DOCTORADO EN CIENCIAS YBIOTECNOLOGIA DE PLANTAS

Estudio sobre el cultivo /.n v/.fro de embriones cigóticosde cocotero (Cocos nuci.fera L.)

Tesis que para obtener el grado deDoctor en Ciencias presenta:

M. C. América Amelia Earth Pech y Aké.

Centro de lnvestigación Científica de Yucatán, A. C.

Mérida, Yucatán, México

2004 :.._j->-

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tt``3S,

CONTENIDO

Agradecimientos

bedicatorias

Lista de tablas

Lista de figuras

Lista de abreviaciones

Resumen

Abstract

lNTRODUCCIÓNCAPITULO 1. Antecedentes1.1

1.2.

EL COCOTERO

1.1.1. Descripción taxonómica

1.1.2. Origen y distribución mundiai

1.1.3. Variedades de cocotero

Ía/ Las variedades altas de cocoteroíb/ Las variedades enanas de cocotero ...,...

1.1.4. El cu¡tivo del cocotero

1.1.5. Usos del cocotero

i.i.6 Prob¡emática del cocotero en México yrecomendaciones

EL AL y estrategias para su control

1. 2.1. Control integral del AL

i. 2.2. Germoplasmaresistentea!ALen México .....

EL problema de la introducción de nuevos genotipos aMéxico y como enfrentarlo1.3.1. Transporte seguro de germoplasma .......

El embrión cigótico de[ cocotero y su cultivo /'n v/.fro ......

1.4.1 Aspectos generales del embrión

1.41.1 La germinación

1.4.12 Germinación del fruto de cocotero .......

i.4.i.3 Requerimientode02para lagerminación

1.4. t4

1.4.1.5

Reguladores de crecimiento en lagerminación

Las giberelinas y la inducción de procesosmetabólicos en la germinación ......

1.5. La técnica del cultivo /.n vi.fro de embriones cigóticos .,,...,

15.1

1.5.2

1 _5_3

1. 5.4

1.5.5.

1. 5.6.

1.5.7

1.5.8

1.6.

Historia del cultivo /.n v/.Ím de embriones cigóticos .....

Germination /.n v/.íro de embriones cigóticos decocotero (cocos nucifera L)Limitantes de los protocolos actuales para cultivo /.nvi.fro de embríones cígóticos de cocotero ..,....Factores que afectan a la germinación del embrión Í.n

1.5.4`1. Calidaddelembrión (gradodedesarrolloymadurez)

1.5`4.2 Mediodecultivo

Conversión a plántulaDesarrollo de las plántulas /.n vtt/o .......Sobrevivencia de las plántulas en condíciones Ex

Alternativas para incrementar la eficiencia del cultívo/.n vÍ.íro de embriones cigótlcos de cocotero .......

Hipótesis y Objetivo§

1.6.1

1.6_2.

Objetivos1.6.1.1 Objetivo general1.6.1.2 0bjetivos específicosHipótesís

CAPITUL02. Wlejoramiento de la respiración aeróbica en lagerminación de embriones y cultivo /.n vt.rroCAPITUL03. lvlodificaciones en las condiciones de cultivo /.n vitro parael desarrollo post-germinativo de embriones de cocotero ...... `CAPITUL04. Efecto del ácido abscísico y polietilenglicol en lagerminación /.n v/.Íro de embriones cigóticos de cocotero (Cocosnucifera LCAPITUL05. Efecto del ácido giberélico (GA3) en la germinación deembriones cigóticos de cocotero (Cocos nuc/'Íra L.) /.n v/.fro y sudesarrollo post-germinativoCAPITUL06. Discusión general

26

26

27_

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28

29

59

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a todas las personas que me apoyaron durante el período en el que realicemi trabajo de tesis Doctoral; en el cual se me permitió contribuir en el desarrollo de latécnica de cultivo /'r} v/.fno de embriones de cocotero.

Este trabajo se realizó en el Centro de lnvestigación Científica de Yucatán en laUnidad de Biotecnología bajo la dirección del Dr. Carlos Oropeza Salin y el Dr. JorgeSantamaría Fernández, a quienes les agradezco su apoyo durante el desarrollo deeste trabajo de investigación.

Por sus valiosas observaciones y apohaciones agradezco a los miembros de micomité tutoral y a los encargados de la revisión de la tesis: Dra. Alma Orozco, Dr.Armando Escamilla (R I.P), Dr. Brian Maust, Dr. Luís Sáenz, Dr. Daniel Zizumbo V. Dr.Jorge Santamaría, Dr. Carlos Oropeza.

Un especial agradecimiento al Dr. Carlos Oropeza Salin por sus consejos y por suinmensurable participación en cada uno de los pequeños detalles que conformaroneste trabajo de investicacioon

A todos los .integrantes del laboratorio de propagación clonal de la Unidad debiotecnología, al personal del área de lnvernadero y viveros del CICY por su apoyo.

A: lng. Miguel Fernández, M.C. Carlos Talavera, M.C. lván Córdova, M.C. RamónSouza, lng. José Luis Chan y del Dr. Luis Sáenz. Por el arduo trabajo realizadodurante la adquisición del material biológico iGracias!

AI Dr Jorge Argaez por su apoyo y observaciones en la pafte de los análisisestadísticos, y al lng. Tomás Madera por su colaboración en los análisis de losmateriales empleados en las extens.iones

Agradezco la beca de manutención del CONACYT (N° 47477), al apoyo financieropara la parte experimental CONACYT-SISIERRA (N° 990130) y COGENT(No 970104)

DEDICATORIAS

A mis padres por su amor, comprensión y apoyo que me dan impulsándome a lasuperación personal y profesíonal

A mi esposo y amigo Bello Melchor por su amor, su apoyo y su gran paciencia paraconmigo, por impulsarme, para que día con día yo me supere en lo profesional ypersonal. Por estar conmigo siempre Por compartir cada logro conmigo como si fuerael proplo, este éxito es de los dos.

A mí hija Christian Mirabeau, la alegría de mi vida por su amor y simpatía haciéndomereír y enojar, para oMdar las presíones.

A mis hermanos y sobrinos por todo el cariño y alegría que me dan.En especial a mi hermana Brenda por incontables momentos compartidos frente a unahumeante taza de café.

Al los amígos que me acompañaron en este proceso, Gracias Álvaro Alfaro porquesiempre contamos contigo.

A la vida por brindarme tantas oportunidades de convertir mis sueños en realidad, los

que son y los que faltan.

LISTA DE TABLAS

Productos y usos que se obtienen de cada una de las partes dela planta del cocotero (Cocos r}ucÍ.feffl L

3.1

La problemática del cocotero en América Latina y el Caribe ......mstoria del cultivo de embriones cigóticosDiferentes etapas a través de las cuales pasa el embrión /.r) s/.fu.Efecto de los inhibidores de respiración en la germinación deembriones cigóticos de cocotero (Cocos nuc/feffl L., var. EnanoMalayo verde)Sobrevivenciá de ias piántuias en condiciones ex v/.(ro(invernadero y vivero) germinadas en medio sólido ysubcultivadas en medio liquido

3 2 Plantas cultivadas /.n vÍ.Íro en medio Y3 sólido con empleo deextensiones

4.1 Efecto de la aplicación de ABA / PEG en el peso seco deembriones c.igóticos de cocotero

4.2 Efecto de la aplicación de ABA/PEG en el porcentaje degerminación /.n v/.Íro de embriones cigoticos de cocotero .......

5.1 Sobrevivencia en condiciones ex v/.Ín) de las plántulasobtenidas de diferen{es tratamientos en cultivo /n v/.fro deembriones cigóticos de cocotero

Página

65

65

78

79

91

LISTA DE FIGURAS

Figura

1.1

1.2

13

1.4

1.5

1.6

2.1

2.2

2.3

2.4

3.3

3.4

3.5

3.6

4.1

Origen, e lndicativo de la distribución mundial del cocotero (Cocosnucifera LLos principales productos del fruto del cocotero .......Distribución del cocotero en México y superiicie dedicada alcultivoLocalización del embrión y extracción del mismo de lacocoteroLas diferentes partes del embrión cigótico del cocotero .......El proceso de la técnica del cultivo /.n v/ím de embriones .,....Cultivo /.n v/.Ín) de embriones cigóticos de cocotero en medio sin L ocon S y colocado en tres d.iferentes orientaciones .......Cultivo /n víím de embriones c.igóticos de cocotero bajo diferentestratamientosGerminación máxima bajo diferentes condiciones de atmósfera de

embriones cigóticos de cocotero cultivados /.n vffro .....Tasas de respiración de los embriones cigóticos de cocoterocultivados por 30 días en ausencia o en presencia de inhibidores deIa respiracíón aeróbicaViales empleados durante el cultivo /.n v/.ín) de embriones cigóticosde cocoteroIdentificac.ión del mater.ial utilizado para la fabricación de

las

extensiones, empleados como cubierta de los contenedores decultívoEfecto del empleo de extensión de isopropileno isotáactico en el

desarrollo de las plantas obtenidas del cultivo /.n v/tm de embrionescigóticos de cocotero-`e-`'---_-_ _ _

Efecto del uso de extensiones de isopropileno isotáctico en eldesarrollo de las plantas, empleadas en la última etapa deldesarrollo /.n v/.ÍroEfecto de la adición de diferentes materiales de soporte al medio decultivo /.n v/.(ro en el desarrollo de las plántulas, obtenidas de la

germinación de embriones cigóticos de cocotero var.

de plantas obten

después de 10 meses de cultivo /n-v/Íro de embriones cigóticos de

PEG en la

Adaptación ex v/.Ím (invernadero y vivero)

cocoteroEfecto de los diferentes tratamientos de ABAmorfología de los embriones cigóticos de cocotero germ.inados enmedio Y3 sólido

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1015

19

222327

55

56

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71

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73

74

83

Figura

5.1 Efecto de la aplicación de diferentes concentracíón de GA3 enmedio de cultívo líquido y sólido en la germinación de embrionescigóticos de cocoteroEfecto de GA3 en la germinacíón de embriones cigóticos decocotero cultivados /n v/.Íno en medio líquido y en medío sólido ......Efecto de cuatro tratamíentos en la germinacíón de embrionescigóticos de cocoteroEfecto de la aplicación de GA3 al medio de germinación deembriones cigóticos de cocotero /.n vÍ.Ín), en medio (Y3) L, y S, en laaltura de las plántulas

primarias

5.5

6.1

Efecto de la aplícación de GA3 al medio de germinación deembriones cigóticos de cocotero /.n v/.Ím, en medio (Y3) L, y S en:peso fresco, número de hojas bífidas y el número de raíces

Protocolo generado para el cultivo /.n v/.Íro de embriones cigóticosde cocotero, con alta eficiencía en la producción de plantas .......

Vl

Página

100

Lista de abreviaciones

Abreviación Significadoa Parte apical del embriónANOVA Análisis de varianza

Á:A X::j:ma3'sc í s icoPEG PolietilénglicolAL Amarillamiento letalc Cotiledón del embriónCA Carbón activadoCCRI Cocoa & Coconut

FAO

lBPGR

FAOSTAT

Research lnstituteCoeficiente degerminaciónCentro de lnvestigaciónC.ientífica de YucatánCentre institiite deResearch pour leDéveloppementDépahementDióxido de carbonoCentral plantation CropsResearch lnstitutecadenas de hacesvascularesParte distal del embriónEje embrionarioEnano Malayo AmarilloEnano Malayo VerdeProgenie derivada de lacruza de plantas oanimales de la

generación de padres(P1 ).Food and AgricultureOrganization of theUnited Nationlnternational Board forPlant Genetic ResourcesFood and AgricultureOrganization of theUnited Nation. Agriculturedate.2000.Fao-org/cgibin/nphdb pl?sunset= agricultureGramosÁcido giberélico

AbreviaciónGAsh

HHaBPGR

IDEFOR/DPO

lRD

KCNY3MAYPAN

MedioY3 +CA

MS

N2

ugNAN3NAOCL

02PP:PPCA

PCR

PCRDF

vii

SignificadoGiberelinasZona que desarrollará elhaustorioHoraHectáreaBoard Plant growthregulationlnstitute de Developmentde Fores{ / Departmentdu plante Oleogineous(formarly CNRA)l nstitute de Recherchepour le DéveloppmentCianuro de potasioMedio Y3 LiquidoCruza de = EMA X Altosdel PacíficoMedio Eeuwens,1976 ymodificado por Rillo yPaloma,1992Med.io de Murasmge andSkoog (1962)NitrógenoMicrogramosAzida de sodioHipoclorito de sodio

(cloro comercial)oxígenoPrimordios de hojasRelación peso: pesoPhilippine CoconutAuthorityReacción en cadena dela polimerasaPhilippine CoconutResearch andDevelopment FoundationPo!ietilenglic0lPuntos taniferosPeso frescoPoro germinativo

Abrevíación Significado

PPFD

r

SH

Sl

Suc

Densidad de flujofotón ico fotosi ntéticoPrimordio de radícula

Orientación horizontal delembrión n medio sólidoOrientación Ínvertida delembriónmedío sólidoEmbrión con el porocubierta de gel mediosÓ'ido

Abreviación Significado

SV

UPLB

V:V

ZRC

Kpa

Ls

Orientación hacia arribadel embrión medio sólidoUniversity of thePhilippines at Los BañosRelación volumen avolumenZamboanga ResearchCenterKilo Pascales

Liquido en superficie

viii

Resumen

El cocotero ha sido por mucho tiempo un cultivo importante en las zonas tropicales,tanto desde un punto de vista económico como de subsistencia para mHlones dehabitantes del trópico. En los últimos años el cocotero ha disminuido sus volúmenesde producción debido a que se tienen plantaciones antiguas, con poca atenciónatacadas por condiciones adversas como ciclones, enfermedades y plagas.problema se agrava porque la utilización del cocotero está dirigida principalmente aobtención de copra para la producción de aceite, que está siendo desplazado enmercado mundial por aceite de palma aceitera

Es urgente hacer una replantación con nuevos materiales que actualmente no estándisponibles ni en la cantidad ni en la calidad que se demanda. Se requiere evaluar yseleccionar nuevo germoplasma de cocotero, por medio de un intercambio seguroentre los países productores. Para este propósito, la técnica de cultivo /n v/.fro deembriones cigóticos de cocotero ha sido recomendada por FAO / lBPGR para eltransporte de germoplasma (Frison, et al.,1993)

En la presente tesis se decidió realizar estudios que ayudaran a establecer las basespara explicar porque hay ventaja en el uso de medio sólido, en la orientación delembrión y si esto tenía que ver con respiración aeróbica Por otro lado, puesto que eltrabajo tenía como propósito general contribuir a mejorar la tecnología de cultivo /.nv/.Íro de embriones, también se estudio si las fitohormonas ácido giberélico (GA3) o elácido abscísico (ABA), podian favorecer la germinación y el desarrollo post-

germinativo, si la adición al medio de soportes inertes favorecía el desarrollo de lasraíces; y definm el grado de desarrollo que las plántulas deben de alcanzar encondiciones /.n v/.Íro que les permitan sobrevivir exitosamente al ser transferidas acondiciones ex v/.Íro.

Para los estudios se utilizaron embriones de la variedad Enano Malayo Verde (EMA)con una edad fisiológica de 12-14 meses después de polinización y el medio de cultivofue Y3 con la adición de carbón activado y gel-rite como agente gelificante. Se estudiocomparativamente el uso de medio con (sólido) y sin (líquido) gelificante. Los mejoresresultados en germinación y conversión fueron obtenidos en medio sólido (87% y 82%respectivamente) superando notablemente a los obtenidos usando medio líquido (66%

y 46% respectivamente) Estos resultados se obtuvieron cuando los embriones fueronsembrados en la superficie del medio sólido en posición venical con el micrópHo haciaarriba, es decir cuando están expuestos a la fase gaseosa del ambiente de laatmósfera en el vial Posteriormente se realizaron estudios en los que los embrionesfueron sembrados en diferentes formas exponiéndolos o no al aire, mediante lasustitución del aire por N2 o N2/02, así como también evaluando el efecto deinhibidores de la respiración aeróbica sobre la germinación. De esta forma se obtuvoevidencia que demuestra que la germinación de los embriones de cocotero esdependiente de la respiración aeróbica. También se pudo demostrar que estáscondiciones de germinación favorecen el desarrollo post-germinativo.

Para el caso particular de raíces, se evaluó la adición de medio líquido a soportesinertes: agrolita, vermiculita Ó fibra de coco (cocopeat). Los resultados obtenidos conlos sopoftes fueron inferiores a los obtenidos con medio líquido sin soporte.

Por otro lado, se evaluó el empleo de extensiones (isopropileno isotáctico) en loscontenedores, lo que permítió un incremento en el desarrollo de las plantas de un 35%en la talla y una mejor apariencia. Se determinó que grado de desarrollo deberían dealcanzar las plántulas para lograr una transferencia exitosa a condiciones ex v/'Íro, el

punto Óptimo es cuando ya formaron tres hojas bífidas y tres raíces primarias, con loque se puede obtener cerca de 100% de sobrevivencia en estas condiciones.

Por otro lado, aunque los resultados mencionados arriba en germínación, conversión aplántulas totales fueron buenos, adicionalmente se probó el empleo de fitohormonaspara mejorarlos aún más. El grado de desarrollo de los embriones en una colecta noes homogéneo pues entre otras cosas se efectúa cada tres o cuatro meses, por locual con el objetivo de sincronizar la germinación de los embriones e incrementar el

porcentaje de germinación se evaluó el uso de ABA (solo o en combinación con PEG)y GA3. La aplicación de ABA (solo o en combinación con PEG) al medio (sólido) en lasdiferentes concentraciones usadas tuvo siempre un efecto negativo en la germínaciónde los embriones. Cuando se aplicó GA3 al medio de cultivo, los porcentajes de

germinación aumentaron en medio sólido. de 87% a 98°/o y en líquido de 62 a 80%.Las concentraciones de GA3 aplicadas fueron de 4.6 LiM para el medio sólido y 0.46

uM de GA3 para el medio líquido. Esta fitohormona fue aplicada durante las primerascuatro primeras semanas de cultivo de los embriones en condiciones de oscuridad,después de este tiempo estos fueron transferidos a un medio líquido libre de GA3 parasu subcultivo. Los resultados también mostraron un efecto post-germinativo,incrementándose los porcentajes de conversión y obteniéndose plántulas completas,lo cual permitió lograr un mayor número de plántulas con las característicasadecuadas para su transferencia a condiciones ex vtíro, obteniéndose un 100% desobrevivencia. Las características moriológícas de las plántulas obtenidas con eltratamiento de GA3 fueron mejores que cuando no se usa la fitohormona. Los tiemposde germinación de los embriones cigóticos se lograron reducir con el uso de mediosólido, pero fueron aún más cortos cuando a este medio se le adicionó GA3.

Considerando los resultados en esta tesis, se propone un protocolo que incluye lasmejores condiciones para la geminación y el desarrollo post-germinativo de losembriones cigóticos de cocotero: Para su germinación los embriones se deben cultivarpor cuatro semanas en la superficie de medio sólido conteniendo GA3 4.6 LiM, enposición vertical con el extremo del micrópilo orientado hacia arriba expuesto a laatmósfera de aire del contenedor. Posteriormente se deben transferir a medio líquidopara su conversión. Se requiere poner extensiones de isopropileno isotáctico a loscontenedores, las cuales además de proporcionarles espacio adicíonal, permiten elintercambío de gases aunque no la pérdida de agua, redundando en un mejordesarrollo de las plantas. La transferencia a condiciones ex v/.Íro deberá de efectuarsecuando las plántulas hayan formado tres hojas bífidas y tres raíces primarias almenos.

2

Abstract

The coconut palm is an important crop for the inhabitants of the tropical zones where a

great number of families obtain their income from this palm. However nowadays in thePeninsula of Yucatan and Gulf of México the surface of cultivation has decreased from200 thousands hectares to 160 thousands, mamly because of old plantations and thedisease lethal yellowing (LY). The problem becomes worse as the coconut oil is beingsubstituted in international markets by the oil from oil palm.

At present, the major strategy to challenge the LY is replanting the zones affected withresistant varieties to LY However because of phytosanitary safety measures, theimportation of resistant palm to México has been restricted Therefore is important tohave techniques that warrant that the exchange of germless is safe. The technique of/.n v/'Íro culture has been recommended by FAO/lpGR for the safe transport of coconutgermless (Frison, et al ,1993)

ln the present thesis, basic studies were carried out that help to explain why theorientation of the micropyle was imponant, and whether the aerobic respiration wasessential On the other hand the thesis had as a general objective to improve theoverall efficiency of the system, therefore we carried out studies of the effect of theaddition of gibberellic acid (GA3) and abscisic acid (ABA) on the germination and post-

germinative development The addition of inert suppofts was also studied on thedevelopment of the roots and the stage of development which the plantlets had thebest chance of survival.

For these studies embryos from Green Malayan dwarf plants with 12 to 14 monthsafter anthesis using the medium Y3 added with activated charcoal with (S) or without

(L) gelifying agent The results showed that the use of solid medium (S) was betterthan liquid medium (L) With S germination and conversion were 87% and 82%respectively, and with L they were 66°/o y 46% respectively. The results obtained with Swere possible only when the zygotic embryo was placed with the micropyle upwardsthat is when it was in contact with the atmosphere of the container Other studies werecarried out with zygotic embryos exposed to different atmospheres such as air, N2 ormix of N2/02, and inhibitors of respiration were also evaluated. The results showed thatthe germination of zygotic embryos of coconut palm requires aerobic respiration, thusexplaining why the percentage of germination is higher when the micropyle is exposedto the container atmosphere. This condition affects positively the postgerminativedevelopment as well.

Different inert supports such as agrolite, vermiculite and coco-peat were evaluated in Lto determine theirs effect on the development of the plantlets. The results showed that

plantlets grown in the ineri supports had a reduced response than L without supports

On the other hand the use of isotactic isopropylene extensions for the containers wasalso evaluated to increase their volume capacity and gas exchange and it was found

3

that they promoted the development of the plantlets in terms of length, dry weight,niimber of bifid leaves and number of roots. The best stage of development to transferthe plantlets to ex v/.Íro conditions was evaluated and it was when they had 3 bifidleaves and three primary roots; this way the ex v/.Íro survival obtained was 100°/o

ln order to further Ímprove the performance of this techníque phytohormones (ABA andGA3) were added to the culture medium to test their effect, ABA was tested alone or Íncombination wíth PEG because most of the embryos were not at the same stage ofdevelopment and Ít has been reported that ABA synchronizes the stage beforegermínation. The results showed that in all the concentration used ABA or ABA/PEGhad a negative effect ln contrast, GA3 increased the germination percentage in S from87% to 98% and in L from 62% to s0%. The best concentrations were 4.6 LiM formedium S and 0.46 LiM for medium L Tms phytohormone was applied during fourweeks of culture and after this times the embryos were transferred to culture mediumwithout growth regulators. Treated embryos showed also better post-germinativedevelopment and Íncrease percentage of conversion into plantlets, allowing more

plantlets to reach the optimal stage of development for ex v/'Íro survival Moreover theplantlets treated with GA3 showed shorter times to reach the adequate developmentalstage to ex v/.Íro adaptation in medium S than the not treated plantlets.

Based on the results obtained in the present thesis, a protocol for coconut zygoticembryo culture is proposed that provides conditíons for germination and post-

geminatíve development of the embryos that allows a performance similar or betterthan that of embryos germinating in the nut. lt can be summarized as follows: For

germination the embryos must be cultivated four weeks in solid medíum contaíning 4 6uM GA3 with the micropyle in contact with the container atmosphere. Four weeks later,the embryos are transferred to fresh phytohormone-free liquid medium for conversion.Then on transferences are carried out every six weeks and eventually an isotacticisopropylene extension in placed on the container to provide more space (and gasexchange but no loss of water) that improves development. The transfer of plantlets toex v/.Íro conditions must be carried out when they have three bifid leaves and threeprimary roots at least.

INTRODUCCION

El cocotero (Cocos nuc/fera L.) es la Única especie del género Cooos, y se encuentraampliamente distribuido en las regiones tropicales en todo el mundo Es uno de losárboles más bellos y útiles Ha tenido un papel esencial en la vida de los pobladoresde regiones tropicales, por su uso integral, así como por ser una planta esencial del

paisaje.

