DIEGO HERNANDO PEÑA LÓPEZ
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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LOS ALCALOIDES PROVENIENTES DE LAS HOJAS DE Siparuna sessiliflora DIEGO HERNANDO PEÑA LÓPEZ DIRECTORA: ELIZABETH GIL CODIRECTORA: MARIA XIMENA RODRIGUEZ PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE QUÍMICA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, 27 DE MAYO DE 2011
Transcript of DIEGO HERNANDO PEÑA LÓPEZ
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LOS ALCALOIDES
PROVENIENTES DE LAS HOJAS DE Siparuna sessiliflora
DIEGO HERNANDO PEÑA LÓPEZ
DIRECTORA: ELIZABETH GIL
CODIRECTORA: MARIA XIMENA RODRIGUEZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE QUÍMICA
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ, 27 DE MAYO DE 2011
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
Artículo 23 de la Resolución Número 13 de julio de 1946.
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AGRADECIMIENTOS
A Melissa por su cariño y acompañamiento
A las profesoras Elizabeth Gil y María Ximena Rodríguez por su apoyo incondicional,
comprensión, enseñanzas y colaboración
A mis amigos y compañeros de laboratorio y universidad
A la Universidad Javeriana y su personal
A mis padres y familiares
TABLA DE CONTENIDO
Pag.
Resumen 1
Introducción 1
Planteamiento del problema y justificación 2
Pregunta de investigación 3
1. Marco Teórico 3
1.1 Uso de las plantas en la medicina tradicional 3
1.2 Siparuna sessiliflora 4
1.3 Alcaloides 4
2. Objetivos 5
2.1 Objetivo general 5
2.2 Objetivo específicos 5
3. Materiales y Métodos 5
3.1 Recolección y preparación del material vegetal 5
3.2 Pruebas químicas para identificación de grupos de metabolitos en el material
vegetal 6
3.2.1 Pruebas fitoquímicas preliminares 6
3.2.2 Marcha analítica para alcaloides 6
3.3 Extracción de los metabolitos totales 6
3.4 Extracción de los alcaloides 7
3.5 Ensayos microbiológicos 7
3.5.1 Pruebas de difusión en agar 7
3.5.2 Determinación de la actividad antibacteriana 7
3.6 Identificación de los alcaloides por Cromatografía de Gases acoplada a
Espectrometría de Masas (GC-MS) 8
3.7 Análisis estadístico 8
4. Resultados y Discusión 9
4.1 Pruebas fitoquímicas preliminares 9
4.2 Marcha analítica para alcaloides 10
4.3 Pruebas de difusión de extractos en agar 11
4.4 Determinación de actividad antibacteriana 11
4.5 Identificación de los extractos por GC-MS 14
5. Conclusiones 18
6. Recomendaciones 18
7. Bibliografía 19
Anexo 1. Metodología marcha analítica
Anexo 2. Identificación de alcaloides y metabolitos, de los extractos totales y
alcaloidales
Anexo 3. Ensayos de inhibición bacteriana
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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LOS ALCALOIDES
PROVENIENTES DE LAS HOJAS DE Siparuna sessiliflora
RESUMEN
El estudio de plantas con potencial farmacológico, es un área de estudio en ascenso, dada la
escasez de producción de nuevos antimicrobianos, y el aumento de la resistencia de
especies bacterianas patógenas a los antibióticos convencionales. La planta Siparuna
sessiliflora, ha sido utilizada por culturas americanas como planta medicinal, sin embargo
poco se ha investigado el potencial de esta especie. Se llevó a cabo un estudio preliminar de
la composición de la especie S. sessiliflora, para obtener un conocimiento inicial del
potencial del material de trabajo. También se hizo una extracción por maceración en frío
con cloroformo y etanol, con agitación constante, diferenciando hojas de peciolos. La
extracción de los alcaloides se realizó disolviendo los extractos secos totales en
diclorometano, mediante variación del pH.
Las pruebas antibacterianas se realizaron contra dos cepas Gram positivas (Staphylococcus
aureus y Bacillus subtilis), y dos Gram negativas (Escherichia coli y Pseudomonas
aeruginosa). La actividad se midió mediante halos de inhibición, en cajas Petri usando agar
Mueller Hinton. Se separaron e identificaron los metabolitos presentes en todos los
extractos, por medio de Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas.
Se encontró actividad antibacteriana para todas las bacterias y con todos los extractos,
resultando mayor actividad en los extractos de alcaloides, identificando principalmente
alcaloides isoquinolínicos, a los que posiblemente se deba el potencial antimicrobiano de la
planta.
INTRODUCCIÓN
El uso medicinal de productos a base de plantas, o de sus extractos, es una tradición
largamente expandida entre la humanidad y ha sido aplicada desde tiempos inmemoriales.
En la actualidad, a pesar del auge de los medicamentos de origen sintético, la industria de la
medicina basada en productos naturales es una empresa a la que pertenece un 25% de las
drogas prescritas a nivel mundial, incluyendo el 11% de las 252 drogas esenciales según la
OMS, como lo reporta Olaya (1).
Colombia es una de las naciones de mayor riqueza en recursos naturales, es por ello que
debe ser una prioridad para el país llevar a cabo estudios a profundidad sobre biodiversidad
y de ésta manera poder hacer una adecuada explotación de los recursos, con el fin de
incentivar el crecimiento de la industria de productos naturales. Un problema que afecta la
popularización de los medicamentos basados en productos naturales, es que por lo general
2
no cuentan con un respaldo científico que los avale, dando como resultado desconocimiento
y desconfianza popular, y al competir con los fármacos de venta regular no son tomados en
cuenta por gran parte del mercado potencial.
