INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL

UNIDAD SINALOA

“Diseño de metagenómica funcional de

consorcios microbianos tolerantes a glifosato,

carbofurán, permetrina y clorpirifós”

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRÍA EN RECURSOS NATURALES

Y MEDIO AMBIENTE

PRESENTA:

AMÉRICA JAZMÍN COTA ÁLVAREZ

GUASAVE, SINALOA; MÉXICO ENERO 2021

II

CARTA CESIÓN DE DERECHOS

En la Ciudad de Guasave, Sinaloa el día 07 del mes enero del año 2021, el que

suscribe América Jazmín Cota Álvarez alumna del Programa de Maestría en Recursos

Naturales y Medio Ambiente, con número de registro B180507, adscrito a CIIDIR

Unidad Sinaloa, manifiesto que es el autora intelectual del presente trabajo de Tesis

bajo la dirección de los Dr. José Luis Acosta Rodríguez, y cede los derechos del trabajo

titulado “Diseño de metagenómica funcional de consorcios microbianos tolerantes a

glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós”, al Instituto Politécnico Nacional para su

difusión, con fines académicos y de investigación.

Los usuarios de la información no deben reproducir el contenido textual, gráficas

o datos del trabajo sin el permiso expreso del autor y/o directores del trabajo. Este

puede obtenerse escribiendo a las siguientes direcciones amecota1287@gmail.com y

acostarojo@gmail.com. Si el permiso se otorga, el usuario deberá dar el

agradecimiento correspondiente y citar la fuente de este.

_____________________________

América Jazmín Cota Álvarez

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

III

IV

V

RECONOCIMIENTO A PROYECTOS Y BECAS

El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Biotecnología Agrícola

del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional

(CIIDIR) Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN), bajo la dirección del

Dr. José Luis Acosta Rodríguez. El presente trabajo recibió financiamiento a través del

de proyectos SIP-IPN con el número de registro 20170193 y 20195561, y recursos de

Proyectos de Desarrollos Tecnológicos o Innovación IPN2019 B180507 brindando

apoyo para la realización de estancia de investigación en el extranjero y fondos para

materiales de laboratorio. En el periodo estancia de maestría, la alumna América

Jazmín Cota Álvarez CVU 428184, recibió apoyo beca CONACYT con numero de

apoyo 728842 y financiamiento movilidad extranjera-2019 CONACYT BECA MIXTA

no. 000016-01NACF-03684, y fondos de beca BEIFI-IPN2019-2020.

VI

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Agrogenómica,

Departamento de Biotecnología Agrícola del Centro Interdisciplinario de Investigación

para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico

Nacional (IPN), agradezco en primera instancia al Instituto y a mi director de tesis el

Dr. José Luis Acosta Rodríguez por depositar su confianza en mí para formar parte del

del gran equipo de Agrogenómica, como también reconocimiento por sus

aportaciones, consejos, paciencia y el apoyo brindado a lo largo de mi estancia de

maestría, gracias por forjar y contribuir a mi formación académica.

Al Laboratorio de Biología de Sistemas del Centro Nacional de Biotecnología

(CNB) del Consejo Superior de Investigación Científica (CSIC)-Madrid, España, por

facilitar movilidad estancia en el extranjero con objetivo de desarrollar algunas

metodologías, estableciendo una colaboración con el Dr. Juan Nogales Enrique

agradezco sus aportaciones acertadas y la confianza depositada.

Así como también, me permito agradecer a las diferentes personas que

contribuyeron durante el desarrollo de dicho trabajo.

Al Comité Tutorial integrado por Dra. María Nancy Herrera Moreno, Dr. Jesús

Arturo Fierro Coronado, Dr. Jorge Montiel Montoya y Dra. Josefina León Félix, muchas

gracias por sus contribuciones, su invaluable tiempo y su apoyo.

Por apoyo técnico otorgado agradezco al MC. Mariela Guadalupe Espinoza

Mancillas, Dr. Jesús Arturo Fierro Coronado y MC. Julián Alberto Galaviz Lara.

Al Dr. Blas Blázquez Castiñeira por su asesoría, apoyo técnico, por su atención

prestada y por su apoyo durante la realización de mi estancia en CNB.

Al equipo del Laboratorio de Laboratorio de Agrogenómica, Departamento de

Biotecnología Agrícola del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo

Integral Regional (CIIDIR).

VII

DEDICATORIA

En principio debo agradecer y dedicar a Dios y a mis padres mi día a día, con

todo el amor, admiración y respecto a Mario Guadalupe Cota y Rosa María Álvarez,

por forjar en mí el carácter de lucha, de trabajo, de esfuerzo, por guiarme, por su apoyo

incondicional en todo este proceso, por creer en mí, este logro lo quiero compartir con

ustedes. ¡Muchas gracias!

A mis tres pedacitos, mis hermanas a las que amo con todo mi corazón: Ivonne,

Yarentzy y María Rosa, por estar siempre conmigo acompañándome en cada

proyecto, por jugar ese papel super bien de hermanas mayores de forma

extraordinaria, por siempre mil gracias por formar parte de mi historia personal, de

tantos momentos y recuerdos. ¡Siempre juntas cuatro de cuatro!

A mis retoños más pequeños; Mariam Camila, Cesar Mateo, Amanda Isabel y

Luis Emilio. Siendo los sobrinos, una hermosa distracción, en particular a mi

“Chiquichi”. Además, hago un espacio a tan especial cuñado, Erick Romero.

A mis tíos Felipe Álvarez y Lucila Ulloa, y a mi primo consentido Felipito, gracias

por la patadita de suerte para mi estancia, en especial tía Luci mil gracias por el detalle

esos 10 € y mi cadenita, cada vez que los miraba en esa cajita me recordaban mi

sueño, ¡te quiero mucho!

¡A toda mi familia gracias!

A mi prima Macoche +, tío “Tato” +, son las estrellas que más brilla en el cielo,

comparto mi trabajo con ustedes sé que lo interpretarían y compartirían esta pación.

En particular a Gabriela Báez “coma” mi hermana, gracias por asistirme en tu

casita cuando tenía que quedarme hasta tarde en Guasave, gracias por compartir tu

comida, tu espacio, tus hijos, tu familia conmigo, sé que lo haces con el corazón. Otra

persona muy muy especial Stephania Perry, en la distancia, pero siempre juntas

gracias por tus videollamadas, gracias por acompañarme en este proceso.

VIII

A Gabriela, Arturo, Goretty, Roxana, Stephanie, Gisel, Joseline, Areli, Carolina,

Yamel y Priscila gracias por su amistad incondicional.

A una persona espacial Bertha Altamirano, gracias por tus consejos, por

acompañarme y por tu cariño.

A mis compañeros de maestría Mario Mario, Dulce y Héctor gracias por

escucharme y acompañarme compartiendo este proceso.

En este tiempo conocí a los Guachupines, gracias por recibirme en su país,

siempre presente en mis recuerdos con mucho cariño, gracias por formar parte de esto

“tus cepitas” mis guachupinas; Lety, Manuela e Inmaculada, ¡gracias por todo! Así

como también a Dani “marroquí” y a la chica 100 % “madrileña” Martha.

A una persona muy especia 23.09.2019 “Siempre Juntos”.

Son muchas las personas especiales a las que me gustaría agradecer su

amistad, apoyo, ánimo y compañía en las diferentes etapas de mi vida. Algunas están

aquí conmigo y otras en mis recuerdos y en mi corazón. Sin importar en dónde estén

o si alguna vez llegan a leer estas dedicatorias quiero darles las gracias por formar

parte de mí, por todo lo que me han brindado y por sus bendiciones.

América Cota

IX

ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 1

II. ANTECEDENTES ............................................................................................... 5

2.1 Agricultura en el noroeste de México ......................................................... 5

2.1.1 Principales Cultivos en Sinaloa .......................................................... 6

2.1.1.1 Cultivo Maíz (Zea mays) ............................................................ 6

2.1.1.2 Cultivo de papa (Solanum tuberosum L.) .................................. 6

2.1.2 Principal cultivo en Sonora ................................................................. 7

2.1.2.1 Cultivo de Trigo (Triticum sp.) .................................................... 7

2.2 Control de plagas ....................................................................................... 8

2.3 Generalidades Plaguicida ........................................................................... 9

2.4 Clasificación de los Plaguicidas ............................................................... 12

2.5 Plaguicida, Suelo, Medio Ambiente y Salud ............................................. 15

2.6 Plaguicidas seleccionados ....................................................................... 18

2.6.1 Glifosato ........................................................................................... 18

2.6.1.1 Impacto por el uso de Glifosato ............................................... 20

2.6.1.2 Degradación de glifosato por microorganismos ....................... 20

2.6.2 Carbofurán ....................................................................................... 24

2.6.2.1 Impacto por el uso de Carbofurán ........................................... 25

2.6.2.2 Degradación de carbofurán por microorganismos ................... 25

2.6.3 Permetrina ....................................................................................... 27

2.6.3.1 Impacto por el uso de Permetrina ............................................ 28

2.6.3.2 Degradación de permetrina por microorganismos ................... 29

2.6.4 Clorporifós ........................................................................................ 32

2.6.4.1 Impacto por el uso de Clorpirifós ............................................. 33

2.6.4.2 Degradación de clorpirifós por microrganismos ....................... 35

2.7 Consorcios microbianos ambientales y sintéticos .................................... 39

2.8 Metagenómica Funcional ......................................................................... 42

III. JUSTIFICACIÓN .............................................................................................. 44

IV. HIPÓTESIS ......................................................................................................... 45

V. OBJETIVOS ..................................................................................................... 46

Objetivo General ............................................................................................... 46

Objetivos Específicos ........................................................................................ 46

VI. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 47

6.1 Antecedentes Proyecto (SIP20170193) ................................................... 47

6.2 Producto Químico ..................................................................................... 56

X

6.3 Etapa I ...................................................................................................... 56

6.3.1 Objetivo 1: Valorar la capacidad de tolerancia a glifosato, carbofurán,

permetrina y clorpirifós de las cepas aislados de cultivos de papa, maíz y

trigo del noroeste de México. ................................................................... 56

6.3.1.1 Reactivación de las cepas aisladas de cultivos de cultivos de

papa (Solanum tuberosum L.), maíz (Zea mays) y trigo (Triticum) ...... 56

6.3.1.2 Valorar la capacidad de tolerancia a 200 ppm glifosato,

carbofurán, permetrina y clorpirifós de las cepas aislados. .................. 57

6.3.1.3 Valorar la capacidad de tolerancia a 5000 y 10000 ppm

glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós de las cepas del grupo I.58

6.4 Etapa II ..................................................................................................... 59

6.4.1 Objetivo 2. Identificar cepas con capacidad de tolerancia a carbofurá y

glifosato Grupo II por secuenciación Sanger (marcadores 16S rRNA). .. 59

6.4.1.1 Extracción de ADN .................................................................. 59

6.4.1.2 Amplificación de ADN mediante PCR ...................................... 59

6.4.1.3 Secuenciación ......................................................................... 61

6.4.1.4 Análisis filogenético16S rRNA ................................................. 61

6.5 Etapa III .................................................................................................... 62

6.5.1 Objetivo 3. Conformar el consorcio microbiano a partir de las cepas

con mayor tolerancia a los diferentes plaguicidas. ................................... 62

6.5.1.1 Consorcio Artificial: valoración de tolerancia a diferentes

concentraciones de glifosato. ............................................................... 62

6.5.1.2 Comparación de un consorcio nativo (aislado ambiental) contra

un consorcio artificial en diferentes concentraciones de glifosato ........ 64

6.6 Etapa IV .................................................................................................... 65

6.6.1 Objetivo 4. Diseño de primer para genoteca de metagenómica

funcional dirigida a genes asociados a degradación de plaguicidas. ....... 65

6.6.1.1 Construcción de la base de datos de genes asociados a la

degradación de plaguicidas .................................................................. 65

VII. RESULTADOS ................................................................................................. 66

7.1 Etapa I ...................................................................................................... 66

7.1.1 Objetivo 1: Valorar la capacidad de tolerancia a glifosato, carbofurán,

permetrina y clorpirifós de las cepas aislados de cultivos de papa, maíz y

trigo del noroeste de México. ................................................................... 66

7.1.1.1 Reactivación de las cepas aisladas de cultivos de papa

Solanum tuberosum L., maíz (Zea mays) y trigo (Triticum) .................. 66

7.1.1.2 Valorar la capacidad de tolerancia a 200 ppm glifosato,

carbofurán, permetrina y clorpirifós de las cepas aislados. .................. 69

XI

7.1.1.3 Valorar la capacidad de tolerancia a 5000 y 10000 ppm

glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós de las cepas del grupo I.76

7.2 Etapa II ..................................................................................................... 78

7.2.1 Objetivo 2. Identificar cepas con capacidad de tolerancia a carbofurán

y glifosato Grupo II por secuenciación Sanger (marcadores 16S rRNA). . 78

7.3 Etapa III .................................................................................................... 81

7.3.1 Objetivo 3. Conformar el consorcio microbiano a partir de las cepas

con mayor tolerancia a los diferentes plaguicidas. ................................... 81

7.3.1.1 Consorcio Artificial: valoración de tolerancia a diferentes

concentraciones de glifosato. ............................................................... 81

7.4 Etapa IV .................................................................................................... 86

7.4.1 Objetivo 4. Diseño de primer para genoteca de metagenómica

funcional dirigida a genes asociados a degradación de plaguicidas. ....... 86

VIII. DISCUSIÓN ...................................................................................................... 90

IX. CONCLUSIONES ........................................................................................... 101

X. PERSPECTIVAS ............................................................................................ 102

XI. BIBLOGRAFÍA .............................................................................................. 103

XII. ANEXOS ......................................................................................................... 125

XII

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Consumo anual total de plaguicidas (1990-2017) a nivel mundial. ........ 10

Figura 2. Distribución del consumo anual para 2017 a nivel mundial representado

en toneladas ........................................................................................... 11

Figura 3. Localización de los sitios identificados en los que se reporta la presencia

y niveles medidos de plaguicidas. .......................................................... 17

Figura 4. Estructura química glifosato; nombre IUPAC [Ácido 2- (fosfonometilamino)

acético] ................................................................................................... 19

Figura 5. Vías metabólicas del glifosato en bacterias............................................ 22

Figura 6. Estructura química de carbofurán; nombre IUPAC [3-hidroxi-2,2-bis

(trideuteriomethyl) -3 H -1-benzofuran-7-il] N metilcarbamato ............... 25

Figura 7. Estructura molecular de permetrina; nombre IUPAC [3- (2,2-dicloroetenil)

-2,2-dimetilciclopropano-1-carboxilato de (3-fenoxifenil) metilo] ............. 28

Figura 8. Vías de degradación microbiana propuestas para piretroides tipo I

representativos. R1 representa diferentes grupos sustituyentes en los

piretroides tipo I ...................................................................................... 30

Figura 9. Árbol filogenético de enzimas funcionales clave involucradas en la

degradación de los piretroides. .............................................................. 31

Figura 10. Estructura molecular de clorpirifós; nombre IUPAC [dietoxi-sulfaniliden-

(3,5,6-tricloropiridin-2-il) oxi-λ 5 -fosfano] ............................................... 33

Figura 11. Vía propuesta para la degradación aeróbica de clorpirifós por bacterias.

............................................................................................................... 37

Figura 12. Vía propuesta para la degradación anaeróbica de clorpirifós ................ 38

Figura 13. Estrategias para seleccionar a los miembros del consorcio ................... 41

Figura 14. Área de estudio ...................................................................................... 48

Figura 15. Aislados de microorganismo de suelos .................................................. 52

Figura 16. Histograma de la abundancia bacteriana de la metagenómica de los tres

sitios muestreados. ................................................................................ 55

Figura 17. Diagrama de ubicación de cebadores de la región 16S rRNA. .............. 60

XIII

Figura 18. Morfología de cepas aisladas de suelos ................................................ 67

Figura 19. Prueba de Hemólisis. ............................................................................. 68

Figura 20. Pruebas de tolerancia de bacterias aisladas de suelos agrícolas de

Guasave (cultivos de papa) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y

Clorpirifós Etil; MM9 200 ppm. ............................................................... 70

Figura 21. Pruebas de tolerancia de bacterias aisladas de suelos agrícolas de

Culiacán (cultivos de maíz) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y

Clorpirifós Etil; MM9 200 ppm. ............................................................... 71

Figura 22. Pruebas de tolerancia de bacterias aisladas de suelos agrícolas de

Navojoa (cultivos de trigo) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y Clorpirifó

Etil; MM9 200 ppm. ................................................................................ 72

Figura 23. Pruebas de tolerancia de hongos aisladas de suelos agrícolas de Navojoa

(cultivos de trigo) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y Clorpirifós Etil;

MM9 200 ppm. ....................................................................................... 73

Figura 24. Pruebas de tolerancia de hongos aisladas de suelos agrícolas de

Guasave (cultivo de papa) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y

Clorpirifós Etil; MM9 200 ppm. ............................................................... 74

Figura 25. Cladograma del alineamiento de secuencias nucleotídicas. Aislados con

capacidad de tolerancia a carbofurán y glifosato Grupo II (por

secuenciación Sanger (marcadores 16S rRNA). .................................... 79

Figura 26. Dendograma aislados identificados asociados a su capacidad de

tolerancia. ............................................................................................... 80

Figura 27. Curva de crecimiento tolerancia a glifosato de Bacillus megaterium GVE7

y GVE 19 ................................................................................................ 83

Figura 28. Curva de crecimiento tolerancia a glifosato de Bacillus megaterium cultivo

mixto (Consorcio) ................................................................................... 84

Figura 29. Gráfica comparativa B. Subtilis WT; cepas individuales; cultivo mixto curva

de crecimiento a 5000 ppm. ................................................................... 85

XIV

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación de los plaguicidas en función de su toxicidad aguda ......... 13

Tabla 2. Clasificación por grupo químico y su modo de acción ............................ 14

Tabla 3. Caracterización del suelo de los puntos de muestreo de los municipios de

Guasave, Culiacán y Navojoa con base a la norma NOM-AA-021-

2001. ...................................................................................................... 49

Tabla 4. Patrones usados para identificación de plaguicidas en suelos de Guasave

............................................................................................................... 50

Tabla 5. Cepas aisladas de los diferentes sitios (Guasave, Culiacán y Navojoa) 53

Tabla 6. Tolerancia a diferentes plaguicidas ........................................................ 54

Tabla 7. Muestras positivas de hongos y bacterias a mix de plaguicidas a 200 y

100 µL/L ................................................................................................. 54

Tabla 8. Diseño experimental ............................................................................... 58

Tabla 9. Cuadro descripción de los cebadores para las regiones de 16S rRNA .. 60

Tabla 10. Condiciones de amplificación de ambas regiones 16S rRNA................. 60

Tabla 11. Diseño Experimental; tratamientos para evaluar M9 3aa+0.2%FC+1vit; 0-

10000 ppm Glifosato; Cepas A y B; Consorcio ...................................... 64

Tabla 12. Prueba de hemólisis de bacterias aisladas Guasave, Culiacán y

Navojoa .................................................................................................. 68

Tabla 13. Cepas del total de los sitios clasificación determinada por las pruebas de

tolerancia al total de los plaguicidas. ...................................................... 75

Tabla 14. Ensayo aumento de concentraciones de plaguicida a 5000 ppm y 10000

ppm de las cepas que presentaron tolerancia a 200 ppm (Grupo I) ....... 77

Tabla 15. Base de datos vías de degradación asociadas a genes de degradación

para Carbofurán, Glifosato, Clorpirifós y Permetrina. ............................. 87

Tabla 16. Diseño de primers para la aplicación metagenómica ............................. 88

XV

GLOSARIO

ADN (ÁCIDO DESOXIRIBONUCLEICO). Es una molécula de ácido nucleico

que basan en largas cadenas de desoxiribunucleótidos polimerizados. En una cadena

doble de ADN, ambas hebras se mantienen unidas a través de enlaces puente de

hidrógeno entre los pares de bases de nucleótidos complementarios.

BIOENSAYO DE TOXICIDAD. Prueba para establecer la magnitud y la

naturaleza del efecto que producirá un agente químico sobre organismos expuestos a

él bajo condiciones específicas.

DEGRADACIÓN. Proceso de descomposición de la materia, por medios físicos,

químicos o biológicos.

ENZIMA. Proteína producida por células vivas que puede catalizar una reacción

química.

GEN. Porción lineal de un cromosoma que determina o condiciona uno o más

caracteres hereditarios. La unidad funcional más pequeña del material genético.

GENOMA. Toda la información genética contenida en una célula u organismo.

MARCADOR GENÉTICO. Segmento de ADN cuya herencia se puede rastrear.

Puede ser un gen o un segmento sin función conocida. Dado que las secuencias de

ADN que se encuentran contiguas en un cromosoma tienden a heredarse juntas, los

marcadores se usan como formas indirectas de rastrear el patrón hereditario de genes

que aún no se han identificado, pero cuyas ubicaciones aproximadas se conocen.

METAGENÓMICA. Estudio directo de todo el material genético de las muestras

obtenidas en un determinado entorno biológico evitando la necesidad de aislamiento

y cultivo individual.

MICROGRAMO (µg). Unidad de masa equivalente a 0.001 miligramo (mg) y/o

0.000001 gramos (g).

XVI

PARTES POR MILLÓN (ppm). Proporción de la concentración de una

sustancia con respecto a la concentración de otra, como una unidad de soluto disuelta

en un millón de unidades de disolvente. Se puede expresar también en términos de

peso-peso, volumen-volumen o en cualquier otra relación de unidades de medida.

PLAGUICIDA. Sustancia o agente que destruye un grupo determinado de

organismos indeseables.

SIMBIOSIS. Forma de interacción biológica que hace referencia a la relación

estrecha y persistente entre organismos de distintas especies. La interacción biológica

puede ser mutualista, cuando ambos miembros obtienen beneficio, comensal, cuando

uno de los miembros de la simbiosis obtiene beneficio sin generar perjuicio al otro, y

parasitaria, cuando uno de los miembros de la simbiosis obtiene beneficio en

detrimento del otro.

SUELO AGRÍCOLA. Suelo dedicado a la producción de cultivos, forrajes y

pastos cultivados. Es también aquel suelo con aptitud para el crecimiento de cultivos

y el desarrollo de la ganadería. Esto incluye tierras clasificadas como agrícolas, que

mantienen un hábitat para especies permanentes y transitorias, además de flora y

fauna nativa, como es el caso de las áreas naturales protegidas.

TOLERANCIA. Capacidad de una cepa bacteriana de no ser eliminada por un

antibiótico a concentraciones relativamente altas, aunque puede inhibirse a

concentraciones muy inferiores.

