DIFERENCIACION ENTRE LOS VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA Y...

DIFERENCIACION ENTRE LOS VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA Y DE LA ESTOMATITIS VESICULAR POR MEDIO DE LA INOCULACION

DE RATONES*

RAYMUNDO G. CUNHA, D.V.M., ERVIN A. EICHHORN, V.M.D. Y FIDEL MATA O., Q.B. J

Del Centro Panamericano de la Fiebre Aftosa, Rio de Janeiro, Brasil

En 1933, Cox y Olitsky (1) demostra- ron que los ratones suizos adultos, inoculados intracerebralmente, eran susceptibles a los tipos ‘(New Jersey” e “Indiana” del virus de estomatitis vesicular procedente de cobayos.

En una publicación ulterior, Olitsky, Cox y Syverton (2) observaron que, utilizando la vía intraperitoneal, sólo se conseguía in- fectar a los ratones de menos de catorce días. Los ratones adultos no resultaban afectados. Sabin, Olitsky y Cox (3) estu- diaron detalladamente la susceptibilidad de los ratones jóvenes y de los adultos al virus de la estomatitis vesicular inyectado por vías diferentes. Nagel (4) mostró la susceptibilidad de los ratones adultos, inyectados intracerebralmente, a la cepa del tipo “A” Vallée del virus de la fiebre aftosa adaptada al cobayo. Tras 60 pases cerebrales el virus sólo se ha116 en el tejido cerebral.

Con los tipos de virus “0” y “C” no se han logrado resultados satisfactorios (5). Más recientemente, Skinner (6) probó la susceptibilidad de los ratones lactantes al virus de la fiebre aftosa.

Durante muchos años, el diagnóstico diferencial de la estomatitis vesicular y de la fiebre aftosa se basó en la inoculación de material sospechoso a diferentes especies de animales, como caballos, terneros, cerdos y cobayos (7, 8).

Brooksby (9, 10) mostró que la prueba de fijación del complemento se puede utilizar para diferenciar y tipificar los virus causan- tes de estas dos enfermedades. Sin embargo, en ciertos casos se ha visto que especí- menes de campo, principalmente los de la L

* Publicado simulthneamente en inglés en el Ameritan Journal of Veterinary Research.

fiebre aftosa, pueden ser negativos en cuanto a la fijación del complemento, y mostrar sin embargo capacidad infectiva con los animales experimentales. El virus puede estar presente en cantidades dema- siado pequeñas para ser apreciadas mediante la fijación del complemento, pero eso no quiere decir que no sea infectivo. Como no es práctico ni económico el empleo de vacunos para la comprobación de numerosas pruebas negativas a la fijación del complemento, particularmente donde las enfermedades se presentan en forma enzoótica, se ha ideado una prueba sencilla y barata. Esta se ideó, en principio, para diferenciar el virus de la estomatitis vesicular del de la fiebre aftosa, y se basa en la susceptibilidad de los ratones, adultos y lactantes, a cada uno de estos virus. Además los tejidos de los ratones inoculados se pueden usar como antígenos en las pruebas de fijación del complemento para determinar el corres- pondiente tipo de virus.

MATERIALES Y METODOS

Virus de la fiebre aftosa.-Todas las cepas fueron de origen brasileño.

Tz$o “0”. Se prepararon inóculos de dos cepas de campo, una procedente de un brote en el estado de Sã;o Paulo y la otra de un brote en el estado de Río de Janeiro. Las cepas originales se inocularon 8 terneros susceptibles, para disponer de la necesaria cantidad de epitelio lingual (virus).

Tipo “A”: Se usaron dos cepas. La pri- mera fué una cepa de campo procedente de Río Grande do Sul, pasada una vez en un ternero susceptible, y la otra consistió en material de un brote de Río de Janeiro, (Distrito Federal). El material se envió a nuestro laboratorio en glicerina fosfatada, sin refrigeración.

83

84 BOLETIN DE LA OFICINA SANITARIA PANAMERICANA

Tipo Y?‘: Una de las dos cepas usadas se obtuvo del Instituto Biológico de Sã;o Paulo, donde se utiliza como virus simiente para la preparación de vacuna. La otra cepa se obtuvo de lesiones epiteliales procedentes de un brote en el estado de Minas Gerais, Brasil. Ambos virus llegaron a nuestro laboratorio en glicerina fosfatada, sin re- frigeración.

Virus de estomatitis vesicular.-Como, hasta hoy, no se ha identificado en el Brasil la estomatitis vesicular, todas las cepas de virus utilizadas se obtuvieron de otros paises de la América Latina.

Tipo “New Jersey”: Una cepa consistió en epitelio original de un brote natural ocurrido en Panamá. Esta cepa se había conservado durante varios meses, a -20” centígrados, antes de ser utilizada. La segunda cepa con- sistió en epitelio procedente del quinto pase bovino de la cepa Huando, del Perfi. Se había almacenado, a la temperatura citada, durante más de un año.

