticamente (Devia 2003).
Diagrama de Flujo para la Obtención de Pectina.
El diagrama de flujo para obtención enzimática de pectina a partir de la
cáscara de banano maduro consiste en 6 etapas, como se detalla en el Anexo
N°19.
El proceso inicia con la selección de la cáscara de banano separando las
que se encuentren en proceso de putrefacción, posterior mente se lava a presión
para eliminar cualquier residuo de pulpa, impureza o material extraño y luego se
lleva en unas canastillas al escaldador donde se le adiciona tres partes de agua
por cada parte de cáscara, es decir, existe una relación de volumen 3:1 y se
calienta durante 15 min a 95 C, proceso que se realiza con el fin de inactivar
enzimas pectinóliticas.
Posteriormente se lleva las cáscaras al molino donde se triturara la materia
prima aumentando el área superficial para facilitar la siguiente operación que es la
hidrólisis enzimática dando uniformidad al ataque enzimático, se adiciona
posteriormente el hongo Trichoderma harzianum, el sustrato estará a
concentraciones superiores al 50%, el proceso se realiza con constante agitación
mecánica (120 rpm) para evitar la sedimentación y degradación del bagazo.
25
Para obtener la pectina se solubiliza en el agua, la solución de la hidrólisis
se pasa por un filtro prensa compuesto por placas recubiertas con mallas con el
fin de evitar el paso del bagazo.
Finalmente, la pectina se concentra en un rota vapor y se envasa en bolsas
de polietileno virgen (Rivadeneira y Cáceres, 1999).
1.2.4. Microorganismo utilizado en la extracción de pectina.
1.2.4.1. Trichoderma harzianum.
Este hongo se lo ha localizado en residuos orgánicos y el suelo, están
acondicionados a diversas condiciones ambientales lo que facilita su amplia
distribución. Esta especie optan habitad secos y cálidos (Vijai, y otros 2014).
Se han identificado variadas especies y cepas, en el cultivo de hongos
comestibles, algunas son inocuas y otras perjudiciales, por lo que su relación
antagónica con los hongos cultivados todavía no está completamente conocida y
varía entre especies y cepas (Seaby 1996). Este hongo también produce
cutinasas que ayudan a mejorar la hidrólisis polietileno (Agnes, y otros 2017).
Esta especie se encuentra dentro de los denominados deuteromicetos o
también nombrados hongos imperfectos donde se incluyen un gran número de
especies de reproducción únicamente asexual, ya sea porque no poseen o no se
conoce su reproducción sexual.
Trichoderma harzianum se especializa por contar con conidióforos
terminados en fialidas, esporas, lisas, hialinas, con un solo núcleo, verdosas
subglobosas u ovoides y colonias de crecimiento rápido de 7 a 9 cm (Gams y Biset
1998). Los conidióforos están muy ramificadas teniendo cada ramificación forma
de ángulo recto con la pequeña rama que la soporta. El conjunto de bifurcaciones
26
posee apariencia piramidal parecida a un pequeño arbusto, morfología
característica y típica de este hongo.
1.2.4.2. Clasificación Científica.
Investigaciones ejecutadas a este tipo de hongo han llevado a la
clasificación científica, que se detalla en el apéndice N° 4.
En el Anexo N° 17 se muestra la microscopia electrónica de barrido de
peritecios inmaduros después de 15 días de inoculación. A. peritecios Inmaduro
(Pi) a partir de paja inoculado con Gibberella zeae solamente. B. peritecios
Inmaduro de paja tratada con Trichoderma harzianum. C. peritecios Inmaduro de
paja inoculado con G. zeae solamente. D. Colapsar peritecios inmaduro de paja
tratada con T. harzianum. Peritecios E. inmaduros de paja inoculadas con G. zeae
solamente. Magnificación F. Superior de peritecios inmaduros a partir de paja
tratada con T. harzianum con hifas y esporas de T. harzianum estrechamente
adherido a la superficie. Bares: A-E = 20 micras, F = 10 micras (µm).
1.2.4.3. Ciclo de Vida.
El hongo inicia su crecimiento y se ramifica como una hifa fúngica típica que
mide de 5-10 µ de diámetro. La esporulación asexual ocurre cuando las esporas
de 3-5 µ de diámetro son liberadas en un gran número.
Además se forman clamidospora (espora de pared gruesa) intercaladas, de
forma individual, aunque a veces dos o más clamidosporas se pueden fusionar.
Dentro del género Trichoderma harzianum (Rifai), se diferenciaron cuatro biotipos
(Th1, Th2, Th3 y Th4), que afectan al cultivo de hongos comestibles.
Los biotipos fueron caracterizados por el porcentaje del crecimiento micelial
y la apariencia de la colonia, además por las tipologías morfológicas a nivel
microscópico, en donde se incluye también las fiálides y fialósporas. Th2 Y Th4
27
son los biotipos más incidentes y altamente virulentos en las plantas de hongos
comestibles, y los biotipos Th1 y Th3 pueden infestar la composta del hongo pero
raras veces causan pérdidas (Doyle 1991, Rifai 1969).
1.2.4.4. Mecanismo de Acción.
El hongoTrichoderma harzianum posee la característica filamentosa cuyo
interés radica en la generación de metabolitos primarios (celulasas, quitinasas,
xilanasas) y secundarios (aromas), así como agente de control biológico.
Una de las técnicas más empleadas a nivel industrial, es la aplicación de
cepas liofilizadas, como punto de partida en el desarrollo del inóculo. Los hongos
son principalmente sensibles al proceso de liofilización (Soina, y otros 1995).
1.2.4.5. Temperatura de Incubación.
El proceso de incubación requiere de una temperatura de 25 a 30º C que es
la temperatura óptima para el desarrollo de estos hongos, por lo cual es necesario
el uso de la climatización (incubadoras), por encima o por debajo de estos
parámetros no se garantiza estabilidad en el desarrollo del microorganismo y
aumentan las contaminaciones. El tiempo de incubación esta entre los 4 y 6 días
(Sandle 2014).
28
CAPÍTULO 2
ASPECTOS METODOLÓGICOS
2.1. Métodos.
2.1.1 Modalidad y Tipo de Investigación.
Al conocer las composición química de la cáscara de banano maduro y el
mecanismo de acción del hongo Trichoderma harzianum, se describió todas las
etapas del proceso, sus características, parámetros y productos que se forman
durante el proceso de obtención de pectina.
