DISEÑO DEL ESTUDIO Y MÉTODOS

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DISEÑO DEL ESTUDIO Y MÉTODOS

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Universidad Nacional de Catamarca - Secretaría de Ciencia y Tecnología Editorial Científica Universitaria

ISBN: 978-987-661-270-8

2. - DATOS SECUNDARIOS Y CARACTERÍSTICAS DEL AMBIENTE

2.1. - Selección del tipo de estudio

Se realizó un estudio de alcance descriptivo, prospectivo, con diseño no experimental

transeccional, con seguimiento de la cohorte en humanos durante el período 2008-2012

en el Valle de Fiambalá, provincia de Catamarca, República Argentina.

2.2. - Lugar de la población

Los trabajos de campo se llevaron a cabo en Tatón, área perteneciente al noreste del

valle o bolsón (Niz et al, 2004) de Fiambalá (El topónimo Fiambalá proviene de la

voz cacán fiambalao, que significa "casa del viento o país del viento") (Lafone Quevedo,

1999), departamento Tinogasta, provincia de Catamarca, Argentina (Figura 6). Unos 40

kilómetros al norte de la ciudad de Fiambalá surgen oasis como Tatón (1.874 m.s.n.m.)

27º20´20,33”S y 67º31´28,37”O y hacía el este, Río Grande (2.834 m.s.n.m.)

27°13´34.21¨S y 67°22´28.25¨O. Estas poblaciones viven de la explotación en pequeña

escala de la ganadería ovina, caprina y camélidos sudamericanos, de las plantaciones de

frutales, vid, del cultivo de maíz y alfalfa (Machado Aráoz, 2007);(Orgaz et al, 2007).

b.

a.

c.

Figura 6 Ubicación geográfica del Valle de Fiambalá, departamento Tinogasta, provincia

de Catamarca, República Argentina.

Nota: a. Mapa político de la República Argentina; b. Mapa de la provincia de Catamarca; c. Vista

satelital del Valle de Fiambalá.

http://es.wikipedia.org/wiki/Cac%C3%A1n_(lengua)

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2.3. - Selección de la población

La población humana estudiada reunió las siguientes condiciones: a) compartir su hábitat

con animales domésticos infectados con F. hepatica y b) que esos animales fueran

nacidos y criados en la zona, para garantizar que el foco de transmisión fuese local.

2.4. - Período de estudio

El estudio se desarrolló entre septiembre de 2008 y noviembre de 2012.

2.5. - Descripción regional del hábitat del valle de Fiambalá

El límite físico al norte del valle es la ladera sur de la cordillera de San Buena Ventura,

que la separa de la puna. Al este, gira hacia el sur por la divisoria de aguas que separa la

cuenca del río Grande. El oeste se halla delimitado por la Sierra de Famatina (Montero

López et al, 2009).

La existencia de vegetación achaparrada, muerta y médanos indican los aspectos típicos

del paisaje, resultante del tipo climático, y que son denominador común del centro de los

bolsones ocupado por salares o barreales rodeados de médanos (Quiroga, 1986).

Las características del hábitat natural, el medio ambiente y los factores climáticos locales

son cruciales para entender el área endémica humana en cuestión, en relación con el

patrón de transmisión (Mas-Coma, 2005; Mas-Coma et al, 2009 a), el escenario

epidemiológico (Mas-Coma et al, 1999 a, 2009 a) y las mejores estrategias para el

diagnóstico y encuestas (Mas-Coma et al, 2014 a).

2.5.1. - Orografía

La zona posee en su formación materiales que pertenecen a los primeros tiempos de la

tierra, los que discordan con rocas modernas. Orográficamente se destaca el flanco

occidental de la Sierra de Fiambalá (Paleozoico) que se dispone de norte a sur (Cabrera,

1958).

La región está cubierta de tipos erosivos cuyas características responden al resultado de

la acción del termoclastismo, que produce desintegración mecánica, resquebrajamiento y

disgregación que son acumuladas por el viento (Navarro, 1994).

En las zonas más bajas se observa material, que comprende extensos abanicos aluviales

y la presencia de innumerables dunas, en forma de medialunas, y médanos que hacen

típico el árido paisaje.

2.5.2. - Clima

La zona de estudio se encuentra dentro del dominio de lo que se denomina Clima

Templado, correspondiente a la categoría Árido de Sierras y Bolsones (Argerich, 2004).

Se producen heladas todo el año, existiendo frío seco de altura, inviernos fríos y veranos

templados. La presencia de sierras da lugar a la formación de microclimas, lo que

acondiciona el marco topográfico para la existencia de oasis que se localizan en los

conoides de deyección en la falda occidental de los valles.

http://es.wikipedia.org/wiki/Sierra_de_Famatina

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El relieve es un factor decisivo, ya que produce un efecto barrera o de aislamiento que

convierte a los valles en compartimientos separados, y define el clima. El valle, por el que

corre el río Abaucán, presenta un clima mesotérmico con amplitudes térmicas

estacionales y día/noche; tanto en verano como en invierno se producen grandes

amplitudes diurnas.

Los determinantes más importantes del clima son la temperatura, el régimen de lluvias y

el balance hídrico. El clima es ventoso seco conocido como “viento zonda”. Se alcanza un

nivel de presión atmosférica media de aproximadamente 620 hPa (Castañeda y Ratto,

2005).

Las lluvias son escasas y torrenciales, se dan principalmente en verano, la precipitación

anual no supera los 50 mm. El régimen hídrico del suelo resulta importante para el

desarrollo de los caracoles y para la transmisión de F. hepatica (Malone, 1994) porque

produce encharcamientos donde se reproducen los moluscos. En el valle de Fiambalá la

altura de la sierra homónima, de 3.000 m s.n.m., aproximadamente, resulta insuficiente

para producir lluvias importantes.

La evolución anual de los factores climáticos se obtuvo por interpolación proporcionada

por las estaciones meteorológicas circundantes más cercanas, a partir de una base de

datos seriada de 50 años (1950-2000). Los valores fueron obtenidos de la base de datos

agroclimáticos de Agromet Grupo FAO (FAOCLIM). El método de interpolación utilizado

para evaluar las características climáticas del área local es el Nuevo LocClim 1.10

descargado de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la

Alimentación (FAO) con una resolución temporal de días.

Entre la variedad de índices existentes para cuantificar la aridez/humedad y

continentalidad se seleccionaron el índice de aridez de De Martonne y el índice de

continentalidad de Gorczynski. Los índices de aridez proporcionan una manera sencilla

de expresar la relación de precipitación/evaporación. El índice de aridez de De Martonne

se define como la relación de la suma anual de la precipitación en mm y la temperatura

media anual de 10 °C. El índice de continentalidad de Gorczynski es una manera simple

pero eficiente para estimar la influencia del océano en el clima local. El índice depende

linealmente de la amplitud térmica anual (diferencia de temperatura media mensual entre

el mes más cálido y el más frío) (Grieser et al, 2006).

Para evaluar las características climáticas del valle de Fiambalá, se utilizaron las

clasificaciones de Koeppen y Budyko. La clasificación climática de Koeppen es uno de los

sistemas más utilizados para la clasificación del clima y se basa en el concepto de que la

vegetación nativa es la mejor expresión del clima. Por lo tanto, los límites de la zona

climática se seleccionan de acuerdo con la distribución de la vegetación. Combina las

temperaturas medias anuales y mensuales y la precipitación y la estacionalidad de la

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precipitación. El sistema de clasificación climática Budyko es un método de

categorización de los climas, basado en la relación de energía recibida a la energía

requerida para evaporar la precipitación local. Los principios de la clasificación de Budyko

tienen en cuenta las características de radiación, que se estrecha y los correlaciona

directamente con la temperatura en la estación cálida, y los factores de circulación, que

correlacionan indirectamente las características cuantitativas de la precipitación y el

régimen de humectación (Oliver y Wilson, 1987).