Mundialmente el cocotero ocupa el séptimo lugar entre las especies productoras deaceite, siendo los principales países productores, Filipinas, lndonesia y la lndia, queconiuntamente alcanzan más del 80 % de la producción mundial. México ocupa elséptimo lugar al nivel mundial y el primero en América (FAOSTAT,1999)La mayor parte de la producción de cocotero en México se dedica a la extracción deaceite (de la copra), el cual tiene una amplia gama de aplicaciones industriales

(Persley, 1992, Magat, 1993) como la fabricación de jabones y, en la industriagalletera y confitera.

Desde el punto de vista agrícola el cocotero representa una alternativa para las áreascosteras, por su capacidad de desarrollo en suelos arenosos pobres en nutrientes ymateria orgánica, y su capacidad de poder soportar inundaciones, temporalesEl cultivo del cocotero en México y en otros países del caribe presenta muchos

problemas de cultivo, que resultan en la baja productividad y debido a los siguientesfactores;

• Germoplasma no mejorado o no seleccionado• Edad de las palmas viejas muy por arriba de su edad productiva• lnsuficiente velocidad de replantación• Pocaatención alcultivo• Pestes y enfermedades (con tratamientos no disponibles)• Crecen en áreas a veces susceptibles a calamidades naturales (tifones,

huracanes)

En cuanto a las enfermedades del cocotero, el principal problema en México y enotros países productores de Latinoamérica, es el amarillamiento letal (AL), por el daño

que causa EI AL es una enfermedad epidémica provocada por un fitoplasma ytransmitida por al menos un homóptero, Myndus cmcíus (Bourdeix,1999, Hocher etal ,1999) Desde hace 20 años se encuentra en México y está devastando las zonascocoteras (Bourdeix,1999, Hocher et al ,1999) Hasta el momento la Única formaeficiente para enfrentar al AL es la replantación con palmas resistentes a lasenfermedades La susceptibilidad a enfermedades varía entre las diferentesvariedades de cocotero. Los materiales recomendados, para este propósito son lasvariedades de Enano Malayo, híbridos producto de la cruza con Enano Malayo yvariedades altas susceptibles. Sin embargo esto representa una base genética muyreducida y para poder ampliarla la diversidad genética, es necesario evaluar otrosmateriales, para poder ampliar Con este propósito desde hace, diez años se esta

5

evaluando una colecta de germoplasma en México Con respecto a su resistencia alAL. Los resultados han mostrado que las zonas costeras del Pacífico mexicano sonuna fuente muy valiosa de germoplasma resistente al AL (Zizumbo et al., 2002).La

procedencia de estos materiales, fue identificada con bases históricas, morfológicas,fisiológicas y genéticas (isoenzimas) indicando una amplia base genética en el

germoplasma mexícano (Zizumbo et al„ 1999) y recientemente confirmado por mediode marcadores moleculares, microsatélites (Baudouin y Levron, 2002.). La ampliabase genética del Pacífico mexicano puede aumentarse, también trayendo materialesde diferentes sitios para su eventual evaluación. Por otro lado los materiales deMéxico pueden ser útiles para otros países. Sín embargo la movilízación de materialescomo frutos o planta representan un riesgo fitosanitarío de introducción deenfermedades.

Para evitar estos ríesgos el Consejo lnternacional de Recursos Fitogenéticos, lBPGR(sus siglas en lnglés) ha recomendado la movilización de material vegetal por mediodel uso de la técnica de cultivo /n v/.Íro de embriones (Frison,1993)Los protocolos del cultívo /.n vÍ.Íro del cocotero tenían baja eficiencia por lo que desdehace varios años,12 laboratorios en 11 países del mundo han estado trabajando en laoptimización de protocolos de esta técníca Los centros de investigación y los paísesinvolucrados en incrementar la eficiencia del cultivo /n v/.íno de cocotero son UPLB,Filipinas; lDEFOR e lRD/CIRAD, Francia, CPCCRl, lndia; lBRIEC, lndonesía; CICY,México; PCA-ZRC, Filipínas, PCRDF, Filípinas; CRI, Sri-Lanka. En 1999 se reportó

que los protocolos tenían baja eficjencia, en la germinación y pahicularmente en laconversión (Batugal y Engelmann,1998). Sin embargo el EPCRl (lndia) que describióaltos porcentajes de germinación y de conversión (Karun et al , 1997), aunque losresultados obtenidos no son reproducibles, ya que los resultados varían dependiendode la variedad.

La principal díficultad que se tiene en el cultivo /.n vÍ.Íro es el proceso de aclimatizaciónde las plántulas y en cuanto a la determinación de la sobrevivencía ex-vííro, se reportómuy poco avance (ver Batugal y Engelmann,1998).La investigación realizada en este tema se ha basado en la modificación de los medioy las condiciones de cultivo mediante, prueba y error, muy pocos estudios se hancentrado en el conocimiento de los procesos físíológicos que ocurren durante lagerminación y conversión a plántulas de los embriones cigóticos de cocotero /n v/fro,de tal manera que se pueda avanzar más rápidamente en la optimización de estatécnica.

Con el propósíto de tener conocímientos básicos acerca del proceso del cultivo Í.n vÍ.Írodel embrión cigótico de cocotero que permitan modificar las condiciones del protocolode cultivo /.n v/'fro de embrjones de cocotero, se realizó un estudio del cultivo /.n v/.íro deembriones cigótícos de cocotero Para poder obtener un protocolo con altosrendimientos en cada una de sus fases, con altos resultados en el proceso deaclimatamiento. Y para que la técnica del cultivo /.n vÍ.Íro pueda ser usada como unaherramienta en el transporte o Íntercambio de germoplasma, cultivo Ín v/.íro,caracterización, conservación y mejoramíento genético. Lo que permitiría la obtenciónde materiales con las características deseadas, para poder replantar las áreas

6

desbastadas por las enfermedades, lo anterior permitiría el manejo sustentable afuturo del cocotero

Los estudios realizados permitieron conocer el proceso de germinación /'n v/fro deembriones cigóticos de cocotero como el requerimiento de la respiración aeróbicapara la germinación del embrión, por lo tanto la importancia de la posición y ubicacióndel micrópilo del embrión en el medio de cultivo durante la germinación El efecto delas modificaciones en el medio de cultivo durante la germinación como el medio físicoliquido o sólido (adición de gelificante), Ia adición de reguladores de crecimiento (ABA,en la sincronización la germinación) y GA3, en el incremento de la germinación), comoel efecto que tienen estos factores en el desarrollo postgerminativo. Y la importanciade las condiciones de cultivo empleado durante la última fase del desarrollo de las

plántulas.

El efecto fue cuantificado mediante (a) la eficiencia de la germinación de losembriones cigoticos, (b) en la conversión a plántulas completas de los embriones

germinados (brotes), (c) en el establecimiento de las plántulas a condiciones ex v/'ÍroLos resultados obtenidos en tesis fueron integrados en un protocolo para mejorar de laeficiencia de la técnica de cultivo /.n v/fro de embriones cigóticos de cocotero

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Capitulo 1

ANTECEDENTES

1.1. EL COCOTERO

1.1.1. Descripción taxonómica

C nuc/fera L. es la única especie en la subtribu Buí//r)ae de la tribu Coco/c/eae,subfamilia Areco/deae, famHia Arecaceae, género Cocos (Uhl y Drasfield,1987).

El cocotero es la palma cultivada de mayor distribución mundial por su ampliaadaptación en los diferentes ambientes tropicales y subtropicales, en las áreascosteras entre 20° N y 20° S del ecuador (Plucknett, 1979; Persley, 1992) y deimportancia socioeconómica ya que provee a sus cultivadores de alimento ymateriales para la construcción, además de la comercialización de los productos ysubproductos lndustriales No se reproduce asexualmente, y solo se propaga porgerminación de las semillas, las cuales son recalcitrantes, con tiempos de germinacióndependiendo de la variedad El numero de cromosomas es 2n = 32.

1.1.2. Origen y distribución mundial

El origen del cocotero ha sido polémico, debido a que se han encontrado evidenciascontradictorias Sin embargo por el registro fósil de cocotero (Sauer,1994; Loy et al ,1992), su diversidad morfológica y la riqueza de sus interacciones con la fauna y elhombre en el área lndo-pacífico se creé que esta es su área de origen (Harries,1978,Sauer,1994).

La distribución original del cocotero posiblemente se extendió por flotación desde laisla Seychelles en el oeste a las lslas Line en el Este, (Palmira y Christmas) en elPacífico Norte e lslas Marquesas en el Pacífico Sur (Harries,1995). De esta región sediseminó a las áreas costeras de clima cálido húmedo, de donde se adentró a loscontinentes en forma natural a través de los ríos o lagunas (Harries,1978; Ashburner,1994) De acuerdo a Harries (1990) los atolones son considerados los ecosistemasmás estables del cocotero Los tipos de cocotero silvestres han sido encontrados envarios países como son las islas de Java, lndonesia, Queensland, Australia y en lasFilipinas El consenso general fue que el cocotero tuvo su domesticación en las

grandes islas Malasia (Harries, 1990) un área que se extiende hacia el sur (delecuador) al trópico de capricornio entre 145° y 180° E (Child,1974: Purseglove,1972)

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Las palmas silvestres no son necesariamente primitivas o de frutos pequeños, ya quedepende de la variedad. Según Harries, (1978) Ia forma silvestre o típo Mu kafa y laforma domesticada o tipo Niu vaí Las primeras tienen las siguientes características:son delgadas, tallo curvo, con cicatrices irregulares, hojas largas, con frutos largosangulares con delga fibra, con nueces de concha delgada, endospermo delgado y altocontenido de aceite. Polinización cruzada no absoluta, germinación y velocidad decrecimiento lento, y son susceptibles a tormentas y a MLO (organismos parecidos amicoplasmas).

La Niu vai es robusta, erecta, con bases que pueden llegar a ser muy grandes, hojascortas esféricas con frutos esféricos, con nueces con conchas delgadas, mucho agua,endospermo delgado con bajo contenido de aceite. Con polinización cruzada y aveces con auto polinización, germina pronto y crecimiento rápiclo, es tolerante atormentas y a MLO.

La distribución geográfica, de los ecosistemas Unaturales", "domesticados" y actualesdel cocotero abarca todas las áreas húmedas de los trópicos (Fig.1.1 ).

Figura 1.1. Origen e lndicativo de la distribución mundial del cocotero (Cocos nuci'Íem L.),ecosistema de la palma de cocotero. Los limites del ecosistema Unatural" se encuentran dentrode la elipse; y los del ecosistema "domesticado" dentro del círculo; los del ecosistema dentrode las lineas paralelas aproximadamente a las del trópico de Cáncer y Capricornio.

H. C. Harries,1991, León,1968

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1.1.3. Variedades de cocotero

La principal clasificación del cocotero se basa en su altura En 1978 el Consejolnternacional Recursos Filogenéticos (lBPGR-CIRFT) reconoce taxonomicamente dosvariedades de C. nucí.fera; los cocoteros altos var. íyp/ca y los cocoteros enanos var.nana Existe una variedad adicional producto de la cruza de las dos variedades antesmencionadas, la variedad híbrida (Ohler,1999).

Las variedades de cocoteros de diferentes orígenes son identificadas usando datos enla germinación de la semilla, habitad de la palma, biología floral, precocidad y

producción.

Observaciones en la forma, color del fruto e incidencias de enfermedades y pestesson consideradas La relación entre la velocidad de germinación y el tiempo de lamaduración del fruto podría contar para la estabilidad genética de tipo Niu kafa, el cual

podría favorecer la deriva genética (Harries,1981) La velocidad de germinación esrelacionada con la selección natural, la domesticación pre-agricultural.

El cocotero es polinizado principalmente por insectos, las abejas de la miel (Ap/'s/nd/ca) son los principales insectos polinizadores otros insectos como son las avispas,mariposas y hormigas también iuegan un papel principal (Oler, 1999), aunque tambiénse ha reportada su polinización por el viento pero en un menor grado (Ashburner,1995).

(a) Las variedades altas de cocotero

El cocotero alto llamado "grand cocotier" o variedad typica, altamente distribuida en elmundo, crece de 20 a 30 m, madura y florece de 6 a 10 años después de plantada.Tiene como característica una larga vida sO a 100 años Las variedades de altospresentan mayor variación por que normalmente tienen polinización cruzadas porinsectos o por el viento (alógamas). Debido a la no-concordancia de la fase masculina

y femenina en la misma inflorescencia o con la inflorescencia siguiente de la mismapalma. Se consideran heterocigóticas.Se ha planteado que el origen de las dos variedades ha sido tanto por selecciónnatural como la efectuada por el hombre (domesticación) La distribución geográficaayudó a una diferenciación más marcada, en cuanto al tipo de fruto y a la estructurade la planta Estos dos tipos se denominan Niu vai y Niu kafa, (Uhl y Drasfield,1987:Harries,1978) y están localizadas en todo el mundo.

(b) Las variedades enanas de cocotero

Las variedades enanas es una probable mutación de los tipos altos (Purseglove,1975,Woodruf,1979), que han sido seleccionadas, cultivadas y diseminadas por el hombre

(Harries,1978) Crecen de s m o más Florecen de 5 a 6 años después de plantadasTienen una vida productiva corta de 30 a 40 años.

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Se autopolinizan (autógamas), debido al traslape de la fase masculina con la femeninaen la misma inflorescencia (Persley,1992), por lo cual se consideran homocigóticas.Las variedades enanas conocidas generalmente como Wana War, poseen tres tiposbásicos. Dos de ellas corresponden a las variedades Wana y Javánica de Narayana yla tercera es la Mu /eka del Pacífico. La variedad Javánica, reconocida comúnmentecomo Enano malayo, y se le considera procedente de Java (Harries, 1978). Seconocen tres tipos de esta variedad, el rojo (reg/a), el amarillo (eburr)ea) y el verde(pum/'/a), su importancia radica en su alta resistencia ante el Amarillamiento Letal,presentando más del 90% de sobrevivencia (Zizumbo et al ,1999)

Aún cuando el uso de estas variedades estaba limitado al aspecto decorativo, a partirde 1920, se comenzó a considerar como un cultivo de importancia (Jack y Sands,1922) debido a la posibilidad de obtener cantidades comerciales de híbridos FI

provenientes de las cruzas de las variedades altas de características deseables conlas enanas, muy apreciadas por su precocidad, alta productividad y resistencia al AL(Harries,1976).

Variedad Enano Malayo verde. Es del tipo Nana, la variedad verde es preferida porcultivadores, por su alta productividad, por sistema de raíz que ocupa menos espacio(root garden), y al tallo se mantiene corto por largo tiempo, comienza su floración en eltercer año de ser plantado, enseña alta resistencia a organismos tipo micoplsmas(Oler,1999).

1.1.4. El cultivo del cocotero

El cultivo del cocotero (Cocos nucifera L.) está ampliamente distribuido en el mundo y

posee un alto valor económico. Principalmente para la producción de aceite, laproducción mundial del cocotero se estima en 42 billones de nueces. Más de la mitadprovienen del suroeste de Asia, principalmente de Filipinas e lndonesia. Otra cuarta

::ohdeucí:o'aenprÁ:uécr:;:|ÁP,rr:cváe;erepgr,':::Psa'dme:n;eacíf:c:ndúaéxyc:r)LBarnaks:,,per:á::teon::

ymaTyaonrzpaanTaeJduent::ncuoen:::uqyueens:opnroddouscet:r::rásméprácriae::Si:dpero#:;Ówoá:mÁbf,ricuaeTodos los países productores consumen cerca de dos tercios de la cosechalocalmente en uso doméstico, procesos comerciales y en la propagación. Laexportación de los países productores se realiza principalmente a Norteamérica y losPaíses del Oeste de Europa (Harries,1995).

1.1.5. Usos del cocotero

Los usos del cocotero son muchos y variados. Es utilizado principalmente en formaindustrial para la extracción de aceite del endospermo sólido seco, el cual posee unalto contenido de ácido laúrico (48°/o). La mayor proporción de la producción de aceite

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es empleada en la industria oleo-quím.ica, en la fabricación de surfactantes y espumasestabnizadoras para detergentes, jabones, cosméticos, inh.ibidores de corrosión,emulsificanrtes y plastificantes en PVC. Por otra parte la utilización de las diferentespartes de la planta es integral, (Tabla 1.1) y se pueden observar los diferentesproductos que se tienen solo del fruto (Fig 1 2) (Persley,1992., Harries,1995).

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Tabla 1.1. Productos y usos que se obtienen de cada una de las partes de la planta delcocotero (C. nuc/'Íeffl L.)

Partes del cocotero Usos y productos

Raíces

Medícinas, energéticos, tejidos, cestos,esteras, producción de tintes (taninos,palillos para los dientes.

TroncoCorteza y fibra

Construcción: madera, vigas, muebles,marcos.Herramientas y utensilios, ornamentos,material duro para ebanisteria etc.Obtención de resinas y ceras para cunirpieles, Carbón.

HojasRaquis, foliolos

Paja para techos, paredes, ventiladores,bardas, alfombras, carpetas, material paratejer canastas, sombreros, gorras,zapatillas, paños, bolsas, escx)bas; palillosde dientes.

lnflorescencia Savia

Azúcar de coco, jarabe de coco, ponches,tuba o vino de coco, bebidas alcohólicas, alcohol destilado, vinagre. levadura

Meristemo Corazones o yemas Como alimento exótico crudo o cocidos.

Fruto

Fibra del mesocarpío "fibra

Fibras para hilados y tejidos (esteras,alfombras, sacos etc.) cuerdas, materialde relleno (asientos, cojines, colchones),aislantes, cocopeat, (fibras comprimidas)

de coco„ para suelos hortícola, material decomposta, bloques para construcción,energético, cartones, cepillos, escobas.

Concha o endocarpioCarbón activado, energéticos, botones,joyeria, juegos, vasijas.

Agua de coco (endospermoBebida refrescante, bebidas, alcohólicas,dulces, vino, champagne, gel de coco,

Iíquido) vinagre, suero.

Endospermo sólido

Aceite, coco deshidratado, dulces, aguade coco, queso de coco, meimelada,productos para confitería.

Harina de endospermo: torta de copra,harina, pan, galletas, panqué, empanadas

Fuente: Non Wood Forest Products: Tropical Palms, Food and Agriculture Organization of the UnitedNations, Bankok,1997.The Philippines Recommends for Coconut, PCARRD Philippines Recommends Series No. 2-8,1993.

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Figura 1. 2. Los principales productos de fruto del cocotero

1.1.6. Problemátjca del cocotero en México y recomendaciones

(a) Problemática

La problemática del cultivo del cocotero en México y en general en los paísescultivadores de esta especie en Latino América y el Caribe, se presentan acontinuación en Tabla 1. 2.

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Tabla 1.2. La problemática del cocotero en América Latina y el Caribe *.

Problemasi)rincipalesCausas Efectos

Palmas no seleccionadas o

• Crecientedisminución delosingresosdelosproductores.(a) Baja mejoradas.

productivi ® Plantaciones viejas.dad: Poca atención al cultivo.

® Enfermedades y plagas.

(b)Disminucióndelasuperficie • Enfemedades y plagas.•Edaddelaspalmas. • Abandono de lasplantaciones.

de cultivo. • Dañoalaindustriadelcocotero.(c) Hay poca diversificación de productos y

aprovechamiento de subproductos.

(d) No se conoce el mercado, ni existe un plan dedesarrollo nacional.

(*)Seminario sobre la Problemática del Amarillamiento Letal en México, Mérida, Yucatán, 1989.Seminario lnternacional Sobre lnvestigación y Desarrollo del Cultivo del Cocotero, Kingston,Jamaica,1992. Simposio lnternacional sobre Amaril]amiento l,etal, Mérida, Yucatán,1993.

Se puede concluir que los problemas princípales son: (1) la baja productividad (2) ladisminución de la superficie (3) diversificación. Este cultivo ha disminuido de 204, 470Ha en 1990 a 140,000 Ha en 1998 (FAOSTAT,1998), principalmente debido a laenfermedad del Amarillamiento Letal A continuación se presentan las causas y losmotivos de la baja productividad en la produccíón del cocotero.

> Palmas no seleccionadas

La mayoría de las plantaciones de cocotero en México han sido establecidas con

germoplasma que no ha sido ni mejorado ni seleccionaclo.

> Plantaciones viejas

El 70% de éstas plantaciones tienen una edad mayor a los 48 años de establecidos,se encuentra en estado de abandono (se limita a la recolección de los pocos frutosque produce), por lo que la productividad está disminuyendo y es necesario larenovación de las plantaciones.

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> Poca atención al cultivo

Prácticas culturales pobres, la poca o a nula aplicación de fertilizantes, así como eldesconocimiento de la fertmdad del suelo y un pobre control de la maleza, hancausado la disminución de la copra y la muerte de las palmas, así como el abandonode las superficies de cultivo en las que la producción ha declinado en formaconsiderable

> Enfermedades y plagas

El amarHlamiento letal (AL) es una enfermedad devastadora que ya ha ocasionado lamuerte de millones de palmas de cocotero en México, es causada por un fitoplasma ytransmitida pcm un homóptero Myndus crL/dus. Esta enfermedad actualmente seencuentra en Yucatán, Campeche, Quintana Roo y en el Estado de Tabasco yVeracruz, ha disminuido 41,000 ha. en los últimos diez años y se proyecta, que acabecon las plantaciones que se encuentran en el Golfo de México y un 40% de lapoblación que se encuentra en el Pacífico.

Otros problemas fitosanitarios importantes son la pudrición del cogollo y anillo Rojo¿á:¿aáas por ei hor\go Phytophtora paimivora y ei nemá`oq.o. F?aq!napheie.n.cpgs^cocoph/./us, respectivamente Estos problemas se encuentran distribuidas en,15,000Ha en el país (Ohler,1999).

> lncorporación y desarrollo de nuevos productos al mercado

El uso y el valor del cocotero para los pequeños cultivadores, podrían ser mayoresque el de la copra y el aceite, aunque aún son pocos los estudios que calculan el valortotal de producción que incluyan otros productos diferentes de la copra y el aceite. Serequieren de más estudios que permitan un mejoramiento agrícola para la obtenciónde mayor productividad, la cual ésta relacionado con el tipo de población de cocotero.Muchos cultivadores a pequeña escala difieren de los valores de productos primariosreconocidos Las variedades de cocoteros con alta productividad, son disponibles ybasados en esquemas de desarrollo que difieren de los cultivares mejorados, losproductores prefieren su cultivo local (Godoy y Bennet, 1991). Los cultivadoresprefieren las variedades altas, poblaciones alogamas con altos niveles de diversidadentre poblaciones (Foale,1991). La diversidad genética permitiría .incrementar el valorde la productividad del cocotero. El cual tiene un alto potencial de uso en la industriade alimentos, industrial, farmacéutica, usos en energía y para la protección del medioambiente (el uso de materiales biodegradables). Los productos ya existentes delcocotero se podrían mejorar, también podrían usarse como materia prima de otrosproductos, actualmente hay una creciente demanda de productos no tradicionales decocotero (Punchihewa,1999).

Por lo anteriormente, es importante identificar el material genético, para realizarmejoramiento genético, permit.iendo incrementar la variabilidad genética, para poderenfrentar los problemas fitosanitarios, la diversificación productiva y el desarrollo denuevos productos.

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1.2. EI AL y estrategias para su control

1.2.1. Control integral del AL

Considerando que las investigaciones llevarán muchos años y una cura permanenteno ha sído encontrada. El problema del amaríllamiento letal (AL) se ha abordado através de un programa de control integral, aplicando diversas estrategias de métodospotenciales que incluyen diferentes aspectos como son. control del vector a través delnsecticidas y control biológico; del agente causal a través de control qui'mico;erradicación por tumba y quema; cuarentena de cocotero y otras especies,quimioterapia, control del vector, empleando germoplasma resistente al agente causal,que además tengan buena estabilidad de producci.Ón y sean resistentes a los vientoshuracanados, para replantar las áreas (Enano Malayo, Altos del Pacífico e hi.bridos)(Been,1995; Oropeza et al„ 1995).

La única estrategia efectiva es la replantación con germoplasma resistente al AL enMéxico.

1.2.2. Germoplasma resistente al AL en México

Hace 14 años se realizó una colecta de germoplasma en Méxi.cc) obteniéndose unacolecci'Ón como fuente para determinar los niveles de resistencia al AL del

germoplasma indi'gena La cual comprende 17 poblaciones colectadas en las costasdel Pacífico y el Atlántico (Fig. 1. 3)

Los resultados han mostrado que las zonas costeras del Pacífico mexicano son unafuente valiosa de germoplasma resistente al AL (Zizumbo et al, 2002) Adicionalmentelos enanos malayos han mostrado alta resistencia al AL.