XENOBIÓTICO. Compuesto químico elaborado por el hombre o material no

producido por la naturaleza y no considerado de manera normal como un componente

de un sistema biológico.

XVII

RESUMEN

La región noroeste del país representa el 20.9% de esta producción, debido a

empresas agrícolas producción comercial de grandes volúmenes. Sinaloa y Sonora

están dentro de los primeros lugares de los estados con mayor producción. Los

principales cultivos en la región son papa, maíz y trigo, éstos en relación con el uso y

aplicación de plaguicidas específicamente para cultivos de granos es necesario utilizar

productos fitosanitarios que permitan mantener la producción bajo un sistema de

monocultivo. Por otro lado, la actividad agrícola que aplica más plaguicidas por

hectáreas es el cultivo de papa. El uso indiscriminado de plaguicidas como glifosato,

carbofurán, permetrina y clorpirifós altamente tóxicos y acumulables en suelo, agua

subterránea y manto freático, ha generado impactos ambientales y problemas de salud

al ser humano. Para atender este problema se han generado soluciones en función de

microorganismos con capacidad de degradar estos contaminantes. Por tanto, el

objetivo de la presente investigación fue identificar y caracterizar la capacidad de

tolerancia (CT) a diferentes concentraciones de glifosato, carbofurán, permetrina y

clorpirifós de cepas aisladas de suelos agrícolas. La primera etapa partiendo de 86

aislados no identificados estos se sembraron a concentraciones de 200 ppm de cada

molécula, se clasificaron en función de su CT. Grupo I paso a ensayos a

concentraciones de 5000 ppm y 10000 ppm. Se tienen identificadas las cepas del

Grupo II: se seleccionaron aquellas que presentaron tolerancia a dos plaguicidas en

específico carbofurán y glifosato reportadas como Bacillus subtilis, Bacillus

megaterium, Bacillus toyonensis, Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus

aryabhattai y Bacillus velenzensis. Se valoró la curva de crecimiento bacteriano del

consorcio artificial (GVE7 y GVE19) ambas Bacillus megaterium en función CT a

concentraciones de 250 a 10000 ppm glifosato como única fuente de carbono estas

presentaron una tolerancia a 5000 ppm valoradas en 24h y se logró validar el método

de valoración en placa como prueba de tolerancia. Por otra parte, diseño de

metagenómica funcional dirigida a un panel de cuatro genes mcd, phnJ, cpd y estP, el

primer diseño de cebadores para apuntar más de un gen asociados a la degradación

para varias familias de plaguicidas en particular para especies del género de Bacillus.

XVIII

Estos resultados sugieren desarrollar cinética de degradación, combinación variable

de consorcios, dejando las bases para el desarrollo de un consorcio con potencial de

aplicación biotecnología en la degradación de estos plaguicidas, así como también

determinar el potencial de degradación para carbofurán, glifosato, clorpirifós y

permetrina en diferentes ambientes.

XIX

ABSTRACT

The northwest region of the country represents 20.9% of this production, due to

agricultural companies whose objective is the commercial production of large volumes.

Sinaloa and Sonora are among the first places of the states with the highest production.

The main crops in the region are potato, corn, and wheat. In relation to the use and

application of pesticides specifically for grain crops, it is necessary to use phytosanitary

products that allow production to be maintained under a monoculture system. On the

other hand, potato cultivation is one of the agricultural activities that consumes the most

pesticides per hectare. The indiscriminate use of pesticides such as glyphosate,

carbofuran, permethrin and chlorpyrifos, which are highly toxic and can accumulate in

the soil, subway water and groundwater, has generated environmental impacts and

health problems for human beings. To address this problem, solutions have been

generated based on microorganisms with the capacity to degrade these pollutants.

Therefore, the objective of this research was to identify and characterize tolerance

capacity (TC) to different concentrations of glyphosate, carbofuran, permethrin and

chlorpyrifos of isolated strains from agricultural soils. The first stage, starting from 86

non identified isolates, these were planted at 200 ppm concentrations of each molecule,

and they were classified according to their CT. Group I went on to trials at

concentrations of 5000 ppm and 10000 ppm. Group II strains have been identified:

there were selected those which showed tolerance to two specific pesticides carbofuran

and glyphosate reported as Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus toyonensis,

Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus aryabhattai and Bacillus velenzensis. It was

evaluated the bacterial growth curve of artificial consortium (GVE7 and GVE19) both

Bacillus megaterium in CT function at concentrations from 250 to 10000 ppm

glyphosate as the only source of carbon. These presented a tolerance at 5000 ppm

valued in 24h and it was possible to validate the method of titration in plate as a

tolerance test. On the other hand, design of functional metagenomics directed to a

panel of four genes mcd, phnJ, cpd and estP, the first design of primers to target more

than one gene associated to degradation for several families of pesticides for species

of the genus Bacillus. These results suggest developing degradation kinetics, variable

XX

combination of consortia, leaving the basis for the development of a consortium with

potential biotechnology application in the degradation of these pesticides, as well as to

determine the degradation potential for carbofuran, glyphosate, chlorpyrifos and

permethrin in different environments.

1

I. INTRODUCCIÓN

En 2018 Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera (SIAP) reporta

una superficie cultivada de 20.3 millones de hectáreas. Nuestro país se ubica entre

las 12 economías con mayor producción agrícola en el mundo y en la tercera

posición en América Latina. Actualmente, el sector agrícola genera 8.1% del PIB

primario, reportando SIAP en 2018 un valor de producción de este sector por

634,955 millones de pesos, representando la región noroeste el 20.9% de esta

producción, esto debido a empresas agrícolas, empleando gran infraestructura

(FAO, 2017; SIAP, 2018). Los principales estados productores son Sinaloa

ocupando el segundo lugar con una producción de 12.6 millones de toneladas y

Sonora este representa el quinto lugar de los estados con mayor producción

aportando 8.4 millones de toneladas (SIAP, 2018).

En el año 2018 Sinaloa reportó 1,117103 ha, de las cuales el 61% se

destinaron a cultivos de granos, el maíz representa el 41% de valor total de

producción del estado en ese mismo año. La aplicación de paraquat, 2,4-D,

glifosato, paratión metílico, fosfuro de aluminio, monocrotofos y lambda cialotrina

son uno de los principales plaguicidas que se usan en los cultivos de maíz

(Hernández et al., 2019a).

Por otra parte, Sinaloa es el segundo productor a nivel nacional de papa,

seguido de Sonora, con una superficie sembrada de 13,333 ha y un rendimiento de

386,498 ton/ha (SIAP, 2018). El cultivo de papa a nivel mundial es una de las

actividades agrícolas que consume más plaguicidas por hectárea. CIP y FAO, el

alto consumo de plaguicidas es porque cultivo de papa está expuesto al ataque de

diferentes patógenos, plagas y malezas, la mayoría de las cuales aumenta en

condiciones de alta humedad (Ramírez et al., 2014b).

La superficie sembrada de trigo a nivel nacional, para el ciclo otoño-invierno

2017/18, es de 467 mil 319 ha (SIAP, 2018). En el estado de Sonora en el año 2018,

se registra 602,947 ha de superficie sembradas representando 36.9% de cultivos

sembrados de trigo. Los cultivos de maíz y trigo son fundamentales en la producción

agropecuaria mundial tanto por su importancia como alimentos básicos, además de

2

fuente de proteína. Los sistemas productivos de monocultivo como (maíz y trigo)

utilizados mayormente en la región noroeste, para mantener este sistema es

necesario utilización de productos fitosanitarios (agroquímicos como plaguicidas)

que permitan mantener la producción.

El volumen de producción de plaguicidas en México para 2017 fue de 59 157

ton (INEGI, 2018) y del total de plaguicidas utilizados en la zona noroeste, Sinaloa

se aplica cerca del 30% (Leyva et al., 2014). Están autorizados 183 ingredientes

activos de Plaguicidas Altamente Peligrosos (PAPs), los cuales representan el 33%

de los IA publicados en el Catálogo Oficial de Plaguicidas (CICOPLAFEST 2016).

Estos se pueden clasificar como extremadamente peligrosos y mortales si son

inhalados, así como carcinógenos, probables carcinógenos, mutagénicos,

bioacumulables, persistentes en agua, suelo o sedimento, y muy tóxicos en

organismos acuáticos y abejas.

Los estados de Sonora y Sinaloa utilizan entre un 40 y 50% de PAPs,

destacando por su alta toxicidad: paratión metílico, malatión, metamidofos,

clorpirifós, monocrotofos, paraquat, glifosato, carbofurán, metomilo, mancozeb,

clorotalonil, dimetoato, carbarilo, atrazina, fosfuro de aluminio, imidacloprid,

cipermetrina, lambda cialotrina y endosulfán (Hernández et al., 2018).

En 2019 el Instituto Nacional de Ecología y Cambio Climático, reporta un

panorama amplio y actual sobre las investigaciones y estudios que se han efectuado

en el país para detectar la presencia y cuantificar los niveles de plaguicidas en agua

superficial, agua subterránea y suelo en 125 sitios localizados en 23 estados de la

república, la mayoría de ellos en los estados con mayor actividad agrícola como

Sinaloa y Sonora. Entre todos los sitios identificados se reporta el Valle de Culiacán,

una zona con intensa actividad agrícola de Sinaloa, el mayor número de plaguicidas

detectados, con 31 ingredientes activos y algunos metabolitos.

La acumulación de estos plaguicidas en el ambiente, por diversos procesos,

puede disminuir la capacidad del suelo afectando sus funciones de producción

biológica, protección ambiental y sustento de la salud humana (Vallejo, 2013). Por

3

lo que, en los últimos años se ha dirigido hacia una agricultura sostenible, para

encontrar soluciones biológicas en tema de la degradación de plaguicidas.

Los plaguicidas sus metabolitos son biodegradados del medio ambiente por

microorganismos o completamente biodegradados por un consorcio microbiano

(Ortiz et al., 2013). Esta característica de tolerar y degradar de los microorganismos

está asociada con su adaptación (a largo plazo) a ambientes altamente impactados

por estos contaminantes. Los microbios comúnmente identificados para la

biorremediación de plaguicidas son Pseudomonas sp., Bacillus sp., Klebsiella sp.,

Pandoraea sp., Phanerochaete chrysosporium y Mycobacterium sp. (Odukkathil y

Vasudevan 2013). Dado a que las bacterias podrían inducir fácilmente cepas

mutantes, teniendo así capacidad bioquímica para un entorno adaptativo, y por lo

cual se podrían realizar un estudio más profundo (Racke et al., 1996; Oliveira et al.,

2015).

Bacillus cereus CB4 con capacidad de degradar concentraciones hasta de

12 g/L (12,000 ppm), e identificaron vías metabólicas mediante la actividad de CP

liasa y la actividad de glifosato oxidorreductasa degradando el glifosato a AMPA,

glioxilato, sarcosina, glicina y formaldehído como productos (Fan et al., 2012). Los

consorcios de tres microorganismos (Brevibacterium frigoritolerans, Bacillus

aerophilus y Pseudomonas fulva) podrían degradar el forato (entre 97.65 y 98.31

%) a concentraciones de 100, 200 y 300 mg/kg se encontró en suelos inoculados

con cultivos mixtos. (Villaverde et al., 2017). Por lo que, los microorganismos y

consorcios aislados de suelos impactados por plaguicidas, se consideran como

mejores y efectivos porque tienen una mayor adaptabilidad en una región geográfica

particular (Verma et al., 2014).

Fang et al. (2014), reportaron mediante análisis metagenómico la abundancia

y diversidad de genes lip y mnp, que codifican para la peroxidasa, y el gen carA,

que codifica para la lacasa, detectándose como los genes dominantes para la

degradación de contaminantes orgánicos. Los genes hdt, hdg y atzB, que codifican

hidratasa, deshalogenasa y etilaminohidrolasa, fueron los genes más abundantes

involucrados en la degradación diclorodifeniltricloroetano (DDT),

4

hexaclorociclohexano (HCH) y atrazina (ATZ) en agua dulce y sedimentos marinos,

los conjuntos de datos se derivaron utilizando Illumina secuenciación de alto

rendimiento y se basaron en BLAST.

Debido a la necesidad de resolver problema de acumulación de estos

agroquímicos en los diferentes ambientes, es importante buscar soluciones

sustentables, se propone en el presente trabajo identificar y caracterizar cepas

aisladas de suelos agrícolas con capacidad de tolerancia a diferentes plaguicidas

aplicados en el ámbito agrícola (glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós) ya

que la evolución microbiana y los procesos de biorremediación presentan un

equilibrio natural entre ellas, para diseñar consorcios artificial o natural con

potencial de tolerancia al conjunto de esta moléculas, se requiere interpretar la

interacción entre los integrantes del consorcio artificial o natural con ayuda de las

nuevas herramientas “omicas” como metagenómica funcional dirigida a genes

asociados a la degradación, es posible realizar estudios más profundos y dirigidos

pudiendo descifrar vías metabólicas, ya que es necesario conocer la actividad

enzimática de los organismos que le permite utilizar dichos xenobióticos

(plaguicidas) como única fuente de carbono, energía o nutriente.

5

II. ANTECEDENTES

2.1 Agricultura en el noroeste de México

La agricultura es una de las actividades económicas con el crecimiento más

acelerado en los últimos años a nivel mundo. En 2018, SIAP (Servicio de

Información Agroalimentaria y Pesquera) reporta 21.2 millones de hectáreas de

superficie sembradas y en las que se cosecharon 20.3 millones de hectáreas, por

lo que la agricultura en nuestro país es más que un sector productor importante,

según datos del (SIAP) el campo mexicano se ubica entre las 12 economías con

mayor producción agrícola en el mundo y en la tercera posición en América Latina

(FAO, 2016; SIAP, 2018).

Actualmente, el sector agrícola genera 8.1% del PIB primario, reportando

SIAP en 2018 un valor de producción de este sector por 634, 955 millones de pesos,

representando la región noroeste de México el 20.9% de esta producción, esto

debido a la agricultura de riego, que es llevada a cabo por empresas agrícolas cuyo

objetivo es la producción comercial de grandes volúmenes, esta actividad se

encuentra en los Estados del norte de México utilizando gran infraestructura

(CEDRSSA, 2017). Por tanto, para mantener esta producción es necesario atender

una problemática prioritaria en la agricultura, la cual ha sido la presencia de plagas

en los cultivos, es decir, organismos que interfieren el desarrollo del producto y con

el bienestar humano, lo cuales se combaten regularmente con el uso de

agroquímicos como los plaguicidas. En México, durante varias décadas ha

prevalecido el principal modelo desarrollo agrícola, el cual se ha basado en la

aplicación de plaguicidas, además de otros insumos para garantizar y proteger los

cultivos. Esto ha sido así sobre todo en los estados del norte de la república, como

Sinaloa y Sonora, representando una importante producción agrícola. En el año

2018 Sinaloa ocupa el segundo lugar con una producción de 12,604,945 toneladas

con un valor de 54,166 millones de pesos, con lo que respecta a Sonora este

representa el quinto lugar de los estados con mayor producción aportando

8,438,928 toneladas con un valor de 44,915 millones de pesos (SIAP, 2018; INECC,

2019).

6

2.1.1 Principales Cultivos en Sinaloa

2.1.1.1 Cultivo Maíz (Zea mays)

En el año 2018 Sinaloa cultivó 1,117103 ha, de las cuales 683,826 ha se

destinaron a cultivos de granos generando una producción total de 6,410,871

toneladas de alimento con un valor de 25,114 millones de pesos, dentro de los

cultivos de grano, tan solo el maíz representa el 41% de valor total de producción

del estado en ese mismo año. Recordando que, Sinaloa ocupa el tercer estado con

mayor producción aportando el 8.5% al total nacional (SIAP, 2018). Por lo que, el

estado ocupa el 1ra posición a nivel nacional en la producción de maíz con un

volumen de producción de 5,818,056 toneladas, participando así con un 21.41% a

nivel nacional.

El uso de paquetes tecnológicos basados principalmente en insumos tipo

fertilizantes y plaguicidas químicos van en aumento (Hernández et al., 2019b). En

particular, el cultivo de maíz se aplica principalmente paraquat, 2,4-D, glifosato,

paratión metílico, fosfuro de aluminio, monocrotofos y lambda cialotrina (Bernardino

et al., 2017). El cultivos de maíz durante y posterior a su cosecha requiere la

aplicación de estos plaguicidas, representando un riesgo para la salud y el medio

ambiente, por consiguiente, la detección adecuada de los residuos de este tipo de

sustancias es de gran interés para minimizar el impacto negativo de los plaguicidas

en la salud y calidad de los productos agrícolas (Hernández et al., 2019a).

2.1.1.2 Cultivo de papa (Solanum tuberosum L.)

Sinaloa es el segundo productor a nivel nacional de papa, seguido de Sonora,

con una superficie sembrada de 13,333 ha y un rendimiento de 386,498 ton/ha

(SIAP, 2018). El cultivo de papa (Solanum tuberosum L.) a nivel mundial es una de

las actividades agrícolas que consume más plaguicidas por hectárea (Ramírez-

Muñoz et al., 2014a). Según CIP y FAO (2008), el alto uso de plaguicidas es debido

a que el cultivo de papa está expuesto al ataque de diferentes patógenos, plagas y

malezas, la mayoría de las cuales se incrementan en condiciones de alta humedad.

7

2.1.2 Principal cultivo en Sonora

2.1.2.1 Cultivo de Trigo (Triticum sp.)

La superficie sembrada de trigo a nivel nacional, para el ciclo otoño-invierno

2017/18, es de 467 mil 319 ha de las cuales se han cosechado 465 mil 997 (99.7%),

con una producción de 2 millones 802 mil 008 toneladas (SIAP-SAGARPA, 2018).

En el estado de Sonora en el año 2018, se registra 602,947 ha de superficie

sembradas representando 36.9% de cultivos sembrados de trigo, generando una

producción de 1,449,714 toneladas, un rendimiento de 6.49 (udm/ha), con un valor

de producción de 5,738,794 millones de pesos. El 83% de la producción de trigo en

la entidad es del tipo cristalino y el 17.0% restante es panificable (SIAP-SAGARPA,

2018).

Las principales enfermedades que atacan a los cultivos de trigo son causadas

por hongos, entre ellas la fusariosis o “golpe blanco” de la espiga, cuyo agente

causal es Fusarium graminearum, afectando el rendimiento. El control químico para

Fusarium se basa en la aplicación de fungicidas del grupo de los triazoles, que se

aplican durante la antesis de las espigas (Strada et al., 2012)

Por otra parte, este tipo de cultivos también se ve afectado por ataque de

plagas como el pulgón de cogollo y cultivos aislados con pulgón de la espiga,

aplicando principalmente insecticidas de los grupos organofosforados y piretroides.

Los plaguicidas organofosforados (OPP), como un pesticida económico, estable y

eficiente, se usan general y ampliamente en la producción agrícola en el mundo.

Los OPP pueden inhibir la actividad de la acetilcolinesterasa y, por lo tanto, se

acumula acetilcolina en el cuerpo, lo que puede tener un efecto grave en el sistema

nervioso central, puede causar síntomas de intoxicación e incluso provocar la

muerte. Debido a su toxicidad y abuso, la contaminación del agua y la tierra por los

OPP también se ha convertido en un problema ambiental grave, que en todo

momento amenaza la vida de las personas (Liu et al., 2018).

8

Los cultivos de maíz y trigo son de importancia a nivel mundial dado que

forman parte los alimentos básicos, además de fuente de proteína para

aproximadamente el 70% de la población humana en el mundo (Strada et al., 2012).

2.2 Control de plagas

La FAO (2016) define el término plaga como “cualquier especie, raza o biotipo

vegetal o animal, o agente patógeno dañino para las plantas o productos vegetales”.

Las pérdidas en la producción agrícola mundial ocasionada por plagas se estiman

una fluctúan entre 20 y 40%, causando pérdidas económicas de miles de millones

de dólares al año. Además, la FAO prevé la necesidad mundial de producir 60%

más de alimentos para el sustento de una población más numerosa en todo el

planeta (Zepeda, 2018). Para 2050, la agricultura tendrá que continuar

suministrando 80% de los alimentos de todo el mundo, minimizar las pérdidas de

productos del campo causadas por las plagas de los cultivos; por consiguiente, es

imprescindible para saciar las necesidades futuras de alimentos (FAO, 2011).

Por tanto, en los últimos años el control de plagas se ha convertido en uno

de los retos de mayor importante en la actividad agroproductiva. Existen diversos

tipos de tácticas que pueden actuar preventiva y/o curativamente para el control de

plagas las cuales pueden ser; cultural, mecánico, físico, biológico, genético y

químico (Zepeda, 2018).

Pese a cada una de las iniciativas, el agricultor sigue eligiendo un limitado

número de alternativas para el control de plagas, basados aun mayormente en la

aplicación de plaguicidas químicos impulsados por la revolución verde, sin ni una

capacitación, monitoreo y organización entre productores, gobiernos y

especialistas, la utilización de plaguicidas tuvo un incremento exponencial en las

últimas décadas, creándose una dependencia casi total en los procedimientos

químicos de defensa (Zepeda y Zepeda, 2018). Resultando así, efectos colaterales

negativos afectando la salud humana en forma de intoxicaciones agudas y crónicas

en las poblaciones, así como también en el medio ambiente, comprometiendo la

sostenibilidad de los sistemas agrícolas (Zepeda y Zepeda, 2018).

9

2.3 Generalidades Plaguicida

Los plaguicidas son sustancias o mezcla de sustancias liberadas en el medio

ambiente de forma intensiva para prevenir, destruir, repelar, atraer o controlar

plagas y enfermedades incluidas las especies no deseadas de plantas o animales.

Estos se pueden aplicar durante la etapa de producción almacenamiento,

transporte, distribución y en el procesamiento de alimentos (FAO y OMS,1997;

Yamada, 2016b). Por otro lado, los plaguicidas incluyen además otras sustancias

como reguladores del crecimiento de las plantas, defoliadores, desecantes, agentes

diluyentes de la fruta, inhibidores de germinación y sustancias aplicadas a los

cultivos antes o después de la cosecha para protegerlos del deterioro durante el

transporte y el almacenamiento (Michlig, 2018).

El uso de estos agroquímicos ha aumentado la productividad agrícola, el

rendimiento y protección de los cultivos, garantizando así los alimentos e incrementa

los ingresos de los agricultores (Antonini y Argilés, 2017). El aumento de la

demanda de alimentos en los últimos años es por la crecente población que se

estima en 8.500 millones de personas para el 2030, por lo que ha intensificado el

uso de los plaguicidas (Clark y Tilman, 2017; Crist et al., 2017).