Este software permite precisar la altitud y las correcciones horizontales. Los factores

climáticos analizados incluyeron las temperaturas máximas, medias y mínimas, la

precipitación, la evapotranspiración potencial (ETP), periodo húmedo (estación de

crecimiento de vegetación), y el período seco. En relación con la vegetación, la estación

de crecimiento es el periodo durante un año, cuando la precipitación es superior a la

mitad de la evapotranspiración potencial y se define por Prec/ETP > 0,5 (FAO, 1978),

aunque para este foco se analizaron ETP > 0,5 y EPT > 0,45 debido a sus condiciones de

aridez extrema.

2.5.3. - Hidrografía

La cuenca se alimenta con aguas provenientes de deshielos y vertientes temporarias, las

cuales llegan al valle de Fiambalá, formadas por efluentes y cursos secundarios, en

donde el sistema vuelca sus aguas al río Abaucán (Sempé, 1983). Las vegas de

superficie poco definida son ambientes lenticos permanentes, su agua es transparente,

neutra a ligeramente ácida.

2.5.4. - Flora y Fauna

La mayor cantidad de pastos se producen en las vegas, predominando las siguientes

especies forrajeras: Hydrocotyle sp., Halerpestes cimbalaria (Pursh) Greene, Ludwigia

sp., Mulhembergia aperifolia, Deyeuxia haeckeli y Sinzyrinchium chilense (Navarro,

1994).

Dentro de los herbívoros de la fauna silvestre cabe mencionar: vicuña (Vicugna vicugna)

y guanaco (Lama guanicoe).

SERES HUMANOS

3. - Epidemiologia en seres humanos

3.1. - Características de la población estudiada

A partir de estudios previos se estimó, en base a los registros de los agentes sanitarios

del Área Programática N° 10, una población de 350 habitantes en la localidad de Tatón y

sus alrededores.

3.1.1. - Criterios de inclusión: En el inicio de la investigación se incluyó a toda la

población de la localidad elegida.

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3.1.2. - Criterios de exclusión: Se excluyeron a aquellas personas que no desearon

participar, pacientes con antecedentes, síntomas o signos de enfermedades

hematológicas que suponían un riesgo para la extracción de sangre, recién nacidos o

niños de un año o menos.

Como consecuencia de ello, la población estudiada comprendió 305 personas de ambos

sexos, quienes concurrieron voluntariamente a las postas sanitarias donde se realizaron

los estudios. El rango de edad de los pacientes fue de 2 a 86 años.

El trabajo se inició en 2008 y finalizó en 2012, con la colaboración de los Hospitales “San

Juan Bautista” y “Eva Perón” de la ciudad de Catamarca, el Hospital Municipal de

Enfermedades Infecciosas “Dr. Francisco Javier Muñiz” de la ciudad autónoma de

Buenos Aires, del Ministerio de Salud de Catamarca, el Hospital Zonal “San Juan

Bautista” de Tinogasta, el Hospital Zonal “Luis Agote” de Fiambalá y el Minihospital “René

Favaloro” de Medanitos. También participaron el Centro de Estudios de Alta Complejidad

(CEAC) de la ciudad autónoma de Buenos Aires, el laboratorio de Parasitología de la

Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de Catamarca, en forma conjunta

con el ex Instituto Nacional de Microbiología “Dr. Carlos Gregorio Malbrán”, actual

Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, de la Administración Nacional de

Laboratorios e Institutos de Salud, ubicado en la ciudad de Buenos Aires, República

Argentina.

Para estudiar a las personas durante toda la investigación se solicitó una declaración en

la que los interesados dieron su consentimiento verbal y escrito (Véase anexo. Figura 19,

pp. 184) y se obtuvo la correspondiente autorización de las autoridades de la División de

Docencia e Investigación del Hospital San Juan Bautista de la Provincia de Catamarca

para realizar la investigación. De cada paciente se recolectaron los datos personales, se

describieron síntomas, signos y se realizaron exámenes de laboratorio.

Para el estudio se seleccionó un grupo de pacientes que reunían los siguientes criterios:

- Pacientes con serología positiva para F. hepatica, especialmente aquellos con

más de una prueba positiva en años sucesivos.

- Pacientes con sintomatología clínica, náuseas, vómitos y dolor en hipocondrio

derecho.

- Patrón humoral de colangitis: aumento de fosfatasa alcalina, transaminasas y

fundamentalmente de eosinofilia.

- Anormalidades de las vías biliares en la ecografía: dilatación de las vías biliares

intrahepáticas, dilatación del colédoco mayor o igual a 7 milímetros,

engrosamiento de las paredes del colédoco y bandas ecogénicas periportales.

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3.2. - Obtención de las muestras

Se trabajó con un cuestionario para la recolección de datos. El mismo presentó dos

partes, una correspondiente a personas y la otra a hogares. Se emplearon para la

recolección de datos personales que incluían la identificación, edad, sexo, ocupación y

domicilio, datos de hábitos alimenticios y contactos con animales. Datos de la vivienda

referidos al tipo, materiales de construcción, servicios, fuentes de provisión de agua y

energía. El cuestionario se completó durante la visita a los pobladores mediante

interrogación a adultos y niños (en este caso en presencia de un familiar a cargo) y

observación del encuestador (Véase anexo. Figura 20-21, pp. 185-186).

3.2.1. - Recolección de sangre

Las muestras de sangre obtenidas por venopunción fueron empleadas (previa a su

colocación en los tubos) para realizar extendidos hemáticos. Para ello se colocó una gota

sobre un portaobjetos y se distribuyó con el uso de un extensor.

Los extendidos se dejaron secar a temperatura ambiente, se fijaron con alcohol metílico y

colorearon con la tinción de Giemsa, se rotularon con lápiz indicando nombre, apellido y

número de frotis en uno de los extremos del vidrio. Estos materiales se transportaron a

temperatura ambiente, en cajas para almacenamiento de portaobjetos, hasta los

laboratorios bioquímicos.

Durante los años 2009, 2010 y 2011 se obtuvieron muestras de 10 ml de sangre de las

personas (n=305) por venopuntura (Lavery e Ingram, 2005), colocándolas en dos tubos:

uno con anticoagulante EDTA (3 ml de sangre) y otro tubo seco (7 ml de sangre) para

separación del suero, rotulados con nombre, apellido y número de envase. En estas

condiciones fueron transportados hasta el Laboratorio del Hospital Zonal “Luis Agote”, de

Fiambalá. Allí se mantuvieron 8 horas a temperatura ambiente para su exudación,

posteriormente se centrifugaron a 3.000 rpm y después fueron separados por aspiración

con pipetas y transferidos a 2 tubos con los mismos rótulos. En aquellas muestras donde

se observó hemólisis, se realizó centrifugación a baja velocidad y transferencia a tubos

limpios.

Las muestras obtenidas fueron mantenidas en heladera y transportadas a 4 ºC a la

ciudad de Catamarca donde se congelaron a -20 °C para conservarlas hasta llevar a

cabo los análisis correspondientes. El suero contenido en un tubo se utilizó para los

diagnósticos inmunológicos y el del otro para la determinación de enzimas, proteínas y

bilirrubina.

A una de las muestras de suero, en el departamento de Parasitología, del Instituto

Malbrán, se les realizó el ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (Enzyme-Linked

InmunoSorbent Assay, ELISA), para la identificación de los anticuerpos anti-F. hepatica

presentes en los sueros de los pacientes (utilizando proteína recombinante procatepsina

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L1).

El segundo tubo con suero, para las demás determinaciones, se analizó en los

laboratorios bioquímicos con los cuales se trabajó.

3.2.2. - Inmunodiagnóstico

El ensayo inmunoenzimático es una prueba ampliamente usada para el diagnóstico de

fasciolosis. Su sensibilidad y especificidad dependen de la calidad de los antígenos del

parásito empleados para evaluar la detección de anticuerpos anti-F. hepatica (Binkley y

Sinniah, 1997). La procatepsina L1 (cisteín-proteasa) obtenida como recombinante, se

usó como antígeno en ELISA por ser una prueba con buenos resultados previos

(Carnevale et al, 2001 a).