El diseño de investigación utilizado fue el descriptivo porque se manipularon
las variables que intervinieron en el proceso de hidrolisis enzimática
(concentración de sustrato y concentración de Inóculo) con el propósito de
establecer la influencia que poseen los dos factores en la producción de pectina, la
agitación mecánica se la realizo cada hora por el lapso de 1 minuto a 120 rpm.
2.1.2. Métodos.
El método utilizado en la presente investigación fue de carácter
experimental, debido a que se manipuló las variables: concentración de sustrato y
concentración de inóculo, obteniéndose como variable respuesta, la concentración
de pectina obtenida en el proceso de hidrólisis enzimática de cáscara de banano
maduro.
2.2. Variables.
2.2.1. Variable Independiente.
- Concentración de sustrato.
- Concentración de inoculo.
2.2.2. Variable Dependiente.
- Cantidad de pectina obtenida.
29
2.2.3. Operacionalización de las Variables.
TIPO DE VARIABLE
DEFINICIÓN
OPERACIONAL
DIMENSIONES
INDICADORES
TIPO DE
MEDICIÓN
INSTRUMENTOS
DE MEDICIÓN
IND
EP
EN
DIE
NT
ES
Concentración de sustrato.
Concentración de
inóculo.
Concentración de cáscara de banano maduro (%).
Concentración de
conidios del Trichoderma harzianum (g/L)
Características
físico químicas y microbiológicas de la cáscara de banano maduro.
Efectividad del
Trichoderma harzianum en la hidrólisis enzimática.
Composición
de la cáscara de banano maduro.
Grado de
hidrólisis de la cáscara de banano.
Cuantitativo
Análisis de laboratorio (determinación de ceniza, humedad, carbohidratos totales, látex).
Análisis de
laboratorio (medición de pH).
DE
PE
ND
IEN
TE
S
Cantidad de
pectina obtenida.
Recuperación de la cantidad de pectina obtenida.
Grado de
gelificación de la pectina.
Prueba sensorial de la pectina.
Porcentaje de
metoxilos presentes en la pectina.
Porcentaje de aceptación de la pectina.
Cuantitativo
Cualitativo
Análisis de
laboratorio (cuantificación).
Encuesta a los
potenciales consumidores.
30
2.3. Estadística Descriptiva o Inferencial.
Mediante este método estimaremos los parámetros (variables) que se
manipularon durante el proceso de hidrólisis enzimática y en función de los datos
obtenidos se realizó análisis de varianza y contraste de la hipótesis planteada
para la obtención de pectina a partir de la hidrólisis enzimática de la cáscara de
banano maduro, realizando un análisis de varianza (ANOVA) y comparación
múltiple de Tukey.
2.4. Población y Muestra.
2.4.1. Población.
El Universo está constituido por la empresa DIANA-FOOD ECUADOR S A
ubicada en la provincia de El Oro, cantón Pasaje, parroquia la Peaña, siendo el
lugar donde se obtendrá las muestras objeto de estudio.
2.4.2. Muestra.
El tipo de muestreo fue aleatorio simple, en donde se tomó 10 kilogramos
por muestra de cáscara de banano maduro.
2.5. Técnicas de Análisis de Datos.
Para poder aprovechar íntegramente la cáscara de banano, fue necesario
someterlo a un proceso hidrotermico de escaldado a 95 °C por 15 minutos, luego
la reducción de tamaño de partícula mediante molienda y posterior hidrólisis
enzimática, utilizando las enzimas secretadas por T. harzianum (β-1,3- glucanasa)
(Mohammed, y otros 2004) capaces de promover una separación selectiva de sus
componentes poliméricos (celulosa y hemicelulosa).
31
La separación de los principales componentes de la cáscara de banano se
la realizó mediante trituración mecánica (molienda), la hidrólisis de la celulosa y
hemicelulosa mediante el método biológico. El tratamiento se realizó en función
del grado de separación requerido y de la finalidad del proceso de obtención de
pectina. No obstante para que el proceso sea económicamente rentable, debe ser
eficiente desde el punto de vista energético, químico, y promover una conversión
efectiva de los carbohidratos de interés, evitando su degradación, y obteniendo un
alto rendimiento de producto final.
Proceso de Obtención de la Pectina.
El proceso de obtención de la pectina se realizó en tres etapas, a
continuación se detalla las etapas del diagrama de flujo de la obtención de pectina.
Pre Tratamiento.
La cáscara de banano maduro fueron seleccionadas por su alto contenido
de pectina total, fueron tratadas previamente; se molieron en tamaño de partícula
de 0.5 mm y se colocaran en un bioreactores experimentales, con un litro de agua
destilada, a una temperatura entre 85 y 95°C durante 15 minutos, con la finalidad
de inactivar las enzimas pectinesterasas que hidrolizan los grupos de ésteres
metílicos, formando metanol y pectinas de menor metoxilo; inactivando también la
poligalacturonasa que desdobla los uniones glucosídicos entre moléculas
galacturónicas, despolimerizando la cadena a fracciones más cortas y, finalmente,
llegando al ácido galacturónico (Carbonell, Costell y Durán 1990).
Mediante una maya metálica se separó las cascaras escaldadas del agua
caliente, extrayendo la mayor cantidad de agua posible y lavando el sólido varias
veces con agua destilada, para eliminar los azúcares y flavonoides. Este proceso
se repitió por tres veces más.
32
Extracción de la Pectina y Acondicionamiento Final.
El proceso de extracción y acondicionamiento final de la pectina de la
cáscara de banano se realizará en varias etapas. Se empleara el hongo
Trichoderma harzianum como productor de enzimas celulosas, el medio
permaneció por 48 horas a agitación mecánica cada hora 1 minuto a 120 rpm.
Luego se filtró en un tamiz de 400 µm, A la solución se la concentrará en
una rota vapor al vacío hasta peso constante.
Caracterización de la Pectina.
La calidad de la pectina se determinara por sus propiedades fisicoquímicas
sobre la base del porcentaje de metoxilos (Carbonell, Costell y Durán 1990),
grado de metoxilación (Gee, Mccomb, McCready, 1958; 23,72-75), pH,
humedad (AOOAC 1990), cenizas totales (AOAC, 1984), viscosidad relativa
(Gierselmer, 1997: 171-185).
Determinación de Carbohidratos Totales.
Método de fenol-sulfúrico.