Para atender la demanda mundial de esas sustancias se estima que se han

desarrollado y registrado más de 6,400 ingredientes activos que, una vez

combinados con otros componentes y aditivos, representan más de 100 mil

formulaciones comerciales. El consumo promedio de insecticidas, herbicidas,

fungicidas y bactericidas entre 1990 a 2010 a nivel mundial fue de 342,000, 566,000

y 353,000 ton, respectivamente (Liu et al., 2015). En 1990 se reportaba un consumo

anual a nivel mundial por 2.29 t de plaguicidas, ya para el año 2017 se reporta 4.11

millones de tonelada (Figura 1 y 2), México es uno de los principales países

consumidores de plaguicidas reportando en ese mismo año 1.77 kg/ha con un

consumo total 47,128 ton (FAO, 2020).

10

Consumo anual total de plaguicidas (1990-2017) a nivel mundial.

Fuente: FAO, 2020.

11

Distribución del consumo anual para 2017 a nivel mundial

representado en toneladas. Fuente: FAO, 2020.

12

El mayor consumidor de plaguicidas es Europa, seguido de China y los

Estados Unidos (EE. UU.). Con lo que respecta a los países en desarrollo la

aplicación de estos agroquímicos representa aproximadamente el 25% del uso

mundial de plaguicidas en la agricultura, con una aplicación excepcionalmente alta

en vegetales (Bernhardt et al., 2017).

Por tanto, la aplicación desmedida de los plaguicidas a través del tiempo se

han acumulado estos en el medio ambiente, los cuales pueden persistir en

diferentes sistemas (Udeigwe et al., 2015). Estos residuos se han encontrado en

cereales, vegetales, frutas y miel, así como sus derivados; como jugos y el vino,

esto dependiendo de las buenas prácticas de los agricultores y procesadores (Heard

et al., 2017). Junto con eso, podemos mencionar la aplicación deficiente afecta a

organismos no objetivos como peces y otras especies acuáticas, polinizadores

naturales (abejas y mariposas), ganado, aves y microorganismos benéficos del

suelo (Buah et al., 2018).

2.4 Clasificación de los Plaguicidas

Los plaguicidas se pueden clasificar según los ingredientes activos, la

estructura química, el modo de acción y la toxicidad (Botitsi et al., 2017). Hay

plaguicidas orgánicos e inorgánicos. Los plaguicidas orgánicos son a base de

carbono, ya sean plaguicidas de materiales naturales o plaguicidas sintéticos a partir

de productos químicos orgánicos (Cantrell et al., 2012). Los plaguicidas inorgánicos

se derivan de compuestos minerales o químicos que se producen como depósitos

en la naturaleza, principalmente compuestos de antimonio, cobre, boro, flúor,

mercurio, selenio, talio, zinc y fósforo y azufre elemental (Patinha et al., 2018).

Además, los plaguicidas se clasifican en función de la toxicidad aguda oral y

dérmica (Tabla 1). Según la Organización Mundial de la Salud (2010), LD 50 es la

estimación estadística del número de miligramos (mg) de tóxico por kilogramo (kg)

de peso corporal requerido para matar al 50% de la población de animales en

estudio. La formulación de plaguicidas puede contener más de un ingrediente, como

un agente humectante de toxicidad significativa, entonces la clasificación debe

corresponder a la toxicidad de los ingredientes mezclados (OMS, 2009).

13

Según los ingredientes activos y las plagas objetivo, los plaguicidas tienen

diferentes modos de acción: interfieren con la síntesis de aminoácidos y proteínas,

sistema nervioso, división celular, producción de energía, respiración, regulación del

crecimiento o desarrollo, fotosíntesis, daño del ácido desoxirribonucleico (ADN) y

metilación, integridad de membrana o multisitio y en algún momento con

especificidad desconocida (Tabla 2).

Tabla 1. Clasificación de los plaguicidas en función de su toxicidad aguda

Clases

DL50 para ratas (mg/kg de peso corporal)

Oral Dérmico

I a Extremadamente peligroso <5 <50

I b Altamente peligroso 5-50 50-200

II Moderadamente peligroso 50-2,000 200-2,000

III Ligeramente peligroso Más de 2,000 Más de 2,000

U Es poco probable que produzca

peligro agudo

Más de 5,000

Fuente: Organización Mundial de la Saludo (2010)

14

Tabla 2. Clasificación por grupo químico y su modo de acción

Grupo químicos Modo de acción y efecto sobre las plagas

Organoclorado Modulador del canal de sodio y disruptor del sistema nervioso, que conduce a convulsiones y parálisis.

Organofosfato Inhibidores de la acetilcolinesterasa, que causan la falla del impulso nervioso a través de las sinapsis y provocan una contracción rápida de los músculos voluntarios, por lo tanto, parálisis y muerte.

Carbamatos Inhibidores de la acetilcolinesterasa, afecta el sistema nervioso y los músculos.

Piretroides Moduladores de canales de sodio; se une a los canales de sodio dependientes de voltaje para despolarizar los nervios. Potentes neurotoxinas y disruptor endocrino que conducen a parálisis.

Neonicotinoides El modulador competitivo del receptor nicotínico de acetilcolina se une a los receptores nicotínicos de acetilcolina que conducen a parálisis

Fenilpirazoles (Fiproles) Bloqueadores de los canales de cloruro activados por Gaba, que afectan los nervios y los músculos.

Compuestos organoestánnicos Efectos de disrupción endocrina. Además, inhibición de la fosforilación oxidativa.

Pirazol Afecta la respiración mitocondrial.

Derivados de triazina Afecta el ciclo de división celular que resulta en la muerte celular.

Compuestos de arsénico Predomina el daño del ADN y el efecto epigenético sobre la metilación del ADN.

Derivados de bipiridilio Afectan la fotosíntesis y el fotosistema.

Compuestos de cobre Actividad multisitio, principalmente daño en el ADN.

Derivados de nitrofenol Respiración que afecta la fosforilación oxidativa.

Buprofezina Inhibidores de la biosíntesis de quitina.

Imazamox Se dirige a la síntesis de ácidos nucleicos, aminoácidos y proteínas.

Propiconazol Desmetilación de C-14 en la biosíntesis de ergosterol, que conduce a la acumulación de metilesteroles C-14.

Avermectinas Modulador alostérico del canal de cloruro activado por glutamato, que afecta los nervios y los músculos causando parálisis.

Triflumezopirim Modulador competitivo del receptor de acetilcolina nicotínico, que actúa sobre los nervios y los músculos como un objetivo.

Diamidas (ciantraniliprol) Modulador del receptor de rianodina; actuando sobre los nervios y músculos como objetivo.

Fuente: (Zikankuba et al., 2019)

15

2.5 Plaguicida, Suelo, Medio Ambiente y Salud

Se han reportado impactos negativos relacionados a la aplicación constate

de ciertos plaguicidas afectando directamente las funciones del suelo. Por ejemplo,

algunos plaguicidas organoclorados (OCP) disminuyendo la fijación simbiótica de

nitrógeno, lo que provoca una disminución en la producción agrícola (Fox et al.,

2007). El informe de la FAO y el ITPS (Panel Técnico Intergubernamental sobre

Suelos), destaca la falta de conocimientos sobre la interacción entre plaguicidas y

suelo, principalmente en lo que se refiere a la contaminación del suelo por estos

(FAO y ITPS, 2017). A pesar de acciones internacionales para evaluar el riesgo

ecotoxicológico de los plaguicidas y controlar su uso y liberación al medio ambiente,

a través de los Convenios de Rotterdam y Estocolmo (PNUMA, 1998, 2001), estas

acuerdos pueden prevenir y controlar la contaminación del suelo, pero es necesario

aún interpretar las interacciones específicas de los plaguicidas con los componentes

del suelo, su movilidad en esta matriz y posible absorción por las plantas, así como

su efecto en la producción agrícola (Arias-Estévez et al., 2008).

Algunos plaguicidas se han encontrado muy estables y persistentes en el

medio ambiente como los organoclorados (OCP) utilizados popularmente durante

años para controlar plagas y enfermedades (Buah et al., 2018). Los plaguicidas

(OCP) aldrin, dieldrin, endosulfan, diclorodifeniltricloroetano (DDT),

hexaclorobenceno (HCB) y hexaclorociclohexano (HCH) pueden persistir en el

medio ambiente durante años después de la aplicación (Debnath y Khan, 2017).

Además, la mayoría de los plaguicidas tienden a ser liposoluble, ya que se han

reportado concentraciones en la leche, sangre y tejidos grasos que se acumulan en

la cadena alimentaria (Du et al., 2017); (Buah et al., 2018). La exposición contaste

a estos residuos pueden ocasionar efectos en la salud humana incluyendo dolor de

cabeza, irritación de la piel, picazón, mareos, inquietud, neurotoxicidad, dificultades

para respirar, pérdida del conocimiento, enfermedades crónicas, cáncer y la muerte

(Guyton et al., 2015; Evangelou et al., 2016).

A pesar de la poca información disponible respecto al uso de plaguicidas, se

sabe que en México están autorizados 183 ingredientes activos (IA) de Plaguicidas

16

Altamente Peligrosos (PAPs), los cuales representan el 33% de los IA publicados

en el Catálogo Oficial de Plaguicidas (CICOPLAFEST, 2016). Dichos IA se pueden

clasificar como extremadamente peligrosos y mortales si son inhalados, así como

carcinógenos, probables carcinógenos, mutagénicos, tóxicos en reproducción,

perturbadores endócrinos, bioacumulables, persistentes en agua, suelo o

sedimento, y tóxicos en organismos acuáticos y abejas. Los estados de Sonora y

Sinaloa utilizan entre un 40 y 50% de PAPs, destacando por su alta toxicidad:

paratión metílico, malatión, metamidofos, clorpirifós, monocrotofos, paraquat,

glifosato, carbofurán, metomilo, mancozeb, clorotalonil, dimetoato, carbarilo,

atrazina, 2,4-D, fosfuro de aluminio, imidacloprid, cipermetrina, lambda cialotrina y

endosulfán (Bejarano, 2017; García et al., 2018; Camarena et al., 2019).

Por consiguiente, el Instituto Nacional de Ecología y Cambio Climático

(INECC) en 2019, reporta un panorama amplio y actual sobre las investigaciones y

estudios que se han efectuado en el país para detectar la presencia y cuantificar los

niveles de plaguicidas en agua superficial, agua subterránea y suelo en 125 sitios

de México (Figura 3). Estos sitios se localizan en 23 estados de la república, la

mayoría de ellos en los estados con mayor actividad agrícola siendo Sinaloa y

Sonora, mientras que Chiapas es un estado con alta incidencia de enfermedades

transmitidas por vectores. Entre todos los sitios identificados se reporta el Valle de

Culiacán, una zona con intensa actividad agrícola en el Estado de Sinaloa, el mayor

número de plaguicidas detectados, con 31 ingredientes activos y algunos

metabolitos.

17

Localización de los sitios identificados en los que se reporta la

presencia y niveles medidos de plaguicidas. Fuente: (INECC, 2019)

18

2.6 Plaguicidas seleccionados

2.6.1 Glifosato

Los herbicidas son formulaciones químicas ampliamente utilizadas para

controlar de maleza y gramíneas anuales de hoja ancha que compiten con los

cultivos. Sin embargo, en las últimas décadas, los herbicidas también se usan para

el pretratamiento de tierras agrícolas y su aplicación se ha incrementado mediante

el cultivos genéticamente modificados tolerantes a herbicidas que pueden

metabolizar concentraciones elevadas (Powles, 2014).

El glifosato, nombre IUPAC [Ácido 2- (fosfonometilamino) acético] es el

ingrediente activo no selectivo que se usa como el herbicida más popular y de

amplio espectro, en los campos de producción agrícola desde 1974 (Figura 4) (Gill

et al., 2017). Después de 30 años de aplicación, representa el herbicida más exitoso

de la historia. Tiene un enlace carbono-fósforo (C-P) muy estable y una alta

solubilidad en agua (12000 mg/L). A pesar de su estabilidad, una vez dispersado en

el medio ambiente tiene una vida media en el suelo ligeramente degradable de 8-

280 días, dependiendo del tipo de suelo, la técnica de procesamiento, las

condiciones climáticas y otros factores ambientales. Por lo que, puede acumularse

en el suelo y agua, este es toxico para plantas, animales y bacterias, además los

residuos de herbicidas utilizados en cultivos anteriores pueden causar fitotoxicidad

en los cultivos de rotación, amenazando la seguridad de la producción de alimentos

(Duke y Powles, 2008; Zhao et al., 2015).

19

Estructura química glifosato; nombre IUPAC [Ácido 2-

(fosfonometilamino) acético]. Fuente: PubChem

20

2.6.1.1 Impacto por el uso de Glifosato

El uso intensivo de glifosato (GP) ha resultado en un aumento de riesgos

crónicos y remotos para el humano y el medio ambiente (Wang et al., 2016). Las

prácticas de aplicación inadecuadas y la sobrepulverización dan como resultado

una presencia generalizada en ambientes acuáticos y terrestres (Zhan, Feng, et al.,

2018). El glifosato a pesar de que es considerado ligeramente degradable, es

bastante resistente a la degradación debido al enlace C-P en la molécula (Chekan

et al., 2016). Estos se unen a las partículas del suelo y se acumula en la capa

superior causando cambios estructurales en la comunidad microbiana inhibiendo el

crecimiento y facilitar el aumento de hongos fitopatógenos (Van Bruggen et al.,

2018a).

Los herbicidas que contienen glifosato se adsorben a la arcilla y la materia

orgánica, frenando su degradación por microorganismos del suelo y provocando

con el tiempo la acumulación en los suelos (Cassigneul et al., 2016; Okada et al.,

2016). En consecuencia, se puede encontrar en aguas subterráneas, aguas

superficiales y sedimentos (Lupi et al., 2015). Rendon-von y Dzul, (2017) reportan

en México concentraciones de glifosato en muestras de agua subterránea de hasta

1.42 μg/l. Sin embargo, este se descompone en el suelo por en presencia de

microrganismos (Van Bruggen et al., 2018b).

Debido a la aplicación a gran escala y su acumulación en el medio ambiente

y en productos comestibles, en los últimos años estos plaguicidas han generado

efectos secundarios nocivos con respecto a la calidad del suelo y agua, y salud de

plantas, animales y humanos (Zhang et al., 2017). Dado a informes actuales por la

Agencia Internacional de Investigación contra el Cáncer (IARC), la Organización

Mundial de la Salud reclasificó el herbicida glifosato (categoría 2A) como

probablemente cancerígeno en ser humano (IARC, 2015; Bai y Ogbourne, 2016).

2.6.1.2 Degradación de glifosato por microorganismos

El catabolismo microbiano es una vía importante para la disipación de

herbicidas en el medio ambiente. A través del tiempo se han aislado y

21

caracterizados una variedad de microorganismos capaces de degradar una

diversidad de herbicidas. Sobre la base de estos recursos microbianos, se han

descifrado algunas rutas metabólicas y se han caracterizado genes y enzimas

involucradas en el catabolismo de herbicidas (Huang et al., 2017a).

La degradación del glifosato en suelos se debe principalmente al

cometabolismo microbiano, ya que la gran mayoría utilizan a este herbicida como

unida fuente de carbono (Sviridov et al., 2015). Las bacterias se encuentran entre

los microorganismos más comúnmente estudiados por su capacidad de

degradación del glifosato, ya que estudios in vitro han reportado que pueden usarlo

como fuente de sustancias inorgánicas P (Pi) (Kononova y Nesmeyanova, 2002;

Singh y Walker, 2006; Sviridov et al., 2015). El glifosato se metaboliza a través de

una de las dos vías conocidas, la vía C-P liasa y la vía de glifosato oxidorreductasa,

GOR (Huang et al., 2017a). En la ruta C-P liasa, el glifosato se transporta y escinde

por medio de un conjunto de aproximadamente 14 proteínas codificadas en el

operón phn, produciendo una molécula que contiene P (5-fosforibosil 1-difosfato,

PRPP) y N- metilglicina (sarcosina) (Figura 5). Se ha demostrado que varias

especies o cepas microbianas pueden utilizar el glifosato a través de esta vía,

utilizándolo como fuente de fosfato inorgánico. Incluyen Ochrobactrum anthropi

ATCC 49188 y así como también aislado de suelo contaminado con glifosato;

Sinorhizobium meliloti, Agrobacterium tumefaciens, Burkholderia pseudomallei, y

varias especies de cianobacterias, incluyendo Nostobacteria sp. PCC 7120.

La vía GOR produce glioxilato y ácido aminometilfosfónico (AMPA) que aún

retiene el enlace C-P, y debe canalizarse hacia la vía C-P liasa para una

degradación completa (Kononova y Nesmeyanova, 2002; Jochimsen et al., 2011;

Sviridov et al., 2012)

22

Vías metabólicas del glifosato en bacterias

23

Así, la ruta de la C-P liasa es crítica en la mineralización del glifosato como

un paso central y de conexión en ambas rutas metabólicas conocidas descritas para

este compuesto (Huang et al., 2017b). En la vía de la C-P liasa, se requiere la

expresión de 14 polipéptidos, especificados por el operón phnCDEFGHIJKLMNOP,

para la descomposición completa de los fosfonatos. Entre las muchas proteínas

involucradas, el complejo central phnGHIJK parece tener un papel clave en la

división del enlace C-P, actuando específicamente como C-P liasa (Hove et al.,

2014). Una evolución conservadora considerable en las secuencias alineadas de la

proteína phnJ en comparación con otras proteínas Phn, sugiere que esta es la

enzima clave en la vía (Parker et al., 1999; Jochimsen et al., 2011).

Fan et al. (2012) reportaron a Bacillus cerus CB4 con capacidad de degradar

concentraciones hasta 12 g/L (12,000 ppm), como también estudiaron la

metabolización del glifosato indicando ambas vías mediante la actividad de CP liasa

y la actividad de glifosato oxidorreductasa degradando el glifosato a AMPA,

glioxilato, sarcosina, glicina y formaldehído como productos.

La permanencia de GP en el suelo, depende de la tasa de degradación

química, fotodegradación y microbiana. Para los procesos de biorremediación de

suelos, las bacterias y los hongos son los microorganismos mayormente

caracterizados por su capacidad de tolerar y degradar estos compuestos. Los

hongos filamentosos presentan ventajas sobre otros microorganismos como las

bacterias y levaduras, por el crecimiento micelial y enzimas extracelulares. Algunos

de los estudios recientes se han centrado en los procesos y las rutas metabólicas

al identificar los metabolitos intermedios de algunos plaguicidas en relación con los

hongos, se ha reportado que siguen diferentes procesos durante la biodegradación

de diferentes plaguicidas (Maqbool et al., 2016). Por ejemplo, algunas de las cepas

de hongos que pertenecen a los ascomicetos, basidiomicetos y cigomicetos pueden

transformar los plaguicidas a través de hidroxilación y desmetilación polar (Ellegaard

et al., 2013).

Aluffi et al. (2020), valoraron la tolerancia de diferentes géneros de hongos 5,

20, 50 y 100 mM (equivalente a 0,85, 3,4, 8,4 y 16,9 mg / ml ó 850, 3400, 8400,

24

16900 ppm respectivamente) concentraciones de glifosato, encontrando el valor

más alto (>1000 mM) de concentración efectiva de herbicida que causó un 50% de

inhibición del crecimiento (CE50), para los aislados de Trichoderma y Sterilia spp.

con valores de CE50 de 100 mM (16,900 ppm), mientras que Aspergillus spp. y

Mucor presentaron valores de CE50 entre 50 mM (8,400 ppm) y 100 mM (16,900

ppm), rendimiento de crecimiento en los medios suplementados con GP después

de un período de aclimatación variable.

2.6.2 Carbofurán

Carbofurán, nombre IUPAC [2,3-dihidro-2,2-dimetilbenzofuran-7-il

metilcarbamato] (Figura 9). Este plaguicida es usado ampliamente como

insecticida, nematicida y acaricida, pertenece al grupo químico de los carbamatos y

a la categoría IB. Altamente peligroso (OMS); I. Altamente tóxico (EPA). Los

carbamatos tienen como acción principal la inhibición de la enzima

acetilcolinesterasa, tanto la colinesterasa eritrocitica, estos actúan por

carbamilación de la enzima y esa unión es más débil e inestable que la unión

generada por una intoxicación con organofosforados, lo que la hace reversible; lo

anterior causa la perdida de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa

ocasionando un síndrome colinérgico (Öztürk et al., 2016).

En los últimos años se ha prohibido su aplicación en la Unión Europea y

Canadá, debido a su alta toxicidad y alto potencial de lixiviación al agua subterránea,

sin embargo, todavía se usa en países como Kenia, Vietnam y Corea del Sur. En

México la Secretaría de Economía reportó, en el período de 2003 a 2019, los

plaguicidas con mayor cantidad importada son Paraquat, Cloropicrina, el Amitraz,

Carbofurán y Bromuro de metilo (INECC, 2019). En 2018, la Comisión Federal para

la Protección contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS), con la Industria de Protección

de Cultivos (PROCCYT), asociación a la que pertenece FMC Agroquímica de

México, y la Unión Mexicana de Fabricantes y Formuladores de Agroquímicos

(UMFFACC) acuerdan el retiro voluntario del mercado y la cancelación de los

Registros Sanitarios de todos los productos a base de carbofurán (Furadan ®).

25

Estructura química de carbofurán; nombre IUPAC [2,3-dihidro-2,2-

dimetilbenzofuran-7-il metilcarbamato] Fuente: PubChem

2.6.2.1 Impacto por el uso de Carbofurán

Aunque el carbofurán muestra eficiencia agronómica, este insecticida tiene

restricciones ambientales debido a los riesgos de contaminación. Un problema

frecuentemente asociado al carbofurán, es la muerte de los animales del bosque

como el caso que se notificó en el estado de Virginia observado por (Stinson et al.,

1994). La presencia continua de carbofurán en los canales de agua y ríos puede

causar daños graves, agudos o crónicos a los organismos acuáticos (Crepeau y

Kuivila, 2000). El uso de carbofurán en la agricultura está prohibido en algunos

países, debido a su toxicidad ecológica.

Aunque el carbofurán es químicamente inestable debido a la hidrólisis en el

medio ambiente, sus residuos a menudo se detectan en las aguas subterráneas

debido a su uso generalizado en el suelo y su alta fluidez (Campbell et al., 2004).

Por lo tanto, se ha generado una gran preocupación e interés con respecto al

comportamiento ambiental y los mecanismos de degradación del carbofurán (Yan

et al., 2018).

2.6.2.2 Degradación de carbofurán por microorganismos

El proceso de degradación de la molécula de carbofurán (2,3-dihidro-2,2-

dimetil-7-benzofuranol metilcarbamato) (representada como RX) ocurre cuando

26

reacciona con la molécula de agua originando un nuevo enlace C – N y rompiendo

un C – X enlace en la molécula original. La reacción neta es esencialmente un

desplazamiento directo de X por OH (Mabury y Crosby, 1996).