3.2.2.1. - Expresión y purificación de la proteína recombinante procatepsina L1 (rproCL1)

El protocolo de expresión del antígeno E-S fue realizado previamente en el Instituto

Malbran (Carnevale et al, 2001 a) en bacterias Escherichia coli M15 recombinantes

conteniendo el plásmido pQE-proCL1, que se multiplicaron en medio Luria (LB)

suplementado con los antibióticos ampicilina (100 µg/ml) y kanamicina (10 µg/ml), toda la

noche y en agitación a 37 °C. El cultivo se diluyó 20 veces en 100 ml del mismo medio,

se incubó en agitación durante 4 hs a 37 °C, con la adición de isopropil-ß-

Dtiogalactopiranosido (IPTG) a concentración final de 2 µM para inducir la expresión de

rproCL1.

El lisado de bacterias se obtuvo en presencia de agentes desnaturalizantes y se sometió

a diálisis. La preparación proteica obtenida se purificó por cromatografía quelante a

través de una resina de Ni2+-ácido nitrilotriacético en condiciones desnaturalizantes

(Carnevale et al, 2001 a). Las fracciones de elución se analizaron por SDS-PAGE

(Wiltfang et al, 1991) y la proteína purificada se cuantificó por el método de Bradford

(Bradford, 1976) y se guardó a -70 °C en alícuotas de 40 µg.

Las bacterias se cosecharon por centrifugación y el pellet fue resuspendido en 2 ml de

solución de resuspensión (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0 5% -

mercaptoetanol, 2,5% SDS) para posteriormente hervirlo durante 5 min. La muestra así

tratada se centrifugó 30 min a 4 °C a 15.000 x g recuperándose el sobrenadante. El SDS

presente en la preparación se precipitó por adición de un volumen de KCl 100 mM,

incubado por 10 min a temperatura ambiente y centrifugación a 15.000 x g durante 3 min.

El sobrenadante fue equilibrado en solución de lisis por diálisis con 10 volúmenes de

buffer de lisis (dos recambios) durante 48 horas a 4 °C.

La preparación proteica obtenida se pasó a través de una resina de Ni2+-ácido

nitrilotriacético (Qiagen). La proteína rproCL1 se unió por afinidad al Ni2+ y el remanente

de proteínas de la bacteria se eluyó por sucesivos lavados con solución de lavado (buffer

de lisis a pH 6,3). Finalmente la proteína rproCL1 se eluyó de la columna con solución de

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elución (buffer de lisis a pH 4,5) (Carnevale et al, 2001 a). Las fracciones de elución se

analizaron por electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida coloreados con

azul de Coomassie.

3.2.2.2. - Ensayo inmumoenzimático

El ensayo de ELISA para la detección de anticuerpos anti-rproCL1 de F. hepatica se

desarrolló en base al protocolo previamente descripto (Carnevale et al, 2001 b). Se utilizó

en el desarrollo de la prueba el antígeno rproCL1 a concentración 4 µg/ml y como

cromógeno ABTS. Para el ensayo se utilizaron placas de ELISA de 96 pocillos “PolySorp”

(Nunc) sensibilizadas con el antígeno rproCL1 a concentración 4 µg/ml en buffer

carbonato 0,05 M, pH 9,6 (100 µl/pocillo) mediante incubación por 3 horas a 37 °C y 18

horas a 4 ºC, en cámara húmeda.

Después de la sensibilización con el antígeno, los pocillos se lavaron 3 veces con 200

µl/pocillo de PBS/0,05% Tween, antes de la adición de 200 µl/pocillo de la solución de

bloqueo (PBS/0,05% Tween/3% seroalbúmina bovina). Después de 30 min de

incubación, a 37 °C en una cámara húmeda, los pocillos se lavaron como se describió

anteriormente. Los sueros humanos en dilución 1:250 (100 µl/pocillo) en solución de

bloqueo fueron añadidos por duplicado a la placa e incubados durante 30 min a 37 °C.

Luego de nuevos lavados, la placa fue incubada por otros 30 min a 37 °C en presencia de

100 µl de un segundo anticuerpo anti-IgG humana preparado en cabra y marcado con

peroxidasa (Sigma) diluido 1:4000 en solución de bloqueo.

Finalmente, se procedió a detectar el anticuerpo unido al antígeno después de nuevos

lavados mediante la reacción enzimática de la peroxidasa en presencia del sustrato

peróxido de hidrógeno y del cromógeno 2,2-azino-bis 3-etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico

(Sigma). Las placas se leyeron a los 10 min, en el lector de ELISA iMark™ BioRad. La

densidad óptica expresó el valor de corte de la técnica, diferenciando sueros positivos y

negativos (el cálculo se realizó en base a las densidades ópticas de los controles

negativos). El punto de corte fue de ≥0,410 nM, aplicando el criterio de +3 desvíos

estándar por sobre el cual se consideró todo suero analizado como positivo.

Para validar el ensayo, fueron llevadas 12 muestras positivas al Centro Colaborador de la

Organización Mundial de la Salud, Departamento de Parasitología de la Universitat de

Valencia, España.

3.2.2.3. - Fórmula leucocitaria

Se procedió en primer lugar a la determinación, en los extendidos hemáticos, de la

fórmula leucocitaria.

3.2.2.4. - Eosinofilia

El nivel de eosinofilia fue calculado (fórmula absoluta y relativa) mediante recuento

diferencial de eosinófilos respecto al cálculo de leucocitos totales en los extendidos

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hemáticos coloreados. Considerando como normales hasta 350/mm3, se efectuó la

determinación en campos no superpuestos (Louis et al, 1962).

3.2.2.5. - Proteinas Totales

Este examen se realizó con reactivos comerciales utilizando el método colorimétrico para

determinar proteínas totales en suero por ser útil para el seguimiento de cambios

ocasionados por diversos estados de enfermedad hepática (McPherson, 2011) mediante

la lectura de la absorvancia. Se mezcló con varilla, se incubó 15 min a 37 °C y se leyó en

espectrofotómetro a 540 nM o en fotocolorímetro con filtro verde (520-560 nM) llevando a

cero con el blanco de reactivo. Longitud de onda: 625 nM en espectrofotómetro o en

fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nM), con una temperatura de reacción de 15 a 28

°C y un tiempo de reacción de 10 min. Tomando como valores normales, el rango de 6,0 a

8,3 gm/dL (gramos por decilitro).

3.2.2.6. - Ácidos biliares

Reabsorbidos en el intestino grueso y transportados por la albúmina hacia el hígado

como parte de su ciclo enterohepático. En plasma el 88% de las sales biliares se

encuentran unidas a la albúmina. Se consideraron los valores normales inferiores a 10

nM/ml.

3.2.2.7. - Bilirrubina sérica

Es el ligando más estudiado. En plasma la bilirrubina es insoluble y su unión a la

albúmina la vuelve soluble. La unión a la albúmina determina su detoxificación en cuanto

a su rol antimitocondrial, promueve su efecto antioxidante y colabora en su destrucción

por parte de la luz in vivo. El nivel normal considerado de bilirrubina directa es 0 a 0,3

mg/dL y el de bilirrubina total 0,3 a 1,9 mg/dL.

3.2.2.8 . - Enzimas

Se realizaron pruebas de funcionalidad hepática para detectar un aumento de las

enzimas alanina amino transferasa o transaminasa glutámico-pirúvica (ALT o GPT),

aceptando los valores normales de 6 a 35 UI/L y aspartato amino transferasa o

transaminasa glutámica oxalacética (AST o GOT) con valores normales entre 6 a 30 UI/L

(Gianini et al, 2005).

Para conocer el pasaje del parásito a los canalículos biliares y una posible fase crónica

de la enfermedad, se analizó el aumento de fosfatasa alcalina (FAL) que se encuentra

elevada en patologías del hígado asociadas con enfermedad de las vías biliares y

colestasis. Se tomaron como valores normales en adultos desde 25 a 100 UI/L y en niños

menos de 350 UI/L (Pratt y Kaplan, 2000).