Este método propuesto por Dubois et al en 1956 se fundamenta en que los
carbohidratos son particularmente sensible a ácidos fuertes y altas temperaturas.
Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar
empezando con una deshidratación simple, si se continúa el calentamiento y la
catálisis ácida se producen varios derivados del furano que condensan consigo
mismos y con otros subproductos para producir compuestos coloridos producto de
la condensación de compuestos fenólicos y con heterociclos con el nitrógeno
como heteroátomo. La condensación más común es con fenol. Este método es
fácil, eficaz y rápido.
33
Todos los azúcares como oligosacáridos y polisacáridos pueden ser
determinados, recordando que éstos bajo hidrólisis ácida producen
monosacáridos. La forma en que procede la reacción no es estequiométrica y
depende de la estructura del azúcar, por lo tanto se realiza una curva patrón.
Determinación de Lignina.
Se denomina como lignina al residuo insoluble que queda después de un
ataque ácido del alimento, y se determina según la norma ANSI/ASTM (American
National Standard Institute, 1977a).
Reactivos:
– Ácido sulfúrico al 72% (H2SO4).
Procedimiento:
Se pesó 1 gramo de muestra (P1), con precisión de 0,0001 g, se mezcla
bien con 15 ml de H2SO4 al 72% y se deja reposar 12-24 horas.
Se transfiere el contenido del vaso a un matraz de 1.000 ml y se añaden
560 ml de agua desionizada para pasar de H2SO4 72% a H2SO4 3%. El matraz se
conecta a un refrigerante y se mantiene a ebullición durante 4 horas en una manta
calefactora, al cabo de las cuales se deja sedimentar el sólido y se filtra en una
placa filtrante, previamente secada en estufa a 105 ºC y pesada (P2).
El sólido filtrado se lava con abundante agua desionizada caliente hasta
que el pH del agua de lavado no sea ácido, se seca en estufa a 105 ºC durante 12
horas y se pesa (P3). Se toman unos 100 mg del sólido seco y se calcinan en
mufla a 430 ºC durante 24 horas, obteniéndose así su porcentaje en materia
orgánica (MOlig). El contenido en lignina se calcula con la siguiente expresión:
Lignina (%) = [(P3 – P2) x (% MOlig) x 100] / [P1 x (100 – % H)]
34
Donde % H es el porcentaje de agua respecto a muestra liofilizada y molida.
Determinación del Grado de Esterificación.
Este indicador de localidad de las pectinas se lo calculo basándose en el
método de valoración de Schultz, (1965). Para ello se considerara como
valoración A, el volumen gastado de NaOH 0,1 N durante la acidez titulable en la
muestra ensayada.
Seguidamente, se añadirá 20 ml de NaOH 0,5 N y se dejará reposar por 30
minutos hasta que ocurra la desterificación de la pectina. A continuación se
agregaron 20 ml de HCL 0,5 N para neutralizar el NaOH. Finalmente la dilución se
valoró con NaOH 0,1 N (valoración B).
El grado de esterificación (DE)
Grado de Gelificación.
Expresada como la cantidad de azúcar (sacarosa) que gelificará una parte
de pectina para obtener una firmeza dada bajo condiciones establecidas de pH =
3,2 – 3,5; de 65 a 70°Brix y pectina dentro de los límites de 0,2 a 1,5 %.
Para esta prueba, se preparara una escala entre 0,4 a 1,4 g de pectina,
éstas se incluyen a vasos de precipitación de 200 ml de capacidad, luego se
adicionará a cada vaso 50 ml de agua destilada y se lleva a ebullición hasta la
disolución completa de la pectina, luego se agrega 100 g de azúcar blanca se
diluye completamente y se agregara agua hasta peso de 150 g, finalmente se
adicionara ácido cítrico hasta obtener el pH adecuado (3,2 – 3,5), estos geles se
dejaran reposar por 24 horas y luego se procederá a desmoldar evaluándose las
características de cada uno de ellos en forma visual para calcular el grado de
gelificación. Se elegirá el gel que presenta las características más apropiadas y se
aplicara la siguiente fórmula:
35
Porcentaje de Metoxilos.
Contenido de metoxilos: se basa en las determinaciones de la Valoración B
del grado de esterificación (A. Ferreira 2007), y se calculara por medio de la
fórmula:
Donde 31 es el peso molecular del metoxilo (CH3O-)
pH.
En un vaso de precipitado se vacía un volumen de 50 ml de cada muestra,
se agregara una barra de agitación y se pondrá en una parrilla de agitación.
Se introducirá el electrodo en la muestra de manera que no toque el fondo para
permitir la agitación. Esta medición se reitera con otro volumen igual de muestra.
Las lecturas no deben diferir por más de 0,1 unidades de pH (Ramirez y
Mendoza Cantu 2008).
Finalmente, se registran y anotan los valores del pH junto con la
temperatura de las muestras.
Humedad.
El porcentaje de humedad en las muestras de pectina obtenidas será
determinado mediante secado en un desecador automático (termostabil C2) con
circulación de aire, a 30°C hasta obtener un peso constante (Hart y Fisher, 1984).
36
Cenizas Totales.
Se estimaran según el método general descrito por Hart y Fisher, (1984).
Para la determinación de cenizas totales se pesaran 2 g de cada una de las
muestras de pectinas obtenidas a cada uno de los valores de pH y tiempos de
hidrólisis establecidos para el ensayo. La fuente de calor o mufla donde se
realizara la incineración se regulo a 550 °C, hasta que las cenizas adquirieron un
color blanco o grisáceo.
El porcentaje de cenizas totales se calculará de la siguiente manera:
Viscosidad Relativa.
La viscosidad de las soluciones de la pectina depende de varios factores
como principalmente del grado de metoxilación, temperatura, pH, presencia de
sales y su concentración, al disminuir la concentración o el grado de metoxilación,
la viscosidad aumenta (Alcalá 1980).
Cociente que se obtendrá comparando la viscosidad n1 de un líquido con la
viscosidad n2 de otro líquido expresado en número absoluto.
D= Densidad del líquido
T= Tiempo de escurrimiento
37
n2= es una viscosidad de un líquido conocido por ej. 0.01 poise (agua)
n1= viscosidad del líquido problema.
Acidez Titulable.