Tipo “Indiana”: Se utilizaron dos cepas denominadas “San Marcos, pase XII” y “Carrillo Puerto Vera Cruz, Cosecha No. 995067, de 21/7/52”. Procedían del Perú y México, respectivamente, y habían sido enviadas por el “Instituto Nacional Antiaf- toso” y la “Comisión México-Americana de la Fiebre Aftosa”.

Inóculos.-Todos los inóculos se prepararon triturando de 1 a 2 g de epitelio lingual, con arena estéril, y resuspendiendo el material en cantidad suficiente de solu- ción salina isotónica tamponada para hacer una suspensión de 1:5. La suspensión se sometió a acción de una centrífugadora horizontal, durante 10 minutos y a razón de 2.500 r.p.m.

Una parte del líquido sobrenadante se mezcló con cantidades iguales de penicilina y estreptomicina, en solución, por lo que la suspensión definitiva de virus tenía una dilución 1: 10 de la del material original. La concentración de antibióticos se calculó para obtener 1,000 unidades de penicilina y 1 mg de estreptomicina por centfmetro cúbico de suspensión. La suspensión se

depositó en el refrigerador durante media hora a 4” centígrados, al cabo de los cuales se tomó una pequeña porción y se sembró en medio de tioglicolato para investigar posibles contaminaciones.

A partir de la dilución 1: 10, se prepararon diluciones multiples de 10 (1: 100, 1: 1000, etc.). Estas diluciones se hicieron con solución tampón fosfatada.

Diluente.-(Solución Madre). Se pre- ti paró de acuerdo con la siguiente fórmula:

NaH2P042H20. . . . . . 23 g NazHP0412Hz0.. . . . . . 36,0 g Agua destilada.. . 1,092 ml

Esta solución madre se diluyó a 1:20 con agua destilada, según la necesidad y se esterilizó en un autoclave. El margen de pH en el diluente final fué 7,5-7,7.

”

Ratones.-En todos estos experimentos se utilizó la estirpe del Instituto Rockefeller de ratones suizos. Los ratones lactantes tenían todos de 7 a 8 días de edad, y los adultos de 30 a 50 días, pesando cada uno de 13 a 16. El peso de los ratones adultos era algo inferior al normal, debido al sistema de crianza. Cada madre amamanta 8 crías, en vez de las 4-5 que es lo general. Su peso normal a las edades arriba indicadas sería k de 18-22 g.

Prueba de fijación del complemento.- La prueba de fijación del complemento usada en estos experimentos se llevó a cabo de acuerdo con técnicas ya descritas (11, 12), salvo las modificaciones que abajo se indican. Esta técnica se basa en la unidad 50% de hemólisis y para las lecturas se utiliza un espectrofot6metro.

Antígenos.Se utilizaron epitelio lingual bovino y tejidos muscular y cerebral de ratones adultos y lactantes. Se preparó una suspensión básica 1: 5 para titulación y pase ulterior, y se reservó una parte para la pre- paración de antígenos destinados a la prueba de fijación del complemento. En todos los casos posibles, se prepararon dos antígenos de cada suspensión, uno mediante la extracción con cloroformo (antígeno ECL) y otro mediante acción centrífuga de alta

Julio 19551 FIEBRE AFTOSA Y ESTOiWATITIS VESICULAR 85

velocidad (antigeno CAV). Esta ultima se llevó a cabo en un centrifugador refrigerado “International”, durante 30 minutos, a razón de 16.000 r.p.m., con ayuda de un accesorio multiplicador de velocidades.

Complemento.-En cada prueba se usaron cuatro unidades 50% de complemento liofilizado preparado por los Laboratorios Biológicos de Texas.

Antisueros.-Se utilizaron sueros de cobayos hiperinmunizados con virus de los tipos estándar “O”, “A” y “C” de fiebre aftosa e “Indiana” y “New Jersey” de estomatitis vesicular. Algunos de los sueros contra la fiebre aftosa fueron elaborados en nuestros laboratorios, y los demás se obtuvieron del Virus Research Institute, de Pirbright, Inglaterra. Los sueros de estomatitis vesicular se consiguieron en el Bureau of Animal Industry, Estados Unidos.

Procedimiento.-Cada uno de los inóculos originales fué tipificado por la prueba de fijación del complemento y titulado tanto en ratones lactantes como en adultos. Las series de diluciones de virus se inocularon intraperitonealmente a grupos de ratones lactantes, e intracerebralmente, a ratones adultos, bajo ligera anestesia de éter. Cada

+ ratón lactante recibió 0,05 ml de la sus- pensión y cada ratón adulto 0,03 ml. Los ratones fueron examinados dos veces al día para comprobar la existencia de síntomas clínicos de la enfermedad y los casos de defunción.