Para comenzar a dar credibilidad a ciertas plantas que han sido usadas como medicinales,
es necesario realizar la extracción de sus sustancias activas con el fin de analizar su
potencial medicinal. Las plantas como producto de su metabolismo secundario, llevan a
cabo, entre otros, la síntesis de alcaloides, que son sustancias que proveen a las plantas de
protección contra plagas o alejan otros organismos que sean posibles predadores; además
pueden actuar como reguladores de crecimiento (2). Siparuna sessiliflora es una especie
que se encuentra distribuida en el continente americano, incluyendo a Colombia (3); y ha
sido referenciada por culturas indígenas, en su medicina tradicional (4).
Este trabajo hace parte del Grupo de Investigación en Fitoquímica de la Universidad
Javeriana (GIFUJ), y es financiado por la Pontificia Universidad Javeriana. Está definida
como una investigación básica, de tipo descriptivo, observacional, transversal y
prospectivo. La población en estudio es la especie Siparuna sessiliflora y se espera verificar
el potencial antibacteriano que tienen los alcaloides de dicha especie, al ser enfrentados a
cuatro cepas de especies bacterianas de interés clínico.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
La investigación enfocada en los productos naturales, es un campo que no se ha explorado a
profundidad; sin embargo, es bien conocido el papel que desempeñan estos productos en la
medicina humana, además el hallazgo y aislamiento de sustancias como los alcaloides, ha
permitido el crecimiento de esta industria (2). Los compuestos de origen natural, poseen
algunas ventajas sobre los fármacos de origen químico como una acción global debido a sus
principios activos, efecto más duradero, estímulo al organismo a generar acciones de
protección contra enfermedades en tratamientos y debido a que presentan menos efectos
secundarios, permite tratamientos más largos (1). Los compuestos naturales se usan en los
tratamientos de enfermedades de difícil curación como en algunos tipos de cáncer, donde se
ha implementado el uso de la Vincristina en reemplazo de fármacos de síntesis química,
arrojando mejores resultados en la recuperación del paciente (5); también se usa en terapia
clínica el alcaloide papaverina, dado su actividad dopaminérgica (2)
De esta manera es importante resaltar, que del género Siparuna se han aislado diversos
alcaloides con actividad biológica y potencial medicinal, como inhibición de
microorganismos o actividad antimalárica (Plasmodium falciparium) (4, 6-11). Uno de los
alcaloides más representativos es la liriodenina, la cual ha sido aislada de las especies S.
guianensis, S. gilgiana, S. tanduziana, S. thecaphor y S. apiosyce (7-10, 12). Este alcaloide
está referenciado en la farmacopea brasilera además de ser comercializado tanto en gotas
como jarabe, como tratamiento para la tos (6). Adicional a este alcaloide, se han aislado
algunos más que muestran actividad biológica, entre los que se encuentran la cassamedina,
oxonantenina, flavinantina, nantenina, isocoridina, asimilobina, noroliverolina, nornanteina
y la reticulina (6, 9-11). Sin embargo, la especie S. sessiliflora permanece aún poco
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reconocida por su posibles propiedades farmacológicas; aunque se tiene la referencia, por
tradición oral, que los indios Quichua ecuatorianos usaban pequeños trozos de corteza
calentada para remediar las llagas de herpes (13). El presente trabajo permitirá corroborar la
presencia de determinados alcaloides, encontrados previamente por Padilla (14) y buscar
algunos que no hayan sido reportados en S. sessiliflora, además de poner a prueba su
capacidad antibacteriana y permitirá hacer un análisis diferenciado por tejido de la planta.
En el presente estudio se busca corroborar la actividad antimicrobiana que tengan los
alcaloides extraídos, lo que va a permitir el desarrollo de nuevos antimicrobianos, ya que es
un aspecto de gran necesidad en la actualidad por el auge de la resistencia que muchos
microorganismos patógenos generan frente a los antimicrobianos ya altamente utilizados y
comercializados. Un caso relacionado con este aspecto es el de Staphylococcus aureus, el
cual era tratado con meticilina, pero generó resistencia a este antibiótico y ahora el 40% de
las infecciones en el Reino Unido y el 63% en Estados Unidos están dadas por cepas
resistentes a meticilina (15). Adicionalmente, se estima que anualmente el costo para tratar
las infecciones por microorganismos resistentes, reside entre 4-7 billones de dólares solo en
Estados Unidos (16).
PREGUNTA DE INVESTIGACION:
¿Son los alcaloides presentes en las hojas y peciolos de Siparuna sessiliflora, los
responsables de la actividad antibacteriana sobre Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Escherichia coli y/o Pseudomonas aeruginosa?
1. MARCO TEÓRICO
1.1 Uso de las plantas en la medicina tradicional
El uso de las plantas como fuente de medicamentos contra diversas enfermedades es una
tendencia que se ha repetido a lo largo de la historia de diversas culturas. A pesar del auge
de los medicamentos sintéticos y de la industria farmacéutica, el 25% de los medicamentos
prescritos en países industrializados, está basado en productos derivados de las plantas (17).
Tanto las hojas como los frutos se han usado en culturas antiguas en forma de baños
principalmente y también oliéndolas directamente, atribuyéndoseles así, propiedades
medicinales contra afecciones como inflamación de garganta y efectos revitalizantes de
cerebro y ojos (4).
Dado el conocimiento que se tiene sobre las propiedades medicinales de ciertas plantas, se
han desarrollado algunos estudios principalmente en el continente Europeo; sin embargo, es
necesario llevar a cabo mayores estudios en los países andinos puesto que son
principalmente estos los que poseen mayor diversidad y por ende mayor posibilidad de
encontrar sustancias útiles desde un punto de vista farmacológico (12). Además de esto, es
4
importante resaltar que la búsqueda de sustancias medicinales en plantas que
tradicionalmente fueron usadas en las culturas indígenas es una reivindicación de los
conocimientos de estos pueblos, y se sabe que dada la fragilidad de la tradicional oral y el
desinterés de los ciudadanos, progresivamente se ha perdido el conocimiento de los pueblos
indígenas (18).
1.2 Siparuna sessiliflora
El género Siparuna crece en zonas tropicales de América y consta de 70 especies. Su altura
varía entre 2,5m y 7m, presenta un olor característico a limón y un fruto rojo, carnoso con
muchas semillas. Las hojas son simples y opuestas, de forma ovalada, con vellosidades
(13).