Al someter una muestra de pectina con una base para la determinación de
su acidez, se debe realizar evitando el exceso de esta base ya que se podría
saponificar algunos de los grupos éster de la pectina. Lo cual nos arrojaría valores
elevados para la acidez titulable. La saponificación de la pectina puede aparecer
cuando el grado de alcalinidad de la solución es menor que cuando la
fenolftaleína se torna de color, es muy importante encontrar el punto adecuado en
el cual la acidez pueda ser titulada.
La determinación de la acidez libre de las pectinas, se empleó un indicador
con un cambio muy cercano a un pH de 7.5 y una mezcla de indicadores con un
cambio (Carreto y Quiroz 1984) notable de amarillo a violeta, este pH ha sido
adaptado pues da los mejores resultados.
La mezcla que se utilizará está compuesta de la siguiente manera,
utilizando las sales de sodio de las sustancias:
- Azul de bromotimol (0.4%)
- Rojo de fenol (0.4%)
- Rojo de cresol (0.4%)
- Agua destilada
- 1 volumen
- 3 volúmenes
- 1 volumen
- 1 volumen
Sin embargo la acidez titulable puede variar muy ampliamente y es evidente
38
que está afectada en gran parte por los métodos de extracción y purificación de
las pectinas.
Solubilidad.
La solubilidad de la pectina se determina en 20 partes de agua y forma una
solución coloidal opalescente, de fácil fluidez, ácida al papel tornasol e insoluble
en alcohol o en alcohol diluido y en otros solventes orgánicos (Joseph 1980).
En las pectinas la solubilidad va incremento de acuerdo al grado de
esterificación y con un decrecimiento en su peso molecular.
Cuando las pectinas han sufrido esterificación no son precipitadas por
electrolitos, son estables en condiciones ligeramente ácidas, pero inestables en
bases y ácidos fuertes. La solubilidad de la pectina es menor cuando el tamaño
de la cadena aumenta y el contenido de metoxilos es bajo (Askel 1987).
Pectinas que poseen un porcentaje de esterificación del 20% son
precipitadas por soluciones de cloruro de sodio, con un porcentaje de
esterificación del 50% por soluciones de cloruro de calcio, y con una grado del
70% precipitan con el cloruro de aluminio o cobre (Askel 1987).
Análisis Sensorial.
Prueba de Aceptación/Rechazo.
La manera de conocer la información de la aceptación que tiene el producto
consiste en realizar una pregunta dicotómica, la cual fue una respuesta binaria del
39
consumidor habitual de mermelada de durazno. Este método fue la alternativa
para aumentar la eficiencia del estimador dicotómico.
La aplicación dando al analista semienterrado una pregunta al cual debe
responder me gusta o no me gusta. Si responde Me gusta entonces la otra
pregunta recibirá un valor inferior.
Si responde No me gusta a la primera pregunta, recibe un valor inferior
sobre el cual se decide (Camerón y Kolstad 1987). A continuación se presenta el
modelo de encuesta aplicado al análisis sensorial de la mermelada de durazno
donde la variable manipulada fue el tipo de pectina utilizado.
Protocolo de la Evaluación Sensorial.
La mermelada se retiró del almacenamiento en frío y se dejó calentar a
temperatura ambiente el día de la evaluación. Los recipientes que contenían las
muestras fueron enumerados.
Cuatro muestras se presentaron a cada panelista por día de evaluación. Se
entregó las muestras en platos de poliuretano con tapa, que contienen la
mermelada, las cuales fueron etiquetadas con números aleatorios de cuatro
dígitos. La evaluación sensorial se llevó a cabo en la Unidad Académica de
Ciencias Químicas y de la Salud – alumnos de la carrera de ingeniería en
alimentos, donde se equipó con cabinas sensoriales para ayudar a aislar a los
panelistas de interrupciones externas y con rojo iluminación en las cabinas para
disminuir el impacto potencial de diferentes peelings color en los resultados. Los
panelistas sensoriales son estudiantes del noveno semestre de la carrera de
ingeniería en alimentos, y la mayoría tenía experiencia previa en la evaluación
sensorial en productos relacionados de otros productos hortícolas. Hubo 10
panelistas por cada día de prueba de evaluación por productos que se evalúan.
Se dieron instrucciones para enjuagar la boca con agua entre muestras. Para cada
muestra de mermelada se calificaron dada en simpatía general utilizando una
escala dicotómica (me gusta o no me gusta). Por consenso, los panelistas
40
aceptaron adherirse a los siguientes método de evaluación de la muestra: levantar
la tapa y evaluar el aroma en 1 o 2 olfateos, tome 1 cucharadita (28 g) de muestra
en la boca y evalúe la textura, tome otra 1 cucharadita de muestra en la boca para
evaluar el sabor, y tragar o expectorar la muestra y evaluar después de los
atributos de sabor (Tiparat, Robert y Heather 2018). El color, sabor, olor y textura
fueron evaluados colocando los dos tipos mermelada (mermelada con pectina
obtenida a partir de la cáscara de banano y mermelada con pectina comercial.
"Además, los panelistas fueron consultados si la muestra probada influiría en
cómo compran mermelada en el futuro. Como parte del perfil de cada panelista el
grado de acidez y dulzor de la mermelada también se registraron (Obenlanda,
Campisi-Pinto y Arpaia 2018).
2.6. Diseño Experimental.
El diseño de la investigación fue de carácter descriptivo (describe
situaciones, se observa y se define con precisión el mejor tratamiento aplicado a
la obtención de pectina a partir de cáscara de banano maduro), experimental [Se
realizó doce (12) hidrolizados enzimáticos, correspondiente a un diseño
experimental completo al azar, resultantes de considerar dos factores
(concentración del sustrato y concentración de inoculo y dos niveles para el factor
A y dos para el factor B)].
El modelo estadístico es un diseño completo al azar con un arreglo
factorial 2X2, en condiciones de temperatura ambiente de la ciudad de Machala
(25 - 30°C), en donde por cada factor se multiplico por 2 niveles, resultando así
un total de 4 tratamientos, cada tratamiento fue por triplicado resultando un total
de 12 tratamientos.
Se prepararon medios de cultivo (cáscara de banano molida y agua
purificada) a concentraciones de 40% y 50% en un recipiente de vidrio de 2000 ml
de capacidad, luego se esterilizó a 121°C por 15 minutos, luego se trasvasaron en
41
bioreactores experimentales de 4 litros de capacidad y se inoculo conidios del
hongo Trichoderma harzianum en concentraciones de 1 g/L y 1,5 g/L, inicialmente
se varió la concentración del inoculo manteniéndose la concentración del sustrato
en un valor constante, posteriormente se varió la concentración del sustrato
manteniendo la de los inóculos. Cada tratamiento tuvo tres repeticiones
obteniéndose un total de doce (12) hidrolizados de cáscara de banano, como se
detalla en la Tabla N° 2.
