DIVISIÓN DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
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UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DEL VALLE DE TOLUCA DIVISIÓN DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA CRECIMIENTO DE CÉLULAS TRONCALES MESENQUIMALES SOBRE UN COMPÓSITO A BASE DE COLÁGENO - HIDROXIAPATITA COMO SUSTITUTO ÓSEO RADIOESTERILIZADO CON RADIACIÓN GAMMA DE Co-60. TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA PRESENTA ROMERO LÓPEZ ARIATNA JANITZI DIRECTORES MTRO. VALENTÍN MARTÍNEZ LÓPEZ DR. DANIEL LUNA ZARAGOZA ASESOR ACADÉMICO DR. OMAR ALBERTO HERNÁNDEZ AGUIRRE ALMOLOYA DE JUÁREZ, EDO. DE MÉX. DICIEMBRE DEL 2017
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UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DEL VALLE DE TOLUCA
DIVISIÓN DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
CRECIMIENTO DE CÉLULAS TRONCALES MESENQUIMALES SOBRE UN COMPÓSITO A
BASE DE COLÁGENO - HIDROXIAPATITA COMO SUSTITUTO ÓSEO
RADIOESTERILIZADO CON RADIACIÓN GAMMA DE Co-60.
TESIS
PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
PRESENTA
ROMERO LÓPEZ ARIATNA JANITZI
DIRECTORES
MTRO. VALENTÍN MARTÍNEZ LÓPEZ
DR. DANIEL LUNA ZARAGOZA
ASESOR ACADÉMICO
DR. OMAR ALBERTO HERNÁNDEZ AGUIRRE
ALMOLOYA DE JUÁREZ, EDO. DE MÉX. DICIEMBRE DEL 2017
CRECIMIENTO DE CÉLULAS TRONCALES MESENQUIMALES SOBRE UN
COMPÓSITO A BASE DE COLÁGENO - HIDROXIAPATITA COMO SUSTITUTO
ÓSEO RADIOESTERILIZADO CON RADIACIÓN GAMMA DE Co-60.
DEDICATORIAS
Esta tesis la dedico con muchísimo amor y cariño a mis padres Alejandro
Romero Martínez y Cecilia López Orihuela, gracias por brindarme siempre su
apoyo incondicional.
Papá muchas gracias porque convivir contigo no tiene comparación, me
enseñaste a disfrutar y aprender de cada etapa, convirtiéndose el tiempo en
nuevas enseñanzas, porque al lado de un caballero como tú, cada momento es
único. Gracias papi por estar presente en mi vida e impulsarme a conseguir mis
metas.
Mami, no todos tienen la suerte de tener una Madre tan valiente, decidida y
honesta, me siento bendecida por tenerte en mi vida. Gracias por enseñarme a ser
fuerte, a no dejarme vencer por las adversidades, a tener confianza en mí y sobre
todo por tus persistentes esfuerzos.
A Edgar y Quetzalli, mis queridos hermanos, porque gracias a ellos adquirí el
don de la paciencia. Por compartir alegrías y tristezas, ser mis cómplices de
aventuras y sobre todo de travesuras, los amo, siempre estaré con ustedes en las
buenas, en las malas y en las peores.
A mis abuelos Lino y Margarita por siempre estar conmigo incondicionalmente,
por el tiempo que me cuidaron y por la infinidad de consejos, los cuales ustedes
me los han dado con el ejemplo.
A mis abuelos Benigno y Filiberta, que aunque ya no pueden leer estas líneas,
tienen un lugar muy especial en mi memoria y su recuerdo me sirve de inspiración.
Al resto de mi familia y amigos que siempre han estado conmigo, apoyándome
con sus talentos, sus palabras de aliento y sus consejos, siendo esto último lo que
siempre me da un plus para que todo salga mejor.
Y por último a todos aquellos que participaron en toda mi formación académica,
por aportar sus conocimientos y lecciones, las cuales me han servido para
afrontar el mundo.
AGRADECIMIENTOS
Mi agradecimiento de manera especial y sincera al Dr. Daniel Luna Zaragoza por
aceptarme para realizar esta tesis bajo su dirección. Por su apoyo y confianza en
mi trabajo y su capacidad para guiarme, todo esto ha sido un aporte invaluable, no
solamente en el desarrollo de esta tesis, sino también en mi formación. Le
agradezco también el haberme facilitado siempre los medios suficientes para
llevar a cabo todas las actividades propuestas durante el desarrollo de esta tesis.
Quiero expresar también mi más sincero agradecimiento al M. en C. Valentín
Martínez López por su dirección y participación activa en el desarrollo de esta
tesis. Quiero destacar su siempre atenta disponibilidad y paciencia al incorporarme
en una línea de investigación nueva para mí. Sin duda que su participación
enriqueció enormemente el presente trabajo realizado. Muchas gracias por
permitirme vivir una experiencia tan importante para mi formación.
Al Dr. Omar Alberto Hernández Aguirre, le agradezco por sus siempre atentas y
rápidas respuestas a las diferentes inquietudes, surgidas durante el desarrollo de
este trabajo, lo cual se ha visto también reflejado en la conclusión de esta tesis.
Al Dr. Jorge Enrique Pliego Sandoval por su atenta participación en la evaluación
de la presente tesis.
Agradezco con mucho aprecio a la Biol. Carmina Ortega Sánchez por su siempre
atenta y efectiva colaboración durante mi estancia en el INR, apoyándome
siempre en la realización de este trabajo, lo cual se vio reflejado en los resultados
obtenidos.
A mis compañeras de investigación, ahora amigas Ruth Alejandra Hernández
Aparicio y Nancy Saenz Serrano, por haber compartido sus experiencias en el
laboratorio y siempre aportar sus comentarios constructivos. Mi estancia a su lado
fue épica.
Al personal del Banco de Tejidos Radioesterilizados del ININ, la M. en A. Lourdes
Reyes Frías, al Técnico Daniel Rebollo por sus atenciones y facilitación de la
dermis porcina y a la Dra. María Esther Martínez Pardo por permitirme el uso de
su espacio de trabajo en el Laboratorio de Ciencias Básicas y Ambientales.
Agradezco de manera especial al M. en C. Isidoro Martínez Mera, al M. en C. Juan
Bonifacio Martínez, al Ing. Pavel López Carbajal y al Tec. Carlos Salinas Molina
por las atenciones y compartir sus conocimientos durante mi visita a sus
laboratorios de caracterización de materiales.
Agradezco infinitamente al Técnico Jorge Eliseo Pérez del Prado por su
extraordinaria colaboración durante las intensas sesiones de MEB que llevamos a
cabo.
A Yaaziel Malgero Ramirez y Ana Esperanza Camacho López por el aporte de las
imágenes de las células troncales mesenquimales diferenciadas.
A Lenin Tamay de Dios por permitir la utilización del microscopio confocal y la
toma de microfotografías.
Al Ing. Gabriel Castañeda Jiménez por la construcción del pastillador y estar
siempre atento al buen funcionamiento de este.
A la Dra. Marquidia Pacheco Pacheco por la facilitación del equipo del infrarrojo.
Al Laboratorio de Ciencias Básicas y Ambientales, especialmente al Dr. Jaime
Vite, por su amabilidad y su disponibilidad durante mi estancia.
Al Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares por permitirme realizar la tesis
de licenciatura en sus instalaciones y su calidez como centro de investigación.
Al instituto Nacional de Rehabilitación Luis Guillermo Ibarra Ibarra por permitirme
el uso de sus instalaciones para la elaboración de la presente tesis de licenciatura.
ACRÓNIMOS
Col Colágeno
CTMs Células Troncales Mesenquimales
ECM Matriz Extracelular (Extra celular matrix)
EDS Espectroscopia de Dispersión de Energía Rayos X (Energy-dispersive X-ray spectroscopy)
DRX Difracción de Rayos X
FTIR Espectroscopia de Infrarrojo con Transformada de Fourier (Fourier transform infrared spectroscopy)
HAp Hidroxiapatita
ISCT Sociedad Internacional de Terapia Celular
kGy Kilogray
MEB Microscopia Electrónica de Barrido
TGA Análisis Termogravimétrico (Thermogravimetric analysis)
ÍNDICE
RESUMEN ............................................................................................................. 1
INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 2
CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS ............................................................................ 4
1.1 Ingeniería de tejidos ............................................................................... 4
1.2. Biomateriales ............................................................................................. 5
1.2.1. Biomateriales cerámicos ..................................................................... 6
1.2.2 Biomateriales poliméricos ................................................................... 7
1.3. Función del tejido óseo ............................................................................ 7
1.3.1 Componentes del tejido óseo .............................................................. 9
1.3.2. Matriz orgánica .................................................................................. 10
1.3.3. Células del tejido óseo ...................................................................... 13
1.3.4. Matriz inorgánica ............................................................................... 14
1.4. La piel ....................................................................................................... 18
1.5. Compósitos .............................................................................................. 19
1.6. La radiación gamma ................................................................................ 20
1.7. Células troncales mesenquimales .......................................................... 22
1.7.1. Adherencia de las células a las superficies de cultivo ................... 23
1.7.2. Antígenos de superficie .................................................................... 23
1.7.3. Osteogénesis ..................................................................................... 24
1.7.4. Adipogénesis ..................................................................................... 25
1.7.5. Condrogénesis................................................................................... 26
1.7.6. Fuentes de obtención y cultivo de las células madre
mesenquimales ............................................................................................ 27
OBJETIVOS ........................................................................................................ 29
General ......................................................................................................... 29
Específicos .................................................................................................. 29
CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA ........................................................................... 30
2.1. Obtención de hidroxiapatita de origen bovino ...................................... 31
2.1.1. Limpieza y corte ................................................................................. 31
2.1.2. Eliminación de lípidos ....................................................................... 32
2.1.3 Pre calcinación y calcinación ............................................................ 32
2.2. Obtención del colágeno de dermis porcina ........................................... 33
2.2.1 Solubilizacion y precipitación ............................................................ 34
2.2.2 Filtración y liofilización ...................................................................... 34
2.3. Elaboración del compósito a base de hidroxiapatita y colágeno. ....... 35
2.3.1. Compactación .................................................................................... 35
2.3.2. Empacado .......................................................................................... 36
2.3.3. Irradiación .......................................................................................... 37
2.4. Caracterización fisicoquímica ................................................................. 37
2.4.1. Microscopía electrónica de barrido .................................................. 37
2.4.2. Difracción de rayos X ........................................................................ 37
2.4.3. Espectroscopia de infrarrojo con trasformada de Fourier ............. 38
2.4.4. Análisis termogavimétrico ................................................................ 38
2.5. Caracterización microbiológica .............................................................. 38
2.6. Obtención de células troncales mesenquimales ................................... 39
2.6.1. Expansión celular .............................................................................. 39
2.6.2. Evaluación de las características morfológicas .............................. 39
2.6.3. Siembra de CTMs en el compósito de Hap-Col ............................... 40
2.7. Caracterización biológica de las CTMs .................................................. 40
2.7.1. Evaluación del inmunofenotipo de CTMs ....................................... 40
2.7.2. Diferenciación osteogenica de CTMs ............................................... 41
2.7.3. Diferenciación condrogénica de CTMs ............................................ 41
2.7.4. Diferenciación adipogénica de CTMs ............................................... 41
2.7.5. Inmunofluorescencia ......................................................................... 42
2.8. Caracterización biológica de las CTMs sembradas en los compósitos
de HAp-Col ...................................................................................................... 42
2.8.1. Viabilidad celular ............................................................................... 42
2.8.2. Adhesión celular y morfología por MEB .......................................... 43
CAPÍTULO 3. RESULTADOS ............................................................................. 44
3.1. Caracterización fisicoquímica de la hidroxiapatita, colágeno y los
compósitos...................................................................................................... 44
3.1.1. Microscopia electrónica .................................................................... 44
3.1.2. Difracción de rayos X ........................................................................ 47
3.1.3. Espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier. .......... 49
3.1.4. Análisis termogavimétrico. ............................................................... 50
3.3. Caracterización biológica de las CTMs y cultivo celular en los
compósitos...................................................................................................... 53
3.3.1 Expansión celular y características morfológicas ........................... 53
3.3.2. Evaluación del inmunofenotipo de CTMs ........................................ 54
3.3.3. Diferenciación osteogénica de CTMs ............................................... 55
3.3.4. Diferenciación condrogénica de CTMs ............................................ 55
3.3.5. Diferenciación adipogénica de CTMs ............................................... 55
3.3.6. Inmunofluorescencia ......................................................................... 57
3.3.7. Viabilidad celular ............................................................................... 57
3.3.8. Adhesión celular y morfología por MEB .......................................... 58
DISCUSIONES .................................................................................................... 61
CONCLUSIONES ................................................................................................ 64
REFERENCIAS ................................................................................................... 65
1
RESUMEN
En ingeniería de tejidos se tiene el conocimiento de que existen diversas
patologías por las cuales ya no se lleva a cabo el proceso de regeneración ósea
y en conjunto con la ciencia de materiales se están creando soluciones para
desarrollar biomateriales que permitan un crecimiento celular el cual favorezca a
la regeneración de tejido óseo.