1: Se recogió tejido cerebral y muscular de cada uno de los grupos de ratones que mostraron síntomas clfnicos de la enfermedad, y se preparó una suspensión al 1: 5 de cada tejido. Esta suspensión se utilizó para titula- ción y para pases ulteriores.

?r Las series de pases de cada cepa se continuaron hasta la obtención de resultados claros tanto en ratones lactantes y adultos como en la prueba de fijación del complemento, o en ambos métodos.

Los cálculos para las titulaciones de virus, JI

se efectuaron mediante el método del 50% de mortalidad,.según Reed y Müench. (13)

EXPERIMENTOS Y RESULTADOS

Virus Tipo “0” de la fiebre aftosa

Cepa 1: Se inocularon en grupos de ratones lactantes y adultos series de diluciones de virus infectado procedente del epitelio lingual bovino que oscilaban entre 10-l y 10M7. Para cada dilución se utilizaron ocho ratones de cada grupo de edad. En los ratones lactantes se obtuvo un título de 1O-5n ‘j, pero en los ratones adultos no se registraron defunciones ni síntomas de enfermedad. El antígeno bovino dió una fijación positiva con suero de tipo “O”, y negativa con los demás antisueros.

Los antígenos preparados de tejido muscular de los ratones lactantes muertos mostraron una fijación firme con antisuero aftoso tipo “0” en la prueba de fijación del complemento, mientras un antígeno preparado con tejido cerebral de los mismos ratones no mostró fijación alguna.

Estos antígenos fueron titulados en ratones lactantes y adultos. El antígeno muscular mostró un título de 1O-4s 5 en ratones lactantes, pero la dilución 10-l no infectó a los ratones adultos. El antígeno cerebral no resultó infectante para ninguno de los grupos de ratones en una dilución de 10-l.

Cepa 2: El mismo procedimiento se repi- tió con la segunda cepa de tipo “0”. El título del virus, en ratones lactantes, fu6 10d5; en los ratones adultos no se mostraron síntomas de la enfermedad. El antí- geno bovino CAV dió una fijación firme con antisuero tipo “O”, y se apreció cierta fijación con los antisueros de los tipos “A” y -2”.

Los antígenos preparados de tejido muscular de ratones lactantes dieron una clara fijación con antisuero tipo “0”. Los anti- genos de tejido cerebral fueron negativos (Véase Cuadro No. 1).

Virus tipo “A” de la fiebre aftosa

Cepa 1: La serie de diluciones de epitelio lingual infectado con virus dió títulos de lo-** 5 en los ratones lactantes, y de 10-lp 6, en los ratones adultos. El medio de tioglico-

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CUADRO No. l.-Experimentos con virus Vallée Tipo “O”, de pebre aftosa. Tilulación en ratones lactantes y resultados de la fijacihz del complemento.

cepas y material usados

Cepa 1 Lengua bovina Ratones lactantes

Músculo

Cerebro


Músculo Cerebro

-

-

-

Pase número

-

7 I

r ‘ítul0 en rato- Ies lactantes’

10-6, 6

10-d. 5

<10-l

10-h

10-4. 2

< 10-l

Reacción de fijación del complemento

Tipo de antígeno

CAV

ECL CAV ECL CAV

CAV

CAV CAV

85t

100 100

0 0

100

100 0

Suero “A”

0

0 20

0 0

20

0 0

Suero “C”

5

0 40

0 0

48

4 0

* Las mismas suspensiones fueron tituladas en ratones adultos y no se manifestó la presencia de virus.

CAV = centrifugación de alta velocidad; ECL = extracción con cloroformo. t Los números representan el porcentaje de fijación. No se citan los resultados negativos con suero

“New Jersey” e ‘<Indiana”.

lato mostró que el inkulo no era estéril, y por esta razón estos títulos fueron inexactos probablemente.

El antígeno preparado del material original di6 una clara fijación del complemento ron suero anti-aftosa tipo “A”.

Se recogió tejido muscular y cerebral de ambos grupos de ratones para tipificación y titulación. Un antígeno CAV de tejido muscular de ratón lactante di6 un 70% de fijación con antisuero tipo “A” y una ligera fijación con antisuero tipo “0”. El mismo tejido dió un título de 10-3e 5 en ratones lactantes. El tejido cerebral no di6 fijación, y su título fué sólo de 10-l.

Se efectuó un segundo pase en ratón lactante utilizando para ello una suspensi6n de tejido muscular del primer pase. También en este caso se recogió tejido muscular y cerebral. Con el músculo se preparó un antígeno ECL, que rindió un 37% de fijación con antisuero tipo “A”. Sin embargo, el antí- geno CAV mostró una fuerte fijación con el antisuero tipo “A” y una ligera fijación con el tipo “0” (36 %) y con el tipo “C” (15 %). El tejido muscular di6 un título de 10M4* 5. Se efectuaron otros tres pases en ratones lac-

tantes, a fin de conseguir unos resultados más claros. La titulación y los resultados de las pruebas de fijación del complemento apare- cen en el Cuadro No. 2.