El pH se mantuvo entre 6,49 – 4,2 que es el rango de acción del
Trichoderma harzianum. La agitación se realizó cada hora por 1 minuto (120 rpm)
empleando un agitador magnético a temperatura ambiente.
Después de la hora 12 se tomaron muestras del medio cada 12 horas para
realizar lecturas de pH y concentración de oxígeno disuelto durante 60 horas que
transcurrió el proceso de hidrolisis enzimática.
Factor A: Concentración del sustrato (%)
Factor B: Concentración del inóculo (g/L)
X = % de pectina obtenida.
T1= 40% de sustrato y 1 g/L de inóculo;
T2= 40% de sustrato y 1,5 g/L de inóculo
T3= 50% de sustrato y 1 g/L de inóculo;
T4= 50% de sustrato y 1,5 g/L de inóculo.
42
2.7. Cronograma de Actividades.
Meses/ Semanas
Actividades
Octubre Noviembre Diciembre Enero
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Des
arr
oll
o y
en
tre
ga d
e
trab
ajo
de
tit
ula
ció
n
Desarrollo del trabajo de titulación X X X
Análisis e interpretación de datos X X X
Culminación del trabajo de titulación X X
Desarrollo y culminación del artículo científico X X X X
Recepción de artículo científico X
Recepción de trabajo de titulación concluido X
Su
ste
nta
ció
n f
inal
y d
ec
lara
ció
n d
e
Ap
to
Designación de tribunal de sustentación de tesis - CP X
Emisión de resolución X
Entrega de resoluciones a docentes X
Sustentación del trabajo de titulación X
Recepción de informes de sustentación X
Aprobación de informes de sustentación y declaración de Apto (A) – CP
X
Emisión de resolución X X
Entrega de empastados, repositorio y CD´s X
43
RESULTADOS.
Caracterización Fisicoquímica.
Las características físico químicas de la cascara de banano maduro se
pueden observar en la gráfica N°1. Es evidente la presencia mayoritaria de
humedad con un 82,68% ±2,23, seguido de un 14,36% ±1,1 de carbohidratos
totales que están conformados por lignina, hemicelulosa y celulosa.
Gráfico N° 1. Caracterización fisicoquímica de la cáscara de banano maduro
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
Caracterización Microbiológica.
A continuación en la Tabla N°1 se muestra la calidad microbiológica de la
cáscara de banano maduro utilizada para la obtención de pectina. En base a ella
la cáscara de banano maduro cumple con los requisitos microbiológicos
establecidos por el Codex alimentarius para frutas frescas.
Ceniza Humedad Carb Totales Latex
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
14,36 ± 1,1
Lignina 45%
Hemicelulosa 25%
Celulosa 30%1,73 ± 0,11
82,68 ± 2,23
1,3 ± 0,09
Po
rcen
taje
(%
)
Componentes
44
Tabla N° 1. Cuantificación de la flora microbiana presente en la cáscara de banano maduro
Microorganismo Resultado UFC/G
LMP
Codex Alimentarius
Aerobios mesófilos 10 103
Coliformes totales 5 103
Hongos Ausencia Ausencia
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
Medición del pH durante la Hidrólisis Enzimática de la Cáscara de Banano
para la Obtención de Pectina.
Por su parte la Gráfica Nº 2 presenta la disminución del pH durante el
tiempo de hidrólisis de la cáscara de banano maduro, lo cual es evidente en los 4
tratamientos, desde 6,31 – 4,51 unidades de pH en el tratamiento 1; 6,24 – 4,58
unidades de pH en el tratamiento 2; 6,45 – 4,51 unidades de pH en el tratamiento
3; 6,49 – 4,2 unidades de pH en el tratamiento 4, estabilizándose después de 48
horas de hidrólisis en todos los tratamientos.
Gráfico N° 2. Comportamiento del pH durante el tiempo de hidrólisis de la cáscara de banano maduro
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
0 12 24 36 48 60
4,0
4,4
4,8
5,2
5,6
6,0
6,4
6,8
4,5
4,2
T1= 40% de sustrato y 1 g/L de inóculo
T2= 40% de sustrato y 1,5 g/L de inóculo
T3= 50% de sustrato y 1 g/L de inóculo
T4= 50% de sustrato y 1,5 g/L de inóculo
pH
(U
nid
ades
)
Tiempo (horas)
45
Medición de Oxígeno Disuelto Durante el Tiempo de Hidrólisis Enzimática.
En la Gráfica Nº3 se aprecia la medición de la concentración de Oxígeno
disuelto en mgO2/L, al igual que el pH existe una disminución del oxígeno disuelto
en los 4 tratamientos. Este va decreciendo desde un 4,87 - 0,66 mg O2/L en el
tratamiento 1, 4,86 – 0,55 mg O2/L en el tratamiento 2, 4,55 – 0,23 mg O2/L en el
tratamiento 3 y 4,44 – 0,12 mg O2/L en el tratamiento 4.
Gráfico N°3. Comportamiento de la concentración de oxígeno disuelto durante el tiempo de
hidrólisis enzimática
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
A continuación en la Gráfica Nº 4 se muestra los gramos de pectina
obtenidos a partir de 100 gramos de cáscara de banano maduro.
Después de 48 horas de hidrólisis enzimática cuando se estabiliza el pH en
valores de 4,2 unidades de pH y la concentración de oxígeno disuelto hasta
valores de 0,12 mg O2/L, en el tratamiento 4 (50% de sustrato y 1,5 de inóculo),
cesa la hidrólisis de la celulosa y hemicelulosa presente en la cáscara de banano y
0 12 24 36 48 60
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5 T1= 40% de sustrato y 1 g/L de inóculo
T2= 40% de sustrato y 1,5 g/L de inóculo
T3= 50% de sustrato y 1 g/L de inóculo
T4= 50% de sustrato y 1,5 g/L de inóculo
Oxíg
en
o D
isu
elt
o (
mg
/L)
Tiempo (horas)
46
se alcanza un porcentaje promedio de 8,66% de pectina. A continuación en la
Tabla N°2 se presenta el análisis estadístico de la concentración de pectina
obtenida en los 4 tratamientos estudiados.