El estudio del trabajo consiste en cultivar CTMs sobre un compósito a base de
hidroxiapatita bovina y colágeno porcino radioesterilizado con radiación gamma de
Co 60, garantizando la esterilidad de los biomateriales. La hidroxiapatita fue
extraída de hueso bovino por tratamiento térmico; el colágeno de dermis porcina
por tratamientos ácidos, caracterizando ambos fisicoquímicamente por las
técnicas de MEB, EDS, DRX, FTIR y TGA. Se elaboró una mezcla de 70%
Hidroxiapatita y 30% de Colágeno para formar los compósitos, los cuales se
esterilizaron con radiación Gamma de Co-60 a diferentes dosis para su posterior
caracterización fisicoquímica y microbiológica que permitió evaluar la inocuidad de
los compósitos irradiados. Seguido a esto se realizó el cultivo de CTMs aisladas
de periostio, evaluándoles, la adherencia, antígenos de superficie, plasticidad de
diferenciación a otros linajes e identificar la presencia de osteopontina. La CTMs
se sembró en los compósitos esterilizados para evaluar su viabilidad y adhesión
celular.
La hidroxiapatita bovina y colágeno porcino fueron obtenidos por sus respectivos
tratamientos, lo cual permitió observarlos fisicoquímicamente, en cuanto a los
compósitos de Hap-Col 70:30 se demostró que no sufren cambios
estructuralmente y químicamente al ser irradiados con radiación gamma de Co 60.
Las CTMs muestran ser plástico-adherentes, expresando marcadores de
superficie mesenquimales, tienen una capacidad de diferenciación y la presencia
de osteopontina.
Las CTMs en los compósitos de Hap-Col mostraron tener una viabilidad celular
del 92% y un crecimiento celular. Los compósitos HAp-Col permiten viabilidad y
crecimiento celular pero poca adhesión.
2
INTRODUCCIÓN
Actualmente la ingeniería de tejidos es una herramienta que se utiliza para la
creación de implantes capaces de conducir e inducir la regeneración de un tejido
específico, el cual ha sido lesionado o perdido. Esta área se apoya de diversos
biomateriales que forman andamios para la realización de crecimientos celulares.
Uno de los métodos más eficaces para esterilizar a los biomateriales es la
radioesterilización con radiación gamma, una de las ventajas es que este método
se hace cuando los biomateriales están en su empaque final. Los rayos gamma de
Co 60 tienen la propiedad de romper las cadenas de ADN de microorganismos,
por lo que quedan eliminados o inhibidos para su posterior reproducción. El
proceso no afecta las propiedades fisicoquímicas de los productos, siempre y
cuando se apliquen las dosis apropiadas para cada caso. Por eso es muy
importante realizar estudios previos para definir un tiempo de exposición
adecuado1.
La piel es el órgano más grande del cuerpo humano, esta consta de 3 capas
llamadas epidermis, dermis e hipodermis, la dermis contiene alta concentración
de colágeno2, este es un biomaterial con aplicaciones médicas por sus
propiedades de biocompatibilidad, biodegradabilidad y afinidad celular3, el
colágeno es una proteína abundante en el reino animal4, puede ser obtenida de
diferentes órganos y tejidos, uno de los que más la contiene es precisamente la
dermis porcina.
Similares al colágeno, existen una gran cantidad de biomateriales los cuales se
pueden clasificar en metálicos, en cerámicos, en polímeros naturales y sintéticos5.
Una de las condiciones para utilizar este tipo de biomateriales en el cuerpo
humano es que deben de estar estériles6.
El hueso es un compósito que está compuesto por una fase orgánica y una fase
inorgánica, esta última está compuesta de un fosfato de calcio llamado
hidroxiapatita, la cual ha sido ampliamente estudiada debido a su bioactividad,
biocompatibilidad y osteoconductividad7, una forma de obtener este biomaterial es
3
por medio de tratamiento térmico de huesos, debido que es una materia prima
abundante y económica debido a que este tejido de origen animal es un desecho8.
El hueso tiene la capacidad de autoregenerarse como parte del proceso de
reparación en respuesta a una lesión, así como durante el desarrollo del esqueleto
o la remodelación continua a lo largo de la vida adulta9, 10. La regeneración ósea
está compuesta por una serie de eventos biológicos de inducción y conducción
ósea11. Sin embargo existen ciertas lesiones masivas en las que se requiere tejido
óseo externo como pudiera ser en grandes defectos óseos creados por traumas,
infecciones, resecciones tumorales y anomalías óseas. Existe diferentes
procedimientos para aumentar el proceso de regeneración ósea, uno de los más
comunes es con autoinjertos, sin embargo, el tomar tejido óseo de otra parte del
cuerpo, existe morbilidad y potencial de infección del área donadora, otra opción
son los aloinjertos, sin embargo las listas de espera para los pacientes que están
en espera de un órgano o tejido supera los 20,000, además las donaciones en
México de órganos y tejidos son bajos11.
Por lo anterior, se hace necesario encontrar alternativas para poder satisfacer la
necesidad de estos. Como la ingeniería de tejidos que utiliza andamios, para
hacer crecer células, como los son las CTMs una población ampliamente
estudiada de células madre adultas debido a sus importantes propiedades y a su
potencial prometedor en medicina regenerativa12, 13. Bajo condiciones
microambientales específicas, las CTMs pueden proliferar y dar lugar a varios
linajes celulares entre los que se encuentran los osteoblastos, los condrocitos y los
adipocitos13. Para, formar órganos y tejidos a la medida12. La producción de hueso
por esta tecnología se muestra como una alternativa ante la alta demanda de
estos tejidos, ya que además se tendrá la ventaja de poder producirse
ilimitadamente en el laboratorio15.
Este trabajo de investigación está encaminado hacia la búsqueda de una
alternativa para la regeneración ósea realizando un compósito a base de
hidroxiapatita-colágeno, esterilizado con radiación gamma de Co-60, para llevar a
cabo el cultivo de células troncales mesenquimales.
4
CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS
1.1 Ingeniería de tejidos
La ingeniería de tejidos utiliza los principios que rigen el trasplante de células, las
ciencias aplicadas y la ingeniería, todo ello orientado hacia el desarrollo de
sustitutos biológicos que permitan restablecer o mantener la función normal de un
órgano o tejido. La ingeniería de tejidos se encarga de desarrollar biomateriales,
como una matriz de soporte extracelular artificial, que reemplace a la natural y
provea un espacio tridimensional, para que las células puedan formar el nuevo
tejido con su apropiada estructura y función (Figura 1.1). La matriz debe proveer
las condiciones y el ambiente para que pueda ocurrir una adecuada regulación
celular (adhesión, migración, proliferación y diferenciación), así como la adecuada
entrega de factores bioactivos (de crecimiento y adhesión) 16.
Figura 1.1. Ingeniería de Tejidos.
El tipo de células que se utilizan en una aplicación específica de ingeniería de
tejidos es de crucial importancia, pues estas secretan la MEC, con características
bioquímicas y morfológicas que son responsables de darle un carácter inductivo
5
al implante. Las células interactúan con el material del andamio y responden a
cualquier estimulo del medio en el que se encuentran, ya sea in vitro o poco
después de ser implantadas. Por lo tanto, el tipo celular adecuado afectara todas y
cada una de las etapas de producción del implante y regeneración17, 18.
En cuanto a la matriz tridimensional tiene como función principal la de soportar la
adhesión, proliferación y migración celular, así como su diferenciación y
maduración del fenotipo celular. Idealmente, el material utilizado para construir el
andamio debe ser biodegradable para permitir la normal formación de tejido
nuevo; en otras palabras, la meta es lograr un tejido nativo nuevo. El material
debe ser biocompatible, en cuanto a las propiedades mecánicas representan
quizás uno de los requisitos más difíciles de cumplir. El andamio debe soportar las
demandas mecánicas del sitio lesionado durante todo el proceso de regeneración,
lo que implica que las propiedades y mecanismos de degradación deben trabajar
en equilibrio con la formación de tejido nuevo19, 20.
1.2. Biomateriales
Se denominan biomateriales a los productos empleados para reproducir la función
de tejidos vivos en los sistemas biológicos de forma segura, mecánicamente
funcional y aceptable fisiológicamente, que son temporal o permanentemente
implantados en el cuerpo y que tratan de restaurar el defecto existente 21, 37. El
biomaterial en contacto con los tejidos vivos no debe producir en ellos ningún tipo
de alteración, por lo cual existe una gran diversidad de biomateriales 22.
Cualquier biomaterial, para poder ser implantado en el cuerpo, debe cumplir
ciertos requisitos generales que se encuentran en el concepto de
biocompatibilidad: la tolerancia de dicho material, su bioestabilidad tanto a corto
como a largo plazo, el mantenimiento de sus propiedades y su estructura
fisicoquímica en el entorno biológico durante el tiempo que permanezca en el
organismo23. Además, deben poseer propiedades mecánicas y químicas
específicas que aseguren la función para la cual se diseñan. Esta viabilidad
funcional es crítica y está relacionada con la capacidad del material para
6
desempeñar su papel en una aplicación concreta, quedando garantizada a largo
plazo la función del órgano o tejido donde se implanta 24,25.
Para determinar la biocompatibilidad de un nuevo o potencial biomaterial se deben
realizar diversas pruebas que demuestren que el biomaterial cumple con los
requisitos mínimos como implante26. Una de las herramientas básicas utilizadas en
los estudios de biocompatibilidad son los cultivos celulares, que permiten
determinar cómo responden las células a la presencia de diferentes materiales,
evaluando cómo se produce la adhesión celular, extensión, crecimiento en
presencia del material, o determinando las actividades enzimáticas y metabólicas
que pueden alterarse por la presencia del material objeto de estudio27. Aquellos
biomateriales que superan los ensayos in vitro mostrando una buena
biocompatibilidad pasan a ser probados en los ensayos in vivo, que consisten en
la implantación del potencial biomaterial en animales de laboratorio27.
Los biomateriales se pueden clasificar dependiendo de su comportamiento cuando
son implantados o dependiendo de su naturaleza química28, 29, estos últimos se
pueden clasificar en tres grupos como biomateriales metálicos, cerámicos y
poliméricos. Los materiales de origen biológico seleccionados en el presente
estudio pertenecen a dos de estos grupos, cerámicos y poliméricos por lo que se
describirán a continuación.
1.2.1. Biomateriales cerámicos
Varias cerámicas son buenos biomateriales debido a que, en general, son
materiales químicamente inertes, no suelen desencadenar respuestas indeseadas
en el tejido en el que se implantan y no son susceptibles de ataque microbiano en
ausencia de humedad28. Los biomateriales cerámicos son un grupo de
compuestos inorgánicos de composición variada. Son muy resistentes al desgaste
y generalmente se comportan como buenos aislantes térmicos y eléctricos29.
Estas propiedades los hacen adecuados para el desarrollo de sustitutos óseos.
Dentro de este tipo de biomateriales se encuentra la alúmina (óxido de aluminio),
la hidroxiapatita y los biovidrios (cuya composición se basa en SiO2 - CaO - Na2O -
P2O5 y algunos que contienen MgO y K2O) 30, 31.
7
1.2.2 Biomateriales poliméricos
Los polímeros son moléculas de cadenas largas que consisten en un número de
pequeñas unidades repetitivas, denominados monómeros32. Los biomateriales
poliméricos pueden ser de origen natural o sintético, dentro de este grupo se
encuentra, el poliestireno, el nylon, el fibrinógeno, el colágeno, los hidrogeles, etc.
Con este tipo de biomateriales se tiene la posibilidad de moldearse de distintas
formas como en fibras, tejidos, películas o bloques33, 34. Debido a lo anterior, son
de los biomateriales más utilizados en la fabricación de dispositivos biomédicos.
Uno de los campos de estudio actual es en el desarrollo de polímeros
bioabsorbibles35, 36 estos polímeros son degradados dentro del organismo y sus
productos de degradación son eliminados mediante la actividad celular37. Este tipo
de biomateriales, pueden ser utilizados como soporte de células vivas, en el
reemplazo de tejidos, e incluso en piezas y dispositivos para la fijación de fracturas
óseas38. Otra utilidad de este tipo de biomateriales es en los sistemas de
liberación controlada de drogas o fármacos39.