Existen varias técnicas de descontaminación disponibles para la eliminación

de estos contaminantes, aunque no todas son lo suficientemente eficientes como

para destruir los contaminantes. Los microorganismos juegan un papel importante

en la desintoxicación de compuestos xenobióticos, y pueden degradar estos

contaminantes a productos inocuos (principalmente CO2 y H2O) (Jiang et al.,

2006).(Tejada y Magallona, 1985) y (Rouchaud et al., 1990), han observado que los

principales metabolitos del carbofurán son el 3-cetocarbofurano (2,2-dimetil-3-oxo-

2,3-dihidro-1-benzofuran-6-il metilcarbamato), carbofuran-fenol (2,2- dimetil-2,3-

dihidro-1-benzofuran-7-ol) y 3-cetocarbofuran-fenol (7-hidroxi-2,2-dimetil-1-

benzofuran-3 (2 H ) -ona).

La biodegradación, especialmente la degradación microbiana, es el

mecanismo principal que conduce a la disipación de carbofurán. Hasta la fecha, se

han reportado algunos microorganismos que degradan el carbofurán de los géneros

de Achromobacterium, Flavobacterium, Pseudomonas, Sphingomonas,

Novosphingobium , Paracoccus y Cupriavidus (Tomasek y Karns, 1989; Yan et al.,

2007; Rousidou et al., 2016; Yan et al., 2018; Gupta et al., 2019). Entre ellos, solo

varias cepas podrían usar carbofurán como fuente de carbono para el crecimiento,

incluida Sphingomonas sp. cepa CF06, Novosphingobium sp. KN65.2 y Cupriavidus

sp. ISTL7 (Feng et al., 1997; Nguyen et al., 2014; Gupta et al., 2019). Por lo que,

solo tres genes han sido clonados e identificados funcionalmente como

responsables de la hidrólisis del carbofurán, incluidos mcd (Tomasek y Karns,

1989), cehA (Hashimoto et al., 2002) y mcbA (Trivedi et al., 2016; Zhu et al., 2018).

Entre estos tres genes, cehA es el gen más antiguo reportado y el más alojado.

Aunque se ha informado que existe cehA en cepas de diferentes géneros, su

mecanismo de hidrólisis aún necesita ser investigado (Jiang et al., 2020).

27

2.6.3 Permetrina

Los piretroides sintéticos son análogos de la piretrina natural que se

encuentra en la planta Chrysanthemum cinerariaefolium de la familia Asteraceae

(Smith y Stratton, 1986). Durante las últimas cuatro décadas, los piretroides se han

utilizado globalmente para el manejo y control de plagas en la agricultura,

silvicultura, áreas sanitarias y hogares. En comparación con las piretrinas naturales,

los piretroides sintéticos son más estables a la luz solar directa y son

significativamente más efectivos contra una amplia gama de insectos. Estas

propiedades los hicieron mucho más adecuados para su uso en la agricultura

(Laskowski, 2002). Hoy en día, los piretroides contribuyen con más del 25% del

mercado mundial de plaguicidas (Chen et al., 2011).

Estos se clasifican como insecticidas de Tipo I y Tipo II; los piretroides tipo I

carecen de un grupo ciano y tienen una gran diversidad estructural (aletrina,

bifentrina, d-fenotrina, permetrina, resmetrina, teflutrina y tetrametrina), la

clasificación tipo II con un grupo α-ciano son más neurotóxicos que los piretroides

tipo I e incluyen ciflutrina, cihalotrina, cipermetrina, deltametrina, fenvalerato,

fenpropatina, flucitrina, flumetrina, fluvalinato y tralometrina (Kaviraj y Gupta, 2014).

Dentro de los piretroides con mayor estabilidad ambiental y actividad

insecticida es permetrina, nombre IUPAC [3- (2,2-dicloroetenil) -2,2-

dimetilciclopropano-1-carboxilato de (3-fenoxifenil) metilo] (Figura 6). Estos actúan

a nivel contacto, estomacal, no sistémico, con leve efecto repelente, bloquea la

conducción del estímulo nervioso. Es más estable en medios ácidos que en

alcalinos, mayor estabilidad a pH 4; DT50 50 d a pH 9; estable a pH 5 y 7 a 25ºC y

al calor (>2 años a 50ºC). Los residuos de piretroides no son extremadamente

tóxicos para los humanos, pero su exposición a largo plazo puede afectar la calidad

del semen, el ADN espermático y las hormonas reproductivas (Han et al., 2008).

Por lo que, permetrina se clasifica en el grupo IA. Extremadamente peligroso (OMS);

I. Altamente tóxico (EPA).

28

Estructura molecular de permetrina; nombre IUPAC [3- (2,2-

dicloroetenil) -2,2-dimetilciclopropano-1-carboxilato de (3-fenoxifenil) metilo].

Fuente: PubChaem.

2.6.3.1 Impacto por el uso de Permetrina

Los piretroides son propiedades altamente hidrófobas y absorbentes,

propiedades que facilitan su entrada directa o indirecta en los ecosistemas naturales

para amenazar la integridad ecológica acuática y terrestre. El uso generalizado y la

aplicación constante de permetrina en los suelos agrícolas, ha generado la

acumulación en diferentes entornos, especialmente en el suelo, debido que se unen

fuertemente a las partículas del suelo y la materia orgánica. Por lo que les permite

filtrarse al agua subterránea y formar residuos de estos compuestos (Antwi y Reddy,

2015).

Cycoń et al. (2014), encontraron la mayor disipación de piretroides en los

suelos que se caracteriza por el mayor contenido de materia orgánica. Estos

resultados mostraron que la materia orgánica y el contenido de arcilla son los

principales factores que controlan la biodisponibilidad de los piretroides para los

microorganismos. Las propiedades lipofílicas de los piretroides resultan en su fuerte

29

tendencia a unirse a varios componentes orgánicos y no orgánicos del suelo y estos

insecticidas pueden persistir en los suelos durante un largo período.

Los insecticidas piretroides son beneficiosos para el manejo de plagas

agrícolas y domésticas, pero su aplicación debe monitorearse cuidadosamente para

evitar impactos tóxicos relacionados con el medio ambiente y la salud. Se deben

explorar y optimizar técnicas eficientes para eliminar los residuos de piretroides y

remediar los ambientes contaminados. Hasta la fecha, se han utilizado diversos

enfoques para descomponer productos químicos persistentes a través de procesos

biológicos, químicos, físicos y fisicoquímicos (Marican y Durán, 2018).

2.6.3.2 Degradación de permetrina por microorganismos

La eficiencia de degradación de los piretroides depende no solo de la

actividad catabólica de los microorganismos del suelo, sino también en gran medida

de las diferentes propiedades del suelo, es decir, la textura del suelo, el contenido

de materia orgánica, la humedad, el pH y la temperatura (Mariusz Cycoń y

Piotrowska-Seget, 2016).

Los piretroides representativos de Tipo I y Tipo II contienen un residuo de

ácido ciclopropano carboxílico conectado al alcohol aromático. Hasta la fecha, se

han estudiado las vías de biodegradación de solo cuatro piretroides tipo I: aletrina,

bifentrina, D-fenotrina y permetrina (Chen et al., 2012; Yang et al., 2018; Zhan et al.,

2018) . Como se muestra en la Figura 7, los piretroides representativos de Tipo I

se degradan a ácido ciclopropano carboxílico y PBAlc, que se transforma en PBAld

para producir más ácido 1,2-bencenedicarboxílico o 1,2-bencenedicarboxílico butil

dacil éster (Yang et al., 2018).

30

Vías de degradación microbiana propuestas para piretroides tipo I

representativos. R1 representa diferentes grupos sustituyentes en los

piretroides tipo I. Fuente:(Zhan et al., 2020)

31

Las enzimas funcionales clave involucradas en la degradación de los

piretroides (Figura 8). PytZ, perteneciente a la familia VI de esterasa, se aisló de

Ochrobactrum antropic YZ-1 (Zhai et al., 2012). Sys410, perteneciente a la familia

de la esterasa V, se aisló de la biblioteca metagenómica de Turban Basin (Fan et al.,

2012). PytH, perteneciente a la carboxilesterasa, se aisló de Sphingobium sp. JZ-1

(Wang et al., 2009). La aminopeptidasa se aisló de Pseudomonas aeruginosa GF31

(Tang et al., 2017). EstP, perteneciente a la esterasa, se aisló de Klebsiella sp.

ZD112 (Wu et al., 2006) Est3385, perteneciente a la familia de esterasa I, fue

aislado de Rhodopseudomonas palustris PSB-S (Luo et al., 2018). EstZ,

perteneciente a la esterasa, se aisló de Pseudomonas aeruginosa PAO1 (datos no

publicados). Pye3, perteneciente a la familia de esterasa I, se aisló del metagenoma

del suelo vegetal (Li et al., 2008). PytY, perteneciente a la familia VI de esterasa, se

aisló de Ochrobactrum antropic YZ-1 (Ruan et al., 2013). Se aisló CMO,

perteneciente a la monooxigenasa, de Streptomyces sp. (Chen et al., 2013).

Árbol filogenético de enzimas funcionales clave involucradas en la

degradación de los piretroides.

32

Zhan et al. (2018), reportan A. baumannii ZH-14 capaz de utilizar una amplia

gama de permetrina sintéticos (SP) así como fuentes de alimentos, con la capacidad

excepcional de colonizar nichos ecológicos donde los nutrientes son limitados,

valoraron la degradación de SP reportando un 100% (50 mg/L)) dentro de 72 h,

concluyendo que esta cepa en particular degrada una concentración de 800 mg/L.

Por lo que, determinaron que esta cepa (ZH-14) degrada permetrina, a través de

una nueva vía metabólica con la formación de 3-fenoxibencenometanol, 3-

fenoxibenzaldhído y éster bis (2-metilpropil) del ácido 1,2-bencenedicarboxílico

como los principales metabolitos intermedios, que se transformaron aún más sin

persistencia producto acumulativo, lo que indica que la cepa bacteriana puede

albergar una vía metabólica completa para la degradación y el metabolismo de la

permetrina.

2.6.4 Clorporifós

Los organofosforados (OP) son ampliamente utilizados en aplicaciones

agrícolas y domésticas, posicionándose como uno de los principales en el mercado

internacional en el uso de insecticidas. Debido a su mecanismo de acción, el cual

inactiva de forma irreversible a la colinesterasa (Che) y su alta estimulación

colinérgica, durante décadas los OP proporcionan un control amplio y efectivo

contra las plagas, garantizando así el suministro mundial de alimentos y la salud

pública para una población en rápido crecimiento (Liu et al., 2018).

Clorpirifós, nombre IUPAC [dietoxi-sulfaniliden- (3,5,6-tricloropiridin-2-il) oxi-

λ 5 -fosfano] (Figura 10), pesticida organofosforado (OP) fue introducido por Dow

Chemical Company en 1965, como un pesticida de follaje para uso generalizado en

cultivos significativos y se ha utilizado comercialmente desde la década de 1960

(Das y Adhya, 2015). La formulación comercial de clorpirifós (CP) se realiza en

diversas formas, incluidos los concentrados emulsionables (EC), el polvo

humectable (WP) y los gránulos (GR). Los CP por su actividad insecticida de amplio

espectro contra plagas de artrópodos, los convierte en uno de los OP con mayor

consumo (Liu et al., 2018).

33

Estructura molecular de clorpirifós; nombre IUPAC [dietoxi-

sulfaniliden- (3,5,6-tricloropiridin-2-il) oxi-λ 5 -fosfano] Fuente: PubChaem.

2.6.4.1 Impacto por el uso de Clorpirifós

Las causas de acumulación, amortiguación, filtración, inactivación y

degradación del suelo por plaguicidas se ven considerablemente influenciadas por

la materia orgánica (Burauel y Baßmann, 2005). El suelo puede actuar como un

medio potencial de transporte de plaguicidas para contaminar el agua, el aire, suelo,

las plantas y los alimentos, impactando diferentes ecosistemas y la salud humana.

El movimiento de los plaguicidas en el suelo se produce por medio del flujo

intermedio, la lixiviación, el desbordamiento de la superficie, el drenaje subterráneo

y la transferencia de nutrientes minerales del suelo a los productos agrícolas

afectado la calidad de los alimentos (Dar et al., 2019a).

El clorpirifós es un pesticida de toxicidad moderada (Clase II) que tiene una

dosis letal mediana en mamíferos (DL 50) de aproximadamente 32–1000 mg/kg

(Organization, 2010). Existen evidencias de la acumulación de los

organofosforados, ya que se han detectado en suelo, agua, alimentos y fluidos a

nivel mundial. Se analizaron 45 muestras de maíz y soja procedentes del norte de

Italia para detectar residuos de plaguicidas, por lo que en 30 muestras se

encontraron hasta 12.4 mg/kg de clorpirifós (Marchis et al., 2012). En este mismo

34

sentido (Salas et al., 2003) realizaron un estudio para medir los residuos de

plaguicidas OP en la leche pasteurizada comercial de México. Se recogieron

muestras de tres marcas comerciales de supermercados y una marca de tiendas

gubernamentales. Los residuos de plaguicidas OP se encontraron en todas las

marcas, y se confirmó que cada marca contiene los residuos de uno o muchos

plaguicidas OP por encima de sus niveles de LMR.

Morales et al. (2017), detectaron diferentes tipos de plaguicidas

relativamente en baja concentración en muestras de agua dulce de México. Las

frecuencias de detección de plaguicidas OP en las muestras fueron, en orden

descendente, clorpirifós (28.5%)> diazinón (25%)> malatión (5.6%)> etion (1.4%)>

carbofenotión (0.7%)> metilparatión (0.7%), reportando concentración máxima de

(CP) de 0.0296 μg/L, 0.0163 μg/L y 0.0157 μg/L para los ríos Tamazula, Humaya y

Culiacán, respectivamente.

El análisis residual del pesticida OP, CP se trazó en las muestras de orina de

residentes urbanos y agricultores. La concentración residual máxima de PC en

muestras de residentes urbanos se detectó como 1.03 μg/g mientras que, en la

muestra de los agricultores, el análisis residual se realizó desde, antes de la

pulverización de plaguicidas hasta el tercer día después de la pulverización, que se

detectaron en los rangos de 2.45–7.66 μg/g (Wang et al., 2016).

Debido a su baja solubilidad en agua y alta sorción del suelo, su movilidad

fuera del sitio (como lixiviación y escorrentía superficial) a través y sobre el perfil del

suelo es limitada (Racke et al., 1996) lo que puede resultar en una alta acumulación

de residuos de clorpirifós por su aplicación intensiva y excesiva en cultivos

agrícolas. En las últimas décadas, la creciente evidencia indicó que la exposición

crónica al clorpirifós puede inducir efectos adversos en organismos no objetivo, lo

que potencialmente amenaza el equilibrio ecológico (Muturi et al., 2017; Zhang

et al., 2017). Además, la asociación entre la exposición al clorpirifós y múltiples

síndromes clínicos ha suscitado una gran preocupación, ya que la exposición aguda

a altos niveles de clorpirifós conduce a una crisis colinérgica en humanos y

35

animales, incluidos signos periféricos, efectos en el sistema nervioso central y

eventualmente convulsiones y muerte (Lu et al., 2015; Christen et al., 2017).

2.6.4.2 Degradación de clorpirifós por microrganismos

En el entorno natural, la degradación de clorpirifós puede ocurrir mediada por

evaporación, hidrólisis, oxidación, fotólisis y metabolismo microbiano después de la

aplicación directa al suelo (Racke et al., 1996; Lester et al., 2017). Lo

organofosforados a pesar de sus características fisicoquímicas, su baja persistencia

y degradación natural, estos son fácilmente solubles en agua pudiendo representar

un impacto al ecosistema y de igual forma causar graves problemas de salud.

Por tanto, la degradación de organofosforados ya sea por métodos biológicos

o fisicoquímicos, se ha investigado ampliamente en todo el mundo. Sin embargo, la

remediación biológica se ha estudiado en mayor proporción por la razón de que los

microorganismos hidrolizan a los OP más rápido que los procesos químicos y aun

diez veces más rápido que la degradación física (Ragnarsdottir, 2000), esto debido

a que los microorganismos en el medio ambiente puede utilizar a los OP como única

fuente de carbono, nitrógeno y fósforo, generalmente la hidrolisis de OP se lleva a

cabo en los enlaces (P-O) alquilo y arilo con ayuda de enzimas hidrolasa,

fosfotriesterasa y fosfatasa (Brajesh y Walker, 2006). Por lo que, podemos concluir

que la capacidad de la población microbiana para degradar estos contaminantes

esta conferida por genes catabólicos para permaneceré en números nichos

ecológicos, adquiriendo la fuerza de tolerancia y capacidad para ser utilizados en

procesos de biorremediación (Dar et al., 2019b).

El primer microorganismo con capacidad de degradación de OP se aisló e

identificado en 1973 como Flavobacterium sp. En consecuencia, seguido del

aislamiento e identificación de varios microbios como hongos, algas y

cianobacterias que pueden descomponer una amplia gama de OP (Dar et al.,

2019b).

La biodegradación de la CP se lleva a cabo tanto aeróbicamente como

anaeróbicamente por los microbios a través de dos vías principales de degradación,

36

es decir, catabolismo y co-metabolismo. El proceso catabólico implica la

descomposición completa de compuestos orgánicos complejos o sus fragmentos,

mientras que el proceso co-metabólico conduce a la degradación parcial de los

compuestos orgánicos, sin beneficio para el organismo (Yadav et al., 2016).

La degradación o descomposición de la CP en un entorno aeróbico, las

bacterias tienden a transformar CP en subproductos altamente electrofílicos, es

decir, CP-Oxon (dietil 3,5,6-tricloropiridin-2-il fosfato) o TCP (3,5,6-tricloro-2-

piridinol) y DETP (Dietil tiofosfato) mediante desulfuración oxidativa o desarilación,

respectivamente, con TCP como el metabolito más común. CP-Oxon se hidroliza

aún más a DEP (dietilfosfato) y TCP (Tiwari y Guha, 2014). Tiwari y Guha (2014)

llevaron a cabo el estudio de biodegradación de la PC en condiciones anaeróbicas

e informaron la producción de TCP y DETP durante la degradación de la PC, lo que

indica que en condiciones anaeróbicas la PC se hidroliza directamente a TCP y

libera DETP (Figura 10).

Las enzimas hidrolíticas esenciales organofosforado hidrolasa (OPH), que

comprende el diclorhidrato de O-fenilendiamina (OPD), la descarboxilasa de

pirofosfato de mevalonato (MPD), la hidroxilasa de metil paratión (MPH) ), etc.

(Zhang et al., 2017). El primer OPH fue aislado del plásmido de Pseudomonas

diminuta por Serdar et al. (1989). Mulbry y Karns, (1989), aislaron OPH que

comprende 1693 pares de bases que tienen un marco abierto de lectura. La cepa

Stenotrophomonas YC-1, con capacidad de degradación completa de CP a

concentraciones de 100 mg/kg. El gen mpd de esta bacteria se clonó con éxito y se

usó para la biorremediación de suelos contaminados (Yang et al., 2006) (Figura 11-

12).

Dar et al. (2019b), realizaron una revisión de literatura reportan diversas

cepas bacterianas pueden tolerar y degradar CP a concentraciones de 10 a 1000

mg/L. Sasikala et al. (2012) aislaron diferentes especies bacteriana generando un

consorcio con capacidad de degradación de CP a CP-oxón y dietilfosforotioato, bajo

las siguientes condiciones pH 7, temperatura 37ºC y concentraciones de 500 mg/L

o 500 ppm.

37

Vía propuesta para la degradación aeróbica de clorpirifós por

bacterias. Fuente: modificado de Singh y Walker, 2006; Reddy et al., 2012.

38

Vía propuesta para la degradación anaeróbica de clorpirifós

(Modificado de Tiwari y Guha, 2014).

39

2.7 Consorcios microbianos ambientales y sintéticos

El microbioma del suelo desempeña un papel principal en el funcionamiento

del ecosistema, participando en los procesos biogeoquímicos necesarios. Cualquier

cambio en el microbioma del suelo conduce a diferencias en las propiedades

fisicoquímicas del suelo, como la salinidad, el pH y el contenido orgánico, lo que

finalmente conduce a la infertilidad del suelo. Las comunidades microbianas del

suelo se consideran bioindicadores sensibles de la contaminación del suelo, ya que

son las primeras señales de cambios fisiológicos y fisioquímicos a largo plazo en el

suelo (Singh et al., 2020).

En la naturaleza, los microorganismos generalmente sobreviven en

comunidades complejas que contienen múltiples poblaciones que pueden

interactuar metabólicamente entre sí. Por lo que, la diferenciación funcional y el

intercambio de metabolitos durante las interacciones ecológicas, particularmente en

las relaciones de cooperación, permiten a las especies coexistentes reciclar los

nutrientes de manera eficiente y obtener una fuerte resistencia a las perturbaciones

ambientales (Kawaguchi et al., 2016). Así podemos definir a un consorcio como

grupos coexistentes de dos o más especies microbianas. Además, el cultivo de

poblaciones mixtas también presenta una mayor capacidad de resistencia a

cambios ambientales.

Esta interacción microbio-microbio, determinan la estabilidad y las funciones

de los consorcios, generando así combinaciones de efectos positivos, negativos y

neutrales entre dos especies, existen seis modos básicos de interacción:

mutualismo, comensalismo, parasitismo o depredación, competencia, amensalismo

y neutralismo (Faust y Raes, 2012). Es más probable que se logre un crecimiento

estable y robusto en consorcios basados en relaciones de cooperación, como

mutualismo y comensalismo.

Al comunicarse mediante el intercambio de metabolitos o señales, los

miembros de un consorcio coordinan sus actividades y se benefician mutuamente

a través de la división del trabajo, que permite a los consorcios microbianos tener la

capacidad de realizar funciones complejas y permite procesos paralelos o

40

secuenciales para la utilización de recursos. La diversidad de reacciones

bioquímicas en los consorcios aumenta la eficiencia general de la utilización de los

recursos y reduce la formación de subproductos (Che y Men, 2019a).

