UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA

DINÁMICA DE LA BIODIVERSIDAD EN PROCESOS DE

BIOLIXIVIACIÓN

MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL QUÍMICO

MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGÍA

PAULINA BRUSADELLI ACUÑA

PROFESOR GUÍA BLANCA ESCOBAR MIGUEL

MIEMBROS DE LA COMISIÓN ORIANA SALAZAR AGUIRRE

TOMÁS VARGAS VALERO

SANTIAGO DE CHILE OCTUBRE 2007

RESUMEN DE LA MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL QUÍMICO E INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGÍA POR: PAULINA BRUSADELLI ACUÑA FECHA: 23/10/2007 PROF.GUÍA: Sra. BLANCA ESCOBAR M.

“DINÁMICA DE LA BIODIVERSIDAD EN PROCESOS DE BIOLIXIVIACIÓN”

El presente trabajo de título tiene por objetivo estudiar la dinámica de la biodiversidad en procesos de biolixiviación, es decir, busca establecer alguna relación entre la variación de los parámetros fisicoquímicos presentes en el ambiente en estudio y las bacterias identificadas para cada condición. Su importancia en estos procesos, radica en determinar los parámetros fisicoquímicos que estimulan o inhiben la actividad de los microorganismos involucrados, para optimizar la recuperación de cobre, importante en nuestro país.

Para esto, se utilizó la técnica de determinación de los polimorfismos de los largos de los fragmentos terminales de restricción (T-RFLP) en soluciones obtenidas de una mini columna de biolixiviación, con lo que se logró identificar las poblaciones bacterianas presentes.

Para corroborar la información obtenida con el protocolo propuesto por Gabriela Morales, se buscó una enzima de restricción adicional para el método de T-RFLP. La segunda enzima seleccionada correspondió a MspI, la cual mostró ser capaz de distinguir entre dos de las especies bacterianas encontradas en los procesos de biolixiviación, L.ferrooxidans y Sb.thermosulfidooxidans, pero no proporciona ningún aporte frente al otorgado por RsaI, que es capaz de distinguir entre A. ferrooxidans y A.thiooxidans.

Se determinó que es válido considerar como bacterias presentes en la solución, aquellas cuyos TRFs se encuentren presentes en la muestra analizada al digerir con cada enzima de restricción por separado., sin poder descartar plenamente las que se encuentren sólo con una enzima por poder asociarse a errores del método de T-RFLP.

En la mayoría de las muestras se encontraron α proteobacterias y A.ferrooxidans. Además, en las soluciones estudiadas se determinó la presencia de A.thiooxidans, Sb.thermosulfidooxidans, Sb.acidophilus Desulfosporosinus spp., Shewanella spp. Arthrobacter spp., o Ferrimicrobium acidiphilium, Acidomonas methanolica, Acidocella spp., Acidiphilum spp. o Acidimicrobium ferrooxidans.

Al analizar lo parámetros fisicoquímicos de las muestras estudiadas, se destaca la disminución de la diversidad bacteriana a medida que aumentan los iones metálicos en solución y la mayor cantidad de bacterias generadas en las muestras con aireación.

Los parámetros fisicoquímicos de la muestra 4 mostraron ser los más favorables para la diversidad bacteriana: Eh de 597 mV, pH inicial de 1,6, pH final de 1,4, concentración inicial de FeSO4 de 6 g/l y aire.

A través del índice de diversidad de especies, no se logró observar, en ninguno de los casos, una correspondencia entre el aumento de las condiciones inhibitorias y la disminución del índice. En el caso del índice de Shannon-Wiener, se observó una cierta tendencia a disminuir en algunas muestras a medida que aumentaron los iones metálicos en solución, pese a que ambos índices pueden verse afectados por los errores asociados al T-RFLP.

Se observó concordancia entre los dendrogramas elaborados a partir de la aparición de las bacterias en cada muestra, según los resultados de la digestión con RsaI o MspI, debido a que los TRFs asociados a las mismas bacterias fueron agrupados de igual forma. Además se observó que las agrupaciones realizadas eran congruentes con las características de las bacterias encontradas en el sistema estudiado.

El análisis de componentes principales mostró no ser concluyente a la hora de agrupar los TRFs asociados a bacterias biolixiviantes según su aparición en las soluciones, principalmente debido a que su elaboración toma en cuenta las abundancias relativas de los fragmentos considerados.

Finalmente, no se encontró una relación entre las soluciones, a partir de las bacterias encontradas en cada una, que fuera congruente con los parámetros fisicoquímicos analizados.

A mis padres, Mario y Mª Alicia, mis hermanos, Cristóbal, Italo y Romina, y Marco.

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Agradecimientos

En el momento en que termino una etapa más de mi vida, miro hacia atrás y doy las gracias a todos los que en algún momento influyeron en la persona en que me he convertido.

En primer lugar, a mi familia le agradezco su apoyo incondicional. Agradezco a mi papá por darme la oportunidad de estudiar la carrera que quise, en donde quise. A mi mamá, por brindarme siempre su apoyo y por tratar de hacerme la vida más sencilla, para poder así enfocarme en mis estudios. A mis hermanos, Cristóbal e Italo simplemente por estar ahí sin importar nada, y a Romina por su alegría de niña que siempre me ha hecho recordar lo lindo que es jugar sin preocupaciones y por su cariño incondicional.

No puedo dejar de agradecer a la “mamma”, mi abuelita Alicia, por su constante apoyo y sus rezos de ayuda en los momentos complicados, ni a la “nonna”, Sonia, por su preocupación constante.

A Marco le agradezco su apoyo constante, su ayuda y su paciencia desde el primer momento, porque simplemente es mi amigo y compañero, con el que me siento feliz.

Agradezco la preocupación y el apoyo incondicional de mi amiga de la vida, Andrea, además de la buena disposición a pasar un momento agradable siempre que fuera requerido.

A Karla e Ivana, les agradezco su comprensión y apoyo en este último tiempo, y, por supuesto, su grata compañía.

A Germán le agradezco su compañía, su alegría, sus locuras, sus tonteras y su amistad, por sacarme una sonrisa y hacerme olvidar las preocupaciones aunque fuera por un momento.

A todos aquellos que me han acompañado, y, cómo olvidarlos, a los que compartieron conmigo en la “salita” les agradezco esos gratos momentos de estudio, ocio y divagaciones.

Finalmente, agradezco a mi profesora guía, Sra. Blanca Escobar, por su apoyo y ayuda en el transcurso de la memoria.

..y a todos los que se me hayan quedado en el tintero, gracias…

Amigos míos, nos vemos en la vida…

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Índice

Capítulo 1. Introducción....................................................................................................................................2 1. 1. Aspectos Generales ..............................................................................................................................2

1. 2. Antecedentes Bibliográficos ................................................................................................................3

1. 2. 1. Microorganismos lixiviantes ........................................................................................................4 1. 2. 2. Factores que influyen en la rapidez de la biolixiviación ..........................................................6 1. 2. 3. Inhibición de la actividad enzimática de los microorganismos biolixiviantes......................7 1. 2. 4. Técnica de T-RFLP.......................................................................................................................7 1. 2. 5. Comparación de poblaciones microbianas a través de análisis estadísticos .........................8

1. 3. Descripción del Proyecto.....................................................................................................................9

1. 4. Objetivos ..............................................................................................................................................10

1. 4. 1. Objetivo General........................................................................................................................ 10 1. 4. 2. Objetivos específicos................................................................................................................. 10

1. 5. Alcances................................................................................................................................................10

Capítulo 2. Metodología.................................................................................................................................. 11 2. 1. Materiales .............................................................................................................................................11

2. 2. Métodos................................................................................................................................................11

2. 2. 1. Selección de la segunda enzima a utilizar ............................................................................... 11 2. 2. 2. Obtención de muestras de bacterias desde una mini-columna de biolixiviación ............. 12 2. 2. 3. Extracción de DNA desde soluciones de procesos de biolixiviación ................................ 14 2. 2. 4. T-RFLP........................................................................................................................................ 15 2. 2. 4. 1. Amplificación de un fragmento del rDNA 16S............................................................ 15 2. 2. 4. 2. Purificación y cuantificación del DNA .......................................................................... 15 2. 2. 4. 3. Digestión de los productos de PCR y electroforesis capilar ....................................... 16 2. 2. 4. 4. Procesamiento de los resultados de la electroforesis capilar....................................... 16

2. 2. 5. Análisis utilizados para comparar las especies bacterianas encontradas ............................ 17 2. 2. 5. 1. Determinación de la abundancia relativa de los TRFs................................................. 17 2. 2. 5. 2. Índices de biodiversidad................................................................................................... 17 2. 2. 5. 3. Análisis de cluster .............................................................................................................. 18 2. 2. 5. 4. Análisis de componentes principales.............................................................................. 19

Capítulo 3. Resultados..................................................................................................................................... 20 3. 1. Selección de la segunda enzima a utilizar en los análisis de T-RFLP..........................................20

3. 2. Variación de los parámetros fisicoquímicos en las muestras estudiadas.....................................21

3. 3. Obtención de microorganismos, DNA genómico y producto amplificado...............................25

3. 4. Determinación de las poblaciones bacterianas en solución y su comparación mediante

diversos análisis............................................................................................................................................28

3. 4. 1. Determinación de la abundancia Relativa de los TRFs ........................................................ 28 3. 4. 2. Comparación de los índices de biodiversidad........................................................................ 32 3. 4. 3. Comparaciones de las muestras estudiadas ............................................................................ 33 3. 4. 3. 1. Comparación entre los TRF asociados a bacterias según su aparición en las muestras ............................................................................................................................................... 33 3. 4. 3. 2. Comparación entre las soluciones según la aparición de bacterias en solución....... 35

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3. 4. 3. 3. Comparación de los TRFs mediante el análisis de componentes principales .......... 37 Capítulo 4. Discusión ...................................................................................................................................... 39 4. 1. Selección de la segunda enzima de restricción a utilizar ...............................................................39

4. 2. Análisis de los parámetros fisicoquímicos de las muestras estudiadas........................................40

4. 3. Obtención de microorganismos, DNA genómico y fragmentos amplificados del rDNA 16S41

4. 4. Análisis de los TRFs encontrados y su relación con las condiciones de la mini-columna.......42

4. 5. Análisis de la diversidad biológica en la mini-columna .................................................................46

4. 5. 1. Análisis de los índices diversidad de especies y de Shannon-Wiener ................................. 46 4. 5. 2. Comparación entre las distintas muestras obtenidas de la mini-columna ......................... 47 4. 5. 2. 1. Comparación entre las bacterias encontradas en solución.......................................... 47 4. 5. 2. 2. Comparación entre las soluciones según las bacterias encontradas........................... 49

4. 6. Efectos de los errores asociados a la metodología de T-RFLP....................................................50

4. 6. 1. Asociados a la extracción de DNA.......................................................................................... 50 4. 6. 2. Asociados a la reacción de PCR............................................................................................... 50 4. 6. 3. Asociados a la digestión enzimática ........................................................................................ 50

Capítulo 5. Conclusiones ................................................................................................................................ 52 Bibliografía ........................................................................................................................................................ 54 Anexos............................................................................................................................................................... 57 Anexo A. Partidores utilizados ..................................................................................................................57

Anexo B. Soluciones utilizadas..................................................................................................................57

Anexo C. Protocolos...................................................................................................................................59

(a) Protocolo de electroforesis en gel de agarosa al X%. .................................................................. 59 (b) Protocolo de determinación de Fe+2 y fierro total. ...................................................................... 59

Anexo D. Tablas de las enzimas de restricción, su sitio de restricción y el largo de los fragmentos

que se forman...............................................................................................................................................60

(a) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de Acidithiobacillus caldus. (776 pb) .............................................................................................................. 60 (b) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de Acidithiobacillus ferooxidans. (776 pb) ...................................................................................................... 65 (c) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de Acidithiobacillus thiooxidans. (776 pb) ...................................................................................................... 70 (d) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de Leptospirillum ferrooxidans. (778 pb) ........................................................................................................ 74 (e) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de Sulfobacillus thermosulfidooxidans. (766 pb) .............................................................................................. 78

Anexo E. Digestión virtual ........................................................................................................................82

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Índice de Tablas

Tabla 1. Máxima concentración de iones metálicos (en [g/l]) en la cual se observa crecimiento o actividad enzimática............................................................................................................................................7 Tabla 2. Condiciones y concentraciones iniciales de los iones de cada muestra en la columna de biolixiviación..................................................................................................................................................... 13 Tabla 3. Concentraciones necesarias de los reactivos para la reacción de PCR. .................................... 15 Tabla 4. Programa de PCR utilizado. ............................................................................................................ 15 Tabla 5. Concentración de los reactivos en la digestión de los productos de PCR ............................... 16 Tabla 6. Tamaño en pb de los TRF obtenidos con el programa Virtual Diegest a través de la digestión con las enzimas de restricción RsaI y MspI, de forma independiente y de forma combinada (RsaI+MspI). .................................................................................................................................................... 20 Tabla 7. Valores de los parámetros estudiados para cada muestra a la que fue sometida la mini-columna. ............................................................................................................................................................ 22 Tabla 8. Abundancias relativas de los TRFs más significativos obtenidos en todas las muestras digeridas con RsaI. ........................................................................................................................................... 28 Tabla 9. Abundancias relativas (en porcentaje) de los TRFs más significativos obtenidos en todas las muestras para la digestión con MspI............................................................................................................. 29 Tabla 10. Bacterias presentes en las soluciones a partir del análisis de T-RFLP con RsaI y MspI de forma independiente........................................................................................................................................ 30 Tabla 11. Índice de diversidad de especies (S) de cada muestra según la enzima de restricción utilizada (RsaI o MspI). ................................................................................................................................... 32 Tabla 12. Índice de Shannon-Wiener (H) de cada muestra según la enzima de restricción utilizada (RsaI o MspI).................................................................................................................................................... 32 Tabla 13. Composición de medio MC. ......................................................................................................... 57 Tabla 14. Composición del Buffer A2X. ........................................................................................................ 57 Tabla 15. Composición del Buffer de lavado................................................................................................. 57 Tabla 16. Composición del Buffer TE............................................................................................................ 58 Tabla 17.Composición del Buffer de carga 6X.............................................................................................. 58 Tabla 18. Composición del Buffer TAE 50X. ............................................................................................... 58 Tabla 19. Composición del Buffer de almacenamiento................................................................................ 58 Tabla 20. Composición del estándar de peso molecular, 1 Kb. ................................................................ 58 Tabla 21. Composición de la solución de la RNasa.................................................................................... 58 Tabla 22. Tamaños de los TRFs obtenidos de la digestión virtual de las bacterias asociadas a procesos de biolixiviación................................................................................................................................................ 82

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Índice de Figuras

Figura 1. Esquema de los distintos tipos de lixiviación de un sulfuro según Tributsh (obtenida de Ballester 2005). ....................................................................................................................................................4 Figura 2. Esquema del método de t-RFLP......................................................................................................8 Figura 3. Esquema del proceso de selección de la segunda enzima a utilizar. ........................................ 12 Figura 4. Mini columna de biolixiviación. (a) Foto lateral de la mini columna de biolixiviación; (b) foto del mineral a procesar; (c) esquema de la mini columna de biolixiviación. ................................... 13 Figura 5. Evolución del potencial redox en las muestras 4, 5, 6, 7, 8 y 9 de la mini-columna de biolixiviación operada bajo diferentes condiciones (Tabla 7). La simbología utilizada para cada muestra se encuentra en la parte inferior del gráfico. ................................................................................. 21 Figura 6. Evolución de la cantidad de cobre lixiviado (en [Kg])............................................................... 23 Figura 7. Evolución de la cantidad de ión férrico en generado (en [Kg])................................................ 23 Figura 8. Evolución de la cantidad de sulfato generado (en [g]). .............................................................. 24 Figura 9. Evolución de la cantidad de células generadas a partir de la muestra 2. ................................. 25 Figura 10. Gel de agarosa al 0,8% del DNA genómico de las muestras 3 y 5 . Carril 1: muestra 5 ; carril 2: muestra 5 tratada con RNasa; carril 3: muestra 3; carril 4: muestra 3 tratada con RNasa; PM: Estándar de tamaño molecular 1Kb.............................................................................................................. 26 Figura 11. Gel de 1,4% de agarosa de los productos de PCR de la muestra 4 para distintas diluciones. Carriles 1y 2: amplificado de la muestra 4 sin diluir; carriles 3 y 4: amplificado de la dilución 1:10 de la muestra 4; carriles 5 y 6: amplificado de la dilución 1:100 de la muestra 4; PM: estándar de tamaño molecular 1Kb. ................................................................................................................................................. 26 Figura 12. Variación de la abundancia relativa de A.ferrooxidans según el análisis con la enzima RsaI............................................................................................................................................................................. 29 Figura 13. Relación de los TRFs significativos (a) obtenidos de la digestión con RsaI, (b) obtenidos de la digestión con MspI. ................................................................................................................................ 33 Figura 14. Relación de las bacterias encontradas en solución a partir de la Tabla 10............................ 34 Figura 15. Dendrogramas que muestran la relación entre las soluciones a partir de las poblaciones desarrolladas en ellas (a) según la digestión con RsaI, (b) según la digestión con MspI. ...................... 35 Figura 16. Dendrograma de la relación entre las soluciones a partir de las poblaciones desarrolladas en ellas, según los datos obtenidos en la Tabla 10. ..................................................................................... 36 Figura 17. Gráfico del análisis de componentes principales para los TRF obtenidos de la digestión con RsaI. Los números corresponden a los tamaños de los TRF. ........................................................... 37 Figura 18. Gráfico del análisis de componentes principales para los TRF obtenidos de la digestión con MspI. Los números corresponden a los tamaños de los TRF........................................................... 38 Figura 19. (a) Modelo esquemático de la formación de pseudo-TRF, plegamiento parcial de la hebra simple podría o no formar pseudo-TRF. (b) Ejemplo de las estructuras secundarias formadas. (Egert y Friedrich 2003) .............................................................................................................................................. 51

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Capítulo 1. Introducción 1. 1. Aspectos Generales

La importancia económica de la producción de cobre en Chile, impulsa el óptimo aprovechamiento de los recursos minerales explotados. El cobre se presenta fundamentalmente en dos formas: como minerales oxidados y como minerales sulfurados. Los primeros son fácilmente solubles por lo que son tratados por medio de lixiviación ácida, mientras que los minerales sulfurados, principalmente calcopirita (CuFeS2), calcosina (Cu2S) y covelina (CuS) en Chile, son insolubles incluso en ácidos concentrados.

Es en este contexto que la biolixiviación o lixiviación bacteriana se presenta como una opción para recuperar metales de interés a través de su solubilización bajo la acción directa o indirecta de microorganismos desde, por ejemplo, botaderos y pilas.

Dependiendo de la composición del mineral sulfurado, la biolixiviación es una alternativa ventajosa a las tecnologías pirometalúrgicas, si bien es más lenta en cuanto a la obtención del mineral, ya que demanda menores inversiones de capital y menores costos de operación. Además se presenta como una tecnología más limpia que las practicadas comúnmente, debido a que no se emite SO2 al ambiente en su periodo de operación (Ballester 2005).

Es así, como la búsqueda de las condiciones óptimas de crecimiento y actividad de los microorganismos envueltos en estos procesos, es decir los parámetros que estimulan o inhiben su accionar, se vuelve de vital importancia para la industria.

Para lograr esto, se deben identificar las poblaciones bacterianas envueltas en el proceso en estudio y cómo éstas se ven influenciadas por las características fisicoquímicas que las rodean, lo que contribuiría a mejorar el entendimiento de los procesos de biolixiviación.

Sin embargo, dado que no todos los microorganismos presentes en estos procesos serán cultivables, las técnicas de cultivo tradicionales no logran detectar la realidad del ecosistema estudiado. Por esta razón, las técnicas moleculares independientes de cultivo se presentan como la alternativa indicada para determinar los microorganismos involucrados en un proceso en un tiempo dado.

En este contexto, el presente trabajo pretende identificar las poblaciones bacterianas asociadas a un ambiente de lixiviación específico, a partir de una técnica molecular, y buscar alguna relación entre éstas y las variaciones de los parámetros fisicoquímicos relevantes del sistema.

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1. 2. Antecedentes Bibliográficos

Los microorganismos presentes en los procesos de biolixiviación tienen un rol catalítico en la oxidación del ión ferroso (Fe+2) y del azufre elemental producidos durante la lixiviación química, a ión férrico (Fe+3) e ión sulfato, respectivamente (Ecuación 1 y Ecuación 2). Los iones férricos corresponden a los agentes químicos oxidantes que disolverán el sulfuro metálico (Ballester 2005; Watling 2006).

Ecuación 1. Oxidación biológica del ión ferroso a ión férrico (Watling H.R., 2006).

OHFeOHFe bacteria2

32

2 25,022 + →++ +++

Ecuación 2. Oxidación biológica de azufre a sulfato (Watling H.R., 2006).

4222 2232 SOHOHOS bacteria →++

Los fundamentos bioquímicos de las reacciones de lixiviación han sido ampliamente estudiados en los últimos años, habiéndose propuesto 2 mecanismos para estos procesos.

El primero consiste en la llamada “lixiviación indirecta” o “mecanismo indirecto”, en la que la oxidación del sulfuro metálico se realiza a través de los iones férricos sin mediar contacto entre los microorganismos y la superficie o alguna reacción enzimática, combinada con la oxidación biológica de los iones ferrosos en solución obtenidos de la reacción anterior, como se muestra en la Ecuación 1 (Figura 1) (Watling 2006).

La “lixiviación por contacto” o “mecanismo por contacto” supone que la mayoría de las células se adhieren a la superficie de los minerales sulfurados, lo que se traduce en la disolución del mineral producto de los procesos electroquímicos que tienen lugar en la interfaz entre la pared del microorganismo y la superficie del sulfuro (Figura 1) (Watling 2006).