Cepa 2: El primer pase de esta cepa mostró un título de 10m3s 7 en los ratones lactantes, y fué negativo en los adultos. Se k obtuvo una fijación firme con antisuero tipo “A” con un antígeno preparado del in6- culo.

Se recogi6 tejido muscular y cerebral de los ratones lactantes para titulacibn y íija- ción del complemento. El tejido muscular dió un título de 10v5’ 3 y el cerebral un titulo de 1O-2* *. El antígeno ECL de tejido muscular rindi ligera fijación (20%) ron antisuero tipo “A”; no di6 fijación ron los de- más antisueros después de la acostumbrada media hora de incuhaci6n. Sin embargo, tras 15 minutos de inauharión se logr6 una fijación firme con antisuero tipo “A”, a la vez que se observaba una hem6lisis completa en los demás sueros y tubos de control. El antígeno CAV dió una fijación mayor (81%) con antisuero tipo “A”, y también se observó cierta fijación con-los tipos “0” (20 %) y “C” (10 %). Un antígeno CAV de

Julio 19551 FIEBRE AFTOSA Y ESTOMATITIS VESICULAR 87

CUADRO No. 2.-Experimentoscon virus Vallée Tipo “A” defiebre aftosa. Tilulación en ratones lactantes y resultados de la fijación del complemento.

Cepas y material usados Pase número Tipo de

antígeno Suero “0” Suero “A” Suero “C”

Cepa 1 Lengua bovina

Ratones lactantes * Músculo

Cerebro Músculo

1Múscu10

k Cerebro Músculo

Cerebro Músculo

Cerebro

10-z. 6 ECL 0 1oot 0 CAV 29 100 29

1 10-8. 5 CAV 20 70 0 1 10-l CAV 0 0 0 2 10-4. 6 ECL 0 37 0

CAV 36 100 15 3 10-4. 3 ECL 0 30 0

CAV 6 70 5 3 10-l. 6 CAV 0 0 0 4 10-S ECL 0 5 0

CAV 27 100 36 4 10-Z CAV 0 0 0 5 10-4, 7 ECL 0 100 0

CAV 10 100 20 5 10-Z CAV 0 0 0

Cepa B Lengua bovina Ratones lactantes

Músculo

10-8, 7 ECL

10-5. 8

Cerebro Músculo

10-2, 8

10-6. 8

Cerebro Músculo

Cerebro Músculo

W8* 7 10-b

0 82 0

1 0 20 0 20 81 10

1 0 0 0 2 0 50 0

10 65 0 2 0 0 0 3 0 59 0

40 100 17 3 0 0 0 4 0 0 0

11 41 17 5 0 48 0

30 100 10 5 0 0 0


CAV = centrifugación de alta velocidad; ECL = extracción con cloroformo. i Los números representan el porcentaje de fijación. No se citan los resultados negativos con suero

“New Jersey” e “Indiana”.

10-3~ 7 10-d

Músculo

Cerebro lo-8 > 7

ECL CAV CAV ECL CAV CAV ECL CAV CAV ECL CAV ECL CAV CAV

Reacción de fijación del complemento

tejido cerebral no dió fijación. Se realizaron vieron resultados similares con material de otros cuatro pases en ratones lactantes, y los pases 3” y 5”. Los antígenos CAV dieron de cada pase se recogió tejido muscular y una fijación más fuerte con antisuero tipo cerebral para titulación y tipificación. El “A”, pero no se consiguió una hemolisis antígeno ECL de tejido muscular del se- completa con los demás antisueros. gundo pase dió una fijación mayor con Todos los antígenos de tejido cerebral antisuero tipo “A” (50%) y no rindió fija- dieron resultados negativos. Estos resul- ción con los demás antisueros. Se obtu- tados se resumen en el Cuadro No. 2.


Virus tipo “C” de fiebre aftosa ligera fijación (24 W) con antisuero tipo “C”.

Cepa 1: Esta cepa produjo un título de El antígeno muscular CAV del segundo

1O-4* 3 al ser inoculada en ratones lactantes, pase en ratones lactantes di6 una fijación

no se acusó reacción en los adultos. El mucho mayor (98%) con antisuero tipo

inóculo dió una fuerte fijación con el suero “C” y una ligera fijación con los tipos “0”

anti-aftosa tipo “C”. y “A” (10 % y 23 %, respectivamente).