3.2.3. - Análisis de los datos

Se utilizó la regresión logística por ser una de las herramientas estadísticas con mejor

capacidad para el análisis de datos en investigación clínica y epidemiología. Esta técnica

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modeló cómo influyó en la probabilidad de aparición de un suceso, habitualmente

dicotómico, la presencia o no de diversos factores y el valor o nivel de los mismos. En

este caso, con el objeto de identificar aquellos factores significativos en la explicación de

la probabilidad de que un paciente presente fasciolosis, se aplicó un modelo de regresión

logística múltiple con el programa SPSS®, versión 11.5 para Windows. El modelo

matemático permitió, además, evaluar la contribución de cada variable sobre las chances

(odds) que tiene un paciente de presentar un resultado positivo.

Se clasificó el valor de la variable respuesta como 0 cuando no se presentó el suceso

(caso negativo) y con el valor 1 cuando sí estuvo presente (paciente con resultado

positivo). Se consideraron como variables independientes o explicativas en el modelo:

edad, sexo, resultado de los exámenes y síntomas.

Todos los datos se registraron según el número de identificación utilizado durante la

recolección, correspondiente al integrante de la población y el número de la muestra para

el resto de los materiales analizados.

Las prevalencias de infección por diferentes métodos se compararon usando el test de

Chi2 y se calcularon los valores predictivos con intervalos de confianza de 95%. El valor

obtenido para el estadístico de contraste de hipótesis H0: β=0 llamado test de Wald, se

halló mediante el cociente entre el coeficiente y su error estándar. Este estadístico siguió

una distribución Chi2 con 1 grado de libertad.

3.2.4. - Materia fecal

Antes del inicio de la toma de muestras para coproparasitología, se realizó una

explicación oral respecto a la metodología de recolección, con solicitud de repetición de

las indicaciones por parte de los participantes. Se entregó un instructivo impreso por

persona, los envases con la solución y una cucharita descartable para la recolección de

cada muestra.

El procedimiento consistió en recolectar muestras de materia fecal (n=96) emitida durante

3 días consecutivos y colocarla en recipientes (rotulados con el nombre, apellido y

número de envase) con solución salina formolada 5% como conservante. Los frascos

conteniendo las muestras fueron retirados, por los agentes sanitarios, a partir del cuarto

día posterior a su entrega, las mismas se conservaron a temperatura ambiente y se

transportaron hasta el Laboratorio de Parasitología de la Facultad de Ciencias de la

Salud, Universidad Nacional de Catamarca, en cajas destinadas para tal fin.

Las personas participantes de ambos sexos y distintos grupos etarios no fueron

discriminadas por familias, por que se analizaron individualmente. Se destaca que en

general la población fue reacia a proporcionar las muestras.

La elección del conservante fue realizada por las ventajas de su fácil preparación, bajo

costo, fijador multipropósito, larga duración y apropiada para procedimientos de

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sedimentación.

3.2.3.1. - Técnica de Sedimentación Rápida (TSR)

De cada muestra de materia fecal (n=96) se tomaron de 4-8 gr de heces que fueron

homogenizadas, en un vaso cónico, con una varilla de vidrio en 30 ml agua corriente

filtrada y calentada a 50 °C. Obtenida una buena homogenización, se agregó agua hasta

completar 150 ml. La mezcla se trasvasó a un recipiente cónico de vidrio, de 250 ml de

capacidad, tamizándola con un colador de malla. Se completó el volumen con agua

filtrada y se dejó reposar por 3 a 4 min, no más (la sedimentación se basó en que el

tiempo de caída de los huevos de F. hepatica en el agua es 100 mm/min, más rápido que

el de la caída de detritos de las materias fecales). Luego se decantó dos terceras partes

del sobrenadante y se volvió a agregar agua fría hasta completar la capacidad de la copa.

Se repitieron los mismos pasos 2 o 3 veces o hasta que el sobrenadante quedara limpio.

Finalmente, se removió el sedimento, se aspiró parte con una pipeta Pasteur, el que fue

vertido en un portaobjeto con concavidades y se observó al microscopio con lentes de

menor aumento.

3.2.3.2. - Técnicas de concentración

3.2.3.2.1. - Método de Telemann modificado

Las heces fijadas (n=96) en solución salina formolada fueron homogeneizadas con varilla

de vidrio y filtradas a través de un embudo con una doble gasa en tubo de centrífuga. Se

agregaron aproximadamente 2 ml de éter y los tubos se centrifugaron a 1000-1500 rpm

de 3 a 5 min. Se eliminó con golpe seco el sobrenadante. Se tomó con pipeta Pasteur

una pequeña cantidad del sedimento y se colocó en portaobjetos. Se agregó una gota de

lugol y se selló con un cubreobjetos para su observación al microscopio óptico.

3.2.3.2.2. - Método de flotación de Willis

Se cubrió el fondo de un vaso de 50 ml (sin pico vertedor) con un volumen de muestra de

heces previamente homogeneizada (n=96). Se llenó hasta la cuarta parte del frasco con

solución salina sobresaturada y se mezcló con varilla de vidrio hasta obtener una

suspensión muy fina. Se dejó la solución en estas condiciones 20 min. Se aspiró el

volumen superior de la solución y se recuperó con pipeta una muestra del fondo que fue

colocada entre portaobjeto y cubreobjetos y se observó al microscopio. Este último

procedimiento fue adicionado para la búsqueda de huevos operculados de F. hepatica

que presentan la característica de no flotar.

3.2.3.2.3. - Método cuantitativo para huevos

La técnica de Kato-Katz o frotis grueso (solicitada para la entrega gratuita de Egaten®

triclabendazol para uso humano; donación de Novartis Pharma AG) (Savioli et al,

1999);(OMS, 2006);(Keiser et al, 2007) se preparó por recomendación de la OMS para la

búsqueda, hallazgo y recuento de huevos de F. hepatica en heces (n=15).

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3.3. - Diagnóstico por imágenes

A los casos seleccionados, por nivel elevado de eosinofilia, fosfatasa alcalina o

resultados serológicos de F. hepatica positivos, se efectuó ecografía abdominal con un

equipo portátil Aloka 500, con transductor Cónvex 3,5 MHz.

En dos oportunidades, médicos especialistas del Hospital Muñiz y del Ministerio de Salud

de la provincia de Catamarca efectuaron las ecografías (n=57) de aquellas personas a las

que previamente se había seleccionado.

En el caso de pacientes sintomáticas (n=2) médicos gastroenterólogos practicaron una

exploración con el método invasivo: Colangiopancreotografía Endoscópica Retrograda

(CPRE), con el uso de coledocoscopio flexible Olympus CHF P20 de 4,9 mm con canal

de trabajo de 2,2 mm y visión lateral, realizando una papilotomía retrograda endoscópica

y barrido instrumental con catéteres de Dormia (Mazzariello, 2009), en clínicas privadas

de las ciudades de San Fernando del Valle de Catamarca y Córdoba.

3.4. - Datos clínicos

Médicos de los distintos nosocomios efectuaron los exámenes clínicos a personas

sospechosas de fasciolosis o que lo solicitaron, donde se evaluaron síntomas y signos

tales como fiebre, dispepsia, diarrea, ictericia, dolor abdominal, vómitos, hepatomegalia,

etcétera. Los datos fueron anotados en la planilla de registro de observaciones diseñada

para este fin, que corresponde a una fracción del cuestionario (Véase anexo. Figura 21,

pp. 186).

ANIMALES COMO HOSPEDADOR DEFINITIVO DE F. hepatica

4. - Especies animales estudiadas

El componente animal incluyó para su estudio ejemplares (n=1088) de las especies

domésticas Bos primigenius taurus (bovinos), Capra aegagrus hircus (caprinos), Equus

africanus asinus (asnos), Equus ferus caballus (caballos), Lama glama (llamas), Ovis

orientalis aries (ovinos) y Sus scrofa domestica (cerdos), de diferentes razas, categorías y

sexos.