Gráfico N°4. Cantidad de pectina obtenida luego de la hidrólisis enzimática de la cáscara de
banano maduro
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
Como se puede apreciar en la Tabla Nº 2 si existe diferencia significativa
(p˂0,05) en la producción de pectina a partir de la cáscara de banano maduro, al
aumentar la concentración de sustrato e inóculo aumenta la producción de
pectina.
Por otro lado, en la Tabla Nº 3 se muestra la prueba de comparación
múltiple de Tukey de los 4 tratamientos estudiados.
Tabla N° 2. Análisis estadístico (ANOVA) de la producción de pectina
Fuente Media Varianza N
T1= 40% de sustrato y 1g/l de inóculo 7,68 0,02 3
T2= 40% de sustrato y 1,5 g/l de inóculo 7,73 0,01 3
T3= 50% de sustrato y 1 g/l de inóculo 7,7 0,08 3
T1 T2 T3 T40
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
*0,95
8,66 ±0,21
7,7±0,287,73±0,127,68± 0,14
g d
e P
ecti
na/1
00 g
de C
áscara
Tratamientos
47
T4= 50% de sustrato y 1,5 g/l de inóculo 8,66 0,04 3
F = 17,15574
p = 7,61363E-4
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
Adicionalmente la Tabla Nº 3 nos indica que los tratamientos 1, 2 y 3
alcanzaron medias estadísticamente iguales en la producción de pectina y el
tratamiento 4 difiere de los tres primeros en la producción de pectina, al contener
el tratamiento 3 y 4 la misma concentración de sustrato, se evidencia que el factor
que influye en la producción de pectina es la concentración de inóculo (1,5 g/l).
Tabla N°3. Prueba de comparación múltiple de Tukey 95% HSD
Tratamientos N Media
Grupos
Homogéneos
T1 3 7,68 X
T3 3 7,7 X
T2 3 7,73 X
T4 3 8,66 X
Contraste Diferencia ±Limites
T1- T2 -0,04 0,52
T1- T3 -0,01 0,52
T1 - T4 * -0,98 0,52
T2 - T3 0,03 0,52
T2 - T4 * - 0,93 0,52
T3 - T4 * -0,96 0,52
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
Grado de Gelificación
48
A continuación se muestra el grado de metoxilo de la pectina obtenida y
pectina de comercial.
Como podemos apreciar en la Gráfica Nº 5, si existe diferencia significativa
(p˂0,05) en el porcentaje de metoxilos entre la pectina comercial y la pectina
obtenida a partir de cáscara de banano maduro, las cuales alcanzan una
diferencia del 9,11% en metoxilos y 5,66 minutos de diferencia en el grado de
gelificación entre la pectina comercial y la obtenida, la prueba fue realizada en
mermelada de durazno.
Gráfico N°5. Comparación del grado de gelificación de la pectina comercial y la pectina obtenida
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
Análisis Sensorial.
% Metoxilo Grado de Gelificación % Metoxilo Grado de Gelificación 0
10
20
30
40
50
60
70
5,66 min
* 9,11%
29,33 ± 0,57
58,44 ± 0,92
23,66 ± 0,57
67,55 ± 1,28
PECTINA OBTENIDAPECTINA COMERCIAL
P
o
r
c
e
n
t
a
j
e
49
Mediante la comparación sensorial de la mermelada de durazno con distinto
tipo de pectina, se analizó un “conjunto de características que se pueden
diferenciar entre las distintas formulaciones, lo cual influirá en la aceptación del
producto por parte del analista semi entrenado (estudiantes de ingeniería de
alimentos de la Universidad Técnica de Machala). A continuación en la Grafica
N°6 se muestran los resultados obtenidos en la prueba aceptación-rechazo de las
2 formulaciones estudiadas.
Como se puede apreciar en la Gráfica Nº 6 si existe diferencias detectadas por
los analistas semi entrenados. En lo referente al color de la mermelada, el 66,33%
dice si gustarle el color de la mermelada de durazno con pectina de cáscara de
banano, mientras que al 81% también manifestó que le gusta el color de la
mermelada donde se utilizó pectina comercial, siendo este parámetro donde existe
mayor porcentaje de diferencia (14,67%). A continuación se muestra el análisis de
varianza de todos los 4 parámetros sensoriales analizados mediante un análisis de
varianza (ANOVA).
Gráfico N°6. Análisis sensorial de la mermelada con distintas pectinas (comercial y de
cáscara de banano)
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
Color Olor Sabor Textura Color Olor Sabor Textura0
20
40
60
80
100
64,66
69,66
80,338178
75
86
66,33
Pectina de Comercial
Po
rcen
taje
de A
cep
tació
n (%
)
Pectina de cáscara de Banano
50
Como se puede apreciar en la Tabla Nº 4 si existe diferencia significativa
(p˂0,05) en el color de la mermelada elaborada con la pectina comercial y la
pectina obtenida, al realizar el análisis de varianza obtuvimos una diferencia de
14,67% a favor de la pectina comercial. Los analistas semi entrenados detectaron
las diferencias de olor entre los dos mermeladas, es mínima a favor de la
mermelada con pectina comercial (5,67%).Con respecto al sabor de las dos
mermeladas si existió diferencia significativa (p≥0,05), y en la textura de este
producto, la de mayor aceptación fue la mermelada donde se utilizó como
espesante la pectina de cáscara de banano maduro (78%).
Tabla N° 4. Análisis de varianza de la mermelada de durazno con distinto tipo de pectina
Fuente Media Varianza Repeticiones
Color (P Obtenida) 66,33 0,33 3
Color (P Comercial) 81 4 3
F = 148,92 Dif = 14,67
p = 2,58E-4
Olor (P Obtenida) 86 1 3
Olor (P Comercial) 80,33 0,33 3
F = 72,25 Dif = 5,67
p = 0,001
Sabor (P Obtenida) 75 1,53 3
Sabor (P Comercial) 69,66 0,31 3
F = 53,48 Dif = 5,34
p = 0,001
Textura (P Obtenida) 78 1 3
Textura (P Comercial) 64,66 0,25 3
F = 437,4 Dif = 13,34
p = 3,08E-5
51
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
Prueba de Hipótesis
La prueba de hipótesis se realizó a partir de 4 tratamientos todos por triplicado,
con un tamaño de la muestra igual a 12, y un nivel de confianza de la prueba igual
a 95,0%. Con un total de 12 muestras y una desviación estándar de 1, el
estadístico Chi cuadrado es igual a 44,0. Siendo el valor de p ˂ 0,05, la hipótesis
nula es rechazada en un nivel de confianza del 95,0%.