Las interacciones microbianas y las redes metabólicas que poseen los

consorcios microbianos ambientales pueden proporcionar orientación para el diseño

y la optimización de consorcios microbianos sintéticos estables, robustos y

eficientes para una variedad de aplicaciones de ingeniería, como la biosíntesis y la

biodegradación (Che y Men, 2019b). Podemos definir a un consorcio microbiano

sintético como a las comunidades microbianas simples diseñadas regularmente por

2 a 3 especies. Los consorcios microbianos sintéticos exitosos no sólo cumplen las

funciones deseadas, sino que también sostienen el crecimiento celular de manera

estable y robusta (Villaverde et al., 2018). Se forman relaciones más estables entre

los miembros del consorcio cuando dependen en gran medida unos de otros. Las

interacciones microbianas que conducen a la interdependencia y las relaciones

estables incluyen la alimentación cruzada, la desintoxicación y la formación de

biopelículas, que son importantes principios de diseño de los consorcios (Men et al.,

2014; Shahab et al., 2018). Normalmente hay dos estrategias para seleccionar a los

miembros del consorcio: a) de arriba abajo (de complejo a simple): los miembros

del consorcio son los protagonistas clave identificados de una comunidad

microbiana compleja específica (Zuroff Curtis, 2012; Che y Men, 2019b) (Figura

13a), y b) de abajo arriba (de simple a complejo): los miembros del consorcio se

seleccionan de un conjunto inclusivo de microorganismos aislados y/o manipulados,

que pueden poseer los rasgos deseados pero no necesariamente tienen orígenes

ambientales comunes (Kong et al., 2018) (Figura 13b).

41

Estrategias para seleccionar a los miembros del consorcio; (a) de

arriba abajo (de complejo a simple) y (b) de abajo arriba (de simple a complejo).

Kong et al., 2018.

El uso de consorcios microbianos para mejorar la eficiencia de la

biodegradación ha aumentado debido a su capacidad de metabolismo sinérgico. El

intermediario metabólico de un microorganismo puede ser utilizado por otra para

una degradación eficiente, acelerando así la biodegradación y evitando los posibles

efectos tóxicos de los metabolitos formados (Li et al., 2017; Villaverde et al., 2017a).

Ortiz-Hernández y Sánchez-Salinas (2010), aislaron un consorcio bacteriano

formado por Stenotrophomonas malthophilia, Proteus vulgaris, Vibrio metschinkouii,

Serratia ficaria, Serratia spp. y Yersinia enterocoliti cepas puras provenientes de

suelos agrícolas, capaz de degradar tetraclorvinfos (ácido fosfórico, 2-cloro-1-

(2,4,5-triclorofenil) etenil dimetil ester).

Los consorcios de tres microorganismos (Brevibacterium frigoritolerans,

Bacillus aerophilus y Pseudomonas fulva) podrían degradar el forato, y la mayor

eliminación de forato (entre 97.65 y 98.31%) a concentraciones de 100, 200 y 300

mg/kg se encontró en suelos inoculados con cultivos mixtos. (Villaverde et al.,

2017a).

42

2.8 Metagenómica Funcional

Por otra parte, el suelo ha sido utilizado para realizar estudios

metagenómicos debido a su alta diversidad microbiana (Pathak et al., 2009; Voget

et al., 2006). El suelo es uno de los nichos ecológicos de mayor diversidad genética

microbiana, dado a la riqueza de texturas y estructuras, determinadas

principalmente por el contenido de arena, limo, arcilla, materia orgánica, contenido

de agua, y pH (Cortés et al., 2014). Por lo que un gramo de suelo puede contener

más de 4,000 especies, de diferentes microorganismos, principalmente procariotas,

que a su vez poseen miles de enzimas diferentes, constituyendo una reserva

enorme de nuevas moléculas (Curtis et al., 2002; Torsvik et al., 2002; Plassart et al.,

2012; Cortés et al., 2014).

Las enzimas que comúnmente se obtienen de meta genomas de suelos son

lipasas, esterasas y α-glucidasas, estas pueden hidrolizar enlaces C-C y C-O; desde

una perspectiva ecológica, puede contribuir al ciclo del carbono, por lo que sus

genes están ampliamente distribuidos en la comunidad microbiana (Martínez-

Martínez et al., 2013). La metagenómica brinda la oportunidad de aislar nuevas

secuencias de ADN que codifiquen enzimas y proteínas que participen en vías

metabólicas en relación con la biodegradación de plaguicidas, busca ser capaz de

estudiar con mayor profundidad a la comunidad microbiana, tanto a su estructura

como diversidad y entender el sinergismo entre las especies, su relación con los

ciclos biogeoquímicos (Cortés et al., 2014).

Se han caracterizado genes degradantes de plaguicidas de diferentes

microorganismos. La mayoría de los genes catabólicos responsables de la

degradación son extracromosómico, genómico o encontrados en transposones. El

nuevo avance en el campo de la metagenómica y la secuenciación del genoma

completo ha abierto nuevas vías para buscar los nuevos genes degradativos de

contaminantes y sus elementos reguladores de microorganismos tanto cultivables

como no cultivables del medio ambiente. Las enzimas responsables de la

degradación de varios plaguicidas están codificadas por estos plásmidos y

transposones que actúan como un elemento genético móvil (Kumar et al., 2018). El

43

valor de utilizar enfoques metagenómicos holísticos en todo el sistema como

herramienta para predecir la degradación microbiana en el contexto de la ecología

de hábitats contaminados (Jeffries et al., 2018).

Fang et al. (2014), reportaron mediante análisis metagenómico la abundancia

y diversidad de genes lip y mnp, que codifican para la peroxidasa, y el gen carA,

que codifica para la lacasa, detectándose como los genes dominantes para la

degradación de contaminantes orgánicos. Los genes hdt, hdg y atzB, que codifican

hidratasa, deshalogenasa y etilaminohidrolasa, fueron los genes más abundantes

involucrados en la degradación diclorodifeniltricloroetano (DDT),

hexaclorociclohexano (HCH) y atrazina (ATZ) en agua dulce y sedimentos marinos,

los conjuntos de datos se derivaron utilizando Illumina secuenciación de alto

rendimiento y se basaron en BLAST.

El análisis metagenómico extiende las observaciones de aislados cultivados

y proporciona evidencia de que la secuencia IS1071 es un portador de genes

catabólicos en ambientes estresados con xenobiótico y contribuye a la adaptación

a nivel de la comunidad para la biodegradación de plaguicidas (Moore et al., 2016).

Los suelos contienen comunidades microbianas extremadamente diversas

con capacidades metabólicas versátiles. La adquisición de nuevos rasgos se

produce mediante la diversificación del material genético existente del metagenoma

y se habilita aún más mediante la transferencia horizontal de genes (Maheshwari

et al., 2017). Por lo tanto, es posible que surjan nuevas actividades metabólicas y

se refuercen evolutivamente a través de la selección dentro de las comunidades

microbianas del suelo (Fierer, 2017; Kumar y Pannu, 2018).

44

III. JUSTIFICACIÓN

En México en el año 2017, se reportó un volumen de producción de 59 157

ton de plaguicidas, siendo Sinaloa y Sonora de los principales estados agrícolas

consumidores. Estos agroquímicos, son fuentes de contaminación del suelo, ya que

su uso excesivo satura los procesos biológicos de degradación. Dando como

resultado una prolongación de la vida media de los plaguicidas, afectando la

capacidad del suelo, acumulación en el ambiente y graves problemas de salud

pública. La comunidad microbiana en suelos es compleja, actúan como una red

metabólica que colectivamente permiten la degradación catabólica de dichos

contaminantes. Aprovechando la maquinaria metabólica de los microorganismos

nativos para la remediación de suelos, se identifican genes asociados en la

degradación para predecir rutas metabólicas y generar un consorcio microbiano

dirigido a un amplio espectro de plaguicidas, con ayuda de herramientas de

metagenómicas funcionales.

45

IV. HIPÓTESIS

La presencia y variación de genes de los integrantes del consorcio

microbiano aumentará el espectro de tolerancia a diversas familias de plaguicidas.

46

V. OBJETIVOS

Objetivo General

Identificar los genes asociados a la degradación de glifosato, carbofurán,

permetrina y clorpirifós provenientes de microorganismos aislados de cultivos papa,

maíz y trigo por metagenómica funcional.

Objetivos Específicos

• Valorar la capacidad de tolerancia glifosato, carbofurán, permetrina y

clorpirifós de las cepas aislados de cultivos de papa, maíz y trigo del

noroeste de México.

• Identificar a los integrantes del consorcio microbiano por

secuenciación Sanger (marcadores 16S rRNA).

• Conformar el consorcio microbiano a partir de las cepas con mayor

tolerancia a glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós.

• Diseño de primer para genoteca metagenómica funcional dirigida a

genes asociados a degradación de glifosato, carbofurán, permetrina y

clorpirifós.

47

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1 Antecedentes Proyecto (SIP20170193)

Se cuenta con un registro de los sitios (Guasave de cultivos de papa

(Solanum tuberosum L.), Culiacán cultivos de maíz (Zea mays) y Navojoa cultivo de

Trigo (Triticum) (Figura 14), donde se muestreo suelo impactado por la agricultura,

se definen las características fisicoquímicas y las concentraciones de plaguicidas

presentes (Tabla 3 y 4). A partir de los aislados de suelos contaminados de

plaguicidas del proyecto de (SIP20170193), de los que se partió con 86 cepas de

bacterias y hongos no identificado (Figura 15) (Tabla 5) y las pruebas de tolerancia

a diferentes plaguicidas (Tabla 6-7), dichas cepas se encuentran almacenadas a -

20°C en glicerol en el Laboratorio de Inocuidad Agroalimentaria del CIIDIR-IPN,

unidad Sinaloa.

De igual forma, se cuenta en el grupo de trabajo con Metagenómica del sitio

de muestreo correspondientes a los diferentes suelos, identificando la población

microbiana mediante amplicones 16S rRNA, en la (Figura 16) se muestra la

abundancia y diversidad de taxones.

48

Área de estudio: A. Región agrícola del valle del Yaqui y del río Mayo

(Navojoa cuenta con 295,553 habitantes), B. Valle agrícola de Guasave (Guasave

cuenta con 163,650 habitantes), C. Valle agrícola de Culiacán (Culiacán cuenta con

905, 265 habitantes). Elaborado por Montoya-Álvarez, 2017, a partir de datos

obtenidos de: Arellano-Aguilar et al., 2017; Leal Soto et al., 2014; Leyva et al., 2014b

y Hernández y Hansen., 2011.

49

* Milimhos por centímetro (mmhos/cm) * Centimoles por kilogramos (Cmol/Kg) * Partes por millón (ppm)

Tabla 3. Caracterización del suelo de los puntos de muestreo de los

municipios de Guasave, Culiacán y Navojoa con base a la norma NOM-AA-

021-2001

Análisis

Punto de Muestreo Referencia

Guasave Culiacán Navojoa

Potencial Hidrogeno: pH

7.8 6.4 7.8 6.6-7.3

Conductividad Eléctrica: CE (mmhos/cm)

1.99 0.10

1.99 ˂2.0

Materia Orgánica: %MO

0.7 1.20 0.70 ˂1.5

Nitratos: NO3 (ppm)

50 25 50 -

Fosforo: Olsen P (mg/Kg)

5.15 42.90 5.15 ˂10

Potasio: K (Cmol/Kg)

1.6 2.65 1.60 0.9-1.75

Calcio: Ca (Cmol/Kg)

18.6 20.36 18.6 14-20

Magnesio: Mg (Cmol/Kg)

3.98 4.0 3.98 ˃4.0

Sodio: Na (Cmol/Kg)

0.7 0.70 0.70 1.1-1.5

Fierro: Fe (ppm)

8.3 11.47 8.3 ˃9

Cobre: Cu (ppm)

2.3 4.2 2.3 ˃1.3

Zinc: Zn (ppm)

5 6.35 5.0 ˃1.5

Manganeso: Mn (ppm)

8.2 8 8.2 ˃8

Textura % Arena Arcilla Limo

Franco-Arcillosa

46.02 25.62 24.36

Arcillosa 16.02 63.62 20.36

Franco 46.02 25.62 24.36

50

Tabla 4. Patrones usados para identificación de plaguicidas en suelos de Guasave

DT50 suelo Guasave Culiacán Navojoa

15 meses ligeramente degradable

- 0.007590

250 días Muy

ligeramente degradable

- 0.000891

100 a 184 días Ligeramente degradable

0.002244 0.001031 0.000964 - 0.000363

( - ) Muy

ligeramente degradable

- 0.000613 0.001024

60-800 días Ligeramente degradable

- - 0.003108 - 0.002681 -

4 años

Ligeramente/no degradable

- - 0.004290 - 0.003517 -

4 años Ligeramente/no

degradable

- - 0.001060 - 0.000367 -

> 7 año Muy

Ligeramente Degradable

0.000181 0.000248 0.001267 - 0.000435 -

Años Muy

ligeramente degradable

- - 0.000629 - 0.000235 -

4-30 años Muy

Ligeramente Degradable

0.000009 0.000050 0.000749

0.000012 0.000213 -

4-14 años Muy

ligeramente degradable

- - 0.000576 0.000011 0.000351 -

60-800 días Ligeramente degradable

- 0.000121 - - -

120 días - 0.000118 0.000382 - - -

51

Ligeramente degradable 4-14 años

Muy ligeramente degradable

- 0.000615 0.004125 - -

Años (proporcional al

grado de cloración)

Muy ligeramente degradable

0.000066 - - - - -

**Guasave. Valle agrícola de Guasave (Guasave cuenta con 163,650 habitantes), Culiacán. Valle

agrícola de Culiacán (Culiacán cuenta con 905, 265 habitantes) y Navojoa. Región agrícola del valle del Yaqui y del río Mayo (Navojoa cuenta con 295,553 habitantes)

52

Aislados de microorganismo de suelos; de cultivos de papa Solanum

tuberosum L. Aislados de suelos de cultivos maíz (Zea mays). Aislados de suelos

de cultivos Navojoa cultivo de Trigo (Triticum).

53

Tabla 5. Cepas aisladas de los diferentes sitios (Guasave, Culiacán y Navojoa)

GUASAVE CULIACÁN NAVOJOA

GVE 1 G 1 CLN 1 C1 NAV 1 N 1

GVE 2 G 2 CLN 2 C 2 NAV2 N2

GVE 3 G 3 CLN 3 C 3 NAV 3 N3

GVE 4 G4 CLN 4 NAV 4 N 4

GVE 5 G5 CLN 5 NAV 5 N 5

GVE 6 G6 CLN 6 NAV 6 N 6

GVE 7 (A) G7 CLN 7 NAV 7 N 7

GVE 8 G8 CLN 8 NAV 8 N 8

GVE 9 G9 CLN 9 NAV 9 N 9

GVE 10 G10 CLN 10 NAV 10 N 10

GVE 11 CLN 11 NAV 11

GVE 12 CLN 12

NAV 12 (Consorcio ambiental)

GVE 13 CLN 13 NAV 13 GVE 14 CLN 14 NAV 14 GVE 15 CLN 15 NAV 15 GVE 16 CLN 16 NAV 16 GVE 17 CLN 17 NAV 17 GVE 18 CLN 18 NAV 18 GVE 19

(B) CLN 19 NAV 19 GVE 20

GVE 21 * CLN 20

CLN 21

CLN 22

CLN 23

CLN 24

CLN 25

CLN 26 *GVE (bacterias) *G (hongos) **CLN (bacterias) **C (hongos) ***NAV (bacterias ***N (hongos)

54

Tabla 6. Tolerancia a diferentes plaguicidas

Tabla 7. Muestras positivas de hongos y bacterias a mix de plaguicidas a 200 y 100 µL/L

*Mix [carbofurán, paraquat, paratión y permetrina]

PLAGUICIDA (100 µL/L)

DT50 SUELOS (cálculos FAO)

GUASAVE CULIACÁN NAVOJOA

Bacteria Hongo Bacteria Hongo Bacteria Hongo

Carbofurán 30-117 días Moderadamente

Degradable

M7 M10

M11 M5 M2 M4 M7

M7 M12

Paraquat 1,000 días Muy

Ligeramente Degradable

M10 M8 M7

M5 M15

M2 M4 M7

Paratión Varias Semanas

Fácilmente Degradable

M7

M11 M2 M4 M7

M7 M13

Permetrina ˂38 días Moderadamente

Degradable

M7 M8 M10

M3 M4

M11 M15

M2

M4 M5 M7

MIX PLAGUICIDA

GUASAVE CULIACÁN NAVOJOA

Bacteria Hongo Bacteria Hongo Bacteria Hongo

200 µL/L

M11 M7

M5 M1 M3

M7 M12

100 µL/L M7 M10

M3 M4

M11 M15

M2 M3

M4 M7

55

Histograma de la abundancia bacteriana de la metagenómica de

los tres sitios muestreados.

56

6.2 Producto Químico

Para el objetico 1, pruebas de tolerancia en medio solido M9 se utilizaron

plaguicidas marcas comerciales Glifosato (FAENA® 35.6%), Carborurán (Furadan®

350L), Permetrina (PERKILL® 34%CE) y Corpirifós Etil (CHLORBAN® 480CE) y el

objetivo 2, curvas de crecimiento se evaluó solo glifosato N - (fosfonometil) glicina

grado analito (96%) marca Sigma-Aldrich.

6.3 Etapa I

6.3.1 Objetivo 1: Valorar la capacidad de tolerancia a glifosato, carbofurán,

permetrina y clorpirifós de las cepas aislados de cultivos de papa, maíz

y trigo del noroeste de México.

6.3.1.1 Reactivación de las cepas aisladas de cultivos de cultivos de papa

(Solanum tuberosum L.), maíz (Zea mays) y trigo (Triticum)

- Selección y adaptación de cepas aisladas

a. Reactivación de las cepas aisladas de cultivos de cultivos de

papa (Solanum tuberosum L.), maíz (Zea mays) y trigo

(Triticum)

Se tomaron los 86 aislados proyectos (SIP20170193) conservados en glicerol

a -20ºC, para su reactivación y posterior purificación en medio Luria Bertani (LB)

agar y Luria Bertani (LB) caldo, se llevaron a cabo la inoculación de las cajas de

agar LB por medio de asas bacteriológicas por estriado y se pasaron a incubar a 28

°C, durante 24 horas.

b. Preparación de los preinóculos

Los preinóculos se realizaron adicionando dos asadas de la cepa

correspondiente en 50 mL de caldo LB esterilizado a 121 °C y 15 psi. Se incubaron

a 27 ± 2 °C y 150 rpm, por 24 horas.

c. Actividad Hemolítica

57

Se determino la capacidad de producción o ausencia de hemólisis, en agar

sangre al 5% de suero de sangre de bovino (Anexo 1), se llevaron a cabo la

inoculación por estriado y posteriormente se incubo a 28 °C, durante 18 horas

(Haubert et al., 2017).

- Selección de Plaguicidas

Se realizó una base de datos de plaguicidas para determinar los

agroquímicos tomando en cuenta la familia, procesos de degradación y la vida

media DT50, como referencia; TOXNET https://toxnet.nlm.nih.gov; PubChem

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov; DISI https://disi.gob.mx/agroquimicos/ (Anexo I).

6.3.1.2 Valorar la capacidad de tolerancia a 200 ppm glifosato, carbofurán,

permetrina y clorpirifós de las cepas aislados.

Para cada tratamiento en esta Etapa I/Fase I, se tomó en cuenta la

valoración de tolerancia (86 cepas), se inocularon en agar medio mínimo mineral

M9 (Na2HPO4·7H2O 48 mM, KH2PO4 22 mM, NaCl 8.6 mM, NH4Cl 18.7 mM, MgSO4

1 mM y CaCl2 0.1 mM: pH 7-7.2 (se ajustó HCL 1 M o NaOH 5 M), este se preparó

de acuerdo a la metodología de (Graf y Altenbuchner, 2011; Shabbir et al., 2018a),

una vez esterilizado el medio y a temperatura de 40°C se agregó 200 ppm 0 200

mg/L patrón de plaguicidas marca comercial (glifosato, carbofurán, permetrina y

clorpirifós) como única fuente de carbono, cada plaguicida se preparó un stock 2

g/L disuelto en agua desionizada estéril y se filtró usando acrodisco 0.22 µm, y por

último se conservó a 4°C para su aplicación. Por medio de asas bacteriológicas por

estriado y posteriormente se incubaron a 28ºC durante 7 días, metodología con

modificaciones (Shabbir, 2018b) .

El ensayo se realizó considerando un blanco y testigo para garantizar la

confiabilidad de los resultados, como medida de control y para obtener datos

estadísticamente significativos por cuatro replicas (Anexo II). Para evaluar el

crecimiento en la caja se determinó una escala ponderada (elaboración propia),

tomando los siguientes criterios: área (valores:0-6) y densidad/biomasa

(observación) (valores:0-4) (Anexo III), dichos resultados se concentraron en una

58

matriz para luego generar la distribución de datos en un mapa de calor (Anexo IV)

para la interpretación de resultados. Se determinó la clasificación de las cepas en

dos grupos considerando la capacidad de tolerancia a 200 ppm (Tabla 8).

Tabla 8. Diseño experimental

Tratamiento Medio de Cultivo

Microorganismo

T (n)

M9 + [300ppm] de plaguicida

Cepa (n) TP (+) / PA (-)

Control

C1

M9 + [300ppm] de plaguicida

-----

C2

M9 Cepa (n) TP (+) / PA (-)

6.3.1.3 Valorar la capacidad de tolerancia a 5000 y 10000 ppm glifosato,

carbofurán, permetrina y clorpirifós de las cepas del grupo I.

Una vez realizado el análisis, se seleccionaron aquellas cepas que

presentaron tolerancia a las cuatro moléculas, para su posterior evaluación a

concentración a 5,000 ppm para cada patrón de plaguicida, posteriormente las

cepas que presentaron tolerancia a 5000 ppm se pasaron a 10,000 ppm, bioensayos

Etapa I/Fase II. El aumento de las concentraciones se determinó considerando la

literatura disponible de las concentraciones mínimas o máximas reportadas para

tolerancia y la degradación de los cuatro plaguicidas 10 a 8,000 ppm o mg/L, así

como la dosis que se aplica en campo. Este ensayo se realizó siguiendo la

metodología anterior, pero la interpretación de resultados no se aplicó la escala

ponderada, por lo que aquella cepa que presentara crecimiento positivo (+) y

ausencia de crecimiento (-), todos los tratamientos se llevaron considerando un

control y una réplica.

59

6.4 Etapa II

6.4.1 Objetivo 2. Identificar cepas con capacidad de tolerancia a carbofurán y

glifosato Grupo II por secuenciación Sanger (marcadores 16S rRNA).

Estudios moleculares

6.4.1.1 Extracción de ADN

Bacterias

Una vez reactivas y purificadas las cepas, se realizó una resiembra masiva

en caldo de cada cepa para la obtención de biomasa, se pasó a la extracción de

ADN siguiendo los pasos indicados por el kit DNeasy UltraClean Microbial Kit

QIAGEN. Posteriormente, el ADN se observó en geles de agarosa al 1% teñidos

con bromuro de etidio y se visualizaron.