4.1. - Exámenes coproparasitológicos

Para conocer la prevalencia de infección por F. hepatica y la contaminación del ambiente

por el aporte de huevos al medio, se recolectaron muestras de materia fecal en 36 viajes

a campo realizados en primavera y otoño. Las muestras (n=1077) se obtuvieron de las

distintas especies animales domesticas presentes en la zona: ovinos (n=322), asnos

(n=192), llamas (n=210), caprinos (n=197), bovinos (n=72), equinos (n=46), y porcinos

(n= 38) durante los años 2008-2011.

http://es.wikipedia.org/wiki/Equus_ferus_caballus

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Las muestras de heces fueron recogidas en el momento de la defecación de cada

ejemplar o con el uso de guantes descartables de pared delgada que permitieron la

penetración completa de la mano o de un dedo según la especie animal a evaluar. Se

humedeció la protección con agua corriente al igual que la región anal para no maltratar

al animal en el momento de extracción de las boñigas del recto.

La materia fecal obtenida fue colocada en recipientes plásticos individuales que

contenían solución salina formolada al 5% y se transportaron al laboratorio de

Parasitología de la Facultad de Ciencias de la Salud, de la Universidad Nacional de

Catamarca para su análisis. En el diagnóstico de infección por F. hepatica se utilizó la

técnica de sedimentación para la detección de huevos en materia fecal (Dennis et al,

1954), fundamentada en repetidos lavados y filtrados de la muestra coprológica y la

observación posterior. Se preparó una solución detergente con 95 ml de agua destilada y

5 ml de detergente líquido más unas gotas de solución al 1% de sulfato de aluminio y

potasio.

Se pesó 5 gr de heces de cada muestra, se colocaron en un mortero, se agregó 25 ml de

solución detergente y se mezcló cuidadosamente con varilla, sin formar espuma. En un

embudo colador se colocó una doble gasa y se filtró la suspensión a un tubo de 50 ml de

capacidad, se lavó con solución detergente el recipiente que contenía las muestras,

filtrando este líquido y agregándolo al tubo, adicionando más solución detergente al

sedimento de la malla hasta llenar el tubo. Se dejó el tubo en reposo entre 5 y 10 min,

eliminando 3/4 parte del sobrenadante, se lavó el embudo con solución detergente y

agregó al tubo. Se volvió a llenar el tubo hasta el reborde con solución detergente,

dejando reposar aproximadamente 10 min. Se eliminó el sobrenadante del tubo, dejando

2 a 3 ml de sedimento. Se tiñó con gotas de azul de metileno al 1% o 2 gotas de tintura

de yodo y se dejó en reposo de 2 a 5 min, vertiendo este contenido en una caja de Petri.

Se lavó el tubo con 5 ml de agua corriente agregándolo a la placa, y se observó al

microscopio de 4x a 10x. Finalmente se reportó la presencia o ausencia de huevos de F.

hepatica. La identificación de los huevos se realizó a partir de sus características

morfológicas, forma ovalada u ovoide, con una envoltura lisa de color amarillento o

marrón claro, que en una de sus extremidades posee un pequeño opérculo, cuyas

medidas varían entre 130-140 μm de largo por 70-90 μm de ancho (Boero, 1976). Las

prevalencias de infección de las diferentes especies se compararon usando el test de

Chi2.

4.1.1. - Identificación de otros parásitos gastrointestinales

Muestras de materia fecal ovina fueron estudiadas con el método de Willis para

comprobar presencia/ausencia de especies parásitas que pudieran cohabitar con F.

hepatica.

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4.2. - Necropsias y obtención de especímenes de F. hepatica

Se participó, durante 2008, 2009 y 2010, en las faenas domiciliarias y peridomiciliarias de

11 animales domésticos, [Lama glama (n=4), Ovis orientalis aries (n=4), Capra aegagrus

hircus (n=2) y Bos primigenius taurus (n=1)] de ambos sexos y distintas edades,

sacrificados por los pobladores, que de esa forma se proveían de carne para la

alimentación familiar. Se obtuvo autorización verbal para realizar la inspección sanitaria

de los cadáveres, que permitiera la búsqueda de ejemplares adultos de F. hepatica y

otros signos de enfermedad. El estudio se realizó con el material recogido del ganado

sacrificado por sus propietarios, por lo que no se necesitó la autorización del Comité de

Ética, del Colegio Médico Veterinario de la Provincia de Catamarca.

En la cavidad abdominal se examinaron los órganos in situ, observando esencialmente la

relación entre ellos y las anormalidades en el peritoneo y contenido del abdomen. El

hígado se inspeccionó mediante palpación en toda la superficie para posteriormente

realizar cortes paralelos a través del parénquima.

De manera especial se procedió, in situ, a la inspección visual del hígado, cuando se

trataba de fasciolosis aguda (n=2), para observar inflamación, presencia de hemorragias

en el parénquima producidas por la migración de los parásitos inmaduros durante las

primeras semanas post-infección o trayectos con sangre coagulada, hematomas debajo

de la cápsula de Glisson (subcapsulares), congestión venosa y peritonitis fibrosa

adyacente. La búsqueda de formas jóvenes de F. hepatica se realizó, mediante incisiones

paralelas del parénquima hepático, con cortes en lámina cada dos centímetros y medio

de espesor.

En los animales revisados, que presentaban fasciolosis crónica (n=5), los hallazgos

dependieron de la presencia y número de parásitos. Se buscó especialmente en las

carcasas, edemas en “cuello de botella”, edemas generalizados y signos de caquexia. En

los hígados se examinó todo dato objetivo observado de colangitis, fibrosis hepática y

ganglios linfáticos agrandados. En los cortes practicados a los canales biliares se observó

la presencia de engrosamientos en las paredes de los ductos y depósitos calcáreos en su

lumen.

En las necropsias, se recolectó bilis para la búsqueda de huevos de F. hepatica, los que

a posteriori serían utilizados, con los caracoles, en la reproducción in vitro del ciclo. La

bilis se colectó en tubos cónicos de 50 ml de capacidad recubiertos en papel de aluminio,

se refrigeró y se transportó hasta el laboratorio de la Facultad de Ciencias de la Salud,

donde se conservaron en heladera a 4-8 °C.

Los ejemplares de parásitos hallados durante las faenas se lavaron durante 30 min en

solución fisiológica, fueron dispuestos en 3 grupos de envases, uno con solución AFA

(etanol 95º 85 ml, formaldehído comercial 10 ml y ácido acético glacial 5 ml) para realizar

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estudios anatomorfológicos, un segundo al que se agregó etanol 70° para el análisis de la

variabilidad genética y un tercero conteniendo ARNlaterR para estudios de resistencia

antiparasitaria. Todos los tubos fueron numerados para identificar lugar, especie, sexo,

edad aproximada o categoría de los animales y datos del propietario del animal faenado.

4.2.1. - Estudios morfológicos de F. hepatica

Ejemplares de F. hepatica obtenidos en la faena de un bovino infectado naturalmente en

el valle de Fiambalá (n=20) se compararon con las medidas de especímenes procedentes

de Rosario de la Frontera, Salta, Argentina (n=15), de Cordeiro, Río de Janeiro (n=23),

Lavras, Minas Gerais, Brasil (n=18) y Galicia, España.

El método de estudio aplicado se basó en el protocolo propuesto por Valero et al, (2005)

y se llevó a cabo en el Laboratório de Helmintos Parásitos de Vertebrados, Fiocruz, Río

de Janeiro, Brasil. Se realizaron estudios morfológicos de F. hepatica con microscopia de

campo claro y usando microscopia de contraste por interferencia diferencial o técnica DIC

(Differential-Interference Contrast) Normarski. Los especímenes fueron mantenidos en

solución AFA hasta el laboratorio del Fiocruz, donde se fijaron en etanol 70°, se

presionaron entre vidrios transparentes para facilitar la visualización de las estructuras e

inmediatamente después se realizó la deshidratación de las muestras con una serie

ascendente de alcoholes y luego se tiñeron con carmín alcohólico de Langeron (1949),

seguido de una aclaración con solución de salicilato de metilo y bálsamo de Canadá, en

la proporción 1:1. El material fue montado entre portaobjetos. Se midieron los ejemplares

para su registro y comparación de tamaño con especímenes de las otras regiones. Las

microfotografías se obtuvieron usando un microscopio de campo claro (Olympus BX51).