1.3. Función del tejido óseo
Por su estructura y sus funciones, el tejido óseo desempeña un papel como,
protector de los órganos vitales, como el sistema nervioso central, el cual está
protegido por la bóveda craneal y las vértebras, mientras que el corazón y los
pulmones lo están por la caja torácica. Otra función es el control metabólico, ya
que mantiene el equilibrio fosforo-calcio, el esqueleto contiene el 99% del calcio y
el 90% del fosforo del organismo. La medula ósea contiene las células
hematopoyéticas en el hueso esponjoso, donde se producen las células
sanguíneas. El hueso es duro, resistente y elástico. Estas propiedades mecánicas
le permiten soportar los efectos de la gravedad, las tensiones mecánicas externas
y las fuerzas de contracción musculares40.
El hueso cortical representa aproximadamente el 80% del esqueleto y constituye
la pared externa de cualquier pieza ósea, así como la diáfisis de los huesos largos.
Sus osteones son cilíndricos, de 200-300 μm de diámetro, y en el centro tienen un
8
canal de Havers más o menos abierto de 50 μm de diámetro de promedio, cuya
orientación es paralela al eje de la diáfisis. Están unidos por los conductos
transversales de Volkmann (Figura 1.2) 41. La resistencia del hueso cortical
depende de varios parámetros: extrínsecos (dirección y velocidad de aplicación de
las tensiones) o intrínsecos (geometría de la pieza ósea y propiedades de la matriz
mineralizada) 42.
Figura 1.2. Estructura del hueso cortical.
El hueso esponjoso representa el 20% del esqueleto adulto. Está formado por
trabéculas a modo de placas o de columnas, unidas entre sí y rodeadas por tejido
adiposo y hematopoyético ricamente vascularizado. Las trabéculas conforman una
red tridimensional cuya orientación está determinada por las fuerzas mecánicas
(Figura 1.3). El hueso esponjoso proporciona una superficie de intercambio
considerable con los líquidos intersticiales y se regenera más rápida que la del
hueso cortical, por lo que cumple una función importante en el equilibrio fosforo-
calcio 43.
9
Figura1.3 Ubicación del hueso esponjoso.
1.3.1 Componentes del tejido óseo
El tejido óseo es un tejido conjuntivo altamente especializado compuesto por una
matriz orgánica, compuesta de fibras de colágeno de tipo I, glucosaminoglucanos,
proteínas no colágenosas y las células óseas como los osteoblastos, osteocitos y
osteoclastos, y una matriz inorgánica, constituida por hidroxiapatita, esta matriz le
confiere al hueso su dureza y su resistencia44.
La matriz ósea contiene pequeñas cantidades de factores de crecimiento y
citosinas (factor de crecimiento transformante β [TGF- β], factor de crecimiento
similar a la insulina [IGF], osteoprotegerina, factor de necrosis tumoral [TNF],
interleucinas y proteínas morfogenéticas óseas [BMP])45. Estos factores de
crecimiento desempeñan un papel importante en la activación y diferenciación
celular e intervienen en el acoplamiento, formación y resorciones óseas.
10
1.3.2. Matriz orgánica
El colágeno es el componente esencial de la piel y el hueso, representa
aproximadamente el 25% del peso seco total de los mamíferos46. Se han
caracterizado 29 tipos distintos de colágeno y todos presentan una estructura de
triple hélice. Se sabe que los tipos de colágeno I, II, III, V y XI forman fibras de
colágeno47. Las moléculas de colágeno se componen de tres cadenas α que se
unen debido a su estructura molecular. Cada cadena α está compuesta de más de
mil aminoácidos basados en la secuencia -Gli-X-Y-. La presencia de glicina es
esencial en cada tercera posición de aminoácido con el fin de permitir un
empaquetado ajustado de las tres cadenas α en la molécula de tropocolágeno y
las posiciones X e Y se llenan principalmente con prolina y 4-hidroxiprolina 48, 49.
Los fibroblastos son los responsables de la producción de colágeno en el tejido
conectivo. La cadena pro-α del colágeno se sintetiza a partir de un ARNm, dentro
del retículo endoplásmico rugoso y pasa al aparato de Golgi de la célula. Durante
esta transferencia, algunos residuos de prolinas y lisinas son hidroxilados por la
enzima lisil oxidasa47. Las lisinas específicas están glicosiladas y luego las
cadenas α-α se autoensamblan en procolágeno antes de su encapsulación en las
vesículas excretoras. Después de su paso a través de la membrana plasmática,
los propeptidos se separan afuera de la célula para permitir la auto-polimerización
de los telopéptidos. Esta etapa marca la iniciación del auto-ensamblaje del
tropocolágeno en fibrillas de 10 a 300 nm y la aglomeración de las fibrillas en
fibras de colágeno de entre 0.5 a 3 μm50 (Figura 1.4). Los colágenos formadores
de fibrillas son los más utilizados en la producción de biomateriales basados en
colágeno51.
La principal clasificación de los colágenos se basa en los tipos fibrilar y no fibrilar
del colágeno. Los colágenos fibrilares forman fibrillas características, que son
rápidamente identificadas por sus estriaciones transversales y proporcionan la
tensión requerida para mantener unidos a los tejidos. El colágeno no fibrilar forma
una estructura reticular que sirve como armazón para la unión de células
epiteliales y endoteliales o como barrera de filtración en tejidos como el riñón. La
11
diferencia más importante entre el colágeno no fibrilar y el fibrilar es que los
monómeros del primero, contienen grandes unidades globulares, lo que implica
que los monómeros de colágeno no fibrilar se autoensamblan, formando
estructuras más complejas, que las que se encuentran ordinariamente dispuestas
en el colágeno fibrilar 52.
El tamaño de la parte helicoidal varía considerablemente entre los diferentes tipos
de colágeno. La repetición Gli-X-Y es el motivo predominante en los colágenos
que forman fibras del tipos I, II, III, lo que da lugar a la formación de dominios
helicoidales de 300 nm de longitud, dando unos 1000 residuos de aminoácidos en
el polímero53. En otros tipos de colágeno, estos dominios son mucho más
pequeños o contienen interrupciones en la triple hélice. Así, los colágenos tipo VI o
X contienen triples hélices de alrededor de 200 ó 460 aminoácidos,
respectivamente54.
Figura 1.4. Estructura macro-micro del colágeno.
Además de las diferencias en la estructura primaria de los colágenos de varios
tejidos, el análisis de la composición de aminoácidos demuestra que existen
diferencias en su contenido en hidroxilisina y en menor medida, en hidroxiprolina.
Asimismo, existen variaciones en el contenido total de glúcidos unidos a la
hidroxilisina, tanto entre colágenos de diferentes tipos genéticos, como dentro de
un único tipo genético, particularmente el tipo55.
12
Estas variaciones en la secuencia primaria y en las modificaciones secundarias
pueden dar lugar a un gran número de moléculas de colágeno diferentes, cada
una de las cuales puede formar estructuras con diferente organización
arquitectónicas y diferente función56.
Hay aproximadamente veinticinco diferentes conformaciones de la cadena α, cada
una producida por su gen único. La combinación de estas cadenas, al agruparse
en tres, se juntan para formar los veintinueve tipos diferentes de colágeno que
actualmente se conocen57.
El colágeno tipo I es el colágeno más abundante y estudiado de esta familia.
Constituye más del 90% de la masa orgánica del hueso y es el principal colágeno
de los tendones, la piel, los ligamentos, la córnea y muchos tejidos conectivos58.
La triple hélice del colágeno tipo I es un heterotrímero formado por dos cadenas
idénticas α 1(I) y una cadena α 2(I). Las fibras helicoidales, in vivo suelen
encontrarse entremezcladas con la fibras de colágeno tipo II (en la piel) o con el
colágeno tipo V (en el hueso y en los tendones). El colágeno tipo I proporciona
rigidez contra la tensión y en el hueso, es el responsable de las propiedades
biomecánicas relacionadas con la resistencia a la carga y a la tensión59,60.
El colágeno se puede extraer de varias fuentes, pues está presente en casi todos
los animales61. Las fuentes para obtener colágeno para utilizarse en aplicaciones
de ingeniería de tejidos son la piel y tendones de bovina, piel porcina y cola de
rata entre otras. Los animales marinos son también una fuente potencial para
obtener colágeno entre estos se encuentran las esponjas62,63, los peces64,
medusas65. Algunas de esta fuentes para obtener colágeno son utilizados en la
industria62.
Se puede investigar las diferentes fuentes de colágeno ya que las propiedades del
colágeno difieren de un animal a otro. El colágeno también puede ser utilizado en
aplicaciones biomédicas como la matriz extracelular (MEC) descelularizada que
sirve como un material de andamiaje para la regeneración de tejidos. El colágeno
de MEC acelular son generalmente obtenidos a partir de dermis humana o porcina
o de intestino de cerdo o submucosa de la vejiga66.
13
1.3.3. Células del tejido óseo
Las células óseas se originan en la medula ósea, la cual produce dos grupos de
células madre. Las células madre de la serie hematopoyética, que producirán las
células sanguíneas y células inmunitarias (entre ellas, las de serie monocito-
macrófago que origina los osteoclastos) y las células madre mesenquimales o
estromales, que dan origen a los fibroblastos, los adipocitos, las células
endoteliales, los osteoblastos y los condroblastos (Figura 1.5)67.
Figura 1.5. Células formadoras de tejido óseo.
Los osteoblastos son las células que sintetizan la parte orgánica (colágeno tipo I,
proteoglicanos y glucoproteinas) de la matriz ósea. Además, sintetizan
osteonectina y osteocalcina. La primera facilita el depósito de calcio y la segunda
estimula la actividad de los osteoblastos68. Parte de la osteocalcina que se
produce y se transporta en la sangre, actúa tanto en los osteoblastos cercanos
como los que se localizan a distancia69. Los osteoblastos son capaces de
concentrar sulfato de calcio y participan en la mineralización de la matriz. Siempre
se localizan en las superficies óseas. Cuando hay actividad intensa de síntesis
ósea, la forma es cúbica, con citoplasma muy basófila. En cambio cuando su
actividad es poca, se aplanan y la basofilia citoplasmática disminuye. Una vez que
el osteoblasto queda atrapado en la matriz recién sintetizada, el osteoblasto se
llama osteocito. La matriz se deposita alrededor de la célula y de sus
14
prolongaciones, formándose así las lagunas y los canalículos. Los osteoblastos en
la fase de síntesis presentan las características ultra estructurales de las células
productoras de proteínas. La matriz ósea recién formada, adyacente a los
osteoblastos activos y que todavía no está calcificada, recibe el nombre de
osteoide70.
Los osteocitos son las células que se encuentran en el interior de la matriz ósea y
ocupan las lagunas de las cuales parten los canalículos. Cada laguna contiene un
osteocito. Dentro de los canalículos, las prolongaciones de los osteocitos
establecen contactos por medio de uniones, por donde pueden pasar moléculas
pequeñas al igual que iones de un osteocitos a otro. Los osteocitos son células
aplanadas que presentan una cantidad pequeña de retículo endoplasmático
rugoso, complejo de Golgi poco desarrollado y un núcleo con cromatina
condensada. Aunque esas características ultraestructurales indican que la
actividad de síntesis es escasa, los osteocitos son indispensables para la
conservación de la matriz ósea. Cuando mueren, le sigue la resorción de la
MEC71.
Los osteoclastos son células móviles, gigantes y muy ramificadas. Las
ramificaciones son muy irregulares, con forma y espesor variables. Es frecuente
que en las zonas de resorción del tejido óseo haya porciones dilatadas de los
osteoclastos que se hallan en depresiones de la matriz resorbidas por la actividad
de estas células y conocidas como lagunas de howship. El citoplasma de los
osteoclastos es granular, a veces provisto de vesículas, con basofilia si son
jóvenes y acidofilos si son maduros. Estas células se originan de precursores
mononucleados provenientes de la médula ósea que, al contacto con el tejido
óseo, se unen para formar los osteoclastos multinucleados72.