La especie Siparuna sessiliflora se distribuye entre Colombia, Venezuela, Ecuador, Perú y
Brasil; desde los 50 hasta 1700msnm, sobre suelos franco arenosos (13). Para diferenciar la
especie, se toman en cuenta algunas características especiales de la planta como son la
presencia de placas de perforación escalariformes en el arbusto, una característica que
comparte con S. pauciflora es la presencia de tépalos perfectamente circulares y visibles en
la etapa de fructificación; además es diferenciable por el tamaño del grano de polen, el cual
varía entre 14.5 a 17µm, siendo menor al de otras especies. Las flores presentan una
superficie con densa pilosidad y sus cuatro estambres exteriores forman un tubo pues están
fusionados sus filamentos lateralmente (13).
1.3 Alcaloides
Los alcaloides son compuestos derivados de microorganismos, organismos marinos y
plantas. Son metabolitos secundarios con estructuras complejas nitrogenadas que han sido
usadas en medicina como agentes anticancerígenos, para combatir la malaria y como
analgésicos, entre otras enfermedades (19). Además de estas propiedades medicinales,
también se ha reportado la actividad antimicrobiana de los alcaloides, tanto para inhibición
de bacterias como de hongos, tal es el caso de los alcaloides harman, harmina, harmalina y
harmalol extraídos de Peganum harmala (20).
Además de su variedad en cuanto a actividad biológica, los alcaloides presentan elevada
diversidad estructural y diversos orígenes de acuerdo con su ruta de biogenésis (21). Una de
las clasificaciones más destacadas, es la de los alcaloides isoquinolínicos (figura 1), los
cuales se denominan así, por tener como base de su estructura, la isoquinolina, tal es el caso
de las isoidolobenzazepinas que a pesar de no tener isoquinolina se les considera
isoquinolínicos por su ruta biogenética (21).
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Figura 1. Estructuras de a) isoquinolina, b) tetrahidroisoquinolina
La ruta biogenética de los alcaloides isoquinolínicos inicia en el aminoácido aromático
tirosina, el cual sufre reacciones de hidroxilación y metilación sucesivas, culminando en un
derivado de la β-fenetilamina o en el anillo de tetrahidroisoquinolina –estado más común en
el que se encuentra la isoquinolina (22). Los alcaloides isoquinolínicos y bis-
bencilisooquinolínicos, han sido reportados como los metabolitos secundarios de mayor
actividad antibacteriana, en plantas superiores. Estos alcaloides han sido aislados de plantas
del género Siparuna, como S. arianae V. Pereira y S. tanduziana (7,10).
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
- Evaluar la actividad antibacteriana de los alcaloides extraídos a partir de hojas y
peciolos de Siparuna sessiliflora
2.2 Objetivos específicos
- Extraer los alcaloides de hojas y peciolos de S. sessiliflora
- Evaluar la actividad antibacteriana de los extractos obtenidos.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Recolección y preparación del material vegetal
La recolección del material vegetal se llevó a cabo en el municipio de Viotá,
Cundinamarca, en la Vereda Brasil (Sendero ambiental Mogambo), en donde se escogieron
para el presente trabajo, las hojas de una planta de cultivo, de espécimen macho. Para el
comienzo del proceso de extracción se realizó el secado del material, a temperatura
ambiente durante 7 días. Posteriormente se separaron las hojas de sus peciolos y se trituró
el material con un molino eléctrico de cuchillas.
6
3.2 Pruebas químicas para identificación de grupos de metabolitos en el material
vegetal
Un análisis preliminar del material vegetal obtenido permite una aproximación a la
identificación de las familias de metabolitos que se encuentran presentes en la muestra. Los
análisis químicos permiten una rápida visualización de la reacción obtenida al enfrentar la
muestra a un sustrato cromógeno determinado, o sustancias que producen precipitación;
dependiendo del grupo funcional a identificar (23).
3.2.1 Pruebas fitoquímicas preliminares
A partir de los extractos totales obtenidos de hojas y peciolos, se llevaron a cabo las
pruebas fitoquímicas preliminares, sugeridas por Bilbao mediante las cuales se puede
identificar el comportamiento químico al ser enfrentado a reactivos específicos
estandarizados que modifican los grupos funcionales de la muestra y permiten obtener un
conocimiento inicial sobre la composición del extracto (24). La caracterización se realiza
mediante la observación directa del cambio químico de la muestra; dado que las reacciones
que se producen causan cambios de color, producción de gas, espuma o precipitación (24).
3.2.2 Marcha analítica para alcaloides
Según el protocolo sugerido por Sanabria (25) para el análisis fitoquímico preliminar se
llevó a cabo el procedimiento específico para alcaloides descrito en el anexo I.
3.3 Extracción de los metabolitos totales
Para realizar la extracción de los alcaloides, se llevó a cabo una maceración en frío con
agitación constante, a partir de 312 g de hojas trituradas, así como de 80 g de peciolos. La
maceración se realizó usando como solvente cloroformo, para obtener los metabolitos de
baja y mediana polaridad. La extracción se llevó a cabo de forma exhaustiva, filtrando y
cambiando el solvente cada 48 horas, hasta encontrar un resultado negativo (ausencia de
alcaloides). El extracto se concentró por rotoevaporación del solvente; este procedimiento
se realizó en 7 ocasiones para obtener el extracto clorofórmico total (HC para hojas y PC
para peciolos). Se repitió el procedimiento utilizando como solvente etanol, para obtener
los extractos totales en este solvente (HE para hojas y PE para peciolos).
Finalmente, se determinó el porcentaje de rendimiento del proceso de extracción para cada
uno de los solventes empleados (ver ecuación 1).