Además se obtuvieron microfotografías utilizando contraste de interferencia diferencial,

(Normarski) para estudiar especímenes un tanto gruesos, que no permiten el uso de

contraste de fases. La imagen proyectada al ser seudo tridimensional facilitó observar las

espinas del tegumento para diferenciarlos. Esta técnica se aplicó a 23 especímenes.

Ocho muestras del valle de Fiambalá, 7 de Salta, 4 especímenes de Cordeiro, y 4

ejemplares de Lavras.

4.2.2. - Estudios de haplotipos de F. hepatica

Para analizar los haplotipos de F. hepatica circulantes, parásitos obtenidos (n=30) en la

necropsia de un bovino naturalmente infectado, se conservaron hasta su transporte al

Instituto Malbrán en etanol 70º y se procesaron para la extracción de ADN empleando un

kit comercial. Se llevaron a cabo reacciones de PCR para la amplificación del marcador

molecular correspondiente al gen mitocondrial de la subunidad 1 de la citocromo c

oxidasa (COI). Los amplicones obtenidos se secuenciaron automáticamente. Las

filogenias fueron reconstruidas utilizando el algoritmo de máxima parsimonia

implementado en el programa PAUP* (Swoffod, 2001). Los árboles se obtuvieron

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mediante 1000 réplicas bootstrap. La adición de secuencias fue al azar con 5

repeticiones. Se compararon con ejemplares de fasciolas de otras regiones del país.

4.2.3. - Estudios de resistencia a antiparasitarios

Para conocer la posible resistencia a drogas antiparasitarias (Triclabendazol, TCBZ), se

utilizó la técnica RAPD PCR para la que se seleccionó ejemplares procedentes de un

bovino (n=9) y 2 ovinos (n=18) obtenidas en las faenas realizadas en septiembre de 2009

y noviembre de 2010. En cada tubo de microcentrifuga de 2 ml de capacidad se

colocaron 3 ejemplares de F. hepatica con el medio ARNlaterR y se enviaron a la Cátedra

de Farmacología, de la Facultad de Ciencias Veterinarias, de la Universidad del Centro

de la Provincia de Buenos Aires, para realizar el ensayo que involucró el análisis de los

fragmentos amplificados, mediante electroforesis en geles de

poliacrilamida desnaturalizantes. El iniciador empleado se marcó con un compuesto

fluorescente, y se resolvió empleando un secuenciador automático. Se emplearon como

testigos muestras de F. hepatica procedentes de la provincia de Chubut y otras de

Cajamarca, Perú. En cada tubo se preparó: BSA 1mg/ml 2,5 µl, dNTPs 20 mM 2 µl, Taq

directa sin diluir 0,25 µl, DNA 10 ng/µl 1 µl, MgCl 25 mM 2 µl, primer mezcla F y R 1 µl y

H2O csp 16,25 µl. La secuencia del cebador utilizado fue: M-13: GAG GGT GGC GGT

TCT y el Programa 7: Di: 94 °C 2 min, 94 °C 30 seg, 37 °C 1 min, 72 °C 2 min (45 ciclos),

Ef: 72 °C 5 min. Los tubos y orden de siembra fueron 1) PM 10 µL, 2) ADN Fh Sensible

(cepa pura Cullompton), 3) ADN Fh Resistente (cepa pura Sligo), 4) ADN Fh Perú ovino

(Pedro Ortiz de Cajamarca), 5) ADN Fh Quebrada Grande (Vega), 6) ADN Fh Puerta de

Tatón (Bayón), 7) ADN Fh Casa Grande (López), 8) ADN Fh Chubut ovino (Jensen).

IDENTIFICACIÓN DEL HOSPEDADOR INTERMEDIARIO DE Fasciola hepatica

5. - Epidemiología de los caracoles

5.1. - Recolección de limneidos en la zona del valle de Fiambalá

Los métodos malacológicos correspondieron a los básicos utilizados en malacología y

comprendieron la recolección de los limneidos (n=2354) en la naturaleza, su transporte, y

la posterior aclimatación de los mismos en condiciones de laboratorio para su estudio

(Roberts, 1950);(Malek, 1962);(Prasertphon, 1990).

Se seleccionaron 4 biotopos donde se colectaron caracoles mediante la búsqueda visual

sobre la vegetación o de los ejemplares que se desplazaban libremente en la superficie

del agua. También se buscaron moluscos en restos del sustrato seco, troncos, hojas,

tallos, etcétera.

El área de trabajo fue determinada con el fin de recolectar el mayor número de

ejemplares posibles, en total se realizaron 24 muestreos de 3 horas cada uno, desde

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Electroforesis_en_geles_de_poliacrilamida&action=edit&redlink=1



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septiembre a mayo de cada año, colectando moluscos en sus diferentes hábitats,

mediante las manos enguantadas para no dañar al caracol y reduciendo el impacto sobre

el biotopo. En los diferentes muestreos y en cada sitio se recolectaron todas las especies

de caracoles presentes, utilizando igual método de captura (Rabinovich, 1980).

El material malacológico colectado provenía de poblaciones naturales del valle de

Fiambalá. Las expediciones para la recolección de los moluscos se realizaron en

poblaciones de caracoles del río Abaucán (27º29´28,71''S y 67º36'06,12''O), en la vega

ubicada en las afueras de Tatón (27º20'29,35''S y 67º31'58,24''O), gasterópodos

presentes de la vega “La Primavera de Isataco” (27º29'28,71''S y 67º36'06,12''O), entre

las localidades de Tatón y Medanitos y en Río Grande (27º13'37,94''S y 67º22'43,17''O).

Estos lugares fueron escogidos teniendo en cuenta los casos registrados en el marco

veterinario (Curtale et al, 2000) y las primeras estimaciones sobre fasciolosis en seres

humanos detectadas en la zona.

De cada una de las áreas de recolección se tuvieron en cuenta una serie de

características bióticas tales como: la presencia de otras especies de moluscos

(Paraense, 2005), presencia/ausencia de vertebrados como potenciales hospedadores

definitivos y tipo de vegetación de la zona.

5.1.1. - Transporte de limneidos al laboratorio

La recolección de moluscos en el terreno se realizó siguiendo las instrucciones generales

que cabe encontrar en cualquier libro de malacología que se refiera a gasterópodos de

agua dulce. Siempre se trató de hacer colectas lo más numerosas posibles, dada la

mortalidad de estos caracoles en situaciones experimentales.

Para el transporte de los ejemplares vivos, se utilizó recipientes de plástico conteniendo

agua del lugar. Durante los viajes se hizo especial hincapié en la temperatura (menor a

20 °C), para evitar la contaminación del agua que podía llevar a la mortalidad de los

caracoles recolectados. A su vez se colectaron especímenes que fueron colocados en

tubos con alcohol etílico. Se trasladaron al laboratorio de Parasitología de la Facultad de

Ciencias de la Salud, de la Universidad Nacional de Catamarca para estudios apropiados.

5.2. - Tareas en el laboratorio

5.2.1. - Adaptación y cultivo de limneidos

El primer paso que se realizó en el laboratorio, fue la aclimatación de los moluscos

recolectados, tratando de simular las condiciones que encontraban en la naturaleza. Esta

fase duró aproximadamente 48 horas (Rondelaud y Barthe, 1987);(Audousset et al,

1989). Durante este período, los ejemplares se colocaron en recipientes de vidrio con

agua y un suministro de lechuga, a temperaturas entre 20 y 25 ºC.

Se consiguió un correcto mantenimiento para la reproducción del ciclo biológico, al

disponer en el fondo de los recipientes, una capa fina de sedimentos de grava

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(Rondelaud y Barthe, 1978);(Audousset et al, 1989) cubierta con agua, ambos elementos

previamente esterilizados mediante el empleo del autoclave. Cada 3 a 4 días se añadían

hojas de lechuga (Venturini et al, 1981) y se procedía al cambio de agua del recipiente

(Bouix-Busson et al, 1985 a);(Bouix-Busson et al, 1985 b).