Un antígeno ECL preparado con tejido Se efectuaron otros dos pases en ratones

1 actantes. muscular di6 una fuerte fijación con anti-

No se prepararon antígenos con

suero tipo “C” (85%) y una reacción muy material del tercer pase, pero se recogi6 te-

ligera (5%) con antisuero tipo “A”. El jido muscular del cuarto pase para titula-

antígeno CAV preparado de este tejido di6 ción y fijación del complemento. Se obtuvo

casi los mismos resultados, consiguiéndose un título de 1~-~, a y se otlservó rlara fija-

una fuerte fijación con el antisuero tipo “C” ción con el antisuero tipo “C” en ambos

y una fijación muy ligera con los tipos “0” y tipos de antígeno (véase el Cuadro No. 3).

‘IA”. Los antígenos de tejido cerebral dieron Virus de estomatitis vesicular “New Jersey” resultados negativos. Cepa 1: Se inoculó una serie de diluciones

Cepa 2: El primer pase fu6 negativo en los de virus en grupos de ocho ratones lactantes ratones adultos y di6 un título de 10T3* 3 en y de ocho adultos. De los ocho ratones lac- los lactantes. Un antígeno CAV preparado tames inoculados ~610 murieron dos; en a partir del inórulo mostró solamente una los adultos se obtuvo un título de 10-4* 6. ligera fijación con el antisuero tipo “C”. Se recogió tejido muscular y cerebral de

Una suspensión de tejido muscular del los ratones adultos. Una suspensión de tejido primer pase di6 un titulo de 10h4* 8, y un cerebral di6 títulos de lOW* 2 y 10-3p ‘, antigeno CAV preparado con ella mostró una respectivamente, en los ratones adultos y

CUADRO No. 3.-Experimentos con virus Waldmann Tipo “C” de pebre aftosa. Titulación en ratones lactantes ?/ resultados de la, .fiiación del complemento.

Cepas y material usados Pase número


Músculo

Cerebro


Músculo Cerebro Músculo Músculo

-

1 I

.-

-

:ítu10 en ratones lactantes’

10-4, 8 CAV

10-6, 6

10-z. 7

ECL CAV ECL CAV

10-3. 3 CAV

10-4. 8

10-l

10-6, 8

10-6, 8

CAV CAV CAV ECL CAV

i-

-

Reacción de fijación del complemento t

Tipo de antígeno Suero “0”

0

0 5 0 0

0

0 0

10 0 4

.- Suero “A”

-

I’ SUWO

Vsldmann “C”

0 1001

5 85 23 91

0 0 0 0

0 30

0 24 0 0

23 98 0 97 5 97


CAV = centrifugación de alta velocidad; ECL = extracción con cloroformo. t Los números representan el porcentaje de fijación. No se citan los resultados negativos con suero

“New Jersey” e “Indiana”.


en los lactantes; una suspensión de tejido Virus de estomatitis vesicular ” Inndz’ana” muscular di6 títulos de 10-4* 7 en los ratones adultos y lo-‘* 4 en los lactantes. Cepa 1: Se inoculó una serie de diluciones

Tanto los antígenos ECL como los CAV de virus de 10-l a lo-‘, procedente de epite-

dieron un 100% de fijación con antisuero lio lingual bovino, en ratones lactantes y tipo “New Jersey” y no acusaron reacción adultos. Se obtuvieron títulos. de 10-l* 7 y con los demás antisueros. Ninguno de los lo-39 4, respectivamente. dos antígenos preparados con tejido muscu- De cada grupo de ratones se recogió lar de ratones adultos produjo fijación. tejido muscular y cerebral, y se preparó una

Cepa 2: Una suspensión de esta cepa no suspensión al 1:5 para titulación y antí- se mostró infectante a los ratones lactantes, genos. Cada serie de suspensiones de virus pero cuatro de los ocho ratones adultos se tituló en* los ratones lactantes y en los inoculados con una dilución 10-l de virus adultos. resultaron infectados y murieron. Se recogió tejido muscular y cerebral de los cuatro

Tejido muscular de ratón adulto titulado

ratones muertos. en ratones lactantes y en adultos, dió, res-

El tejido muscular dió un título de 10P3* 7 pectivamente, títulos de 10P5* 5 y no menor

en los ratones adultos y de 10-l* 7 en los de 1O-6s 5. El cerebro de ratón adulto di6

lactantes. títulos de 10e6* 4 y lO-‘j* ‘. El músculo de

Una suspensión de tejido cerebral dió un ratón lactante dió títulos de 1O-5m 5 y

título de lo-’ en los ratones adultos y de 1O-5, * y el cerebro de los mismos ratones, de

104s 6 en los lactantes. lo+ 8 y no menor de lW* 5.

Los antígenos musculares ECL y CAV El antígeno CAV preparado con cerebro

no dieron reacción con ninguno de los anti- de ratones lactantes-le’ pase-y los dos

sueros. Los antfgenos similares de tejido antígenos ECL y CAV, preparados con cerebral dieron una clara fijación con anti- cerebro de ratones adultos, mostraron una suero “New Jersey (véase Cuadro No. 4). fijación 100 % con suero anti-estomatitis

4 CUADRO No. &-Experimentos con virus (‘New Jersey” de estomatitis vesicular. Titulación en ratones y resultados de la fijaiión del complemento.