)1(Ecuación100x)g(vegetalmaterialPeso
)g(extractoPesoientodimnRe%
7
3.4 Extracción de los alcaloides
La extracción de los alcaloides, a partir de los extractos crudos (HC, PC, HE y PC), se llevó
a cabo utilizando el procedimiento sugerido por Ticona (26). Cada extracto crudo por
separado, se disolvió en 100mL de diclorometano y se agregó 100mL de HCl 1N, agitando
constantemente por 30 minutos. En un embudo de separación se separó la fase ácida. Se
repitió el proceso hasta obtener resultados negativos para la fase ácida con el reactivo de
Dragendorff; es decir, hasta haber extraído todos los alcaloides en la solución ácida.
Posteriormente, la fase ácida se neutralizó con NaOH 1N hasta pH 7 y se extrajo con 20mL
de diclorometano aplicando agitación continua por 30 minutos; este proceso se repitió 5
veces. Se separó la fase orgánica y se concentró en un rotoevaporador. Basándose en el
peso del extracto conseguido, se calculó el porcentaje de rendimiento del proceso,
siguiendo la ecuación 1.
3.5 Ensayos microbiológicos
Se realizó la prueba de actividad antibacteriana a los extractos totales (HC, PC, HE y PE) y
a los extractos alcaloidales obtenidos según el numeral 3.4 (HC Alk, PC Alk, HE Alk y PE
Alk) en cloroformo y etanol, tanto de hojas como de peciolos.
3.5.1 Pruebas de difusión en agar
Para evaluar la actividad antibacteriana, se puso a prueba la difusión del extracto, mediante
el uso de dos técnicas: método de difusión por pozo y por sensidiscos, ambos en 20mL de
agar Mueller Hinton; con el fin de determinar el mejor método para observar inhibición de
crecimiento bacteriano.
Para el método de difusión por pozo, se procedió a hacer una perforación al agar con una
pipeta Pasteur que luego se selló con 10µL de agar agua. Posteriormente, se agregó una
muestra de extracto, probando concentraciones de 5mg/mL, 10mg/mL y 20mg/mL, y se
varió el volumen de inoculo, 10µL, 30µL y 50µL. Por otra parte, el método de sensidiscos,
se realizó usando discos de papel Whatman N°4 de 6mm de diámetro, en los cuales, se
evaluaron las mismas concentraciones y volúmenes del método de pozo. Se midió la
difusión del extracto, además de evaluarse las características del halo producido, con el fin
de determinar el método más adecuado. Las mediciones de los halos de difusión, se
llevaron a cabo a las 16 horas de incubación a 35°C.
3.5.2 Determinación de la actividad antibacteriana
Se realizó un cultivo masivo, a partir de colonias aisladas de los microorganismos Gram
positivos Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 6638, y como
bacterias Gram negativas Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC
9027; bacterias suministradas por el cepario de la Pontificia Universidad Javeriana y
seleccionadas por ser microorganismos patógenos humanos o causantes de intoxicación
8
como B. subtilis. Además, estas cepas son referenciadas por la CLSI (Clinical Laboratory
Standards Institute) en la revisión anual de la sensibilidad de antibióticos comerciales
(CLSI) (27). Se llevó a cabo la elaboración de un banco de trabajo, de las cuatro cepas
bacterianas, mediante crioconservación de los microorganismos en medio líquido tripticasa
soja (TSB, Scharlau), suplementado con glicerol al 20%.
Las concentraciones de los extractos evaluadas fueron de 5 mg/mL, 10 mg/mL y 20
mg/mL; estas concentraciones se seleccionaron según estudios previos realizados sobre S.
conica y S. guianensis (14), y se utilizó 10µL como volumen del extracto. Como control
positivo se utilizó 30µg de cloranfenicol (OXOID) y como control negativo de inhibición
se usó dimetil sulfóxido (DMSO), con el cual se solubilizaron los extractos crudos y
alcaloides. Las mediciones de los halos de inhibición (en milímetros), se llevaron a cabo a
las 16 horas de incubación a 35°C. Todas las pruebas se realizaron por cuadruplicado.
3.6 Identificación de los alcaloides por Cromatografía de Gases acoplada a
Espectrometría de Masas (GC-MS)
Con el fin de hacer una aproximación a la identificación de los compuestos presentes en el
extracto de alcaloides, se utilizó el cromatógrafo de gases acoplado a espectrometría de
masas de la Pontificia Universidad Javeriana. Mediante esta técnica se puede conseguir
identificar y realizar una cuantificación de los compuestos volátiles y semivolátiles
presentes en una mezcla dada (28). El equipo, consta de un cromatógrafo de gases: Agilent
Technologies 6850 series II y está acoplado a detector selectivo de masas Agilent MSD
5975B, con puerto de inyección Split/splitess (260 ºC, relación de Split 15:1) y un inyector
automático Agilent 6850 series. Usando una columna capilar de sílice fundida, HP-5MS de
30 m X 0,25 mm (di) X 0,25 µm (df), con una fase estacionaria 5% polidimetilsiloxano. Se
programó el horno, a una temperatura inicial de 80°C (1min), para luego incrementarse
hasta 320°C (2min) @ 10°C/min. La ionización se realizó mediante impacto de electrones
(EI) a una energía de 70eV. La cámara de ionización y la línea de transferencia, tuvieron
una temperatura de 230°C y 285°C respectivamente; se usó helio (99,995%, Aga Fano
S.A.) como gas de arrastre, con un flujo constante de 1ml/min. Los espectros de masas y
corrientes iónicas reconstruidas (TIC) fueron adquiridos usando un analizador cuadrupolar,
por medio de barrido automático de frecuencia (full scan) a 4,75 scan s-1, en el rango de
masas m/z 20-300 uma. Los espectros de masas obtenidos se compararon con los de las
librerías Willey 7 y Nist05, con el fin de llegar a su identificación.
3.7 Análisis Estadístico
Los resultados experimentales de halos de inhibición bacteriana fueron comparados
mediante la aplicación de ANOVA, usando el programa PASW Stadistics 18. Valores de
p≤ 0,05 se consideraron como significativos.