La población de altos del Golfo de México distribuidos en la costa del Atlántico y laPeni'nsula de Yucatán, presenta características de Alto de Atlántico, susceptibles al AL

Debido al impacto del AL en nuestro pai.s se han usado el enano y sus híbridos para laproducción de material resistente al AL, empleando la variedad de enano malayocomo progeni.tor femenino (Been,1981; Zizumbo,1997, Oler,1999) resi.stente y como

progenitor masculino variedades altas, las cuales han presentado resistencia ante elALLos híbridos comercjales son de enanos x tipo alto, Ios cuales combínan la precocidadcon la robustez de los altos. Sin embargo la base genética del cocotero es pequeña,por lo que es necesario probar germoplasma de otras partes del mundo para poderdisponer de una mayor diversi.dad genéti.ca. Algunos híbridos altos x altos parecentener un comparable potenci.al. Los cuales son disponíbles para intercosechas yofrecen mejores prospectos para mejoramiento. Los Enanos x híbrídos de enanos son

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más productivos que los enanos puros (Le saint y de Nuce de L, Amothe 1987) ypodría ser una interesante solución para usos espec(ficos.

El cultivo del cocotero en México

Figura 1. 3. Distribución del cocotero en México y superficie dedicada al cultivo.Dominguez et al.,1999; FAO,1990.

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Fuentes Potenciales de Nuevos genotipos de cocotero para introducir aMéxíco

El origen de los materiales altos del Pacífico inicialmente fue identificado con baseshistóricas, morfológicas, fisiológicas, genéticas (isoenzimas) como distintas regionesde Asia (Zizumbo et al„ 1999) y recíentemente confirmado por medio de la técnica demarcadores moleculares de microsatélítes (Baudouin y Levron, 2002). De esta formala base genética no solo puede aumentarse con los materiales del Pacífico mexícanorecién caracterizados, sino también mediante la Íntroducción de materíales originariosde Asia-Pacífico para su evaluación. La recombinación de estos permitiría incrementarpotencialmente la diversidad genética, para un uso futuro.

En Jamaica se encontró que la variedad de Enano malayo amarillo es resistente AL elcual fue empleado como progenitor para la producción de híbridos

Entre los híbridos resistentes AL, destaca el MAYPAN (Enano malayo amarillo = EMAX Altos del Paci'fico, el cual es susceptible) por su alta resistencia al AL (alrededor de90%) y por su precocidad, y buena producción de copra (Been,1995). MAYPAN seproduce en Jamaica para fines comerciales. Esta región podría ser una fuente paralntroducir materíal resistente.

Por otro lado los materiales de México pueden ser útiles para otros países, pues sepuede obtener materíal resistente para ser utilizados en programas de mejoramientogenético como los "Altos del Paci.fico 2" el cual presenta altos niveles de resistencia ymuestra otras características favorables de alta. productividad, precocidad, velocidadde producción de hojas emisión de inflorescencias entre otras. Sin embargo lamovílización de materiales como semílla o planta representaría un riesgo deintroduccíón de enfermedades.

1.3. El problema de la introducción de nuevos genotipos a México ycomo enfrentarlo

La movilización del germoplasma, de cocotero tanto de una región a otra del paíscomo de otras zonas productoras de cocotero del mundo, no es posible, debido alcontrol estrito control sanitario que existe por el riesgo de diseminación de patógenosy pestes El intercambio de germoplasma de cocotero se permite por medio deltranspone de polen o de embriones cigóticos in v/.Íro, el cual reduce la posibilidad deintroducción de materiales enfermos y plagas en áreas libres de enfermedades ypatógenos. Debido a que se requiere de la introducción de nuevos genotípos decocotero para su evaluación de resistenci.a a enfermedades y desempeño agronómico,como para incrementar la diversi.dad genética del cocotero.Por lo tanto es necesario contar con una técnica efectiva de germinación deembriones cigóticos de cocotero Í`n v/.fro.

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1.3.1. Transporte seguro de germoplasma

El material /.n v/.Íro se mantiene en condiciones controlas dentro de un contenedor, elcual podría estar libre de contaminac'ión de patógenos externos si se parte de materialsaludable. El material al ser transportado y cultivado /.n v/fro en un área cerrada reducela posibilidad de la introducción de enfermedades en áreas libres de éstas. Lasprincipales ventajas son:

a) Como se lleva a cabo en un sistema cerrado, evita la entrada de artrópodos,insectos, microorganismos. En caso de infección no permite la salida deagentes causales,

b) b) Este sistema permite el monitoreo de bacterias y fitoplasmas por PCR yNested- PCR antes de sacarlas al exterior

c) c) Es un sistema portátil.

Desventajas:

a) Respuestas lentas /.n ví.frob) Alta heterogeneidad en el comportamiento del materialc) Se requiere personal especializado para llevarlo a cabod) lnstalaciones especiales

(Ashmore,1997; Santos; Rival et al ,1997; Hocher: 1997)

La aplicación que tiene la técnica de cultivo Í.n v/'Íro es que permite establecer unbanco de germoplasma, ya que ofrece la posibilidad de colectar en el campo ytransportar el material al laboratorio en condiciones estériles. Es útil para el transponea lugares donde la semilla no es disponible, cuando las semillas son grandes, frescasy difíciles de transponar, permite realizar colectas de regiones remotas a los sitios decultivo. También pueden ser utilizadas, en varias etapas en la conservación degermoplasma como son la, caracterización, selección, almacenamiento y distribuciónSería útil en la propagación y conservación de especies de semillas recalcitrantes lascuales germinan llegando a la madurez y no permiten su almacenamiento (Ashmore,1998).

Como en el caso del cocotero que es una especie con frutos de grandes dimensiones,con semillas recalcitrantes, no posee un periodo de secado y de dormancia, germinainmediatamente llegando a la madurez del fruto (Ashmore, 1998). Al transportarembriones /.n v/.Íro reduce el volumen, mantiene la viabHidad del embrión, resultadosde experimentos preliminares han mostrado que es posible almacenar embrionescigoticos de cocotero /.n v/.Íro por períodos de hasta un año (Assy Bah y Engelmann.1993).

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La diferencia entre el cultivo /.n s/.fu y el cultivo /.n v/.Íro, es que la germinación /.n s/.Íu seda dentro del fruto natualmente, ya sea debajo la plata de cocotero o en viveros y lagerminación Í.n vt.Íro de los embriones de cocotero, se lleva a cabo dentro de un vial,en un medio sintético.

1.4. El embrión cigótico del cocotero y su cultivo jn vi.fro

El embrión del cocotero se encuentra localizado, en la parte superior del fruto debajodel tallo, dentro del endocarpio o concha, debajo del ojo suave, embebido en elendospermo sólido, en el cual se puede observar dos constricciones. Con la ayuda deun sacabocado se extrae un cilindro de endospermo, el cual contiene el embrión (Fig.1 _ 4).

1.4.1. Aspectos generales del embrión

embrión

Figura 1. 4. Localización y extracción del embrión del cilindro de endospemo sólido, extraídodel fruto de cccotero. A: corte transversal del cilindro de endospermo, en el cual se puedeobservar la posición del embrión debajo la testa, embebido en el endospermo; 8: un cortetransversal del cilindro de endospermo, para la extracción del embrión y en C: el embriónextraído.

Durante el desarrollo del fmto después del proceso de deposjcjón y gelificación, paraformar el endospermo §ólido en las paredes de la cavidad de la semilla, una pequeñadepresión puede ser vista en la región micropilar del saco embrionario, bajo el ojosuave, durante esta etapa el embrión es embebido en el tejido nuclear y elendospermo celular es fomado sobre éste libremente. El embrión se desarrollalentamente y finalmente se mantiene libre en una cavídad formada en el endospermosólido, manteníéndose en forma vertical con el micrópilo en la parte superior (Cufter etal,1952). Durante el desarrollo del embrión de cocotero se dan cambios en tamaño y

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forma, el tiempo de desarrollo de los embriones es variado dependiendo de lavariedad (lsla~ Flores et al.,1998) 'El embrión del coco{ero en la madurez comprende el eje embrionario y un cotiledón(Fig.1. 5. A), tiene una forma cilindrica con medidas aproximadas de 5 a 10 mm delongitud y de 3 a 5 mm de diámetro (lslas,1998; Sugimura y Murakami,1990),El embrión del cocotero como en muchas monocotiledóneas tiene un cotiledón (c)moriológicamente y funcional, altamente especializado En el cotiledón se puedendistinguir claramen{e tres partes, la parte superior (apical: a), separada por una regiónmedia estrecha (constricción) que lo une a la parte inferior (distal: d); en esta región sedesarrollará posteriormente el haustorio (órgano digestivo, almacenamiento yproveedor de productos de hidrólisis) después de la germinación del fruto (Fig. 1. 5 8).El eje embrionario esta situado en un extremo superior del cotiledón (1. 5 A, verrecuadro) y esta formado por la plúmula, el eje central y los primordios de radícula Fig.1.5 8.

Figui.a 1.5. En A se muestra las diferentes partes que constituyen el embrión cigótico delcocotero, con una zona superior a la que se denomina apical (a); y otra zona inferiordenominada parte distal (d), las cuales forman el cotiledón del embrión, en (c); se puede ver elesquema de un corle transversal, en el cual se muestra la zona que desarrollará el haustorio(h), durante la germinación i.n si.íu, y la posición del eje embrionario (ee); en la figura frontal delembrión se muestra la ubicacíón del poro germinativo o micrópilo (pg) y los puntos pigmentadoo tanlferos (pt). En el recuadro se señalan la ubicación del eje embrionario (ee). y el micrópilo(pg). En 8 el esquema de un corte transversal del embrión, mostrando el cilinclro formado por elcotiledón (c) y la posición del eje embrionario (ee), fomado por los primordios de radicula (Pr) ylos primordios de las hojas (ph), se señalan las cadenas de haces vasculares (cv) en elcotiledón.

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En el cotiledón se puede observar un área central con una región expandida formadapor puntos pigmentados (pt), a un lado de esta área se presenta una región sin fusíón,como un corte radial al cual se le denomina micrópilo o poro germinativo (pg), bajoéste se encuentra localizado el eje embrionario (ee), formado por una zonameristemática protegida en el extremo por los primordios de las hojas plegadas ycubierta por el coleoptilo (plúmula), orientadas hacia el micrópilo; ocupando una

posición transversal al eje central del embrión. En un ángulo ligeramente menor a los45° y en sentjdo opuesto a la plúmula, están situados los primordios de la radícula(Pr). Las células meristemáticas apicales de la radícula se orientan hacia la parte lisade la región de expansión y termina en un parche circular de puntos pigmentados decolor oscuro (pt), estas células contienen materiales de un amarillo oscuro, parecidosa taninos (Selvaratnam,1952; Sugimura y Murakami,1990) (Fig.1. 5 A).

1.4.1.1. La germinación de las semillas

Se define como el proceso de activación del embrión, que comienza con la toma deagua (imbibición) por la semilla y termina con el inició de la elongación del ejeembrionarío, y la elongación de la radícula (Mayer y Poljakoff-Mayber,1989).

Para que la semilla pueda germinar, se requiere que se encuentre en las condicionesnecesarias para que el proceso de germinación pueda ser posible, las cc)ndicic)nesrequeridas de varían de acuerdo a la especie y variedad, también influyen lascondiciones de formación de la semilla y a los factores hereditarios.

Los factores que controlan las condiciones de germinación de las semillas se puedendividír en exógenos y endógenos:

Factores exógenos.. a) agua, b) gases (02, C02, etc.), c) temperatura, d) luz.

Factores endógenos: a) grado de desarrollo y madurez del embrión, b) Presencia deinhibidores y estimuladores de la germinación, c) grado de permeabílidad de la testade la semilla.

Durante la imbibición, el metabolismo rápidamente se restablece: la respiración, laactividad de los organelos y de las enzimas, síntesis de ARN y de las proteínas lascuales son actividades celulares fundamentales inmediatamente involucradas en lagerminación.

1.4.1.2. Germinacjón del fruto de cocotero

En general cuando el fruto del cocotero adquiere la madurez fisiológica, no tarda en

germinar, sÍ este se encuentra las condiciones de humedad y temperatura favorables.

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El periodo entre el acondicionamiento y la germinación puede ser variable, aunque losfrutos estén agrupados en racimos el grado de madurez. La velocidad de germinaciónes determinada por factores genétiéos y condiciones ambientales. Según Harries(1981), el tiempo requerido para la maduración y germinación distingue la germinacióntardía del tipo Niu kafa, de la germinación precoz del tipo Niu vai. El fruto contienefactores inhibitorios y estimuladores del crecimiento en el agua y endospermo, loscuales regulan la iniciación y mantenimiento de la dormancia del embrión, y las

proporciones relativas de estos pueden ser cruciales para su germinación

Tan pronto como la germinación del cocotero ha ocurrido, se da el alargamiento delembrión, y la emergencia de la plúmula a través del ojo suave de la semilla y eldesarrollo de la radícula a través de la fibra del fruto, simultáneamente con eldesarrollo de la parte apical del embrión, en la parte distal se inicia el crecimiento ydesarrollo del haustorio (organo digestivo), en el interior de la cavidad del fruto. Através del haustorio se digiere progresivamente el endospermo (Iíquido y sólido), y senutre a la planta ioven durante los primeros cuatro meses de germinación, despuéshay recambio de asimilación interna y externa por fotosíntesis (Oler,1999), despuésde 18 meses el endospermo ha sido agotado.

Aunque por lo general se considera la germinación del cocotero, cuando la plántula esvisible y ha emergido del fruto, el proceso de germinación ya ha ocurrido conanterioridad (dos meses antes).

141.3 Requerimiento de 02 para la germinación

La mayoría de las semillas requieren del oxigeno para germinar, pero esterequerimiento es dependiente de la especie El embrión es el que requiere el oxígeno,pero la estructura que lo cubre podría reducir la alimentación del oxigeno y asídetermina la sensibilidad a este gas. Los requerimientos de oxigeno para la

germinación de las semillas han sido estudiados por diferentes autores (Bewley yBlack,1982: Cóme,1982; Mayer y Poljakoff-Mayber,1989; Cóme y Corbineau.1992).Solo seis especies de plantas son conocidas en la literatura que germinan bajo anoxia.Estas son cuatro de la especie de Ech/'noch/oa (Kennedy et al„ 1980: Rumpho et al ,1984), arroz (Taylor, 1942), y Eri.fr/.na caffra (Small et al., 1989). Varias plantasacuáticas germinan mejor bajo concentraciones reducidas de oxigeno que el aire.

El requerimiento de oxigeno para la germinación de embriones aislados es menos queel de las semillas intactas, en muchos casos el embrión aislado germina bien enatmósferas conteniendo de 1 % a 3% de oxigeno.En el caso del cocotero no se sabe si la germinación es aeróbica o anaeróbica,aunque se tiene el conocimiento que el consumo de oxigeno endógeno de variostejidos meristemáticos en etapas de desarroHo del fruto, y en embriones jóvenes esalto, el cual disminuye progresivamente en embriones maduros. El desarrollo ydiferenciación del tejido del endospermo, tanto liquido como celular, no es

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acompañado por una alta velocidad endógena de respiración aeróbica (Cutter et al„1952).

1.4.1.4. Reguladores de crecimíento en la germinación

Los reguladores de crecimiento afectan la germinaci.Ón de las semillas, existenevidencias de que el balance de los reguladores de crecimiento es muy importante enel control en la dormancia y germinación. Por 1o tanto el efecto del incremento odisminución en las diferente etapas, de las gíberelinas (GA), citocininas, ácidoabsci'sÍco (ABA) y del etileno, ha sido estudiado durante dormancia, y en la ruptura dela dormancia, así como el metabolísmo durante la germinación, donde se hanevaluado los niveles endógenos de los diferentes reguladores. Durante la germinaciónlos niveles de GAs se incrementan mientras los niveles de los otros reguladoresdisminuyen.Las GAs son capaces de romper la dormancia en algunas semillas, muchos de losestudios metabólicos se han realizado con GA3. Lona (1956) y Kahn et al.,1956 seencuentran entre los primeros que mostraron que las giberelinas estimulan lagerminación de Lacíuca soarí.o/a y Lacíuca saníí.va en la oscuridad.

1.4.1.5. Las giberelinas y la inducción de procesos metabólicos en la

germinación

Las giberelinas son los reguladores de crecimiento que estimulan la germinacíón enlas semillas y tienen un papel central y regulatorio en la producción de a-amilasas, unade las hidrolasas que se sjntetizan y liberan en la membrana aleuronal. Las GAsinducen la si'ntesis de novo de una proteinasa cysteina en la membrana de la aleuronadel grano de cebada, al mismo tiempo que se sintetizan y liberan las ci-amilasa,(Bewley y Black,1994)

El mecanismo de control para síntesis de a-amilasas en la membrana aleuronal delgrano de cebada, podría operar como sigue. después de la imbjbición un factor,posiblemente GA es sintetizado por el embrión, liberado a través del escutelo ydifundido a través del almidón del endospermo y dentro de la membrana aleuronal Almismo tiempo, la membrana aleuronal sufre de cambios metabólicos que permite larecepción de la estimulación por GA, lo cual promueve la síntesis de varias hidrolasas,pero partícularmente de a-amilasas. Esta es secretada dentro del endospermo ycomienza la hidrólisis del almidón de reserva, algunas de las maltosas y glucosasliberadas por amilolisis pueden ser convertidas a sacarosa por las células aleuronalesy transportadas al crecimiento del embrión, pero mucho es absorbjdo directamente através del escutelo donde la sacarosa es formada (Lovegrove eí a/., 1998; Davies,1995).

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1.5. La técnica del cultivo jn yjfro de embriones cigóticos

La extracción de un cilindro de endospermo del fruto de cocotero conteniendo alembrión, permite mantener al embrión en condiciones jn s/.Íu, el cual se esteriliza antesy después de la extracción del embrión. El embrión es cultivado posteriormente, pormedio de la técnica de cultivo /.n vi.Íro de embriones cigoticos, germinando en un mediode cultivo en condiciones controladas, asl como su posterior conversión a plántulacompleta, desarrollo y finalmente la aclimatación y transferencia a condiciones ex v/.íro(Fig. 1. 6).

Figura 1. 6. El prcM=eso de la técnica del cultivo /.n v/'Íro de embriones cigoticos: lncluye lagermlnación del embrión cigótico y su desarrollo a plántula en condiciones /.n v/.Ím.

1.5.1. Historia del cultivo /n y/.tro de embriones cigóticos

Como se puede observar (Tabla 1.3). Se realizaron diferentes modificaciones en loscomponentes del medio de cultivo de embriones cigóticos y aunque se lograban unmejoramiento en la germinación de los embriones estos continuaban teniendoproblemas en la eficiencia la de germinación, conversión a plántulas y desarrollo.

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Tabla 1.3. Historia de cultivo de embr ones cicióticos

Roferencia Especie /embrione§Medio de cultivo Re§puesta

Hannig,1904

Cruci'fera

Medio simple Germinación de embrionessin reguladores. lnmaduros, desarrollo(MS), alto contenjdo deazucares normal

Cutter and Wilson,Cocotero Sólido y líquido, adícionado con Pobre y poco crecímjento

1 954 _ aciua de coco de i)lúmula muv lentoMursshige and Skoog

Cocotero MS, variacíón de sacarosa y Para la produccíón y1962 i)resencia de reguladores desarrollo de raícesDe Guzmán y Del Cocotero, White sólido GerminaciónRosario,1964. Makapuno Desarrollo DobreDe Guzmán,1970.

Cocotero, Murashige y Skoog (MS),15% Mejoramiento de

Makapunode agua de coco y giberelinas. geminaciónvdesarrollo de los brotes

Balaga y De Guzmán.Cocotero Inicial Wmte líquido y posterior lncremento en tamaño,

1971.Makapuno a MS sólido (agar) germinación en sólido,desarrollodelosembriones

Del Rosarío y DeCocotero lnicial White líquído y posteríor Mayor germinación y

Guzman,1976.Makapuno a MS sólido (agar) incrementodeazúcar` desarrollo de raíces.

De Guzmán y Manuel,Cocotero lncorpora CA al MS, sólido lncremento de germinación,

1977.Makapuno (jnicialmente y en subcultivos). brotes y plántula.másraíces

Mariano y De Cocotero, lncorporación de Kcl al medio Aumento de germinacíón,Guzmán,1997 Makapuno White líquido.

Eeuwens,1983Cocotero Y3 sólido, CA, Ínicialmente y Desarrollo de plántulas y

subcultivo en medio líquido raícesRillo y Paloma,1990. Cocotero Medio MS, White, Y3, en Incremento de geminación

MakaDuno li'quido v sólido. desarrollo brote v raícesKarun y Sajani,1993.

Cocotero

Medío Y3, sólido y líquido, Mejor germinación conhormona§ NM e lBA, sólido inicjalmente,crecimientodebrotes,raíces

Talavera C,1995.

Cocotero

Y3+ CA, cultivado en li.quido y Germinación de embriones,subcultivo en med liquido desarrollo de plántulas yraíces

1.5.2. Germinación Í.n v/.fro de embriones cigóticos de cocotero (cocosnucifera L).

Por lo anterior, se han establecido diferentes protocolos, para el cultivo /.n v/.Íro deembriones cigóticos de cocotero en varios centros de investigación en diferentespaíses (Costa de Marfil, Francia, India, Filipinas, y Sri-Lanka). Estos protocolos sepresentaron en el lnternational Embryo Culture and Aclimatisation Workshop (PCAAlbay Research Center, Philíppines, October 27-31, 1997). Se concluyó que lamayoría de estos protocolos difieren en las condiciones de cultivo y tienen una bajaeficiencia en la germinación (20 a 60%). Además, los tiempos requeridos para la

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germinación varían de 3 a 14 meses después de inoculac.ión, con bajos porcentajesde conversión a plántulas completas como de aclimatización de las plántulas a lascondiciones ex-v/fro (40% o menos) Los pobres resultados obtenidos quizás se debana que los protocolo se modifican y aplican a variedades muy específicas (Engelmann,1998) Cuando estos protocolos han sido aplicados en otras variedades, se hanpresentado diferencias en los resultados de germinación, conversión a plántula yaclimatización a condiciones ex-v/íro, así como también en los períodos de cultivo encada uno de ellos, a excepción del protocolo de la lndia, que reporta altos porcentaiesde germinación (90%), y solo el 60% de estas plantas se han podido establecer encondiciones de invernadero (Batugal y Engelman, 1998) Los resultados delestablecimiento de las plántulas obtenidas en los distintos protocolo en condiciones exv/.fro han sido muy bajos y no han sido reproducibles en otros laboratorios.

1.5.3. Limitaciones de los protocolos actuales para cultivo /.n v/.Íro deembriones cigóticos de cocotero

Por lo anterior los protocolos empleados actualmente presentan una baja eficiencia enla germinación que varia entre un 20% a 60% Los tiempos de germinación /n v/'Íroson muy prolongados y los embriones colectados presentan heterogeneidad en laetapa de madurez del fruto.

Los resultados de productividad obtenidos durante el cultivo /.n v/fro son muy bajos, sise compara con los porcentajes que se obtienen en la germinación de las semillas encampo, de las cuales germinan un 80% y de estas plántulas un 70% desarrollan ysobreviven (Batugal y Engelmann,1998)

La aplicación de estos protocolos a otras variedades presenta diferencias en losresultados de germinación, conversión a plántula y aclimatización a condiciones ex-v/.fro, y no ha sido reproducible en otros laboratorios

Los resultados obtenidos con esta técnica hacen necesario realizar estudios básicospara tener un mayor conocimiento acerca de la germinación de embriones cigóticos encultivo /n v/.Íro, para entender que factores son importantes en el desarrollo de lasplantas /.n v/.fro, que permitan hacer más eficiente la metodología en germinación,desarrollo y establecimiento en condiciones ex-v/.fro de las plántulas.

1.5.4. Factores que afectan a la germinación del embrión Í.n v/.tro

Los factores que intervienen en la germinación y desarrollo del embrión en cultivo /nvitro, como..

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1,5 4.1. Calidad del embrión (grado de desarrollo y madurez)

La extracción del embrión de la semilla ofrece dos ventajas, primero elcomportamiento del embríón depende esencialmente del tamaño del embrióninoculado, segundo el embrión maduro se puede extraer del fruto.