6.4.1.2 Amplificación de ADN mediante PCR

Para la amplificación de las regiones conservadas 16S y 18S se utilizaron los

siguientes cebadores; 515f -1100r (Yang et al., 2016) correspondientes a cada

fragmento de interés (Tabla 9) (Figura 17). La reacción de amplificación: 5 μL de

ADN [20 ng], 0.5 μL de cada oligonucleótido [10 μM], 5 μL de buffer PCR [5X], 2 μL

de MgSO4 [25 mM], 0.5 μL de dNTP‟s [10 mM], 0.2 μL de Taq polimerasa [5 U/μL]

y agua ULTRAPURA para llevar a un volumen final de 25 μL. Las reacciones se

colocaron en un termociclador, bajo las siguientes condiciones descritas en el

(Tabla 10). Por lo que, los productos de PCR se corrieron en una cámara de

electroforesis en un gel de agarosa al 1%, a un voltaje de 90 V durante 35 minutos

(Sabrook y Russell, 2001). Los resultados se observaron bajo luz ultravioleta en un

fotodocumentador. Los productos de PCR se purificaron con el kit PureLink™ PCR

Purification Kit Invitrogen, con las especificaciones descritas por el proveedor.

60

Diagrama de ubicación de cebadores de la región 16S rRNA. Ilustración de diferentes regiones variables. Las regiones rojas (V2, V8) tienen una resolución filogenética deficiente a nivel de phylum. Las regiones verdes (V4, V5, V6) están asociadas con la distancia geodésica más corta, lo que sugiere que pueden ser la mejor opción para los análisis relacionados con la filogenia y el análisis filogenético de nuevos filos bacterianos. La figura se refiere al mapa de cartilla de Lutzonilab (http://lutzonilab.org/16s-ribosomal-dna/). El uso de esta información fue aprobado por los autores originales del sitio web.

Tabla 9. Cuadro descripción de los cebadores para las regiones de 16S rRNA

Cebadores Secuencia (5 'a 3') Tamaño Referencia

515f GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 585 pb Turner et al., 1998 Weisburg et al., 1991

1100r AGGGTTGCGCTCGTTG Yang et al., 2016 16S1 AAGGAGGTGATCCAGCC 16S2 GAGASTITGATCHTGGCTCAG

Tabla 10. Condiciones de amplificación de ambas regiones 16S rRNA

Etapa 16S rRNA

Tiempo (min) Temperatura (ºC)

Desnaturalización inicial 4 95

Desnaturalización 1 95 Alineamiento 1 70

Extensión 2 72 extensión Final 5 75

(Kumar y Shukla, 2005)

(ADN ribosomal 16S | Lutzoni Lab 2019

61

6.4.1.3 Secuenciación

La pureza y la concentración del producto de PCR se midieron utilizando un

espectrofotómetro Nanodrop, aquellos que cumplieron con las especificaciones se

enviaron a la Instituto de Biotecnología de la UNAM por el método de Sanger y a la

empresa MACROGEN, se obtuvieron la generación de los archivos FASTA y su

archivo de calidad con base en el programa CONSED.

6.4.1.4 Análisis filogenético16S rRNA

Las secuencias obtenidas se analizaron mediante BLAST comparando con

anteriores resultados publicadas en el NCBI (por sus siglas en inglés, National

Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Posteriormente,

se llevó a cabo una alineación múltiple empleando el programa MAFFT (Katoh et al.,

2002), así como el filtrado de estos con ayuda de GBlocks (Selección de bloques

conservados de múltiples alineaciones para su uso en el análisis filogenético). Tras

el análisis se identificó el modelo de sustitución empleando el programa Model Test

(Posada, 2006). Para la construcción de árboles filogenéticos se utilizó el programa

Silva (https://www.arb-silva.de/aligner/) RAXML (Máxima Verosimilitud).

62

6.5 Etapa III

6.5.1 Objetivo 3. Conformar el consorcio microbiano a partir de las cepas con

mayor tolerancia a los diferentes plaguicidas.

6.5.1.1 Consorcio Artificial: valoración de tolerancia a diferentes concentraciones

de glifosato.

El análisis del estudio anterior, se seleccionaron dos cepas del grupo I, (A)

una con capacidad de tolerancia (CT) mayor y (B) otra con un comportamiento

menor a concentraciones 200 ppm o mg/L, con base a nuestras escales ponderadas

y el análisis previo, para generar un cultivo mixto (consorcio artificial) y valorar curva

de crecimiento bacteriano en medio liquido M9* (Na2HPO4·7H2O 48 mM, KH2PO4

22 mM, NaCl 8.6 mM, NH4Cl 18.7 mM), MgSO4 1 mM y CaCl2 0.1 mM,

suplementado con (3aa+0.2%FC+1vit); pH 7-7.2 (se ajustó HCL 1 M o NaOH 5 M),

a diferentes concentraciones 0, 250, 500, 1000, 2500, 5000 y 10,000 ppm de

glifosato (N - (fosfonometil) glicina grado analito (96%) (marca Sigma-Aldrich

número de catálogo 337757-5G), el ensayo se realizó de forma individual (curva de

crecimiento de cada cepa A y B) y consorcio artificial (cultivo mixto), también se

consideró una cepa control (Graf y Altenbuchner, 2011; Shabbir et al., 2018a).

a. Preparación Consorcio Artificial (cultivo mixto)

Una vez seleccionadas las cepas con base a su capacidad de tolerancia a

glifosato, y a su actividad hemolítica se descartando aquellas que presentaron β-

hemólisis positiva A (>CT) y B (<CT). Debido a que no se tiene datos individuales

sobre la eficacia de cada una de las cepas, se procedió a aplicar la misma cantidad

de inóculo a cada uno de los tratamientos.

Para la combinación de las cepas nativas preseleccionadas, inicialmente se

preparó los preinóculos de cada una de las cepas (dos asadas en 50 mL de caldo

nutritivo LB previamente esterilizado a 121 °C y 15 psi en erlenmeyers de 250 mL),

una vez listos los preinóculos, se realizó el lavado de las células y se ajustaron todas

63

las cepas a una misma OD 600 nm absorbancia de 0.2. Para ajustar la densidad

óptica se realizarán los cálculos correspondientes según la ecuación:

A1 V1 = A2 V2

Donde:

A1: OD 600 nm del cultivo de preinóculo

V1: volumen tomado del cultivo de preinóculo

A2: OD 600 nm absorbancia de 0.2

V2: volumen que se requiere inocular (20 mL)

El volumen V1 se depositó en un tubo falcón estéril de 45 mL y se centrifugo

a 2000 rpm durante 60 min. El sobrenadante fue descartado y el pellet se

resuspendió en el agua destilada estéril hasta completar 20 mL correspondiente a

cada cepa, para realizar la mezcla [A+B] (mismo volumen) y los preinoculos de

forma individual se conservaron para su posterior análisis.

b. Cinética de Crecimiento

Se inocularon los tratamientos con un volumen de preinóculo proveniente del

tratamiento anterior equivalente al 10% del volumen total del medio líquido (20 mL)

OD 600 nm absorbancia igual a 0.2. Una vez inoculado cada tratamiento (Tabla 11)

para cada concentración de glifosato, se pasaron a incubar a 150 rpm, 27± 2 ° C.

Todas las fermentaciones líquidas se llevarán a cabo con un pH inicial de 7-7.2 en

medio M9 suplementado, por duplicado, se tomaron lecturas cada 2 horas a las

cuales se les midió OD 600 nm (Basu et al., 1996).

64

Tabla 11. Diseño Experimental; tratamientos para evaluar M9 3aa+0.2%FC+1vit; 0-10000 ppm Glifosato; Cepas A y B; Consorcio

TRATAMIENTO

M9*+ 0

M9*+ 250ppm

M9*+ 500ppm

M9*+ 1000ppm

M9*+ 2500ppm

M9*+ 5000ppm

M9*+ 10000ppm

A B

MEZCLA (A+B) CONTROL

*blanco + testigo **3aa: triptofano, treonina y fenilalanina; 0.2% FC: porcentaje fuente de carbono (glucosa) mínima;

1vit: tiamina (tratamiento)

6.5.1.2 Comparación de un consorcio nativo (aislado ambiental) contra un

consorcio artificial en diferentes concentraciones de glifosato

El ensayo consistió en comparar ambos consorcios bajo las siguientes

condiciones, se utilizará agar medio mínimo Mineral M9 (Na2HPO4·7H2O 48 mM,

KH2PO4 22 mM, NaCl 8.6 mM, NH4Cl 18.7 mM, MgSO4 1 mM y CaCl2 0.1 mM); pH

7-7.2, para valora la capacidad de tolerancia de ambos consorcios en diferentes

concentraciones de 0, 250, 500, 1000, 2500, 5000 y 10,000 ppm de glifosato (N -

(fosfonometil) glicina grado analito (96%) (marca Sigma-Aldrich número de catálogo

337757-5G). Se preparó el inoculo para ambos consorcios, estos fueron reactivados

(dos asadas en 50 mL de caldo nutritivo LB previamente esterilizado a 121 °C y 15

psi en erlenmeyers de 250 mL), se pasarán a medio agar LB para partir de

consorcios en medio sólido y una vez listos los preinóculos estos serán inoculados

en cada tratamiento, metodología de (Graf y Altenbuchner, 2011; Shabbir et al.,

2018a).

El ensayo se realizó considerando un blanco y testigo para garantizar la

confiabilidad de los resultados, como medida de control y para obtener datos

estadísticamente significativos por cuatro replicas. Para la interpretación de

resultados se utilizó escala ponderada.

65

6.6 Etapa IV

6.6.1 Objetivo 4. Diseño de primer para metagenómica funcional dirigida a

genes asociados a degradación de plaguicidas.

6.6.1.1 Construcción de la base de datos de genes asociados a la degradación de

plaguicidas

La búsqueda de las secuencias que codifican para enzimas asociadas a la

degradación de los diferentes plaguicidas reportados de bacterias se realizó usando

como referencia la base de datos de NCBI, (http://fungene.cme.msu.edu) y

(https://metacyc.org/). Una vez descargados los genomas se construyó una base de

datos con la información de los aislados previamente identificados y los genes

asociados a degradación de glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós.

a. Diseño de primers

Para el diseño de primers se utilizó programa bioinformático OLIGO 6 (DBA

Oligo, Inc.; https://www.oligo.net/) y primers BLAST

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi que permite diseñar

cebadores para la región de interés (Araujo et al., 2018).

66

VII. RESULTADOS

En la presente tesis los objetivos se organizaron por etapas, con la finalidad

de llegar al diseño de metagenómica dirigida a un panel de genes asociados a la

degradación de los diferentes plaguicidas, por lo que a continuación se presentan

los resultados correspondientes a cada experimento desarrollado por cada etapa.

7.1 Etapa I

7.1.1 Objetivo 1: Valorar la capacidad de tolerancia a glifosato, carbofurán,

permetrina y clorpirifós de las cepas aislados de cultivos de papa, maíz

y trigo del noroeste de México.

7.1.1.1 Reactivación de las cepas aisladas de cultivos de papa (Solanum

tuberosum L.), maíz (Zea mays) y trigo (Triticum)

En la presente Se logró reactivar el total de los aislados 86 cepas no

identificadas de los tres sitos (papas Solanum tuberosum L., maíz (Zea mays) y trigo

(Triticum) se cuenta con morfologías diferentes correspondientes a 64 de bacterias,

21 hongos y un consorcio natural (NAV 12) aislado de Navojoa (Figura 18). Una

vez reactivas se realizó ensayo para medir su activada hemolítica, por lo que, se

reportan (+) a β-Hemólisis 6 cepas (GVE4, GVE8, CLN 7, NAV8, NAV15 y NAV16),

identificándose como probable patógeno estas se trabajaron con las medidas de

protección necesarias (Figura 19) (Tabla 12). El total de las cepas pasaron a

conservarse a temperatura de -20°C al 30% de glicerol.

67

Morfología de cepas aisladas de suelos; Guasave cultivo de papa

(Solanum tuberosum L.), Culiacán cultivos de maíz (Zea mays) y Navojoa cultivos

de trigo (Triticum) contaminado por plaguicidas. **Cepas reactivas en medio LB ;(a

–f) morfología presuntiva de bacterias; (g – i) morfología presuntiva de hongos.

(a) (b)

(g)

(d)

(i) (h)

(f) (e)

(c)

68

Prueba de Hemólisis. *(a) β-Hemólisis; halo de hemólisis completamente claro; (b) α-Hemólisis; lisis parcial de eritrocitos coloración verde alrededor de las colonias (producto de degradación de la hemoglobina llamado biliverdina); (c) γ-Hemólisis; ausencia de hemólisis; estrado en medio Sangre Base Agar 5% de sangre de bovino.

Tabla 12. Prueba de hemólisis de bacterias aisladas Guasave, Culiacán y Navojoa

Bacterias por sitio de aislamiento Hemólisis

α β Γ

Guasave (cultivos de papa) 6 2 12

Culiacán (cultivo de maíz) 12 1 13

Navojoa (cultivo de trigo) 3 3 13

α- Hemólisis; lisis parcial de eritrocitos coloración verde alrededor de las colonias (producto de degradación de la hemoglobina llamado biliverdina): β-Hemólisis; halo de hemólisis completamente claro: γ-Hemólisis; ausencia de hemólisis

(a) (c) (b)

69

7.1.1.2 Valorar la capacidad de tolerancia a 200 ppm glifosato, carbofurán,

permetrina y clorpirifós de las cepas aislados.

Los bioensayos realizados en esta Etapa I/Fase I valoración capacidad de

tolerancia a 200 ppm concentración mínima PP, se determinó a partir de la

distribución de los datos interpretados mapa de calor para cada región

representados en las (Figura 20-24), dependiendo de su capacidad de tolerancia

(CT) a 200 ppm a los diferentes plaguicidas, se agruparon: Grupo I y Grupo II,

integrados por (bacterias y hongos respectivamente), por lo que Grupo I 24.42%

(21/86) cepas presentaron CT a los cuatro plaguicidas, incluyendo en este grupo a

NAV 12 (CN), así como también podemos resaltar aquellas cepas aisladas de

suelos agrícolas de Culiacán en su mayoría presentaron CT al total de los

plaguicidas evaluados, y representado el 75.58% (65/86) cepas CT a igual o menor

a tres plaguicidas evaluados determinando así el Grupo II, dentro de este se ubicó

aquellas cepas que resultaron con CT a glifosato y carbofurán, concentrándose en

la Tabla 13. En este primer ensayo se clasificó aquellas cepas con base a su

capacidad de tolerancia con la finalidad de filtrar y pasar a los siguientes ensayos.

Por último, de la variedad de plaguicidas evaluados en el presente experimento

carbofurán cuenta con la mayor incidencia en todos los aislados.

70

Pruebas de tolerancia de bacterias aisladas de suelos agrícolas de

Guasave (cultivos de papa) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y Clorpirifós

Etil; MM9 200 ppm. A) Histograma B) Dendograma mapa de calor muestra una matriz en la distribución de datos representado por colores

dando un resumen de las diferencias numéricas en árbol de agrupamiento; i. Cepas de Guasave; a) Grupo I (mayor tolerancia); b) Grupo II (menor tolerancia); c) Bacterias con

actividad hemolítica (+) ii. Repeticiones x1…x4; Densidad (DEN 0-6); Área (0-4)

A)

B)

i) ii)

(a

(b

(c

71

Pruebas de tolerancia de bacterias aisladas de suelos agrícolas de

Culiacán (cultivos de maíz) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y Clorpirifós

Etil; MM9 200 ppm. A) Histograma B) Dendograma mapa de calor muestra una matriz en la distribución de datos representado por colores

dando un resumen de las diferencias numéricas en árbol de agrupamiento; i) Etiqueta cepas; a) Grupo I (mayor tolerancia); b) Grupo II (menor tolerancia); c) Bacterias con

actividad hemolítica (+) ii) Repeticiones x1…x4; Densidad (DEN 0-6); Área (0-4)

A)

B)

i)

ii)

(a

(b

(c

72

Pruebas de tolerancia de bacterias aisladas de suelos agrícolas de

Navojoa (cultivos de trigo) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y Clorpirifós

Etil; MM9 200 ppm. A) Histograma B) Dendograma mapa de calor muestra una matriz en la distribución de datos representado por colores

dando un resumen de las diferencias numéricas en árbol de agrupamiento; i) Etiqueta cepas; a) Grupo I (mayor tolerancia); b) Grupo II (menor tolerancia); c) Bacterias con

actividad hemolítica (+) ii) Repeticiones x1…x4; Densidad (DEN 0-6); Área (0-4)

A)

B)

i) ii)

(a

(b

(c

73

Pruebas de tolerancia de hongos aisladas de suelos agrícolas de

Navojoa (cultivos de trigo) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y Clorpirifós

Etil; MM9 200 ppm. A) Histograma B) Dendograma mapa de calor muestra una matriz en la distribución de datos representado por colores

dando un resumen de las diferencias numéricas en árbol de agrupamiento; i) Etiqueta cepas; a) Grupo I (mayor tolerancia); b) Grupo II (menor tolerancia); ii) Repeticiones x1…x4; Área (0-4)

A)

B)

(a

(b

i)

ii)

74

Pruebas de tolerancia de hongos aisladas de suelos agrícolas de

Guasave (cultivo de papa) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y Clorpirifós

Etil; MM9 200 ppm. a) Histograma b) Dendograma mapa de calor muestra una matriz en la distribución de datos representado por colores

dando un resumen de las diferencias numéricas en árbol de agrupamiento; i) Cepas de Guasave; a) Grupo I (mayor tolerancia); b) Grupo II (menor tolerancia) ii) Repeticiones x1…x4; Área (0-6)

A)

B)

(a

(b

i) ii)

75

Tabla 13. Cepas del total de los sitios clasificación determinada por las pruebas de tolerancia al total de los plaguicidas.

Grupo I: pasar a ensayos de aumento de concentraciones Grupo II: Se seleccionaron 14 cepas aquellas con capacidad para dos plaguicidas (glifosato) marcadas con (*) para ser identificadas y dos de estas cepas con capacidad de tolerancia a glifosato para conformar un consorcio) (cultivo mixto) (A) y (B) (CN); Consorcio Natural

GRUPO I (cuatro plaguicidas)

GRUPO II (tres ≤ plaguicidas)

GVE 1 CLN 3 NAV 6 GVE 3* CLN 1* NAV 1

GVE 2 CLN 4 NAV 12 (CN) GVE 5* CLN 2 NAV 2

G1 CLN 5 N 5 GVE 6* CLN 9* NAV 3

G2 CLN 6 N 6 GVE 7* (A) CLN 10 NAV 4

G6 CLN 8 GVE 9 CLN 11 NAV5*

G7 CLN 18 GVE 10 CLN 12 NAV 7

G8 CLN 20 GVE 11 CLN 13 NAV 9

CLN 23 GVE 12* CLN 14 NAV 10*

C 2 GVE 13 CLN 15 NAV 13

C 3 GVE 14 CLN 16 NAV 14*

GVE 15 CLN 17 NAV 17

GVE 16 CLN 19 NAV 18*

GVE 17 CLN 21 NAV 19*

GVE 18 CLN 22 N 1

GVE 19* (B) CLN 24 NAV 11 (H)

GVE 20* CLN 25 N 4

G5 CLN 26 N 7

G3 C 1 N 8

G4 N 9

G9 N 10

G10

76

7.1.1.3 Valorar la capacidad de tolerancia a 5000 y 10000 ppm glifosato,

carbofurán, permetrina y clorpirifós de las cepas del grupo I.

Los aislados clasificados en la (Etapa I) dentro del (Grupo I) caracterizados

como aquellos que presentaron CT al total de los plaguicidas (glifosato, carbofurán,

permetrina y clorpirifós) incluyendo al consorcio natural NAV12, así como también

consorcio artificial aislados GVE7 y GVE19 recordemos que estos pertenecen al

Grupo II. Dichas cepas pasaron a una segunda valoración CT ya que se aumentaron

las concentraciones de 200 ppm a 5000 ppm y una máxima de 10000 ppm, por lo

que se determinaron en esta Etapa I/Fase II, con base a las asociadas a procesos

de degradación y tolerancia de estos cuatro plaguicidas 10 a 8000 ppm o mg/L, así

como la dosis que se aplica en campo. En el ensayo de tolerancia a 5000 ppm se

encontró el 66.66% (16/24) aislados tolerantes a los cuatro plaguicidas y 45.83%

(11/24) cepas tolerantes a sólo tres de los plaguicidas a 10000 ppm, ya que la

mayoría no soportan concentraciones altas a permetrina. Dentro de este ensayo,

podemos destacar que los hongos presentan CT para ambas concentraciones, a

excepción de permetrina a 10000 ppm, así como dentro de estos aislados se cuenta

con un consorcio natural (NAV 12) conformado por dos morfologías diferentes estos

crecen entre, sin presentar antagonismo y dado a sus características de tolerancia

etapa II presentaron crecimiento a 5000 ppm en todos los plaguicidas, como

también en 10000 ppm en glifosato, carbofurán, y clorpirifós, con lo que respecta al

consorcio artificial presenta CT tan solo a concentraciones de 5000 ppm (Tabla 14).

77

Tabla 14. Ensayo aumento de concentraciones de plaguicida a 5000 ppm y 10000 ppm de las cepas que presentaron tolerancia a 200 ppm (Grupo I)

CEPAS Tolerancia a 5,000 ppm Tolerancia a 10,000 ppm

C-01 P-02 G-03 F-04 C-01 P-02 G-03 F-04

GVE 1 - - - -

GVE 2 + + + + + - - +

GVE 7(ICA) + + + + - - - -

GVE19(ICA) + + + + - - - -

GVE 21 + + + + + + - +

CLN 3 - - - -

CLN 4 + + + + + - + +

CLN 5 + + + + - + + +

CLN 6 + + + + - + - +

CLN 8 - - - -

CLN 18 + + + + - + - +

CLN 20 - - - -

CLN 23 + + - - - - - -

C 2 - - - +

C 3 - - - +

NAV 6 + + + + - - - -

NAV 12 (CN) + + + + + + - +

G1 + + + + + - + +

G2 + + + + + - + +

G6 + - + + + - + +

G7 + + + + + - + +

G8 + + + + + - + +

N 5 + + + + + - + +

N 6 + + + + + - + +

*C-01(Clorpirifós); P-02(Permetrina); G03(Glifosato); F-04(Carbofurán) **ICA (Integrante del Consorcio Artificial) ***CN (Consorcio Natural)

78

7.2 Etapa II

7.2.1 Objetivo 2. Identificar cepas con capacidad de tolerancia a carbofurán y

glifosato Grupo II por secuenciación Sanger (marcadores 16S rRNA).

