Disrupcion Celular

DISRUPCIÓN CELULAR

Operaciones y Procesos Biotecnológicos IIDISRUPCIÓN CELULAR

1) Estudiar los procesos habitualmente empleados en laindustria para separar y/o purificar productos deinterés.

Objetivos de Operaciones y Procesos Biotecnológicos II:

2) Evaluar las variables que permiten optimizar losprocesos habitualmente involucrados en la separaciónde residuos insolubles, el aislamiento y la purificaciónde un determinado producto.


Productos de interés liberadosnaturalmente al medio

Disrupción celular Lípidos

Proteínas recombinantes

Enzimas

Antibióticos

?

ADN, ARNMicroorganismoProductor


Proceso General

Que clase de célulase quiere destruir?

Cuál es el productoque queremos

extraer?

Selección delmétodo de

disrupción celulara emplear

Puesta a puntodel métodoseleccionado

Evaluaciónacerca de losrendimientos

obtenidos

Conclusiones


¿Qué es lo que debemos

conocer de la célula a la

hora de diagramar una

disrupción?


Estructura de la Membrana Plasmática

Membrana Plasmática

- Actualmente el modelo que describe la membrana plasmática es el del“mosaico fluido”.


Las principales funciones de la membrana plasmática son:

Membrana Plasmática

Servir de sitio estable para la catálisis enzimática.

Servir de receptores que reconocen señales de determinadas moléculasy transducir la señal al citoplasma.

Ayudar a la compartimentalización sub-celular .

Protección.

Comunicación intercelular.

Regular el intercambio de sustancias entre el interior y exterior celular(lo que entra y sale de la célula).

Aislar selectivamente el contenido de la célula del ambiente externo.


o El tipo de célula con el que se vaya a trabajar es importante:

o La pared celular es una estructura rígida y compleja queprotege a la célula del ambiente, manteniendo su forma ypresión osmótica.

Pared Celular

- células vegetales (plantas y algas)

- hongos y levaduras

- bacterias (Gram positivas y Gram negativas)


- La red de mureína (peptidoglicano) estamuy desarrollada (puede presentar hasta50 capas).- Es frecuente la presencia de losaminoácidos L-diaminopimélico o delisina.

- En ella se encuentran ácidos teicoicos ylipoteicoicos.

- No presentan lipo-polisacáridos.

- Presentan una sola bicapa lipídica.

Pared Gram Positiva

- Presentan bajo contenido proteico.

- Alto contenido de lípidos.Staphylococcus


- La red de mureína presenta una solacapa.- Contiene únicamente meso-diaminopimélico y nunca contiene lisina.

- Hasta ahora no han podidoencontrarse ácidos teicoicos o lipo-teicoicos.

- Se encuentran grandes cantidades delipoproteínas y lipo-polisacáridos querepresentan hasta el 80 % del peso secode la pared celular.

- Tienen dos bicapas lipídicas.

- Presentan porinas en la membranasexterna.

Pared Gram Negativa

E. Coli


Pared celular de Hongos y Levaduras

- Es una estructura muy gruesa (100-200 nm)

- La pared celular esta compuesta por dos capas de polisacáridos, unacapa interna transparente y amorfa, constituida principalmente de β-

1,3 y β-1,6-glucanos. En la capa externa se encuentran ubicadas las

mano-proteínas, ancladas a la capa interna de β-glucanos o bien

atravesándola.

- Representa del 15-25% del peso celular en base seca.


Pared celular Células Vegetales

- Pared primaria: mide entre100 y 200 nm de espesor,compuesta entre un 9 y un25% de celulosa

- Laminilla media: Es el lugarque une las paredes primariasde dos células contiguas.

- Pared secundaria: (cuando existe) serelaciona con la especialización de cada tipocelular. A diferencia de la pared primaria,contiene una alta proporción de celulosa,lignina y/o suberina. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II

DISRUPCIÓN CELULAR


Células Animales

Micelios

Bacilos Gram (-)

Bacilos Gram (+)

Células Vegetales

Levaduras

Cocos Gram (-)

Esporas

Dificultad Para la Disrupción Celular

Métodos de Disrupción Celular

Métodos mecánicos:

- Son inespecíficos.-Suelen ser mas efectivosque los métodos químicos.