El comportamiento del embrión durante el cultivo /.n v/.Íro, depende de la etapa dedesarrollo en que se encuentra al ser inoculado, y se sabe que la sobrevivencia de losembriones extraídos se incrementa con el desarrollo y el grado de madurez adquirida(Monnier,1984). Cuando los embriones inmaduros se han cultivado tanto en mediolíquido y medio sólido (agar, Difco Bacto-Agar), y el medio de cultivo tiene bajaconcentración de azucares (sacarosa), éste germina precozmente. La germinaciónprecoz se caracteriza por la elongación prematura de células del hipocotilo, con eldesarrollo del ápice del brote, y de una, radícula elongada, produciendo una plántuladébil la cual mantiene características embriogénicas (Finkelstein y Crouch, 1984),Hannig (1904) enfatizó la importancia del empleo de una alta concentración de azúcar

(8%-12°/o) en el medio de cultivo para evitar la germinacíón de los embriones antes dela madurez.

El cultivo /.n v/.fro de embriones cigóticos es un recurso que permite el completodesarrollo del embrión en planta, ya que el período de reposo del embrión no existe,aparentemente no hay un periodo de quiescencia pues este se elimina, al ser extraídodel fruto maduro (Monnier, 1978), de tal manera que la germinación ocurreinmediatamente después del desarrollo del embrión.Si comparamos las diferentes etapas del desarrollo del embrión en condiciones /'n s/.Íucon las etapas del cultivo /`n V/.Íro (Tabla No.1. 4), se puede observar que el cjclo decultivo /.n v/.Íro, se acona, pues el embrión /.n s/.Íu, una vez terminando su desarrolloembriogénico se detiene (quiescencia) y ocurre la deshidratación, durante esteperíodo de maduración se acumulan los materiales de reservas, al mismo tiempo ladormancia podría ocurrir. En condiciones /.n v/.Íro el embrión no pasa por un periodo dereposo, por lo cual se obtiene un crecimiento vegetal más rápido (Finkelstein yCrouch,1984).Esta propiedad es usada para acortar el ciclo de cultivo y obtener un crecimientorápido de la planta

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Tabla 1. 4 Diferentes etapas a través de las cuales pasa el embrión /n s/fu,. En cultivo /'n v/.fro elperíodo de reposo es suprimido (Monnier,1995).

Etapas Embriogénesi§ Período de reposo Germinación

Desarrollosdelembrión lnmaduro Maduro Plántula

Cambios en el Multiplicación de Presencia de: Hidratación,

embrión pequeñas células células alargamiento ydeshidratadas, multiplicación de

Acumulación de reservas, células. Movilización

reservas dormancia. de reservas,adquisiciónde foto ygeotropismo.Jt

Cultivo /.n v/'fro

Ruta alterna

Monnier,1995

Una de las principales dificultades encontradas en el cultivo de embriones de cocoteroes la gran heterogeneidad durante la germinación /'n v/fro Esto depende de un altorango de factores incontrolables como son la edad del embrión, etapa de desarrollodel embrión, condiciones fisiológicas, influencia de la palma madre etc. (Verdeil et al,1998).

1.5 4.2. Medio de cultivo

La sobre vivencia y desarrollo de los embriones Í.n v/Íro depende del medio de cultivo

que se emplee (Thomas, 1972), que consiste en una mezcla de nutrientes yreguladores de crecmiento, que se modifica de acuerdo a la variedad de la planta y oen las diferentes etapas del cultivo.De naturaleza física del medio de cultivo depende el desarrollo del material cultivadoEstos se puede clasificar en medio líquido y sólido (Bonga y Von Aderkas, 1992,George et al ,1987, Pharis y Rood,1988)Para la obtención del medio sólido una alternativa es el empleo de un agente

gelificante como el gelrite, pues su uso ha sido ventajoso a otros gelificantes, por quees capaz de estandarizar el medio de cultivo (Flehinghaus et al.,1991 ) y es altamenteresistente a la degradación por las enzimas excretadas por el cultivo.

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Entre los componentes de la formulación del medio de cultivo se encuentran losreguladores de crecimiento que influyen en la germinación de los embriones cigóticos/n v/.{ro, aunque no es indispensable adicionarlos al medio de cultivo, ya que losembriones poseen sus propios reguladores de crecimiento endógenos (Monnier,1976). La aplicación exógena de ellos podría tener un efecto sinérgico con losendógenos.Del estado físico del medio de cultivo depende la disponibilidad de oxígeno, necesaria,

para la germinación de la mayoría de los embriones (Bewley y Black,1982, Cóme,1982; Mayer y Poliakoff-Mayber,1989; Cóme y Corbineau. 1992). Y del sistema decultivo depende la ubicación del material cultivado (dentro del medio de cultivo,sumergido o expuesto en la superficie del medio) en el medio de cultivo, permitiendomayor o menor disponib"dad al oxígeno.

1.5.5. Conversión a plántula

Uno de los problemas con el que se encuentra en el cultivo /n v/.fro de embrionescigóticos de cocotero es la baja conversión (un buen desarrollo que permita laobtención de una planta completa) de los embriones germinados. 0 sea un adecuadodesarrollo de la plántula. En algunos casos el desarrollo de los brotes es muy lento yla velocidad de desarrollo de los mismos es variada, mucha de las plántulas presentanmorfologías anormales. El desarrollo del brote depende mucho de la etapa demaduración del embrión y de las condiciones de germinación (kermode et al ,1989:Verdeil et al„ 1998: Tang et al„ 2000), en el caso del empleó de embriones inmadurosse obtienen una germinación precoz, con características embriogénicas, los cuales nodesarrollarán en plántulas completas. Por otro lado el porcentaje de conversión deembriones maduros germinados es muy bajo y con diferentes velocidades dedesarrollo. La conversión a plántulas de los brotes obtenidos depende de lascondiciones de cultivo (luz, temperatura, humedad), la formulación del medio decultivo, al balance de las hormonas y al sistema de cultivo empleado para esta etapa(Finkelstein y Crouch,1984, García-Martín, et al., 2001 )El porcentaje de conversión a plántulas completas obtenido de los embriones(maduros) de cocotero germinados /n v/'íro hasta ahora es muy bajo, los cualespresentan diferentes velocidad de desarrollo.

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1.5.6. Desarrollo de las plántulas de cocotero /.n v/.fro

La obtención de plántulas completas con un buen desarroHo durante el cultivo /.n v/.frodepende de las condiciones proporcionadas a los embriones después de sugerminación en condiciones /n v/.fro (Shimatzu y Kurata, 1999). Los porcentajesobtenidos de plántulas bien desarrolladas en cultivo /.n v/íro Durante el cultivo /n v/.Írode los embriones germinados se emplean diferentes composiciones del medio decultivo (medio liquido = L Ó en medio sólido = S), para su subcultivo o unacombinaciones de estos (los embriones germinados en medio S se transfieren amedio S o a un medio L, Ó en el otro caso se germinan en medio L y se transfieren amedio L o medio S) (Assy Bah,1986) Esto puede tener un efecto en el desarrollo dela plántula cultivada (Karun et al„ 1998, Verdeil et al„ 1998, Del Rosario 1998 y DeGuzmán,1976).

Se reportan muchas diferencias en los grados de desarrollo de las plántulas cultivadas/n v/.íro como son: en las medidas alcanzadas en altura, en el número de hojasescamas emitidas, en el número de hojas verdaderas, y de raíces. (Engelmann,1998)En algunos casos los embriones germinados desarrollan brotes solamente y en otroscasos generan solamente raíces, y no continúan desarrollando, esto podría dependerde la respuesta del embrión y del medio empleado para su subcultivo.

Siendo esta una condición importante en el desarroHo de las plántulas cultivadas /.nv/Íro, requiere una evaluación de este efecto, ya que se necesitan plántulas con ungrado de desarrollo adecuado, para ser transferidas a condiciones ex v/.fro, que lespermitan su sobrevivir (Verdeil et al.,1998; Del Rosario,1998; Damasco,1998; Rillo etal., 2002_)

1.5.7. Sobrevivencia de las plántulas en condiciones Ex y/.fro

En esta etapa de la técnica del cultivo /n v/íro de embriones de cocotero, se pierde ungran porcentaie de plántulas obtenidas con los diferentes protocolos empleados hastaahora. La aclimatización de las plántulas obtenidas presentan problemas y menos del40% sobreviven, los laboratorios en su mayoría no reportan porcentajes desobrevivencia ex-v/.íro (Engelmann, 1998), pues generalmente son sensibles a lascondiciones a las que se someten, Ias v/.{ro plantas tienen diferencias fisiológicas yanatómicas en las raíces, hojas y meristemo apicales (Verdeil et al., 1998) al sertransferidas de las condiciones /.r) v/Íro a condiciones de campo, pues estas plántulasson cultivadas en altas condiciones de humedad, su capacidad fotosintética y lacompensación de C02 son bajas (Swartz y Lindstrom,1986), carecen de la cantidadadecuada de la cera epicutícular y tienen estomas no funcionales, por lo tanto las

plántulas transferidas presentan una excesiva deshidratación y un pobre control en elintercambio de gases (Santamaría et al , 2002)

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Las plántulas primero se transfieren bajo una atmósferas de alta humedad, se hausado "mini invernaderos" para crear atmósfera de alta humedad los cuales consistenen domos de cristal o bolsas de plástico. Esto se utiliza pocas semanas, permitiendolas condiciones de alta humedad, enraizamiento y la adaptación progresiva a lascondiciones ambientales.

El porcentaje de aclimatación de plántulas cultivadas /.n v/íro, obtenidos con losdiferentes protocolos ha sido hasta el momento muy bajo o no se reponan datos

Hasta ahora no se ha estudiado, un método que permita la sincronización de lagerminación de los embriones, que incrementen el porcentaje de germinación y deconversión a plántulas de los embriones germinados y, que permita un adecuadodesarrollo de las plántulas cultivadas /.n v/.Íro y su aclimatación a condiciones decampo (Bonga y Von Aderkas,1992).

1.5.8. Alternativas para incrementar la eficiencia del cultivo /.n v/.fro deembriones cigóticos de cocotero.

Una alternativa para incrementar la eficiencia del sistema en la germinación y eldesarrollo de la plántula, sería efectuando modificación en las condiciones de cultivo:La posición del embrión en el medio de cultivo durante la germinación puede tener unefecto en la respuesta de germinación (Harries,1981) El estado físico del medio decultivo (sólido, líquido) y la ubicación (sumergido o expuesto) del embrión en el medio

(por medio del uso de soportes cilindros de poliestireno como flotadores para elembrión, cmndros de papel celulosa (sorbarod)), podría tener un efecto en lagerminación de los embriones.Otra alternativa para incrementar la eficiencia de la germinación del cultivo /.n v/.íro deembriones cigóticos es la aplicación de reguladores de crecimiento (ácido giberélico,GA3, ácido abscísico, ABA); y ABA / polietilenglicol (PEG) al medio de cultivo.Existen estudios realizados en germinación Í.n vÍ.Íro de embriones de palma con laaplicación de GAs (Lamout,1985, Chin et al.,1998) en los cuales la germinación seincrementó de un 60% a 90%. La acumulación de ABA es esencial para la maduraciónnormal del embrión (Bonga, 1992). En etapas tardías de embriogénesis, el ácidoAbscísíco (ABA) suprime la germinación precoz (Willianson y Quatrano,1988; Rock yQuatrano, 1991), promueve la acumulación proteínas de reserva Por lo que laaplicación de ABA podría inducir la maduración de los embriones

El polietilenglicol (PEG) es un agente activo osmótico, que mejora el desarrollo y lamaduración del embrión de un número de especies vegetales y el cual es usadoconjuntamente con ABA, (Samosir et al.,1998; Kaur et al.,1998).Lo cual permítiría incrementar el porcentaje de germinación y sincronización de lamisma.

La presente tesis forma parte de un proyecto integral del estudio del cocotero, para laobtención de conocimientos básicos del cocotero, que permitan el estudio y control de

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enfermedades, conservación, mejoramiento genético, y propagación masiva deplantas que permitan en el futuro la replantación de las zonas productoras decocoteros, con materiales resistentes y productivos

El estudio de la técnica del cultivo /n v/fro de embriones cigóticos de cocotero nospermitirá evaluar las condiciones de cultivo que permitan la modificación y obtener unprotocolo con mayor productividad en la germinación de los embriones, en eldesarrollo y climatización de las plantas en condiciones ex v/.Íro.

El mejoramiento de la técnica de cultivo /.n v/Íro, permitirá el intercambio seguro de

germoplasma de cocotero en forma de embriones, el cultivo del material i.n v/Íro conalta producción, evitando la perdida de material valioso, por la selección nointencionada del germoplasma (debido a los bajos porcentajes de germinaciónobtenidos con los protocolos actuales). Por lo tanto permitirá la conservación delmaterial específico, para su caracterización, evaluación y meioramiento. Permitirá lamovilización del germoplasma e incremento de la base genética, Io que permitiría unuso sustentable del cocotero en el futuro.

Para realizar este estudio de cultivo de embriones cigóticos de cocotero /`n v/.Íro, se

partió del protocolo empleado en el Centro de lnvestigación de Yucatán (CIcy), porser un protocolo reproducible, pero que requiere ser modificado para incrementar losbajos rendimientos (Talavera C,1995)

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1.6.2. HIPÓTESIS

1. La germinación de embríones cigóticos de cocotero Í.n v/'{ro es dependiente dela respiración aeróbíca.

2. El buen desarrollo postgerminativo de los embriones depende del medio decultivo (sólido) empleado durante la germinación.

3 La conversión de los embriones germinados a plántulas completas podríadepender del sistema de cultivo (L /S) que se emplee para su subcultivo.

4. La aclimatización de las v/.Íro-plantas depende del grado de desarrollo en elmomento de la transferencia a condiciones ex v/tro.

5. La adicíón de ácido absci'sico (ABA solo o en combinación con PEG) al mediode cultivo podri'a sincronizar la germinacíón de los embríones zigóticos decocotero, sincronizando la etapa anterior a la germínación.

6. La adición de ácído giberélico (GA3) al medio de cultivo podría incrementar los

porcentajes de germinación de los embriones cigóticos.

7. La eficiencia de la técníca de cultivo de embríones cigóticos de cocotero

puede ser incrementada (en términos del número de v/.fmo-plántulasexjtosamente adaptadas a condiciones ex vitro) mediante: (a) las condicionesde cultivo del embríón en la germinación (posición y ubicación del embrión enel sistema), (b) la modificación de los componentes del medio de cultivo(adición de fitohormonas y gelífícante), y (c) variaciones de las condiciones decultivo durante el desarrollo de las plántulas /n v/.Íro (medio de cultivo, adiciónde extensiones volumen, intercambio gaseoso), c) el grado de desarroHoalcanzado por la plántula cuando se transfiere a condlciones ex-v/.Íro.

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Capitulo 2

Mejoramiento de la respiración aeróbica en la germinación deembriones y cultivo /.n v/.fro

Los resultados de capítulo fueron publicados en ln Vitro Plant. Del 2004, Vol. 40, 90-94.

Introducción

Con el descubrimiento de germoplasma resistente en México, y la necesidad de unintercambio de germolasma, para el programa del mejoramiento integral del cultivo decocotero, que permita incrementar las fuentes genéticas de cocotero, para ser usadosen programas de mejoramiento genético y programas de replantación. Para éstepropósito es necesario introducir a México genotipos de cocotero de otras partes delmundo. Para el movimiento seguro del germoplasma, Food and AgricultureOrganization /International Board for Plant Genetic Resources (FAO/lBPGR)recomienda el uso de la técnica del cultivo /.n v/.Íro de embriones cigóticos (Frison etal.,1993), que permite su germinación y conversión a plántulas en un medio ambientecontrolado Sin embargo, Ios protocolos reportados hasta ahora muestran bajaeficiencia, alrededor de 40% de conversión comparado con el 80% en semillas encampo (ver Batugal y Engelmann, 1998). Esto limita la aplicación de esta técnicadonde la pérdida de germoplasma hace ineficiente los protocolos de cultivo /.n v/'fro, Ioscuales podrían presentar una selección genética no intencional. Estos protocolos hanusado indistintamente medio Iíquido o sólido durante las primeras semanas de cultivo

para la germinación de los embriones. El mejor resultado reportado (90% degerminación y abajo del 60% de conversión para ciertos genotipos) ha sido obtenidoen medio sólido (Karun et al.,1998), pero la razón de estos resultados no es claraEstos resultados no han sido reproducibles y los otros laboratorios repohan

porcentajes menores al 80% en germinación y menores al 40% en conversión y desobrevivencia mucho menores. Además se ha observado que cuando los embrionesson cultivados con el micrópilo con una orientación hacia arriba (V.M de Paz,comunicación personal) el porcentaie de germinación, es más alto, pero no es unapractica común. Sin embargo, ninguna investigación sistemática se ha realizado paraexplicar la causa esto Aunque las semillas de algunas especies germinan bajoanoxia, embriones o semillas de muchas especies son dependientes de la respiraciónaeróbica para su germinación (Bewley y Black,1983; Mayer y Poliakoff-Mayber,1989;Corbineau y Cóme,1995). En semillas, el poro germinativo del embrión o micrópilo esuna zona importante para el intercambio gaseoso (Corbineau y Cóme,1995) En casodel embrión del cocotero no se sabe, si requiere de la respiración aeróbica para

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germinar. De ser así, esto podría explicar la observación mencionada anteriormente.Los embríones podrían recibir probablemente una menor alimentación de oxígeno,para llevar a cabo la respiración aeróbica, sÍ se mantienen en la base del vial decultivo en medio líquido o sÍ ellos tienen el micrópilo sumergido dentro del medíosólido, cuando se cultivan con la parte superior orientada hacia abajo.En este capitulo se reportan evidencias que muestran el requerimiento de respíraciónaeróbica de los embriones cigóticos de cocotero para su germinación, y como sugerminación y conversión /.n v/.Íro son mejoradas cuando se cultivan con el extremo delmicrópilo expuesto al ambiente de la atmósfera del vial de cultivo. Este descubrimientopone las bases para el mejoramiento de protocolos del cultivo /.n v/'íro de embrionescigóticos de cocotero y un movimiento seguro de germoplasma.

Materiales y Métodos

Mafer/.a/ vegefa/. Los embriones fueron obtenidos de nueces de cocotero de lavariedad Enano malayo verde (EMV) colectados en plantaciones en Yucatán, México.Las nueces fueron cosechadas de 12-14 meses post-antesis, y el endospermo sólido(el cual contíene el embrión) fue extraído de la nuez abierta con un sacabocado (1.6cm de diámetro) según metodología (Rillo,1992, Talavera,1995).

Esfer/.//.zac/.Ón. El endospermo fue y puestos en una solución al 0.6% de Naocl(blanqueador comercial diluido). Los cilindros fueron esterilizados superficialmente con70% de etanol por 3 minutos, lavando tres veces con agua destilada estéril, despuésse lavó con una solución de 3% de Naocl por 20 minutos y tres veces con aguadestilada. En el laboratorio, bajo condiciones asépticas, los cilindros de endospermofueron nuevamente lavados con una solución del 70% de etanol por tres minutos ytres veces con agua destilada estéril, posteriormente fueron lavados con una soluciónde 3% de Naocl por 20 minutos y tres veces con agua destilada estéril. Losembriones fueron entonces extraídos del endospermo y lavados en una solución de0.6% de Naocl por 10 minutos y con agua destilada estéril tres veces (Rillo,1992).

Medi.o de cu/f/.vo y cond/.c/.ones. Cada embrión fue cultivado y germinado en viales

#,:oyT:,::natet:,;;£]ocToonTaLaá:c,Tnedd,:::r::[t,:octyv:£;:w5e;SL,,t,9E7,6L:d::,f:cma:,:apdoorfue sin (L) o con agente gelificante (S) 3 g L-` gelrite y el pH fue ajustado a 5.75 antesde esterilizar en la autoclave por 20 minutos a 120 °C y 105 Kpa. Después de la

::|ri#j::i;Óg,g':s,:grptré;neensv|:%:ndér::ñí::i::::n2a5c:;a:idamdeá:o,Á3o:,yy§iuna:dgaedn::por una semana en la oscuridad a 27± 2 °C antes de ser transferidos a condiciones deiluminación. Todos los subcultivos /.n v/tro fueron realízados con una intensidad de luzde 45-60 umol m-2s-` PPFD (photosynthetic photon flux density) y fotoperíodo de 16 / 8H. A las cuatro semanas de que las plántulas iniciaron su crecimiento, fuerontransferidas a 50 ml de medio fresco en contenedores de 500 ml. Las plántulas fueronsubcultivadas en 50 ml de medlo fresco cada seis semanas hasta que desarrollarontres hojas bífidas y tres raíces primarias. En la fase final del cumvo i.n v/.Íro se

48

emplearon extensiones de isopropileno isotáctico (bolsas) colocadas en la pahesuperior de los contenedores de 500 ml proporcionando más espacio para elcrecimiento de la plántula (de acuerdo a Rillo,1998).

Medio y posición del embrión durante !? gerLrina:!Iór.Para estudiar el efecto del agente gelificante y la orientación del embrión en elporcentaje de germinación de cocotero, Ios embriones fueron cultivaron en medio conagente gelificante (S), fueron puestos en tres diferentes orientaciones en relación conel extremo del micrópilo (manteniendo la orientación estándar del vial Orientaciónhacia arriba (SV), orientación horizontal (SH), y orientación hacia abajo (Sl). Paraembriones en el medio sin agente gelificante (L) solo hay una orientación la horizontal

y los embriones se mantuvieron sumergidos dentro del medio.

Ac//'maf/'zac/'ón de p/ántu/as Las plántulas fueron transferidas a condiciones deinvernadero, y se plantaron en bolsas negras de polietileno, conteniendo una mezclade peatmoss y suelo (1: 1 P: P) y cubiertas con una bolsa de polietileno transparentecon cortes de 1.5 cm en cada lado a una distancia 2.5 cm entre corte, después de unasemana, Ia cubierta transparente fue removida y las plántulas fueron mantenidas portres semanas más en el invernadero antes de ser transferidas a condiciones de viveroen condiciones de sombra.

Tratamiento de inhibición y velocidad de respiración Los lotes de embrionesfueron cultivados con (cianuro de potasio KCN, 0.5 iiM a 50 mM), o Azida de sodio0.46 iiM a 500 mM) como inhibidores de la respiración. Se incluyeron controles. Lavelocidad de respiración y el porcentaje de germinación fueron determinados despuésde 1, 3,15 y 30 días de cultivo en medio sólido. Para la medición, los embrionesfueron transferidos del medio de cultivo a una solución buffer (200 mM HEPES, pH 7)

::n:au;áT:rá2dt:,moo#.[agf.gpLFatpr:S3„Farc:::o,d:o:o:neomx::,roanf:Swf,,seonm5:g,aacomoe,

D/.seño exper/.menfa/. Se empleo un diseño de bloques completamente al azar. Cadatratamiento tuvo 3 Iotes con 20 embriones cada uno.

Aná//.si.s esfad/'sti.co. El análisis estadístico fue realizado basándose en losporcentajes de germinación. Los resultados fueron analizaron utilizando análisis devarianza y pruebas de Newman-Keuls (cx:=0 05) fueron usadas para la comparaciónmúltiple de la significancia de los tratamientos.La variable dependiente es germinación, Ia cual se analizó después de s semanas decultivo. Los tratamientos L, SV, SH y Sl que son las variables independientes Comoes común, la hipotes nula postula que el promedio de la germinación es igual en cadatratamiento, es decirHi

UO=U2. L13, U4

donde:

u, es la germinación media del tratamiento i, i= 1, 2, 3,4La hipótesis alternativa postula, que por lo menos un par de medias son diferentes

49

Las pruebas de Análisis de varianza de una vía, fueron realizadas empleando el

programa estadístico Sígma Stat para Windows, versión 1.0. En cada caso se verificóque los supuestos en los que se basa los análisis son satisfechos. Para consultar losdetalles de este tipo de análisis consultar Manly,1991 ; Sokal y Rohlf,1979.

Resultados y discusión

Efecto del agente gelificante y posición del embrión en germinación

El cultivo de embríones en medio S en las posiciones SV, SH y Sl (Fig. 2.1A), la

germjnación máxima de los embriones en medío líquido fue menor (66%) que Scuando los embriones fueron cultivados en SV (93%) o en orientacíón horizontal (80°/o)(Fig. 2.18). Embriones cultivados en posición Sl mostraron un porcentaje más bajo degerminación (56%) (Fig. 2.18), entre los tratamientos se observaron diferenciassignificaticas (para una p = 0.000021). El periodo de cultivo para obtener la máxíma

germinación fue más corto en S (3-4 semanas) que en líquido (5-6 semanas) (ver Fig.2.2 8). En ambos casos, los embriones germinados fueron transferídos a L despuésde germinación. Estudjos previos mostraron que si se transferían a medio S, eldesarrollo de los brotes se retrasaba y mucho de los embriones germinados noconvierten a plántulas (datos no mostrados). Por lo cual la transferencia de S a L fuerealizada. Después de seis meses en las evaluaciones de conversión se observó queel 89 % de los embriones puestos SV y 61% de SH, seguido por la germinación en L

(46%) y Sl (37°/o) (Fig. 2.1C). También se observaron diferencias significativas (parauna p < 0,00002) en el desarrollo de las plántulas después de seis meses (Fig. 2.1 D).Embríones germinados en SV se convjnieron más rápido en plántulas que algunos delos otros tratamientos y los embriones germinados en la posición Sl convirtieron en

plántulas con desarrollo muy lento (Fig. 2.1 D).