5.2.2. - Taxonomía

De los primeros ejemplares (n=1236) colectados en diciembre de 2009, un grupo (n=298)

de los moluscos se llevaron al Laboratorio de Parasitología General, Unidad de Ecología

de Reservorios y Vectores de Parásitos, Departamento de Ecología, Genética y

Evolución, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires donde

se confirmó por las características morfológicas de la conchilla (Paraense, 1982) y

órganos internos que se trataba de limneidos.

El material colectado y conservado en etanol (n=236), en septiembre de 2010, se

comparó con las descripciones y los dibujos de las especies de limneidos detalladas para

la Región Neotropical (Paraense, 1982);(Paraense, 1984).

La caracterización morfométrica comparativa de la conchilla de los limneidos es una

característica adicional de interés, sobre todo cuando se trata de especies de

hospedadores intermediarios del grupo Galba/Fossaria ampliamente distribuido en zonas

endémicas de fasciolosis de América del Sur (Samadi et al, 2000);(Bargues et al, 2007 a,

2011 a).

Las conchillas de limneidos se midieron de acuerdo con los métodos tradicionales

malacológicos (Oviedo et al, 1995);(Samadi et al, 2000). Para estudiar la estructura

anatómica de la población se midió el largo de la conchilla desde el ápex hasta el margen

anterior y el ancho en la sección más amplia (Hubendick, 1951) de los caracoles

recolectados en cada ambiente y por fecha de muestreo, utilizando un calibre de Vernier.

Otros moluscos, recolectados simultáneamente con los de la familia Lymnaeidae, fueron

identificados a nivel de género, siguiendo las claves y descripciones de los gasterópodos

de agua dulce de Argentina (Castellanos y Landoni, 1981);(Rumi et al, 2008).

5.2.3. - Infección natural por F. hepatica

Teniendo en cuenta que los moluscos fueron recolectados en zonas de endemia animal,

se consideró necesaria la comprobación de una posible parasitación. Después de su

aclimatación, 70 ejemplares recolectados en 2011, fueron aislados en cajas de Petri

individuales para comprobar en éstos la emisión de cercarias durante 60 días. Las cajas

de cultivo fueron revisadas una vez a la semana en busca de la posible presencia de

metacercarias enquistadas en las paredes del recipiente o en la lechuga que servía de

alimento.

Un grupo de cuerpos de caracoles (n=453) se examinaron para la identificación de

estadios intermediarios de F. hepatica. Se sacrificaron y relajaron los ejemplares y luego

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al llevar a cabo la disección de los cuerpos en fresco, separando las partes duras de las

blandas con agujas de disección, se comprimieron entre dos portaobjetos y se

observaron al microscopio óptico (4x) para reconocer las estructuras de los diferentes

estadios intermedios del parasito.

5.2.4. - Infección inducida del hospedador intermediario

En el laboratorio de Parasitología de la Facultad de Ciencias de la Salud se realizó la

infección experimental del hospedador intermediario, la que se consiguió forzando el

contacto miracidio-molusco (n=60) y manteniendo los caracoles infectados bajo

condiciones controladas de temperatura, humedad e iluminación (Mas-Coma et al, 1997

a);(Valero y Mas-Coma, 2000).

Los miracidios utilizados se obtuvieron de forma experimental mediante la eclosión de los

huevos previamente embrionados (recogidos en las necropsias, lavados con solución

isotónica y filtrados). Se mantuvieron en estufa a temperatura de 25 °C durante 8 días,

observándolos cada 24 horas para comprobar la maduración de los mismos. Los huevos

embrionados se sometieron a la acción de la luz durante 30 min, promoviendo la apertura

del opérculo y salida del estadio larvario (Ubaid, 1989). La infección se logró poniendo en

contacto los moluscos con varios miracidios -infección plurimiracidial- en una caja de Petri

durante un tiempo que osciló entre 2 y 6 horas. Pasado este periodo se observó el

recipiente bajo la lupa en busca de miracidios, y en caso de no estar presentes, se

consideró un signo inequívoco de que habían penetrado en el caracol (Krull,

1941);(Kendall, 1950);(Roberts, 1950).

5.3. - Identificación de la especie mediante determinación de haplotipos

Se transportaron caracoles de una misma población de limneidos (n=38), colectados

durante 2012 en los biotopos de la zona y fijados con alcohol etílico 70%, al Centro

Colaborador de la OMS, Departamento de Parasitología, de la Universitat de Valencia,

España, para realizar los análisis moleculares mediante procedimientos de extracción de

ADN. Su mantenimiento durante el viaje, se llevó a cabo mediante cambios del alcohol en

forma periódica.

En la presente investigación, entre los marcadores moleculares utilizados en la

identificación de los limneidos y para demostrar a que especie pertenecían, se

seleccionaron: ADN nuclear ribosomal (ADNr), marcador de ADN mitocondrial (ADNmt),

primer espaciador transcrito interno (ITS-1), segundo espaciador transcrito (ITS-2), ARN

ribosomal, codificación de gen de la subunidad grande del gen mitocondrial (16S),

citocromo c oxidasa subunidad I de secuencia de nucleótidos y la secuencia de

aminoácidos (Cox1).

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5.3.1. - Marcadores de ADN seleccionados

Los marcadores se utilizaron para demostrar la clasificación de las especies de limneidos

y evaluar comparativamente la variabilidad intraespecífica de sus poblaciones en muchos

países de América Latina (Bargues y Mas-Coma, 2005);(Bargues et al, 2001, 2007 a,

2011 a, b, c), que también incluye Argentina (Bargues et al, 2006, 2007 b);(Mera y Sierra

et al, 2009).

5.3.2. - Extracción de ADN

El total de ADN fue aislado con fenol-cloroformo y se precipitó en etanol (Sambrook et al,

1989). La extracción se realizó individualmente de una pequeña porción del tejido de la

cabeza-pie de cada caracol (Manlatis et al, 1989). Las muestras de los especímenes de

limneidos se suspendieron en un tubo eppendorf con 400 μL de tampón de lisis 10 μL

Tris-HCl, pH 8.0, 100 μL EDTA, 100 μL NaCl, 1% SDS conteniendo 500 µg/ml de

proteinasa K (Promega, Madison, WI, USA) y digeridos durante 2 horas a 55 °C con

agitación alterna cada 15 min. Los pasos del procedimiento se realizaron de acuerdo con

métodos descriptos previamente (Bargues y Mas-Coma, 1997);(Bargues et al, 2001, 2007

a). El sedimento (pellet) se secó y se resuspendió de nuevo en 30 μL de buffer TE estéril

(pH 8.0), esta suspensión fue almacenada a -20 ºC hasta su empleo.

5.3.3. - Secuenciación de los marcadores de ADNr y ADNmt

Las secuencias de ADN fueron amplificadas mediante la reacción en cadena de

polimerasa (PCR) con la utilización de 4-6 μL de ADN genómico cada 50 μL de reacción

de PCR, según métodos descritos en la bibliografía (Bargues y Mas-Coma, 1997,

2005);(Bargues et al, 1997, 2001, 2006 a, c, 2007, 2011 a, b, c, 2012 a, b);(Mas-Coma et

al, 2001). El programa utilizado para los espaciadores fue: 1) 30 seg a 94 ºC; 2) 30 seg a

94 ºC; 3) 30 seg a 50 ºC; 4) 1 min a 72 ºC; 30 ciclos repetitivos de los pasos 2 a 4; 5) 7

min a 72 ºC; 6) descenso y mantenimiento a 4 ºC. Diez μL de cada producto de PCR se

chequeó mediante electroforesis en gel de agarosa coloreadas con bromuro de etidio 1%

(NuSieve® GTG® agarosa). Para poder extrapolar el peso de los fragmentos de ADN se

utilizó el marcador de peso molecular VI (Boehringer Mannheim).