Se determinó por secuenciación de amplicon de 16S rRNA especifico de la

región V1-V4, la identidad del grupo II se incluyen los aislados GVE7 y GVE 19

(integrantes del consorcio artificial). Por lo que, se reporta la predominancia de cinco

aislados identificados como Bacillus subtilis, seguido de Bacillus megaterium

registrando cuatro y el resto una diversidad de Bacillus como; Bacillus sp., Bacillus

cereus, Bacillus albus, Bacillus aryabhattai y Bacillus thuringiensis, es importante

señalar el análisis de sustitución por sitios se observó una distancia nucleotídica

(0.010) (Figura 25). Así como también, se realizó la distribución de datos en función

de los aislados previamente identificados en relación con su capacidad de

tolerancia, pudiendo interpretar que este grupo presenta una baja tolerancia a

clorpirifós y una mayor a carbofurán, como también presentando una CT intermedia

dichas cepas a glifosato y permetrina (Figura 26).

79

Cladograma del alineamiento de secuencias nucleotídicas. Aislados

con capacidad de tolerancia a carbofurán y glifosato Grupo II (por secuenciación

Sanger (marcadores 16S rRNA).

80

Dendograma aislados identificados asociados a su capacidad de tolerancia.

81

7.3 Etapa III

7.3.1 Objetivo 3. Conformar el consorcio microbiano a partir de las cepas con

mayor tolerancia a los diferentes plaguicidas.

7.3.1.1 Consorcio Artificial: valoración de tolerancia a diferentes concentraciones

de glifosato.

Para el diseño de este consorcio se seleccionaron dos cepas (A y B) dentro

del Grupo II aquella que presentaron una tolerancia alta a glifosato cepa (A) GVE7

y otra con una CT menor (B) GVE 19, ambas identificadas como Bacillus

megaterium. Para adecuar un medio con las características de potenciar el

crecimiento de ambas y generar un cultivo mixto, se adecuó un medio liquido medio

Mínimo Mineral M9 con algunos suplementos como aminoácidos (treonina,

triptófano y fenilalanina), 0.2% de glucosa (fuente de carbono mínimo) y vitamina

(tiamina), la intención de adecuar el medio M9 a una concentración baja de glucosa

para valorar a glifosato como fuente alternativa de carbono para el consorcio. Este

ensayo consistió en determinar una curva de crecimiento en medio liquido M9 a

concentraciones 0, 250, 500, 1000, 2500, 5000 y 10000 ppm de glifosato (N -

(fosfonometil) glicina grado analito (96%) de cepas individuales (Figura 27 a y b),

cultivo mixto (Figura 28) y de igual forma se compararon B. Subtilis WT; cepas

individuales; cultivo mixto (Figura 29). La representación gráfica cinética de

crecimiento correspondiente a cada tratamiento, dieron como resultados ambas

cepas Bacillus megaterium (GVE 7 y GVE 19) completa inhibición del crecimiento

microbiano en el tratamiento de máxima concentración a 10000 ppm,

comportamiento bajo concentraciones de 5000 ppm presentaron ambas cepas a las

12 hrs un aumento de biomasa similar alcanzando una OD 600 nm máxima a las 24

hrs, con respecto a la valoración del comportamiento del consorcio artificial (GVE7

+ GVE19 mix) coincide con los resultados individuales de las cepas en el tratamiento

10000 ppm, pero una marcada diferencia en biomasa en la última lectura 24 hrs se

puede observar mientras el crecimiento microbiano (mix) en concentraciones 0-

2500 ppm va disminuyendo, a concentraciones de 5000 ppm la OD 600 nm va

82

incrementando, de modo que podría asociarse a un proceso adaptativo a medida

que el tiempo transcurre. Grafica comparativa B. Subtilis WT; cepas individuales;

cultivo mixto curva de crecimiento a 5000 ppm, se puede observar una mínima

diferencia en relación con el comportamiento del consorcio artificial, ya que se logra

distinguir en la lectura 24 hrs a diferencia GVE7 un pequeño aumento de biomasa

en el mix, y una marca diferencia en relación con la cepa control B. Subtilis WT.

Los experimentos realizados anteriormente en la Etapa I/Fase II, donde se

aumentaron las concentraciones a 5000 y 10000 ppm estos bioensayos se llevaron

en medio mínimo mineral M9 sólido, en dichos experimentos se valoró CT de las

cepas GVE7 y GVE19 (integrantes del consorcio artificial), es importante mencionar

que presentaron CT a 5000 ppm y nulo crecimiento a concentraciones máximas de

10000 ppm (Tabla 15). Podemos entonces, relacionar estos resultados con las

observaciones en la cinética de crecimiento en medio liquido M9 ya que presentaron

este mismo comportamiento (Figura 27 a y b). En tanto, podemos interpretar la

metodología medio solido – liquido M9 un acercamiento a una correlación

presuntiva, ya que se propone llevar a cabo ambos experimentos bajo las mismas

condiciones.

83

(a)

(b)

Curva de crecimiento tolerancia a glifosato de Bacillus megaterium

GVE7 y GVE 19. (a) GVE7; (b) GVE19; ambos experimentos se llevaron a cabo bajo las mismas

condiciones; temperatura, tiempo (24hrs) e inoculadas en Medio mínimo mineral M9 (modificado añadiendo tres

aminoácidos, 0.2% glucosa y tiamina) respectivamente a concentraciones variables de patrón de plaguicida 0-

10000 ppm (línea azul 0 ppm; naranja 250 ppm; gris 500 ppm; amarilla 1000 ppm; azul claro 2500 ppm; verde

5000 ppm; azul marino 10000 ppm); representación gráfica de la curva entre densidad óptica OD 600 nm contra

tiempo (hora).

84

Curva de crecimiento tolerancia a glifosato de Bacillus megaterium

cultivo mixto (Consorcio). Experimento consorcio se llevaron a cabo bajo condiciones;

temperatura, tiempo (24hrs) e inoculadas en Medio mínimo mineral M9 (modificado añadiendo tres

aminoácidos, 0.2% glucosa y tiamina) respectivamente a concentraciones variables de patrón de

plaguicida 0-10000 ppm (línea azul 0 ppm; naranja 250 ppm; gris 500 ppm; amarilla 1000 ppm; azul

claro 2500 ppm; verde 5000 ppm; azul marino 10000 ppm representación gráfica de la curva entre

densidad óptica OD600 contra tiempo (hora).

85

Gráfica comparativa B. Subtilis WT; cepas individuales; cultivo

mixto curva de crecimiento a 5000 ppm. Se llevaron a cabo bajo condiciones;

temperatura, tiempo (24hrs) e inoculadas en Medio mínimo mineral M9 (modificado añadiendo tres

aminoácidos, 0.2% glucosa y tiamina) concentraciones del patrón de plaguicida 5000 ppm; línea

representada por color azul GVE7 Bacillus megaterium; naranja GVE19 Bacillus megaterium; gris

mix (consorcio); amarilla B. Subtilis WT; representación gráfica de la curva entre densidad óptica OD

600 nm contra tiempo (hora).

86

7.4 Etapa IV

7.4.1 Objetivo 4. Diseño de primer para genoteca de metagenómica funcional

dirigida a genes asociados a degradación de plaguicidas.

Para esta última etapa con base a los ensayos previos se determinó el panel

de oligos (primers) de cepas identificadas dentro del grupo II incluyendo consorcio

artificial, con el objetivo de proponer posible diseño para la genoteca de

metagenómica funcional dirigido para aquellos genes asociados a rutas centrales a

la degradación en específico a los cuatro plaguicidas, a través de MetaCyc se ha

identificado los siguientes genes para cada de los plaguicidas; glifosato phnJ,

carbofurán mcd, permetrina estP y por ultimo clorpirifós cpd, por lo que, se podrá

encontrar descrita en tanto a la vía de degradación, espacie de la cual han sido

aislados, así como también gen, proteína y numero de acceso en la Tabla 15.

Una vez determinada la base de datos correspondiente a cada vía de

degradación y ubicando el gen central, se realizó el diseño de primers, basándonos

en las 14 cepas correspondientes al grupo II (CLN1 Bacillus thuringiensis; NAV19

Bacillus cereus; NAV 5 Bacillus sp; GVE20 Bacillus albus; GVE6 Bacillus

aryabhattai; GVE7 Bacillus aryabhattai; GVE19 Bacillus aryabhattai; GVE5 Bacillus

aryabhattai; NAV18 Bacillus subtilis; CLN9 Bacillus subtilis; GVE12 Bacillus subtilis;

GVE3 Bacillus subtilis; NAV14 Bacillus subtilis y NAV10 Bacillus subtilis), esto con

la finalidad de generar un panel dirigido a la variedad de especies de Bacillus, por

tanto el diseño está en función de la relación gen-especie (Tabla 16).

87

Tabla 15. Base de datos vías de degradación asociadas a genes de degradación para glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós.

TOLERANCIA Vía

Degradación

Especie gen/ Acceso Proteína

GLIFOSATO Vía

C-P Liasa

VIA III

Rhizobium

meliloti

(cepa 1021)

Ensifer

meliloti

Sinorhizobium

meliloti

phnJ

SM_RS24155

Ubicación: plásmido:

pSymB

Secuencia:

NC_003078.1

UniProtKB - Q52987

α- D- ribosa 1-

metilfosfonato

5-fosfato CP-

liasa

CARBOFURÁN Vía

etilmalonil-

CoA

Rhodobacter

sphaeroides

mcd

SMR D3JV03

UniProt D3JV03

(2S) -

metilsuccinil-

CoA

deshidrogenasa

PERMETRINA --------- Klebsiella sp.

ZD112

estP

G-12541 (MetaCyc)

Q52NW7 (UniProt)

Piretroide

Hidrolasa

Esterasa

Hidrolizante de

piretroides

CLORPIRIFÓS Degradación

Clorpirifós

Paracoccus

sp. TRP

cpd

G-80423 (MetaCyc)

SAMN02746000_03607

A0A1X7LL67 (UniProt)

Clorpirifos

Hidrolasa

88

Tabla 16. Diseño de primers para la aplicación metagenómica

AISLADO

Carbofurán Glifosato Permetrina Clorpirifós

posición/tamaño posición/tamaño posición/tamaño posición/tamaño

CLN 1

Bacillus thuringiensis

cepa OCAT32

1 (66-361) --------- --------- ---------

315pb --------- --------- ---------

2 (180-599) --------- --------- ---------

439 pb --------- --------- ---------

3 (420-944) --------- --------- ---------

544 pb --------- --------- ---------

NAV 19

Bacillus cereus cepa

FORT 87

1(67-608) --------- --------- 1(178-313)

561 pb --------- --------- 136pb

2 (608-779) --------- --------- 2 (288-829)

191 pb --------- --------- 542 pb

NAV 5

Bacillus cereus cepa

FORT 87

1(67-608) --------- --------- 1(178-313)

561 pb --------- --------- 136pb

2 (608-779) --------- --------- 2 (288-829)

191 pb --------- --------- 542 pb

GVE 6

Bacillus aryabhattai cepa CN13-

5 Bacillus sp.

cepa HRTK156 Bacillus

megaterium cepa SD15

1 (90-203) 1 (59-226) 1 (486-1449) ---------

114 pb 168 pb 964 pb ---------

2 (185-575) 2 (117-569) 2 (1423-1557) ---------

391 pb 453 pb 154 pb ---------

3 (411-1115) 3 (444-745) 3 (752-1469) ---------

705 pb 302 pb 738 pb ---------

GVE 7

Bacillus aryabhattai cepa CN13-

5

1 (90-203) 1 (59-226) 1 (486-1449) ---------

114 pb 168 pb 964 pb ---------

2 (185-575) 2 (117-569) 2 (1423-1557) ---------

391 pb 453 pb 154 pb ---------

3 (411-1115) 3 (444-745) 3 (752-1469) ---------

705 pb 302 pb 738 pb ---------

GVE 19

Bacillus aryabhattai cepa IGND-

13

1 (90-203) --------- --------- ---------

114 pb --------- --------- ---------

2 (185-575) --------- --------- ---------

391 pb --------- --------- ---------

3 (411-1115) --------- --------- ---------

705 pb --------- --------- ---------

GVE 5

Bacillus aryabhattai cepa CN13-

5

1 (90-203) 1 (59-226) 1 (486-1449) ---------

114 pb 168 pb 964 pb ---------

2 (185-575) 2 (117-569) 2 (1423-1557) ---------

391 pb 453 pb 154 pb ---------

3 (411-1115) 3 (444-745) 3 (752-1469) ---------

705 pb 302 pb 738 pb ---------

89

NAV 18

Bacillus subtilis cepa CICC10028

1 (225-421) 1 (55-516) 1 (486-1449) 1 (51-261)

197 462 pb 964 pb 211 pb

2 (402-959) 2 (59-724) 2 (1423-1557) 2(289-308)

558 pb 681 pb 154 pb 359 pb

--------- --------- 3 (752-1469) 3 (629-846)

--------- --------- 738 pb 218 pb

CLN 9

Bacillus subtilis cepa

D9 16S

1 (225-421) --------- --------- ---------

197 --------- --------- ---------

2 (402-959) --------- --------- ---------

558 pb --------- --------- ---------

GVE 12

Bacillus subtilis cepa

D9 16S

1 (225-421) --------- 1 (486-1449) ---------

197 --------- 964 pb ---------

2 (402-959) --------- 2 (1423-1557) ---------

558 pb --------- 154 pb ---------

--------- --------- 3 (752-1469) ---------

--------- --------- 738 pb ---------

GVE 3

Bacillus subtilis cepa IAM 12118

1 (225-421) 1 (55-516) 1 (486-1449) ---------

197 462 pb 964 pb ---------

2 (402-959) 2 (59-724) 2 (1423-1557) ---------

558 pb 681 pb 154 pb ---------

--------- --------- 3 (752-1469) ---------

--------- --------- 738 pb ---------

NAV 14

Bacillus sp. cepa BAB-

5924 Bacillus

subtilis cepa sdau08-96

Bacillus velezensis cepa B6-2

1 (225-421) 1 (55-516) 1 (486-1449) ---------

197 pb 462 pb 964 pb ---------

2 (402-959) 2 (59-724) 2 (1423-1557) ---------

558 pb 681 pb 154 pb ---------

--------- --------- 3 (752-1469) ---------

--------- --------- 738 pb ---------

NAV 10

Bacillus sp. cepa BAB-

5924

1 (225-421) 1 (55-516) 1 (486-1449) 1 (32-233)

197 pb 462 pb 964 pb 202 pb

2 (402-959) 2 (59-724) 2 (1423-1557) 2 (149-899)

558 pb 681 pb 154 pb 751 pb

--------- --------- 3 (752-1469) ---------

--------- --------- 738 pb ---------

GVE 20

Bacillus albus cepa

FA77 Bacillus sp. (alternativa)

1 (66-380) --------- --------- ---------

315 pb --------- --------- ---------

2 (366-958) --------- --------- ---------

593 pb --------- --------- ---------

90

VIII. DISCUSIÓN

En los últimos años, el aumento en la demanda de alimentos a causa del

incremento en el número de población que se estima en 8.500 millones de personas

para el 2030, por lo que se ha intensificado el uso de los plaguicidas (Clark y Tilman,

2017; Crist et al., 2017). Los organofosforados (OP) posicionados como uno de los

principales en el mercado internacional como insecticidas y herbicidas (Liu et al.,

2018); Glifosato [Ácido 2- (fosfonometilamino) acético], herbicida más popular y de

amplio espectro, en los campos de producción agrícola desde 1974 (Gill et al.,

2017). Dado a informes actuales por la Agencia Internacional de Investigación

contra el Cáncer (IARC), la Organización Mundial de la Salud reclasificó a glifosato

en la categoría 2A (IARC, 2015; Bai y Ogbourne, 2016); Clorpirifós, [dietoxi-

sulfaniliden- (3,5,6-tricloropiridin-2-il) oxi-λ 5 -fosfano] toxicidad moderada (Clase II),

por su actividad insecticida de amplio espectro contra plagas de artrópodos, los

convierte en uno de los OP de mayor consumo (Liu et al., 2018).

Otros plaguicidas como carbofurán, [2,3-dihidro-2,2-dimetilbenzofuran-7-il

metilcarbamato] (insecticida, nematicida y acaricida), pertenece al grupo químico de

los carbamatos y a la categoría IB. Altamente peligroso (OMS); I. Altamente tóxico

(EPA), a pesar de ser químicamente inestable debido a la hidrólisis en el medio

ambiente, sus residuos a menudo se detectan en las aguas subterráneas debido a

su uso generalizado en el suelo y su alta fluctuación (Campbell et al., 2004). Dentro

de los piretroides con mayor estabilidad ambiental y actividad insecticida es

permetrina [3- (2,2-dicloroetenil) -2,2-dimetilciclopropano-1-carboxilato de (3-

fenoxifenil) metilo] el uso generalizado y la aplicación constante en los suelos

agrícolas, ha generado la acumulación en diferentes entornos, especialmente en el

suelo, debido que se unen fuertemente a las partículas y la materia orgánica de éste

(Antwi y Reddy, 2015). Permetrina se clasifica en el grupo IA. Extremadamente

peligroso (OMS); I. Altamente tóxico (EPA).

El movimiento de los plaguicidas en el suelo se produce por medio del flujo

intermedio, la lixiviación, el desbordamiento de la superficie, el drenaje subterráneo

y la transferencia de nutrientes minerales del suelo a los productos agrícolas (Dar

91

et al., 2019a). Por lo que, éste puede actuar como un medio potencial de transporte

de plaguicidas para contaminar el agua, el aire, suelo, las plantas y los alimentos,

impactando diferentes ecosistemas, así como también la salud humana. En la

presente investigación, se determinó la capacidad de tolerancia (CT) mediante el

crecimiento en medio sólido M9 como única fuente de carbono (patrón de

plaguicida) a diferentes concentraciones partiendo con 200 ppm hasta 10000 ppm

de glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós de cepas aislados de suelos

agrícolas de tres sitios diferentes (Culiacán, Guasave y Navojoa) y consorcios

natural como artificiales, se determinó el diseño para la conformación de consorcios

artificial, así como curva de crecimiento a concentraciones diferentes a un máximo

de 10000 ppm de glifosato, los aislados caracterizados como tolerantes se

identificaron por 16S rRNA y se diseñó un panel de oligos para genes asociados a

rutas metabólicas de degradación de éstos cuatro plaguicidas.

En la Etapa I/Fase I, se clasificaron el total de los 86 aislados (hongos,

bacteria y consorcio natural) en Grupo I (21/86) 24.42% CT cuatro plaguicidas,

incluyendo en este grupo a NAV 12 (CN) y Grupo II 75.58% (65/86) CT tres ≤

plaguicidas. Una vez agrupadas las cepas en función de su CT, se valoró grupo I

concentraciones máximas Etapa I/Fase II; por lo que, aislados que presentaron

crecimiento para el total de plaguicidas en tratamientos a 5000 ppm (GVE2, GVE7*,

GVE19*, GVE21, CLN4, CLN5, CLN6, CLN18, NAV6, NAV12*, G1, G2, G6, G7, G8,

N5, N6), y para 10000 ppm (GVE21, CLN4, CLN5, NAV12*, G1, G2, G6, G7, G8,

N5, N6) estos presentaron CT (3/4) plaguicidas (permetrina). En este experimento

se incluyeron GVE7 y GVE19 (consorcio artificial) presentado CT a 5000 ppm,

presentando un comportamiento diferente NAV12 (consorcio natural) ya que

presentó CT a 10000 ppm (carbofurán, permetrina y clorpirifós). Podemos

mencionar que dichas cepas se aislaron de suelos agrícolas del estado de Sinaloa

y Sonora. En el año 2019, el Instituto Nacional de Ecología y Cambio Climático

(INECC) presentó un panorama amplio y actual sobre las investigaciones y estudios

que se han efectuado en el país para detectar la presencia y cuantificar los niveles

de plaguicidas en agua superficial, agua subterránea y suelo en 125 sitios de

México, representando ambas entidades mayor actividad agrícola y del total de los

92

sitios identificados, se reporta el Valle de Culiacán, una zona con intensa actividad

agrícola y así como también el mayor número de plaguicidas detectados, con 31

ingredientes activos y algunos metabolitos. La acumulación de estos plaguicidas en

el ambiente, por diversos procesos, puede afectar la capacidad del suelo para

realizar sus funciones de producción biológica, protección ambiental y sustento de

la salud humana (Leyva-Morales et al., 2014b; Martínez-Valenzuela et al., 2017).

Sonora y Sinaloa utilizan entre un 40 y 50% de PAPs, destacando por su alta

toxicidad: paratión metílico, malatión, metamidofos, clorpirifós, monocrotofos,

paraquat, glifosato, carbofurán, metomilo, mancozeb, clorotalonil, dimetoato,

carbarilo, atrazina, 2,4-D, fosfuro de aluminio, imidacloprid, cipermetrina, lambda

cialotrina y endosulfán (Bejarano, 2017; García et al., 2018; Camarena et al., 2019).

Estos se han detectado en muestras de agua, sedimento, suelo agrícola,

organismos acuáticos, roedores entre otros (Arellano-Aguilar y Von Osten, 2016;

Hernández et al., 2018). Por lo que, dichos suelos han sido impactados a través de

los años por estos plaguicidas, indicando que un mayor tiempo de exposición al

plaguicida para estos suelos podría ser la causa de un aumento en la población

microbiana con capacidad de tolerancia a estos.

Por tanto, dado que los microorganismos persisten a compuestos

recalcitrantes, estos se han asociado y caracterizado por llevar a cabo funciones

importantes en relación con la degradación de xenobióticos, así como también influir

en los procesos físicos o químicos durante la degradación (Chakrabarty, 2017). Un

estudio reciente por Rosado-Flores et al., (2020), en este sentido caracterizaron

capacidad de tolerancia a 2, 4- diclorofenoxiacético (2,4-D) y malatión e identificaron

por 16S rRNA y región ITS, de una diversidad microbiana de suelos agrícolas de

diferentes localidades de Guanajuato, en el presente ensayo reportan la medición

de la capacidad de tolerancia en relación a la concentración celular por variantes de

densidad óptica (OD) a una longitud de 625 nm en medio mínimo (MM) líquido, por

lo que reportan cepas de Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas pavanii y

Acinetobacter lactucae crecimiento a una concentración > 2.0 g/L (2000 ppm) de

2,4-D y > 1.0 g/L (1000 ppm) de malatión. Así como, Fusarium sp., a 2.0 g/L (2000

ppm) de malatión y 0.9 g/L (900 ppm) de 2,4-D y Talaromyces variabilis a 3.1 g/L

93

(3100 ppm) de malatión. Menciono que, en otro estudio reportan de un total de seis

aislados de suelos agrícolas de Tailandia, una cepa con una capacidad de tolerancia

a clorpirifós a una concentración máxima de 2000 ppm en comparación de las

concentraciones reportadas en el medio ambiente (50-100 ppm), dicho ensayo es

importante destacar que para la medición de la capacidad de tolerancia que se llevó

bajo las siguientes condiciones; valoración crecimiento microbiano (turbidez) en

medio mínimo mineral M9 líquido a diferentes concentraciones de plaguicida

(clorpirifós), e identificada por 16S rRNA como Pseudomonas stutzeri CHL3, dicha

cepa presenta potencial para ser utilizada para biorremediación no sólo para

clorpirifós sino también para otros insecticidas organofosforados (Phumkhachorn,

2020).