En un experimento independiente, los embriones fueron puestos en la orientaciónvertical (SV) (mostrado en la Fig. 2.1A) pero la mitad de los viales fueron rotados 90°C. Después de cuatro semanas, el porcentaje de germinación máxima de embriones

rotados fue de 98% (promedio de tres lotes, cada uno con 30 viales por tratamiento),el mismo porcentaje que en los viales no rotados.

El incremento del porcentaje de germinación y un mejor desarrollo en general, fueasociado con el cultívo inicial de los embriones (a). En medi.o sólido, con (b) laubicación del embrión con el extremo del micrópilo hacia arriba de la superficie delmedio de cultivo expuesto a la fase gaseosa del ambiente de la atmósfera en el vial.

La relevancia de éste factor individual fue probada en un experimento individual en el

que se evaluó el efecto del cultivo inicial de los embriones manteniéndolos con unaorientación hacía arriba en medio líquido, manteniendo el extremo del mícrópilosumergido (Ls) o arríba (La) en la superficie del medio (usando soporte mecánico, Fig.2.2A), y comparándolos con los embriones cultivados en medio L y SV. Paracomprobar el requerimiento del oxígeno del aire del contenedor, el extremo del

50

micrópilo de un lote de embriones fue cubierto con gel y cultivado en posición vertical

(SVc) (Fig. 2.2A) Embriones cultivados en La muestran un máximo en el porcentajede germinación (90%) similares a aquellos embriones germinados en SV (92%) y másaltos que los observados en los embriones cultivados en medio líquido (65%) o Ls(21°/o) (Fig 2.28) los cuales mostraron las diferencias significativas (para una p=0.000158). Los embriones cultivados SV alcanzaron la máxima germinación en menortiempo que los otros tratamientos (3 semanas). Cuando los embriones fueroncultivados en SV pero cubiertos con el gel, estos no pudieron germinar en las primerascinco semanas y solo después de seis semanas algunos embriones germinaron (32%)(Fig. 2.28) Los embriones cubiertos con el gel que germinaron fueron los que sehincharon y no mantuvieron completamente cubieho el extremo del micrópilo (nomostrados) como en el inicio de los experimentos Estos resultados indican que para

que el proceso de germinación de los embriones de cocotero se lleve a cabo, no esnecesario que sean cultivados en medio sólido, pero sÍ que el extremo del micrópilodebe estar arriba de la superiicie del medio y estar expuesto a la fase gaseosa delambiente de la atmósfera del vial de cultivo.

Respiración aeróbica en la germinación de embriones cigóticos de cocotero

Se conoce que muchas semillas y embriones requieren de 02 y de respiraciónaeróbica para su germinación (Bewley y Black,1983; Mayer y Poljakoff-Mayber,1989;Corbinneau y Cóme,1995). Entonces, sÍ como se mostró anteriormente los embrionesdel cocotero necesitan estar expuestos a la fase gaseosa del ambiente de laatmósfera del vial para poder germinar, ellos pueden ser dependientes de respiraciónaeróbica para su germinación. Cuando el aire del vial fue remplazado con N2, la

germinación de los embriones, después de cuatro semanas de cultivo en medio S, seredujo de un 86% a 12°/o y no se incrementó en un periodo de 10 semanas (Fig. 2.3,N2). Cuando después de 4 semanas de cultivo, la atmósfera de N2 del contenedor fueremplazada por aire, la germinación se restableció 68% (Fig. 2.3, N2-aire). Encontraste, la germinación de los embriones cultivados en atmósfera de aire fue de86% después de 4 semanas (Fig. 2.3, Control).

Adicionalmente, cuando el aire del víal fue remplazado por una mezcla de N2/02 (50/50, V V), la germinación de los embriones no fue afectada, incrementándose hastaun 92 % después de 4 semanas (Fig 2.3, N2 /02) Por lo tanto, la germinación podríallevarse a cabo con una atmósfera de aire o en presencia de oxígeno, pero no sinalguno de estos, soportando un requerimiento de la respiración aeróbica para la

germinación. Los tratamientos presentan diferencias significativas para una o:< 0.05.

Adicionalmente a estas pruebas, los embriones fueron cultivados en posición SV con

#í3::ug:i3d%e5s':n#::v:a:reo:nmdebenrlg:ne::,So:;í::Í#?b;:uon:;t§Í;igmd::e}:::r%ac,i:Kn:ed:ep(£:a6:,#M:haYy:dg:un nivel basal de 1 5 LiM h-`mg-`PF o más bajos cuando los inhibidores estuvieron

presentes en el medio (Fig. 2.4) En consecuencia la germinación cambió de un 100%

51

en medio sin .inhibidor a 0% cuando alguno de los inhibidores estuvo presente en elmedio (Tabla 2.1). En contraste, cuando después de 14 días de cultivo, Ios embrionesfueron transferidos de un medio conteniendo inhibidor a un medio libre de inhib.idor,más del 50% de los embriones germinaron después de 60 días de cultivo (Tabla 21).Estos resultados no solamente sustentan que los embriones c.igóticos de cocoterorequieren la respiración aeróbica para germ.inar, sino también un requerimientoespecifico para la ruta del citocromo oxídasa.

Nuestros resultados demuestran la importancia de mantener el extremo del micrópilode los embriones cigót.icos de cocotero expuestos al volumen de aire del contenedorde cultivo /.n v/.Íro para incrementar la eficiencia de ambos: germinación y posteriorconversión en plántulas. Este mejoramiento es importante, ya que estos ayudarían aevitar la selección no intencional causada por la baia germinación y correspondienteconversión de una población dada, poniendo las bases para el mejoramiento de losprotocolos para el cultivo de embriones de cocotero /.n v/.íro. El mejoramiento deprotocolos podría facmtar el movimiento seguro de germoplasma y de conservación dela diversidad genética.

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Tabla 2.1. Efecto de los inhibidores de la respiración en la germinación /.n v/.fm de embriones

a,egoctácr%::ea:t:::¿eoroytgogcoLS.nd„ec,:eefr,tLe,cvoanreFnea::e#ao,adyeo,v:::reó,p::Tr:ed::a¥:choanc,:5a:n::sobre la superficie del m edio de cult.vo (como SV, Fia. 1A).

Duración delTiempoTrns Germinación (%)

tratamiento conacurrido

Control KCN NaN3 2,4 DNPjnmbidor

(d) Sin inhibidor [0.5 uM] [0.0005 uM] [0.5 L'M]

Durante todo elexperimentoi

14 100 0 0 0

28 100 0 0 0

60 100 0 0 0

90 100 0 0 0

Solo durante losprimeros14días ydespuésenmedioIibredeinhibidores ii14 71 0 0 0

28 93a 34d 43c 52b

60 93a 53d 60c 66b

90 93a 53d 60c 66b

Letras diferentes después de las figuras denotan sígnificancías estadísticas diferentes (G=0 05), en dentro de las filas (i) n = 12 por tratamiento. (ii) n = 30 por tratamiento.

53

BIBLIOGRAFÍA

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54

L SV SH SI

::g:r:díá,*:,acgu:#íeos,#fiTffidneteesmt%r,::3sgc¿fnó,tértssí;=nmá:í:fi£:¡eEtT;ncoo,¥aíadyooevne::ee:diferentes orientaciones (con relación al extremo del micrópilo): Hacia arriba [SV], horizontal[SH] o hacia abajo [Sl]. Los viales fueron mantenidos en la orientación estándar con relacióna la gravedad. Efecto del agente gelificante y orientación en (8) el porcentaje de geminaciónde embriones después de s semanas. (C) el porcentaje de conversión de embriones aplántulas y (D) desarrollo de las plántulas después de seis meses. Los datos mostrados sonel promedio de 3 Iotes (n = 20) embriones por lote). Letras diferentes denotan díferenciasignificativas (cL=0.05).

55

A

[- `_.,10 `_,,

L SV SVc La Ls

8100£80Eiav ,p/zjFEEE8OL

C:860a)E Ov±!/ ,-cE40a'0200 |// /° _,:v°v°Ede/VVVVe€/gó

11111

02468

Tiempo (semanas)

Figura 2.2. (A) Cultivo /'n vt'Ín) de embriones cigóticos de cocotero (var. Enano Malayo Verde)bajo diferentes tratamientos. En medio sín agente gelificante (L), fueron colocados en unaorientación hacia arriba (con relación al extremo del mícrópilo) y soportado mecánicamente para

:gaenn`:en3r:ifi?:ríi:í3e;:LS,u::,T::,e,g;:::d::á:a.)n:ss:uT%3i::,!Lá)áoesnet:nu':aq::een:a:::i:acc::arTiba sin (SV) o con cubierta de gel (SVc). Los viales se mantuvieron en la onentación estándarcon relación a la gravedad. (8) Efecto de diferentes tratamientos en el porcentaje degerminación de embriones. Los datos mostrac¡os son el promedio de 3 lotes (n = 20 embrionespor lote). Letras dfferentes denotan diferencias significativas (a =0.05)

56

Control N2 N2-Air N2/02

Tratamiento

Figura 2.3. Germinación en diferentes condiciones de atmósfera de embriones cigóticos de

Íá::nr,oe,(vya:.oEn£3:sMea:aoyr,e¥teará:)nchuaft:yaag:ngb,:eví„roe,,aec|óTeaíi:n:enmaog::,temfcer#o?.tigmLos viales fueron mantenidos en orientación estándar en relación con la gravedad. Tiempocompleto de tratamiento: 8 semanas. (Promedio de 3 lotes, n = 20 embriones por lote).Letras diferentes denotan diferencias significantivas (a = 0.05).

57

15

Tiempo (días)

Figuia 2.4. Tasas de respiración de los embriones cigóticos de cocotero (var. Enano

rga::¥eoíe::fidÉ¡n%,t{:ag:S3:Í,¡%:¡r::ht:::seTabcr,¡:n:rsrií:e{od;nc:t:af:¡g:sa:neTr%d+oo%eTmicrópilo). En cada caso se presentan el promedio y desviación estándar de 3 lotes (n =20embriones por lote).

58

Capitulo 3

Modificaciones en las condiciones de cultivo para el desarrollo post-germinativo de embriones germinados de cocotero

Introducción

Dos de los principales problemas que se tienen con los protocolos actuales de cultivo/.n v/.Íro de embríones cigóticos de cocotero son. (a) bajo porcentaje de conversión oformación de planta completa con hojas y raíces (a partir de los embriones

germinados), y (b) baja sobrevivencia de las plántulas al ser transferidas decondiciones /.n v/.fro a ex v/.Íro @atugal y Engelmann, 1998/. La mayoría de los

protocolos reportan de un 40 a un 86% de desarrollo de los embriones iniciales enplántulas completas. La duración para obtener estas plántulas dura entre 3 a 14meses después de iniciar el cultivo de los embriones; y reportan entre 10 y 40% desobrevivencia de las plantas, algunos protocolos ní siguiera mencíonan este parámetrodespués de ser transferidas a condiciones ex v/'fro (ver Batugal y Engelmann,1998).

En cuanto a conversión, en la presente tesis se demostró que con el uso de medjosólido (Capítulo 2) y mejor aún en combinación con la adición de GA3 (Capítulo 5) se

pueden incrementar los porcentajes de germinación (cerca de 100%); así como, el deconversión (cerca de 90%) para embriones de cocotero (var. EMV).

La baja sobrevivencia de las plántulas en condiciones ex v/fro quizá se deba a que noestán adaptadas al cambio drástico de condiciones, ya que estas plántulas se handesarrollado en un ambiente de alta humedad relativa dentro del contenedor, bajailuminación y una alta disponibilidad de nutrientes en el medio de cultivo, en contrastecon las que se enfrentaran ex v/.Íro que son totalmente opuestas. En diferentesestudios se ha visto que las plantas cultivadas Í.n vt.Íro presentan baja habilidadfotosintétíca, bajo contenido de clorofilas, no contíenen carotenoides y tienen bajoÍndice estomático (Del Rosario,1998, Talavera,1998; Verdeil et al ,1998) Las hojastienen un bajo control de la transpíración, debido a la pobre funcionalidad de susestomas (Santamaría et al„ 1994,1993) y al bajo contenido de ceras (Sutter,1988) encomparación con las plantas de campo.

Se está trabajando en como mejorar el desarrollo fisiológico de las plántulas decocotero, en particular para mejorar su capacidad de control de transpiración y sucapacidad fotosintética. Se han obtenido resultados positívos usando cubiertas conventanas de papel Whatmann 1 (Talavera et al„ 1998). También se trabaja en evaluardiferentes condíciones de luz, atmósfera y típo de azucares, así como la concentración

que permita meiorar la capacidad fotosintética (G. Fuentes, resultados no publicados).

59

Otro aspecto importante es el que las plántulas tengan el volumen físico adecuadopara no restringir su crecimiento y desarrollo. En Fmpinas se acostumbra, para estepropósito el uso de bolsas de isopropileno isotáctico (Fig.3.1A) (E. Rillo, comunicaciónpersonal). Sin embrago, aún no se ha evaluado el efecto de estas bolsas sobre elcrec.imiento y el desarrollo de las plántulas, en comparación con las tapas quenormalmente se usan (Fig.3.1C). El uso de estas bolsas podría tener otras ventajas,de acuerdo a Talavera eí a/., (1998), el isopropileno isotáctico (IPP) para cubrir loscontenedores permite el intercambio de gases, como el etileno, entre el contenedor yel exterior, así como, una mayor exposición de las plantas a la luz, factores que seesperaría fueran favorables.

Por otro lado, aunque se han seguido diferentes estrategias se ha visto que esta bajasobrevivencia persíste en las plántulas aun adaptándolas gradua`mente encondiciones de nebulizador o invernadero. Entonces debe haber otros aspectos quedebemos considerar, por ejemplo el grado de desarrollo de las plántulas al momentode ser transfer.idas a condic.iones ex v/.fro. En nuestro laboratorio se ha observado queel número de hojas y de raíces podría ser determinante para la sobrevivencia ex vitrode las plántulas (J L Chan, comunicación personal).

Por lo tanto es necesario estudiar si el grado de desarrollo de las plántulasefectivamente afecta la sobrevivencia ex vi.fro, y cual sería grado de desarrollo mínimonecesario para garantizar la sobrevivencia. El trabajo repohado en el presente capítulotuvo como objetivo defin.ir el grado de desarrollo de las plántulas cult.ivadas i.n vi.Íro que

permita lograr un alto porcentaje de sobrevivencia a condiciones ex v/.Íro. Para ello seevaluaron modlficaciones a las cond.iciones de cult.ivo para favorecer el desarrollo delas plántulas: (a) empleo de extensiones de isoprop.ileno isotáctico como cub.ierta delos contenedores de cultivo para proveer volumen adic.ional, y (b) uso de diferentessoportes para mejorar el desarrollo de las raíces.

Materiales y Métodos

Mater/.a/ vegefa/ y cu/t/.vo /.n v/.tro.-Frutos de cocotero (C. nucí.fera L.) de la variedadEnano Malayo Verde fueron colectados de 10-12 meses después de la polinización enDzidzantún, Yucatán, Mex. Se extrajeron los embriones y fueron geminados en medioY3 + CA, sólido y líquido (Eeuwens,1976: Rillo y Paloma 1992) en frascos de 50 mlcon 10 ml de medio de cultivo y tapa de plástico (Fig. 3.1A) Después de la

germinación fueron subcultivadas cada 6 a s semanas en medio Y3 líquido y se

rd::tsiá:edr°dneef|u,Uondceuioht:ndees::!tá::ntcé°trcousn)rdéeg'4m5::od:+°ot,°#Í:.q°yduen:6t:8mTérDaFUFr:de 27 ± 2 °C. Durante este periodo se usaron dos tamaños de frascos con tapa deplástico, uno de 145 ml y otro de 500 ml, en el primero se conservaron pcir 24semanas y en el segundo por s semanas (Fig. 3 18 y C) Cuando las plantas crecieronrebasando el nivel del contenedor se les añadió una extensión en forma de bolsa delpp (Fig. 3.1 D) obtenida localmente. Este material se caracterizó por medio de análisis

por calorimetría diferenc.ial de barrido que demostró que el material comercial

60

(adquirido local) usado para este propósito corresponde a Ísopropileno isotáctico (Fig.

t3e?f:,g?aqvT;eat:í:mpf:s::t,:Tnatf:'t::::á:cn:,cnooa:odnéf::tá,nmdpaurr,eFZ,:S,3P2u3)sE::em::::r:a:control se ha empleado en ocasiones para incrementar el volumen de loscontenedores de cultivo en Filipínas. Pero no se emplea sistemáticamente, (vertermogramas del material con las características de Tresaphan SCB, Hoescht figura3.3) hasta finalizar el cultivo /.r} v/.Íro.

Prpparación.de las plántulas para su transferencia ex vitro (invernadero). Lasplántulas cultivadas /.n v/Íro que alcanzaron las condicjones definidas para sutransferencia (tres hojas bífidas y tres rai.ces primarias), se extrajeron del contenedorde cultivo, se lavaron cuidadosamente con agua corriente para eliminar los residuosdel medio de cultívo (evitando que se desprenda la capa de mucílago que recubre eltejido de la parte externa de las raíces) después se lavaron las raíces en una soluciónde fungicida de 2.5 g L-` (Benlate), para evitar que las raíces se deshidraten secubrieron con papel toalla húmeda hasta que estas fueron sembradas en bolsasnegras de polietileno (20 5 X 30 cm) en substrato estéril el cual fue una mezcla de

peatmoss y suelo en una proporción de 1 1 (peso / peso). A cada plántula sembradase le regó y cubrió por una semana con una bolsa de polietíleno trasparentes a la cualse le realizó cortes en los laterales diagonales (cortes de 1.5 cm a los costados y en laparte superior con 2 cm de distancia entre corte y cohe) con el objeto de mantener lahumedad relativa dentro del domo formado por la bolsa, después de transcurrido éstetiempo se retiró la bolsa y se continuó el cultivo de las plántulas por un período de 3semanas más en el invernadero con riego semanal, después las plantas fuerontransferidas a condiciones de campo (vivero) con sombreadero (se protegíó el áreacon una malla negra), en las instalaciones del CICY, hasta que su aclímatación,establecimiento y desarrollo permitieron que se les transfiera totalmente a condicionesde campo.

Conc//.c/.ones c/e /.nvemac/ero y sombreadero.- Las plantas fueron transferídas a

;ncve,rn:::r:n,eenns,?:i'cáoen::zdemáuxímn:,tuáaí#uFeed2a|dsr:':ttJamd-9si;,%bot:,:rF:rr:t::ie33condiciones de sombreadero (humedad relativa 48%, temperatura 36-38 °C, y unaintensidad de luz máxima de 506 Limol m-2 s-') bajo la proteccíón de malla Las

plántulas se mantuvieron en las mismas bolsas en las cuales se sembraron eninvernadero y solo transferidas al sombreadero y regadas cada tercer día Al terminareste periodo fueron transferidas a condiciones de campo.

D/-seño ejrper/.menfa/ Se empleo un diseño de bloques completamente al azar Cadatratamiento tuvo (3 lotes para tapas metálicas n = 5 y tres lotes para las extensiones (n= 10).

Aná//.s/.s esfad/'sf/.co. El análisis estadístjco fue realizado basándose en losporcentajes de germinación. Los resultados fueron analizados utilizando Análisis deVarianza de una vía y pruebas de Newman-Keuls (usando niveles de significancia cc=0.05) fueron usadas para la comparación múltiple de la significancia de lostratamientos.

61

El análisis estadístico fue realizado basándose en los porcentaies de convers.ión Lavariable dependiente en cada caso fue altura, peso, número de hojas y número deraícesprimariasdelasplántulas.LasvariablesindependientesfueromLn-,L/Ext,SrT

y S/Ext.

Las pruebas de Análisis de varianza, fueron realizadas empleando el programaestadístico S.igma Stat para w.indows, versión 1 0. En cada caso se verificó que lossupuestosenlosquesebasanlosanálisisdesignificanc.iafueronsat.isfactorios.

Re§ultados y discusión

a. El efecto del uso de extensiones de isopropilem isotáctico en el desarrollo delas plántulas

Visualmente se pudo observar que cuando se usan las tapas convencionales, lasplántulas al desarrollar mant.ienen sus hojas enroscadas en el borde del contenedor,presentando una coloración pálida o clorosis y apariencia delgada (Fig.3.3A), lasraíces presentan desarrollo pobre (Fig. 338) y muestran la presenc.ia deneumatóforos (F.ig 3.38, flecha). Contrastando con las plántulas cultivadas encontendores a los que se les colocó la extensión, que no mostraron clorosis en lashojas y su grosor fue normal (Fig. 3 3C). Asimismo sus raíces mostraron un extensodesarrollo presentado los diferentes ordenes, pr.imarias, secundarias y terciarias (Fig.3.3D).

En cuanto a la evaluación cuant.itativa, se observaron que hay diferenciassignificativas entre los tratamientos con tapa y con extensión, obten.iéndose mejoresresultados con el uso de extensiones.

Al evaluar el efecto de las extensiones en el desarrollo de las plántulas sedeterminaron cuatro parámetros: altura, peso, número de hojas y número de raícesprimarias de las plántulas. Los resultados mostraron que las plántulas cult.ivadas enlos contenedores cubieftos con extens.ión se desarrollaron con más vigor que las quese cultivaron en los contenedores cubiertos con tapas convencionales.

En el caso de plántulas provenientes de embriones germ.inados en med`o L encontenedores con tapa convencional, la mayoría de ellas tuvo una altura en el rangode 10-20 cm En contraste, cuando se usÓ la extens.ión la mayoría de las plántulasestuvieron en los a los rangos mayores 21-30 y 31-40 cm (Fig, 3 4A). En plántulas

germinadas en medio S ocurrió lo mismo aunque la diferencia fue menos pronunciada(Fig. 3.4A).

En el caso del peso fresco en plántulas provenientes de embriones germinados enmedio L, cuando se uso tapa convenc.ional los porcentajes de plántulas en losintervalos de altura señalados anteriormente fueron menores que cuando se uso la

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extensíón (Fig 3 48) En plántulas germinadas en medio S ociirríó lo mismo, pero el

porcentaje alcanzado en el intervalo de 31-40-cm fue mayor (Fig. 3. 48).En el caso de hojas bífidas en plántulas provenientes de embriones germinados enmedio L, cuando se uso tapa convencíonal el número de hojas en cada rango dealtura fue menor que cuando se usÓ la extensión (Fíg 3.4C) En plántulas germinadasen medio S ocurrió lo mismo, los valores fueron similares en ambos casos L y S (Fig.3.4C)

En el caso de raíces prímarias en plántulas provenientes de embriones germinados enmedio L, cuando se usÓ tapa convencional el número de raíces en cada rango dealtura fue menor que cuando se usÓ la extensíón (Fig 3 4C). En plántulas germinadasen medio S ocurrió lo mismo, los valores fueron similares en ambos casos L y S (Fig3 4C). Es importante señalar que el número de hojas y el número de raíces primariasobtenidos cuando se usaron extensiones, no sólo fueron mayores que cuando se usÓtapa convencional, pero que oscilaron entre 2 y 3.5 Estos valores fueron importantespara sobrevivencia como se verá más adelante.