9
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Al realizar la extracción total y la posterior separación de los alcaloides, se pudo determinar
el porcentaje de rendimiento de las extracciones (según la ecuación 1); obteniendo los
siguientes resultados independientes tanto para cada órgano, como para cada solvente
utilizado. Los porcentajes de rendimiento obtenidos se encuentran consignados en la tabla
1.
Tabla1. Porcentaje de rendimiento de las extracciones totales y las extracciones alcaloidales hojas y
de peciolos, de S. sessiliflora, a partir de 312,2 g de hojas y 80 g de peciolos.
Extracto Convención Porcentaje de
Rendimiento (%)
Hojas en cloroformo HC 8,55
Peciolos en cloroformo PC 3,05
Hojas en etanol HE 2,86
Peciolos en etanol PE 1,09
Alcaloides hojas en cloroformo HC Alk 0,06
Alcaloides de peciolos en cloroformo PC Alk 0,31
Alcaloides de hojas en etanol HE Alk 0,02
Alcaloides de peciolos en etanol PE Alk 0,44
Se puede observar que el porcentaje de rendimiento de los extractos totales clorofórmicos
es más elevado que los etanólicos. Esto se puede deber a una menor cantidad de
metabolitos de alta polaridad. Teniendo en cuenta que todos los extractos presentaron
actividad contra las cuatro cepas evaluadas, se pueden comparar los porcentajes de
rendimiento de la metodología aplicada con la biodirigida de Padilla (14), quien sólo
obtuvo actividad inicial contra B. subtilis, lo cual comprueba que las metodologías
biodirigidas pueden despreciar algunos metabolitos que resultan de interés o con potencial
actividad biológica.
4.1 Pruebas fitoquímicas preliminares
Los resultados de las pruebas fitoquímicas preliminares de los extractos crudos obtenidos se
encuentran en la tabla 2.
Tabla 2. Pruebas fitoquímicas preliminares, realizadas a los cuatro extractos totales
Prueba Compuesto que identifica
Extracto
HC PC HE PE
Lieberman –
Bourchard
Esteroides y esteroles + + + +
Salkowski Terpenos + + - -
Bajlet Terpenos y esteroles + + + +
10
Prueba Compuesto que identifica
Extracto
HC PC HE PE
Hidroxamato férrico Sesquiterpenlactonas - - + -
Shinoda Flavonoides y fenoles + + + +
Cloruro férrico Flavonoides y fenoles + - + -
Antrona Glicósidos de flavonoides o de
terpenos
+ + + +
Drangendorff Alcaloides + + + +
Espuma Saponinas - - + -
De los resultados de la tabla 2 se puede observar la variedad de compuestos que presentan
las hojas de S. sessiliflora. Los resultados positivos de la prueba de Salkowski, para los
extractos de cloroformo; se deben a que los terpenos por ser lípidos son solubles en
solventes apolares; de ahí que no se encuentren en el extracto etanólico. La prueba de
cloruro férrico, fue la única que entregó resultados opuestos entre los extractos de hojas y
los peciolos, siendo positivo solamente en los extractos provenientes de hojas, indicando
diferenciación de tejidos posiblemente por el metabolismo de la planta o una baja
concentración de los flavonoides o fenoles en los peciolos.
4.2 Marcha analítica para alcaloides
A partir del filtrado A (Ver Anexo 1) se llevó a cabo la marcha analítica para alcaloides con
el fin de obtener información sobre los alcaloides presentes en las hojas de S. sessiliflora.
Los resultados se encuentran en la tabla 2.
Tabla 2. Resultados marcha analítica para los extractos alcaloides.
Reactivo I
Dragendorff
Reactivo II
Mayer
Reactivo III
Valser
Reactivo IV
Reineckato de
Amonio
Marco 1 +++ +++ +++ -
Marco 2 +++ +++ +++ -
Marco 3 ++ +++ +++ -
Marco 4 + + + +
Marco 5 + + + -
Marco 6 - - - -
**Nota: Las convenciones de la tabla 2 (Marco 1 a 6) se explican en el Anexo I
(+++) Precipitación abundante o coloración intensa, (++) Precipitación regular o coloración claramente observable, (+) Precipitado escaso o coloración débil, (-) Reacción negativa (Sanabria )
(+) Reacción positiva, (-) Reacción negativa
11
Los resultados expresados en la tabla 2 permiten afirmar que los alcaloides que presentan
las hojas de S. sessilflora son solubles tanto en cloroformo como en una mezcla de
cloroformo-etanol (3:2), solventes de baja a mediana polaridad; esto implica presencia de
alcaloides de mediana y baja polaridad como los de naturaleza indólica (29). Además,
según los resultados hay presencia de alcaloides fenólicos (25). No se encontró presencia de
alcaloides de polaridad alta, los cuales debían ser evidenciados en el marco 6, pues es
donde se encuentran los alcaloides más polares que corresponden a alcaloides de amonio
cuarternario u óxidos de aminas (25, 29).
4.3 Pruebas de difusión de extractos en agar
Al llevar a cabo las pruebas de difusión en el medio Mueller Hinton se pudieron analizar las
diferencias entre los métodos de difusión. Por una parte, el método de pozo presenta mayor
manipulación sobre el medio, lo cual puede derivar en contaminación, mientras que el
método de discos no implica mayor manipulación por lo tanto permite tener mayor
confianza en la prueba realizada en relación a esterilidad.
La difusión en el medio se mostró más homogénea en el caso de los discos, esto debido a
que el pozo puede causar rompimiento en el agar y por ende una difusión errónea de la
muestra a probar, generando interferencia en la lectura de los halos de inhibición. El
volumen óptimo para la técnica de pozo fue de 10µL de agar agua para sellar pozo y 30 µL
de muestra. En contraste a la técnica de disco en la cual 10 µL de muestra fue lo apropiado,
para permitir una buena absorción de la muestra en el disco. Fue buena la difusión del
extracto por la técnica de sensidisco para las tres concentraciones analizadas, con halos de
difusión de valores similares a los encontrados en la técnica de pozo, descartando retención
del extracto por las características de polaridad y mostrando las buenas características del
medio utilizado para este tipo de pruebas (30). Por las razones dadas, se optó por la técnica
de sensidiscos para las pruebas de actividad antibacteriana.