Se añade a éstos mecanismos la “lixiviación cooperativa”, que no es más que la presencia simultánea de los mecanismos anteriores, lo que podría traducirse en un suministro óptimo de energía química a partir de una superficie limitada de sulfuros favoreciendo la supervivencia de las bacterias (Figura 1) (Ballester 2005).

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Figura 1. Esquema de los distintos tipos de lixiviación de un sulfuro según Tributsh (obtenida de Ballester 2005).

1. 2. 1. Microorganismos lixiviantes

La mayor parte de los microorganismos involucrados en los procesos de biolixiviación, se caracterizan por crecer quimiolitotróficamente en ambientes ácidos, con pH menor a 3, con alta concentración de iones metálicos y por ser capaces de utilizar el ión ferroso o los compuestos de azufre reducido como fuente de energía (Rawling 1998; Watling 2006).

Sin embargo también se pueden encontrar microorganismos heterotróficos cuyo trabajo consiste en eliminar del ambiente los compuestos de carbono presentes producto de la muerte celular o de desechos metabólicos de los microorganismos quimiolitotrofos (Brierley 2000).

Los microorganismos asociados a estos procesos se clasifican según la temperatura a la que se desarrollan de forma óptima, encontrándose los mesófilos (temperaturas menores a 40°C), termófilos moderados (temperaturas entre los 30°C y 55°C) e hipertermófilos (temperaturas entre los 50° y 85°C) (Brierley 2000).

Entre las bacterias más estudiadas y presentes en la mayoría de los procesos de biolixiviación se destacan: (Rawlings 2002)

• Acidithiobacillus ferrooxidans: filogenéticamente situadas entre el nodo que une las β y γ proteobacterias, son preferentemente aeróbicas, capaces de utilizar ión ferroso o compuestos de azufre reducidos como donadores de electrones, pero también pueden crecer utilizando el ión férrico como aceptor de electrones. Han sido encontradas como

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el microorganismo dominante en procesos de lixiviación de sulfuros de cobre, especialmente cuando existen altas concentraciones de ferroso. Son mesófilas y el rango de pH en el que se desarrollarían estaría entre 1,8 y 2,0.

• Acidithiobacillus thiooxidans: al pertenecer también al género de las Acidithiobacillus, se encuentran filogenéticamente situadas entre el nodo que une las β y γ proteobacterias, sin embargo están restringidas al uso de compuestos de azufre reducido como donador de electrones. Son mesófilas, probablemente encontrándose hasta los 35°C, y son más ácido tolerantes en comparación con A. ferrooxidans, con un rango de pH entre 0,5 y 5,5.

• Acidithiobacillus caldus: al pertenecer también al género de las Acidithiobacillus, poseen las características filogenéticas antes mencionadas. Sólo puede oxidar compuestos de azufre reducido y crecer a pH bajos. Son consideradas termófilas moderadas, siendo su temperatura óptima de crecimiento de 45°C aproximadamente.

• Leptospirillum: filogenéticamente perteneciente a la división de las Nitrospira, es una bacteria quimiolitoautotrófica ácido tolerante (pH óptimo entre 1,5 y 1,8), capaz de utilizar el ión ferroso como donador de electrones. Tienen una alta afinidad por el ión ferroso y alta tolerancia frente a la presencia de ión férrico. Entre ellas se encuentran las L. ferrooxidans, L. ferriphilium y L. thermoferrooxidans, las primeras mesófilas y la última termófila moderada.

• Sulfobacillus: perteneciente a la familia de las Alicyclobacillaceae (Taxonomy, NCBI), se destacan Sb. thermosulfidooxidans y Sb. acidophilus. Son termófilas moderadas, capaces de crecer autotróficamente utilizando ión ferroso o compuestos de azufre reducidos como donadores de electrones. También son capaces de crecer en ausencia de oxígeno utilizando el ión férrico como aceptor de electrones y compuestos de azufre como donadores de electrones. Se ha encontrado que su crecimiento se encontraría asociado al de Acidimicrobium ferrooxidans, bacteria heterotrófica, capaz de oxidar hierro.

• Acidiphilium: perteneciente a las α proteobacterias (Taxonomy, NCBI), son bacterias heterótrofas que son encontradas frecuentemente creciendo en las cercanías de las A. ferrooxidans, presumiblemente alimentándose de los compuestos orgánicos producidos por éstas durante su metabolismo. Entre ellas, Acidiphilium acidophilum es la única capaz de crecer autotróficamente usando compuestos de azufre reducidos, heterotróficamente usando distintas fuentes de carbono, o mixotróficamente usando carbón orgánico o inorgánico.

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1. 2. 2. Factores que influyen en la rapidez de la biolixiviación

Existen diversos factores asociados a los procesos de biolixiviación que condicionan el crecimiento de los microorganismos en estos ambientes, y éstos varían durante estos procesos provocando variaciones en las poblaciones microbianas (Brandl 2001).

Entre los parámetros fisicoquímicos importantes en el proceso estudiado se encuentran el pH, potencial redox, acidez, concentración de hierro total, de ión ferroso y de cobre, temperatura contenido de oxígeno y viabilidad, y presencia de inhibidores entre otros.

La concentración de hierro total, de ión ferroso y de cobre además del potencial redox, permiten monitorear la disolución del mineral mediada por férrico y observar el comportamiento de las bacterias hierrooxidantes.

La presencia de inhibidores del crecimiento o la actividad de los microorganismos es importante a la hora de utilizar este proceso a escala industrial, debido a que estos influirán en el tiempo de obtención del mineral lixiviado.

En cuanto a los parámetros a tener en cuenta relacionados con los microorganismos, se tienen la diversidad microbiana, la densidad de la población, la actividad microbiana, la tolerancia a los metales y las capacidades de adaptación de los microorganismos. Todos ellos estarán directamente relacionados con la rapidez de la lixiviación del mineral.

Finalmente, las propiedades del mineral a lixiviar también son determinantes en estos procesos, ya que de ellas dependerá la factibilidad de la disolución del mineral tratado. Entre éstas se encuentran, por ejemplo, el tipo de mineral, su composición, el tamaño de partícula, el área superficial y la porosidad.

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1. 2. 3. Inhibición de la actividad enzimática de los microorganismos biolixiviantes

Los microorganismos requieren de la presencia de diversos metales que juegan un rol bioquímico esencial como catalizadores, co-factores de enzimas o estabilizadores de las estructuras de las proteínas (Dopson et al. 2003).

No obstante, la acumulación de estos metales podría llegar a ser tóxica para los microorganismos, afectando los procesos en los que se encuentran envueltos, por lo cual es importante conocer cómo éstos los afectan.

La Tabla 1 presenta algunos ejemplos de la resistencia de bacterias acidófilas a algunos metales encontrados en procesos de biolixiviación.

Tabla 1. Máxima concentración de iones metálicos (en [g/l]) en la cual se observa crecimiento o actividad enzimática.

Cu(II) Fe(III) Al(III) Zn(II)

Acidiphilium cryptum 0,95a 16,76a 5,4c 8,17a Acidiphilium angustum 0,32a - - 0,52a Acidocella aminolytica 1,91a - 5,4c 32,69a Acidocella facilis 0,064a - 5,4c 6,54 a Acidithiobacillus ferrooxidans 15b –50,83a < 20 a,b 6b 15b -70,02a Leptospirrilllum ferrooxidans 0,32a 27,93a - - Sulfobacillus thermosulfidooxidans 0,38a - - 2,8a

Datos obtenidos de las siguientes referencias: (a) Dopson et al. (2003); (b) Acevedo y Gentina (2005); (c) Wakao et al. (2002).

1. 2. 4. Técnica de T-RFLP

La cantidad de bacterias, y microorganismos en general, conocidos en estos procesos, es consecuencia del uso de métodos de cultivo con medios enriquecidos y de aislamiento que provocan la selección de sólo algunas de las poblaciones existentes. Esto ha ido cambiando debido al desarrollo de técnicas moleculares que involucran la extracción y procesamiento del DNA sin que se utilicen etapas intermedias de cultivo (Watling 2006).

Entre estas últimas se destaca la técnica de reconocimiento de los polimorfismos de los largos de los fragmentos terminales de restricción (T-RFLP), la cual permite obtener fragmentos terminales de restricción (TRF) de tamaño característico para determinadas especies, con lo cual podrían ser identificados.

La técnica de T-RFLP se divide en diversos pasos consecutivos como se presenta a continuación (Figura 2):

• Extracción del DNA directamente desde la muestra en estudio; • Amplificación del rDNA 16S bacteriano mediante partidores universales, que sean

específicos para la mayor cantidad posible de especies presentes en la muestra, marcados en el extremo 5’ con un fluorósforo;

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• Digestión mediante una enzima de restricción para generar fragmentos terminales de restricción (TRF) de distinto largo marcados en un extremo;

• Separación de los fragmentos mediante electroforesis capilar de alta resolución para poder determinar el largo de cada TRF mediante la excitación de los fluorósforos, además de obtener una intensidad asociada a cada largo de TRF;

• Obtención de los resultados en forma de un electroferograma y/o tablas.

Figura 2. Esquema del método de t-RFLP.1

1. 2. 5. Comparación de poblaciones microbianas a través de análisis estadísticos

Finalmente, los análisis estadísticos permiten, entre otras cosas, obtener una estimación de la diversidad asociada al ambiente en estudio o agrupar los microorganismos de acuerdo a alguna característica.

En particular, se usan índices de diversidad de especies, de Shannon-Wiener o de Simpson para calcular la diversidad de las especies presentes en las muestras en estudio. Los dos últimos dan cuenta del orden asociado al ambiente estudiado.

Para agrupar especies según alguna característica se utilizan dendrogramas o análisis de componentes principales, que también darán cuenta del comportamiento de los microorganismos en las distintas muestras.

1 Imágenes obtenidas de la sección Books, de la página web de la NCBI (30 Mayo 2007).

Extracción del

DNA bacteriano

Electroferograma obtenido

de la electroforesis capilar

Digestión del producto amplificado

con una enzima de restricción

Amplificación a

través de PCR

Purificación del

producto amplificado

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1. 3. Descripción del Proyecto

El proyecto consiste en el estudio de la dinámica de la biodiversidad en procesos de biolixiviación, es decir, se busca establecer alguna relación entre la variación de los parámetros fisicoquímicos presentes en el ambiente en estudio y las bacterias identificadas para cada condición.

Para esto, se realizará el análisis mediante T-RFLP de las soluciones obtenidas de una mini-columna de biolixiviación montada en el laboratorio, para así identificar las poblaciones bacterianas presentes, debido a que, al ser una técnica independiente de cultivos, permite obtener una aproximación de los microorganismos presentes en solución.

La técnica de T-RFLP consiste en realizar la concentración de las células presentes en la solución, la extracción del DNA de las células, su digestión con enzimas de restricción y la separación de los fragmentos terminales de restricción (TRF) obtenidos a través de electroforesis capilar.

Para corroborar la información obtenida con el protocolo propuesto por Morales (2006), se busca una enzima de restricción adicional que sea capaz de distinguir entre dos de las especies bacterianas usualmente encontradas en los procesos de biolixiviación (A. ferrooxidans y A. thiooxidans), y que permita comparar las informaciones obtenidas en ambos electroferogramas para corroborar la presencia de un determinado microorganismo.

La información obtenida de los electroferogramas se analiza por comparación y de forma estadística para buscar alguna relación entre las distintas bacterias identificadas y los parámetros fisicoquímicos medidos.

Es importante destacar que sólo se estudiarán las bacterias presentes en las soluciones de biolixiviación, debido al uso de partidores universales específicos para bacterias, determinados por Morales (2006), y que éstas serán consideradas mesófilas, dado que no se le añadió ningún tipo de calefacción a la columna.

Este trabajo se centra en la necesidad de determinar las condiciones óptimas de crecimiento y actividad de los microorganismos envueltos en los procesos de biolixiviación, es decir los parámetros que estimulan o inhiben su accionar, a la hora de su evaluación económica, debido a su incidencia directa en la rapidez y capacidad de lixiviación biológica de un determinado metal.

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1. 4. Objetivos

1. 4. 1. Objetivo General

A través del presente trabajo se busca identificar las poblaciones bacterianas presentes en soluciones de biolixiviación y relacionarlas con las características fisicoquímicas más relevantes de la solución en estudio en distintos tiempos.

1. 4. 2. Objetivos específicos

Entre los objetivos específicos se encuentran:

• Seleccionar una segunda enzima de restricción para ser utilizada en la metodología de T-RFLP;

• Identificar mediante el método de T-RFLP las poblaciones bacterianas presentes en soluciones de biolixiviación;

• Relacionar las variaciones de las poblaciones bacterianas con las características fisicoquímicas más relevantes de la solución en un tiempo dado;

• Realizar un análisis estadístico de las poblaciones encontradas, correspondiente a la determinación de índices de diversidad, análisis de cluster y análisis de componentes principales.

1. 5. Alcances

Este proyecto pretende establecer alguna relación entre la variación de algunos parámetros fisicoquímicos presentes en ambientes de biolixiviación y las bacterias identificadas para cada condición.

Para esto, se identificarán mediante la técnica de T-RFLP, las poblaciones bacterianas presentes en 8 muestras obtenidas de una solución proveniente de una mini columna de biolixiviación de sulfuros de cobre montada en el laboratorio de Biohidrometalurgia.

Mediante técnicas químicas se determinaran los parámetros fisicoquímicos de las soluciones, como pH, Eh y la concentración de los iones presentes: Cu(II), Fe(II), fierro total, Al(III), Zn(II) y sulfato.

Paralelamente se buscará una enzima de restricción alternativa a la propuesta por Morales (2006), que permita distinguir entre dos de las especies bacterianas usualmente encontradas en los procesos de biolixiviación, y que además permita comparar las informaciones obtenidas en ambas enzimas por separado para corroborar la presencia de un determinado microorganismo.

Cabe destacar que sólo se estudiarán las bacterias presentes en las soluciones de biolixiviación, debido al uso de partidores universales específicos para bacterias, determinados por Morales (2006), y que éstas serán consideradas mesófilas, dado que no se le añadió ningún tipo de calefacción a la columna.

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Capítulo 2. Metodología

En el presente capítulo se presentan los materiales y métodos utilizados en el estudio de la dinámica de las poblaciones bacterianas, producidas al variar las condiciones de una mini-columna de biolixiviación.

2. 1. Materiales

Los materiales utilizados para el estudio de la dinámica de las poblaciones bacterianas, se encuentran enumerados en la metodología según corresponda.

Asimismo, la composición de las soluciones requeridas en los métodos se encuentra en el Anexo B.

2. 2. Métodos

A continuación se presentan los métodos utilizados para determinar la dinámica de las poblaciones bacterianas en ambientes de biolixiviación.

En primer lugar, se determinó una segunda enzima de restricción a utilizar respecto de la metodología de T-RFLP implementada por Gabriela Morales (Morales 2006) en el laboratorio de Biohidrometalurgia de la Escuela de Ingeniería, Universidad de Chile, con el fin de poder corroborar los resultados obtenidos en la electroforesis capilar con la primera enzima (RsaI).

Paralelamente, se puso en marcha una mini columna de biolixiviación en el laboratorio Biohidrometalurgia de la Escuela de Ingeniería, para así obtener bacterias asociadas a un proceso de biolixiviación de cobre realizado en distintas condiciones, como Eh, pH y concentración de iones en solución.

Luego se extrajo el DNA de las bacterias obtenidas en solución, con el cual se realizó el método de T-RFLP, luego de lo cual fueron analizadas para conocer las especies bacterianas presentes y realizar pruebas estadísticas.

2. 2. 1. Selección de la segunda enzima a utilizar

Para comenzar desde el sitio web del Nacional Center of Biotechnology Information (NCBI) se obtuvo la secuencia del rDNA 16S de las bacterias más conocidas y comúnmente encontradas en los procesos de biolixiviación: Acidithiobacillus ferrooxidans (locus: AF329205.1), Acidithiobacillus thiooxidans (locus: AY830898.1), Acidithiobacillus caldus (locus: Z29975.1), Leptospirillum ferrooxidans (locus: AF356834.1), Sulfobacillus thermosulfidooxidans (locus: AY140233.1).

Luego se realizó la alineación virtual de los partidores universales (Anexo A) a utilizar en el método de T-RFLP experimental usando el programa de libre acceso Kalign (EBI). Para esto se utilizó el partidor 341f y la secuencia complementaria del partidor reverse 1100r. Con esto se obtiene la secuencia que se amplifica teóricamente en la reacción de PCR para una bacteria dada.

El siguiente paso fue obtener el mapa de restricción de cada secuencia amplificada. Esto se logró utilizando el programa de libre acceso Webcutter 2.0, el cual permite ingresar la secuencia a analizar, lineal o circular, y elegir entre mostrar los sitios de restricción de una, algunas o todas las enzimas que

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tiene asociadas el programa. El resultado del procesamiento de los datos se obtiene en forma de tablas, en las cuales aparece un listado de las enzimas de restricción que pueden cortar la secuencia, el sitio de restricción que dicha enzima reconoce, el número de cortes posibles y la posición en la cual se lleva a cabo dicho corte.

Posteriormente se compararon las 5 tablas de enzimas de restricción y sitios de corte obtenidas, buscando una enzima que permita diferenciar las bacterias en estudio a través del TRF obtenido en teoría, al igual como lo hace la RsaI propuesta por Gabriela Morales (Morales 2006), o que permita diferenciar distintos géneros.

Figura 3. Esquema del proceso de selección de la segunda enzima a utilizar.2

Finalmente, se obtuvieron los tamaños virtuales de los TRFs asociados a bacterias biolixiviantes a partir del programa Virtual Diegest, de MICA, con lo que se pudo probar la segunda enzima seleccionada y determinar si era la más idónea para el análisis posterior.

2. 2. 2. Obtención de muestras de bacterias desde una mini-columna de biolixiviación

Para la obtención de muestras frescas, se montó una mini columna de lixiviación en el Laboratorio de Biohidrometalurgia, rellenándola con mineral seco proveniente de la mina Quebrada Blanca (Figura 4 (a) y (b)).

Para su puesta en marcha, se preparó medio MC pH 1,6 (Anexo B) con 3 [g/l] de Fe+2, el que se puso a circular en la columna como muestra el esquema (Figura 4 (c)) sin añadírsele aireación. Esta primera muestra fue retirada al cabo de 21 días, debido al lento aumento del Eh, y cambiada por una muestra fresca de MC pH 1,6 (Anexo B) con 6 [g/l] de Fe+2.

2 Imágenes obtenidas de la sección Books, de la página web de la NCBI (30 Mayo 2007).

Obtención de la

secuencia de la

bacteria

(NCBI)

Alineación de los

partidores

universales

(Kalign, EBI|)

Obtención de la

secuencia

amplificada

Análisis de los mapas

de restricción

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Bomba

Solución ácida

Aireación

Figura 4. Mini columna de biolixiviación. (a) Foto lateral de la mini columna de biolixiviación; (b) foto del mineral a procesar; (c) esquema de la mini columna de biolixiviación.

En algunas de las condiciones estudiadas, se añadió aire al sistema a través de una bomba de pecera (Tabla 2) para considerar otro parámetro involucrado en el crecimiento de las bacterias.

Las siguientes soluciones fueron cambiadas al alcanzar un Eh superior a 590 mV, excepto en los casos 2 y 3 que fueron retiradas a Eh menores para considerar estos casos en el análisis (Tabla 7).

Un resumen de las condiciones iniciales se presenta en la Tabla 2. En las muestras el Fe+2 se agregó como FeSO4, en las muestras 6 y 7 se agregó sulfato como K2SO4, en las soluciones 8 y 9 se agregó aluminio en forma de Al2(SO4)3 y el zinc fue agregado en la muestra 9 como ZnSO4 (reactivos pro análisis, de Merck). El pH se ajustó con H2SO4 concentrado.

El Eh y pH de la columna fue medido periódicamente, y según esta medición se ajustó el pH.

Tabla 2. Condiciones y concentraciones iniciales de los iones de cada muestra en la columna de biolixiviación.

Número de muestra Características Unidades 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Fe(II) g/l 3 6 6 6 6 6 6 6 6 Sulfato g/l - - - - - 30 30 60 71,75 Al(III) g/l - - - - - - - 8,43 8,43 Zn(II) g/l - - - - - - - - 8 pH - 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,3 1,6 1,6 Aireación - no no si si no si si si si

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2. 2. 3. Extracción de DNA desde soluciones de procesos de biolixiviación

Antes de llevar a cabo la extracción del DNA, midió el pH y el Eh de la solución con bacterias mediante el uso de los electrodos correspondientes. Además se realizó el recuento directo de la cantidad de células por ml presentes en la solución.

Se llevó a cabo la extracción del DNA desde una solución proveniente de un proceso de biolixiviación, debiendo usarse guantes y llevar a cabo las siguientes etapas: (Morales 2006)

• Filtrar el volumen de la solución a tratar (aproximadamente 1 L) con una membrana de 0,22 µm. Una vez concluida la filtración, recuperar la membrana y depositarla al interior de un tubo de 40 ml para centrífuga. El líquido filtrado se utiliza para realizar los análisis de fierro total, ión ferroso, cobre, sulfato y, cuando corresponda, de aluminio y zinc en solución.

• Lavar con 20 ml de PBS 1X pH 1,2 agitando en vortex. Centrifugar a 13.000 RPM por 15 minutos. Descartar sobrenadante.

• Lavar con 10 ml de buffer de lavado agitando en vortex. Centrifugar a 13.000 RPM por 15 minutos. Descartar sobrenadante. Repetir el lavado.

• Resuspender en 3 ml de buffer A2X. Adicionar lisozima a una concentración final de 3 mg/ml (243 µl de lisozima de concentración inicial de 40 mg/ml) e incubar por 1 hora a 37°C.

• Agregar SDS a una concentración final de 4% p/v (3,706 ml de SDS 7,5% p/v). • Agregar 1,131 ml de NaCl 5M para llegar a una concentración final de 0,7M, y luego 898 µl

de CTAB 10% p/v para tener una concentración final de 1% de CTAB. Incubar a 65°C por 1 hora. • Realizar 3 ciclos de congelamiento-descongelamiento de 3 minutos cada uno, a -20°C y 70°C

respectivamente. • Centrifugar a 1.000 RPM por 2 minutos. Recuperar el sobrenadante repartiéndolo en tubos

eppendorf de 1,6 ml con 0,7 ml aproximadamente. • Agregar un volumen de la fase inferior de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1).