Cepas y material usados

Cepa 1 Lengua bovina Ratón adulto

Músculo

Cerebro

Cepa 2 Lengua bovina

Ratón adulto Músculo

Cerebro

-

--

Pase número

Título infectivo en

Ratones lactantes

<lO-’

10-1, 4

10-3, 7

<10-l

10-1, 7

10-4.8

%E

10-4, 5

10-4, 7

10-G* 2

10-l

10-3, 7

10-7

I Reacción de fijación del complemento

Tipo de antígeno

ECL

ECL CAV ECL CAV

ECL CAV

ECL CAV CAV

-

--

-

SUW3 New Jersey

&6*

0 0

97 99

98 96

0 0

96

0

0 0 0 0

0 0

0 0 0

ECL = extracción con cloroformo; CAV = centrifugación de alta velocidad. * Los números representan el porcentaje de fijación. Todos los antígenos dieron resultados negativos

con sueros de fiebre aftosa, de los tipos “O”, “A” y “C”.

90 BOLETIN DE LA OFICINA SANITAnI- PANAMERICANA

CUADRO No. 5.-Experimentos con virus “Indiana” de estomatitis vesicular. Titulación en ratones y resultados de la fijación del complemento.

Cepas y material usados


Músculo

Cerebro

Ratón lactante Músculo Cerebro


Músculo

Cerebro

Ratón lactante Músculo

Cerebro

-

Pase número i Título infectivo en I-

Ratones lactantes

10-1, 7

10-6, 6

10-0, 4

10-6, 6

10-O. 8

lo-‘*4

10-3. 6

10-O. 0

>lO-6. 6

10-B

10-3, 4

10-0, 6

10-O I 7

IO-6,s 10-8, 6

10-2, 4

10-z. 5

10-O. 3

>lO-0, 6

10-S

Reacción de fijación del complemento -

Tipo de antígeno

ECL

ECL CAV ECL CAV

ECL CAV

CAV

ECL CAV ECL CAV

ECL CAV CAV

Suero SUWO New Jersey Indiana

0

0 0 0 0

0 0

0

0 0 0 0

0 0 100 0 99

91*

0 0 ti

98 92

0 100

l! 97

0 0

97 97

98

CLE = extraccih con cloroformo; CAV = centrifugación de alta velocidad. * Los números representan el porcentaje de fijación. Todos los antígenos dieron resultados negativos

con sueros de fiebre aftosa, de los tipos “O”, “A” y “C”.

vesicular “Indiana”, y dieron resultados negativos con los demás antisueros.

Los cuatro antígenos preparados con músculo de los dos grupos de ratones no dieron fijación con los sueros ensayados.

Cepa 2: La serie de diluciones de epitelio lingual bovino inoculados en grupos de ratones lactantes y adultos di6 títulos de 10-1, 4 y 10-z* 4, respectivamente.

Se recogieron por separado cerebros y músculos de ratones muertos de ambos grupos, y se prepararon suspensiones al 1: 5 para antígenos y titulación.

Los antfgenos de cerebro de ratón adulto dieron una fijación 100% con suero tipo “Indiana”. El antígeno muscular fué negativo. El cerebro infectivo de ratones lactantes y adultos di6 títulos de lo-“’ 6 y 10-C 8 3, respectivamente. El tejido muscular di6 tftulos de 10-3* 6 y 1O-2n s, respectivamente.

Se recogieron cerebros y músculos de ratones lactantes-l”’ pase-y se prepararon suspensiones al 1:5 para antígenos y titula- ción.

Un antígeno cerebral CAV y antígenos musculares CAV y ECL dieron una fijación 100% con suero “Indiana” y resultados negativos con los demás sueros.

El tejido cerebral dió titulos de 10m6 y 10w8, respectivamente, en los ratones lactantes y en los adultos; el tejido muscular dió una titulación no inferior a 10w6 1 6 en ambas clases de ratones (véase Cuadro No. 5).

DISCUSION

Debido a las dificultades de aislamiento y manipulación, así como a la cuant.ia de los gastos, cada vez se utiliza menos el procedimiento clásico de inocular animales grandes para la diferenciación entre la fiebre aftosa


y la estomatitis vesicular. Según Traum (14) es a veces difícil obtener resultados definitivos por este método, particularmente cuando no se puede emplear más que un grupo de animales. Además, han de transcu- rrir aproximadamente siete días para conseguir un resultado decisivo (15), y, en el caso de la fiebre aftosa, ni aún así se obtiene la indicación del tipo de virus que causó el