Se basan en fuerzas de corte (shear stress) que deforman las célulashasta el rompimiento de sus cubiertas.

- Generalmente son masfáciles de escalar que losmétodos no-mecánicos .

- La separación del productodeseado de otros materiales (ac.nucleicos, proteínas, trozos de lapared celular, etc.) puede llegar aser dificultosa.

- Pueden llegar a dañar productoslábiles.

- Requieren mucha energía.

- Generan elevadas temperaturas.


Métodos de Disrupción Celular

Métodos no mecánicos:

- Por sí mismos, estos métodosno suelen ser muy eficientes.

- Por lo general son menosseveros que los mecánicos.

Rompen las cubiertas celulares induciendo la lisis celular, a travésde medios químicos, físicos o enzimáticos.

- No generan grandes dañosa las célula, facilitando laposterior purificación delproducto de interés.

- Son mas específicos.

- Pocos métodos no mecánicospueden llegar a ser escaladosexitosamente.


Métodos mecánicos

Homogenizadores de alta presión

Se aplica una elevada presión a unasuspensión de células forzándolas através de una válvula, sometiendo a lascélulas a un alto estrés de corte,rompiendo las membranas.

Es uno de los mas utilizados para disrupción celular a gran escala.


El mecanismo de disrupción sedaría por fuerzas de corte en laregión de la válvula, cavitación(debido a las regiones de bajapresión generadas) y al impactocontra el anillo.

Métodos mecánicos

Homogenizadores Microfluidizadores (microfluidizer homogenizer)

El mecanismo de disrupciónrealizado por este equipogenera partículas de mayortamaño que el homogenizadorde alta presión.

En los microfluidizadores, el líquido se divide en dos o más corrientes que sebombean a elevadas presiones (en algunos equipos más de 270 MPa) ygrandes velocidades, unas contra otras en un ángulo de 180° cayendorepentinamente la presión tras chocar ambas corrientes.


Métodos mecánicos

Bead mills (molinos a esferas)

- Aspectos a considerar al trabajar con estos equipos: tamaño de lasesferas (0,2-15mm), cantidad y material de las esferas; velocidad deagitación; temperatura de trabajo; velocidad de flujo y concentración dela suspensión a tratar.

- Básicamente consiste en un agitador adiscos montado sobre un motor centralque gira en una cámara central, la cuales cargada con esferas de vidrio, metalu otro material.

- Son de los mas utilizados a gran escala.


Métodos mecánicos

- Las ondas de ultrasonido crean muchas micro-burbujas en muchos sitios de nucleacióndentro de la suspensión celular. Estas micro-burbujas luego colapsan implosionando duranteel período de rarefacción (compresión) de laonda.

- Este fenómeno, denominado cavitación,produce un shock de ondas muy intenso,generando un fuerte estrés local, deformandoal límite las células y produciendo así suconsecuente ruptura.

- El ultrasonido utiliza frecuencias entre 20 y 50kHz.

Sonicadores (ultrasonido)


Métodos no-mecánicos

Dentro de estos tipos de métodos podemos clasificar tressub-clases principales:

3) Métodos enzimáticos

2) Métodos físicos

1) Métodos químicos



1) Métodos Químicos

Agentes Caotrópicos (urea, clohidrato de guanidina)Interfieren con los enlaces no covalentes (puentes de hidrógeno,fuerzas de van der Walls) desorganizando la estructura del aguahaciéndola menos hidrofílica, debilitando las interacciones soluto-soluto.

Tratamiento con álcalis (hidróxido de sodio e hipoclirito)Se produce la saponificación de los lípidos de las membranas. Es unatécnica muy severa pero efectiva y de bajo costo, siempre y cuando elproducto de interés sea resistente a la degradación a pH elevados.

Tratamiento con solventes orgánicos (cloroformo, tolueno)Los solventes orgánicos permeabilizan las membranas celularesdisolviendo componentes hidrofóbicos de la pared, como losfosfolípidos de la membrana interna en bacterias Gram (-).