Vortex hasta homogeneizar. Centrifugar a 12.000 RPM durante 5 minutos. Recuperar la fase superior y traspasar a tubos eppendorf de 1,6 ml limpios, colocando 0,7 ml por tubo aproximadamente.

• Agregar un volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Vortex hasta homogeneizar. Centrifugar a 12.000 RPM durante 5 minutos. Recuperar la fase superior y traspasar a tubos eppendorf de 1,6 ml limpios, colocando 0,6 ml por tubo aproximadamente.

• Agregar un volumen de isopropanol absoluto frío y acetato de sodio 3M pH 5,2 a una concentración final de 10% v/v. Incubar en hielo por toda la noche.

• Centrifugar a 14.000 RPM por 25 minutos. Descartar sobrenadante. • Lavar con 500 µl de etanol al 70% agitando suavemente. Centrifugar a 14.000 RPM por 10

minutos. Repetir el lavado con etanol. Descartar sobrenadante y secar el pellet a 37°C. • Resuspender el DNA en 50 µl de buffer TE a un solo tubo en dos tandas, cada una con 25 µl

de buffer TE. Almacenar en tubos eppendorf de 0,2 ml con 5 µl aproximadamente de DNA a -20°C.

Para confirmar la obtención de DNA al final de la extracción, se debió realizar una electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%.

Para comprobar la presencia de RNA en las muestras luego de la extracción, se añadió 1 µl de RNasa (Ribonucleasa A from bovine pancreas, SIGMA) cuya concentración era de 1,2 mg/ml a uno de los tubos con 5 µl de muestra de DNA, para tener una concentración final de 0,2 mg/ml de RNasa, y se dejó reaccionar a temperatura ambiente por 30 minutos. La RNasa fue diluida en la solución de RNasa mostrada en la Tabla 21, Anexo B.

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2. 2. 4. T-RFLP

El protocolo de T-RFLP usado correspondió al implementado por Gabriela Morales (Morales 2006) en el laboratorio de Biohidrometalurgia de la Escuela de Ingeniería, Universidad de Chile.

2. 2. 4. 1. Amplificación de un fragmento del rDNA 16S

Se realizó la amplificación de un fragmento del DNA extraído mediante la reacción de PCR con los primers forward 341f marcado con fluorósforo FAM y reverse 1100r (Anexo A), usando dos diluciones del DNA (1:10 y 1:100) y la muestra sin diluir, en duplicado.

En todos los tubos se tuvo un volumen final de 25 µl, correspondiente a la mezcla de reacción, según las condiciones que se presentan en la Tabla 3, 1 µl de la muestra de DNA a amplificar (muestra sin diluir o diluida) y agua desionizada estéril para completar el volumen de reacción. (Morales 2006)

Tabla 3. Concentraciones necesarias de los reactivos para la reacción de PCR.

Reactivos Concentración final Partidor forward 0,5 µM Partidor reverse 0,5 µM Nucleótidos 200 µM Buffer Taq 1X MgCl2 2 mM Taq Polimerasa 2,5 U

El programa de PCR utilizado se presenta en la Tabla 4. (Morales 2006)

Tabla 4. Programa de PCR utilizado.

N° de ciclos Tiempo Temperatura [ºC] 1 3 min. 95 45 seg. 94 30 45 seg. 56 45 seg. 72 1 7 min. 72 - 4

Finalmente, se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1,2% para visualizar la obtención de una banda de aproximadamente 780 pb. A partir de éste se eligió la dilución a purificar y digerir, la cual correspondió a la primera dilución, ordenadas de menor a mayor, en la cual se observa sólo la banda de interés en cada uno de los duplicados.

2. 2. 4. 2. Purificación y cuantificación del DNA

La purificación de los productos de la reacción de PCR se llevó a cabo utilizando el kit de purificación UltraClean PCR Clean-up DNA purification kit, de MoBio Laboratories, siguiendo el protocolo descrito por el fabricante.

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La cuantificación del DNA obtenido se realizó mediante la determinación de la absorbancia a una longitud de onda de 260 nm de una dilución 1:60 de la muestra a analizar (1 µl de muestra en 59 µl de agua desionizada estéril) (Morales G. 2006).

La concentración de DNA en [ng/µl] se calculó según la siguiente fórmula:

conversióndeFactordilucióndeFactoraAbsorbancilngDNAdeiónConcentrac ××=

µ

donde el factor de conversión para DNA de doble hebra es de 50 [ng/µl] de DNA por unidad de absorbancia y el factor de dilución corresponde a 60, con lo que se obtiene que la concentración de DNA es igual a:

3000×=

aAbsorbancilngDNAdeiónConcentrac µ

2. 2. 4. 3. Digestión de los productos de PCR y electroforesis capilar

Para cada muestra, la digestión de los productos de PCR purificados se realizó de forma independiente con las enzimas RsaI (Morales G. 2006) y MspI, en un volumen final de reacción de 20 µl, según las concentraciones mostradas en la Tabla 5 y completado con agua desionizada estéril. La reacción se realizó durante 3 horas a 37ºC para asegurar la completa digestión de los fragmentos.

Tabla 5. Concentración de los reactivos en la digestión de los productos de PCR

Reactivos Concentración final Producto de PCR purificado 18 [ng/µl] Enzima de restricción 15 U Buffer de la enzima de restricción 1X

Posteriormente los fragmentos digeridos fueron enviados a una empresa externa para realizar la electroforesis capilar. La concentración mínima de DNA a enviar recomendada es de 10 [ng/µl] y el volumen mínimo de 5 µl, debido a que este es el volumen necesario para cargar el equipo.

2. 2. 4. 4. Procesamiento de los resultados de la electroforesis capilar

Los datos obtenidos del elecroferograma, en forma de tablas, debieron ser procesados para el análisis posterior.

En primer lugar fue necesario redondear el tamaño de los TRF, debido a que los largos que se obtienen del electroferograma corresponden a números decimales, producto del tiempo de migración de los distintos TRFs obtenidos, y su tamaño real debe corresponder a un número entero dado por la cantidad de pb que lo componen, por lo tanto se deben redondear dichos valores al número entero más cercano. (Morales 2006)

Luego se debieron eliminar los fragmentos cuyo largo fuera menor que 35 pb o mayor que 490 pb, dado que el estándar de tamaño molecular (1Kb) discrimina entre 35 y 500 pb, con mayor error en los extremos. (Morales 2006)

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Por último, los fragmentos que diferían entre si en 2 pb fueron agrupados, debido a que el error del equipo corresponde a ± 2 pb. Esto se traduce en que la altura y el área asociado al largo de un TRF será la suma de aquellos fragmentos que pueden ser agrupados (Wang. et al. 2004; Li et al. 2007).

Una vez realizado este procedimiento, se pudieron comparar los TRFs obtenidos con los largos de los TRFs que se obtuvieron virtualmente a partir del programa Virtual Diegest, de MICA, con lo cual fue posible asociar una especie bacteriana a cada fragmento.

2. 2. 5. Análisis utilizados para comparar las especies bacterianas encontradas

Los análisis utilizados para comparar las especies hacterianas encontradas en las muestras estudiadas correspondieron a la determinación de la abundancia relativa de cada TRF obtenido; el cálculo de los índices de diversidad y de Shannon- Wiener; el análisis de cluster y el análisis de componentes principales, cuya determinación se muestra a continuación.

2. 2. 5. 1. Determinación de la abundancia relativa de los TRFs

La abundancia relativa (Pi) de cada TRF (i) se calculó como se muestra en la siguiente ecuación (Wang et al. 2004; Jernberg et al. 2005; Li et al. 2007).

∑==

n

ii

iii

peakárea

peakáreaPrelativaAbundancia

Donde i corresponde al largo del TRF y n al total de TRFs obtenidos en una muestra.

Se presentan los valores de la abundancia relativa en forma de porcentajes y se consideraron como significativos aquellos TRFs cuya abundancia relativa fuera mayor o igual al 1% (Jernberg et al. 2005; Li et al. 2007), para poder así eliminar o minimizar los TRFs que pudieran ser asociados a ruidos en el electroferograma.

2. 2. 5. 2. Índices de biodiversidad

A continuación se presentan las ecuaciones de los índices comúnmente usados para análisis de biodiversidad.

2.2.5.2.1. Índice de diversidad de especies

La diversidad de especies (S) corresponde a la cantidad de TRFs únicos, es decir diferentes, encontrados en el perfil correspondiente a cada muestra analizada (Li et al. 2007). Para su cálculo se tomaron en cuenta sólo aquellos TRF cuya abundancia relativa fuera mayor o igual al 1%.

2.2.5.2.2. Índice de Shannon-Wiener

El índice de Shannon-Wiener (H) toma en cuenta la diversidad de especies y la proporción de cada una de ellas en la comunidad estudiada, y se calcula para cada condición en estudio como se muestra a continuación (Dunbar et al. 2000; Keylock 2005):

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∑ ⋅−=n

iii PPH )ln(

Donde i corresponde al largo del TRF, n al total de TRFs obtenidos en una muestra y Pi a la abundancia relativa de cada TRF

Se debe destacar que el mínimo valor de este índice es 0, mientras que el máximo corresponde a ln(1/S), donde S es el índice de diversidad de especies (www.mdsg.umd.edu).

2. 2. 5. 3. Análisis de cluster

El análisis de cluster consiste en elaborar dendrogramas, gráficos, que muestren la relación existente entre las diversas bacterias asociadas a un TRF o entre las soluciones a partir de una característica.

En el estudio de la dinámica de las poblaciones microbianas, la característica analizada corresponde a la presencia o ausencia de un determinado TRF en las soluciones en estudio, cuya abundancia relativa fuera mayor o igual al 1%. Con esto se creó una matriz binaria por cada enzima de restricción utilizada, llamada matriz de caracteres, en la cual se colocó un 1 si el TRF se encuentra en la muestra y 0 si no (Vingron et al. 2002/2003; Meyer et al. 2004).

Es importante notar que si se deseaba comparar el comportamiento de las bacterias según su aparición en las soluciones en estudio, las filas correspondían a los distintos TRFs y las columnas a las soluciones, mientras que si se deseaba comparar las distintas soluciones según las bacterias encontradas en ellas, las filas corresponderían a las soluciones y las columnas a los TRFs.

A partir de la matriz de caracteres se utilizaron las herramientas estadísticas de Matlab para obtener la figura del dendrograma.

En primer lugar se calculó el coeficiente de similitud de Jaccard (sij) entre los distintos TRFs, para luego calcular la distancia genética (dij), la que representa la diferencia entre los distintos fragmentos estudiados, como se muestra a continuación.

ijji

ijijij nnn

nsd

−+−=−= 11

Donde nij corresponde al número de TRFs compartidos entre dos soluciones comparadas, es decir la cantidad de 1 presentes en la matriz de caracteres, y ni y nj corresponden al número de TRFs en la solución i y la j, respectivamente (Ma y Zeng 2004).

Luego se determinó la proximidad entre los TRFs a partir de las distancias calculadas utilizando algún método. En este caso se utilizó el método de los “promedios” (average) que provee Matlab, para intentar emular el método de UPGMA (Unweighted pair-group mean aritmetic method).

Finalmente, el programa desplegó la figura obtenida para el dendrograma.

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2. 2. 5. 4. Análisis de componentes principales

Para realizar el análisis de componentes principales, se utilizaron las herramientas estadísticas de Matlab.

Como datos de entrada para Matlab necesarios para crear el gráfico de componentes principales, se debió fabricar una matriz en la cual se encontrara la abundancia relativa de cada TRF (filas) en cada solución (columnas) (Jernberg et al. 2005).

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Capítulo 3. Resultados 3. 1. Selección de la segunda enzima a utilizar en los análisis de T-RFLP

Siguiendo la metodología expuesta para determinar la segunda enzima de restricción a utilizar (Métodos 2. 2. 1.), se obtuvieron las tablas de las enzimas de restricción y sus sitios de corte de cada fragmento del rDNA 16S amplificado virtualmente para las especies bacterianas consideradas, las que se encuentran en el Anexo D.

Al comparar los mapas de restricción obtenidos para las cinco especies bacterianas consideradas, se pudo constatar que, no hay una enzima que permita diferenciar entre A. ferrooxidans y A. thiooxidans exceptuando la RsaI, como propuso Morales (2006), dado el par de partidores universales utilizados y el producto amplificado obtenido. Este resultado se ve restringido a las enzimas consideradas en el programa Webcutter 2.0, las que representan a la gran mayoría de las enzimas de restricción existentes,

Basado en lo anterior, se buscó una enzima que, a pesar de no permitir diferenciar entre las distintas especies de Acidithiobacillus, permitiera distinguir otras especies, representando un aporte a la técnica de T-RFLP propuesta para el análisis de ambientes biolixiviantes. Es por esta razón que se escogió MspI como la segunda enzima de restricción a utilizar, con la que se pudo diferenciar de manera clara L. ferrooxidans de Sb. thermosulfidooxidans.

A continuación se presenta una tabla resumen con los tamaños de los TRFs de las bacterias comúnmente encontradas en ambientes de biolixiviación, obtenidos con el programa Virtual Diegest, de MICA, para la digestión virtual con las enzimas escogidas, por separado y con ambas al mismo tiempo.

Tabla 6. Tamaño en pb de los TRF obtenidos con el programa Virtual Diegest a través de la digestión con las enzimas de restricción RsaI y MspI, de forma independiente y de forma combinada (RsaI+MspI).

Enzimas de restricción Bacterias biolixiviantes RsaI MspI RsaI + MspI Acidimicrobium ferrooxidans 121 138 121 Acidiphilium acidophilum 121 138 121 Acidithiobacillus caldus 551 163 163 Acidithiobacillus ferrooxidans 249 163 163 Acidithiobacillus thiooxidans 309 163 163 Leptospirillum ferrooxidans 146 379 146 Leptospirillum ferriphilium 146 103 103 Sulfobacillus acidophilus 141 143 141 Sulfobacillus thermosulfidooxidans 141 115 115

Para el análisis se consideraron las bacterias comúnmente encontradas en ambientes de biolixiviación y consideradas como las más importantes, y el TRF analizado corresponde a aquel que se alineó con el partidor forward.

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3. 2. Variación de los parámetros fisicoquímicos en las muestras estudiadas

Durante la utilización de la columna como sistema en estudio, se monitoreó la evolución del potencial redox de la solución para cada una de las condiciones de operación propuestas, el cual puede ser relacionado con el crecimiento de microorganismos hierrooxidantes. La Figura 5 presenta los cambios en el potencial en las muestras 4, 5, 6, 7, 8 y 9, las cuales representan diferentes condiciones posibles en ambientes de lixiviación, como concentración de iones metálicos, pH y aire añadido al sistema, que provocan tanto la inhibición de algunas especies bacterianas como la estimulación del crecimiento de otras.

300

350

400

450

500

550

600

650

0 3 6 9 12 15

Tiempo [días]

Eh [m

V]

Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6

Muestra 7 Muestra 8 Muestra 9

Figura 5. Evolución del potencial redox en las muestras 4, 5, 6, 7, 8 y 9 de la mini-columna de biolixiviación operada bajo diferentes condiciones (Tabla 7). La simbología utilizada para cada muestra se

encuentra en la parte inferior del gráfico.

El valor de los parámetros fisicoquímicos estudiados para cada muestra, se encuentran en la Tabla 7. En las muestras el Fe+2 inicial se agregó como FeSO4, en las muestras 6 y 7 se agregó sulfato como K2SO4, en las soluciones 8 y 9 se agregó aluminio en forma de Al2(SO4)3 y el zinc fue agregado en la muestra 9 como ZnSO4.

22

Tabla 7. Valores de los parámetros estudiados para cada muestra a la que fue sometida la mini-columna.

Muestras

Parámetros Unidades 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Eh final mV 443 425 515 597 592 608 583 614 604 pH inicial - 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,3 1,6 1,6 pHfinal - 1,77 1,82 2,3 1,45 1,76 1,79 1,45 1,64 1,62

Fe+2 inicial ppm 3000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 Fe total inicial

ppm 3000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000

Fe+2 final ppm 1421 2349,75 79,13 5,82 6,99 10,3 33,64 39,43 72,96 Fe+3 final ppm 2290,3 3682 5564,42 6505,03 7454,76 7359,6 7966,11 6536,37 6902,64

Fe total final ppm 3711,3 6031,75 5643,55 6510,85 7461,75 7369,9 7999,75 6575,8 6975,6 Cu final ppm 2600 560 160 163,5 181,3 128,8 146,3 85 61,3

Cu disuelto mg 1820 532 156,8 155,3 166,8 122,4 139,0 80,8 57,0 SO4

-2 inicial g/l 5,2 10,3 10,3 10,3 10,3 25,3 25,3 55,3 67,1 SO4

-2 final g/l 14,8 15,8 13,3 19,46 14,4 29,31 32,7 59,88 73 SO4

-2 generado

g/l 9,6 5,5 3,0 9,1 4,1 4,0 7,4 4,6 5,9

Al final ppm - - - - 26,9 27,1 45,5 7450 7530 Zn final ppm - - - - 0,53 0,78 0,61 0,47 7410 Recuento directo

bact/ml 4,5 * 105 5,75 * 106 1,58 * 108 4,26 * 107 1,35 * 107 8,25 * 107 5,0 * 107 7,88 * 107 3,78 * 107

Células generadas

cél 3,15 * 108 5,46 * 109 1,55 * 1011 4,05 * 1010 1,24 * 1010 7,84 * 1010 4,75 * 1010 7,49 * 1010 3,52 * 1010

Volumen final

ml 700 950 980 950 920 950 950 950 930

Aireación - no no Si si no si si si si

23

La Figura 6 y la Figura 7 muestran la evolución de la cantidad de cobre lixiviado y la cantidad de ión férrico generado, respectivamente, en función del tiempo.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98

Tiempo [días]

Cobre disuelto [Kg]

Figura 6. Evolución de la cantidad de cobre lixiviado (en [Kg]).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98

Tiempo [días]

Fe(III) generado [Kg]

Figura 7. Evolución de la cantidad de ión férrico en generado (en [Kg]).

La Figura 8 muestra la evolución de la cantidad de sulfato generado en función del tiempo.

24

0,05,010,015,020,025,030,035,040,045,050,0

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98

Tiempo [días]

Sulfato generado [g]

Figura 8. Evolución de la cantidad de sulfato generado (en [g]).

Cabe destacar que en el transcurso del experimento no se midió la temperatura de la solución o la que había al interior de la columna. Al no haber colocado ningún tipo de calefacción a la columna, se considera que ésta se encontraba a temperatura ambiente, aproximadamente, por lo que se podría asociar el crecimiento de microorganismos mesófilos y moderadamente termófilos que se pudieran haber adecuado a las condiciones del medio.

25

3. 3. Obtención de microorganismos, DNA genómico y producto amplificado

Se efectuó un recuento directo de la cantidad de células presentes en la solución en todas las muestras, luego de lo cual se procedió con la etapa de extracción de DNA.

En la muestra 1 no se pudo obtener DNA genómico, debido a que correspondía a la condición en la cuál se tenía la menor cantidad de células, aproximadamente 4,5 * 105 cél/ml, por lo que no se siguió utilizando esta muestra para los posteriores estudios.

La Figura 9 muestra el aumento de la cantidad de células generadas durante el proceso de biolixiviación ocurrido en la columna a partir de la muestra 2.

1,0E+09

1,0E+10

1,0E+11

1,0E+12

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98Tiempo [días]

Núm

ero de células en solución

Figura 9. Evolución de la cantidad de células generadas a partir de la muestra 2.

Otro análisis realizado correspondió a intentar explicar el barrido obtenido en los geles de agarosa luego de la extracción, correspondiente a fragmentos pequeños de DNA según el estándar de tamaño 1 Kb. Para esto se incubaron dos de las muestras, las muestras 3 y 5, con RNasa según se muestra en la metodología, con lo cual se determinó que el barrido correspondía a RNA. (Figura 10).

26

verificar si se trataría de RNA

Figura 10. Gel de agarosa al 0,8% del DNA genómico de las muestras 3 y 5 . Carril 1: muestra 5 ; carril 2: muestra 5 tratada con RNasa; carril 3: muestra 3; carril 4: muestra 3 tratada con RNasa; PM: Estándar de

tamaño molecular 1Kb.

Luego se llevó a cabo la etapa de PCR de manera exitosa para las muestras estudiadas, obteniéndose el fragmento amplificado del tamaño esperado para todas las diluciones. A través de un gel de agarosa 1,4% (por ejemplo la Figura 11) se observaron los fragmentos amplificados de cada una de las muestras y se procedió a elegir la dilución con la se harían los análisis posteriores.

Figura 11. Gel de 1,4% de agarosa de los productos de PCR de la muestra 4 para distintas diluciones. Carriles 1y 2: amplificado de la muestra 4 sin diluir; carriles 3 y 4: amplificado de la dilución 1:10 de la muestra 4; carriles 5 y 6: amplificado de la dilución 1:100 de la muestra 4; PM: estándar de tamaño

molecular 1Kb.

PM 1 2 PM 3 4

12.216 pb

1.018 pb

506 pb

PM 1 2 3 4 5 6

1.018 pb

506 pb

± 780 pb

27

Luego se realizó la etapa de purificación y la digestión enzimática con la enzima de restricción RsaI o MspI.

En la etapa de purificación se estudiaron dos posibles métodos: purificar la banda del amplificado directamente desde el gel con el kit correspondiente o purificar la solución obtenida luego del PCR con un kit de purificación de productos de PCR. En ambos casos, al hacer un gel de agarosa al 1,4%, se obtuvo la banda esperada purificada, por lo que se esperaba que no hubiera diferencias en la digestión enzimática y en el electroferograma.