1.3.4. Matriz inorgánica
La fase inorgánica del hueso le proporciona su rigidez y su resistencia mecánica
que constituye una importante reserva mineral. Alrededor del 99 % del calcio del
organismo, del 85 % del fósforo y del 40 al 60 % del sodio y del magnesio se
encuentran incorporados en forma de cristales, formando parte de la matriz
15
mineral del hueso. La parte inorgánica representa cerca del 60 % del peso total del
hueso73. Los iones que más se encuentran son el fosfato y el calcio, aunque
también se encuentran en pequeñas cantidades otras moléculas y átomos como el
bicarbonato, magnesio, potasio, sodio y citrato. En estudios con difracción de
rayos X se encontró que los cristales que se forman con los átomos de calcio y
fosforo tienen la estructura de la hidroxiapatita (HAp), con la composición
(Ca5(PO4)3OH)74. Los iones de la superficie del cristal de la HAp están hidratados
y por lo tanto hay una capa de agua e iones alrededor del cristal, esta se
denomina capa de hidratación y facilita el intercambio de iones entre el cristal y el
líquido intersticial. Los cristales de matriz ósea muestran imperfecciones y no son
exactamente iguales a la HAp que se encuentra en los minerales de las rocas75.
Una de las principales características de la HAp es la relación molar entre el
calcio-fosforo ya que entre menor sea la relación, mayor es la acidez y solubilidad
de las muestras. La HAp pura tiene una relación molar Ca/P de 1.67, si la relación
molar es mayor a 1.67, la HAp contiene grupos carbonatos y trazas de Mg76.
La HAp tiene una estructura hexagonal, con un grupo espacial P63/m. Este grupo
espacial se caracteriza por tener un eje c de seis ejes perpendicular a tres ajes-α
equivalentes (α1, α2, α3) en ángulos de 120° entre sí. La unidad completa del cristal
HAp, consiste en Ca, PO4, y grupos OH que se unen (Figura. 1.6). Un conjunto de
4 iones Ca2+ forman un anillo de seis miembros y en cuyo centro se encuentra el
ion OH. Se les conoce como Ca I que se encuentran en columnas paralelas al eje
c en tres ejes a z=0 y z = 1/2. Los 6 iones Ca2 + restantes (Ca II) forman dos
conjuntos de triángulos en z=1/4 y 3/4 relacionados por los ejes de 63 a lo largo del
eje c 77,78. La HAp es uno de los pocos materiales que se clasifican como
bioactivos, lo que significa que ayuda el crecimiento óseo y a la osteointegración,
cuando es utilizado en aplicaciones ortopédicas y dentales79.
16
Figura 1.6. Representación esquemática de la unidad hexagonal de hidroxiapatita.
Blanco, hidroxilo, verde, calcio, púrpura, fósforo y rojo, oxígeno.
Existen diversas formas para obtener HAp, uno de estos es a través de síntesis
química, como los son por los métodos por precipitación, por reacción hidrotermal,
por sol-gel, entre otras80. También se puede obtener de fuentes naturales como de
la cascaras de huevo, de las escamas y de huesos de pescado, de huesos
porcinos y bovinos81.
La HAp generada parcial o totalmente a partir de fuentes biogénicas es aceptada
por los órganos vivos cuando es trasplantada, debido a su parecido desde el punto
de vista fisicoquímico, a la apatita de origen humano82. En la figura 1.7 se
observan cinco grupos de fuentes biogénicas como la extracción de minerales de
residuos biológicos, la síntesis de cáscaras de huevo, la síntesis de exoesqueleto
de organismos marinos, la síntesis de biomoléculas naturales y la síntesis a partir
de biomembranas83.
17
Figura 1.7. Preparación de HAp a través de fuentes biogénicas: (a) extracción de minerales de residuos biológicos, b) síntesis de la cáscara de huevo, c) síntesis de
18
exoesqueleto de organismos marinos, d) síntesis con biomoléculas naturales y e) síntesis a partir de biomembranas.
La extracción de biominerales de desechos biológicos (como el hueso, la escama
y hueso de pescado) es un método conocido para la preparación de HAp usando
fuentes biogénicas. Además de la calcinación, también se pueden utilizar otros
procesos como la hidrólisis enzimática, el tratamiento con plasma y la hidrólisis
hidrotérmal alcalina 84, 85.
1.4. La piel
La piel es el órgano más grande del cuerpo humano y desempeña varias
funciones. Nos protege contra el medio externo, regula la temperatura, produce la
vitamina D cuando absorbe a la radiación ultravioleta y realiza la detección de los
estímulos sensoriales86.
La dermis (corion) es una capa de la piel se ubica profunda a la membrana basal
de la epidermis y es la capa más gruesa de la piel. Contiene los vasos sanguíneos
y linfáticos, nervios y anexos cutáneos. Es un tejido conectivo denso, con gran
resistencia y elasticidad, con fibras de colágeno orientadas en el sentido de las
líneas de tensión (líneas de langer), entrelazadas con fibras elásticas 87.
Se distinguen dos regiones de la dermis, una más superficial la capa papilar y una
más profunda, la capa reticular (Figura 1.8).
19
Figura 1.8. Estructura de la dermis
La capa papilar limita con la epidermis y consiste en un tejido conectivo con fibras
finas de colágeno y elastina. En la superficie presenta protrusiones cónicas
redondas, las papilas dérmicas. Estas papilas se proyectan hacia la epidermis
formando una amplia superficie de unión. La cantidad y altura de las papilas está
relacionada con la exigencia mecánica de ese sector de la piel. En las papilas se
encuentran asas capilares y receptores táctiles88.
La capa reticular limita con el tejido subcutáneo y consiste en un tejido conectivo
denso irregular con fibras elásticas entrelazadas. Estas redes de fibras le otorgan
resistencia, extensibilidad y elasticidad a la piel. El espacio entre las fibras está
ocupado por células adiposas, vasos, fibras nerviosas y los anexos de la piel88.
1.5. Compósitos
Este término significa “formado por al menos dos componentes distintos”. A escala
atómica, las aleaciones metálicas y los polímeros pueden considerarse
compósitos. En ingeniería, estos materiales están constituidos por al menos dos
componentes químicos, separados por una interface. Esta definición comprende a
los materiales que tienen fibras incluidas, en un material continuo. La fase
discontinua suele ser más dura y más resistente que la fase continua y se
denomina material de refuerzo, mientras que el material en fase continua se
denomina matriz89.
Las propiedades de los compósitos dependen de las propiedades de sus
componentes, su distribución y sus proporciones. Entre los componentes se
pueden producir interacciones que le dan las propiedades específicas al
compósito como puede ser su orientación geométrica. La mayoría de los
compósitos se preparan con el fin de tener ciertas propiedades mecánicas como la
fuerza, la resistencia a la fatiga o la rigidez90.
Los compósitos pueden ser reforzados con partículas o con fibras. Las fibras
proporcionan un refuerzo mecánico más eficaz que las partículas y son
20
anisotrópicas, ya que transmiten las fuerzas de modo distinto dependiendo de la
orientación 91.
1.6. La radiación gamma
La radiación se define como una forma de manifestación de la energía que se
transmite a través del espacio en forma de partículas u ondas electromagnéticas
(como la luz, el calor, las microondas, los rayos X y los rayos gamma). Cuando la
radiación tiene la energía suficiente para provocar cambios en los átomos de la
materia con que interacciona, se llama radiación ionizante. La radiación gamma es
de naturaleza similar a la luz visible, la única diferencia es que tiene una longitud
de onda muy corta, por lo tanto, un nivel de energía más alto que la luz, (Figura
1.9). Estas diferencias facilitan la penetración de la radiación gamma dentro de
ciertos materiales. La irradiación es el proceso mediante el cual se expone
deliberadamente en forma controlada un material a la acción de una fuente de
radiación, como pueden ser los rayos gamma o un haz de electrones1.
Figura 1.9. Espectro electromagnético.
21
Uno de los elementos que emite radiación gamma útil para ser utilizada a nivel
industrial es el cobalto-60, este radioisótopo emite dos rayos gamma de 1.17 y
1.33 MeV y tiene una vida media de 5.27 años. El cobalto-60 se produce a partir
de cobalto-59 cuando se coloca en un reactor nuclear, los átomos de cobalto-59
atrapan un neutrón para transformarse al cobalto-60, este radioisótopo al ser
metálico se moldea en forma de lápices, los cuales se encapsulan dentro de
cilindros de acero inoxidable1.
La cantidad de energía de radiación absorbida por un material se conoce como
dosis. La absorción de un Julio de energía por kg de masa de material irradiado se
conoce como Gray (Gy) 1.
La irradiación es un método físico de conservación comparable con la
pasteurización, enlatado o congelación. El proceso consiste en suministrar al
producto ya sea envasado o a granel, una cantidad de energía (dosis)
exactamente controlada, proveniente de una fuente de radiación ionizante, durante
un tiempo determinado, de acuerdo a las características físicas de cada producto,
de tal manera que la energía que reciba sea la suficiente para desbacterizarlo o
esterilizarlo sin que afecte su estado físico. Se trata de un proceso en frío y sin
reacciones químicas1.
El proceso de irradiación gamma ha sido recomendado por el Grupo Consultivo
Internacional para la irradiación de alimentos, integrado por la Organización de las
Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, la OMS y el OIEA. El
mismo grupo afirma que el proceso de irradiación gamma ha sido la técnica de
esterilización más estudiada y que las pruebas practicadas por laboratorios
independientes, en todos los casos, han mostrado que los productos irradiados no
se vuelven radiactivos, ni se generan residuos1.
Existe una amplia variedad de productos industriales que se procesan en todo el
mundo con irradiación gamma: materiales desechables e instrumental de uso
médico, productos farmacéuticos, cosméticos y artículos de higiene personal,
alimentos deshidratados, frutas frescas y vegetales, cereales, pescado, pollo,
carne entre otros1.
22
1.7. Células troncales mesenquimales
Las células troncales mesenquimales (CTMs) también conocidas como células
madre estromales fueron descritas por primera vez en 1968 por Friedenstein et al.
como unidades formadoras de colonias, de aspecto fibroblastoide, que se
adherían al plástico en cultivo con capacidad de regenerar tejido óseo ex vivo92.
En el año 2006, se redefinieron en el Congreso de la International Society of
Cellular Therapy (ISCT), las características mínimas necesarias para que una
célula fuera considerada CTMs, son la siguiente manera:
1) Las CTMs deben tener capacidad de adherencia al plástico en cultivo.
2) Expresar los antígenos de superficie CD73, CD90 y CD105 en ausencia de
otros antígenos hematopoyéticos del tipo CD34, CD45 y marcadores típicos de
linfocitos B, monocitos y macrófagos.
3) Ser multipotentes y presentar una alta plasticidad para diferenciarse in vitro bajo
condiciones estándar de cultivo a osteoblastos, adipocitos y condrocitos (Figura
1.10)93,94.
Figura 1.10. Capacidad de diferenciación de las CTMs.
23
Otras de las características, además de las propuestas por la ISCT, que definen y
clasifican a una célula como CTMs, es que deben de ser de origen mesodérmico,
compartan características de fibroblastos, sean capaces de autorrenovarse para lo
cual durante la división celular solo una de las 2 células resultantes comenzará
programas de diferenciación celular, presentan una inmunogenicidad
relativamente baja y tienen capacidad de diferenciarse bajo determinadas
condiciones hacia células de diferentes linajes (plasticidad clonogénica) 95,96.
1.7.1. Adherencia de las células a las superficies de cultivo
Las propiedades de las superficies plásticas de cultivo para permitir la adherencia
in vitro de las células se relacionan con las interacciones moleculares y la
topografía de dichas superficies. El proceso de la interacción celular con el
material es altamente dinámico y depende de varios factores que repercuten en la
respuesta celular; todo el proceso se puede dividir en diferentes eventos celulares.
El primero se refiere al contacto de la célula con el fluido o medio de cultivo,
seguido de la adsorción de las proteínas de superficie al material lo cual está
influenciado por las características de pH, composición iónica y temperatura de la
solución, luego ocurre la fase de contacto de las células la cual se produce de
manera rápida e intervienen propiedades fisicoquímicas como fuerzas de Van der
Waals. La fase de adhesión celular ocurre en períodos más largos e involucra
moléculas de adhesión y del citoesqueleto, quienes interactúan juntas para luego
inducir una respuesta de proliferación, migración y diferenciación fenotípica celular
97.
1.7.2. Antígenos de superficie
Hasta el momento no se ha identificado una molécula de superficie específica y/o
única de CTMs, sin embargo, uno de los criterios para identificar las CTMs por
caracterización inmunofenotípica está basada en un extenso panel de anticuerpos
monoclonales, incluyendo la determinación de marcadores de diferenciación,
moléculas de adhesión, marcadores de la matriz extracelular y receptores de
factores de crecimiento. El inmunofenotipo aceptado para la identificación de
24
CTMs es la co-expresión de CD44, CD73, CD90, CD105 y HLA-I, en ausencia de
marcadores hematopoyéticos como CD34 y CD4598.