Agentes Quelantes (EDTA):Este agente quela los iones Ca2+ y Mg2+ que unen los LPS adyacenteshaciendo que se liberen parte de los LPS conteniendo proteínas yfosfolípidos de la membrana (Gram -).

Antibióticos:Son efectivos contra bacterias Gram (-) (β-lactámicos) . Distintosantibióticos causan la lisis por distintos mecanismos. No se utilizan agran escala.



Tratamiento con detergentes

La efectividad del método radica en laquímica del detergente, ya que sonanfipáticos.

Se clasifican en tres tipos: catiónicos(sales de tetra-alquil-amonio, pHbásico), aniónicos (SDS, pH ácido) yno-iónicos (Triton-X,).



Forman micelas con los lípidos de lasmembranas, desestabilizándolas.


Shock osmótico

- Las células con paredes celulares son mas difíciles de romper.

- El estrés osmótico es generado cuando las células son situadas enmedios hiper/hipotónicos.

- Es el método químico mas simple.


2) Métodos Físicos

Congelamiento/descongelamiento:

Los cristales de hielo que se forman y crecen durante elcongelamiento, rompen mecánicamente la integridad del interior dela membrana celular, haciéndola mas permeable.

Enfriamiento lento Enfriamiento rápido

Se ha visto que la congelación lenta no funciona tan bien como larápida. La congelación rápida lesiona más específicamente lasmembranas celulares produciendo lisis celular.




Descompresión:

- Es un proceso por el cual las células se mezclan con un gaspresurizado por un tiempo específico. El gas entra en las células yluego al liberar la presión aplicada el mismo se expande causandola disrupción.


Termólisis:

- Es un proceso bastante común a gran escala. Las células sonllevadas a mayores temperaturas con el fin de romper o debilitar lamembrana externa.




Disrupción Enzimática:

Lisozima(muramidasa)

- La principal limitación de este método es su elevado costo. Lainmovilización puede ser una herramienta útil para la reducción decostos

- La lisis enzimática es un método muypreciso, pero que requiere de unacomprensión precisa de la estructura delas paredes celulares que se deseandestruir.


3) Métodos Enzimáticos

Auto-lisis:


- Por sí mismo es un mecanismo lento. Lo que se hace estransformar cepas a fin de hacer estos sistemas auto-líticos muchomas activos, introduciendo genes que codifican antibióticos yenzimas que degraden mas rápidamente las distintas organelas ymembranas celulares.

- Es un proceso por el cual las células inducen su propia destrucción.Se produce la activación de señales que activan la liberación deenzimas que degradan las organelas y membranas de las mismascélulas.


3) Métodos Enzimáticos

Métodos Combinados

Puede verse que los distintos métodos de disrupción poseen diversosprincipios de acción, lo que hace factible su combinación de formasinérgica para aumentar el rendimiento del proceso en un solométodo combinado.

Métodos no-mecánicos combinados

Disrupción mecánica con pre-tratamientos no mecánicos

Evaluación de la eficiencia de los métodos de disrupción

Métodos directos: Consisten en contar el número total de célulasdestruidas e intactas.

- Recuentos en cámara.- Contadores electrónicos.

- Recuentos en placa.- Utilización de centrífugas analíticas.

Métodos indirectos: Consisten en determinar el grado deliberación al medio externo de algún metabolito celular luego deque las membranas celulares son destruidas (determinación deproteínas solubles, actividades enzimáticas, etc.).

Se determina el rendimiento alcanzado en función de la eficiencia de losmétodos realizados, teniendo en cuenta no solo la disrupción celular oel porcentaje de producto recuperado, sino también las condicionesoperativas que se necesitaron para llevarlo a cabo.

Cálculo del Rendimiento Alcanzado


Conclusiones

- Existen una gran diversidad de métodos de disrupción.

- Necesidad de desarrollar y poner a punto técnicas que permitanla determinación de la eficiencia de los métodos utilizados.

- Cada método posee diferentes principios de acción, por lo quepresentan una serie de ventajas y desventajas frente a los demás.

- Existen distintas clases de microorganismos productores con unagran diversidad de metabolitos de interés.


- No existen protocolos universales de disrupción celular.

¿CUÁL ES EL MEJOR MÉTODO?

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