En el presente estudio, respecto a la valoración capacidad de tolerancia (CT),

se empleó medio mínimo mineral M9 sólido aplicado en la metodología Etapa I, esto

debido a la composición del medio de cultivo (no complejo) siendo un parámetro

importante en los ensayos permitiendo un medio selectivo en presencia de

plaguicida. Por lo que, los medios complejos pueden incluir protectores, como

antioxidantes o agentes quelantes. Así mismo, estos ensayos tolerancia al estrés

químico, es necesario la presencia de energía para las bombas de eflujo molecular,

la actividad de chaperona , los cambios en la composición de la membrana y las

funciones de reparación (Nicolaou et al., 2010). En otro estudio, en el cual evaluaron

la capacidad de tolerancia a cinco plaguicidas (sales dimetilaminas, tri-

isopropanolaminas y de glifosato, atrazina y carbofurán) a concentraciones de 0.05,

1, 5 y 10% v/v (500, 10000, 50000 y 100000 ppm), utilizando dos medios de cultivo:

TY (Triptona / Extracto de Levadura) y Bushnell Haas (FLUKA) (Ortiz et al., 2019).

Debido a la diversidad de trabajos, enfocado en la capacidad de tolerancia y

degradación de plaguicidas se tiene una variación de expresión de unidades para

la concentración de patrón de plaguicidas, en el presente trabajo se manejó las

unidades (ppm) siendo la de mayor frecuencia. Así como, se definió el medio M9,

ya que nos permitió medir crecimiento microbiano sin fuente de carbono,

indicándonos su capacidad para tolerar y posiblemente utilizar los plaguicidas como

única fuente, en función de su crecimiento en medio sólido, como también reducir

94

tiempo y costo, debido que se trabajó en la primera etapa con un total de 86

aislados.

Los aislados, una vez valorada su capacidad de tolerancia a los diferentes

plaguicidas, en una segunda etapa los aislados seleccionados del Grupo II (GVE3,

GVE5, GVE6, GVE7*, GVE19*, GVE20, GVE12, CLN1, CLN9, NAV5, NAV10,

NAV14, NAV18, NAV19) (predominante glifosato y carbofurán), con el objetivo de

un análisis molecular (secuenciación 16S rRNA) identificados como Bacillus subtilis,

Bacillus megaterium Bacillus sp., Bacillus cereus, Bacillus albus, Bacillus

aryabhattai y Bacillus thuringiensis. Narsing Rao et al. (2019) evaluaron y proponen

reclasificar Bacillus aryabhattai como sinónimo heterotípico posterior de Bacillus

megaterium de Bary 1884 (Listas aprobadas 1980). Por lo que, las cepas

identificadas como Bacillus aryabhattai (GVE5, GVE6, GVE7*, GVE19*) podrán

renombrarse como Bacillus megaterium (Figura 26). Microorganismos

caracterizados como biorremediadores de plaguicidas son Pseudomonas sp.,

Bacillus sp., Klebsiella sp., Pandoraea sp., Phanerochaete chrysosporium y

Mycobacterium sp. (Odukkathil y Vasudevan, 2013).

En particular, se reporta crecimiento de Baciillus subtilis Bs-15 en

concentraciones altas de glifosato como fuente de carbono y fosfato, presentando

una capacidad de tolerancia máximas de 40000 ppm en medio mínimo mineral MS1

líquido midiendo CT a OD a una longitud de 600 nm (crecimiento bacteriano), así

como también reportan condiciones óptimas para el crecimiento bacteriano y la

degradación del glifosato menos de 10000 ppm de glifosato, temperatura de 35°C y

un pH de 8.0; medido en suelos estéril y no estéril (Yu et al., 2015). Este reporte,

coincide con los aislados (NAV18, NAV14, NAV10, GVE12, GVE3, CLN19)

identificados como Baciillus subtilis con una CT 200 ppm a glifosato, por lo que, es

necesario continuar aumentando la concentración ya que pueden presentar una

mayor capacidad de tolerancia y ser un candidato para las próximas combinaciones

de consorcios pudiendo presentar similitud con el aislado Bs-15. En relación con los

resultados presentados en la valoración de medio líquido de las cepas para la

conformación de consorcios (GVE7* y GVE19*) Bacillus megaterium los cuales

95

presentaron CT a glifosato a 5000 ppm, se podría continuar adecuando el medio de

cultivo como única fuente de fosfato, ya que solo evaluamos fuente carbono, de

igual forma trabajar con el diseño del medio MS1 que podría ser una posible

alternativa para el mejoramiento de condiciones óptimas para el crecimiento de

estas dos cepas. Así también la cepa NAV 12 (CN) CT 10000 ppm a glifosato será

necesario aumentar concentraciones, con las diferentes variables (M9 y MS1), y

fuente (carbono y fosfato).

Por otra parte, es necesario mencionar que para determinar las

concentraciones de los diferentes plaguicidas que nos permitió identificar aquellas

cepas con CT, se requiere una revisión en función de concentraciones asociadas a

la degradación. En este sentido, se reporta Bacillus cereus CBMAI2067, aislada de

la sabana brasileña para la biodegradación de esfenvalerato (piretroide) 100 mg/L

o ppm (67 ± 3% de biodegradación), estos resultados nos permiten contrastar tanto

el emplear medio sólido M9 y las concentraciones determinadas iniciando una

primera etapa determinando capacidad de tolerancia CT a 200 ppm (concentración

media; glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós), en esta etapa encontramos

dos cepas (NAV5/NA19) identificadas como Bacillus cereus, capacidad de

tolerancia a 200 ppm para permetrina siendo un piretroide, de modo que nos permite

comparar nuestro resultados con la capacidad de degradación de la cepa Bacillus

cereus CBMAI2067, teniendo en cuenta que empleamos medio sólido permitiendo

así valorar crecimiento microbiano y no concentración del plaguicida, por lo que,

podemos concluir que a concentraciones mayores de 100 ppm podemos asociar

capacidad de tolerancia con degradación, debido a que estas bacterias crecen bajo

un estrés químico.

El género de Bacillus pertenece a la familia Bacillaceae que comprende 293

especies/subespecies. Estos comparten características similares, son bacterias

grampositivo, aeróbicas o anaeróbicas facultativas, formadoras de esporas (Patel y

Gupta, 2020). Especies de Bacillus se han aislado de una variedad de fuentes, al

ser ubicuos. Por lo que, bacilos constituyen un grupo versátil de bacterias, con

aplicaciones en el campo salud, medio ambiente y agricultura. Producen varios

96

metabolitos secundarios que incluyen antibióticos y biosurfactantes (Caulier et al.,

2019). Además, son fuentes potenciales de enzimas industriales que incluyen

lipasas, proteasas, alfa-amilasa y la enzima de restricción BamH1 (Latorre et al.,

2016). Asimismo, en la biodegradación de varios xenobióticos entre ellos incluidos

los plaguicidas. Debido a que, Bacillus, puede degradar los compuestos tóxicos por

medio de dos procesos; (i) Mineralización completa, (ii) Co-metabolismo (Arora,

2020). Onunga et al. (2015) identificaron Bacillus sp. pudiendo considerarse Bacillus

cereus o Bacillus thuringiensis, reportan como cepa nativa con capacidad de

biodegradación ya que, mineraliza el 98% de 100 μg/mL o ppm de carbofurán en 10

días. Esto coincide con nuestro trabajo, aislado Bacillus cereus (NAV19) y Bacillus

thuringiensis (CLN1) ambas cepas presentaron CT 200 ppm a carbofurán,

mencionemos que ambos experimentos se realizaron bajo determinadas

condiciones y objetivos diferentes, nuestro ensayo es solo valoración de capacidad

de tolerancia en medio sólido, por lo que, estas dos cepas podrían considerarse

para cuantificación de plaguicida por cromatografía de gases (GC) y cromatografía

líquida de alta resolución (HPLC).

En esta segunda etapa, se elaboró dendograma aislados identificados

asociados a su capacidad de tolerancia, para determinar correlación entre especie

y CT, facilitando su clasificación (Figura 28). Las cepas con capacidad de tolerancia

a glifosato 200 ppm son; Bacillus cereus (NAV19), Bacillus aryabhattai (GVE7;

GVE5), Bacillus subtilis (NAV18; NAV14; NAV10) resultados representados en el

dendograma. Estos resultados concuerdan con el primer informe de la cepa CB4

Bacillus cereus con capacidad de degradar glifosato (Fan et al., 2012). Además, se

reporta B. megaterium asociado biorremediación de sitios contaminados con

glifosato, debido a que utiliza glifosato como fuente de carbono y fósforo (Mousa et

al., 2019). Por consiguiente, el hecho de encontrar en nuestros aislados diversas

especies de Bacillus, confiere a este grupo II un potencial para futuros trabajo

derivados de estas evidencias, teniendo en cuenta que este grupo no se llevó a

máximas concentraciones (5000 y 10000 ppm), además mencionar que podrían ser

posibles candidatos para la combinación de más consorcios, considerando que en

97

esta etapa de investigación solo se logró desarrollar un consorcio artificial y obtener

de los aislados un consorcio natural.

El uso de consorcios microbianos para mejorar la eficiencia de la

biodegradación ha aumentado debido a su capacidad de metabolismo sinérgico. El

intermediario metabólico de un microorganismo puede ser utilizado por otra para

una degradación eficiente, acelerando así la biodegradación y evitando los posibles

efectos tóxicos de los metabolitos formados (Li et al., 2017; Villaverde et al., 2017a).

Los consorcios de tres microorganismos (Brevibacterium frigoritolerans, Bacillus

aerophilus y Pseudomonas fulva) degradan forato (entre 97.65 y 98.31%) a

concentraciones de 100, 200 y 300 mg/kg o ppm en suelos inoculados con cultivos

mixtos (Villaverde et al., 2017b). Por lo contrario, reportan un consorcio bacteriano

(Lysinibacillus xylanilyticus CBMAI2085, Bacillus cereus CBMAI2067, Lysinibacillus

sp. CBMAI2051 y Bacillus sp. CBMAI2052) aislados de la sabana brasileña para la

biodegradación de 100 mg/L o ppm de esfenvalerato (piretroide) como única fuente

de carbono en medio de cultivo líquido en un tiempo de 12 días en un 90%, también

compararon el consorcio bacteriano (52 ± 5% de biodegradación) en relación al

promedio de las mismas cepas individuales (40 ± 7% de biodegradación) reportando

mayor eficiencia el consorcio, lo que demuestra que el uso de consorcios es un

enfoque interesante. Sin embargo, la cepa Bacillus cereus CBMAI2067 (67 ± 3% de

biodegradación) fue más eficiente que el consorcio bacteriano, mostrando su

potencial como fuente de carboxilesterasas y demostrando que, en este caso, el

uso de una cepa eficiente única es más adecuado (Anjos et al., 2020).

Se ha conformado un consorcio microbiano artificial a partir de las cepas

grupo II (GVE7 y GVE19) B. megaterium identificadas por 16S rRNA y previamente

caracterizadas dado que cumplen con capacidad de tolerancia carbofurán, glifosato,

clorpirifós y permetrina a concentraciones hasta 5000 ppm M9 sólido valorado

durante 7 días de incubación y curva de crecimiento M9 líquido concentraciones 0-

10000 ppm de glifosato valorada durante 24 hrs, así como también un consorcio

natural NAV12 el cual ha sido caracterizado con un potencial de tolerancia a

concentraciones máximas de 10000 ppm en medio sólido M9 durante 7 días. En el

98

contexto del panorama de valoración en medio líquido, podemos referenciar el

trabajo de Uniyal et al., (2021) ya que evaluaron crecimiento bacteriano y

biodegradación a una concentración inicial de 50 mg/L o ppm de clorpirifós como

única fuente de carbono en medio líquido MSM; tanto de consorcios como de

cultivos axénicos, dichos aislados de muestras de suelos de huertos de manzana,

en tanto reportan capacidad de degradación de CP de cepas bacterianas y el

consorcio presentando una disminución en la concentración de CP con degradación

completa durante los 8 y 6 días de incubación, respectivamente. Por lo que reportan

de acuerdo con el orden: consorcio ECO-M> Cepa ECO2 de Cellulosimicrobium

funkei > Cepa ECO1 de Agrobacterium tumefaciens > Cepa ECO3 de Shinella

zoogloeoides > Cepa ECO4 de Bacillus aryabhattai, dado que concluyen que el

consorcio ECO-M formado por la cepa ECO1 de Agrobacterium tumefaciens, la

cepa ECO2 de Cellulosimicrobium funkei, la cepa ECO3 de Shinella zoogloeoides

y la cepa Bacillus aryabhattai ECO4, establece un enfoque más eficaz para la

biodegradación de CP en comparación con los cultivos axénicos. En contraste con

nuestros resultados en los ensayos valoración capacidad de tolerancia a glifosato

como única fuente de carbono a concentraciones 0-10000 ppm en medio líquido M9

para cepas individuales y cultivo mixto (consorcio), en nuestro diseño se utilizaron

concentraciones iniciales máximas, a diferencia de concentraciones bajas (50 mg/L

o ppm) de clorpirifós empleadas por Uniyal et al., (2021) ya que reportan capacidad

de degradación y no capacidad de tolerancia, así como también cuantificación del

plaguicida por cromatografía. Por lo que, se demostró así en la (Figura 26) gráfica

comparativa B. Subtilis WT; cepas individuales; cultivo mixto curva de crecimiento

a 5000 ppm, en la cual no se logró observar diferencia significativa en el

comportamiento entre consorcio y cultivos axénicos, debido que solo se valoró

capacidad de tolerancia bajo un diseño de concentración nula hasta máximas

valoradas durante 24 hrs, por lo que es necesario diseñar ensayos a

concentraciones 5000 ppm y evaluar a un mayor tiempo (días) y cuantificar

concentraciones inicial y final del plaguicida, como lo sugiere dicho reporte. Otro

punto que es pertinente mencionar, es que en ambos ensayos tanto el de Uniyal et

al., (2021) y nuestros ensayos, se evaluaron organofosforados diferentes clorpirifós

99

y glifosato, por lo que, coinciden en la identificación de Bacillus aryabhattai ECO4

(degradación completa 50 mg/L o ppm CP) con las cepas del presente trabajo

reportadas como Bacillus aryabhattai (GVE5, GVE6, GVE7*, GVE19*)

caracterizadas en función de su capacidad de tolerancia en medio sólido M9 a 200

ppm de glifosato presentando crecimiento positivo el total de las cepas, y en

relación al crecimiento en medio líquido M9 a concentraciones 250, 500, 1000, 2500,

5000 ppm mismo patrón de plaguicida positivas (GVE7 y GVE19). Estos resultados,

coinciden con el reporte de Elarabi et al. (2020), aislaron una cepa con capacidad

de tolerancia a 50, 100, 150, 200 y 250 mg/mL (50000, 100000, 150000, 20000 y

250000 ppm) concentraciones máximas de glifosato valorado en líquido medio de

sales minerales (MSM) cuantificando UFC durante 7 días, dicha cepa identificada

como Bacillus aryabhattai FACU3 por 16S rRNA. Podemos destacar que en tal

estudio se emplearon concentraciones para aislar y caracterizar CT a glifosato

mayores a las reportadas en nuestros aislados, dado al tiempo, debido que

valoramos durante 24 horas. Pailan et al. (2015) reportan una nueva cepa de

Bacillus aryabhattai SanPS1 aislada del suelo de un campo agrícola en India,

identificación por 16S rRNA, reportan CT a hasta 500 µg/mL o ppm para clorpirifós

y paratión, y una degradación de paratión (200 µg/mL o ppm) aproximadamente del

56% en medio mineral líquido (MM) durante las primeras 24 hrs. Por consiguiente,

se puede concluir que la especie de Bacillus aryabhattai presenta un amplio

espectro a diferentes organofosforados.

El diseño de consorcios microbianos aislados de suelos contaminados podría

asegurar una biorremediación más efectiva. Con relación a los resultados de la

presente tesis el consorcio artificial (B. megaterium) CT 5000 ppm, nos permite

formar consorcio de los cuales se pueden modificar, mejorar condiciones de

supervivencia, siendo que estas características son de alto interés en el desarrollo

de este tipo de consorcios, por tanto, se dejan los principios para futuras

combinaciones del resto de los aislados tanto del Grupo I y II. Asimismo, con lo que

respecta el consorcio natural NAV12 caracterizado CT 10000 ppm medio sólido M9,

se sugiere continuar con una identificación molecular, siendo un candidato para

evaluación en medio líquido (curva de crecimiento). Ambos consorcios, son buenos

100

candidatos para cinética de degradación, para dar seguimiento de la presente

investigación.

Aun cuando, se ha reportado diversos microorganismos caracterizados por

su capacidad de tolerar, degradar xenobióticos como los plaguicidas, así como

también se han descrito numerosas rutas metabólicas y aislamiento de enzima

centrales. Para confirmar nuestra hipótesis la presencia y variación de genes de los

integrantes del consorcio microbiano aumentará el espectro de tolerancia a diversas

familias de plaguicidas. En la última etapa, se trabajó no solo con el consorcio

artificial sino con el total de las cepas previamente identificadas variedad de especie

del género Bacillus (Grupo II), por lo que nuestro diseño de metagenómica funcional

está dirigida a un panel de cuatro genes glifosato phnJ, carbofurán mcd, permetrina

estP, y clorpirifós cpd (Tabla 16). Este es, hasta donde sabemos, el primer reporte

de cebadores diseñados para apuntar más de un gen asociados a la degradación

para varias familias de plaguicidas en particular para especies del género de

Bacillus, con aplicación tanto para cultivos puros o metagenómica funcional para

diferentes fuentes ambientales. Además, se propone desarrollar un diseño de

reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para futuros ensayos,

pudiendo ser un sustituto rentable para determinar el potencial de degradación para

carbofurán, glifosato, clorpirifós y permetrina en diferentes ambientes, por medio de

la cuantificación directa de mcd, phnJ, cpd y estP. En este sentido, reportan el primer

diseño de cebadores degenerados dirigidos al gen phnJ en bacterias, phnJF1 y

phnJR2 amplifican un fragmento de tamaño apropiado para ensayo de qPCR

(Morales et al., 2020).

101

IX. CONCLUSIÓN

1. El cribado de 86 cepas aisladas de suelos agrícolas, mediante el

crecimiento en medio sólido M9 patrón de plaguicida 200 ppm, el cual

permite valorar crecimiento microbiano sin fuente de carbono,

indicándonos su capacidad para tolerar y posiblemente utilizar los

plaguicidas como única fuente; Grupo I (21/86) 24.42% CT cuatro

plaguicidas, incluyendo en este grupo a NAV 12 (CN) y Grupo II 75.58%

(65/86) CT tres ≤ plaguicidas.

2. Aumento de las concentraciones 5000 y 10000 ppm, nos permitió una

clasificación dentro del grupo I y caracterizar aquellas cepas que soportan

más de 200 ppm, siendo las concentraciones máximas un indicativo de

tolerancia asociado a un potencial de degradación; 5000 ppm (GVE2,

GVE7*, GVE19*, GVE21, CLN4, CLN5, CLN6, CLN18, NAV6, NAV12*,

G1, G2, G6, G7, G8, N5, N6), y para 10000 ppm (GVE21, CLN4, CLN5,

NAV12*, G1, G2, G6, G7, G8, N5, N6) estos presentaron CT (3/4)

plaguicidas.

3. Conformación de un consorcio artificial con capacidad de tolerancia a

5000 ppm y caracterización de un consorcio natural con capacidad de

tolerar una concentración máxima 10000 ppm, son candidatos para

productos de biodegradación de estos plaguicidas.

4. Análisis molecular Grupo II (secuenciación 16S rRNA) identificados como

Bacillus subtilis, Bacillus megaterium Bacillus sp., Bacillus cereus,

Bacillus albus, Bacillus aryabhattai y Bacillus thuringiensis. Esto coincide

con lo reportado en trabajos previos ya que, el género de Bacillus es una

de las principales bacterias asociadas a los procesos de biodegradación.

5. Este es, hasta donde sabemos, el primer reporte de cebadores diseñados

para apuntar más de un gen asociados a la degradación para varias

familias de plaguicidas en particular para especies del género de Bacillus,

con aplicación tanto para cultivos puros o metagenómica funcional para

diferentes fuentes ambientales.

102

X. PERSPECTIVAS

• Realizar la metagenómica funcional para un consorcio microbiano

tolerantes a carbofurán, glifosato, clorpirifós y permetrina o para

diferentes ambientes impactados por estos plaguicidas.

103

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125

XII. ANEXOS

Anexo I. Base de datos plaguicidas en estudio

PLAGUICIDAD DT50 (en suelos) TOXICIDAD REGISTROS

CARBOFURÁN (Insecticida, Acaricida,

Nematicida)

30-117 Días Moderadamente degradable

IB. Altamente peligroso (OMS); I. Altamente tóxico (EPA)

8

CLORPIRIFÓS ETIL (Insecticida)

3 mese - 1 año Muy ligeramente degradable

II. Moderadamente peligroso (OMS);

II. Moderadamente tóxico (EPA) 165

FAENA (GLIFOSATO)

(Herbicida)

8-280 días Ligeramente degradable

IARC calificó a glifosato como “probablemente carcinógeno en

humanos” (categoría 2A) 85

PERMETRINA (Insecticida)

mayor estabilidad a pH 4; DT50 50 d a pH 9; estable a pH 5 y 7 a 25 ºC y al calor (>2 años a 50 ºC) ˂38 Días Moderadamente

Degradable

IA. Extremadamente peligroso (OMS); I. Altamente tóxico (EPA).

139

126

Anexo II. Valorar la capacidad de tolerancia a 200 ppm glifosato, carbofurán,

permetrina y clorpirifós de las cepas aislados

127

Anexo III. Escala ponderada para evaluar el crecimiento microbiano en medio

solido-ensayo de tolerancia a glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós.

(a

(a)

a) Densidad; valores (0-6) b) Área; valores (0-4)

*bacterias: densidad y área **hongos: área

(b

(a)

128

Anexo IV. Script en R para generar un mapa de calor con la distribución de datos.