1.7.3. Osteogénesis
El hueso es un tejido conectivo especializado que provee soporte a los órganos
del cuerpo. Existen dos maneras de formación de hueso durante el desarrollo
embrionario la intramembranosa y la formación endocondral de hueso. La
osificación intramembranosa forma los huesos planos que incluyen el cráneo y
clavículas medias; mientras que la formación endocondral forma los huesos largos
que comprenden el esqueleto apendicular, huesos faciales y clavículas laterales
97.
La formación intramembranosa se produce gracias a una condensación de las
CTMs comprometidas hacia el linaje osteogénico las cuales se encuentran en
contacto por medio de largas prolongaciones. Algunas CTMs se diferencian en
osteoblastos que al poco tiempo comienzan a secretar matriz ósea orgánica sin
calcificar, la cual se denomina osteoide y consta de proteoglucanos, fibras de
colágeno y sustancia fundamental.
Los osteoblastos que están embebidos dentro del osteoide se comunican entre sí
por medio de finas prolongaciones y al momento de la calcificación por fosfatos de
calcio, quedan atrapados formándose un pequeño espacio propio del hueso que
se denomina canalículo; al mismo tiempo, el osteoblasto de la zona de
calcificación pierde su capacidad de metabolizar matriz ósea y se convierte en
osteocito. Este osteoblasto es rápidamente reemplazado por otro, el cual se
encuentra encima del nuevo osteocito dándole de esta manera la estructura
laminar (por capas) al hueso y haciendo que aumente su grosor 97.
La osificación endocondral se diferencia de la intramembranosa en la manera en
que este proceso involucra un paso intermedio donde el cartílago es quien regula
el crecimiento y desarrollo del hueso. La formación dentro del embrión comienza
con el desarrollo de un modelo de cartílago el cual crece por yuxtaposición y de
manera intersticial; seguidamente los condrocitos de este cartílago se hipertrofian
25
dando como resultado el crecimiento de lagunas y reducción de los tabiques de
matriz cartilaginosa intercalados que se calcifican. El pericondrio se vascularisa
haciendo que las células condrogénicas pasen a ser osteoprogenitoras formando
los osteoblastos, los cuales elaboran matriz ósea sobre la superficie del cartílago
calcificado. Esta matriz se calcifica formando un complejo de cartílago y hueso
calcificado 97.
1.7.4. Adipogénesis
El tejido adiposo es un órgano difuso con gran actividad metabólica, puesto que
sus lípidos están capacitados para almacenar energía. En el humano se
encuentran dos tipos de tejido adiposo, el tejido adiposo blanco, amarillo o
unilocular que representa la mayor parte del tejido adiposo del organismo, y el
tejido adiposo marrón o multilocular, es más escaso y es llamado así porque las
células contienen muchas gotas pequeñas de lípidos 97.
El tejido adiposo blanco o unilocular, posee células adiposas grandes (hasta
100mm de diámetro) y esféricas, que pueden llegar a deformarse cuando están
formando grupos tomando una morfología poliédrica. Cada célula contiene una
gota grande de lípidos en el centro, principalmente triglicéridos, y un citoplasma
reducido al borde de ella, con escasos organelos, el núcleo se encuentra
desplazado hacia la periferia del citoplasma, es oval, con cromatina fina y no
contiene nucléolos. El tejido adiposo blanco se encuentra ampliamente distribuido
como grasa subcutánea, en el mesenterio y en la zona retroperitoneal 99.
El tejido adiposo marrón o multilocular, consta de células grandes y poligonales;
con un citoplasma más abundante y granuloso que las células del tejido adiposo
blanco, que contiene pequeñas gotas de grasa de distintos tamaños. El núcleo es
redondo con gránulos de cromatina un poco gruesos. Con la edad el tejido
adiposo marrón pasa a parecerse al tejido adiposo blanco, por lo que es
indistinguible en adultos 99.
Todas las células adiposas se originan por diferenciación de las CTMs, aunque el
proceso de desarrollo para los dos tipos de tejido adiposo es diferente. El tejido
26
adiposo blanco se desarrolla en los islotes grasos en fetos con 5 meses de vida
aproximadamente; en el citoplasma de las CTMs aparecen gradualmente gotas
grasas y las células se van haciendo más redondeadas mientras que las gotas de
lípidos se hacen más grandes para luego fusionarse y formar una sola vacuola, y
por esto el núcleo cada vez está más excéntrico; en esta etapa la célula ya es
llamada adipocito. El tejido adiposo marrón también se desarrolla a partir de CTMs
en el embrión, las cuales se vuelven semejantes a las células epiteliales y el tejido
se hace lobulado; aquí comienzan a aparecer las primeras gotas de lípidos
haciendo que las células se vuelvan multiloculares y maduras convirtiéndose en
adipocitos 99
.
1.7.5. Condrogénesis
Los adultos contienen cartílago en las superficies de huesos largos y tráquea,
bronquios, nariz, orejas, laringe y en discos invertebrales. El cartílago es un tejido
mecánico; que posee células denominadas condrocitos que se encuentran en
cavidades llamadas lagunas dentro de la matriz extracelular que ellos mismos
secretan, es un tejido que carece de vasos sanguíneos y linfáticos. Sin embargo
los condrocitos reciben su nutrición desde los vasos sanguíneos de los tejidos
conectivos más cercanos por difusión a través de la matriz. La matriz extracelular
está compuesta de glucosaminoglicanos y proteoglicanos los cuales se asocian
con las fibras de colágeno y elásticas que se encuentran aquí. Existen tres tipos
de cartílagos, hialino, elástico y fibrocartílago 99.
El cartílago hialino es el más abundante y se encuentra en el individuo adulto en
las costillas, como parte del esqueleto nasal, laringe, tráquea bronquios y
superficies articulares. El cartílago se desarrolla a partir del mesodermo en la
quinta semana de gestación donde las CMTs se hacen redondas formando
cúmulos celulares densos llamados centros de condrificación. Durante la
diferenciación de las CTMs a condroblastos, las células aumentan su tamaño y
dividen la sustancia fundamental metacromática y el tropocolágeno, que se
polimeriza fuera de la célula para formar colágeno; las células van quedando
atrapadas en esta matriz formando lagunas. Aquí los condroblastos se diferencian
en condrocitos que son células cartilaginosas maduras. El crecimiento del
27
cartílago sucede de dos maneras, el crecimiento intersticial que comienza en el
centro de condrificación donde los condroblastos sufren divisiones mitóticas
aumentando el número de células, las cuales producirán matriz extracelular y se
convertirán en condrocitos y el crecimiento aposicional se refiere a la
diferenciación de las CTMs que rodean el cartílago para formar condrocitos 99.
El cartílago elástico forma parte del cartílago de la epiglotis, laringe y oídos; se
diferencia del cartílago hialino porque su matriz presenta un entretejido denso de
fibras elásticas. El cartílago fibroso está compuesto por una combinación de fibras
de colágeno y células cartilaginosas ubicadas en lagunas rodeadas por matriz
hialina. El fibrocartílago se encuentra en ciertas articulaciones, discos
invertebrales y meniscos 99.
El cartílago elástico forma parte del cartílago de la epiglotis, laringe y oídos; se
diferencia del cartílago hialino porque su matriz presenta un entretejido denso de
fibras elásticas. El cartílago fibroso está compuesto por una combinación de fibras
de colágeno y células cartilaginosas ubicadas en lagunas rodeadas por matriz
hialina. El fibrocartílago se encuentra en ciertas articulaciones, discos
invertebrales y meniscos 99.
1.7.6. Fuentes de obtención y cultivo de las células madre mesenquimales
Las CTMs se pueden obtener de aspirados de médula ósea, tejido adiposo,
sangre del cordón umbilical, pulpa dental, músculo liso, tejido esquelético y
cardíaco, hígado, bazo, testículos, sangre menstrual, páncreas, periostio,
membrana sinovial, dermis, pericitos, hueso trabecular, pulmón, placenta, sangre
periférica, ligamento periodontal y líquido amniótico100. De todas ellas las más
relevantes son las de médula ósea, el tejido adiposo y la sangre del cordón
umbilical101. Una vez que las CTMs se aíslan por adherencia al plástico y se
cultivan in vitro, pueden bajo determinadas condiciones diferenciarse hacía
distintos linajes mesodérmicos como a osteocitos, a condrocitos, a adipocitos, a
mioblastos y a cardiomiocitos102, o incluso pueden diferenciarse hacía células
propias del linaje endodérmico (hepatocitos, células pancreáticas) y ectodérmico
(queratinocitos, astrocitos y neuronas)103. A pesar de que las CTMs poseen una
28
amplia capacidad de diferenciación, se consideran células multipotentes y no
pluripotentes debido a que no ha sido posible evaluar su complementación
tetraploide, prueba mediante la cual tras inyectar las CTMs en un blastocisto de
ratón se espera obtener ratones quiméricos, en los cuales tras el desarrollo del
embrión, las células inyectadas den lugar a células pertenecientes a las 3 capas
embrionarias (endodermo, mesodermo y ectodermo). Las CTMs son fáciles de
aislar, expandir in vitro y manipular durante todo el proceso de cultivo celular, al
que deben ser sometidas para obtener el número de células necesarias. Además
pueden crio-preservarse sin sufrir alteraciones fenotípicas y sin perder ni su
capacidad proliferativa ni la de diferenciarse tras el proceso de descongelación4.
Aunque, se ha descrito que cuando estas células indiferenciadas son sometidas a
procesos de división en cultivo durante más de 7 pases comienzan a verse
afectadas sus características cariotípicas y su actividad de telomerasa104.
29
OBJETIVOS
General
Obtener un compósito a base de hidroxiapatita-colágeno esterilizado con
radiación gamma, para realizar el crecimiento de células troncales mesenquimales
y evaluar su viabilidad.
Específicos
1. Aislamiento y caracterización fisicoquímica de dos biomateriales a partir de
hidroxiapatita de hueso bovino y colágeno de dermis porcina.
2. Elaboración de un compósito con una relación 70-30% (hidroxiapatita-
colágeno).
3. Esterilización del compósito a diferentes dosis de radiación gamma de Co-
60.
4. Evaluación y caracterización del compósito radioesterilizado con Co 60
fisicoquímica y microbiológicamente.
5. Evaluar la viabilidad y adhesión celular de las células troncales
mesenquimales en los compósitos 70-30% (hidroxiapatita-colágeno)
radioesterilizados con Co 60.
30
CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA
En el capítulo 2 se describe el proceso que se realizó en el laboratorio y sus
respectivas caracterizaciones. La metodología que se siguió en el presente trabajo
de investigación se presenta en la figura 2.1.
Figura 2.1. Diagrama de flujo del trabajo experimental
Obtención de hidroxiapatita Obtención de colágeno
Esterilización por radiación
gamma de Co-60
Caracterización fisicoquímica
Elaboración del compósito
Caracterización microbiológica
Aislamiento de CTMs de periostio por explante
Caracterización biológica
Siembra de CTMs en los compósitos de HAp-Col
Caracterización fisicoquímica
Andamio Celular
Pruebas de viabilidad y adhesión
31
2.1. Obtención de hidroxiapatita de origen bovino
Se compró un fémur de bovino fresco en la carnicería, este se mantuvo en
congelación a una temperatura – 40 °C (Figura 2.2).
Figura 2.2. Fémur bovino
2.1.1. Limpieza y corte
El fémur se limpió de restos de tejido blando con instrumental quirúrgico, con una
sierra de banda se realizan los diferentes cortes de hueso esponjoso y con un
molino de hueso se obtiene hueso en forma de polvo (Figura 2.3).
Figura 2.3. Secciones del hueso: a) tubo cortical y cóndilos, b) Corte del hueso
esponjoso, c) Hueso esponjoso molido.
a) b) c)
32
2.1.2. Eliminación de lípidos
En un primer paso al tejido óseo, previamente cortado y molido, se le adiciono
una solución de peróxido de hidrogeno (H2O2) al 3%, posteriormente se colocó en
el limpiador ultrasónico para la eliminación de lípidos. Después se agregó una
solución de metanol-cloruro de metileno 1:1 por dos horas para eliminar los
residuos sanguíneos (Figura 2.4).
Figura 2.4. a) Eliminación de lípidos con H2O2, b) eliminación de residuos sanguíneos con metanol-coluro de metileno.