Es importante destacar que la digestión al utilizar cada enzima fue completa, debido a que al hacer una electroforesis en gel de agarosa al 1,4% de algunas de las muestras digeridas, los fragmentos observados no correspondieron al fragmento entero amplificado con el método de PCR, sino que a fragmentos de menor tamaño.

28

3. 4. Determinación de las poblaciones bacterianas en solución y su comparación mediante diversos análisis.

3. 4. 1. Determinación de la abundancia Relativa de los TRFs

Luego del tratamiento de los TRFs obtenidos en el electroferograma para cada muestra, mencionado en Métodos, 2. 2. 5. 1. , se calcularon las abundancias relativas que se muestran en las tablas a continuación. La Tabla 8 y la Tabla 9, presentan los resultados de la digestión con RsaI y MspI respectivamente. Para este análisis sólo se consideraron los TRFs cuya abundancia relativa fuera mayor al 1%, para eliminar o minimizar los errores asociados a ruidos en el electroferograma (Jernberg et al. 2005; Li et al. 2007), o aquellos que pudieran ser relacionados a alguna especie bacteriana asociada a procesos de biolixiviación. En ambas tablas, las muestras corresponden a las distintas condiciones de operación a las que fue sometida la mini-columna de biolixiviación, que se presentan en la Tabla 7.

Tabla 8. Abundancias relativas de los TRFs más significativos obtenidos en todas las muestras digeridas con RsaI.

Abundancia relativa (%) en cada muestra Tamaño del

TRF(pb) 2 3 4 5 6 7 8 9

70 - - 7,90 1,34 2,34 2,12 - - 77 4,04 7,03 10,13 - - - - - 85 2,71 3,47 7,67 - - - - - 94 1,08 - 0,82 0,36 - - 0,11 0,32 121 0,70 0,95 1,31 10,83 0,30 3,46 1,52 0,46 126 1,06 2,15 1,44 0,99 1,08 0,84 1,14 0,78 141 0,19 0,39 1,67 0,42 - - - - 146 - - 0,68 - - - - - 213 66,75 62,88 44,57 63,72 88,30 82,47 80,20 84,52 238 - - 3,33 1,92 - 1,41 - - 249 - 5,0 6,54 4,65 1,61 5,06 2,44 2,48 267 12,24 - - 2,38 - - - - 309 - 0,57 1,33 0,27 - 0,21 0,28 -

Total 88,77 82,44 87,39 86,88 93,63 95,57 85,69 88,56

29

Tabla 9. Abundancias relativas (en porcentaje) de los TRFs más significativos obtenidos en todas las muestras para la digestión con MspI.

Abundancia relativa (%) en cada muestra Tamaño del

TRF(pb) 2 3 4 5 6 7 8 9

70 7,00 1,08 - - - - 2,62 - 103 9,66 - - - - - - - 115 1,15 1,09 2,06 12,38 - 3,69 1,59 - 130 1,64 2,74 6,33 3,11 - 1,16 1,86 1,25 138 50,27 70,49 48,11 62,76 84,74 82,20 80,73 85,55 143 9,06 3,31 6,18 4,90 2,65 1,06 2,38 1,62 148 - - - - - - 1,16 1,54 163 2,50 7,72 14,44 7,53 6,10 4,22 1,27 2,09 203 - - 2,02 - - - - - 325 - 2,26 1,71 - - - - -

Total 81,28 88,69 80,85 90,68 93,49 92,33 91,61 92,05

Cada TRF puede ser asociado a una especie bacteriana particular presente en procesos de biolixiviación. Por ejemplo, la Figura 12 muestra la variación de la abundancia relativa de A. ferrooxidans en las muestras estudiadas, basado en los resultados obtenidos con la enzima de restricción RsaI. Por otra parte, hay TRFs que corresponden a más de una especie bacteriana. Al tener dos digestiones independientes con enzimas distintas, es posible descartar algunas bacterias que estarían presentes en el proceso usando el análisis con una sola enzima, pero que no están presentes al analizar los resultados obtenidos por la digestión con otra enzima. De esta manera, se tiene que las bacterias que con mayor probabilidad estarían formando parte de las soluciones estudiadas, corresponden a las que se encuentran en ambos análisis presentadas en la Tabla 10.

0

1

2

3

4

5

6

7

2 3 4 5 6 7 8 9

Muestras

Abundancia relativa [%

]

Figura 12. Variación de la abundancia relativa de A.ferrooxidans según el análisis con la enzima RsaI.

30

Tabla 10. Bacterias presentes en las soluciones a partir del análisis de T-RFLP con RsaI y MspI de forma independiente.

TRF (pb) Muestras Bacterias RsaI MspI 2 3 4 5 6 7 8 9

α proteobacteria 213 138 si si si si si si si si Acidimicrobium ferrooxidans

Acidiphilum spp.

Acidocella spp.

Acidomonas methanolica

Ferrimicrobium acidiphilium

121 138 - - si si - si si -

A. ferrooxidans 249 163 - si si si si si si si A. thiooxidans 309 163 - - si - - - - -

Arthrobacter spp. 126 143 si si si - si - si -

Desulfosporosinus spp. 94 164 si - - - - - - -

Shewanella spp. 238 163 - - si si - si - -

Sb. acidophilus 141 143 - - si - - - - -

Sb. thermosulfidooxidans 141 115 - - si - - - - -

31

A continuación se presentan algunas características generales de las bacterias encontradas en solución:

• Acidithiobacillus ferrooxidans: son preferentemente aeróbicas, quimiolitótrofas, capaces de oxidar Fe+2 y compuestos de azufre, en condiciones anaeróbicas son capaces de reducir Fe+3. Han sido encontradas como el microorganismo dominante en procesos de lixiviación de sulfuros de cobre, especialmente cuando existen altas concentraciones de ferroso. Son mesófilas y el rango de pH en el que se desarrollarían estaría entre 1,8 y 2,0. (Rawlings 1998, Malki et al. 2006, Watling 2006, Ghauri et al. 2007)

• Acidithiobacillus thiooxidans: aeróbicas, quimilitótrofas, son capaces de oxidar compuestos de azufre reducido. Son mesófilas, probablemente encontrándose hasta los 35°C, y toleran ambiente más ácidos en comparación con A. ferrooxidans, con un rango de pH entre 0,5 y 5,5. (Malki et al. 2006, Watling 2006, Ghauri et al. 2007)

• Acidiphilium: bacterias heterótrofas, ácido tolerantes, son capaces de oxidar compuestos de azufre de manera autotrófica y de reducir Fe+3 en condiciones aeróbicas o anaeróbicas. Entre ellas, Acidiphilium acidophilum es la única capaz de crecer autotróficamente usando compuestos de azufre reducidos, heterotróficamente usando distintas fuentes de carbono, o mixotróficamente usando carbón orgánico o inorgánico. (Küsel et al. 1999, Rawlings 2002, Malki et al. 2006, Watling 2006)

• Acidimicrobium ferrooxidans: termófila moderada, con un pH óptimo de 2. Es mixotrófica, hierrooxidante y reductora de Fe+3, y su presencia se encuentra asociada al crecimiento de Sulfobacillus. (Rawlings 1998, Rawlings 2002, Watling 2006, Rawlings y Jonson 2007)

• Acidocella: bacteria acidófila, heterotrófica, es capaz de crecer a pH inferiores a a 3,5 y tolerar altas concentraciones de aluminio. Esta bacteria ha sido encontrada asociada al crecimiento de A. ferrooxidans y se adhiere fuertemente a los precipitados de ión férrico. (Wakao et al. 2002, Ghauri et al. 2007, página web: www.learner.org/channel/courses/biology/textbook/microb/microb_14.html)

• Acidomonas methanolica: bacteria heterotrófica reductora de Fe+3 (Rawlings y Jonson 2007). • Arthrobacter: bacteria aeróbica, heterótrofa. Es capaz de utilizar una gran variedad de

compuestos orgánicos, incluyendo compuestos aromáticos, razón por la cual se encuentra presente en diferentes ambientes, especialmente en muestras de suelo. (Crocker et al. 2000)

• Desulfosporosinus: bacteria mesofílica, anaeróbica, reductora de sulfato. Es capaz de crecer de manera autotrófica usando hidrógeno, dióxido de carbono y sulfato. (Robertson et al. 2001, Malki et al. 2006)

• Ferrimicrobium acidiphilium: es mesófila, heterotrófica, capaz de oxidar Fe+2 y reducir Fe+3. Su pH óptimo se encuentra entre pH 1,7 y 1,8.( Watling 2006, Rawlings y Jonson 2007)

• Shewanella: anaeróbica, heterótrofa, reduce Fe(III) y Mn(IV), y oxida H2., compuestos aromáticos o cadenas cortas de ácidos orgánicos. (Arnold et al. 1990, Roden y Lovley 1993, Küsel et al. 1999, Gadd 2001)

• Sulfobacillus: Son termófilas moderadas, capaces de crecer autotróficamente, oxidando le ión ferroso o compuestos de azufre reducidos. También son capaces de crecer en ausencia de oxígeno reduciendo el ión férrico y oxidando compuestos de azufre reducido. Su pH óptimo se encuentra entre 1 y 2,5 Se ha encontrado que su crecimiento se encontraría asociado al de Acidimicrobium ferrooxidans. En particular, Sb.thermosulfidooxidans en más activa en la oxidación de Fe+2 y Sb.acidophilus oxida más rápidamente los compuestos de azufre. (Rawlings 2002, Watling 2006, Rawlings y Jonson 2007)

32

3. 4. 2. Comparación de los índices de biodiversidad

La Tabla 11 presenta los valores obtenidos para el índice de diversidad de especies por cada enzima de restricción, el que corresponde a la cantidad de TRFs únicos, es decir diferentes, encontrados en cada muestra.

Tabla 11. Índice de diversidad de especies (S) de cada muestra según la enzima de restricción utilizada (RsaI o MspI).

S

Muestra RsaI MspI 2 3 6 3 3 5 4 7 6 5 4 5 6 3 3 7 4 5 8 4 6 9 2 5

En la Tabla 12 se muestran los valores obtenidos para el índice de Shannon-Wiener (H) con cada enzima, el que toma en cuenta la diversidad de especies y la proporción de cada una de ellas en la comunidad estudiada, correspondiente a la abundancia relativa.

Tabla 12. Índice de Shannon-Wiener (H) de cada muestra según la enzima de restricción utilizada (RsaI o MspI).

H

Muestra RsaI MspI 2 0,37 1,00 3 0,52 0,70 4 0,90 1,14 5 0,75 1,00 6 0,23 0,41 7 0,49 0,52 8 0,38 0,51 9 0,23 0,40

33

3. 4. 3. Comparaciones de las muestras estudiadas

3. 4. 3. 1. Comparación entre los TRF asociados a bacterias según su aparición en las muestras

La Figura 13 muestra los dendrogramas obtenidos utilizando los TRFs cuya abundancia relativa sea mayor o igual al 1% y asociados a alguna bacteria de los ambientes ácidos de biolixiviación.

(a)

(b)

Figura 13. Relación de los TRFs significativos (a) obtenidos de la digestión con RsaI, (b) obtenidos de la digestión con MspI.

34

La Figura 14 muestra la comparación entre las bacterias resultantes de la comparación de los resultados de los electroferogramas en cada muestra, a partir de los cuales se determinó que las bacterias realmente presentes en solución corresponden a las de la Tabla 10.

Figura 14. Relación de las bacterias encontradas en solución a partir de la Tabla 10.

Distancia

α proteobacteria

Desulfosporosinus spp.

Shewanella spp.

Arthrobacter spp.

A.ferrooxidans.

A.thiooxidans

Acidimirobium ferrooxidans Acidiphilum spp; Acidocella spp Acidomonas methanolica

Ferrimicrobium acidiphilium

Sb.acidophilus Sb.thermosulfidooxidans

35

3. 4. 3. 2. Comparación entre las soluciones según la aparición de bacterias en solución

La Figura 15 presenta la comparación de las muestras según las bacterias en solución, determinadas con el método de T-RFLP, para cada digestión enzimática.

(a)

(b)

Figura 15. Dendrogramas que muestran la relación entre las soluciones a partir de las poblaciones desarrolladas en ellas (a) según la digestión con RsaI, (b) según la digestión con MspI.

La Figura 16 muestra la comparación de las soluciones a partir de la aparición de las bacterias presentadas en la Tabla 10 en la solución.

36

Figura 16. Dendrograma de la relación entre las soluciones a partir de las poblaciones desarrolladas en ellas, según los datos obtenidos en la Tabla 10.

Distancia

37

3. 4. 3. 3. Comparación de los TRFs mediante el análisis de componentes principales

El resultado del análisis de componentes principales para las muestras estudiadas, se muestra en la Figura 17, correspondiente a los TRFs obtenidos con RsaI, y la Figura 18, correspondiente a los TRFs obtenidos con MspI. Cada punto en las figuras se relaciona con un tamaño de TRF, el cual se muestra al lado de cada uno de los puntos, y representa a las bacterias encontradas en solución.

Figura 17. Gráfico del análisis de componentes principales para los TRF obtenidos de la digestión con RsaI. Los números corresponden a los tamaños de los TRF.

38

Figura 18. Gráfico del análisis de componentes principales para los TRF obtenidos de la digestión con MspI. Los números corresponden a los tamaños de los TRF.

39

Capítulo 4. Discusión 4. 1. Selección de la segunda enzima de restricción a utilizar

En diversas fuentes se propone que las enzimas de restricción adecuadas para llevar a cabo la técnica de T-RFLP, son aquellas que reconocen un sitio de restricción de 4 pb. (Liu et al. 1997; Bryan et al. 2005). Esto eventualmente permitiría obtener una mayor cantidad de TRFs distintos, debido a que la probabilidad de que cada enzima encuentre más de un sitio de restricción aumentaría, respecto a aquellas que reconocen sitios de 5, 6 o 7 pb. Esta situación dependerá del grado de conservación de los sitios de restricción en los fragmentos analizados (Liu et al. 1997).

Al estudiar los TRFs teóricos obtenidos con distintas enzimas de restricción, a partir de los fragmentos del rDNA 16S amplificados teóricamente, se comprobó que aquellas enzimas que reconocían sitios de restricción de un largo mayor a 4 pb producían TRFs de igual tamaño para la mayoría de las bacterias consideradas, o simplemente no cortaban la secuencia, según mostró el programa Virtual Diegest, de MICA. Por otro lado, enzimas que reconocían sitios de restricción de 4 pb también presentaron TRFs teóricos de igual tamaño, lo que sugiere que ese sitio de restricción en particular es altamente conservado en los genes del rDNA 16S de estos microorganismos.

Se escogió MspI (C/CGG) como segunda enzima de restricción, teniendo que permite distinguir a L. ferrooxidans y Sb. thermosulfidooxidans de otras bacterias consideradas en procesos de biolixiviación. El uso de esta enzima permite, además, diferenciar L. ferrooxidans de L. ferriphilium y Sb. thermosulfidooxidans de Sb. Acidophilus (Tabla 6). Sin embargo, L. ferriphilium y Sb. Acidophilus no podrían ser completamente diferenciadas del resto de las bacterias, debido a que existe por lo menos una bacteria más cuyo TRF es del mismo tamaño (Tabla 22, Anexo E).

De la misma forma, al digerir con RsaI y MspI no es posible distinguir entre algunas especies bacterianas, como se muestra en la Tabla 6. Debido a que su TRF es el mismo, no se sabría con certeza cual o cuales bacterias están presentes en la solución.

Cabe destacar que al usar la enzima de restricción RsaI, más de algún TRF asociado a las bacterias en estudio tendría un largo mayor que 490 pb, por lo tanto están fuera del rango del estándar de tamaño de la electroforesis capilar y no serán encontrados en la solución. Al usar MspI las bacterias descartadas con la enzima anterior podrían ser encontradas en solución, complementando la información entregada por el análisis con RsaI.

Se ha encontrado en la literatura que el uso dos enzimas de forma simultánea para realizar la digestión de los fragmentos amplificados, aumenta la resolución de la técnica de T-RFLP, lo que se traduce en un aumento de la cantidad de TRF únicos (Liu et al, 1997). En el caso particular de las enzimas utilizadas en este trabajo, su aplicación en conjunto no resulta un gran aporte respecto a la digestión con las dos enzimas de forma separada, debido a que no se lograría la diferenciación entre A. ferrooxiands y A. thiooxidans (Tabla 6). En estas condiciones sigue siendo mejor el uso de RsaI de forma independiente para los ambientes de biolixiviación.

Cabe destacar que la base de datos a través de la cual se efectuó la determinación de los TRF en la implementación inicial de la técnica (Morales 2006) y que dio como resultado el uso de la enzima RsaI, fue actualizada en Julio del 2007. Con esta nueva información, se tiene que los TRFs de A.thiooxidans y de A.albertensis (Tabla 22, Anexo E) son del mismo tamaño al digerir con RsaI. Por lo tanto no se cumpliría la premisa inicial de que esta enzima permite distinguir sin lugar a dudas entre A.ferrooxiands y A. thiooxidans.

40

4. 2. Análisis de los parámetros fisicoquímicos de las muestras estudiadas

Una primera aproximación para estudiar la dinámica de las distintas poblaciones bacterianas presentes en procesos de biolixiviación, la constituye la Figura 5. En ella se ve cómo afectan las diferentes condiciones del medio en la oxidación de ión ferroso a ión férrico.

A medida que aumenta la concentración de sulfato (muestras 6 y 7), de aluminio (muestras 8 y 9) o de zinc (muestra 9), las curvas de Eh muestran una tendencia a retardar su llegada a valores cercanos a los 600 mV, siendo la muestra 9 la que tarda mayor cantidad de tiempo. Esto se explica por la toxicidad del zinc y los niveles de aluminio y sulfato presentes en la columna y la solución, que se traducen en un grado de inhibición de la oxidación de Fe+2 (Tabla 7) y del crecimiento bacteriano (Figura 9) (Dopson et al. 2003).

Las muestras 4 y 5, en que la concentración de sulfato inicial es similar y a las cuales no se añadió ningún compuesto en particular al medio (Tabla 7), muestran una marcada diferencia en su potencial redox a partir del tercer día, siendo la muestra 4 la que menos tarda en llegar a 600 mV. La explicación de este fenómeno puede estar relacionada con los valores de pH y la aireación presente en la columna. En la muestra 4 se suministró aire y el pH final fue de aproximadamente 1,4, mientras que en la muestra 5 no se suministró aire y el pH final fue de alrededor de 1,7, a pesar de que las condiciones iniciales eran similares. De esta forma la muestra 4 se considera más favorable, respecto a la muestra 5, para el crecimiento de una mayor cantidad de organismos biolixiviantes (Figura 9 y Tabla 7), en particular de los hierrooxidantes, entre los que se incluyen los Acidithiobacillus y los Leptospirillum (Yahya y Johnson 2002; Rohwerder et al. 2003), lo que explicaría la mayor rapidez y mayor cantidad de oxidación de Fe+2 (Tabla 7).

En el caso de las muestras 6 y 7, el párrafo anterior se contradice con lo sucedido. Si bien en ambas muestras fue suministrado aire, el pH de la muestra 6 se mantuvo entre 1,6 y 1,7, aproximadamente, mientras que en la muestra 7 se mantuvo entre 1,3 y 1,4, por lo cual se esperaría que en la muestra 7 hubiese una mayor actividad oxidativa, como se comentó anteriormente. Sin embargo en este caso se tiene mayor concentración de sulfato, respecto de las muestras 4 y 5, la que aumentó aproximadamente el doble para simular una mayor generación de ácido sulfúrico (Tabla 7), lo que junto con el bajo pH pudo haber inhibido a algún tipo de microorganismo tanto en crecimiento como en actividad oxidativa. La muestra 6 representaría la situación más favorable para el crecimiento de A. ferrooxidans y otras especies hierooxidantes, lo que podría traducirse en que este caso presente la más rápida actividad oxidativa (Figura 5).

En la muestra 8 (Figura 5) se observa que durante los primeros días los valores del Eh fueron inferiores a los de todas las muestras estudiadas, exceptuando la muestra 9. No obstante, alrededor del día 8 se observa claramente como el Eh es mayor que en las muestras 5, 7 y 9. La explicación de fenómeno podría ser que durante los primeros días se tiene una etapa de ambientación de los microorganismos a los niveles de aluminio adicionados a la solución, pero luego algunos de ellos ven estimulado su crecimiento, dependiendo de la concentración de aluminio en el medio, y otros simplemente toleran la concentración de aluminio presente (Wakao et al 2002).

Las muestras 2 y 3 no son presentadas en la Figura 5 debido a que no se realizó un seguimiento significativo de la variación de los valores del Eh. Por otro lado, en la muestra 1 a pesar de poseer dichos valores, estos presentan una pendiente creciente suave debido a corresponder a la etapa de ambientación de la columna, por lo tanto no se alcanzaron valores de Eh superiores a 450 mV en un tiempo considerable para el estudio y fue cambiada, no siendo significativa para este análisis.

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La gran concentración de cobre obtenida en la solución 1 (Figura 6), en comparación con las otras muestras, se explica debido a que el mineral usado en la columna provenía de un proceso de lixiviación y se encontraba seco. Luego, al hacer circular el medio de cultivo MC, se provocó un lavado del mineral con lo que se recuperó el cobre disuelto que no se había recuperado antes de que se guardara el mineral.

En el resto de las muestras la cantidad de cobre disuelto (Figura 6) está estrictamente relacionado con la actividad de las bacterias (su estimulación o su inhibición). En particular se observa que la cantidad de cobre disuelto tiende a disminuir a medida que se añaden iones de aluminio y zinc a las muestras.

En la Figura 7 se observa cómo la generación de ión férrico es siempre creciente, asociado a la actividad oxidativa de las bacterias en solución y/o adheridas al mineral de la columna. De la misma forma, la cantidad de sulfato generado es creciente (Figura 8), lo que se asocia a oxidación química o a la actividad de bacterias azufre oxidantes presentes en solución y/o adheridas al mineral.