52
DISCUSIÓN
La caracterización fisicoquímica de la cáscara de banano nos indica que el
14,36% está constituida por carbohidratos totales (celulosa, hemicelulosa y
lignina). Valores similares han sido reportados en la caracterización de este
subproducto (Barros, y otros 2016) y de este valor el 7,9% se encuentra en
capacidad de ser hidrolizado por las enzimas producidas por el hongo
Trichoderma harzianum, según lo manifestado por Gustav, y otros (2015). Por su
parte la cantidad de coliformes totales, aerobios mesófilos y hongos se
encuentran por debajo de los límites máximos permisible como lo establece la
norma INEN 2801 para este tipo de fruta.
El valor de pH alcanzado en el medio de cultivo indica que el hongo
modifica el pH del medio de cultivo lo cual le permite llegar a las regiones óptimas
de hidrólisis enzimática (Salazar, López y Cano 2012) de la cáscara de banano
maduro. Tal es el caso que en el tratamiento 4 desciende desde 6,46 hasta 4,2.
En investigaciones sobre este mismo sustrato se han obtenido valores de hidrolisis
similares (Linde, Galbe y Zacchi 2007).
Luego de 48 horas de hidrólisis enzimática, se estabiliza el pH en valores
alrededor de 4,2 y la concentración de oxígeno disuelto se reduce hasta valores
de 0,12 mg O2/L, en el tratamiento 4 (50% de sustrato y 1,5 de inóculo) y cesa la
hidrólisis de la celulosa y hemicelulosa presente en la cáscara de banano, la
misma que, después de un proceso de secado alcanzó un porcentaje promedio
de 8,66% de pectina. Valores cercanos se han obtenido en sustratos similares
(Mouna, y otros 2016). Tal es el caso del porcentaje de pectina obtenido a partir
de pulpa de manzana utilizando la enzima comercial Celluclast donde se
obtuvieron valores comprendidos entre 8.07 a 18.95% (Wikiera, Mika y Grabacka
2015).
53
Por otro lado, el análisis de varianza (ANOVA) indica que si existe
diferencia significativa (p˂0,05) en la producción de pectina a partir de la cáscara
de banano maduro, al aumentar la concentración de sustrato e inóculo aumenta la
producción de pectina.
El grado de gelificación fue el factor dependiente del porcentaje de
metoxilo que contiene la pectina, lo cual le proporciona interacciones hidrofóbicas,
esto es posible al mezclársela con altas concentraciones de azúcar (Oakenfull
1991, Gopiab, y otros 2014). La diferencia en % de metoxilos alcanzada entre la
pectina comercial y la pectina obtenida a partir de cáscara de banano maduro fue
de 9,11%, teniendo la pectina comercial un tiempo de gelificación de 5,66
minutos más rápido. Para procesos de hidrólisis ácida se han reportado valores
de gelificación similares al obtenido en la presente investigación (Hanna, y otros
2017).
El análisis sensorial de aceptación/rechazo, indicó que el color de la
mermelada de durazno elaborada con pectina de cáscara de banano maduro al
0,5% se vio afectado significativamente (p<0,05), siendo este el único parámetro
sensorial poco aceptado por parte de los analistas semi entrenados.
54
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones:
Mediante la cuantificación de los componentes físico químicos de la cáscara
de banano se determinó que existe un 14,36 ±1,1 % de carbohidratos totales, de
los cuales el 7,9% son hidrolizables (celulosa y hemicelulosa) (Zenab y Ayman
2015), mediante la aplicación del hongo Trichoderma harzianum, el restante
6,46% es lignina un compuesto que no se hidroliza mediante las enzimas
secretadas por el hongo T. harzianum . Por su parte, los parámetros
microbiológicos no superaron los límites máximos permisibles para este tipo de
frutas.
Se logró determinar la efectividad del hongo en la hidrólisis enzimática de la
cáscara de banano, debido a que durante este proceso el pH disminuyó desde
6,37 a 4,45 unidades de pH y el oxígeno disuelto disminuyo de 4,68 a 0,39 mg/L.
Esto se debe a que, durante la formación de pectina se obtienen ácidos orgánicos
como el ácido galacturónico componente principal de este producto. Mientras que,
la reducción del oxígeno disuelto se debe a la reproducción del hongo.
En lo referente al grado de gelificación de la pectina obtenida a partir de la
cáscara de banano se pudo establecer un valor de 58,44% de metoxilo, y un
tiempo de gelificación de 26,33 minutos.
Por otro lado, el análisis sensorial de la mermelada de durazno elaborada con
pectina de cáscara de banano maduro indica que la adición de pectina en un 1%
afecta significativamente el color de la mermelada, lo cual se determinó mediante
una prueba dicotómica de aceptación /rechazo. En la cual el 66,33% de los
panelistas semi entrenados prefirieron la mermelada de durazno con pectina de
55
cáscara de banano, mientras que, para el 81% el color de la mermelada donde se
utilizó pectina comercial tubo mayor aceptación.
Adicionalmente, a partir del 8,66% de pectina, el análisis estadístico nos indicó
que si existe diferencia significativa (p˂0,05) en su producción mediante los 4
tratamientos estudiados, al aumentar la concentración de sustrato e inóculo
aumenta la producción de pectina.
Recomendaciones:
Se plantea que para investigaciones futuras se utilice consorcios de
microorganismo que sean capaces de hidrolizar todos los carbohidratos presentes
en la cáscara de banano maduro e inclusive la lignina para de esta manera
aumentar el porcentaje de pectina que se obtenga de esta materia prima muy
abundante en la provincia de El Oro.
56
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65
ANEXOS
66
Anexo N° 1. Selección de la materia prima
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
Anexo N° 2. Tratamiento térmico de las cáscaras de banano (Escaldado)
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
67
Anexo N°3. Molienda de las cáscaras de banano
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
Anexo N°4. Pesado de la cáscara molida
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
68
Anexo N°5. Pesado de las conidias del hongo Trichoderma harzianum para la inoculación en la solución acuosa de cáscaras de banano maduro
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
Anexo N°6. Medición del pH del hidrolizado de cáscaras para la obtención de pectina
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
69
Anexo N°7. Separación mediante filtración de los residuos de cáscara de banano no hidrolizados
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
Anexo N°8. Secado de la pectina
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
70
Anexo N°9. Molienda de los residuos seco del proceso de hidrólisis
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
Anexo N°10. Tamizado de la pectina de cascara de banano
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
71
Anexo N°11. Envasado de la pectina de cáscara de banano
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
Anexo N° 12. Estructura del almidón.