2.1.3 Pre calcinación y calcinación
La pre calcinación se llevó a cabo bajo campana de extracción, donde sobre un
soporte universal con una maya y un Mechero Bunsen, se puso un crisol con el
hueso molido y lavado, se dejó calentando durante 24 horas. Para la calcinación
se utilizó una mufla (Felisa modelo FE-360) donde se coloca el tejido óseo pre
calcinado a una temperatura de 900 °C durante 24 horas, como se puede apreciar
en la figura 2.5. Posteriormente se dejó enfriar y una vez que el hueso calcinado
está a temperatura ambiente, este se guardó en un recipiente estéril para su
posterior caracterización.
a) b)
33
Figura 2.5. a) Pre calcinación de hueso bovino. b) Calcinación de hueso bovino.
2.2. Obtención del colágeno de dermis porcina
La dermis porcina fue proporcionada por el Banco de Tejidos Radioesterilizados,
cuando se procesa la piel porcina, se toman tiras de la epidermis, que son las que
se utiliza como apósito biológico en aplicaciones cínicas, el resto (la dermis) se
envía como desecho. Este desecho es el que utilizamos para obtener el colágeno
(Figura 2.6).
Figura 2.6. Dermis Porcina
a) b)
34
2.2.1 Solubilizacion y precipitación
Se cortó la epidermis en fragmentos de 50 x 50 mm, se colocaron en matraces
Erlenmeyer de 1 litro, se le adicionó ácido acético 0.5 M y se colocaron en un
agitador a 800 rpm durante un periodo de 48 horas. Posteriormente se filtró, se
guardó el sobrenadante y los restos de la dermis fueron eliminados, la solución
obtenida fue neutralizada con NaOH 2M hasta alcanzar un pH de 8.0, cuando se
estabilizó el pH, se le adicionaron 18 ml de NaCl 2.6 M para precipitar a la
proteína (Figura 2.7).
Figura 2.7. Obtención de colágeno de la dermis: a) Ajuste de pH a 8.0, b)
Precipitación.
2.2.2 Filtración y liofilización
La proteína precipitada se filtró y se lavó con agua estéril en varias ocasiones para
eliminar el excesos de NaCl, la proteína obtenida se pesó y se colocó en cajas
Petri, estas a su vez son colocadas en una charola de acero inoxidable y se
congelaron en un ultracongelador a -80°C durante 16 h, al siguiente día la
liofilizadora se enciende y estabiliza en -40°C, posteriormente se colocan las
charolas con la proteína en la liofilizadora y se inicia el proceso de liofilización a
una temperatura inicial de -40°C y un de vacío de 220 mBar, finalizando el
a) b)
35
proceso a las 24 horas a una temperatura de 23° C y un vacío de 0.06 mBar
(Figura 2.8).
Figura 2.8. a) Proteína filtrada, b) Proteína liofilizada.
2.3. Elaboración del compósito a base de hidroxiapatita y colágeno.
Los compósitos se prepararon a partir de los dos biomateriales obtenidos, la
hidroxiapatita a partir de hueso de bovino y el colágeno obtenido de dermis
porcina. La proporción del compósito fue de 70% hidroxiapatita y 30% de
colágeno. Los biomateriales fueron molidos para lograr una mezcla homogénea,
se pesaron 0.30 gramos de colágeno y 0.70 gramos de hidroxiapatita.
2.3.1. Compactación
La mezcla de los biomateriales se colocó dentro de un punzón de acero
inoxidable, el cual fue esterilizado previamente, el sistema se sometió a una
presión 2000 libras y se obtienen pastillas, las cuales son colocadas en un
recipiente estéril (Figura 2.9).
a) b)
36
Figura 2.9. Preparación de los compósitos en forma pastillas: a) colocación de la mezcla de HAp-Col 70:30 en el pastillador, b) Obtención de la pastilla.
2.3.2. Empacado
Los compósitos se empacaron, primero en bolsas de polietileno en forma
triangular, el segundo empaque de forma rectangular, en este se colocó la etiqueta
con los datos del compósito como son N° de lote, fecha de caducidad, etiqueta de
irradiación, condiciones de manejo y lugar donde se elaboró. Posteriormente se
colocó una tercera bolsa de polietileno (Figura 2.10).
Figura 2.10. Empacado: a) Primario, b) secundario y c) terciario.
a) b)
a) b) c)
37
2.3.3. Irradiación
Con el fin de determinar la dosis de esterilidad, los compósitos fueron sometidos a
radiación con rayos gamma de Co-60 a dosis de 5, 10, 15, 20, 25 y 30 kGy en un
irradiador transelektro modelo LGI-01. En la Planta de Fuente de Gammas del
Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares.
2.4. Caracterización fisicoquímica
2.4.1. Microscopía electrónica de barrido
Las muestras de hidroxiapatita, colágeno, del compósito sin irradiar y compósitos
irradiados a las diferentes dosis, fueron caracterizadas por microscopia
electrónica, estas fueron colocadas sobre una cinta de aluminio que se adhiere a
un porta muestras, posteriormente las muestras fueron recubiertas con una capa
de oro con un equipo Denton Vacuum, por la técnica sputtering durante 60
segundos. Las micrografías fueron tomadas a alto y bajo vació a diferentes
magnificaciones con el microscopio electrónico de barrido (JEOL modelo JSM-
5900LV) el cual tiene una resolución de 4 nanómetros y un alcance de 300
magnificaciones, para observar morfología y un comportamiento bajo una fuente
de electrones. También se determinó la composición química elemental de tanto
de la HAp como la del colágeno como del compósito sin irradiar y los compósitos
irradiados a las diferentes dosis por Espectroscopia de Dispersión de Energías
(EDS) con un espectrómetro marca EDAX.
2.4.2. Difracción de rayos X
La identificación de la estructura de los cristales de hidroxiapatita de hueso de
bovino, del colágeno obtenido de dermis porcina, del compósito sin irradiar y los
compósitos irradiados a las diferentes dosis, se llevó a cabo por difracción de
rayos X con un difractómetro (Discovery 8 marca Bruker) las muestras son
colocadas en un soporte de lucita en el goniómetro del difractómetro, con una
fuente monocromadora difractada a 25 kV, a un tamaño de paso de 0.02° durante
28 minutos para adquirir el espectro de rayos X con suficiente intensidad para
alcanzar las líneas de identificación, a un ángulo de 2θ de los elementos
38
presentes a una velocidad de 2°/min y a un intervalo de 8 a 70° 2θ. Los resultados
son comparados con los difractogramas que contiene las tarjetas JCPDS en la
biblioteca del equipo.
2.4.3. Espectroscopia de infrarrojo con trasformada de Fourier
Los espectros de infrarrojo se utilizaron para la identificación de las frecuencias
vibracionales de las bandas de absorción tanto de la hidroxiapatita, como del
colágeno así como de los compósitos de HAp-Col 70:30, utilizando un
espectrofotómetro (Nicolet 6700 FT-IR de la marca Thermo Scientific), en el cual
se colocaron las muestras de una manera directa en el detector, obteniéndose un
espectro de la región del infrarrojo de 500 a 4,000 cm–1 para conocer los grupos
funcionales contenidos en las muestras.
2.4.4. Análisis termogavimétrico
Para determinar la estabilidad térmica de la hidroxiapatita y el colágeno se utilizó
un analizador termogavimétrico (SDTQ600 Texas Instrument), bajo atmosfera de
nitrógeno a una velocidad de 10°C por minuto, a un intervalo de 25°C a 800°C en
atmosfera de nitrógeno. Este análisis se llevó a cabo tomando una mínima
muestra y se colocó en un crisol de platino, este se introdujo al equipo, se
registró la temperatura inicial, para después ir recolectando los datos arrojados de
la pérdida masa conforme aumenta la temperatura y de esta forma obtener los
termogramas.
2.5. Caracterización microbiológica
Una vez irradiados los compósitos a las dosis de 5, 10, 15, 20, 25 y 30 kGy se
sometieron a la prueba de esterilidad, donde dos muestras fueron cultivadas en
caldo de soya tripticaseina, el cual es un medio para el crecimiento de
microorganismos aerobios y las otras dos muestras se cultivaron en medio líquido
de tioglicolato, medio adecuado para microorganismos anaerobios estrictos,
facultativos. Los medios de cultivo se mantuvieron en incubación a 32°C durante
15 días para determinar la esterilidad de los compósitos a las diferentes dosis de
39
irradiación, estos análisis se realizaron de acuerdo a la Farmacopea de los
Estados Unidos Mexicanos.
Una vez determinada la dosis de esterilidad, los compósitos fueron colocados en
cajas de plástico dentro de una hielera que contenía hielo seco y se enviaron al
irradiador gamma del ININ para ser sometidas a una dosis de 15 kGy. Al concluir
la irradiación, inmediatamente los compósitos fueron colocados en el
ultracongelador a -85°C hasta antes de ser utilizandos con las células troncales
mesenquimales.
2.6. Obtención de células troncales mesenquimales
Las células troncales mesenquimales se obtuvieron de fragmentos de periostio (1
cm2), de un donador con consentimiento informado al cual se le realizó una
cirugía de reparación de ligamento cruzado en el Instituto Nacional de
Rehabilitación Nacional. Por el servicio de ortopedia del deporte y artroscopia.
2.6.1. Expansión celular
El procesamiento del explante se lleva a cabo en una placa de seis pozos,
colocando en orientación al tejido del lado donde se encuentra en contacto con el
hueso. Las células se cultivan con medio de cultivo DMEM F12 (Gibco Life
Technologies) complementado con suero fetal bovino al 10% (Gibco Life
Technologies) y Antibiótico/Antimicótico 1% (Gibco Life Technologies) en
atmósfera humidificada al 5% de CO2 a 37ºC. El cultivo de CTMs se mantiene con
cambio de medio complementado cada 2-3 días. Cuando se llega a una
confluencia del 80% aproximadamente, se realizan pases celulares con tripsina
o acutasa según sea el caso.
2.6.2. Evaluación de las características morfológicas
La morfología fibroblastoide inicial, intermedia y final se evaluó mediante
microscopía invertida a diferentes aumentos. Se utilizó un microscopio invertido de
contraste de fases marca ZEISS modelo AXIO VERT 40 y software AXIO VISION
LE.
40
2.6.3. Siembra de CTMs en el compósito de Hap-Col
Los compósitos de HAp-Col irradiados a 15 kGy se colocan en cajas de cultivo
de 48 pozos y se siembran con 40000 células por andamio en medio de cultivo
DMEM F12 con un volumen de 40 μl, se incuban 30min a 37° C, posteriormente
se cubren con 500 μl de medio complementado con suero fetal bovino,
Antibiótico/Antimicótico y Ácido ascórbico. A los compósitos sembrados se les
cambia el medio complementado cada 3 días hasta cumplir sus días de cultivo.
Los tiempos de cultivo fueron de, 1, 3, 7 y 15 días.
2.7. Caracterización biológica de las CTMs
2.7.1. Evaluación del inmunofenotipo de CTMs
Después de llegar a un 80% de confluencia de CTMs en las cajas de cultivo, en el
tercer pase se lleva a cabo un desprendimiento celular con solución de acutasa
(Sigma), del cual se evalúa el número de células viables presentes, utilizando
una cámara de Neubauer con azul tripano y en conjunto con el microscopio
invertido se realiza el conteo celular, una vez conocida la cantidad de células se
colocan de 2.0-5.0 x 105 células por tubo, cantidad necesaria para iniciar las
marcaciones con los anticuerpos acoplados a un fluorocromo (Becton Dickinson)
CD90positivo FITC y APC, CD105 positivo PE, HLA negativo APC, CD44 positivo FITC, CD34
negativo PE, CD45 negativo FITC, CD166 positivo PE y CD73 positivo APC, específicos para
cada antígeno. Las células ya con los anticuerpos incorporados se incubaban de
30-45 minutos en ausencia de luz a 4°C, transcurrida esta incubación las células
son lavadas para eliminar los excedentes de anticuerpos, se centrifugan a 1500
rpm durante 10 minutos para eliminar el sobrenadante y finalmente se resuspende
el pellet celular con PBS, para iniciar la lectura con el citómetro de flujo
(FACSCalibur Becton Dickinson) el cual determina la expresión de las proteínas
relacionadas con el inmunofenotipo en el software CellQuest analizando 10000
eventos.
41
2.7.2. Diferenciación osteogenica de CTMs
Después de tener un 80% de confluencia de las CTMs en el tercer pase, se lleva
a cabo un desprendimiento celular, donde se siembran las células en pozos a
una densidad de 2000 células/cm2 induciéndolas a una diferenciación
osteogénica en medio de cultivo suplementado con BMP - 4 (0.1 μg/ μL), ácido
ascórbico (20 mg/ mL) y dexametasona (10 nM). Los grupos de células en
diferenciación (células inducidas con medio osteogénico) son monitorizadas con
grupos de células control (células no inducidas sin medio osteogénico). El medio
se cambia cada 3 días y se observa la diferenciación usando la tinción de Von
Kossa después de 15 días de cultivo. Las imágenes de la tinción son tomadas
con un microscopio invertido.