Los resultados muestran que cualitativamente y cuantitativamente hay diferenciassignificativas entre cultivar a las plántulas en contenedores con tapa convencional y encontenedores con extensión, siendo mejor el crecimiento y el desarrollo cuando se usaextensión Entre las plántulas formadas de embriones germinados en medio L ó medioS, no hay diferencias en crecimíento y desarrollo. El porcentaje de conversión cuandose germinan los embriones en medio S es mayor que cuando se germinan en medio L(ver Capítulo 2) Esto hace necesario el empleo de las extensiones de lpp en la últimafase del desarrollo de las plántulas /n v/.Íro, pues es permite un pre aclimatamiento delas plántulas, exponiéndolas a un mayor volumen, permitiendo el intercambio de

gases, permitiendo un control de la perdida de agua

Adicionalmente es importante señalar que se observó que las plántulas durante sudesarrollo /`n v/'Íro, sobre la superficie de las raíces, muestran la presencia de unasustancia mucilaginosa y que sÍ ésta es removida cuando las plántulas se separan delmedio de cultivo, al final del proceso Í`n v/'Íro, para ser transferidas a condiciones exv/'Íro, aparentemente afecta el desempeño posterior ex vt.fro de la plántula.

b. El efecto de diferentes soportes en el desarrollo de las raíces

En reportes previos se indica que las plántulas de cocotero obtenidas en condiciones/n v/.Íro generalmente generan un reducido número de raíces primarias (Batugal yEngelmann,1998). Al mismo tiempo se ha observado que la presencia de este tipo deraíces es clave para el establecímiento y sobrevivencia de las plántulas encondicíones ex v/.Íro (resultados de los estudios del grupo de trabajo del proyectococotero del CICY, resultados no publicados). Por tal razón seria conveníente contarcon un tratamiento que permitiera mejorar la generación de raíces primarias en lasplántulas cultivadas Í.n v/.fro.

Cuando las plántulas están listas para ser transferidas a condiciones ex v/.{ro, seembolsan en mezclas de tierra con peatmost, vermiculíta Ó perlita (Aitken-Christie y

63

Thorpe, 1984, Dumasl986), materiales con los que se han obtenido buenosresultados en la generación de raícesPor lo tanto con el propósito de mejorar el desarrollo /.n v/.m del sistema de raíces delas plántulas de cocotero, se decidió evaluar la adición al med.io de cuM (Iíquido) delos siguientes materiales: agrol.ita, vermicul.ita Ó fibra cocopeat como soportes (Fig.3.5A). Los resultados no fueron favorables ya que-no indujeron la generac.ión de unmayor número de raíces, afectaron negativamente el desarrollo de las plántulas. Estasaicanzaron, en reiación con las plántulas cultivadas sin sopohe (control), una mengrtalla, su desarrollo de raíces fue pobre, y las hojas mostraron clorosis y senescencia(Fig. 3.58) Por lo tanto no se recomienda el uso de ninguno de estos materiales.

c. Grado de desarrollo y sobrevivencia ex vitro

Ya se mencionó arriba que de acuerdo a observaciones prev.ias, es necesario quedurante el cultivo /.n v/tro las plántulas de cocotero alcancen c.ierto grado de desarrollopara que sobrevivan exitosamente al ser transferidas a condiciones ex vifro, Sinembargo, hasta el momento no hay estudios en los que se hayan definido yseleccionado las características de desarrollo mínimas requeridas para dichatransferencia En esta secc.ión se reporta un estudio para definir estos requerimientosde desarrollo. Para ello se evaluó la sobrev.ivencia de plántulas mostrando d.iferentesniveles de desarrollo: (a) dos hojas bífidas, una raíz primaria corta (5-8 cm)., (b) doshojas bífidas y una raíz primaria de más de s cm; (c) tres hojas bífidas y una raízprimaria de más de s cm; (d) tres hojas bífidas y 2 raíces primarias con raícessecundarias, y (e) tres o más hojas bífidas y 3 raíces pr.imarias con raícessecundarias. Plántulas con un menor grado de desarrollo no se usaron pues porobservaciones previas sabemos que no sobreviven.

Como resultado de este exper.imento se observó que con excepción del primer grupocuya sobrevivencia fue de 80%, en los otros con plántulas más desarrolladas seobtuvo 100°/o (Tabla 3.1). Por lo tanto es recomendable perm'itir ciue las plántulasalcancen a formar al menos dos hojas bífidas y dos raíces pr.imarias antes de sertransferidas a condiciones ex v/.{ro, para asegurar su sobrevivencia.

En la Tabla 3.2 se resumen los resultados del proceso cuando los embriones segerminan en medio S, se usan extensiones para favorecer el desarrollo de lasplántulas y estas se transfieren a condiciones ex v/% cuando cumplieron con losrequisitos mínimos de desarrollo. De cada 100 embriones 85% germinan después della mes, cerca de 80% alcanzan a convenirse en plántulas después del mes 6-7,lográndose de esta forma una la sobrev'ivencia de 100% en vivero, mostrando uncrecimiento vigoroso (Fig. 3. 6).

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Tabla 3.1. Sobrevivencia de las plántulas en condiciones ex v/Ím (invernadero y vivero)erminadas en medic) sólido v subcu tivadasen medio i auido..Grupo

Hojas Raíces Raíces Raíces %Bífidas primarias secundarias terciarias Sobrevivenciaexvitro*

1 2 1 (5-8 cm) Si No 80

2 2 1 (8 cm 0más) Si No 100

34 23>3 1 (8 o más) Si No 100

2 Si Si 100

5 >4 3 Si Si 100*Después de 11 meses. Primera semana cubierta con bolsas con cohes, despuesdescubieftas.Cadaqrupoconsistiódetreslotesde10plántulasc/u.

Tabla 3.2. Plantas cultivadas /'n vÍ.Ín) en medio Y3 sólido con empleo de extensiones,

Etapa (%o) de respuesta / tiempo acumulado100 embriones (meses)

Germinación 85 1

Desarrollo a plántula completaAclimatizaciónexv/.froí 78 6-7

78 8-10

(1 ) Plantas con hojas bífidas y raíces primarias trasferidas a sustrato peatmost-suelo

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Figura 3.1. Viales empleados durante el cultivo /.n v/.Ím de embriones cigóticos de cocotero.(A) vial de 50 ml cx)n{eniendo 10 ml de medio Y3 + CA + gelificante, empleado para lageminación de los embriones, (8) viales de 125 ml con 25 ml de medio de cuM Y3 + CAllquido, empleados para convei.sión de los embriones germinados, (C) vial de 500 ml con 50ml de medio de cultivo Y3 + CA Iíquido cubierto con tapas convencionales empleados para eldesarrollo de las plántulas (D) vial de 500 ml con 50 ml de medio de cultivo Y3 + CA Iíquido,cubiertos con la extensión de isopropileno isotáctico, empleado en la ultima etapa del cultivo /.r)vitro.

69

3§00 3000 2500 2000 1 SD0 1000 5CK`

W®venumbers (cm-1)

\8+̀\

ü'-PP<orArol fim (samplo pp3) ¡-Ppthist"(Smplepp4) \

100 20 0 300 400 500 600

Temperature. C

Figura 3.2. ldentificación clel material utilizado para la fabricación de las extensiones,empleadas como cubierta de los contenedores de cultivo. En (A) se presentan los espectrosde las muestras comparadas por calorimetiia diferencial de barrido, en la parte superior elmatenal a identíñcar (adquirido local, Cholul, Yuc.), en la inferior el control (PP3..isopolipropíleno isotáctico, con las caracteristicas de Tresaphan SCB, Hoescht, el cual ftieproporcionado por la Dra. Rillo de Filipinas). En (8) se presenta los resuttados de lacomparación de los materiales realizado por medjo de temogravimetría, materiales control(PP3) y la muestra a identificar (PP4), este material parece no contener impurezas ycorresponde a isopropileno isotáctico.

Análisis realizados por el lng. Tomas Madera de la unidacl de materiales del CICY.

70

FíE)Lim ).3. ErBEb d¿l Em]pleo de E.ittph5ién do bopreFill€no ifsoládco en €1 desqrTolo do laé p!anb5 ebt€iiida3 drl mf mom 'pi.tD de embrbma Elgótico5 do Úoeottpo. i[A) Plámiia "11ivada5 t!n Emiz!iiE!dor coii tapa conv€ri#ona] oblE.ruda dz21B

=tg)nñc:#"Tb?aod:-Lüt£:|npT.a#rmdtietiLB|FÜ=ep#m=r!€asm,=üts¥;=dm€mn"±,üa*=nüpoaBn_B(uDT#í€D,:,.r#:a5flbó#::t±E! ri]ceE) En plánbiliia o.ov€nl€nto5 dB la gEimLnaBión tm mcdio S 'y 6ubüJlijvada6 m d""o L eoíi la ublizBción deom€iisün, En cada Hs® qas paántula5 5o njlüvaJion tkspué5 dEr 10 rr"e5 ÜEi mJftnrD iri v.'`l,ro.

Ln sn L/EXT s/EXTlntervalo de altura (cm)

Ln- sn L;Ex s/EXTlntervalo de altura (cm)

Ln sn- L/EXT snlntervalo de altura (cm)

Ln SrT L/EXT S/EXTlntervalo de altura (cm)

Flgura 3.4. Efecto del uso de extensiones de isopropileno isotáctico en el desarrollo de lasplantas, empleadas durante dos meses, en la última etapa del desarrollo in vffm. Plántulasobtenjdas de embriones cigóticos de cocotero var, EMV geminados en medio Y3 sóljdo ylíquido, cultivadas en medio Y3 líquido en viales cubiertos cDn la tapa convencional demetal y con las extensiones en forma de bolsas transparentes, 3 lotes para tapas metálicas(n = 5) y tres lotes para las extensiones (n = !0) (A) Promedio de las alturas de las plántulasen cada tratamiento, las cuales presentan diferencias significativas (p =0.0001). (8) Sepresentan los promedicx; de pesos en cada tratamiento (p = 0.00087), (C) Promedio delnúmero de hqias b[fidas para cada tratamiento (p = 0.0145) y en (D) Promedjo del númerode raíces primarias en cada tratamiento (p = 0.019). En todos los parámetros evaluadospresentan diferencias signifi catJvas enti.e tratamientos.lJT = líqujdo con tapa me4álica; LJEX = Iíquido cubierto con extensión de isopropilenoisotáctico; S/T= sólido con tapa metálica; S/Ex = sólido ciibierto con extensión deisopropileno isotáctico

72

''';.`

abcd

Figura 3.5 Efecto de la adición de diferentes materiales de sopode al medio de cultivo /.n vitmen el desarrollo de las plántulas, obtenidas de la germinación de embriones cigóticos decocotero var. EMV. En A se miiestran las plántulas en los diferentes soportes usados. En todoslos casos se empleó medio Y3 liquido más a: sin soporte, b: agrolita; c: vemiculita; d: coco-peat. En 8 se muestran las plántulas después de dos meses de cultivo en cada tratamiento.Todas las plántulas usadas contaban con dos hojas bífidas y al menos una raíz primana aliniciar el tratamiento.

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1246

Tiempo (semanas)

lnvernadero Vivero

Tratamiento

Figum 3.6. Adaptación ex vffro (invernadero y vivero) de plantas de cocotero var. EMVobtenidas después de 10 meses de cultivo /.n v#ro, obtenidas de embriones cigóticosgerminados en medio sólido posición vertical, mostrándose la duración en cada etapa delProceso.

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Capitulo 4

Efecto del ácido abscísico y el polientilenglicol en la germinación /.nv/.fro de embriones cigóticos de cocotero (Cocos nuci'fera L.)

Introducción

El ácido abscísico (ABA) es una fitohormona que juega un papel importante durante laetapa de la maduración del embríón Suprime la germinación precoz de los embrionesinmaduros e induce la expresión de los genes asociados a la maduración para laacumulación de productos de reserva y la adquisición de tolerancia a la desecación

(Rock y Quatrano, 1995; White et al , 2000) de la semilla. La distribución de ABA en lasemilla es diferencial, localizándose principalmente en las membranas y las cubiertasde las semillas y en menor cantidad en el eje embrionario (Subbaiah y PoweH,1987).Los niveles de ABA varían entre 1-10 uM (Rock y Quatrano, 1995). ABA tiene unefecto en los eventos fisiológicos y morfológicos que ocurren durante el desarrollo dela semilla. Se reportan bajos durante la embriogénesis temprana y luego se elevanconsiderablemente durante la embriogénesis media y dismínuyen durante la etapatardía de embriogénesis después de la acumulación de los materiales de reserva y laetapa de desecación (Dodeman et al.,1997, Rock y Quatrano,1995) Durante estasetapas la concentración de ABA establece los procesos que permíten la adquisición detolerancia a la desecación y dormancía de las semillas (White y RÍvín, 2000)

En embríones inmaduros de trigo, maíz, col, girasol y soya, la aplicación de ABA encondiciones /n v/.fro favoreció la maduración y previno la germinación (Blackman et al„1991; Lepage-Degivry y Garelo,1992; Rock y Quatrano,1995) La inhibición de la

germinación causada por ABA se eliminó al lavar a los embriones con agua,restableciéndose la germinación (Lepage-Degivry y Garelo,1992)

Por otro lado se ha encontrado que el políetilenglicol (PEG), promueve también lamaduración e inhibe la germinación de embriones de diferentes especies comolechuga (Powell et al.,1984) y pepino (Gawronska et al. 2000). Se propone que estosefectos ocurren porque PEG genera condiciones de estrés hídrico en los tejidos, loque provoca una disminución de citocininas, giberelinas y se incrementan los nivelesde ABA endógeno (Itaí et al ,1968; Mizrahi et al ,1971; Boucaud y Unger,1976;Morgan,1990; Kaur et al ,1998). Bajo estas condiciones se reduce el transporte desacarosa de los cotiledones a los ejes embrionarios (Lovegrove y Hooley, 1982,Bewley y Black,1982; Gupta et al ,1993; Bewley y Black,1994 Kaur et al.,1998)En el caso del cultivo í.n v/.íro de los embriones cígóticos de cocotero, no tienen elmismo grado de desarrollo y por 1o tanto su grado de madurez no es homogéneo. Porlo que esto puede explicar la heterogeneídad en la germinación de embriones. Por ello

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se ha sugerido e` uso de ABA Y PEG, para promover la maduración de embrionescigóticos de cocotero logrando así incrementar el porcentaie de germinación las.incronizac.ión de esta y el porcentaje de conversión de estos embr.iones.

g:T,::::s(1:i:,.ceon,e::,'JnaarsL::ruenTef;í,,dce:n2:;M;c,ao,n::oÁáeyo517o/ú:a,-p;rF:n;c:Ó,p,g:respect.ivamente. Aunque el porcentaje de germinación es aún bajo, estos resultadosmuestran que el potenc.ial del uso de ABA para promover la germinación de cocoteroin vitro.

Adic.ionalmente, el ABA (en combinación con PEG) también se ha probado conrespectoaembriogenesissomática,observándoseunefectoposMenelnúmerodeembriones formados, pero además lográndose un desarrollo más s.incronizado ymayor porcentaje de germinación (Samosir et al.,1998).

Es evidente que el ABA y el PEG incrementan el % de germinac.ión de los embrionesde cocotero /.n v/.fro, pem no se sabe el efecto que tendrían con la edad de losembriones que se emplean, y probando los dos compuestos en conjunto.

Con base a lo anter.ior se consideró que era importante extender el estudio del uso deABAsoloyademásencombinaciónconPEGencultivo/.nv/trodeembr.ionescigóticosde cocotero. Por lo tanto el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de laaplicación ABA y PEG, en el porcentaje de germinación de embriones cigóticos decocotero cultivados i.n v/fro.

Materiales y métodos

Obtenci.ón y preparaci.Ón de /os embr/.ones.- Se util.izaron embriones de cocoteroextraídos de los frutos de la variedad EMV con una edad de 12" meses después depol.in.izaciómAlosembrionesselesapl.icóeltratamientodeesterilizac.ión(R."1992)mencionado anteriormente (ver materiales y métodos en el capítulo 11). El materialb.iológicoempleadoparalosexper.imentosfuecolectadoenDzidzantúmYuc.

Trafam/.entos con ABA /PEG.- Los embriones fueron cultivados individualmente enmed.io sólido (Y3+ CA + gelificante) al cual se le agregaron diferentes concentracionesde ABA en combinación con PEG empleando un d.iseño factorial con las siguientes

%ohnec:rct:fc¿%ne;pdEeGto:fo,t§báL2,,,¡2p5á,3%50,os,#,ácchse.#:cna¡.g:T:ra::[:;„,S:gc::de ABA y GA3 se realizó a temperatura ambiente, por medio de filtración a través deuna membrana MIlipore" M.ilelex-GS" con poros de un diámetro 0.22 tJm (Carriglwohill,Co, Crkireland) La aplicación de ABA se real.izó después de la ester.ilización del mediode cuftM) (en frío) en condiciones asépticas; el PEG fue aplicado al med.io de cult.ivoantes de ester.ilizar en autoclave a 15 Psi por 15 m.in. El tratamiento de ABA / PEG fueaplicadoporunperíododedossemanas,despuésdelascualeslosembrionesfuerontransferidos a un medio de cultivo fresco (libre de hormonas) y a un med.io fresco ccmGA3 [0.45 LiM], se cultivaron por un periodo de cuatro semanas más después de este

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periodo los embriones que germinaron se transfírieron a medio Y3 Iíquido paradesarrollo posterior.Se evaluó el efecto de la adición al medio de cultivo de ABA o PEG, solos o encgmbinación, sobre el peso seco de los embriones, el porcentaje de germinación y susincronizacjón.

D/.sefio e)íper/.menfa/ Se ha empleando un diseño factorial con las siguientesconcentraciones de ABA (0, 2 2, 22 5, 45 0 4/M/ y PEG (0,10, 30 g 1-'. El experimentose realizó con 3 lotes de 20 embriones cada uno.

Análisis estadístico. El análisis estadístico fue realizado basándose en los

porcentajes de germinación Peso seco Los resultados fueron analizaron empleandoAnálisis de varianza y pruebas de Newman-Keuls (usando niveles de significancía a:=0.05) para la comparacíón múltiple de la significancia de los tratamíentos

Las pruebas de ANOVA de una vía, fueron realizadas empleando el programaestadístico Sigma Stat para windows, versión 1 0. En cada caso se verificó que lossupuestos en los que se basa los análisís de significancia fueron satisfechos

Resultados y discusión

a. Efecto de ABA/PEG sobre el peso seco

Los Pesos secos de los embriones incrementaron con la adición de ABA y /o PEG

#::a:T3)oE:T.:nt°ar+nb::enmceanut:Ófu:nd:n%r%tm3e3t:°:npE:s:°sge:;i;nerAOB;o,:Uuanndp°o::mayor, 0.015 g. Por otro lado, el mayor Íncremento de 0.22 g fue obtenido con 2 uMABA sin PEG El resto de los tratamientos con ABA Ó PEG solos Ó en combinacióncausaron incrementos con valores intermedios. Sin embargo los tratamientosmostraron diferencias significativas entre los tratamientos y el control, la diferencia de

promedios es de St-Newman-Keul que normalmente es p<0 05)

77

Tabh4.1.Efectodelaapl.icac.ióndeABA/PEGenelpesosecodeembr.ionescigóticosdei EMV una edad de l2 a l4 meses después de ponnizcaAC;ón ..,. dE:cocotero. en ia var.tratamientoseaplicocons.inGA3.arauABA(uM) I=WIV, uHa cugv v, .durante2semanas,lue

go fueron `ransferidos a medio 0'3 +CA) soiicioltivaronorssemanas.na n =20 or tratamiento, los cuales se cupEG(gL')

0 100.97311.03141.03121.0508 30

0 0.84861.01.01391.0197

2.2 1.0654

22.5 1.0316

45.o 1.0591.0319

EI PEG se reporta que causa .incrementos en peso seco, pues genera condiciones deestrés hídrico y esto puede conducir a un incremento de ABA endógem el cualpropicia la acumulación de materiales de reserva en soya (Blackman et al.,1991), a'igualqueenembrionesdepepino(Gawronskaetal„2000)ydePí.ceag/auca(Dustanet al.,1988).

Sin embargo los tratamientos generaron defectos en la moriología de los embr.ionesFigura 4J Los embriones germinados normalmente sin tratam.iento (F.ig. 4.1A)contrastan con el tipo de embriones obtenidos con tratamientos ABA / PEG Sepresentó. vitrificac.ión, elongación del brote y de la hoja escama (F.ig. 4.18); bi.ote conaspecto esponjoso y hoja escama necrótica separada del embrión (Fig. 4.1C), brotecubieho por la hoja escama con el eje del cot.iledón deforme con aspecto fenolizado(Fig. 41D), brote elongado con la hoja escama fusionada y un pobre desarrollo (Fig.

€oínE,e,Er:ttoasm:eenfteoct:,:fÁ3rAonpE:y33x:enL9,ose,P5a¿fyoa:geToossetLa;:,TLeenstops;eg::t:,r%Tpj:aspectodevitrificac.iónyfueron.incapacesdegerminar.ComosemuestraenlaTabla4.2 estos tratamientos tuvieron un efecto negativo sobre la germ.inac.ión.

Los cambios en la moriología descritos anteriormente podrían ser la respuesta a lascondiciones de estrés hídrico causadas por el uso de PEG en los tratam.ientos, puesse conoce que PEG genera cambios en las características ultraestructurales de Pi.ceag/auca(Robehs,1991)yFas/.a/.aponi.ca(LÓpez-CarboneHetal.,1994).

78

Tabla 4.2. Efecto de la aplicacíón cle ABA /PEG en

STP::o::3i:'sg3téc::rg:n::gstedr:ger:ap#se::?,:,TY.:2aossDsempn:Sdecu,t-enmed,.o

ABA (uM)

n -jiQLEviacion estandar).PEG(gL-`)

0 1013o150.0133.3

0 98.6 52.62.2 65.0 30.0

22.5 75.0 40.0 25.045.045.0 38.0 31.5

el porcentaje de germinación /.n v/.Íro de

b. Efecto de ABA /PEG sobre el porcentaje de germinación

La germinación de los embriones de los lotes control fue de 98%, mientras que con losotros tratamientos siempre hubo un efecto i.nhibi.torio reduciéndose el porcentaje degerminacjón a valores entre 23 y 63%, según el tratamiento (Tabla 4.2).

El bajo porcentaje de germinación obtenido con los tratamientos podría deberse a quese indujo un estado dormante del embrión (Roberts, et al,1991; Flinn, et al.,1993;Thorpe,1995) por que los niveles de ABA endógeno podían haber si.do ya altos en losembriones usados, pues eran maduros, y al añadir ABA resultó en una concentracíónexcesiva de esta fítohormona. Otro factor que pudo haber contribuido es que a losembriones no se efectuó un lavado exhausti.vo después del tratamiento de ABA paraeliminarle como recomienda por Le Page-Degivry y Garello (1992).

Desafortunadamente al momento de realizar este experimento no teníamoscc!nocimiento de esta experjencia. Aunque difícilmente esta podría ser la causaprimaria pues los tratamientos con ABA consistieron de un pulso de dos semanas,después del cual los embriones fueron subcultivados varias veces, siempre a mediolibre de ABA. De esta forma la concentración de esta fitohormana debíó habersediluido muchas veces en este proceso y la disminución del porcentaje de germinaciónocurrió aún con las con las concentraciones más bajas de ABA usadas.

Para tratar de contrarrestar la capacidad de ABA para inhibir la germinación se probóla adición de la giberelina GA3, puesto que es sabido que las giberelinas promueven la

germinación y este efecto ha sido ya demostrado en el presente sistema de cultivo deembriones cigótícos de cocotero (ver Capítulo 5). Los embriones después de sertratados por dos semanas con ABA se subcultivaron en medio S libre de estafitohormona. Cuando al medio se le añadjó GA3 (4.6 HM), el 75% Ios embriones

germinaron, mi.entras que cuando los embriones fueron transferidos a un medio sin lagiberelína sólo 40% germinó. Sin embargo el tratamiento con GA3 no permítió que selograra la recuperación del porcentaje de germinación de 98% obtenido para elcontrol, sin adíción al medio de ABA ó PEG.

79

En cuanto al desarrollo de las plántulas obten.idas de la germinación de los embrionestratados, se observaron alterac.iones. Se presentaron hojas fusionadas y redondas, enalgunos brotes no hubo desarrollo normal de la hoja escama, solamente se desarrolloel eje del brote, el cual elongó en forma cHíndrica muy delgada, en algunos casosvitrificado o con pardeamiento (con aspecto deshidratado) del eje del embrión y delbrote, los cuales no se desarrollaron y necrosaron posteriormente Con exc?pc.ión devitrificación que solo ocurrió con PEG, todas las otras alteraciones ocurrieron conambos, solos o en comb'inacíón.