La purificación de los productos amplificados por PCR tuvo la finalidad de obtener una

solución concentrada y de alta pureza del fragmento, eliminando los restos de cebadores,

nucleótidos, sales, etcétera. La concentración de ADN así como su pureza fueron

calculadas por espectrofotometría en una dilución de la muestra al 5% en tampón Tris 10

μL.

Cada uno de los cuatro marcadores de ADN (ADNr ITS-2 y ITS-1, y de ADNmt, genes

16S y cox1) se amplificaron por PCR en forma independiente para cada muestra y cada

producto de PCR se secuenció para la caracterización del haplotipo. Los espaciadores

ITS-2 y ITS-1 se amplificaron utilizando los cebadores descritos anteriormente (Bargues

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et al, 2001, 2006, 2007 a, b);(Mas-Coma et al, 2009 a). Los fragmentos diana de los

genes 16S y cox1 fueron amplificados por PCR usando un conjunto de cebadores

universales (Simón et al, 1991);(Folmer et al, 1994). Los procedimientos de amplificación

y las condiciones del ciclador térmico para cada uno de los marcadores de ADN se

llevaron a cabo en un Mastercycle Epgradient (Eppendorf, Hamburgo, Alemania), como

se describió previamente (Mas-Coma et al, 2009 a);(Bargues et al, 2011 a).

Los productos de PCR fueron purificados utilizando el Ultra Clean System™ Purificación

de ADN PCR Clean-up (MoBio, Solana Beach, CA, USA) de acuerdo con el protocolo del

fabricante y se resuspendieron en 50 μL de 10 mM de tampón TE (pH 7,6). La

concentración final de ADN se determinó midiendo la absorbancia a 260 y 280 nM en un

Eppendorf BioPhotometer (Hamburgo, Alemania).

La secuenciación de cada marcador molecular se realizó en ambas hebras por el método

didesoxinucleótidos (ddNTPs) de terminación de cadena. Se llevó a cabo con el kit que

contiene tinte de color de enzima termoestable Taq en un Applied Biosystems 3730 DNA

Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) usando cebadores de PCR.

5.3.4. - Análisis de la secuencia

Las secuencias fueron alineadas utilizando CLUSTALW2 (Larkin et al, 2007) en versión

6.0.6 MEGA (Tamura et al, 2013) y el conjunto se trabajó con el paquete Staden (Staden

et al, 2001). Las correcciones menores para el mejor ajuste de nucleótidos se hicieron en

los casos de los espaciadores ITS. Las homologías se realizaron utilizando el programa

BLASTN (Camacho et al, 2008) del Centro Nacional para el sitio web de información

sobre Biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Las distancias genéticas se

midieron usando parámetros proporcionados por PAUP v.4.0b10 (Swofford, 2001).

Como la sistemática de limneidos sudamericanos pertenecientes al grupo Galba/Fossaria

es controversial y no se puede hacer solo con criterios morfológicos (Bargues et al, 2007

a);(Mera y Sierra et al, 2009), para identificar qué individuos pertenecen a L. neotropica o

L. viator, la comparación de las secuencias se realizaron utilizando todos los datos de

secuencias ribosomales y mitocondriales de moluscos descargados de GenBank.

5.3.5. - Nomenclatura de los haplotipos de ADN

En lo referente a la nomenclatura, los códigos de las secuencias obtenidas utilizados para

la definición de los haplotipos siguen la propuesta estándar para limneidos (Bargues y

Mas-Coma, 2005);(Bargues et al, 2006 a);(Mas-Coma et al, 2009 a). Es importante

puntualizar que los códigos de haplotipos son definitivos sólo cuando se trata de

secuencias completas del marcador utilizado para haplotipar. Sin embargo, se consideran

códigos preliminares cuando la secuencias utilizadas corresponden a fragmentos o

secuencias incompletas.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST

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5.4. - Determinación molecular de la infección natural de limneidos con F. hepatica

Se seleccionaron al azar caracoles (n=120) recolectados a fines del verano de 2011 y

conservados individualmente en alcohol 70%. Los ejemplares fueron llevados al

Departamento de Parasitología del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas,

ANLIS „„Dr. Carlos G. Malbran”, donde se sometieron a la técnica de amplificación en

cadena de la polimerasa (Cucher et al, 2006). La secuencia completa del ADN

mitocondrial de F. hepatica, disponible en la base de datos GenBank (Número de acceso:

AF216697) se empleó para adquirir el par de cebadores utilizados en el método.

La identidad de F. hepatica se corroboró mediante la determinación molecular en los

caracoles limneidos. Esta técnica se empleó a fin de determinar la infección de moluscos

del género Lymnaea con F. hepatica. A 10 μL de material genético obtenido se le

adicionaron 40 μL de mezcla de reacción compuesta de: 0,25 µL de cebadores FhCO1F,

0,25 µL de cebadores FhCO1R, 0,20 µL de ddNTPs, 0,20 µL de enzima Taq polimerasa,

5 µL de MgCl, 5 µL de buffer de reacción, 0,40 µL de BSA y 28,70 µL de agua bidestilada

estéril. Este proceso se realizó en tandas de 75 muestras a modo de trabajar con mayor

practicidad. El protocolo empleado fue el mismo usado para determinar si existió

amplificación en la secuencia de ADN en las muestras de limneidos colectados a campo.

De estas muestras se tomaron 5 μL para ser sembrados en un gel de electroforesis de

concentración 1,5%, para verificar si hubo amplificación de la muestra, a su vez se

sembró la mezcla de reacción (sin ADN) y una muestra de control positivo que permitió

verificar si las muestras analizadas estaban infectadas. Se procedió a realizar la

electroforesis, en las mismas condiciones anteriores.

La técnica de PCR se empleó para amplificar la secuencia de ADN de las muestras

limneidos. A 10 µl de material genético se les adicionó 40 µl de mezcla de reacción: 0,5 µl

de primer 213 10 mM, 0,5 µl de primer 297 10 mM, 0,2 µl de dNTPs, 0,2 µl enzima Taq

polimerasa, 5 µl MgCl, 5 µl de buffer de reacción B10x ClK, 0,4 µl de BSA y 28,2 µl de

agua bidestilada estéril.

Los tubos de ADN y uno que contenía agua (a modo de control) fueron llevados a un

termociclador, empleando el programa “sil Lymnaea 18s” previamente cargado en el

equipo. Se llevó a una temperatura de 95 °C durante 5 min, luego a temperaturas de 94

°C, 55 °C y 72 °C durante 10 seg repitiendo este ciclo 35 veces, para después llevarlos

durante 10 min a 72 °C para finalmente bajar la temperatura hasta 4 °C.

5.4.1. - Electroforesis

De las muestras se tomaron 5 µl para ser sembrados en un gel de electroforesis de

concentración 2,5%, que permitió la separación de las macromoléculas en base a su

carga y masa al colocarlo en una cuba de electroforesis que poseía un tampón y donde

se aplicó corriente eléctrica. Esto se realizó mezclando 6 g de agarosa en 400 ml de

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buffer TAE (tris-acetato), calentando para disolver la agarosa, luego se dejó enfriar la

mezcla hasta 50-60 °C y se añadieron 24 µl de bromuro de etidio, que actuó como

colorante. Se vertió en un molde y colocando un peine se formaron pocillos donde fueron

sembradas las muestras y colocadas en la cubeta de electroforesis que presentaba

solución tampón de TAE 1x, el gel quedó completamente cubierto.

Una vez realizado esto se colocó en el primer pocillo el ADN marcador adecuado (100

bp), en el último la mezcla de reacción con agua y en los pocillos restantes las muestras

que se analizaron por duplicado. El ADN migró hacia el ánodo aplicando tensión eléctrica

hasta que el bromuro de etidio recorrió la distancia a través del gel (30 min). Finalmente

se introdujo el gel en un transiluminador UV y se fotografió. Se eliminó el gel en el

recipiente aparte para residuos sólidos destinado al bromuro de etidio.

DISEÑO DEL ESTUDIO Y MÉTODOS

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