4. 3. Obtención de microorganismos, DNA genómico y fragmentos amplificados del rDNA 16S

En la Figura 9 se observa el aumento de la cantidad de células generadas en el tiempo. En particular, en la muestra 9 la cantidad de células generadas disminuye posiblemente debido a los iones de zinc añadidos al sistema (Tabla 7). Por otra parte, en las muestras en las que no hubo aireación se obtuvo la menor cantidad de células generadas (muestras 2, 3 y 5, Tabla 7), sin que hubiese algún ión adicional en solución. Esto muestra la necesidad de la adición de aire para la obtención de una gran cantidad de microorganismos relacionados con estos ambientes.

Al analizar las variaciones de pH en la Tabla 7, se observa que la mayor cantidad de células generadas se tiene en la muestra 3, en la que se tiene el pH más alto analizado (pH 2,3). Sin embargo en esta muestra el potencial redox alcanzó los 515 mV, por lo que los niveles de Fe+3 no habrían alcanzado a afectar a los microorganismos presentes y no se puede asociar una alta actividad de bacterias hierrooxidantes que expliquen la cantidad de células. Por otra parte, las muestras en las que se tiene el menor pH final estudiado (muestras 4 y 7 con un pH final de 1,45), no se obtuvo un cambio sustancial respecto a las otras muestras en la cantidad de células presentes. Es por esto que no se pueden asociar las variaciones de pH al comportamiento general de las muestras en cuanto a la cantidad de células generadas.

Como ya se comentó en los resultados, la muestra 1 fue la que presentó la menor concentración de células al realizar el recuento directo al final de cada etapa (Tabla 7) y no se logró extraer su DNA. Debido a esto se especula que se requiere una cantidad de células totales del orden de 1010, por lo que se debería tener 1 litro de solución con una concentración de 107 células/ml para lograr una extracción de DNA exitosa.

Por otra parte, la Figura 10 demuestra que se logró la extracción de DNA genómico, y que eventualmente sería necesario añadir al protocolo de extracción una etapa en la que se adicionará RNasa, para así eliminar el RNA obtenido (señal al final de los carriles 1 y 3), permitiendo ver de forma clara en la electroforesis la calidad del DNA extraído, aunque la presencia de DNA no afectó las reacciones de PCR (Figura 11).

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En la comparación de los métodos de purificación del producto de PCR, en ambos casos se encontró un fragmento, dependiente de la enzima de restricción utilizada, que poseía la mayor abundancia relativa, superior al 40% en todas las muestras. Por otra parte, los electroferogramas resultantes de la purificación desde el gel no presentaban todos los posibles TRFs obtenidos de la digestión enzimática, porque el mayor TRF en ocasiones no superaba los 170 pb, por lo que fueron considerados como resultados no significativos. Fue por estas razones que se decidió llevar a cabo el protocolo de T-RFLP utilizando el kit de purificación de productos de PCR.

4. 4. Análisis de los TRFs encontrados y su relación con las condiciones de la mini-columna

Se puede observar en la Tabla 8 y la Tabla 9 que al hacer la digestión con RsaI se tiene una mayor cantidad de TRFs respecto de los obtenidos con MspI (13 con RsaI versus 10 con MspI), lo que proviene, en el caso de RsaI, de contabilizar TRFs que si bien no son significativos (abundancia relativa menor al 1%) pueden ser asociados a alguna bacteria biolixiviante que se esperaría encontrar.

Por otra parte, con ambas enzimas de restricción se obtuvo un TRF con la mayor abundancia relativa, sobre el 40%, que se encuentra presente en todas las muestras en estudio. En el caso de RsaI su tamaño es de 213 pb y en el caso de MspI es de 138 pb, los cuales pueden ser asociados a α proteobacterias genéricas. Por otra parte, el TRF de largo 138 con MspI es también asociado a Acidimicrobium ferrooxidans, Acidiphilum spp., Acidocellas spp., y Acidomonas methanolica, todas α proteobacterias heterótrofas (Taxonomy, NCBI), mientras que éstas corresponden al TRF de 121 pb para la digestión con RsaI. Con esta información no parece extraña la posibilidad de que el TRF de 213 pb obtenido con RsaI, corresponda efectivamente alguna α proteobacteria que se desarrolle en ambientes ácidos como el estudiado.

En la Tabla 8 se observa la presencia de TRFs de largo 70, 77 y 85 pb al hacer la digestión con RsaI, los cuales pueden ser asociados a alguna bacteria no cultivable, según los resultados arrojados por la digestión virtual. Para estas bacterias no cultivables, su TRF con MspI correspondería a 138 pb, por lo cual no se podría descartar la posibilidad de que efectivamente se hayan desarrollado en el sistema estudiado. Sin embargo, como no se conoce cuales fueron las condiciones en las que fueron obtenidas las bacterias no cultivables que aparecen en la base de datos, es decir el ambiente en el cual se encontraban, es difícil determinar si realmente estos fragmentos corresponden a alguna bacteria o simplemente a errores asociados a la técnica, razón por la cual estos fragmentos no fueron incluidos en los siguientes análisis estadísticos. El mismo argumento es válido en el caso del TRF de largo 325 pb obtenido con la enzima MspI en la Tabla 9, el que corresponde también a alguna bacteria no cultivable. En este caso, su correspondiente TRF con RsaI es de 127 pb, el que puede ser asociado al de tamaño 126 pb. Ambos fragmentos son significativos en las mismas soluciones (en la muestra 3 y la 4) por lo que no se podría descartar del todo su presencia.

Contraria a la anterior es la situación de los fragmentos de largo 267 pb con RsaI y 70 pb con MspI. El primero, si bien puede ser relacionado con una bacteria no cultivable, en la digestión virtual no hay más de una bacteria no cultivable asociada a dicho fragmento, por lo que no se confirma su existencia, pudiendo ser resultado de un error de la técnica o debido a que no ha sido detectado por otras investigaciones. El segundo, por otra parte, no corresponde a ninguna bacteria, cultivable o no, según los resultados de la digestión virtual. Tomando en cuenta el error del método de ±2 pb, no existían TRFs de tamaño 70 ±2 pb, por lo que probablemente éste correspondería a algún tipo de error.

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El análisis de cada situación estudiada debe hacerse de manera individual, comparando la Tabla 8 con la Tabla 9, y viendo en cada caso a qué bacteria correspondería cada TRF según la Tabla 22 (Anexo E). Para este análisis se descartaron los TRFs asociados a bacterias no cultivables y los TRF que no pueden ser asociados a bacterias, como se menciona en el párrafo anterior.

Como ya se explicó, los fragmentos de 213 y 138 pb corresponden a α proteobacterias. Sin embargo no se puede descartar la presencia específica de Acidimicrobium ferrooxidans, Acidiphilum spp., Acidocellas spp. o Acidomonas methanolica en las muestras 2, 3, 6 y 9, debido a que son también α proteobacterias y a que su TRF de 121 pb con RsaI estaba presente en dichas muestras, pese a no ser significativo según los criterios utilizados. En las otras condiciones (muestras 4, 5, 7 y 8), el TRF de 121 pb tuvo una abundancia relativa mayor al 1%, por lo que confirmaría la presencia de, al menos una de las bacterias heterotróficas antes mencionadas, importantes por disminuir los niveles de los compuestos orgánicos en solución producidos durante el metabolismo de los microorganismos.

El fragmento de 249 pb, obtenido a través de la digestión con RsaI, corresponde a A. ferrooxidans y se encuentra de manera significativa a partir de la muestra 3. Como su TRF con MspI es de 163 pb y se encuentra presente en todas las muestras, permitiría confirmar la presencia a partir de la muestra 3 de esta bacteria considerada como la más común en procesos de biolixiviación. Asimismo, la presencia de actividad oxidativa del ión ferroso a ión férrico de manera importante a partir de la muestra 3, concuerda plenamente con la aparición de A. ferrooxidans en las soluciones.

En el caso de A. thiooxidans su TRF de 309 con RsaI sólo es significativo en la muestra 4, pero aparece con una abundancia relativa menor al 1% en las muestras 3, 5, 7 y 8. Al igual que en el caso de A. ferrooxidans, su TRF es de 163 pb, por lo que sólo se podría asegurar la presencia de A. thiooxidans en la muestra 4 y podría especularse que estuviera presente en baja concentración en las otras muestras.

El TRF de 126 pb con RsaI corresponde a Arthrobacter spp., cuyo tamaño es de 143 pb con MspI. Como ambos fragmentos se encuentran en el análisis en las muestras 2, 3, 4 y 8, se puede establecer que el microorganismo se encontraba presente en dichas soluciones, lo que concuerda con el resultado obtenido por Gabriela Morales (2006) que encontró esta bacteria asociada a procesos de biolixiviación.

El fragmento de largo 141 pb con RsaI puede ser asociado a Sb.acidophilus o a Sb.thermosulfidooxidans, de 143 y 115 pb con MspI respectivamente. Estos tres TRFs se encuentran presentes en el análisis de la solución 4, único en el cual el TRF de 141 pb es significativo, por lo que su presencia se vería confirmada sólo en ese caso. No obstante, el fragmento de 115 pb con MspI se encuentra presente significativamente en las muestras 2, 3, 4, 5, 7 y 8 y el 141 pb de forma no significativa en las 2, 3 y 5, por lo que se puede pensar en la presencia de Sb. thermosulfidooxidans en estas soluciones pero que, debido a errores asociados a la técnica de TRFLP, no haya sido posible detectarlos al digerir RsaI.

La presencia de algún Sufobacilli en la muestra 4 concuerda con Rawlings (2002), que postula que el crecimiento de Acidimicrobium ferrooxidans ocurriría en asociación con estas bacterias. Del mismo modo, Yahya y Johnson (2002) comentan que se encuentra una mayor actividad de estas bacterias al crecer en mezcla con otros microorganismos acidófilos, lo que concuerda con los casos en estudio.

Por otro lado, el TRF de 94 pb con RsaI se asocia con Desulfosporosinus spp. (bacteria sulfato reductora (Malki et al. 2006)) y con Enterobacter cloacae (heterotrófica neutrófila (Brandl 2001)), ambas asociadas a ambientes de biolixiviación. El tamaño de su TRF al digerir con MspI sería de 164 y 163

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pb respectivamente, los que se consideran iguales debido al error asociado a la electroforesis capilar. Como ambos TRF obtenidos al digerir con distintas enzimas se encuentran presentes en la muestra 2, la única que presentó el TRF de 94 pb, las dos bacterias podrían ser asociadas al sistema en estudio, pero debido a que el pH es ácido, se descarta la presencia de Enterobacter cloacae dado que su desarrollo es poco probable.

El TRF de largo 238 pb con RsaI en las muestras 4, 5 y 7 correspondería, según la digestión virtual, a Shewanella spp., bacteria que reduce el ión férrico (Küsel et al. 1999), o a Pseudoalteromonas spp., bacteria acuática. Como ambas bacterias serían asociadas a un TRF de 163 pb con MspI, el cual se encontró presente en las mismas muestras, se considera que efectivamente Shewanella spp. estaría presente en el estudio, descartando a las Pseudoalteromonas spp. por no pertenecer a un ambiente ácido.

Es importante notar el caso de los TRF de 103, 130 y 148 pb obtenidos en la digestión con MspI. El primero es asociado a L. ferriphilium y cuyo TRF con RsaI correspondería a 146 pb. Al no encontrarse el fragmento de 146 pb de manera significativa en alguna de las muestras, sólo estaría presente en la muestra 4 con abundancia relativa menor al 1%, se supondría que no había L. ferriphilium en la solución. Confirmando lo anterior, tampoco se encontraron presentes TRFs que puedan ser asociados a la familia de las Nitrospira, a la que pertenecen los Lesptospirilli (Rawlings 2002). Además, se realizó una reacción de PCR con partidores específicos para L. ferrooxidans, con lo que no se encontró presencia de esta bacteria, reafirmando la suposición anterior. Pese a esto, el hecho de que se pudiese encontrar L ferriphilium en las muestras estudiadas concuerda con algunos trabajos que afirman que en realidad es esta bacteria y no L.ferrooxidans la que comúnmente se encuentra en los procesos de biolixiviación (Rawlings 2002).

El TRF de 130 pb obtenido con MspI podría corresponder a Chromobacterium violaceum, Stenotrophomonas maltophila o Psycrobacter glanícola, según los resultados de la digestión virtual, y su fragmento al digerir con RsaI sería de 146 pb, en los dos primeros casos, y de 551 pb. Todas estas bacterias son asociadas a procesos de biolixiviación según Brandl (2001), sin embargo no corresponden a las bacterias más comunes. Las tres bacterias son heterotróficas, y en el caso de Chromobacterium violaceum el principal agente lixiviante correspondería a cianuro (Brandl 2001), por lo cual no correspondería encontrarla en el ambiente estudiado. Asimismo, el TRF de 146 pb no fue significativo en el estudio y el de 551 pb no puede ser detectado dado el rango del electroferograma, así que no se podría asegurar la presencia de alguna de estas bacterias.

El TRF de 148 pb obtenido de la digestión con MspI podría ser asociado a Alicyclobacillus disulfidooxidans, mientras que el de 164 pb correspondería a Alicyclobacillus spp. Ambas bacterias tendrían asociado un TRF de 146 pb al digerir con RsaI, por lo que, al igual que en el caso anterior, no se puede asegurar la presencia de estas bacterias en el estudio.

A lo largo del análisis se observa que las poblaciones bacterianas no se mantienen de una condición a otra, en los casos en que las soluciones son prácticamente iguales (soluciones 2 y 3 con cada enzima). Además, aparecen como significativas bacterias que no son encontradas frecuentemente en los ambientes de biolixiviación (Desulfosporosinus spp. y Shewanella spp.). Asimismo, al tomar en cuenta el análisis de los TRFs obtenidos con cada enzima en forma separada, no se encuentra una clara tendencia en la inhibición de las bacterias entre las distintas soluciones. Esto concuerda con el hecho de que las comunidades bacterianas estudiadas a escala de laboratorio tienden a presentar las características de sistemas caóticos, atribuibles a predación, competencia por los sustratos y nuevas presiones selectivas impuestas por los cambios de los parámetros fisicoquímicos de los sistemas estudiados (Saikaly et al. 2005).

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Luego de este razonamiento se puede observar cómo el análisis a partir de cada enzima en forma independiente, puede inducir a suponer la presencia de una u otra bacteria, lo que podría no corresponder con la realidad. Es por esta razón que se considera más válida la información otorgada al comparar la presencia de los TRFs al digerir con cada enzima por separado (Tabla 10). Esta restricción permitiría disminuir los efectos caóticos del análisis de las digestiones independientes, pero a la vez se debe tener en cuenta que el sistema quedaría virtualmente subestimado.

Se debe considerar además que este análisis por comparación se encuentra sujeto a los errores asociados a la técnica de T-RFLP, mencionados más adelante, los cuales influirían directamente en el tamaño, la presencia de los TRFs y en su abundancia relativa.

La más alta velocidad de oxidación de ión ferroso que se observa en la muestra 4 (Tabla 7 y Figura 5), se ajusta al hecho de que sea en esta condición en la que se encuentre una mayor diversidad de microorganismos de manera significativa.

En todos los casos estudiados es aceptable encontrar organismos heterótrofos asociados a estos ambientes, como Acidiphilum y Ferrimicrobium acidiphilium, además de los hierrooxidantes, sulfato reductores o azufre oxidantes, debido a que se encargarían de eliminar los compuestos orgánicos que podrían llegar a ser tóxicos para las otras bacterias (Brierley 2000).

La concentración de cobre sólo parece presentar valores inhibitorios en las muestras 1 y 2 para algunos de los microorganismos encontrados, como Sb. thermosulfidooxidans y Acidiphilium angustum (Tabla 1), ninguno de los cuales se encuentra en la muestra 2, si se trabaja con los TRFs encontrados con ambas enzimas (Tabla 10).

En la muestra 7, la posible presencia de Acidocella spp. y Acidiphilum spp. se explicaría por la acción estimuladora que podrían provocar en ellas ciertas concentraciones de aluminio agregadas en forma de sulfato de aluminio (Wakao et al. 2002).

Por otro lado, no se observa la presencia de especies de Leptospirillum a pesar de que algunas soluciones presentaron las condiciones óptimas para su crecimiento: aire y pH óptimo (entre 1.0 y 1.7). Esta situación podría deberse, en la muestra 2 y 3, al bajo Eh al cual fue recolectada la solución; a que éstas se encontraran adheridas al mineral de la columna en mayor proporción que el resto de los microorganismos (Ghauri et al. 2007) o a que precipitaran junto con el hidróxido férrico, dependiente de los valores de pH en la solución, como sucedería con A.ferrooxidans.

En la muestra 9, la concentración de zinc es inhibitoria para Sb. thermosulfidooxidans y Acidiphiliun angustum, según la Tabla 1, lo que se refleja en las bacterias encontradas en esta solución: sólo A.ferrooxidans y alguna α proteobacteria. Como Acidiphilium cryptum y Acidocella aminolytica corresponden a α proteobacterias y no serían inhibidas, como muestra la Tabla 1, probablemente podrían ser éstas las que se encuentren en la solución.

Además, en Rawlings (2002) se comenta como las distintas Acidiphilium (bacterias heterótrofas) crecen frecuentemente cercanas a A. ferrooxidans, lo que explicaría su posible presencia en las muestras y en particular en la solución 9.

La constante generación de sulfato hace suponer la presencia de bacterias azufre oxidantes o la oxidación química del azufre por medio de Fe+3. Las bacterias contribuirían a la generación de ácido sulfúrico y la mantención de pH bajos. Esto se ajustaría a la aparición de A.thiooxidans, A.ferrooxidans

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y Sb.thermosulfidooxidans o Sb. acidophilus en la muestra 4, la posible presencia de A.thiooxidans en las muestras 3, 5, 7 y 8, la posible presencia de alguna de las Sulfobacillus en las muestras 2, 3 y 5 (con abundancia relativa menor al 1%) y a la presencia de A.ferrooxidans en todas las muestras excepto la 2. Los bajos niveles de A.thiooxidans y el hecho de no haber detectado otras bacterias azufre oxidantes en solución, pudo deberse a que estas bacterias se encontrasen adheridas al mineral y su concentración en solución no permitiera detectarlas.

La Figura 12 presenta la variación de la abundancia relativa de A.ferrooxidans entre las distintas muestras. A partir de ella no es posible establecer una relación entre la concentración de sulfato en solución y la aparición de esta bacteria en las muestras. Sin embargo, se destaca la disminución de su abundancia relativa en las muestras 8 y 9, las que corresponden a la mayor concentración de sulfato y a la presencia de iones de aluminio y zinc, que en conjunto pudieron haber afectado la cantidad de bacterias presentes.

Al analizar la Tabla 10 se observa que los parámetros de la muestra 4 (pH, Eh, iones y aireación) favorecen la diversidad bacteriana, al encontrarse mayor cantidad de bacterias distintas en solución.

4. 5. Análisis de la diversidad biológica en la mini-columna

4. 5. 1. Análisis de los índices diversidad de especies y de Shannon-Wiener

Al comparar los índices de diversidad de especies obtenidos (Tabla 11), se observa que en la muestra 4, que parece ser una de las que favorece el crecimiento de microorganismos asociados a estos ambientes ácidos, se presenta la mayor cantidad de TRFs únicos y asociados a alguna especie bacteriana para ambas enzimas (7 para RsaI y 6 para MspI). No obstante, se debe destacar que en el caso de la digestión con MspI, las muestras 2 y 8 tienen el mismo número de TRFs únicos que la muestra 4, es decir la máxima cantidad.

Por otra parte, al hacer el mismo ejercicio con la muestra 9 en la que hay mayores niveles de inhibición, en la digestión con RsaI se tiene la menor cantidad de TRFs únicos respecto a las otras condiciones estudiadas (2 TRFs), no así en el caso de la MspI (5 TRFs), cuya mínima cantidad de TRFs únicos se obtiene en la muestra 6 (3 TRFs). Pese a esto, no se logra observar en ninguno de los casos una correspondencia entre el aumento de las condiciones inhibitorias y la disminución del índice de diversidad de especies, es decir de los TRF únicos encontrados.

El índice de Shannon-Wiener (Tabla 12) muestra, al igual que el índice de diversidad de especies, que la mayor diversidad, es decir el mayor valor del índice, se encuentra en la muestra 4 para la digestión con cada enzima, asociado a las mejores condiciones de crecimiento.

En el caso de los resultados obtenidos por la digestión de los fragmentos amplificados del rDNA 16S con RsaI y con MspI, entre las muestras 4 y 5 y 7, 8 y 9 el índice de Shannon-Wiener disminuye su valor al igual que aumentan las condiciones no favorables, solución 5 sin aireación, o inhibitorias en la solución.

Al analizar los índices de Shannon-Wiener de las muestras 6 y 9 se observa que su valor es prácticamente igual con ambas enzimas, pero esto no es concluyente debido a que la muestra 9 es aquella que presenta niveles de zinc inhibitorios y la muestra 6 teóricamente no debiera presentar inhibiciones determinantes.

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Las diferencias arrojadas por los índices de diversidad de especies y de Shannon-Wiener en el análisis provienen directamente de la manera en que se calculan. El primero es un reflejo directo del número de TRFs diferentes asociables a alguna bacteria, mientras que el índice de Shannon-Wiener utiliza el valor de la abundancia relativa para su cálculo. Como la cantidad de TRFs y la abundancia relativa están sujetas a etapas anteriores para su determinación, tendrán asociados los errores de arrastre que se puedan haber generado durante el T-RFLP y el tratamiento de los datos obtenidos del electroferograma.

4. 5. 2. Comparación entre las distintas muestras obtenidas de la mini-columna

4. 5. 2. 1. Comparación entre las bacterias encontradas en solución

Los dendrogramas de la Figura 13 y la Figura 14 presentan básicamente cómo se agrupan las bacterias asociadas a cada TRF basados en su presencia en las muestras analizadas.