Fuente: Editorial El Ateneo. López y Suárez, 2002.
72
Anexo N°13. Fórmula Química de la Celulosa.
Fuente: Biotechnology and Bioengineering 67. Méndez, 2008.
Anexo N° 14. Fórmula Química de la Hemicelulosa.
Fuente: Applied Biochemistry and Biotechnology. 124. Laureano, y otros ,2005.
73
Anexo N°15. Fórmula Química de la Lignina.
Fuente: Biochemicals and Biofuels;Lu y John 2010
Anexo N°16. Fórmula Química de la Pectina.
Fuente: Revista de química, vol 5. Tapia,N, 2003.
74
Anexo N° 17. Trichoderma conidias (esporas asexuales).
Fuente: Departamento de Agricultura de EE.UU.
Anexo N° 18. Diagrama del Proceso de Obtención de la Pectina.
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017.
Pre tratamiento Hidrolisis Acondicionamiento Materia prima Pectina
75
Anexo N° 19. Diagrama de Flujo para la Obtención de Pectina
Fuente: ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL - A CENTRO DE INVESTIGACIÓN
CIENTÍFICA Y TECNOLÓGICA . Rivadeneira y Cáceres 1999.
Anexo N°20. Análisis de las medias a un nivel de confianza del 95%
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
Tratamientos
Analisis de Media95% Limite de Desición
Me
dia
UDL=8,25
CL=7,94
LDL=7,64
T1 T2 T3 T4
7,6
7,8
8
8,2
8,4
8,6
8,8
9
Lavado Selección de La cáscara
Molienda Inactivación Enzimática (95°C, 15 min)
Hidrolisis Enzimática
Filtración Concentración Envasado
76
GLOSARIO DE TÉRMINOS
Pectina: es un polisacárido que se encuentra en la mayoría de las frutas y
que, tratado químicamente, se utiliza en la industria alimentaria para dar
consistencia a mermeladas y gelatinas: pectina de cáscara de maracuyá.
Trichoderma harzianum: Son una especie de hongos cosmopolitas y
típicamente del suelo que pueden ser llevados a sustratos en el cultivo de hongos
comestibles (Klein y Eveleigh, 1998).
Celulosa: es un polisacárido en forma de fibra vegetal que al ser observada
en el microscopio es similar a un cabello humano, cuya longitud y espesor varía
según el tipo de árbol o planta.
Hemicelulosa: es un polímero con cadenas largas sin ramificaciones de β-
D-Glucosa y se distingue del almidón por tener grupos -CH2OH alternando por
arriba y por debajo del plano de la molécula
Lignina: es un compuesto intercelular incrustante o cementante de las
células fibrosas de los vegetales. Se concentra en la lámela media y funciona
prácticamente como relleno para impartir rigidez al tallo de la planta. El segundo
elemento en importancia de la composición vegetal.
Inóculo: Suspensión de microorganismos que se transfieren a un ser vivo o
a un medio de cultivo a través de la inoculación.
Enzimas: son proteínas que catalizan reacciones químicas en los seres
vivos. Los enzimas son catalizadores, es decir, sustancias que, sin consumirse en
una reacción, aumentan notablemente su velocidad.
Celulosas: son glicosil hidrolasas, y utilizan dos mecanismos de hidrólisis
del enlace glucosídico que generan dos posibles configuraciones estereoquímicas
finales.
77
Hidrolisis enzimática: esta reacción se efectúa mediante la ruptura de
enlaces por agua según: H-OH + R-R’ → R-H + R’-OH.
ANOVA: se basa en la descomposición de la variación total de los datos con
respecto a la media global (SCT), que bajo el supuesto de que H0 es cierta es una
estimación de obtenida a partir de toda la información muestral, en dos partes:
Variación dentro de las muestras (SCD) o Intra-grupos, cuantifica la
dispersión de los valores de cada muestra con respecto a sus
correspondientes medias.
Variación entre muestras (SCE) o Inter-grupos, cuantifica la dispersión de
las medias de las muestras con respecto a la media global.
Anexo N°21. Glosario de términos.
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
78
Anexo N°22.- Certificado del trabajo de campo realizado en el Laboratorio de Tecnología
Farmacéutica I de la Unidad Académica de Ciencias Químicas y de la Salud de la
Universidad Técnica de Machala.
Fuente: Dr. Hugo Ítalo Romero Bonilla, Universidad Técnica de Machala, 2017
79
APÉNDICES
Apéndice N°1
Tabla N° 1. Composición química de la cáscara de banano maduro
Composición de Cáscara de banano maduro
%
Humedad 86,6
Lignina 8,20
Celulosa 4,1
Hemicelulosa 1,1
Fuente: Centro de Investigación en Nutrición Animal - Universidad de Costa Rica.
Apéndice N°2
Tabla N° 2. Diseño de las condiciones de la hidrólisis enzimática de la cáscara de banano maduro
N
I
V
E
L
E
S
Factor A = % de
Cáscara de banano
Factor B =
Concentración de
Inóculo (g/L)
Rep Rep. Rep. Total
A1 = 40 % B1 = 1 X X X 3
B2 = 1,5 X X X 3
A2 = 50 % B1 = 1 X X X 3
B2 = 1,5 X X X 3
Total 4 4 4 12
Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017
80
Apéndice N°3
Tabla N° 3. Modelo de la prueba dicotómica.
Mermelada Parámetros Sensoriales
Pectina Obtenida Color Olor Sabor Textura
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Pectina Comercial Color Olor Sabor Textura
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Elaborado por Dr. Jorge Diaz Armijos, 2017.
Apéndice N°4
Tabla N° 4. Clasificación científica del hongo Trichoderma harzianum
Reino Fungí
División Ascomycota
Subdivisión Pezizomycotina
Clase Sordariomycetes
Orden Hypocreales
Familia Hypocreaceae
Género Trichoderma
Especie T. harzianum
Nombre binomial Trichoderma harzianum
FUENTE: (Yedidia, Benhamou y Chet 1999).