4 brote. Por otra parte, se puede confiar general-

mente en la prueba de fijación del complemento para diferenciar los virus de la estomatitis vesicular de los de la fiebre aftosa, así como los tipos y las cepas de virus de estas enfermedades. De todas formas, un resultado negativo no siempre significa ausencia de virus. Por este motivo, la Comisión México-Estadounidense de Erradicación de la Fiebre Aftosa (15) adoptó una prueba diagnóstica en la que se combinan la prueba de fijación del complemento y las inoculaciones en animales grandes. El procedimiento consiste en una prueba de fijación del complemento con la muestra original de epitelio lingual y la simultánea inoculación de, por lo menos, dos reses susceptibles con una parte de la misma muestra. Si la pri-

< mera prueba de fijación del complemento da resultados negativos y las reses susceptibles muestran lesiones vesiculares, se puede conseguir la fijación con epitelio del animal inoculado. De este modo, el laboratorio de la Comisión consiguió incrementar en un lo-15 % el número de diagnósticos positivos de sus resultados. Durante un período de dos años, la prueba primaria de fijación del complemento confirmó la presencia de virus de fiebre aftosa en 4 muestras de epitelo y la de virus de estomatitis vesicular en 308

c de dichas muestras. Las inoculaciones de animales permitieron aislar el virus de la fiebra aftosa en otras 14 muestras y el de la estomatitis vesicular en 53, incrementando de esta manera el total de diagnósticos positivos de 312 a 379. Se observará que el aumento fué especialmente notable en el caso de la fiebre aftosa.

Nuestra experiencia tiende a confirmar

estas observaciones que indican que no se puede confiar, por entero, en la prueba de fijación del complemento usada por sí sola. Sin embargo, en los países donde una o ambas enfermedades son enzoóticas la obtención de reses susceptibles se convierte en una dificultad casi insuperable. El man- tenimiento de medios especiales de aislamiento y el elevado costo de los animales hacen que la inoculación de ganado vacuno no resulte práctica ni económica. El objeto del presente estudio ha sido eliminar el uso de los animales grandes, empleando en su lugar ratones, siempre que sea posible.

Henderson (16) ha mostrado que los ratones de 3 á 4 semanas son tan susceptibles como las reses bovinas al virus de la estomatitis vesicular, cuando se inocula intracerebralmente. Skinner (6) y Skinner, Henderson y Brooksby (17) han probado también que los ratones lactantes son casi tan susceptibles como el ganado al virus de la fiebre aftosa. De ocho cepas ganaderas del virus de fiebre aftosa, siete dieron el mismo título de infectividad al ser tituladas por inocula- ción intradérmica del epitelio lingual del ganado vacuno y, simultáneamente, mediante inoculación intraperitoneal, en ratones lactantes. Debe observarse que cinco de esas cepas eran de campo y habían sido recogidas recientemente. Seis titulaciones llevadas a cabo en este laboratorio de la misma manera, dieron indicaciones similares; la diferencia de las titulaciones ob- tenidas en el ganado y en los rationes no fué superior a log. 0,5.

En este estudio se vió que las cepas de virus utilizadas fueron infectantes para los ratones. Ninguna de las seis cepas de virus de fiebre aftosa fué infectantes para los ratones adultos inoculados intracerebralmente, pero todas lo fueron para los ratones lactantes mediante la inoculación intraperitoneal. Los bajos títulos conseguidos con los tipos de virus “A” y “0” se debió probablemente a la falta de refrigeración durante el transporte.

Por otra parte, el virus de la estomatitis vesicular fué patógeno para ratones adult,os


inoculados intracerebralmente, pero su patogenicidad fué baja para los ratones lactantes inoculados por vía intraperitoneal. Esta diferencia fué muy notable con el virus tipo “New Jersey”.

Las investigaciones sobre el uso del tejido de ratón como antígeno para la prueba de fijación del complemento han probado que este material da resultados muy satisfactorios. El músculo de ratones lactantes infectados contiene una alta concentración de virus de fiebre aftosa, y el cerebro de los ratones adultos contiene una elevada con- centración de virus cuando ha sido infectado por estomatitis vesicular. En el caso del virus de fiebre aftosa, el material del primer pase en ratones da resultados definitivos con el virus de tipo “O”, obteni6ndose un porcentaje muy elevado de fijación del complemento. Los tipos “A” y “C” no rinden un porcentaje de fijación tan alto, pero se podrían realizar pases ulteriores hasta obtener resultados definitivos. El antígeno de tejido cerebral de ratones lactantes di6, en todos los casos, resultados negativos con suero de fiebre aftosa; esto coincide con las observaciones de Rohrer (15) que no con- siguió fijación con cerebros de ratón infectados ni aun despu& de 1.300 pases.

El tejido muscular de ratones adultos, infectado con virus de estomatitis vesicular, no di& fijación, aunque se sabía que contenía una apreciable cantidad de virus. Por otra parte, el tejido cerebral rindió un antígeno que repetidamente produjo buena fijación. Este tejido acusó una alta concentración de virus. La cepa “Indiana” de virus de estomatitis vesicular, cuya invasividad pareció mayor que la de la cepa “New Jersey”, di6 también fijación con un ant,ígeno preparado con músculo de ratón lactante.