El dendrograma asociado a los TRFs encontrados al hacer la digestión con RsaI (Figura 13 (a)), muestra como los TRFs de 309 y 141 pb, correspondientes a A.thiooxidans o A.albertensis y a Sb.acidophilus o Sb.thermosulfidooxidans respectivamente, se encuentran presentes en las mismas muestras (muestra 4), dada la forma en que fueron obtenidos los dendrogramas.

En el caso del dendrograma elaborado a partir de la digestión con MspI (Figura 13 (b)), los fragmentos que presentan mayor cercanía y que se encuentran presentes en iguales condiciones, tienen un tamaño de 138, 143 y 163 pb, y estarían relacionados con los otros fragmentos. Esto concuerda con lo mostrado en el dendrograma a partir de RsaI (Figura 13 (a)), en donde los TRF de 249 y 213 pb, si bien corresponden al segundo par de fragmentos más cercanos en cuanto a su aparición en el análisis de las soluciones, también estarían relacionados con todos los otros fragmentos. Este fenómeno proviene del hecho que las bacterias asociadas a estos TRFs, A. ferrooxidans en el caso del TRF de 249 pb, algún Acidithiobacillus para el de 163 pb, y α proteobacterias en el caso de los fragmentos de 213 y 138 pb, se encuentran presentes en todas o casi todas las muestras estudiadas, por lo que se deben estar relacionados con los microorganismos que van apareciendo en las otras situaciones estudiadas.

El TRF de 126 pb para RsaI sería el siguiente en cercanía a los TRF de 249 y 213 pb, coincidiendo con la cercanía del fragmento de 143 pb mostrado en el dendrograma elaborado a partir de los resultados obtenidos con la enzima MspI, dado que ambos representan al Arthrobacter spp.. Sin embargo, esta situación se contradice con el haber encontrado el fragmento de 141 pb alejado del primer grupo (249 y 213 pb), ya que el TRF de 143 también podría corresponder a Sb.acidophilus.

Se destaca también el hecho de que el TRF de 121 pb para el análisis con RsaI se encuentre alejado del fragmento de 213 pb (Figura 13 (a)), los que podrían estar relacionados por pertenecer ambos a α proteobacterias.

En ambas figuras se muestra como los fragmentos de 94 pb obtenido al digerir con RsaI y de 203 pb al digerir con MspI, se encuentran en la rama más alejada de los microorganismos comúnmente encontrados en biolixiviación, correspondientes a Desulfosporosinus spp. y Thermotrix thiopara respectivamente.

En la Figura 14 se presenta el dendrograma resultante del análisis de las digestiones independientes con cada enzima de restricción, el cual es similar al obtenido de la digestión con RsaI. En ella se observa que las bacterias Sulfobacillus y A.thiooxidans se encontrarían estrechamente

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relacionadas, como ya se ha comentado, debido a que ambas se encuentran presentes sólo en la muestra 4. Esto se reafirma al notar que ambas corresponden a bacterias azufre oxidantes, lo que daría cuenta de la mayor cantidad de sulfato generado.

En el caso de A.ferrooxidans y α proteobacterias, la gran relación existente entre ellas (Figura 14), se explica debido a que sus respectivos fragmentos se encuentran presentes en la mayor parte de las muestras analizadas. Estas bacterias también se encontrarían más relacionadas que las otras a Arthrobacter spp. Estos hechos coinciden una vez más con la necesidad de tener bacterias heterótrofas en solución acompañando a alguna bacteria quimiolitótrofa, con el fin de eliminar los compuestos orgánicos presentes en solución.

La explicación anterior también se ajusta a la relación entre la aparición de Shewanella spp. y la presencia de Acidimicrobium ferrooxidans, Acidiphilum spp.; Acidocella spp., Acidomonas methanolica o Ferrimicrobium acidiphilium. Esto se debe a que todas serían heterótrofas y algunas de ellas son capaces de reducir Fe+3, por lo que podrían crecer acompañando a las A.ferrooxidans.

La bacteria Desulfosporosinus spp. sería aquella menos relacionada al resto de las bacterias encontradas en solución. Lo anterior podría deberse a que es la única bacteria anaeróbica estricta sulfato reductora encontrada en el análisis, detectada en la muestra 2, en la que no hubo aireación y el potencial redox indicaría que los niveles de Fe+3 en solución no llegarían a ser tóxicos.

En el análisis de componentes principales se observa que en el caso de la digestión con RsaI, Figura 17, al igual que en el dendrograma, los fragmentos de 141 y 309 pb se encuentran juntos, debido a su presencia sólo en la muestra 4 y que sus abundancias relativas son similares, 1,67% y 1,33% respectivamente. Además el fragmento de 94 pb, que se encuentra cercano a los antes mencionados, podría ser asociado al mismo grupo, lo que no concuerda con los parámetros de las soluciones en que cada uno fue encontrado ni con el resultado del dendrograma.

Contraria a esta situación es la de los TRF de 213 y 121 pb, los que se encuentran comparativamente alejados del resto de los puntos observados, por lo que no podrían ser agrupados con ninguno de ellos. Al igual que lo ocurrido en el dendrograma correspondiente, se podría haber esperado que estos dos TRFs se hubiesen encontrado relacionados, ya que ambos son asociados filogenéticamente a α proteobacterias, uno de forma específica (213 pb) y el otro a bacterias de la misma familia (121 pb).

En la Figura 18, correspondiente al análisis de componentes principales de los TRF obtenidos de la digestión con MspI, se observa, de manera similar a la de la Figura 17, que dos de los fragmentos se encuentran relativamente alejados del resto, los TRFs de 138 y 163 pb. En particular, no se hubiese esperado que el fragmento de 138 pb no formara un grupo unido al TRF de 143 pb, debido a que se encontraron presentes bajo las mismas condiciones.

Como la abundancia relativa de los fragmentos de 213 pb con RsaI y 138 de la digestión con MspI fue siempre mayor al 40%, mientras que la de los otros fue menor que 15% en la mayoría de los casos, se entiende que en el análisis de componentes principales éstos TRFs no se encuentren agrupados a los otros fragmentos.

Por otra parte, en la Figura 18 se observa que los puntos no formarían algún grupo definido en comparación con la figura obtenida en el caso de la digestión con RsaI.

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En ambos análisis de componentes principales, la primera componente principal, correspondiente al eje de las absisas, explica casi por completo la variabilidad del sistema en estudio (sobre un 98%). Según este análisis, en ambos casos todos los TRFs, exceptuando el de 138 y 213 pb cuando corresponda, podrían ser asociados a un mismo grupo, pero esto no permitiría observar cómo las variaciones de las condiciones en la columna afectan en las poblaciones encontradas en solución.

Así, se puede establecer que no se observa una relación entre la agrupación efectuada a través de los dendrogramas y del análisis de componentes principales, debido principalmente a que los dendrogramas toman en cuenta la aparición de los microorganismos en cada solución, mientras que el análisis de componentes principales toma en cuenta relaciones a partir de la abundancia relativa de los TRF en cada solución. Es por esta razón que los dendrogramas pueden ser considerados como más representativos en el estudio de la variación de las poblaciones bacterianas.

4. 5. 2. 2. Comparación entre las soluciones según las bacterias encontradas

La Figura 15, muestra el resultado del análisis de cluster al observar la presencia de cada TRF en las soluciones estudiadas.

En la Figura 15 (a) se observa que las soluciones 5 y 7, y las 3 y 6, presentan las mismas bacterias en solución al hacer la digestión con RsaI. En el caso del pH ningún par de soluciones tiene igual pH final, por lo que se podría pensar que esto no provoca grandes cambios en las poblaciones presentes.

Por otra parte, el Eh final en las muestras 5 y 7 fue similar (592 y 583 mV respectivamente), lo que no se cumple en las muestras 3 y 6, por lo que no se puede llegar a alguna relación.

Al analizar la Figura 15 (b) se tiene una estrecha relación entre las muestras 3, 5 y 7, que, como se explicó anteriormente, no permiten llegar a alguna relación concluyente. En esta figura y en la Figura 15 (a), se observa que las soluciones 8 y 9 se encontrarían relacionadas, lo que podría explicarse dado que ambas corresponden a las soluciones con mayores concentraciones de iones metálicos que pudieron haber afectado el desarrollo bacteriano.

Al comparar ambos dendrogramas en forma general, se observa que no se mantienen las relaciones entre las distintas soluciones al analizar los resultados obtenidos de las distintas digestiones enzimáticas.

Al analizar el dendrograma de la Figura 16, obtenido del análisis de las bacterias presentes en cada digestión, se obtiene prácticamente el dendrograma resultante de la digestión con la enzima RsaI. De esta manera no se puede establecer una relación específica entre las soluciones estudiadas, y se podría pensar que los distintos parámetros no influirían en la obtención de las mismas poblaciones bacterianas en una solución, lo que concuerda con la posibilidad de encontrar comportamientos caóticos en los sistemas de laboratorio. (Saikaly et al. 2005)

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4. 6. Efectos de los errores asociados a la metodología de T-RFLP

4. 6. 1. Asociados a la extracción de DNA

En primer lugar, la extracción del DNA depende de la habilidad del experimentador, y es inevitable que en el transcurso de ésta no se pierda DNA. Por esto, si bien no se puede asegurar que el DNA obtenido corresponda al de todos los microorganismos presentes en la solución, éste debería pertenecer al de las bacterias más representativas del ambiente estudiado.

4. 6. 2. Asociados a la reacción de PCR

Por otra parte, Egert y Friedrich (2003) postulan que durante la reacción de PCR se podrían producir pseudo-TRF, en muestras de cultivos puros y de muestras extraídas directamente del ambiente, debido a la posibilidad de que en algunos fragmentos amplificados el sitio de restricción deseado se encuentre localizado en un sector que se encuentre como hebra simple. Como las enzimas de restricción, al ser endonucleasas, no cortan hebras simples, éstas reconocerían el siguiente sitio de restricción de doble hebra en la secuencia, el cual podría haberse formado si la hebra se pliega sobre si misma en alguna sección, como se muestra en la Figura 19. Este hecho podría incrementar virtualmente la abundancia relativa de algún fragmento que no se relaciona a alguna bacteria, según los datos obtenidos “in sílico”. Además, el reconocimiento de estos pseudo-TRF dependerá de la enzima de restricción utilizada, ya que se encuentra influido directamente por la posición en la cual se encuentra el sitio de restricción.

4. 6. 3. Asociados a la digestión enzimática

En la etapa de digestión podría ocurrir que no hubiera digestión completa, independientemente de la formación de pseudo-TRFs (Egert y Friedrich 2003; Li et al. 2007). La electroforesis de agarosa al 1,4% realizada, en la cual se observó que los fragmentos digeridos fueron menores al tamaño del fragmento amplificado, no permite descartar este hecho. Cabe la posibilidad de que aún hubiese habido digestión parcial del amplificado, es decir que el DNA no hubiera sido cortado en todos los sitios posibles para dar origen a los TRFs más pequeños y esperados teóricamente en el análisis obtenido de la digestión virtual, de hasta 300 pb aproximadamente.

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(a)

(b)

Figura 19. (a) Modelo esquemático de la formación de pseudo-TRF, plegamiento parcial de la hebra simple podría o no formar pseudo-TRF. (b) Ejemplo de las estructuras secundarias formadas. (Egert y

Friedrich 2003)

Por último, en la etapa de electroforesis capilar, el equipo tiene asociado un error, derivado de los posibles ruidos en el momento de la lectura, y ésta además puede depender de los compuestos presentes en la muestra, derivados de la purificación y la digestión del DNA y que podrían eventualmente influir en los resultados del análisis.

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Capítulo 5. Conclusiones

En el trabajo presentado, se utilizó la técnica de T-RFLP para identificar las poblaciones bacterianas presentes en soluciones de biolixiviación y observar si los cambios de los parámetros fisicoquímicos de las soluciones influyen la diversidad bacteriana.

A partir del análisis de las tablas de enzimas de restricción y los sitios de corte para cinco de los microorganismos característicos en procesos de biolixiviación, fue posible determinar que, aparte de RsaI, no hay otra enzima de restricción que logre distinguir entre A. ferrooxidans y A. thiooxidans. De esta manera se seleccionó como segunda enzima de restricción a utilizar la enzima MspI, la cual permitiría distinguir entre L. ferrooxidans y Sb. thermosulfidooxidans.

En forma paralela, se logró obtener poblaciones microbianas creciendo en una mini-columna de biolixiviación, la cual fue montada en el Laboratorio de Biohidrometalurgia de la Universidad de Chile, con lo que se aseguró la obtención de muestras íntegras de DNA y poder variar las condiciones de crecimiento.

En el análisis de los TRFs resultantes de la digestión enzimática con RsaI y MspI en forma separada, se encontraron algunas diferencias a la hora de definir las bacterias presentes en forma significativa, es decir con una abundancia relativa mayor o igual al 1%. Esto pudo deberse a comportamientos caóticos del sistema o a errores en el método de T-RFLP.

A partir de lo anterior, se concluyó que es válido considerar como bacterias presentes en la solución, aquellas cuyos TRFs se encuentren presentes en la muestra analizada al digerir con ambas enzimas por separado. Sin embargo, no se puede descartar completamente la presencia de las bacterias cuyo TRF no se encuentre al digerir con una de las enzimas o que tengan una abundancia relativa menor que el 1%, debido a que los errores asociados al método de T-RFLP pueden derivar en una sub o sobreestimación de la cantidad, de la presencia o de la abundancia relativa de cada TRF.

La cantidad de ión férrico y de sulfato generado presente en la solución mostró ser creciente en el tiempo, lo que concuerda con la presencia de bacterias hierrooxidantes, como A.ferrooxidans, y con la posibilidad de oxidación química del azufre o de la presencia de bacterias azufre oxidantes, como A.thiooxidans y Sb.thermosulfidooxidans.

Al aumentar la concentración de Al(III) y Zn(II) en solución, se observó la disminución de la abundancia relativa de A.ferrooxidans y una disminución de la diversidad bacteriana.

En la muestra 8, donde se agregó Al2(SO4)3, se encontraron los TRFs de bacterias que verían estimulado su crecimiento en presencia de Al(III), como Acidocella spp. y Acidiphilum spp.

Las variaciones de pH no mostraron ser determinantes en la cantidad de células generadas en solución. Asimismo, el aumento de la concentración de sulfato en las muestras 6 y 7, no muestra una tendencia particular al analizar la abundancia relativa de A.ferrooxidans. Por otro lado, el aire añadido al sistema favoreció la cantidad de microorganismos generados.

Los parámetros fisicoquímicos de la muestra 4 mostraron ser los más favorables para la diversidad bacteriana: Eh de 597 mV, pH inicial de 1,6, pH final de 1,4, concentración inicial de FeSO4 de 6 g/l y aire.

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Se destaca el hecho de que no se detectara ninguna especie de Leptospirillum, bacteria frecuentemente encontrada asociada a procesos de biolixiviación, al digerir con la enzima RsaI, por lo que se supone que no estaría presente en las muestras estudiadas. Esto podría deberse a que estas bacterias se encontrasen adheridas al mineral o a que hubiesen precipitado junto con los hidróxidos de hierro, por lo tanto su presencia en solución no sería detectable.

Mediante el análisis del índice de diversidad de especies no se logra observar, en ninguno de los casos, una correspondencia entre el aumento de las condiciones inhibitorias y la disminución del índice, es decir de los TRFs únicos encontrados. En el caso del índice de Shannon-Wiener, se observa una cierta tendencia a disminuir en ciertas soluciones a medida que aumenta la cantidad de iones en solución. Sin embargo, como estos índices dependen de la presencia y la abundancia relativa de los TRFs, se verán afectados por los errores asociados al T-RFLP.

A partir de los TRFs con presencia significativa en las muestras, se elaboraron dendrogramas para cada enzima de restricción utilizada. Se pudo observar cierta concordancia entre los dos dendrogramas. Los TRFs asociados a A. ferrooxidans y a α proteobacterias fueron agrupados juntos, y luego estaría asociado a éstos el TRF correspondiente a Arthrobacter spp. para ambos casos. Las dos últimas corresponderían a las bacterias heterótrofas que eliminarían los compuestos orgánicos producidos por otros microorganismos.

Por otro lado, A.thiooxidans y las Sb.thermosulfidooxidans y Sb.acidophillus fueron agrupadas juntas, correspondiendo a bacterias azufre oxidantes presentes sólo en la muestra 4.

La agrupación de Shewanella spp. y de Acidimicrobium ferrooxidans, Acidiphilum spp., Acidocella spp., Acidomonas methanolica o Ferrimicrobium acidiphilium, se debería a que todas son heterótrofas y algunas de ellas son capaces de reducir Fe+3, por lo que podrían crecer acompañando a las A.ferrooxidans.

Las agrupaciones resultantes al analizar las bacterias presentes en cada solución, no permiten ser concluyentes a la hora de establecer una relación entre los parámetros fisicoquímicos estudiados, lo que concuerda con la posibilidad de encontrar comportamientos caóticos en los sistemas de laboratorio.

Finalmente, el análisis de componentes principales mostró no ser concluyente a la hora de agrupar los TRFs asociados a bacterias biolixiviantes según su presencia frente a determinados parámetros fisicoquímicos. Esto se debe principalmente a que su elaboración toma en cuenta las abundancias relativas de los fragmentos considerados, los cuales presentan valores dispares, uno sobre el 40% y el resto menor al 13% en todos los casos.

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Anexos Anexo A. Partidores utilizados

Los partidores universales utilizados fueron tomados de Morales G. (2006), los cuales corresponden a:

• Partidor forward marcado con el fluorósforo FAM:

341f 5’- CCTACGGGAGGCAGCAG -3’

• Partidor reverse:

1100r 5’- GGGTTGCGCTCGTTG -3’

Anexo B. Soluciones utilizadas A continuación se presenta la composición de las soluciones utilizadas en los métodos

mencionados. Todas ellas fueron preparadas en agua destilada, excepto el buffer TAE y la solución para la RNasa, preparado en agua desionizada.

Tabla 13. Composición de medio MC.

Reactivo Concentración [g/l] (NH4)2SO4 0,4

MgSO4 * 7H2O 0,4 K2HPO4 * 3H2O 0,056

Tabla 14. Composición del Buffer A2X.

Reactivo Concentración [mM] Tris HCl pH 8,0 200

EDTA 50 NaCl 200

Citrato de Na 2 CaCl2 10

Tabla 15. Composición del Buffer de lavado.

Reactivo Concentración (v/v) Buffer A2X 50% Glicerol 25%

Agua Destilada 25%

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Tabla 16. Composición del Buffer TE.

Reactivo Concentración [mM] Tris HCl pH 8,0 10

EDTA 1

Tabla 17.Composición del Buffer de carga 6X.

Reactivo Concentración Glicerol 30% v/v

Azul de bromofenol 0,25% p/v Agua destilada -

Tabla 18. Composición del Buffer TAE 50X.

Reactivo Concentración Tris HCl pH 8,0 24,2% p/v

Ácido acético glacial 5,71% v/v EDTA 0,5 M 10% v/v

Agua desionizada -

Tabla 19. Composición del Buffer de almacenamiento.

Reactivo Concentración [mM] Tris HCl pH 7,5 100

NaCl 200

Tabla 20. Composición del estándar de peso molecular, 1 Kb.

Reactivo Concentración (v/v) Buffer de almacenamiento 10%

Estándar de peso molecular 1 Kb 10% Buffer de carga 16,5% Agua destilada -

Tabla 21. Composición de la solución de la RNasa.

Reactivo Concentración (mM) Tris HCl (pH 7,5) 10

NaCl 15 Agua desionizada estéril -

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Anexo C. Protocolos

(a) Protocolo de electroforesis en gel de agarosa al X%.

• Pesar X gramos de agarosa, dado el porcentaje de agarosa que se desee en el gel. Disolver en 100 ml de Buffer TAE 1X, en horno microondas por aproximadamente 1 minuto, agitando cada 20 segundos hasta disolver completamente.

• Una vez tibia la mezcla, adicionar 10 µl de bromuro de etidio.

• Colocar la(s) peineta(s) en la cámara de electroforesis, y luego agregar la cantidad de agarosa necesaria para la formación de los pocillos.

• Cuando la agarosa haya gelificado, retirar la(s) peineta(s) y cubrir con Buffer TAE 1X.

• Cargar la(s) muestra(s) en el gel. Para cargar, mezclar 5µl de una muestra de DNA + 3µl de Buffer de carga 6X, y el volumen total colocarlo en uno de los pocillos formados por la peineta.

• Cargar 5 µl de estándar de peso molecular.

• Correr el gel por 40 minutos a 100 Volts (Programa 8).

• Retirar el gel de la cámara y colocar en el transiluminador UV para visualizar la migración de las bandas.

(b) Protocolo de determinación de Fe+2 y fierro total.

Determinación de ferroso en precencia de férrico:

• Tomar 0,1 ml de muestra diluída hasta una concentración de 100 ppm de ferroso, • Agregar 1 ml de solución NaF 0,5 M y agitar; • Agregar 0,4 ml de solución de fenantrolina y agitar; • Agregar 1 ml de agua destilada y agitar; • Leer absorbancia a 510 nm contra blanco.

Determinación de fierro total:

• Tomar 0,1 ml de muestra diluída hasta una concentración de 100 ppm de ferroso, • Agregar 0,1 ml de solución de hidroxilamina y agitar; • Agregar 0,4 ml de solución de fenantrolina y agitar; • Agregar 1,9 ml de agua destilada y agitar; • Leer absorbancia a 510 nm contra blanco.