4.4 Determinación de actividad antibacteriana
En las gráficas 1 a 4 se encuentran los resultados de inhibición bacteriana evaluando los
cuatro extractos totales (HC, HE, PC y PE) y los cuatro extractos alcaloidales (HC Alk, HE
Alk, PC Alk y PE Alk) contra las bacterias P. aeruginosa (Pa), E. coli (Ec), S. aureus (Sa)
y B. subtilis (Bs). El resultado de control negativo, llevado a cabo con dimetil sulfóxido,
fue cero (0) mm de inhibición, para cada bacteria evaluada. En cuanto al valor de control
positivo (Cloranfenicol 30µg, discos comerciales OXOID), se encontró inhibición para P.
aeruginosa (4,8mm), E. coli (15,4mm), S. aureus (25,7mm) y B. subtilis (21,8mm). Y en el
anexo 3 se encuentran imágenes de los valores más altos de inhibición
12
Gráfica 1. Halos de inhibición en milímetros de los extractos totales y alcaloidales de hojas
en cloroformo
Gráfica 2. Halos de inhibición en milímetros de los extractos totales y alcaloidales de
peciolos en cloroformo.
13
Gráfica 3. Halos de inhibición en milímetros de los extractos totales y alcaloidales de hojas
en etanol
Gráfica 4. Halos de inhibición en milímetros de los extractos totales y alcaloidales de
peciolos en etanol
**Nota: las letras en minúscula (a – i) corresponden a los resultados de la distribución estadística de Duncan
después de aplicar el programa PASW Stadistics 18; letras iguales significan que no hay diferencias
estadísticamente significativas entre los tratamientos.
Los resultados muestran que las mayores diferencias se dan en las concentraciones de
20mg/mL, que fue la mayor concentración evaluada, mientras que en las otras dos
14
concentraciones evaluadas (5mg/mL y 10mg/mL) las diferencias estadísticas no son
altamente significativas. Esto permite conocer que los halos de inhibición se ven
potenciados claramente a una alta concentración y si se deseara utilizar alguno de los
extractos buscando inhibición bacteriana, se justifica utilizar las concentraciones más
elevadas (considerando que no existe toxicidad).
Como se observa en las graficas 1-4, se puede inferir que excepto casos puntuales, los
extractos totales y alcaloidales presentaron mayor actividad inhibitoria contra las cepas
Gram positivas (S. aureus y B. subtilis) al compararse con las Gram negativas (E. coli y P.
aeruginosa); esto puede deberse a la baja permeabilidad que presenta la pared de células
bacterianas Gram negativas hacia compuestos antibacterianos por su membrana externa
(15, 31). Entre los mecanismos por los que una sustancia puede inhibir el crecimiento de
algunas cepas bacterianas se encuentra el cambio de polaridad que altera la resistencia de la
pared celular, inhibición de síntesis de ADN, ARN y proteínas (15, 31). Por otro lado, el
ligamiento de ciertas drogas a receptores de membrana celular varían el funcionamiento de
enzimas vitales para la supervivencia de la bacteria (15, 31). A su vez, se ha encontrado que
la inhibición es posible que esté dada por acumulación de las sustancias antibacterianas
sobre la pared celular, dada por unión a receptores celulares, causando perturbación en la
capa bilipídica y cambios en la fluidez de la membrana citoplasmática; pero en el caso de
las bacterias Gram negativas, debido a su baja permeabilidad, los compuestos no se
acumulan fácilmente (15, 31).
Las cepas bacterianas Gram negativas,se han adaptado a los antibióticos con mayor rapidez
que las Gram positivas, puesto que disponen de mecanismos como la modificación
enzimática de antibióticos, principalmente por las β-lactamasas de espectro extendido y las
enzimas modificadoras de aminoglucósidos. También son capaces de desechar el
antibiótico una vez llega al espacio periplásmico mediante bombas de expulsión. Además,
pueden cambiar la permeabilidad de la membrana externa, modificando las porinas, y por
último, alterando los sitios de unión, aunque este es un método más usado por bacterias
Gram positivas (32,33). Dados estos mecanismos de protección de las bacterias Gram
negativas, este grupo de bacterias se convierte en microorganismos frecuentemente
resistentes a antibióticos comerciales, así como también a extractos naturales; sin embargo,
existen reportes de inhibición de Gram negativas. Por ejemplo, se ha reportado actividad
antimicrobiana de Gram negativas con un extracto acuoso de Solanum carolinense y el
alcaloide Canthin-6-ona, aislado de Zanthoxylum elephantiasis, del cual se reportó
actividad inhibitoria contra bacterias Gram positivas y Gram negativas (34). En S.
sessiliflora, Padilla en el 2010 encontró actividad inhibitoria de los alcaloides contra Gram
positivos y leve actividad contra E. coli, lo cual concuerda con lo encontrado en el presente
estudio (14).
4.5 Identificación de los extractos por GC-MS
Los resultados, de la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS),
de los 8 extractos; se encuentran en la tabla 3, (ver anexo 2), donde se pueden observar los
principales compuestos separados e identificados mediante dicha técnica.
15
La inhibición de crecimiento de las bacterias E. coli, B. subtilis y en menor medida P.
aeruginosa, que provocó el extracto total de hojas en cloroformo (HC) observada en la
gráfica 1, se puede explicar dada la presencia de estigmasterol en la muestra. El
estigmasterol, es un esterol del cual se ha reportado actividad antibacteriana, tanto contra
bacterias Gram positivas, como bacterias Gram negativas (35); dada esta característica es
probablemente que el factor causante de inhibición; a pesar de no ser confirmada su
identificación, puede estar actuando de forma sinérgica con otros compuestos. Otro posible
agente causante de la inhibición, es la calicotomina, un alcaloide basado en la
tetrahidroisoquinolina, reportado como agente inhibitorio con buena actividad contra E.
coli, además de presentar actividad contra otras Gram negativas y Gram positivas (36,37).