En general, se observó una notable diferencia entre los resultados obtenidos con los dos tipos diferentes de antígeno. Si bien la centrifugación de alta velocidad di6 un antí- geno de fuerte fijación con antisueros homó- logos, se observó un cierto grado de falta de especificidad. En contraste, el antígeno ex-

traído con cloroformo di6 un resultado más claro, pero una fijación más débil.

De estos experimentos parece despren- derse que los ratones se pueden utilizar con seguridad en substitución del ganado, para los diagnósticos diferenciales de la estomatitis vesicular y de la fiebre aftosa. En con- secuencia, se ha preparado una prueba diag- nóstica de rutina para material sospechoso, y se practica de la siguiente forma:

Se prepara una suspensión al 1:5. Parte de ella se usa en la prueba de fijacirin del complemento, y el resto se trata con penicilina y estreptomicina antes de inocular con ella intraperitonealmente a los ratones lactantes e intracerebralmente a los adultos.

La mortalidad de ratones lactantes solamente, indica que el virus es de fiebre aftosa; la mortalidad de ratones adultos-o de adultos y lactantes-indica la presencia de virus de estomatitis vesicular.

Se preparan antígenos con tejido cerebral y muscular de todos los ratones muertos. Los antígenos cerebrales son reiteradamente negativos a la prueba de fijación del complemento con suero anti-fiebre aftosa, pero dan una reacción positiva con suero anti-estomatitis vesicular. El antfgeno muscular de ratones lactantes infectados con fiebre aftosa dará una fijación positiva con el antisuero hom6logo.

No se incluyó en est,e estudio el virus de exantema vesicular, pero hasta la fecha los ratones no parecen ser susceptibles a él (18).

CONCLUSIONES c

(1) El virus de la fiebre aftosa es infectivo para los ratones lactantes de siete u ocho días si se inocula intraperitonealmente, pero no muestra patogenicidad para los ratones adultos de 30 a 50 días si se inyecta intra- j cerebralmente.

(2) En los ratones lactantes que mueren después de la inoculaci6n intraperitoneal del virus de fiebre aftosa, el tejido musrular es mucho más rico en virus que el tejido cerebral. Los antígenos preparados con músculo dan fijación del complemento positiva con


los sueros conocidos. Los antígenos cerebrales fueron negativos en todos los casos.

(3) Las cepas de virus de estomatitis vesicular utilizadas se mostraron infectivas para los ratones lactantes y para los adultos. Los ratones adultos inoculados intracerebralmente parecen más susceptjbles que los ratones lactantes inyectados intraperitoneal-

k mente. Esta diferencia es más acentuada en las cepas ‘<New Jersey”. En un caso, se consiguió aislar el virus mediante la inocula- ción intracerebral de ratones adultos, mientras que los ratones lactantes inoculados continuaron normalmente.

(4) En los ratones adultos muertos tras la inoculación intracerebral de virus de estomatitis vesicular, el cerebro contenía más virus que el músculo. En los ratones lactantes, la diferencia de títulos entre el cerebro y el músculo no es tan manifiesta. Los antígenos preparados con cerebro de

. ratones adultos o lactantes dieron fijación del complemento positiva con los sueros positivos conocidos. Los antígenos preparados con músculo de ratones adultos fueron reiteradamente negativos, mientras los preparados con músculos de ratones lactantes pueden dar, o no, fijación positiva.

4 (5) Es viable y económica una prueba para aislar y diferenciar el virus de la estomatitis vesicular y el de la fiebre aftosa, mediante el uso de ratones adultos y lactantes en com- binación con la prueba de fijación del complemento.

\ RESUMEN

Se ha examinado la labor realizada sobre la susceptibilidad de los ratones al virus de la estomatitis vesicular y al de la fiebre aftosa.

Los autores describen los experimentos llevados a cabo con dos cepas de cada uno de los tres tipos clásicos de virus de fiebre aftosa y de los dos tipos de virus de estomatitis vesicular. Se estudió la patogenicidad de estas cepas para ratones adultos y para ratones lactantes inoculados por vía intracerebral e intraperitoneal, respectivamente,

así como el uso del tejido de los ratones infectados como antígeno para la prueba de fijación del complemento.

Se sugiere la conveniencia de que, en lugar de animales grandes, se utilicen en gran parte ratones, adultos y lactantes, para la comprobación de especímenes que den resultados negativos en la reacción de fijación del complemento.

Se describe una prueba, a base de ratones, para el aislamiento y diferenciación del virus de la estomatitis vesicular y el de la fiebre aftosa.

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‘94 BOLETIN DE LA OFICINA SANITARIA PANAMERICANA

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DIFERENCIACION ENTRE LOS VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA Y...

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