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Anexo D. Tablas de las enzimas de restricción, su sitio de restricción y el largo de los fragmentos que se forman

(a) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de Acidithiobacillus caldus. (776 pb)

Enzyme Recognition No. Positions name sequence cuts of sites AatI agg/cct 1 77 AccB1I g/gyrcc 2 496 683 AccII Cg/cg 6 62 187 239 423 527 631 AccIII t/ccgga 1 659 AciI ccgc 12 63 119 188 248 296 351 394 542 559 594 602 762 AclWI ggatc 1 122 AcsI r/aatty 2 22 334 AcyI Gr/cgyc 1 497 AfaI Gt/ac 1 551 AflIII a/crygt 1 654 AluI Ag/ct 2 521 730 AlwI ggatc 1 122 AlwNI cagnnn/ctg 1 712 Ama87I c/ycgrg 1 272 AocI Cc/tnagg 1 501 ApaI gggcc/c 1 591 ApoI r/aatty 2 22 334 Asp700I gaann/nnttc 1 77 AspLEI gcg/c 4 239 423 499 770 AspS9I g/gncc 2 401 587 AsuI g/gncc 2 401 587 AvaI c/ycgrg 1 272 BamHI g/gatcc 1 118 BanI g/gyrcc 2 496 683 BanII grgcy/c 2 279 591 BbeI ggcgc/c 1 500 BbiII Gr/cgyc 1 497 BbvI gcagc 2 15 716 BcgI cgannnnnntgc 1 726 BcnI Cc/sgg 1 273 BcoI c/ycgrg 1 272 BglII a/gatct 1 364 BmyI gdgch/c 3 279 591 688 BpmI ctggag 2 316 373 BsaBI gatnn/nnatc 1 533 BsaHI Gr/cgyc 1 497 BsaJI c/cnngg 6 185 271 283 455 542 644 BsaOI cgry/cg 1 556 BsaWI w/ccggw 1 659

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Enzyme Recognition No. Positions name sequence cuts of sites Bsc4I ccnnnn/nnngg 4 6 100 288 644 Bse118I r/ccggy 1 162 Bse1I actgg 4 227 314 383 489 Bse21I Cc/tnagg 1 501 Bse8I gatnn/nnatc 1 533 BseAI t/ccgga 1 659 BseDI c/cnngg 6 185 271 283 455 542 644 BseNI actgg 4 227 314 383 489 Bsh1236I Cg/cg 6 62 187 239 423 527 631 Bsh1285I cgry/cg 1 556 Bsh1365I gatnn/nnatc 1 533 BshNI g/gyrcc 2 496 683 BsiEI cgry/cg 1 556 BsiI ctcgtg 1 736 BsiMI t/ccgga 1 659 BsiSI c/cgg 3 163 273 660 BsiYI ccnnnnn/nngg 4 7 101 289 645 BslI ccnnnnn/nngg 4 7 101 289 645 BsmFI gggac 2 109 760 BsoBI c/ycgrg 1 272 BsoFI Gc/ngc 3 12 60 713 Bsp120I g/ggccc 1 587 Bsp1286I gdgch/c 3 279 591 688 Bsp13I t/ccgga 1 659 Bsp143I /gatc 2 118 364 Bsp143II rgcgc/y 1 500 BspEI t/ccgga 1 659 BspLU11I a/catgt 1 654 BsrBRI gatnn/nnatc 1 533 BsrDI gcaatg 2 36 59 BsrFI r/ccggy 1 162 BsrI actgg 4 227 314 383 489 BsrSI actgg 4 227 314 383 489 BssAI r/ccggy 1 162 BssSI ctcgtg 1 736 Bst2UI Cc/wgg 6 284 340 399 457 543 645 Bst71I gcagc 2 15 716 BstDEI c/tnag 2 501 509 BstDSI c/crygg 1 185 BstEII g/gtnacc 1 393 BstF5I ggatg 2 70 492 BstH2I rgcgc/y 1 500 BstI g/gatcc 1 118 BstMCI cgry/cg 1 556 BstNI Cc/wgg 6 284 340 399 457 543 645

62

Enzyme Recognition No. Positions name sequence cuts of sites BstOI Cc/wgg 6 284 340 399 457 543 645 BstPI g/gtnacc 1 393 BstSFI c/tryag 1 668 BstUI cg/cg 6 62 187 239 423 527 631 BstX2I r/gatcy 2 118 364 BstYI r/gatcy 2 118 364 Bsu36I cc/tnagg 1 501 BsuRI gg/cc 3 77 402 589 Cac8I gcn/ngc 3 179 206 591 CfoI gcg/c 4 239 423 499 770 Cfr10I r/ccggy 1 162 Cfr13I g/gncc 2 401 587 Cfr42I ccgc/gg 1 188 Cfr9I c/ccggg 1 272 Csp6I g/tac 1 550 CviJI rg/cy 10 77 166 277 306 402 521 589 649 720 730 CvnI cc/tnagg 1 501 DdeI c/tnag 2 501 509 DpnI ga/tc 2 120 366 DpnII /gatc 2 118 364 DraII rg/gnccy 1 587 DsaI c/crygg 1 185 Eco147I agg/cct 1 77 Eco24I grgcy/c 2 279 591 Eco64I g/gyrcc 2 496 683 Eco81I cc/tnagg 1 501 Eco88I c/ycgrg 1 272 Eco91I g/gtnacc 1 393 EcoNI cctnn/nnnagg 1 5 EcoO109I rg/gnccy 1 587 EcoO65I g/gtnacc 1 393 EcoRI g/aattc 1 334 EcoRII /ccwgg 6 282 338 397 455 541 643 EheI ggc/gcc 1 498 FauI cccgc 3 542 594 762 FokI ggatg 2 70 492 FriOI grgcy/c 2 279 591 Fsp4HI gc/ngc 3 12 60 713 GsuI ctggag 2 316 373 HaeII rgcgc/y 1 500 HaeIII gg/cc 3 77 402 589 HapII c/cgg 3 163 273 660 HgaI gacgc 1 416 HhaI gcg/c 4 239 423 499 770 Hin1I gr/cgyc 1 497

63

Enzyme Recognition No. Positions name sequence cuts of sites Hin6I g/cgc 4 237 421 497 768 HinP1I g/cgc 4 237 421 497 768 HinfI g/antc 1 696 HpaII c/cgg 3 163 273 660 HphI ggtga 3 331 354 399 Hsp92I gr/cgyc 1 497 Hsp92II catg/ 3 611 658 719 HspAI g/cgc 4 237 421 497 768 ItaI gc/ngc 3 12 60 713 KasI g/gcgcc 1 496 Kpn2I t/ccgga 1 659 KspI ccgc/gg 1 188 Kzo9I /gatc 2 118 364 MaeII a/cgt 2 142 255 MaeIII /gtnac 2 251 393 MamI gatnn/nnatc 1 533 MboI /gatc 2 118 364 MboII gaaga 3 74 158 637 MflI r/gatcy 2 118 364 MnlI cctc 4 11 201 327 374 MroI t/ccgga 1 659 MseI t/taa 4 211 564 616 752 Msp17I gr/cgyc 1 497 MspA1I cmg/ckg 1 187 MspI c/cgg 3 163 273 660 MspR9I cc/ngg 7 273 284 340 399 457 543 645 MvaI cc/wgg 6 284 340 399 457 543 645 MvnI cg/cg 6 62 187 239 423 527 631 MwoI gcnnnnn/nngc 5 37 234 435 505 767 NarI gg/cgcc 1 497 NciI cc/sgg 1 273 NdeII /gatc 2 118 364 NlaIII catg/ 3 611 658 719 NlaIV ggn/ncc 5 120 498 588 664 685 NspBII cmg/ckg 1 187 NspI rcatg/y 2 611 658 PalI gg/cc 3 77 402 589 Pme55I agg/cct 1 77 PspAI c/ccggg 1 272 PspALI ccc/ggg 1 274 PspEI g/gtnacc 1 393 PspN4I ggn/ncc 5 120 498 588 664 685 PspOMI g/ggccc 1 587 PstI ctgca/g 1 672 RsaI gt/ac 1 551

64

Enzyme Recognition No. Positions name sequence cuts of sites SacII ccgc/gg 1 188 Sau3AI /gatc 2 118 364 Sau96I g/gncc 2 401 587 ScrFI cc/ngg 7 273 284 340 399 457 543 645 SduI gdgch/c 3 279 591 688 SfaNI gcatc 1 627 SfcI c/tryag 1 668 Sfr303I ccgc/gg 1 188 SmaI ccc/ggg 1 274 Sse9I /aatt 5 22 218 334 577 617 SseBI agg/cct 1 77 SstII ccgc/gg 1 188 StuI agg/cct 1 77 TaqI t/cga 1 621 TfiI g/awtc 1 696 ThaI cg/cg 6 62 187 239 423 527 631 Tru1I t/taa 4 211 564 616 752 Tru9I t/taa 4 211 564 616 752 Tsp45I /gtsac 1 393 Tsp509I /aatt 5 22 218 334 577 617 TspEI /aatt 5 22 218 334 577 617 TspRI cagtg 2 19 384 TthHB8I t/cga 1 621 XhoII r/gatcy 2 118 364 XmaI c/ccggg 1 272 XmnI gaann/nnttc 1 77

65

(b) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de Acidithiobacillus ferooxidans. (776 pb)

Enzyme Recognition No. Positions name sequence cuts of sites

AatI agg/cct 1 77 AccB1I g/gyrcc 1 494 AccII cg/cg 4 62 187 525 631 AccIII t/ccgga 1 660 AciI ccgc 12 63 188 248 296 351 394 540 557 593 601 682 762 AcsI r/aatty 3 22 334 664 AfaI gt/ac 4 249 309 505 549 AflIII a/crygt 1 655 AgeI a/ccggt 1 302 AluI ag/ct 2 519 730 Alw21I gwgcw/c 1 421 AlwNI cagnnn/ctg 1 712 Ama87I c/ycgrg 1 272 ApaI gggcc/c 1 589 ApoI r/aatty 3 22 334 664 Asp700I gaann/nnttc 1 77 AspHI gwgcw/c 1 421 AspLEI gcg/c 1 770 AspS9I g/gncc 1 585 AsuI g/gncc 1 585 AvaI c/ycgrg 1 272 BanI g/gyrcc 1 494 BanII grgcy/c 2 279 589 Bbv12I gwgcw/c 1 421 BbvI gcagc 3 15 185 716 BcgI cgannnnnntgc 1 726 BcnI cc/sgg 1 273 BcoI c/ycgrg 1 272 BfaI c/tag 3 311 484 499 BglII a/gatct 1 364 BlpI gc/tnagc 1 415 BmyI gdgch/c 3 279 421 589 BpmI ctggag 1 373 Bpu1102I gc/tnagc 1 415 BsaJI c/cnngg 6 185 271 283 453 540 639 BsaOI cgry/cg 1 554 BsaWI w/ccggw 2 302 660 Bsc4I ccnnnn/nnngg 3 6 288 644 Bse118I r/ccggy 2 162 302 Bse1I actgg 1 227 BseAI t/ccgga 1 660

66

Enzyme Recognition No. Positions name sequence cuts of sites

BseDI c/cnngg 6 185 271 283 453 540 639 BseNI actgg 1 227 Bsh1236I cg/cg 4 62 187 525 631 Bsh1285I cgry/cg 1 554 BshNI g/gyrcc 1 494 BsiEI cgry/cg 1 554 BsiHKAI gwgcw/c 1 421 BsiI ctcgtg 1 736 BsiMI t/ccgga 1 660 BsiSI c/cgg 4 163 273 303 661 BsiYI ccnnnnn/nngg 3 7 289 645 BslI ccnnnnn/nngg 3 7 289 645 BsmFI gggac 1 760 BsoBI c/ycgrg 1 272 BsoFI gc/ngc 6 12 60 182 392 554 713 Bsp120I g/ggccc 1 585 Bsp1286I gdgch/c 3 279 421 589 Bsp13I t/ccgga 1 660 Bsp143I /gatc 1 364 Bsp1720I gc/tnagc 1 415 BspEI t/ccgga 1 660 BspLU11I a/catgt 1 655 BspMI acctgc 1 402 BsrDI gcaatg 2 36 59 BsrFI r/ccggy 2 162 302 BsrI actgg 1 227 BsrSI actgg 1 227 BssAI r/ccggy 2 162 302 BssSI ctcgtg 1 736 Bst2UI cc/wgg 5 284 340 455 541 640 Bst71I gcagc 3 15 185 716 BstDEI c/tnag 2 415 507 BstDSI c/crygg 1 185 BstF5I ggatg 1 70 BstMCI cgry/cg 1 554 BstNI cc/wgg 5 284 340 455 541 640 BstOI cc/wgg 5 284 340 455 541 640 BstSFI c/tryag 1 669 BstUI cg/cg 4 62 187 525 631 BstX2I r/gatcy 1 364 BstYI r/gatcy 1 364 BstZI c/ggccg 1 551 BsuRI gg/cc 4 77 394 553 587 Cac8I gcn/ngc 2 179 206 CelII gc/tnagc 1 415

67

Enzyme Recognition No. Positions name sequence cuts of sites

CfoI gcg/c 1 770 Cfr10I r/ccggy 2 162 302 Cfr13I g/gncc 1 585 Cfr42I ccgc/gg 1 188 Cfr9I c/ccggg 1 272 CfrI y/ggccr 2 392 551 Csp6I g/tac 4 248 308 504 548 CviJI rg/cy 12 77 166 184 277 394 519 553 587 645 650 720 730 DdeI c/tnag 2 415 507 DpnI ga/tc 1 366 DpnII /gatc 1 364 DraII rg/gnccy 1 585 DsaI c/crygg 1 185 EaeI y/ggccr 2 392 551 EagI c/ggccg 1 551 EclXI c/ggccg 1 551 Eco147I agg/cct 1 77 Eco24I grgcy/c 2 279 589 Eco52I c/ggccg 1 551 Eco64I g/gyrcc 1 494 Eco88I c/ycgrg 1 272 EcoNI cctnn/nnnagg 1 5 EcoO109I rg/gnccy 1 585 EcoRI g/aattc 2 334 664 EcoRII /ccwgg 5 282 338 453 539 638 FauI cccgc 2 593 762 FokI ggatg 1 70 FriOI grgcy/c 2 279 589 Fsp4HI gc/ngc 6 12 60 182 392 554 713 GsuI ctggag 1 373 HaeIII gg/cc 4 77 394 553 587 HapII c/cgg 4 163 273 303 661 HgaI gacgc 1 415 HhaI gcg/c 1 770 Hin6I g/cgc 1 768 HinP1I g/cgc 1 768 HinfI g/antc 3 146 218 696 HpaII c/cgg 4 163 273 303 661 HphI ggtga 1 354 Hsp92II catg/ 3 610 659 719 HspAI g/cgc 1 768 ItaI gc/ngc 6 12 60 182 392 554 713 Kpn2I t/ccgga 1 660 KspI ccgc/gg 1 188

68

Enzyme Recognition No. Positions name sequence cuts of sites

Kzo9I /gatc 1 364 MaeI c/tag 3 311 484 499 MaeII a/cgt 2 142 250 MboI /gatc 1 364 MboII gaaga 3 74 158 637 MflI r/gatcy 1 364 MnlI cctc 4 11 107 327 374 MroI t/ccgga 1 660 MseI t/taa 4 211 562 615 752 MspA1I cmg/ckg 1 187 MspI c/cgg 4 163 273 303 661 MspR9I cc/ngg 6 273 284 340 455 541 640 MvaI cc/wgg 5 284 340 455 541 640 MvnI cg/cg 4 62 187 525 631 MwoI gcnnnnn/nngc 4 37 391 433 767 NciI cc/sgg 1 273 NdeII /gatc 1 364 NlaIII catg/ 3 610 659 719 NlaIV ggn/ncc 2 496 586 NspBII cmg/ckg 1 187 NspI rcatg/y 2 610 659 PalI gg/cc 4 77 394 553 587 PinAI a/ccggt 1 302 Pme55I agg/cct 1 77 PspAI c/ccggg 1 272 PspALI ccc/ggg 1 274 PspN4I ggn/ncc 2 496 586 PspOMI g/ggccc 1 585 PstI ctgca/g 1 673 RsaI gt/ac 4 249 309 505 549 SacII ccgc/gg 1 188 Sau3AI /gatc 1 364 Sau96I g/gncc 1 585 ScrFI cc/ngg 6 273 284 340 455 541 640 SduI gdgch/c 3 279 421 589 SfaNI gcatc 2 627 680 SfcI c/tryag 1 669 Sfr303I ccgc/gg 1 188 SmaI ccc/ggg 1 274 Sse9I /aatt 5 22 334 575 616 664 SseBI agg/cct 1 77 SstII ccgc/gg 1 188 StuI agg/cct 1 77 TfiI g/awtc 3 146 218 696 ThaI cg/cg 4 62 187 525 631

69

Enzyme Recognition No. Positions name sequence cuts of sites

Tru1I t/taa 4 211 562 615 752 Tru9I t/taa 4 211 562 615 752 Tsp509I /aatt 5 22 334 575 616 664 TspEI /aatt 5 22 334 575 616 664 TspRI cagtg 3 19 226 384 XhoII r/gatcy 1 364 XmaI c/ccggg 1 272 XmaIII c/ggccg 1 551 XmnI gaann/nnttc 1 77

70

(c) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de Acidithiobacillus thiooxidans. (776 pb)

Enzyme Recognition No. Positions Name sequence cuts of sites

AatI agg/cct 1 77 AccB1I g/gyrcc 1 496 AccII cg/cg 4 62 187 527 631 AciI ccgc 13 63 132 188 248 296 351 394 542 559 594 602 681 762 AcsI r/aatty 2 22 334 AfaI gt/ac 3 309 507 551 AflIII a/crygt 1 654 AgeI a/ccggt 1 302 AluI ag/ct 2 521 730 AlwNI cagnnn/ctg 1 712 Ama87I c/ycgrg 1 272 ApaI gggcc/c 1 591 ApoI r/aatty 2 22 334 Asp700I gaann/nnttc 1 77 AspLEI gcg/c 1 770 AspS9I g/gncc 2 401 587 AsuI g/gncc 2 401 587 AvaI c/ycgrg 1 272 BanI g/gyrcc 1 496 BanII grgcy/c 2 279 591 BbvI gcagc 3 15 185 716 BcgI cgannnnnntgc 1 726 BcnI cc/sgg 1 273 BcoI c/ycgrg 1 272 BfaI c/tag 2 311 486 BglII a/gatct 1 364 BmyI gdgch/c 3 279 591 688 BpmI ctggag 1 373 BsaJI c/cnngg 6 185 271 283 455 542 644 BsaOI cgry/cg 1 556 BsaWI w/ccggw 1 302 Bsc4I ccnnnn/nnngg 3 6 288 644 Bse118I r/ccggy 2 162 302 Bse1I actgg 1 227 BseDI c/cnngg 6 185 271 283 455 542 644 BseNI actgg 1 227 Bsh1236I cg/cg 4 62 187 527 631 Bsh1285I cgry/cg 1 556 BshNI g/gyrcc 1 496 BsiEI cgry/cg 1 556 BsiI ctcgtg 1 736

71

Enzyme Recognition No. Positions Name sequence cuts of sites

BsiSI c/cgg 3 163 273 303 BsiYI ccnnnnn/nngg 3 7 289 645 BslI ccnnnnn/nngg 3 7 289 645 BsmFI gggac 1 760 BsoBI c/ycgrg 1 272 BsoFI gc/ngc 6 12 60 182 392 556 713 Bsp120I g/ggccc 1 587 Bsp1286I gdgch/c 3 279 591 688 Bsp143I /gatc 1 364 BspLU11I a/catgt 1 654 BsrDI gcaatg 2 36 59 BsrFI r/ccggy 2 162 302 BsrI actgg 1 227 BsrSI actgg 1 227 BssAI r/ccggy 2 162 302 BssSI ctcgtg 1 736 Bst2UI cc/wgg 7 284 340 399 443 457 543 645 Bst71I gcagc 3 15 185 716 BstDEI c/tnag 2 416 509 BstDSI c/crygg 1 185 BstMCI cgry/cg 1 556 BstNI cc/wgg 7 284 340 399 443 457 543 645 BstOI cc/wgg 7 284 340 399 443 457 543 645 BstSFI c/tryag 1 668 BstUI cg/cg 4 62 187 527 631 BstX2I r/gatcy 1 364 BstYI r/gatcy 1 364 BstZI c/ggccg 1 553 BsuRI gg/cc 5 77 394 402 555 589 Cac8I gcn/ngc 4 133 179 206 591 CfoI gcg/c 1 770 Cfr10I r/ccggy 2 162 302 Cfr13I g/gncc 2 401 587 Cfr42I ccgc/gg 1 188 Cfr9I c/ccggg 1 272 CfrI y/ggccr 2 392 553 Csp6I g/tac 3 308 506 550 CviJI rg/cy 12 77 166 184 277 394 402 521 555 589 649 720 730 DdeI c/tnag 2 416 509 DpnI ga/tc 1 366 DpnII /gatc 1 364 DraII rg/gnccy 1 587 DsaI c/crygg 1 185 EaeI y/ggccr 2 392 553

72

Enzyme Recognition No. Positions Name sequence cuts of sites

EagI c/ggccg 1 553 EclXI c/ggccg 1 553 Eco147I agg/cct 1 77 Eco24I grgcy/c 2 279 591 Eco52I c/ggccg 1 553 Eco64I g/gyrcc 1 496 Eco88I c/ycgrg 1 272 EcoNI cctnn/nnnagg 1 5 EcoO109I rg/gnccy 1 587 EcoRI g/aattc 1 334 EcoRII /ccwgg 7 282 338 397 441 455 541 643 FauI cccgc 3 594 682 762 FriOI grgcy/c 2 279 591 Fsp4HI gc/ngc 6 12 60 182 392 556 713 GsuI ctggag 1 373 HaeIII gg/cc 5 77 394 402 555 589 HapII c/cgg 3 163 273 303 HgaI gacgc 1 416 HhaI gcg/c 1 770 Hin6I g/cgc 1 768 HinP1I g/cgc 1 768 HincII gty/rac 1 140 HindII gty/rac 1 140 HinfI g/antc 4 146 218 663 696 HpaII c/cgg 3 163 273 303 HphI ggtga 1 354 Hsp92II catg/ 3 611 658 719 HspAI g/cgc 1 768 ItaI gc/ngc 6 12 60 182 392 556 713 KspI ccgc/gg 1 188 Kzo9I /gatc 1 364 MaeI c/tag 2 311 486 MaeII a/cgt 1 142 MboI /gatc 1 364 MboII gaaga 3 74 158 637 MflI r/gatcy 1 364 MnlI cctc 5 11 107 327 374 421 MseI t/taa 4 211 564 616 752 MspA1I cmg/ckg 1 187 MspI c/cgg 3 163 273 303 MspR9I cc/ngg 8 273 284 340 399 443 457 543 645 MvaI cc/wgg 7 284 340 399 443 457 543 645 MvnI cg/cg 4 62 187 527 631 MwoI gcnnnnn/nngc 5 37 128 391 435 767 NciI cc/sgg 1 273