A pesar, que no se llega a un buen nivel de identificación de los metabolitos causantes de
inhibición en este extracto; se deben considerar los mencionados, dado que es un extracto
total, y por ende contiene una gran mezcla de sustancias adicionales. Se observa que la
inhibición de P. aeruginosa, fue mayor en el extracto total, a comparación del alcaloidal;
esto insinúa que el agente activo contra esta bacteria no es un alcaloide, puesto que no
permaneció en el extracto de alcaloides. Es importante la búsqueda de ese posible agente
inhibitorio de P. aeruginosa, puesto que cada vez toma más importancia en hospitales, por
su adquisición de genes de resistencia (33, 38).
El extracto alcaloidal de hojas en cloroformo (HC Alk), presenta como compuestos
mayoritarios la mezcla de talicarpina y Corlumina, o un derivado de éstos, pues no los
identifica completamente. La talicarpina, es un alcaloide de la familia isoquinolinica (tiene
en su estructura la tetrahidroisoquinolina), del cual se reporta actividad antitumoral, es
hipotensor y presenta inhibición bacteriana (39, 40); pero no presenta demasiados estudios
al respecto; sin embargo es el compuesto más abundante en el extracto de alcaloides HC,
por lo que se puede pensar que es el mayor principio activo. El alcaloide talicarpina, ya ha
sido aislado de plantas de la familia Monimiaceae (10), familia a la que era asociada el
género Siparuna, hasta la separación a familia Siparunaceae. Se encontró otro compuesto
con la estructura isoquinolínica que fue el 7-metil-6,7,7a,8,tetrahidro,5H,benzo[g][1,3]
dioxolo[4',5':4,5]benzo [1,2,3-de]quinolin-8-ol; del cual posiblemente se deba parte de la
actividad biológica del extracto, dadas las características de los alcaloides isoquinolínicos
(40). En el extracto HC Alk se evidenció la mayor actividad inhibitoria contra E. coli (halo
de 6,7 mm para la concentración de 20mg/ml), y fue en este extracto donde se encontró
ajmalina, el cual es un alcaloide indólico, que ha sido reportado asociado a plantas
medicinales y se conoce por reducir las posibilidades de hipertensión (41); pero del cual no
se ha profundizado en una posible actividad antimicrobiana, por lo que es necesario realizar
un estudio adicional que evalúe la capacidad de este alcaloide para la inhibición de
microorganismos. El alcaloide N-metillaurotetanina, también fue identificado, pero en baja
concentración, este es un alcaloide aporfínico, también encontrado en S. arianae V.Pereira,
S. griseo-flavescens Perk, S. pauciflora A.DC., S. tonduziana Perk (10). Es importante
aislar el alcaloide, que tiene la mayor actividad contra E. coli, para evaluar su actividad de
forma aislada y verificar su potencial; puesto que en el extracto alcaloidal, se encuentra
junto a otras sustancias que pueden reducir su eficacia; a pesar de la posible reducción de
inhibición, el resultado es bueno al compararse con el control positivo.
La gráfica 2, correspondiente al extracto PC, muestra la mayor actividad para B. subtilis y
S. aureus, en la mayor concentración (20mg/ml); estos resultados se entienden al ver en la
16
identificación de metabolitos, del extracto total PC, la presencia en alta abundancia del
estigmasterol, del cual ya se mencionó su efecto antibacteriano (35). Al identificar los
metabolitos, era de esperarse presencia de esteroles como el estigmasterol, dados los
resultados de la prueba de Lieberman Burchard (24).
En cuanto al extracto PC Alk, se encontraron 4 alcaloides, dos no completamente
identificados: Corlumina y coridina; también se encontraron los alcaloides N-
metillaurotetanina y la liriodenina. La coridina es, un alcaloide del cual se ha referenciado
actividad biológica antiparasitaria y contra la malaria (42). En estudios previos, se había
encontrado actividad citotóxica de este alcaloide (43) y una leve actividad antibacteriana
contra B. subtilis y Mycobacterium phlei (44); dos cepas Gram positivas; en el presente
trabajo, los extractos que presentaron coridina (HC Alk, PC Alk y PE Alk), tuvieron buena
actividad antimicrobiana contra E. coli y B. subtilis. En el extracto alcaloidal de peciolos en
cloroformo, las mayores abundancias las presentan la corlumina (no identificado
plenamente), y el principal es la liriodenina, el cual es referenciado como un alcaloide con
bioactividad antileishmania y actividad antimalárica (42), y se ha encontrado que tiene
actividad mutagénica contra Salmonella typhimurium, además de actividad citotóxica, se
observó leve actividad antimicrobiana contra cepas Gram positivas y resistencia de cepas
Gram negativas (44), resultado que concuerda con la actividad de los extractos PC Alk, HC
Alk y PE Alk, en los cuales se encontró el alcaloide sin embargo, en el presente trabajo, E.
coli sí presentó inhibición. La presencia de liriodenina en el género Siparuna, ya había sido
aislada de las especies Siparuna guianensis, S. gilgiana, S. tanduziana, S. thecaphora, S.
nicaraguensis y S. apiosyce (7-11).
En la gráfica 3, se puede observar que los valores de inhibición para el extracto total HE,
son bajos, y en los casos de las cepas Gram negativas los máximos valores de inhibición,
no son significativos, frente a los extractos totales de cloroformo; esto posiblemente esté
mediado por la ausencia de estigmasterol, a comparación de los extractos totales HC y PC.