2.7.3. Diferenciación condrogénica de CTMs
Después de tener un 80% de confluencia de las CTMs en el tercer pase, se lleva a
cabo un desprendimiento celular donde se siembran las células en pozos con un
cultivo de micromasas en alta densidad, las células requeridas son de 2.5 x 105
por pozo en un medio de cultivo suplementado con TGF-ß1 (0.1 μg/ μL), ácido
ascórbico (20 mg/mL), dexametasona (10 nM) y glutaMAX 100 X. Los grupos de
células en diferenciación (células inducidas con medio condrogénico) son
monitorizadas con grupos de células control (células no inducidas y sin medio
condrogénico). El medio se cambió cada 3 días, y la diferenciación se observa
usando la tinción azul alciano después de 15 días de cultivo. Las imágenes fueron
tomadas con un microscopio invertido.
2.7.4. Diferenciación adipogénica de CTMs
Después de tener un 80% de confluencia de las CTMs en el tercer pase, se lleva a
cabo un desprendimiento celular donde se siembran las células en pozos con
una densidad de 30000 células/cm2 por pozo en un medio de cultivo
suplementado con dexametasona (10 nM), insulina (0.1 mg/mL),
isobutilmetilxantina y indometacina. Los grupos de células en diferenciación
(células inducidas con medios adipogénicos) son monitorizadas con grupos de
42
células control (células no inducidas y sin medio adipogénico). El medio se
cambió cada 3 días, y la diferenciación se observa utilizando la tinción de Rojo O
después de 15 días de cultivo. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio
invertido.
2.7.5. Inmunofluorescencia
Con el fin de detectar una posible diferenciación osteogénica de las CTMs en los
compósitos de HAp-Col, se realizó una tinción inmunofluorescente en las CTMs
obtenidas de periostio para detectar expresiones proteicas del marcador
osteogénico de osteopontina, comparándolas con otra tinción inmunofluorescente
realizada a células de hueso también con un marcador de osteopontina. Donde a
los dos tipos celulares previamente fijados se les coloca PBS durante cinco
minutos, después PBS tritón al 3% por dos ocasiones para aplicar la solución de
bloqueo durante 20 minutos para poder agregar el anticuerpo primario
(osteopontita Abcam ab8448) el cual se deja incubando durante 24 horas a 4°C,
para que el siguiente día se lavara con PBS por repetidas ocasiones para añadir el
anticuerpo fluorescente (Goat Anti-Rabbit ab6717 FITC) incubándolo en ausencia
de luz, por dos horas en el incubador a 37°C. Finalmente se lava con PBS por
dos ocasiones y se prosigue a observar la tinción inmunofluorescente en el
microscopio confocal (Carl Zeiss) con el software (ZEN 2010).
2.8. Caracterización biológica de las CTMs sembradas en los compósitos de
HAp-Col
2.8.1. Viabilidad celular
La supervivencia celular en los compósitos sembrados con las CTMs a los
diferentes tiempos se evalúa utilizando el kit de viabilidad/citotoxicidad
(LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells Thermo Fisher) de
células vivas / muertas, para células de mamífero. Las células vivas se tiñen con
calceína AM y las células muertas se marcan con homodímero-1 de etidio unido
al ADN, estas soluciones acompañadas con HBSS (Invitrogen) se agregan
cuidando la ausencia de luz a los pocillos donde se encuentran los compósitos y
43
se dejan en incubación durante 30 min a 37°C. Las tinciones se observan
utilizando la microscopía confocal (Carl Zeiss, ZEN 2010) y el microscopio de
fluorescencia (Carl Zeiss, Axio Vision) con los filtros de excitación y emisión de
517 para calceína y 617 para homodimero-1 de etidio.
2.8.2. Adhesión celular y morfología por MEB
Para evaluar la adherencia de las CTMs en los compósitos de HAp-Col se inicia
por eliminar el medio de cultivo de los pocillos en donde se encuentran los
compósitos, se lavan con PBS y se les agrega glutaraldehído al 2.5% durante
media hora para fijar las células permitiendo preservar su estructura celular,
también se realiza un grupo control el cual no contiene células permitiendo
monitorizar a los compósitos cultivados y ambos son observados en el
microscopio electrónico de barrido (JEOL modelo JSM-5900LV) a amplificaciones
de X200.
44
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
3.1. Caracterización fisicoquímica de la hidroxiapatita, colágeno y los
compósitos.
3.1.1. Microscopia electrónica
La HAp obtenida del hueso bovino se observa que está compuesta por partículas
cristalinas de tamaño irregular, presentando microporos con tamaños entre 1-10
μm de diámetro (Figura 3.1 a). En el análisis de EDS de la HAp se pueden
apreciar los elementos fósforo, calcio y oxígeno principalmente, aunque también
se presentan impurezas como el magnesio y sodio los cuales son característicos
de la HAp de origen orgánico (Figura 3.1 b).
En la micrografía correspondiente al colágeno se observó que la superficie se
denota con una forma irregular, formando redes entrelazadas (Figura 3.1 c). En el
análisis de EDS se presentan elementos como el carbono, oxígeno y nitrógeno
con trazas de sodio y cloro (Figura 3.1 d).
En la micrografía del compósito elaborado con los biomateriales de HAp-Col
(70:30) se pudo medir el área superficial de 0.5 cm2 y un espesor de 0.4cm,
observándolo a una amplificación de 11X, se puede ver que la superficie tiene
una estructura compacta, heterogénea y rugosa (Figura 3.1 e). En el análisis de
EDS los elementos presentes en el compósito son el carbono, oxigeno, fosforo y
calcio, en cantidades menores trazas de magnesio y sodio, lo que es de
esperarse, de acuerdo a sus EDS realizados de forma individual (Figura 3.1 f).
Las micrografías a 200X aumentos del compósito de HAp-Col tanto del no
irradiado, como de los compósitos irradiados a diferentes dosis se pueden ver en
la figura 22, se observa que tienen en general una estructura plana, en algunas
zonas se pueden ver protuberancias, grietas y una baja porosidad. No se
observan cambios en la superficie del compósito al aumentar la dosis de
irradiación, en el caso del EDS, aunque solo se presenta el de mayor dosis, la
presencia elemental en las otras dosis, no muestra cambios significativos.
45
Figura 3.1 a) Micrografía de la HAp 200X, b) EDS de la HAp, c) Micrografía del colágeno 200X, d) EDS del colágeno, e) Micrografía del compósito de Hap-Col
11X y f) EDS del compósito de Hap-Col.
a)
Hidroxiapatita EDS a) b)
Colágeno EDS c) d)
Compósito HAp-Col EDS e) f)
46
Figura 3.2. Micrografías de los compósitos sin irradiar e irradiados a 200X y el EDS del compósito irradiado a 30 kGy.
0 kGy 5 kGy
20 kGy
15 kGy 10 kGy
2 5 kGy
30 kGy EDS
47
3.1.2. Difracción de rayos X
La determinación de los componentes cristalinos de la HAp se realizó por la
técnica de DRX. El difractograma en color rojo corresponde a la HAp obtenida a
partir hueso de bovino, de acuerdo al difractograma en color azul, que
corresponde a la tarjeta JCPDS 01-070-0982, el compuesto encontrado en la
muestra confirma que la cerámica extraída de hueso bovino es HAp
(Ca5(PO4)3OH). Cada tarjeta JCPDS contiene la información cristalográfica de la
composición química del elemento y el compuesto en cuestión, también muestra la
relación de la distancia interplanar en un ángulo 2θ contra la intensidad relativa55.
La muestra de HAp presento una alta cristalinidad y las distancias interplanares
reportadas coinciden, concordando con los datos de referencia establecidos. El
difractograma en color negro muestra la difracción de la proteína obtenida de
dermis porcina, el cual tuvo un comportamiento amorfo, sin embargo, este
resultado nos ayudó como soporte para analizar el difractograma DRX de los
compósitos (Figura 3.3).
Figura 3.3. Difractogramas de rayos X: colágeno porcino (negro), hidroxiapatita
bovina (rojo), e hidroxiapatita de la tarjeta JCPDS-9-432 (azul).
Hidroxiapatita
Colágeno
Compósito HAp-Col
EDS
EDS
EDS
a) b)
c) d)
e) f)
48
Los difractogramas de los compósitos HAp-Col no irradiado y de los irradiados a
dosis de 5, 10, 15, 20, 25 y 30 kGy se muestran en la figura 3.4 lo que permite
observar el comportamiento de los biomateriales que conforman al compósito
después de ser irradiados. Las características cristalinas de la HAp prevalecen sin
cambios en todos los compósitos, así como la parte amorfa, proporcionada por el
colágeno, lo que indica que el efecto de la dosis hasta 30 kGy no altera la
estructura cristalina-amorfa de los compósitos.
Difractogramas de rayos X de los compósitos Hap-Col esterilizados con Co-60: 30 kGy (morado), 25 kGy (azul), 20 kGy (verde), 15 kGy (rosa), 10 kGy (azul), 5 kGy
(rojo) y 0 kGy (negro).
49
3.1.3. Espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier.
El espectro de infrarrojo de la Hap se muestra en color azul, el cual permite
observar las bandas vibracionales características de los grupos fosfatos a
frecuencias de 1046, 961 y 867 cm-1, y los grupos hidroxilo a una frecuencia de
3500 cm-1, ambos grupos característicos del mineral de HAp. En color rojo se
muestra el espectro del colágeno en donde se observan las bandas vibracionales
de las amidas primaria (1634 cm-1), secundaria (1548 cm-1), terciaria (1250 cm-1)
y amida A (3278 cm-1) así como la banda del grupo hidroxilo a (3500 cm-1), estos
son grupos característicos de la proteína (Figura 3.5).
Figura 3.5. Espectros de FTIR: colágeno porcino (rojo) e hidroxiapatita bovina
(azul).
50
Los espectros donde se observan las bandas vibracionales del composito de HAp-
Col no irradiado y la de los irradiados muestran una gran similitud entre ellas,
demostrando que no sufren cambios a causa de la irradiación, lo que indica que
hasta la dosis de 30 kGy, los compósitos no son afectados químicamente (Figura
3.6).
Figura 3.6. Espectros de infrarrojo de los compósitos Hap-Col esterilizados con
Co-60: 30 kGy (cafe), 25 kGy (rosa), 20 kGy (amarillo), 15 kGy (morado), 10 kGy
(negro), 5 kGy (rojo) y 0 kGy (azul).
3.1.4. Análisis termogavimétrico.
El resultado obtenido para determinar la estabilidad térmica de la muestra de HAp
se presenta en la figura 3.7 donde se observa que la pérdida de masa hasta
800°C fue menor del 2%, lo que indica que este mineral es muy estable, ya que
hay que considerar que el punto de fusión de la HAp es mayor de 1200°C50.
51
Figura 3.7. Termograma de hidroxiapatita de hueso bovino.
El efecto de la temperatura sobre el colágeno se observa en el termograma de la
figura 3.8 donde se puede apreciar que hasta 400°C la pérdida de masa es
mínima, en cambio de 400 a 520°C la pérdida de masa aumenta hasta un 35 %,
debido a la trasformación en CO2 de materia orgánica.
Figura 3.8. Termograma de colágeno de dermis porcina.
52
3.2. Caracterización microbiológica
Los resultados de las pruebas de esterilidad muestran que después de los 15
días de incubación, los compósitos de HAp-Col irradiados no presentan
crecimiento microbiológico para organismos anaerobios ni aerobios, lo cual indica
que la dosis de esterilidad se da desde 5 kGy, sin embargo para estar muy por
encima que la dosis mínima de esterilidad, los compósitos HAp-Col se irradiaron a
una dosis de 15 kGy para ser utilizados en la siguiente etapa que es sobre el
estudio de las CTMs en los compósitos HAp-Col (Tabla 3.1 y figura 3.9).
Tabla 3.1.Prueba de esterilidad de los compósitos irradiados
Figura 3.9. Pruebas de esterilidad de los compósitos irradiados por 15 días.