73

Enzyme Recognition No. Positions Name sequence cuts of sites

NdeII /gatc 1 364 NlaIII catg/ 3 611 658 719 NlaIV ggn/ncc 2 498 588 NspBII cmg/ckg 1 187 NspI rcatg/y 2 611 658 PalI gg/cc 5 77 394 402 555 589 PinAI a/ccggt 1 302 Pme55I agg/cct 1 77 PspAI c/ccggg 1 272 PspALI ccc/ggg 1 274 PspN4I ggn/ncc 2 498 588 PspOMI g/ggccc 1 587 PstI ctgca/g 1 672 RsaI gt/ac 3 309 507 551 SacII ccgc/gg 1 188 Sau3AI /gatc 1 364 Sau96I g/gncc 2 401 587 ScrFI cc/ngg 8 273 284 340 399 443 457 543 645 SduI gdgch/c 3 279 591 688 SfaNI gcatc 2 627 679 SfcI c/tryag 1 668 Sfr303I ccgc/gg 1 188 SmaI ccc/ggg 1 274 Sse9I /aatt 4 22 334 577 617 SseBI agg/cct 1 77 SstII ccgc/gg 1 188 StuI agg/cct 1 77 TaqI t/cga 1 621 TfiI g/awtc 4 146 218 663 696 ThaI cg/cg 4 62 187 527 631 Tru1I t/taa 4 211 564 616 752 Tru9I t/taa 4 211 564 616 752 Tsp509I /aatt 4 22 334 577 617 TspEI /aatt 4 22 334 577 617 TspRI cagtg 3 19 226 384 TthHB8I t/cga 1 621 XhoII r/gatcy 1 364 XmaI c/ccggg 1 272 XmaIII c/ggccg 1 553 XmnI gaann/nnttc 1 77

74

(d) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de Leptospirillum ferrooxidans. (778 pb)

Enzyme No. Positions Recognition name cuts of sites sequence AatI 1 77 agg/cct Acc16I 1 30 tgc/gca Acc65I 1 144 g/gtacc AccB1I 1 144 g/gyrcc AccII 3 62 187 630 cg/cg AciI 11 63 188 334 351 394 518 541 558 ccgc 593 601 764 AcsI 1 334 r/aatty AfaI 4 146 484 534 550 gt/ac AflIII 1 653 a/crygt AhdI 1 657 gacnnn/nngtc AluI 2 277 732 ag/ct Alw26I 2 303 424 gtctc AlwNI 1 714 cagnnn/ctg Ama87I 1 102 c/ycgrg ApaI 1 590 gggcc/c ApoI 1 334 r/aatty Asp700I 1 77 gaann/nnttc Asp718I 1 144 g/gtacc AspEI 1 657 gacnnn/nngtc AspLEI 2 31 772 gcg/c AspS9I 1 586 g/gncc AsuI 1 586 g/gncc AvaI 1 102 c/ycgrg AviII 1 30 tgc/gca AvrII 1 643 c/ctagg BanI 1 144 g/gyrcc BanII 1 590 grgcy/c BbvI 5 15 55 185 521 718 gcagc BcgI 1 728 cgannnnnntgc BcoI 1 102 c/ycgrg BfaI 1 644 c/tag BlnI 1 643 c/ctagg BmyI 1 590 gdgch/c BpmI 1 316 ctggag BsaJI 5 161 185 455 541 643 c/cnngg BsaMI 1 294 gaatgc BsaOI 1 555 cgry/cg Bsc4I 5 6 65 140 541 643 ccnnnn/nnngg Bse118I 1 378 r/ccggy Bse1I 2 227 306 actgg BseDI 5 161 185 455 541 643 c/cnngg BseNI 2 227 306 actgg Bsh1236I 3 62 187 630 cg/cg Bsh1285I 1 555 cgry/cg BshNI 1 144 g/gyrcc BsiEI 1 555 cgry/cg BsiI 1 738 ctcgtg

75

Enzyme No. Positions Recognition name cuts of sites sequence BsiSI 1 379 c/cgg BsiYI 5 7 66 141 542 644 ccnnnnn/nngg BslI 5 7 66 141 542 644 ccnnnnn/nngg BsmAI 2 303 424 gtctc BsmBI 1 425 cgtctc BsmFI 2 109 762 gggac BsmI 1 294 gaatgc BsoBI 1 102 c/ycgrg BsoFI 8 12 52 60 182 392 515 555 715 gc/ngc Bsp120I 1 586 g/ggccc Bsp1286I 1 590 gdgch/c BspLU11I 1 653 a/catgt BsrDI 1 36 gcaatg BsrFI 1 378 r/ccggy BsrI 2 227 306 actgg BsrSI 2 227 306 actgg BssAI 1 378 r/ccggy BssSI 1 738 ctcgtg BssT1I 1 643 c/cwwgg Bst2UI 3 399 457 542 cc/wgg Bst71I 5 15 55 185 521 718 gcagc BstDEI 2 416 486 c/tnag BstDSI 2 161 185 c/crygg BstMCI 1 555 cgry/cg BstNI 3 399 457 542 cc/wgg BstOI 3 399 457 542 cc/wgg BstSFI 1 239 c/tryag BstUI 3 62 187 630 cg/cg BstZI 1 552 c/ggccg BsuRI 5 77 271 378 554 588 gg/cc Cac8I 4 179 206 308 590 gcn/ngc CfoI 2 31 772 gcg/c Cfr10I 1 378 r/ccggy Cfr13I 1 586 g/gncc Cfr42I 1 188 ccgc/gg CfrI 1 552 y/ggccr Csp6I 4 145 483 533 549 g/tac CviJI 15 77 160 166 184 271 277 310 317 rg/cy 378 394 554 588 648 722 732 DdeI 2 416 486 c/tnag DraII 1 586 rg/gnccy DsaI 2 161 185 c/crygg EaeI 1 552 y/ggccr EagI 1 552 c/ggccg Eam1105I 1 657 gacnnn/nngtc EclHKI 1 657 gacnnn/nngtc EclXI 1 552 c/ggccg Eco130I 1 643 c/cwwgg Eco147I 1 77 agg/cct Eco24I 1 590 grgcy/c Eco32I 2 120 365 gat/atc

76

Enzyme No. Positions Recognition name cuts of sites sequence Eco52I 1 552 c/ggccg Eco64I 1 144 g/gyrcc Eco88I 1 102 c/ycgrg EcoNI 2 5 642 cctnn/nnnagg EcoO109I 1 586 rg/gnccy EcoRII 3 397 455 540 /ccwgg EcoRV 2 120 365 gat/atc EcoT14I 1 643 c/cwwgg ErhI 1 643 c/cwwgg Esp3I 1 425 cgtctc FauI 3 541 593 764 cccgc FriOI 1 590 grgcy/c Fsp4HI 8 12 52 60 182 392 515 555 715 gc/ngc FspI 1 30 tgc/gca GsuI 1 316 ctggag HaeIII 5 77 271 378 554 588 gg/cc HapII 1 379 c/cgg HgaI 2 52 626 gacgc HhaI 2 31 772 gcg/c Hin6I 2 29 770 g/cgc HinP1I 2 29 770 g/cgc HinfI 1 235 g/antc HpaII 1 379 c/cgg HphI 2 267 354 ggtga Hsp92II 3 610 657 721 catg/ HspAI 2 29 770 g/cgc ItaI 8 12 52 60 182 392 515 555 715 gc/ngc KpnI 1 148 ggtac/c KspI 1 188 ccgc/gg MaeI 1 644 c/tag MboII 1 74 gaaga MnlI 9 11 22 201 317 327 498 510 635 cctc 746 MseI 3 279 501 615 t/taa MslI 1 709 caynn/nnrtg MspA1I 1 187 cmg/ckg MspI 1 379 c/cgg MspR9I 3 399 457 542 cc/ngg Mva1269I 1 294 gaatgc MvaI 3 399 457 542 cc/wgg MvnI 3 62 187 630 cg/cg MwoI 4 391 435 523 769 gcnnnnn/nngc NlaIII 3 610 657 721 catg/ NlaIV 3 146 587 636 ggn/ncc NspBII 1 187 cmg/ckg NspI 2 610 657 rcatg/y PalI 5 77 271 378 554 588 gg/cc PleI 1 239 gagtc Pme55I 1 77 agg/cct PspN4I 3 146 587 636 ggn/ncc PspOMI 1 586 g/ggccc

77

Enzyme No. Positions Recognition name cuts of sites sequence RsaI 4 146 484 534 550 gt/ac SacII 1 188 ccgc/gg Sau96I 1 586 g/gncc ScrFI 3 399 457 542 cc/ngg SduI 1 590 gdgch/c SfcI 1 239 c/tryag Sfr303I 1 188 ccgc/gg Sse9I 4 218 334 576 616 /aatt SseBI 1 77 agg/cct SspI 1 25 aat/att SstII 1 188 ccgc/gg StuI 1 77 agg/cct StyI 1 643 c/cwwgg TaqI 1 620 t/cga ThaI 3 62 187 630 cg/cg Tru1I 3 279 501 615 t/taa Tru9I 3 279 501 615 t/taa Tsp509I 4 218 334 576 616 /aatt TspEI 4 218 334 576 616 /aatt TspRI 2 19 418 cagtg TthHB8I 1 620 t/cga XmaIII 1 552 c/ggccg XmnI 1 77 gaann/nnttc

78

(e) Tabla de las enzimas de restricción que cortan el fragmento del rDNA 16S amplificado de Sulfobacillus thermosulfidooxidans. (766 pb)

Enzyme No. Positions Recognition name cuts of sites sequence Acc65I 1 139 g/gtacc AccB1I 2 139 506 g/gyrcc AccBSI 1 345 gagcgg AccII 6 62 182 302 417 625 665 cg/cg AccIII 1 209 t/ccgga AciI 14 63 183 243 258 291 345 388 507 ccgc 536 553 588 666 674 752 AcsI 1 328 r/aatty AfaI 4 141 478 529 545 gt/ac AluI 3 93 515 720 ag/ct AlwNI 1 702 cagnnn/ctg Ama87I 1 490 c/ycgrg ApaI 2 585 680 gggcc/c ApoI 1 328 r/aatty Asp718I 1 139 g/gtacc AspLEI 8 40 304 390 417 627 662 696 760 gcg/c AspS9I 6 117 126 400 494 581 676 g/gncc AsuI 6 117 126 400 494 581 676 g/gncc AvaI 1 490 c/ycgrg AvaII 1 494 g/gwcc BanI 2 139 506 g/gyrcc BanII 2 585 680 grgcy/c BbsI 2 75 115 gaagac Bbv16II 2 75 115 gaagac BbvI 3 15 180 706 gcagc BcgI 1 716 cgannnnnntgc BcnI 6 120 130 278 451 491 501 cc/sgg BcoI 1 490 c/ycgrg BfaI 2 305 480 c/tag Bme18I 1 494 g/gwcc BmyI 2 585 680 gdgch/c BpiI 2 75 115 gaagac BpuAI 2 75 115 gaagac BsaAI 2 169 251 yac/gtr BsaJI 6 129 180 374 449 490 536 c/cnngg BsaOI 2 300 550 cgry/cg BsaWI 1 209 w/ccggw Bsc4I 4 6 282 502 536 ccnnnn/nnngg Bse118I 2 114 136 r/ccggy Bse1I 3 222 396 647 actgg BseAI 1 209 t/ccgga BseDI 6 129 180 374 449 490 536 c/cnngg BseNI 3 222 396 647 actgg BseRI 1 286 gaggag Bsh1236I 6 62 182 302 417 625 665 cg/cg Bsh1285I 2 300 550 cgry/cg BshNI 2 139 506 g/gyrcc

79

Enzyme No. Positions Recognition name cuts of sites sequence BsiEI 2 300 550 cgry/cg BsiI 2 658 726 ctcgtg BsiMI 1 209 t/ccgga BsiSI 11 115 120 129 137 210 269 278 451 c/cgg 491 500 510 BsiYI 4 7 283 503 537 ccnnnnn/nngg BslI 4 7 283 503 537 ccnnnnn/nngg BsmFI 2 109 750 gggac BsoBI 1 490 c/ycgrg BsoFI 9 12 60 177 289 386 550 663 672 gc/ngc 703 Bsp120I 2 581 676 g/ggccc Bsp1286I 2 585 680 gdgch/c Bsp13I 1 209 t/ccgga Bsp143I 1 358 /gatc Bsp143II 1 663 rgcgc/y BspEI 1 209 t/ccgga BspMI 1 701 acctgc BsrBI 1 345 gagcgg BsrFI 2 114 136 r/ccggy BsrI 3 222 396 647 actgg BsrSI 3 222 396 647 actgg BssAI 2 114 136 r/ccggy BssSI 2 658 726 ctcgtg Bst2UI 4 334 398 537 639 cc/wgg Bst71I 3 15 180 706 gcagc BstD102I 1 345 gagcgg BstDEI 2 410 524 c/tnag BstDSI 2 180 374 c/crygg BstH2I 1 663 rgcgc/y BstMCI 2 300 550 cgry/cg BstNI 4 334 398 537 639 cc/wgg BstOI 4 334 398 537 639 cc/wgg BstSNI 1 251 tac/gta BstUI 6 62 182 302 417 625 665 cg/cg BstZI 1 547 c/ggccg BsuRI 8 77 118 128 396 401 549 583 678 gg/cc Cac8I 6 42 174 201 585 676 692 gcn/ngc CfoI 8 40 304 390 417 627 662 696 760 gcg/c Cfr10I 2 114 136 r/ccggy Cfr13I 6 117 126 400 494 581 676 g/gncc Cfr42I 1 183 ccgc/gg Cfr9I 1 490 c/ccggg CfrI 1 547 y/ggccr Csp6I 4 140 477 528 544 g/tac CviJI 18 44 77 93 118 128 136 155 179 265 rg/cy 272 291 396 401 515 549 583 678 720 DdeI 2 410 524 c/tnag DpnI 1 360 ga/tc DpnII 1 358 /gatc

80

Enzyme No. Positions Recognition name cuts of sites sequence DraII 2 581 677 rg/gnccy DsaI 2 180 374 c/crygg EaeI 1 547 y/ggccr EagI 1 547 c/ggccg EclXI 1 547 c/ggccg Eco105I 1 251 tac/gta Eco24I 2 585 680 grgcy/c Eco47I 1 494 g/gwcc Eco52I 1 547 c/ggccg Eco64I 2 139 506 g/gyrcc Eco88I 1 490 c/ycgrg EcoNI 1 5 cctnn/nnnagg EcoO109I 2 581 677 rg/gnccy EcoRI 1 328 g/aattc EcoRII 4 332 396 535 637 /ccwgg FauI 4 536 588 678 752 cccgc FriOI 2 585 680 grgcy/c Fsp4HI 9 12 60 177 289 386 550 663 672 gc/ngc 703 HaeII 1 663 rgcgc/y HaeIII 8 77 118 128 396 401 549 583 678 gg/cc HapII 11 115 120 129 137 210 269 278 451 c/cgg 491 500 510 HgaI 2 410 621 gacgc HgiEI 1 494 g/gwcc HhaI 8 40 304 390 417 627 662 696 760 gcg/c Hin6I 8 38 302 388 415 625 660 694 758 g/cgc HinP1I 8 38 302 388 415 625 660 694 758 g/cgc HinfI 1 22 g/antc HpaII 11 115 120 129 137 210 269 278 451 c/cgg 491 500 510 HphI 2 278 348 ggtga Hsp92II 2 605 709 catg/ HspAI 8 38 302 388 415 625 660 694 758 g/cgc ItaI 9 12 60 177 289 386 550 663 672 gc/ngc 703 Kpn2I 1 209 t/ccgga KpnI 1 143 ggtac/c KspI 1 183 ccgc/gg Kzo9I 1 358 /gatc MaeI 2 305 480 c/tag MaeII 3 168 190 250 a/cgt MboI 1 358 /gatc MboII 4 29 74 114 369 gaaga MnlI 7 11 152 269 284 311 321 415 cctc MroI 1 209 t/ccgga MseI 3 261 610 742 t/taa MslI 1 653 caynn/nnrtg MspA1I 1 182 cmg/ckg MspI 11 115 120 129 137 210 269 278 451 c/cgg 491 500 510

81

Enzyme No. Positions Recognition name cuts of sites sequence MspR9I 10 120 130 278 334 398 451 491 501 cc/ngg 537 639 MvaI 4 334 398 537 639 cc/wgg MvnI 6 62 182 302 417 625 665 cg/cg MwoI 6 229 385 429 668 702 757 gcnnnnn/nngc NciI 6 120 130 278 451 491 501 cc/sgg NdeII 1 358 /gatc NlaIII 2 605 709 catg/ NlaIV 6 135 141 495 508 582 678 ggn/ncc NspBII 1 182 cmg/ckg NspI 1 605 rcatg/y PalI 8 77 118 128 396 401 549 583 678 gg/cc PspAI 1 490 c/ccggg PspALI 1 492 ccc/ggg PspN4I 6 135 141 495 508 582 678 ggn/ncc PspOMI 2 581 676 g/ggccc RsaI 4 141 478 529 545 gt/ac SacII 1 183 ccgc/gg Sau3AI 1 358 /gatc Sau96I 6 117 126 400 494 581 676 g/gncc ScrFI 10 120 130 278 334 398 451 491 501 cc/ngg 537 639 SduI 2 585 680 gdgch/c Sfr303I 1 183 ccgc/gg SinI 1 494 g/gwcc SmaI 1 492 ccc/ggg SnaBI 1 251 tac/gta Sse9I 4 213 328 571 611 /aatt SstII 1 183 ccgc/gg TaqI 1 615 t/cga TfiI 1 22 g/awtc ThaI 6 62 182 302 417 625 665 cg/cg Tru1I 3 261 610 742 t/taa Tru9I 3 261 610 742 t/taa Tsp509I 4 213 328 571 611 /aatt TspEI 4 213 328 571 611 /aatt TspRI 2 395 598 cagtg TthHB8I 1 615 t/cga XmaI 1 490 c/ccggg XmaIII 1 547 c/ggccg

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Anexo E. Digestión virtual A continuación se presenta una tabla con los tamaños de los TRFs obtenidos de la digestión

virtual.

Tabla 22. Tamaños de los TRFs obtenidos de la digestión virtual de las bacterias asociadas a procesos de biolixiviación

RsaI Msp I Temperatura Acetobacter methanolicus - - Acetobacter spp. 121 138 Acidimicrobium ferrooxidans 121 138 Termófilo moderado Acidiphilium acidophilum 121 138 Mesófilo Acidiphilium angustum 121 138 Acidiphilium cryptum 121 138 Mesófilo Acidiphilium symbioticum 121 138 Mesófilo Acidithiobacillus caldus 551 163 Termófilo moderado Acidithiobacillus albertensis 309 163 Mesófilo Acidithiobacillus capsulatus - - Acidithiobacillus concretivorus - - Acidithiobacillus delicatus 146 163 Acidithiobacillus denitrificans 146 163 Acidithiobacillus ferrooxidans 249 163 Mesófilo Acidithiobacillus intermedius - - Acidithiobacillus kabobis - - Acidithiobacillus neapolitanus - - Acidithiobacillus novelius - - Acidithiobacillus organoparus - - Acidithiobacillus perometabolis - - Acidithiobacillus pumbophilus 147 163 Acidithiobacillus rubellus - - Acidithiobacillus tepidarius - - Acidithiobacillus thiooxidans 309 163 Mesófilo Acidithiobacillus thioparus 117 148 Acidithiobacillus versutus - - Acidobacterium capsulatum 121 123 Mesófilo Acidocella spp. 121 138 Acidomonas methanolica 121 138 Alicyclobacillus spp. 146 164 Mesófilo - Termófilo moderado Alicyclobacillus disulfidooxidans 146 148 Mesófilo - Termófilo moderado Arthrobacter spp. 126 143 Aureobacterium liquifaciens - - Bacillus coagulans 147 102 Bacillus licheniformis 117 216 Bacillus megaterium 117 215 Bacillus polymyxa - - Chromobacterium violaceum 146 130 Comamonas testosteroni 102 132 Crenothrix spp. - - Desulfosporosinus spp. 94 164 Enterobacter aglomerans - - Enterobacter cloacae 94 163

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RsaI Msp I Temperatura Ferrimicrobium acidiphilium 121 138 Mesófilo Gallionella spp. 146 103 Kingella kingae 146 163 Lactobacillus acidophilus 552 215 Leptospirillum ferrooxidans 146 379 Mesófilo Leptospirillum ferriphilium 146 103 Mesófilo Leptospirillum thermoferooxidans Mesófilo Leptospirillum spp. 146 103 Leptotrix discophora 146 163 Metallogenium spp. - - Ochrobacterium anthropi 525 102 Propionibacterium acnes 464 143 Pseudomonas cepacia - - Pseudomonas putida 317 163 Psychrobacter glacincola 551 130 Serratia ficaria 551 163 Shewanella spp. 238 163 Siderocapsa spp. - - Staphilococcus latis - - Staphilococcus spp 146 215 Stenotrophomonas maltophila 146 130 Sulfobacillus acidophilus 141 143 Termófilo moderado Sulfobacillus thermosulfidooxidans 141 115 Termófilo moderado Thermothrix thiopara 135 203 Thiobacillus prosperus 552 163 Mesófilo Thiomonas cuprinus - - Mesófilo Thiomonas spp. 146 163 Mesófilo

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