Sin embargo, se encontró nuevamente la corlumina y se confirma la presencia de 7-metil-
6,7,7a,8,tetrahidro,5H,benzo[g][1,3] dioxolo[4',5':4,5] benzo [1,2,3-de]quinolin-8-ol (un
alcaloide isoquinolínico) ; y como se mencionó antes, solo hay actividad inhibitoria clara en
Gram positivas. La composición de este extracto total, se encontró dada mayoritariamente
por ácidos grasos. El extracto alcaloidal HE, mostró buena abundancia de un compuesto
isoquinolínico, sin identificar completamente, siendo este el componente mayoritario, y
posiblemente el causante de la inhibición de las cuatro bacterias. En este extracto
alcaloidal, también se encontró liriodenina en buena abundancia, igual que en el extracto
PC Alk, y se pueden observar pequeñas diferencias en la inhibición sobre las bacterias, en
la prueba con concentración de 20mg/mL; por lo que posiblemente este compuesto sea uno
de los responsables de la actividad biológica.
En el extracto total de peciolos, extraídos con etanol (PE); se encontró asimilobina, un
alcaloide que ya se ha reportado presente en el género Siparuna, específicamente en S.
apiosyce (45), S. griseo-flvavescens Perk. y en S. tonduziana Perk.(14); además se confirma
su presencia en S.sessiliflora, según el trabajo de Padilla (14). Este alcaloide también había
sido obtenido a partir de la corteza de Polyalthia insignis, utilizando como solvente etanol
(46), así como en el trabajo de Padilla (14); por lo que sugiere que el alcaloide tiene un
17
carácter polar, y por ende una búsqueda de éste alcaloide debería hacerse con solventes de
tipo polar como el etanol. Como se observa en la gráfica 4, la inhibición de la bacteria E.
coli, presenta valores sin diferencias estadísticamente significativas, para las
concentraciones de 10 y 20 mg/ml; por lo es posible que la sustancia que tiene actividad
contra dicha bacteria es un alcaloide, al mantenerse el resultado de inhibición; sin embargo,
en la cromatografía de gases de los alcaloides de este extracto alcaloidal, la asimilobina no
es reconocida posiblemente por estar en baja concentración. Una vez más, están presentes
la Norglaucina, así como la calicotomina y la liriodenina; estas dos últimas, se encuentran
en gran abundancia, por lo que posiblemente el efecto de inhibición sobre E. coli sea dado
por alguno de estos dos compuestos, sobre todo teniendo en cuenta la capacidad
mutagénica de la liriodenina sobre cepas Gram negativas (44), y que la Norglaucina no
tiene estudios a profundiad sobre su inhibición bacteriana. La Norglaucina, es un alcaloide
que se ha aislado de otras plantas de la familia Monimiaceae (10). También se debe
mencionar la presencia de otro alcaloide tetrahidroisoquinolínico: la papaverolina, a pesar
que no se identificó con satisfacción.
Es necesario, llevar a cabo un aislamiento de los distintos metabolitos detectados por el
cromatógrafo, con el fin de determinar el agente causante de la inhibición bacteriana o si es
el caso, la mezcla de sustancias pues como se sabe algunas sustancias presentan sinergismo
con antibióticos (47) y también con algunos extractos de plantas, en los que la mezcla de
compuestos puede tener actividad inhibitoria, en tanto que sus compuestos aislados no
presentan un agente inhibitorio (48).
La mayoría de los alcaloides, exceptuando los de amonio cuaternario y óxidos de aminas
(los cuales según la marcha analítica no se presentan en la muestra analizada); son extraídos
con solventes de carácter apolar, como es el cloroformo; por ende, era de esperarse, mayor
identificación de alcaloides en los extractos alcaloidales en cloroformo, que los de etanol,
como se puede observar en la tabla 3 (Anexo 2); y por ende también, una tendencia a mayor
actividad inhibitoria con los extractos de alcaloides en cloroformo (HC Alk y PC Alk),
como sucedió en la mayoría de pruebas. En los casos en que no se dio dicha tendencia, se
puede pensar en metabolitos distintos a los alcaloides y/o un sinergismo entre compuestos.
Finalmente, se confirma la presencia de alcaloides de la familia isoquinolínica, como ya se
ha referenciado previamente (10,14), encontrándose ocho alcaloides de este tipo,
identificados por GC-MS, además de dos tipo indólico y la presencia de alcaloides
quinolínicos que no fueron identificados. La riqueza natural que poseen las hojas y peciolos
de la planta S. sessiliflora, queda claramente evidenciada, al no solamente encontrar
alcaloides, sino también algunas sustancias con posible acción inhibitoria. Sin embargo, se
muestra que el método de extracción es eficiente para esta planta y estudios posteriores,
pueden partir desde esta premisa.
18
5. CONCLUSIONES
Este estudio permitió ampliar el conocimiento del contenido de alcaloide y otros
metabolitos de S. sessiliflora.
Se confirmó la presencia de alcaloides isoquinolínicos en todos los extractos
alcaloidales obtenidos y su potencial como agentes antimicrobianos.
La metodología empleada no muestra elevado porcentaje de rendimiento en cuanto
a los alcaloides, sin embargo resulta eficaz comparada con el fraccionamiento con
solventes a partir del extracto total etanólico.
Las cepas Gram positivas mostraron ser más sensibles que las Gram negativas a
los extractos evaluados, inclusive a bajas concentraciones. En cuanto a la actividad
inhibitoria contra E. coli y P. aeruginosa, se confirmó la actividad sobre E. coli y
se muestra la posibilidad de la presencia de un agente antibacteriano de amplio
espectro.
6. RECOMENDACIONES
Dado el potencial de inhibición que presenta la planta es necesario llevar a cabo un
estudio fitoquímico a profundidad en la especie.
Evaluar otros potenciales usos que tenga esta especie puesto que diversas sustancias
identificadas se conocen por su utilidad en terapia medicinal o actividad contra la
malaria.
Se deben aislar cada uno de los alcaloides y analizarlos por resonancia magnética
nuclear (RMN) para obtener una caracterización de los mismos y evaluar su
actividad por separado.
Es necesario aislar cada uno de los alcaloides y realizar su caracterización con el fin
de comprobar la existencia de los mismos y otros de tipo indólico, además de
evaluar su actividad antibacteriana.
19
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