Los resultados obtenidos en este trabaio contrastan con los reportados por Damasco(1998), quien reportó un incremento en los porcentaies germinación de embrionescigóticos tratados con ABA. Probablemente en su caso los embriones eran .inmadurosaún pues la edad que reporta es de 10-12 meses (después de polin.ización) y se tratade una variedad alta, las que generalmente requieren de mayor tiempo paramaduración que las variedades enanas. Por ello se esperaría que tuvieron nivelesendógenos ABA más bajos que en embriones maduros, como reportan otros autorespara otras especies (Dodeman et al„ 1997, Rock y Quatrano, 1995) y fueran másresponsivos a esta fitohormona al ser añadida al medio En nuestro caso, losembriones eran de 12-14 meses y de una variedad enana, y ciertamente ya habíanalcanzado la madurez, al menos la mayoría. De esta forma, esperábamos que ABA /PEG permit.iera uniformizar la madurez de los embriones y así favorecer la

germinación, su s.incronización y eventualmente la conversión. Este trabajo qu.e laaplicación de ABA solo Ó en combinación con PEG no es recomendable para meiorarel cultivo de embr.iones c.igóticos maduros de cocotero, al menos de la variedad EMV.Aunque ABA pudiera favorecer la maduración de embriones de cocotero cuando estánen la etapa de embriogénesis media antes de .iniciar la etapa de secado y favorecer lagerm.inac.ión

80

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82

CT ABA / PEG

Figura 4.1. Efecto de los diferentes tratamientos de ABA y /ó PEG en la morfología de losembriones cigóticos de cocotero germinados en medio Y3 sólido. A: geminación normal del

iÉ?nm,!:c:guó#:?Ád:A;:P9,ie::r,t#io,)e,:;:a:n[i,;ot::tTa#emr::g::n,eb,rv:t:f::ffi:::ó:né:táFhe:c,:B::Affi:;J:,

TesioonsaaddaosneÉróÁ'B#PEAGBf3o'uPME9o`áogEM);e2n2e:ó:nL:',,epm"bT':rnd,uon:hh.:,aae:=ammaatids:of:#::con un pobre desarrollo, el desarrollo del primordio fue elongado. Embriones después de ssemanas de cultivo. El tratamjento ftie aplícado durante las dos primeras semanas del cultivo.

83

Capitulo 5

L+

Efecto del ácido giberélico (GA3) en la germinación de embrionescigóticos de cocotero /.n v/.fro y su desarrollo post-germinativo

(Los resultados de este capítulo serán sometidos para su publicación en ln Vítro Plant

lntroducción

Las giberalinas (GAs) son fitohormonas que influyen en la germinación (Gaspar et al.,1996) y se encuentran en altos niveles durante el desarrollo del fruto, disminuyendodurante la fase de maduración e incrementan sus niveles durante la germinación(Rock y Quatrano,1995). En reportes sobre la aplicación de ácido giberélico (GA3) adíferentes semillas dormates se observó que esta giberelina permitió romper ladormancia e indujo la germinacíón (Evans et al., 1996; Fisher, 1980, Yoshida yHirasawa, 1996, Kaur et al., 1998, Powell, 1987). La aplicación de GA3 (encondíciones /n v/fro) además de favorecer el porcentaje de germinacíón, ha mostradoun efecto positivo en la velocidad de germinación como en el caso de semillas degirasol (Baskin y Baskín,1975), de palmas de Kentia (Howea Íorsíeri.ana) (Chin et al ,1988),

Las GAs en el embrión estímulan a las células de la aleurona, las cuales segregan unrango de enzimas hidrolítícas, principalmente a-amilasas (Lovegrove eí a/., 1998,Davíes,1995). Estas enzimas son responsables de la movilízacíón de los materialesde reserva para el crecimiento de las plántulas. En el caso de semillas de tomate(Lycopers/.cum escu/eíum Mill) GA3 induce la expresión secuencial de las endo P-manasas en díferentes áreas del endospermo, iniciando en el área del micrópilo,(Nonogaki et al„ 2000). Las giberelinas también Índucen la actividad de enzimas queson importantes para la germinación y el crecímiento post-germinativo

Con la aplícación de GA3 a diversas semillas también se han observado efectos post-

germinativos como un mayor desarrollo del brote, un cambio en la morfología de lashojas y una mayor adaptabilidad al medio (Phillips,1998; Kaur et al.,1998) En el casode chicharo (Písum safí.vum L ) se ha reportado que GA3 incrementa la actividad deinvertasa ácida soluble producíendo la acumulación de azucares y elongación de losentrenodos en las plántulas durante su crecimíento post-germinativo (Miyamoto ef a/.,2000, Swain et a/,1997). En el caso de Cerc/.s sí//.quas{rum L, durante el desarrollo

posgerminativo, Ia aplicación de GA3 Íncrementó el número de hojas y raíces (Rascioeí a/ , 1998);

85

También se han realizado estudios en embriogénesis somática donde la aplicación deGA3 meioró el desarrollo y porcentajes de germinación de los embr.iones provenientesdel cultivo de diferentes tejidos (Dustan et al., 1995; Choi et al„ 2000), en embriones§omáticos de C/.% s/.ner)s/.s, favorec.ió un balance en el desarrollo de brotes y raíces,lo cual mejoró la conversión a plántula produc.iendo más del 60 % de sobrevivencia(Dustan et al ,1995)

Los reportes de la aplicación de GAs en el cult.ivo y rescate de embriones c.igóticos /.nvt.W son pocos, pero se ha reportado que favorecen su germinación y desarrollo post-germinatvo como cuando se ha usado. Por ejemplo cuando se usÓ GA3 conembr.iones de Phaseo/us w/gar/.s x Phaseo/us po/yaníus, se incrementó lagerminación de 45% a 70% (Geerts et al.,1999). En el caso de maiz se demostró queel uso de g.iberelinas fue necesar.io para la lograr la germ.inación de embriones•inmaduros (White y Rivin, 2000), y en el caso de embriones maduros extraidos de

semillas inmaduras la adición de GA3 incrementó el porcentaje de germ.inación de 20%a 80% (Jacobsen et al.,1995: Arnalte et al.,1991).

Entonces como puede verse el uso de giberelinas puede ser favorable para lagerminación y el desarrollo post-germ.inativo tanto para semillas en condicionesnormales o í.n v/.Íro, como para embriones en condiciones /.rt v/.Íro.

El cult.ivo /.n vi.fro de embriones de cocotero es una estrategia recomenada para elmov.miento de material vegetal debido a que anula la importación de patógenos. S.inembargo los % de germinación oscilan entre 60%-80% con una reconversión del 40%

En el caso del cultivo /.n v/.Íro de embr.iones cigóticos de cocotero no se ha estudiado elefecto de la aplicación GAs al medio de cultivo sobre la germinación y el desarrollo

post-germinativo. Por lo tanto el objetivo del trabajo reportado en este capítulo fueevaluar el efecto de la adición de GA3 al medio de cultivo en condiciones /.n vífro, sobre

la germinación de embriones cigóticos de cocotero y el crecimiento post-germinativo.

Materiales y métodos

Oófenc/.Ón de /os embri.ones. Los embriones fueron extraídos de los frutos decocotero de la variedad Enano Malayo Verde (EMV) y Enano Malayo Amar.illo (EMA)obtenidos en la localidad de Dzidzantún, Yucatán México. Los frutos fueroncosechados con una edad de 12~14 meses después de polinizac.ión (madurosfisiológ.icamente). Los frutos se coftaron transversalmente con un machete y seextrajeron los cmndros de endospermo sólido, con la ayuda de un sacabocado de 2cm de diámetro. De cada fruto se extrae un cilindro de endospermo sólido, en el cualse encuentra .inmerso el embrión.

Esteri.//.zac/.ón Los c.ilindros de endospermo son obtenidos en el sitio de recolección yson depositados en una solución al 0.6 % NAOCL. Posteriormente son lavados conuna solución al 70% de etanol por tres minutos y lavados a tres veces con agua

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destilada estén.l, después se esterilizan superfi.cialmente con una solución al 3%NaocL por 20 minutos y se lavan tres veces con agua destilada estéril En ellaboratorío bajo condi.cíones asépticas los cilindros se esterilízan nuevamente en unasolución al 70% de etanol por 3 minutos y se lavan tres veces con agua destilada,después se les aplica la solución de 3% de NaocL por 20 minutos y se lava tresveces con agua destilada estéril. Los embriones se extraen de los cilindros delendospermo y posteriormente se lavan con una solución de 0 6 NaocL por 10 minutolavándose tres veces con agua destílada estéril. (Rillo,1992. Talavera,1995)

A¢ed/.o de cu/f/.vo. Cada embrión fue cultivado en contenedores de 50 ml los cuales

:F:tuea|Í::,leoaT:dd,::aer3áonya3ct`,:aeduow:2n;,g'9L7|i,,ET:E,fácea,d:epd::E:,ocuy,tpv:,osTaaJ(ulsgt:2a,

:q7u:d:nt3:r:eeFu+oec::ovesaór,,g:rs2eoaT:ndTtóosuna::::fe§:,,f:cma:,teeótFgedL,.83鄧:,r¥teTeg,:adiciono GA3 después de autoclaveado, el GA3 fue esterilizado por filtración a travésde membranas de Milipore de 2 micras Durante las primeras cuatro semanas decultivo los embriones fueron mantenidos en condíciones de obscuridad a 27 ± 2 °C.Después los embriones cultivados en sólido fueron transferidos a contendores de 145ml con 25 ml de medio líquido y a contenedores de 500 ml conteníendo 50 ml demedio para su desarrollo. En medio líquido los embriones se cultivaron Ínicialmente

por 6 a s semanas en las condiciones mencionadas anteriormente después fuerontransferidos a medío Y3 líquido nuevo.

Ad/.c/.ón c/e GA3 a/ mec//.o de cu/Í/.vo. La concentración de GA3 fue dependiente delsistema de cultivo empleado, se aplicó 0 46 uM para el medio líquido y 4.6 LiM para elmedio sólido El tratamiento de GA3 fue aplicado por un período de cuatro semanas.Después los embriones germinados se transfirieron a medio Iíquido fresco (libre dereguladores de crecimiento

Cond/.c/.ones c/e cu/f/.vo /.n v/.fro de /as p/ánfu/as. Las plántulas obtenidas de lagerminacíón /.n v/'frc) de los embriones se subcultivan cada seis semanas en medio Y3Ii'quido, dependiendo de su desarrollo en contendores (de 145 con 25 ml de medi.o;500 ml con 50 ml de medio y en la fase fínal en contendores de 500 ml con 50 ml de

Fa::,:o:%,,:,,%nn::ddoeuf:fo::::ondsóótnt6d:,¥3,hu,mc:::::Pn::snas:ddaed,s:T[:pá,:n4o5.,Sgt:#cmo.,2S-1 PAR Hasta que las plántulas alcanzaron un desarrollo de tres hojas bífidas y tresrai.ces primarias.

7tansferenct.a c/e /as p/ánfu/as a cond/.c/.ones ex-v/.fro Las plántulas se extrajerondel contenedor, a las cuales se les retiró el residuo del medio de cultivo por medio deun lavado muy suave de las raíces y se les aplícó un funguicida (Benlate 2 g Lí)

posteriormente son transferidas a bolsas negras de polivinil con un sustrato de suelo ypeatmost (1:1 peso/peso), las cuales fueron regadas y cubiertas con una bolsa depoli.vínil transparente con cortes en los costados y en la parte superior de 2 cm, con lacual se crea un domo con las condícíones de humedad relativa, manteniéndose enestas condiciones por una semana, después de este periodo fueron retíradas y semantuvieron en condiciones de invernadero por cuatro semanas más, con riego

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semanal. Después de este tiempo las plántulas fueron transferidas a cond.iciones devivero con sombreadero (con luz natural modificada por una malla negra) para suaclimatización. Cuando se menciona medio S o medio L se hace referencia al tipo demedio usado sólo para las primeras cuatro semanas, ya que en las semanas restantesen ambos casos se usó medio líquido (ver detalles en Materiales y Métodos).

En el caso de los embr.iones de la var. EMV, se midió crecimiento y desarrollo lasplántulas evaluando cuatro parámetros, altura, peso fresco, número de hojas bífidas ynúmero de raíces primarias.

D/'seño experi.menfa/. Se empleo un diseño de bloques completamente al azar, s.inrepetición. Cada tratamiento fue realizado para una n =20 para L, y n =30 para S porcada tiempo, en cada tratamiento sin y con GA3

Aná//.s/.s esfadi'sfi.co. El análisis estadístico fue realizado basándose en losporcentajes de germinación y conversión. Por Análisis de Varianza de una vía ypruebas de Newman-Keuls (usando niveles de significancia cc= 0.05), paracomparación múltiple de la significancia de los tratamientos. En cada caso se verificóque los supuestos en los que se basan los análisis de significancia fueron satisfechos.Se empleó el programa estadíst.ico Sigma Stat para windows, versión 1.0. Una curvas.igmo.idea fue ajustada a los datos observados por medio del programa Table curve2D versión 3 for windows 32. Jandel y graficados por medio del programa Sigma Plotdel paquete estadístico Jandel Scientific.En el desarrollo de este experimento las var.iables dependientes consideradas fueronaltura, peso, número de hojas y número de raíces primarias de las plántulas. Lasvariables .independientes son. Ln-, L/Ext, Sff y S/Ext

Resultados y Discusión

Se defin.ió la concentración de GA3 a emplearse en cada sistema de cultivo, aplicandolas concentraciones [0.046, 0.46, 4.6, 46.0 iiM] en ambos sistemas (F.ig. 5.1A). Siendola mejor concentración de 0.46 uM para el medio Iíquido y 4.6 uM para el mediosólido. El tratamiento de GA3 fue aplicado durante las primeras cuatro semanas delcultivo de los embriones. Después los embriones germinados se transf.irieron a mediolíquido fresco (libre de reguladores de crecimiento) donde continuaron su desarrollo.

En la Fig. 5.1 se presentan los porcentajes máximos de germinación alcanzados concada una de las concentraciones usadas después de las semanas 5 y 30. Tanto paramedio S como para med.io L, con 46.0 uM la germinación disminuyó y con 0.046 iiMno hubo efecto con respecto al control. Las otras dos concentraciones usadaspermitieron obtener un efecto positivo sobre el porcentaje de germinación tanto enmedio L como en medio S. Las mejores respiiestas se obtuvieron con 4,5 uM paramedio S y con 0.46 LiM para medio L, síendo mayor cuando se usÓ medio SSe confirmaron los resultados obten.idos en el primer ensayo. Los porcentajes degerminación fueron mayores en medio S qiie en medio L. Para semana la 30, el

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porcentaje en medi.o S Íncrementó de 87% en el control a 98% con GA3 4 6 uM (Fig5.2). En medío L incrementó de 62% en el control a 80% con GA3 0 46 iiM (Fig 5 2)

Los tiempos para que el 50% de los embriones de cada población puedan germinar(medídos como coeficiente de germinación, CG) fueron menores en medio S que enmedio L, y cuando se aplicó GA3 fueron menores que en los controles En medio S elCG disminuyó de 0.46 en el control a 0 36 con GA3 4.6 HM (Fig. 5.2; Tabla 5.1). Enmedio L disminuyó de 0.56 en el control a 0 43 con GA3 0 46 HM (Fig. 5.2; Tabla 51).GA3 fue aplicado durante las primeras cuatro semanas de cultivo de los embriones encondiciones de oscuridad, después de este tiempo estos fueron transferidos a mediolibre de GA3 para su subcultivo. Después de germinar a los embriones se le siguió sudesarrollo y se pudo observar que la aplicación de GA3 también tuvo un efecto post-

germinativo, incrementando los porcentajes de conversión a plántula completa. Enmedio S incrementó de 60% en el control a 87% con GA34.6 uM (Fig. 5.3A). En medíoL incrementó de 25 en el control a 45 con GA3 0.46 LiM (Fig 5 3A).

En forma comparativa se evaluó el efecto de GA3 en medio sólido y en medio li.quidosobre la germinación y la conversión de embriones de la var EMA, ya que este setiene conocimiento que presenta menor respuesta que el EMV. Los resultadosmostraron que en forma similar a lo observado para embriones de la var. EMV, los dela var. EMA mostraron mayores porcentajes de germinación y de conversión en mediosólído que en medío líquido (Fíg. 5.38) En medio sólido también se observaronmayores porcentajes en ambos parámetros cuando se uso GA3 en el medio enrelación a los valores en el tratamiento control (Fig 5.38) Sin embargo los

porcentajes en ambos parámetros fueron inferiores a los obtenidos con embriones dela var EMV. En el caso de medio líquido no se observó diferencia entre el tratamientocon GA3 y el control (Fig 5.38)

En el caso de plántulas provenientes de embriones germinados en medio L sin GA3, Iamayori'a de ellas tuvo una altura menor de 10 cm. En contraste, cuando se uso GA3 lamayoría de las plántulas estuvieron en los rangos mayores 21-30 y 31-40 cm (Fig5.4). En plántulas provenientes de embriones germinados en medio S sin GA3 los

porcentajes fueron relativamente uniformes en todos los rangos, mientras que cuandose usó GA3 la mayoría estuvieron en el rango de 21-30 (Fíg. 5.4). Con base a estasobservaciones, para evaluar a los otros parámetros peso fresco, número de hojasbífídas y número de raíces primarías, no se consideraron las plántulas menores de 10cm Y el estudio se concentró en las plántulas con mayores posibilídades dedesarrollar adecuadamente.

En cuanto a peso fresco, se pudo observar en general un efecto favorable con el usode GA3 En el rango de 10-20 cm de altura, con medio S el peso de las plántulas fuemayor cuando se aplicó GA3 que cuando no, pero con medio L no hubo diferencia(Fíg. 5 5A) El peso con medio S fue mayor que con medio L (Fig. 5. 5A) En el rangode 21-30 cm de altura no hubo diferencias significativas en el peso de las plántulascon los diferentes tratamíentos (Fíg 5 58). En el rango de 31-40 cm de altura, el pesode las plántulas fue mayor cuando se aplicó GA3 que cuando no, ya sea usando medio

89

S o medio L (F.ig 5. 5C) El peso con medio S fue mayor que con medio L cuando seaplicó la giberelina, pero no hubo diferencia cuando no se aplicó (Fig. 5. 5C).

Con respecto al número de hoias bífidas por plántula, en el rango de 10-20 cm dealtura no se observó n.inguna diferencia entre los tratamientos y todos los valoresfueron cercanos a 2.6 (Fig. 5.58). Para las plántulas en el rango de 21-30 cm dealtura, si se observaron diferencias cuando se añadió GA3, s.iendo mayor el valorobtenido que cuando no se añadió (Fig. 5. 58) Para medio L sin GA3 se obtuvo 2.5m.ientras qiie con la giberelina fue 3. Con medio S sin GA3 se obtuvo 2.3 y con la

giberel.ina fue 2 7. Como puede verse, Ios valores con medio L (con o sin giberelina)fueron ligeramente mayores que con medio S Para las plántulas en el rango de 3140cm de altura, en tres de los tratamientos medio L con o sin GA3 y medio S sin GA3, nohubo diferencias y los valores obtenidos fueron cercanos a 3 (F`ig. 5.58). En contraste,en el caso de medio S con GA3 el valor observado fue 3 6, mayor que en los otrostratamientos (Fig. 5. 58).

En el caso del número de raíces primarias por plántula, en el rango de 10-20 cm dealtura se observaron diferencias cuando se añadió GA3, siendo mayor el valorobtenido que cuando no se añadió (Fig 5. 5C). Para medio L sin GA3 se obtuvo 1`8mientras que con la giberelina fue 2.6. Con med.io S s.in GA3 se obtuvo 2.6 y con la

giberelina fue 2.85. Los valores con medio S (con o sin giberelina) fueron mayores quecon medio L En las plántulas en el rango de 21-30 cm de altura también seobservaron diferencias cuando se añadió GA3. Para medio L sin GA3 se obtuvo 2.5mientras que con la g.iberelina fue 2, con medio S sin GA3 se obtuvo 3 y con lagiberelina fue 3.3 (Fig.5. 5C). En las plántulas en el rango de 31-40 cm de altura sólose observaron diferencias cuando se añadió GA3 cuando se uso medio S. Para medioL con o sin GA3 se obtuvo 3, con medio S sin GA3 se obtuvo 3.3 y con la giberelina fue3.5 (Fig. 5. 5C).

Plántulas de los rangos de altura de 21-30 y 31-40 cm obtenidas en medio L o S, cono sin GA3 fueron transferidas de cultivo /.n vi.fro a condiciones ex vi.íro cuando teníantres hojas bífidas y tres raíces primarias. En todos los casos la sobrevivenciaobservada después de tres meses fue de 100% (Tabla 5 2).

90

Tabla 5.1. Sobrevivencía ex/.n v/tro de b.Ííi vÍ{Íc; ae emDriones Cimedíodeerminacióín

fgu°et'%S:eC°S°t::°L(Y)a:.o=nasn¡:#yoVerde),despuésde3meses.EiTratamíento'a

3. Sobrevivencia

Med'o GA3 L'M nD 1%11001100100100L 0 1 10/10

L 0.46 15/15S 0 33/33S 1 4.6 1(a)Lasplántulasfuerontransferidasdectresraícesprimariasypertenecierona 42/42

ultivo m vtíro cuando tenían tres hojas bífidas yloslntervalodealturade21-30y31-40cm.

v/fro de las plántulas obtenidas de diferentes tratamientos en cultivo

Estos resultados indícan que el uso de la giberelina GA3 es benéfíco para la

germínación /.n v/.íro de los embriones cigóticos de cocotero tanto en términos deporcentaje máximo de germínacíón como del tiempo que tomó alcanzar dichoporcentai`e.

En cuanto a la germinación, GA3 (4.6 uM) permítió incrementarla en doce unidades

porcentuales para alcanzar un porcentaje máximo de 95% cuando se usÓ medio S EIporcentaje de germinación ya era alto, así que aunque el incremento fue relativamentepequeño, la germinación máxima alcanzada fue muy alta, de hecho mayor que laobservada en vivero de 80% para esta variedad de cocotero (8. Maust, datos nopublicados) Cuando se usÓ medio L, GA3 (0.46 uM) permitió incrementar lagerminación 18 unidades porcentuales para alcanzar un porcentaje máximo de 80°/oEn este caso el efecto fue mayor ya que el porcentaje i.nicial era mucho más bajo quecuando se usó medio S. Sin embargo este porcentaje máxímo que se alcanzó fue elmismo que el observado en vivero. En cuanto al tiempo que tomó obtener lagerminación máxima en presencia de GA3, hubo una reduccíón de 9 semanas a 5semanas cuando se usÓ medio S, y de 14 a s semanas cuando se uso medio L. Enambos casos la diferencia es muy grande, reducíéndose el tíempo casi a la mitad. Esimportante señalar que tanto para el porcentaje de germínación máximo como para eltíempo requerido para alcanzar a este porcentaje, Ios mejores efectos se lograroncuando se uso la combinación de medio S y GA3 Las concentraciones de GA3 usadascor cada medio fueron diferentes Al defínir en que concentración se obtenían lasmejores respuestas, se encontró que fueron 4 6 HM en medio S y 0 46 uM en medioL La necesidad de una mayor concentración de giberelína cuando se usa medio Spodría deberse a que en este medio la difusión de las moléculas de giberelina debeser más lenta que en medio L.

El efecto favorable de GA3 sobre la germinación de los embriones cígótícos deCocotero coíncíde con los obtenidos cuando se ha estudiado el efecto de GA3 en lagerminación embriones de otras especies En cultívo de embriones de Phaseou/usw/gar/'s (cultivar NI 637) GA3 incrementó el porcentaje de germinación de losembríones y la velocidad de creci.miento de los brotes (Geerts et al , 1999). Enembriones cigóticos de girasol Bíanco et al (1994) y embriones somáticos de Panaxg/.nseng (C A. Meyer), (Kwang-Tae et al, 2000) GA3 favoreció la germinacíón al romper

91

la dormancia después de `a madurac.ión. En semillas de la palma Howea ftm%m(Chin et al„ 1988) y en embriones maduros de maíz (White y Rivin, 2000), amboscultivados /.n v/.fro, GA3 incrementó el porcentaie germ.inación y permitió que esta sealcanzó mas rápidamente.