Dosis de esterilidad Cultivo de tioglicolato
(anaerobios)
Cultivo de soya tripticaseina
(aerobios)
5 kGy
Sin crecimiento microbiano
Sin crecimiento microbiano
10 kGy
15 kGy
20 kGy
25 kGy
30 kGy
53
3.3. Caracterización biológica de las CTMs y cultivo celular en los compósitos.
3.3.1 Expansión celular y características morfológicas
Mediante microscopía invertida con contraste de fases se observan las células
CTMs aisladas de periostio, desde el cultivo primario donde se observa la
migración de las CTMs provenientes del explante de periostio el cual es apreciado
como una sombra negra al plato adherente, a los 15 días las células ya se
encuentran expandiéndose y formando una monocapa logrando apreciar la
morfología fibroblastoide característica de las CTMs, ya en el tercer pase las
células ya están adaptadas, se observan menos espacios entre ellas y la
confluencia ya es de un 85% con la cual se puede proseguir a un
desprendimientos celular (Figura 3.10).
Figura 3.10. Microfotografías de cultivo de CTMs obtenidas de periostio a 10 x. a) Cultivo primario de CTMs. b) CTMs a 15 días de cultivo c) CTMs en el tercer
pase.
a) b)
c)
54
3.3.2. Evaluación del inmunofenotipo de CTMs
Para determinar la expresión de antígenos hematopoyéticos (CD34 y CD45) y
mesenquimales (CD44, CD73, CD90, CD105, CD166 y HLA) se determinó la
intensidad media de fluorescencia de cada proteína en el tercer pase de cultivo. El
resultado de la expresión de los antígenos mediante citometría de flujo fueron los
siguientes CD34 (3.28%) y CD45 (0.62%) resultaron negativos demostrando la
ausencia de células hematopoyéticas contaminantes, en cuanto al linaje de las
células mesenquimales los marcadores positivos fueron CD73 (97.46%), CD90
(99.7%), en cuanto a CD44 (9.73%), CD105 (4.44%) y HLA-I (0.30%) resultaron
negativos, dando a conocer que las CTMs obtenidas de periostio no contaban con
todos los marcadores de células progenitoras del linaje mesenquimal. En los
histogramas se observa el perfil de expresión del control de isotipo en
comparación con los fluorocromos FITC, PE y APC (Figura 3.11).
Control
HLA-I
CD73
CD90
Control
CD45
CD90
55
Figura 3.11. Inmunofenotipo mediante citometría de flujo para CTMs de
provenientes de periostio.
3.3.3. Diferenciación osteogénica de CTMs
La diferenciación osteogénica de las CTMs se observó con una tinción positiva de
Von Kossa después de dos semanas de estimulación, en donde los depósitos de
calcio en las células diferenciadas se observan como pequeños puntos
precipitados en color negro ubicados en el interior de las células. Las células no
inducidas (el grupo control) sirven como controles negativos para los osteocitos,
las cuales no se tiñeron positivamente conservando una morfología de CTMs.
(Figura 3.12).
3.3.4. Diferenciación condrogénica de CTMs
La diferenciación de las CTMs a células de linaje condrogénico se llevó a cabo en
un cultivo de micromasas en alta densidad, tal diferenciación se observó mediante
la tinción de azul alciano en donde las células se tiñen de color azul indicando la
presencia de glicosaminoglicanos. Las células indiferenciadas sirven como
controles negativos con menor presencia de glicosaminoglicanos (Figura 3.12).
3.3.5. Diferenciación adipogénica de CTMs
La diferenciación adipogénica de las CTMs se observó con una tinción positiva de
rojo O después de dos semanas de estimulación, en donde las vacuolas lipídicas
se tiñen en color rojo. Las células no inducidas (grupo control) sirven como
Control
CD34
CD105
56
controles negativos para la tinción de rojo O, las cuales no se tiñeron
positivamente conservando una morfología de CTMs (Figura 3.12).
Figura 3.12. Diferenciación de CTMs: osteogénica y control (a-b), condrogénica y control (c-d) y adipogénica y control (e-f).
Control Diferenciadas
Ad
ipo
gén
ica
O
ste
og
én
ica
C
on
dro
gén
ica
a)
b)
c)
d)
e)
f)
57
3.3.6. Inmunofluorescencia
Las CTMs provenientes de periostio sembradas en los compósitos de HAp-Col,
mostraron expresiones proteicas para osteopontina un marcador osteogénico, el
cual se observa con la tinción inmunofluorescente color verde presente en la
matriz extracelular, indicando que las CTMs tienen un potencial de diferenciación
hacia un linaje osteogénico. La expresión proteica de osteopontina también se
sucedió en las células de hueso las cuales sirvieron como comparativo (Figura 3.
13).
Figura 3.13. Tinción de inmunofluorescencia con osteopontina para CTMs provenientes de células de hueso y periostio.
3.3.7. Viabilidad celular
Los resultados de la prueba de viabilidad LIVE/DEAD realizada a los compósitos
de HAp-Col sembrados con CTMs a tiempos de 1, 3, 7 y 15 días se analizan con
un microscopio de fluorescencia en el cual se observa la auto fluorescencia del
colágeno en donde se encuentran las células vivas (en color verde) con morfología
Peri
osti
o
Hu
eso
Control Osteopontina
a)
b)
d)
c)
58
circular ubicadas en la circunferencia del compósito, alrededor de las partículas de
hidroxiapatita, también se observa que al paso de los tiempos de cultivo la
confluencia celular en los compósitos va en aumento extendiéndose hacia el
centro, las células muertas (en color rojo) no se observaron con este microscopio
en ningún tiempo. En cuanto al análisis realizado con microscopia confocal se
perciben células vivas y muertas, permitiendo realizar un conteo celular con el
software Imagen J mostrando una viabilidad del 92.8%. (Figura 3.14 y Figura
3.15)
Figura 3.14. Grafica de crecimiento de CTM dentro de compósito de Hap-Col.
3.3.8. Adhesión celular y morfología por MEB
Para este análisis se toman micrografías de los compósitos sembrados con las
CTMs a diferentes tiempos de cultivo para identificar la adhesión celular,
resultando complejo diferenciar en el composito la presencia de CTMs por que se
confunde su ubicación en el colágeno debido a su morfología, teniendo como guía
para su identificación a los compósitos sembrados comparándolos con los
compósitos control (no contienen células) y el tamaño de las células. Analizando
las micrografías a 1, 3, y 7 días de cultivo, no se distingue una adhesión celular
en comparación con la del cultivo a los 15 días, en donde en el compósito se
observan varias células con morfología redonda con un tamaño aproximado a los
10 um, en la superficie del colágeno y la presencia en el alrededor de partículas
de HAp (Figura 3.16.).
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1 Día 3 Días 7 Días 15 Días
Célu
las
Crecimiento Celular
59
Figura 3.15. Micrografías de epifluorescencia y fluorescencia confocal de CTM
teñidas con calceína (verde) y homodimero de etidio (rojo) en los compósitos de
Hap-Col 70:30 cultivados por 1, 3, 7 y 15 días.
VIABILIDAD CELULAR
M. de Fluorescencia M.Confocal
1
Día
3
Días
7
Días
15
Días
60
Figura 3.16. Micrografías de Adhesión celular de CTMs en los compósitos de
Hap-Col a 1, 3, 7 y 15 días de cultivo.
ADHESIÓN CELULAR
Con células Sin células
1
Día
3
Días
7
Días
15
Días
61
DISCUSIONES
La literatura proporciona evidencia de andamios realizados con biomateriales tanto
naturales como sintéticos, que son utilizados para realizar cultivos celulares que
permitan el desarrollo de nuevo tejidos, pero estos no siempre brindan los
mejores resultados debido a las dificultades que se tienen en el proceso.
Esta investigación pretende obtener información sobre la obtención de
biomateriales de origen natural provenientes de hueso bovino y dermis porcina,
con metodologías ya establecidas, las cuales se analizan por técnicas específicas
para el área de caracterización de materiales. Permitiendo así la elaboración de
un composito con los biomateriales de hidroxiapatita y colágeno siguiendo las
características del hueso con porcentajes de 70% hidroxiapatita y 30% colágeno,
el composito esta radioesterilizado con irradiación gamma de Co 60 de los cuales
se estudiaron diferentes dosis para elegir la más conveniente, resultando ser la de
15 kGy. Así mismo realizar el cultivo de células troncales mesenquimales
obtenidas de periostio con su respectiva caracterización biológica establecida por
procesamientos normalizados de operación, para llevar a cabo la siembra de estas
células en los compósitos procedimiento del cual no se encontraron registros
establecidos por otros autores, aunque si se encontraron similares en cuanto a la
búsqueda de elaboración de un sustituto óseo con propiedades similares al hueso.
La hidroxiapatita se obtuvo del hueso bovino debido a que está constituido en un
70 % por una matriz inorgánica que en su mayoría es hidroxiapatita la cual al
caracterizarla mostro ser cristalina, tener bandas de grupos fosfatos
desintegración a temperaturas mayores a 900°C; autores como Sodat et al7
proponen al igual que este trabajo la obtención de biomateriales de fuentes
biogénicas como una alternativa.
El colágeno puede ser obtenido de diferentes fuentes ya que esta proteína es muy
abundante, por lo cual se obtuvo de la dermis porcina debido a que contiene
altas concentraciones de colágeno tipo I y con mejor rendimiento que otros tejidos.
El colágeno obtenido mostro características amorfas y la presencia de amidas I, II,
62
III Y A al igual que su desintegración a bajas temperaturas por lo cual
consideramos haber obtenido la proteína 2,56.
La preparación del composito con HAp-Col a través de una mezcla física, resulto
no ser la mejor opción debido a que el colágeno resulto ser muy hidrófilo después
de ser liofilizado y con la diferencia de densidades que tienen con la hidroxiapatita
provoca una separación si el composito no tiene una humedad específica.
Cuando los compósitos son irradiados, no hay cambios en la morfología y la
composición elemental, los difractogramas conservan la parte cristalina de la
hidroxiapatita y la parte amorfa del colágeno al igual que los grupos funcionales
del compósito. La esterilización por radiación gamma de Co 60 es una buena
opción, para la esterilización de biomateriales y de los compósitos ya que estos no
mostraron ningún crecimiento microbiológico, Rangel1 comenta que esta manera
de esterilización tiene ventajas ya que se puede esterilizar desde un empaque
final lo cual tiene beneficios secundarios.
La ISCT ha establecido tres criterios para demostrar CTM in vitro, que consisten
en probar la adherencia en plástico de las células aisladas con morfología
fibroblastoide, determinar la expresión de CD105, CD73 y CD90, en ausencia de
marcadores hematopoyéticos e inducir la diferenciación in vitro de las CMM en
osteoblastos, adipoblastos y condroblastos 93,94.
Las CTM obtenidas de periostio si son células plástico adherentes y tienen una
morfología fibroblastoide que fue observada en los tiempos de cultivo. En cuanto a
su expresión de inmunofenotipo determino la expresión positiva para CD90 y
CD73 estos marcadores son importantes para definir el fenotipo de las células al
igual que el marcador CD105 pero este resulto ser negativo debido a que durante
los pases celulares se perdió su expresión que realizaba en la matriz extracelular
98. La diferenciación al linaje osteogénico, condrogénico y adipogénico fue posible
debido a que las CTM fueron inducidas con proteínas y factores de crecimiento
específicos para cada linaje99.
63
En la siembra de las CTM en los compósitos de HAp-Col, cultivadas a diferentes
tiempos tuvieron una viabilidad y un crecimiento celular significativo demostrando
que el procedimiento que se siguió es adecuado ya que la muerte celular es casi
nula, aun con las limitaciones que se el composito presenta de ser poco
manipulable debido a la forma en que se encuentra compactado. En cuanto a la
adhesión celular, esta no pudo ser observada como se debía, al retirar la humedad
de los compósitos para ser observado con MEB se volvían frágiles además que
las células se confundían con el colágeno por el cual estaba elaborado el
composito.
64
CONCLUSIONES
En este estudio se demostró que los biomateriales fueron extraídos de hueso
bovino y dermis porcina para la elaboración de los compósitos HAp-Col 70:30 los
cuales no mostraron cambios fisicoquímicos al ser irradiados con radiación
gamma de Co 60. Los compósitos no resultan ser citotóxicos para las células
troncales mesenquimales y estas tienen la capacidad de diferenciarse a un linaje
osteogénico que fue doblemente comprobado debido a que estas cuentan con
osteopontina un marcador de células osteogénicas. Las CTMs muestran una
viabilidad del 92% y un crecimiento celular con poca adhesión sobre los
compósitos HAp-Col 70:30. Sin en cambio la estructura del compósito no es la
ideal para la elaboración de un sustituto óseo debido a que es de difícil manejo en
el área del cultivo celular. Se puede realizar un nuevo compósito que cumpla las
necesidades para realizar un sustituto óseo teniendo como antecedentes los
resultados de este trabajo.
65
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