Los resultados presentados aquí también mostraron que el uso de la giberelina GA3 esbenéfico para la conversión /.n v/fn) de los embriones. En medio S se logró un•incremento de 27 unidades porcentuales para alcanzar un porcentaje de conversión

máxima de 87% del total de los embriones ensayados En medio L se logró unincremento de 20 unidades porcentuales para alcanzar un porcentaje de conversiónmáx.ima de 45%. Los incrementos fueron importantes, pahiculamente en el caso demedio L pues el porcentaje sin GA3 fue muy bajo. Nuevamente es claro que el mejorefecto se obtiene del uso comb.inado de medio S y GA3, que permitieron obtener unporcentaje de conversión de casi el doble del obtenido con med.io L y GA3.Para evaluar si se podía obtener un efecto similar del uso de GA3 en embriones deotra variedad de cocotero, se probó en embriones de la variedad EMA. Los resultadosmostraron un efecto similar al obtenido con los embriones de la variedad EMV puesGA3 permitió también incrementar el porcentaie de germinación y de conversión,aunque los valores obtenidos con o sin la giberelina, y con medio S o medio L,siempre fueron inferiores a los obtenidos con embriones de EMV. Esto probablementese deba a que se usÓ para EMA el protocolo desarrollado para EMV y sólo seprobaron las concentraciones Óptimas de GA3 definidas para el caso de EMV. Por lotanto al menos en el caso de un genotipo diferente, podría ser necesario hacer ajustesa la metodología desarrollada para EMV, y probablemente ocurriria lo mismo parapoder usarla Óptimamente con otras variedades.

Para poder determ.inar s.i el uso de GA3 tenía un efecto en desarrollo se evaluó suefecto en altura, peso fresco, número de hoias bífidas y raíces primarias de lasplántulas desarrolladas. Se pudo obtener un efecto favorable, particularmente encombinación con medio S, en cuanto al porcentaje de plántulas mejor desarrolladas,es dec.m que alcanzaban una mayor altura, Ias cuales al m.ismo tiempo eTan las quemostraban mayor peso, número de hoias bífidas y número de raíces primarias.

S.im.ilarmente a los resultados reportados aquí, otros estudios también han mostradoun efecto favorable de giberelinas en el desarrollo post-germinat'M El tratamiento deCerc/.s s/.//.quasírwn L con GA3 durante la germinación tuvo un efecto post germinativofavorable ya que las plantas obtenidas fueron de mayor altura y número de hojas quelos otros tratamientos (Rascio et al„ 1998). En plántulas de P/.sum sanf/.vLm (L)(Miyamoto et al., 2000) y de Trí.#/.cum aesf/.vum (L) (Lev-Yadum et al.,1999)desarrolladas en condiciones /n v/.Ítio, el iiso de giberelinas favoreció el crecimiento.Por otro lado también para el crecimiento de las raíces se ha demostrado laimportancia de las giberelinas, ya que la adición de un inhibidor de estas fitohormonasa plántulas de Lemna m/.nor desarrollándose in vm inhibió el crecimiento de lasraíces, pero al añadir GA3 al medio se restableció su crecimiento normal (lnada et al„2000)En Cuanto a la SoDrevIver`Cla uc ld> |jlalllulao, .u r.uv ..._.._. T__dependiente del uso de medio S o de medio L, ni de la adición de GA3, pues lo que se

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Ia sobrevivencia de las plántulas, se pudo observar que no es

requiere es que las plántulas alcancen un grado de desarrollo mi.nímo quecorresponde a haber formado dos raíces primarias y dos hojas bífídas GA3 puedetener un efecto, pero Índirecto al permitir la formación de un mayor número deplántulas con estás caracteri'sticas en un menor periodo de tiempo

93

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96

ELíquido DSóljdo

0 0.046 0.46 4.6

Concentración GA3 (uM|

E] Líquidol] Sólido

0 0.046 0.46 4.6 46Concentración GA3 (LiM)

Figura 5.1. Efecto de la aplicación de díferentes concentración de GA3 en medio de cultivoIíquido y.sólido en la germinación de embriones cigóticos de cocotero el cual fue colocadocon el micrópi.lo hacia arriba, después de su geminación se subcultivó en medio Iíquido sinregulador a las 5 semanas (A) y 40 semanas de cultivo (8) en los análisis de los resultadosse emplearon los análisis varianza y el mélodo de Student-Newman-Keuls. Var. EMV local,3 lotes de n = 20 embriones.

97

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (semanas)

Figura 5.2. Efecto de GA3 (ácido giberélico) en la geminación de embriones cigóticos decocotero cultivados /.n v#ro en medio líquido (L) y en medio sólido (S). El experimento serealizó con la var. Enano Malayo Verde con una n = 20 por punto. El tratamiento de GA3 seaplicó durante las cuatro primeras semanas de cultivo (Ios embriones de la var. EMV fuerontransferidos a medio liquido después de su gemiinación), el cual duró 30 semanasSe encontró cliferencias significativas entre tratamientos para una p<0.05, letras diferentesdenotan diferencias significativas, por el método de comparación múltiple de Newman-Keuls.

98

-GA3 + GA3 -GA3 +GA3

Liquido Sólido

-GA3 + GA3 -GA3 + GA3Líquido Sólido

Figura 5.3. Efecto de ciiatro tratamientos en la germinación de embriones cigóticos decocotero. En A: geminación y conversión a plántulas en medjo Liquido -GA3, + GA3 en la var.EMV. y. En 8: en medio sólido -GA3. + GA3 en la var. EMA, el tratamiento de GA3 se aplicó conun pulso de 4 semanas, en medio líquido (0.46 i.M) y en sólido (4.6 uM), se subcultivaron enliquido. Se emplean 3 lotes de n = 30 por tratamiento. Letras diferentes denotan significanciaestadistica dfferente para un análisis de comparación múltiple para una p< 0.5.

99

<10 10-20 21-30 3140

Intervalo de altura (cm)

Figura 5.4. Efecto de la aplicación de GA3 al medio de geminación de embriones cigóticosde cocotero var. EMV /.n v/.Ím, en medio rí3) liquido = L, y sólido = S) en la altura de lasplántulas. La aplicación de GA3 fue realizada durante las 4 primeras semanas de cu¡tivo delos embriones, después éstos fueron transferidos para su subcultivo a medio (liquido + CA)fresco sin regulador de crecimiento. El experimento fue realizado con 3 lotes de n =20embriones cada uno, para líquido y 3 lotes de n = 30 para sólido, fue evaluado después de32 semanas de cultivo. Hay diferencias significativas entre tratamiento para un p<0.05. sepresentan desviaciones estándar.

100

10-20 21-30 3140

lntervalo de altura (cm)10-20 21-30 3140

lntervalo de altura (cm)

] L =LíquidoÑ S=sóiidoZZZZZZ L+GA3

EEEE S+GA3

10-20 21-30 3140

lntervalo de altura (cm)

Figura 5.5. Efecto de la aplicación de GA3 (ácido giberélico) al medio de geminación deembrione§ cigóticos de coa){ero í.n v/.lm, en medio (Y3) IÍciuido (L), y sólido (S) en: (A) despuésde 32 semanas de cumvo (A) peso fresco, (8) número de hojas bífidas y (C) el número dei.aices primarias. La aplicac¡ón de GA3 fue realizada durante las 4 primeras semanas de cultivode los embriones, después éstos fueron transferidos para su subcultivo a medio (liquido + CA)fresco sin regulador de crecimiento. El experimento fue realizado con 3 lotes de n = 20embriones cada uno, para líquido y 3 lotes de n = 30 cada uno para sólido, se presentandesviaciones estándar. L+GA3 = medio Líquido +ácido giberélico, S+GA3 = medio sólido+ ácidogiberélico.

101

®^

Capitulo 6

Discusión general

En esta tesis se realizaron estudios básícos del cultivo /n v/.Íro de embriones cigóticosde cocotero que ayudan a entender él porque es importante la orientación delmicrópilo del embrión durante la germinación y si la respiración aeróbica es necesaria

para la germinación y desarrollo posterior.Se propuso estudiar el efecto de una serie de modificaciones a la técnica de cultivo /nv/tro de embriones cigóticos que incrementan la eficiencia en porcentajes degerminación, en conversión a plántulas completas, el desarrollo y la sobrevivencia exv/íro. Las modificaciones son: (a) ubicar verticalmente el embríón durante su

germinación en los medios L y S. (b) emplear medio L, adicionar soportes inertes almedio L, e incrementar el volumen de los contenedores por medio de las extensionesdurante el desarrollo post-germinativo y (c) adicionar al medío de cultivo losfitoreguladores ABA y ABA en combinación con PEG y GA3 durante la germinación.

La técníca del cultivo /.n vííro a pesar de que existe hace muchos años, teníalimitaciones importantes en las diferentes etapas de cultivo En los últimos diez años,algunos grupos han logrado incrementar los porcentajes de germinación, sin embargola eficiencia de germinación continuó siendo baja (60%) así como los porcentajes deconversi.Ón a plántulas completas (Batugal y Engelmann, 1998). Adicionalmentedíchas plantas, presentan una baja sobrevivencia de las plántulas en campo Unlaboratorio (CPCRI) reportó 90% de germinación y 60% de conversión pero no reportala sobrevivencia de las plántulas en campo Además los resultados obtenidos endiferentes laboratorios son muy específicos para variedades en las cuales fueronrealizados, y los resultados obtenidos no han sido reproducibles o aplicables a otrasvariedades.

Los protocolos generados difieren en el medio de cultivo empleado (formulación yestado fi'sico) para la germinación de los embriones cigóticos. Estos emplean medío L,S o ambos pero no reportan cual es el efecto de su uso. Difieren en los medio decultívo inicial (físico y composición) y en la manípulación posterior de hormonas para laconversión a plántula completa.

Por, tanto era necesario plantearse mejorar la eficjencia de esta técnica.

Para poder contríbuir a mejorar el desempeño de la técnica de cultivo de embriones decocotero, se evaluaron distintas estrategias. Por un lado se consideró que la ubicacióny orientación del micrópilo podrían ser importantes, planteando la hipótesis de que losembriones de cocotero requieren de la respíracíón aeróbica para su germinación. Seusaron diferentes enfoques, al emplear los medios L y medio S. También se evaluóel uso de fítohormonas para promover la germinación y la sincronización y el uso de

103

distintos soportes inertes (como agrolita, vermiculita y cocopeat) que favorecieran eldesarrollo de las raíces (Aitken-Christie y Thorpe,1984, Dumas,1986). Por otro ladose determinó las condiciones Óptimas para la transferenc.ia de las plántulas acondiciones ex vÍ.íro.Todos estos estudios se realizaron con embriones de palmas de la variedad EnanoMalayo Verde (EMV) pues es el mater.ial que se ha usado para todos lo estudios delproyecto general de cocotero de la institución (CICY), y deb.ido a la naturaleza demayor respuesta de esta variedad con relación a las otro var.iedades de EM y. Laúnica excepción fue una evaluación del efecto de la aplicac.ión de GA3, con embrionesde Enano Malayo Amarillo (EMA), ya que se t.iene conocimientos que esta variedad hapresentado menor respuesta en cuM de tejido que las otras variedades Ladiferencia de germ.inación entre variedades depende de la genética de estas y derespuesta al medio ambiente. Y debido a su naturaleza los embriones cigóticosresponden individualmente diferente, como una consecuencia del estado de desarrolloembriogénico en el que son extraídos, por los factores genético maternos, por lascond.iciones ambientales en que desarroHo el fruto.

El medio S permitió buenos resultados en los porcentajes de germ.inación, y tuvo unefecto positivo en la morfología del brote obtenido. En medio L el embrión tuvo unaelongación del eie del cotiledón al salir a la superficie, lo cual da la impresión de que elembrión es de mayor tamaño, el brote obten.ido de la germinación en medio Lgeneralmente está hinchado y redondeado (amorfo), el cual durante su desarrollo seencuentra cubierto de hojas escamas elongadas En medio L, Ios embriones en sumayoría no germinan, porque dentro de la periferia del eje embrionario presentandaños, no visibles, pues se encuentra, cubierto por el cotiledón. Por lo tanto el mejormedio de cultivo para la germinación de los embriones fue el medio S, al permitir unmayor porcentaje de germinación y un mejor desarrollo morfológico del brote.

Los resultados indican que la pos.ición vehical con el micrópilo hac.ia arriba fue lamejor, es decm cuando está expuesto a la fase gaseosa del ambiente de la atmósferadel contenedor. Mediante otros estudios con el embrión expuesto a la atmósfera, sesustituyó de la atmósfera del contenedor por N2 u 02 en diferentes proporciones omezclas de N2 / 02, se evaluó el uso de inhibidores de la respiración, y se pudodemostrar que se requiere de la respiración aeróbica para la germinación de losembriones, explicando porqué los embr.iones cultivados de tal forma que exponen elmicrópilo a la atmósfera, germinan más fácilmente. Pero además estos presentaron unmejor desarrollo post-germinativo permitiendo un mayor porcentaje de conversión aplántulas completas.

Para la conversión a plántulas completas de los embriones germinados (en medio Sen posición vertical y el extremo del micrópilo hacia arriba) fueron subcultivados amedio L o medio S. Los mayores porcentajes de conversión a plántulas completasfueron obten.idos cuando el subcultivo fue realizado en medio L. Debido a que elmedio L presenta condiciones de humedad las cuales favorecen la generación deraíces, hasta niveles Iímites en la base del tallo de la planta y una mayor disponibilidadde nutr.ientes. La capacidad de generación de raíces depende de la variedad. En

104

medio S la generación y desarrollo de hojas del brote es lento y la generación derai.ces muy pobre en la mayori'a de los casos, (Oler et al ,1999)

El desarrollo de las plántulas fue favorecido por un incremento en el volumen y elíntercambío de gases, y una mayor exposición a la iluminación, cuando se colocaronextensiones de isopropileno isotáctico en los contenedores, lo cual permitió un mayordesarrollo en las plantas en términos de altura, mayor número de hojas y de raícesprimarías, Ia apariencía de las plantas fue mejor. Debído quizás a que los Órganos dela planta se desarrollan en mejores condiciones, pues al tener mayor volumen lepermíte desarrollarse mejor, una mayor iluminación permíte la funcionalidad de hojas(en producción de ceras y funcionalidad de los estomas), el materjal lpp permiteintercambio de gases evitando que se acumulen Etileno o C02, dentro del contenedory una pequeña perdida de agua, (Sutter, 1988; Talavera et al., 2001) lo cualprobablemente permite un preendurecimiento de las plántulas de cocotero /n v/.fro.Los resultados de la adición de sustratos inertes al medio L no fueron favorables parael desarroHo de las plántulas, causaron inhibición del crecimiento de las raíces de las

plántulas y senescencia en las hojas, causada quízás por una disminución en ladisponibilidad de oxígeno, o algún cambio en el pH (Aiken-Christie y Torpe, 1984,Driver y uttler,1687)

Por lo anterior se decidió emplear el medi.o L solo, sin ningún soporte, para eldesarrollo de las plántulas /.n viíro. Dado que en los protocolos publicados previamenteno se ha reportado cual etapa del desarrollo /n v/.fro de la plántula es la mejor para sutransferencia a condíciones ex v/Íro, en la presente tesis se determinó que grado dedesarrollo deberá de alcanzar las plántulas para lograr una transferencía exítosa. Losresultados mostraron que cuando formaron tres hojas bífidas y tres raíces primarias sepuede obtener 100% de sobrevivencia ex v/tro, Las rai.ces pri.mari.as las cuales sonnecesarias para el anclaje de las plántulas y generaci.Ón de los otros subórdenes deraíces, como las raíces secundarias que tienen como función la absorción denutrientes, permítiendo un mejor desarrollo de la plántula de alcanzar las plántulas

para lograr una transferencia exi.tosa. Los resultados mostraron que cuando formarontres hojas bífidas y tres raíces prímarías se puede obtener 100% de sobrevivencia exv/.fro. Las raíces primarias las cuales son necesarías para el anclaje de las plántulas ygeneración de los otros subórdenes de raíces, como las raíces secundarias que tienencomo función la absorción de nutrientes, permitiendo un mejor desarrollo de la plántula

(Oler,1999).

Por otro lado aunque los resultados mencíonados arriba en germínación, conversión aplántulas totales fueron buenos, se decídió probar adicionalmente el empleo defitohormonas (ABA y GA3) sobre la germinación y la conversión. Debido a que el gradode desarrouo de los embriones en una colecta no es homogéneo pues entre otrascosas se efectúa cada tres o cuatro meses, y se tiene conocimiento que ABAsíncroniza la etapa de maduración anterior a la germinación, por lo tanto con elobjetivo de sincronizar la germinación de los embríones e incrementar el porcentaje de

germinación, en el capítulo 4 se presenta la evaluación del uso de ABA (solo o encombinación con PEG) al medio de cultivo (S) Los resultados obtenidos de laaplícación de ABA/ PEG al medio de cultivo fueron negativos pues no-solo no

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sincronizaron la germinac.ión de los embriones empleado (12-14 meses después depolinizac.ión), si no que mostraron efectos negatü en los embr.iones comohiperhidricidad (v.itrificación) Los cuales contrastan con los reportados por Karun, et al2000., Weerakoon et al„ 2000., Damasco,1998, qu.ienes reportan un incremento en losporcentajes de germ'inación.Su aplicación generó cambios en la moffología y desarrollo de los brotes. Lo anteriorno descarta que ABA / PEG pudiera ayudar a la sincronización de la germinación enembr.iones de un menor grado de madurez al empleado.

Se aplicó GA3 al medio de cultivo de los embriones cigót.icos de cocotero Pues sesabe que rompe la dormancia de los embriones e induce la germinac.ión (Evans et aL1996: Fisher,1980, Yoshida y Hirasawa,1996; Kaur et al.,1998; Powell,1987). Los

porcentajes de germinación fueron incrementados cuando se añadió GA3, en medio Sde 87% a 98% y en medio L de 62 a 80%. Las concentrac.iones de GA3 aplicadasfueron de 4.6 uM para el medio S y 0 46 uM de GA3 para el medio L. Se aplicódurante las primeras cuatro primeras semanas de cultivo de los embriones encondiciones de oscuridad, después de este tiempo estos fueron transfer.idos a unmedio L libre de GA3 para su subcultivoLa aplicación de 4 6 uM de GA3 en combinación con medio sólido durante cultivo mvi.Íro de embriones cigóticos de cocotero tuvo un efecto posit.ivo pues mcrementó los

porcentajes de germinación máxima, redujo los tiempos para alcanzarla e incrementolos porcentajes de conversión de los embriones a plántulas. Efecto que se haobservado en semillas de girasol (Baskin y Bask.in, 1975), de palmas de Kentia(Howea forsíertana) (Chin et al.,1988).

El porcentaje de germinación ya era alto, así que aunque el incremento fuerelativamente pequeño, Ia germinación máxima alcanzada fue muy alta, de hechoigual o mayor que la observada en semillas en vivero de 80% para esta variedad decocotero (8. Maust, datos no publicados).

También mostró un efecto postgerminativo, incrementando los porcentajes deconversión y obtención de plántulas completas, lo cual permitió obtener un mayornúmero de plántulas con las características seleccionadas para su transferencia acondic'iones ex v/.fro, obteniéndose un 100% de sobrevivencia.

Las características moriológicas de las plántulas obtenidas con el tratamiento de GA3fueron mejores que cuando no se usa el regulador pues se observó un mayordesarrollo del brote, las hojas fueron más grandes y gruesas, y los tallos tambiénfueron más gruesos. Después de su conversión a plántula completa se obtuvo unbalance en el desarrollo de sus hojas y rai'ces, lo que permitió mayor adaptabilidad acondiciones ex v/.Íro. Resultados similares han sido reportados para otras especies(Phillips,1998., Kaur et al ,1998: Lev-Yadum et al.,1999). En cocotero la aplicación deGA3 incrementó los porcentajes germinación de embriones cigóticos de variedadesaltas (Karun, et al 2000: Weerakoon, 2000). Con respecto a los tiempos de

germinación de los embriones cigóticos se lograron reducir con el uso de medio S,pero fueron aún más cortos cuando a este medio se le adic.ionó GA3.

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Considerando los parámetros evaluados en esta tesis, se propone un protocolo queincluye las mejores condiciones como se describe a continuación Para sugerminación los embriones se deben cultivar por cuatro semanas en medio Sconteniendo GA3 4.6 uM en posicíón vertical con el extremo del micrópilo orientadohacia arriba. Posteriormente se deben transferir a medio L para su conversíón.Durante el desarrollo de los brotes, y posteriormente plántulas, deberán estar siempreen recipientes que les ofrezcan un volumen sufi'ciente para que no Iímiten sucrecimiento. Para ello se requiere poner extensiones de isopropileno isotáctico en losbordes de los contenedores, las cuales además de proporcionarles espacío adicional,permíten el Íntercambio de gases, aunque no la pérdida de agua, lo que redunda enun mejor desarrollo. En la Fig 6.1 se ilustra el protocolo y además se describe datosadicionales como tiempo de subcultivo. Este protocolo fue probado también conembriones de EMA para evaluarlo con un genotipo distinto. Ocurrió la germinación y laconversión a plántula, pero los porcentajes correspondientes fueron menores que losobtenidos para EMV, sin embargo la adición de GA3 también favoreció a ambos

parámetros, inclusive de una forma más acentuada que en el caso de EMVProbablemente mejores resultados podrían obtenerse después de trabaj.ar un poco enla optimización de las condiciones para este genotipo, como seguramente seránecesario para otros genotipos.

Este protocolo deberá también ser enriquecido al integrar resultados obtenidos enotros estudios dentro del Programa de Cocotero en CICY. En estos estudios se evalúael efecto de cambios en varios parámetros de las condiciones de cultivo sobre eldesarrollo de plántulas formadas de embriones cigótícos de cocotero germinados /nvííro. Uno de estos estudios evaluó el efecto de la ventílación en los contenedores decultivo en el control de la perdída de agua en las plántulas, se probaron variosmateriales y se encontró que el papel Whatman fue el mejor (Talavera et al , 2001)Por lo tanto este beneficio se puede obtener integrando aplicaciones de papel filtroWhatman a las extensiones de isopropileno isotáctico En otro estudio se estáevaluando el efecto de diferentes concentraciones de sacarosa, así como la calidad dela luz, sobre la capacidad fotosintética y adaptación a condiciones ex vííro de las

plántulas formadas (Fuentes, et al sometído). El crecimiento de las plántulas /.n v/.Írocon luz natural mejoró el crecimiento, su capacidad fotosintética y sobrevivencia de las

plántulas en condiciones de campo (C Talavera, resultados no publicados) Por lotanto sería conveníente el uso de luz natural, por ejemplo en la última fase de cultivocuando son añadidas las extensiones a los frascos.

Los resultados en esta tesis son muy alentadores pues han permitido mejorar enforma significativa las respuestas de germinación de embriones cigóticos de cocotero,de su conversión y la sobrevivencia en campo de las plántulas formadas Más aúncuando estos resultados se sumen a los resultados de Talavera y Fuentes, se podrácontar con un protocolo integrado que permitirá obtener mejores resultados, enparticular cuando se apliqué esta técnica para otros genotipos. De hecho el protocolointegrado se podrá comenzar a probar de inmediato y a corto plazo se podri'acomenzar a aplicar. Además del uso principal de esta metodología para el intercambioseguro de germoplasma, también puede ser útil para otros propósitos. Por ejemplo, laconservación de germoplasma, en la caracterización y seleccíón de germoplasma, en

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el rescate de embr.iones de genotipos mutantes de cocotero y como modelo deestudio, de los embr.iones cigóticos para conocer entender lo que ocurre en lagerminacióninvivo,ypuedanserextrapoladosestosconocimientosenembriogénesissomática. En este Último caso se podrían hacer estudios sobre el m.ismo desarrollo delas plántulas al nivel fisiológ.ico, bioquímico y molecular. Podría usarse como uns.istema para el estudio de pos.ible transmisión del AL a través de embriones, ya quelos fitoplasmas que causan esta enfermedad han sido detectados en embriones decocotero (Cordova et al, 2003) También puede ser de utilidad para estudios detransm.is.ión t.n vitro de enfermedades, como ya se está comenzando a usar para latransmisión del fitoplasma del AL (M Narváez, comunicación personal).

El protocolo propuesto en esta tesis y enriquecido con los otros estudios, permitiráademás de un intercamb.io seguro de germoplasma, una mayor movil.ización demater.ial genético, Io cual incrementaría la diversidad genética, se podría obtenermater.ial i.esistente de alta productividad, lo que propiciaría el desarrollo de tecnología

y la generación de nuevos productos. Que en el futuro perm.ita un manejo sustentabledel cocotero.

El protocolo propuesto permite obtener alta eficiencia en la producción de plantas dela variedad de cocoteros enanos, pero requiere ser evaluado con otros genot.ipos parapoder opt.imizar los resultados.

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FIÜ. 8.1. Píobcalo genoíÉdo paía e! cultm ln vlm de embJoanes agóatx>S ds aotem. cm alaeflüsnc]a en tg proakiaclón de planta8.

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