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TEMA 3. Algunas aplicaciones de la biotecnología genética a la biotecnología alimentaria

1- Diagnóstico de patologías hereditarias con repercusión sobre lacantidad o calidad de los productos

2- Detección de genes con influencia en la cantidad o calidad de los productos

3- Identificación genética individual, racial o específica

4- Detección de microorganismos en alimentos

5- Detección de transgénicos

OMIA (Online Mendelian Inheritance in Animals) :Base de datos de genes y enfermedades hereditarias en

137 especies animales

1. DIAGNÓSTICO DE PATOLOGÍAS HEREDITARIAS

Total Caracteres

567 408 298 223 205 202 188 72 59 593 2815

Caracteresmendelianos

204 119 66 37 88 79 81 11 21 117 773

Caracteres Mendelianos(mutación conocida)

150 70 37 15 24 25 28 8 7 52 416

Potenciales modelos caracteres humanos

268 137 151 75 104 75 40 29 38 255 1172

DOG VACA GATO CERDO CABALLO OVEJA POLLO CABRA CONEJO OTROS TOTAL

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Malignant hyperthermia (Phene ID 1193, Group 000621) in Sus scrofa

Possible human homologue (MIM number) 145600 180901 Symbol PSSCross Species SummaryMalignant hyperthermia. A progressive increase in body temperature, muscle rigidity and metabolic acidosis, leading to rapid death.SummaryIn pigs, malignant hyperthermia (MH) leads to rapid post-mortem changes in muscle, resulting in pale softexudative (PSE) meat. MH can be triggered by a minor stress, such as loading, transport, sexual intercourse, high ambient temperature, or exposure to the anaesthetic halothane. Susceptibility tohalothane-induced MH is an autosomal recessive trait in pigs. Together, sudden death syndrome and PSE constitute porcine stress syndrome (PSS), which became a major economic problem in many countries in the 1970s. In part, this was due to strong selection for increased leanness, which is associated withsusceptibility to PSS. In 1991, a major breakthrough occurred when a Canadian research team led by David MacLennan (Fujii et al., 1991) showed that MH is due to a base substitution (C-T) in the 1843rd nucleotide of the gene for the calcium release channel in the sarcoplasmic reticulum of skeletalmuscle. The base substitution causes an amino-acid substitution (arginine - cysteine) in the 615th positionof the calcium release channel, resulting in altered calcium flow. A PCR genotyping test based on thecausative mutation has been used extensively in many countries, leading to the elimination of the mutationfrom many herds.

Species Specific Name Porcine Stress SyndromeGenetic TestVarious PCR genotyping tests have been devised, all based on detection of an RFLP resulting from thecausative base substitution.Single Locus yesCharacterised at a molecular level Yes

SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)

El Síndrome Estrés Porcino (PSS) es una enfermedad hereditaria, quepresenta un modelo de herencia recesiva

SINTOMAS

TaquicardiaRigidez muscular

Aumento progresivo de la temperatura corporalMuerte

LESIONES

Hipertrofia muscularEdema pulmonar

CARNES PSE (pale, soft, exhudative)- palidas, blandas y exhudativas-

CARNES DFD (dark, firm, dry) – dura, seca y oscura

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mayormenorDurezareducidareducidaConservación

bajaaltaPérdida de líquidoselevadabajaCapacidad de enlace de agua

densa, pegajosablandaConsistenciaoscurapálidaColor

>6,2 (también pH)< 5,8Valor pH

Lentamente y parcialmuy rápidoGlucólisis, descenso pH

Carne DFDCarne PSECaracterística

CARACTERÍSTICAS CARNES EN ANIMALES CON PSS

DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)

Mutación en el gen de RYR-l: Receptor de la ryanodina- Gen para la liberación del calcio en el músculo esquelético -

Sustitución C-T en el nucleótido 1843

Sustitución arginina–cisteina en al posición 615

C/C: Individuos sanos y no portadoresC/T: Individuos sanos y portadores

T/T: Individuos enfermos

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DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO PCR/RFLPs

Alelo C

PCR199bp

Alelo T 165bp 34bp

BsiHKA I

199bp

Existen genes que determinan el sexo y que tiene una secuencia distinta en

machos o en hembrasImportante determinar el sexo del embrión para los

programas MOET = ovulación múltiple y transferencia de embriones, pero también el origen de determinados

productos en los que la características y el valor economicopueden variar según el sexo

2- Detección de genes con influencia en la cantidad o calidad de los productos

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GENES RELACIONADOS CON LA GRASA

DAGT 1 en vacuno: tiene una gran influencia en la

cantidad de grasa en la leche

G G A A

grasa en la leche

Grasa en la leche

SI ANALIZAMOS EL ADN DE LOS INDIVIDUOS PODREMOS SELECCIONAR DIRECTAMENTE POR EL

GENOTIPO

Más genes interesantes…

HAY OTROS GENES DE INTERES RELACIONADOS CON CARACTERES PRODUCTIVOS

K-Caseína - mayor rendimiento en la producción de queso

IGF2 – Desarrollo muscular y depósitos grasos

RYR 1 – Desarrollo muscular e hipertermia maligna Síndrome de estrés porcino (SSP)

PRKAG 3 – Aumenta la cantidad de glucógeno del músculo en un 70% y el desarrollo muscular

MIOSTATINA –Hipertrofia muscular o doble musculatura

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GEN DE LA MIOSTATINAPERDIDA DE FUNCIÓN DEL GEN GENERA UN FENOTIPO

SIMILAR EN LAS TRES ESPECIES DE MAMÍFEROSHipertrofia muscular

“ CULONES “

Fotografías obtenidas de Genomeresearch (Womack, 2005)

- mayor rendimiento a la canal- mayor proporción de músculo - menor proporción de hueso - mucha menor proporción de grasa

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AUTENTIFICACIÓN

3. IDENTIFICACIÓN GENÉTICA

TRAZABILIDAD

En ambos casos se trata de utilizar los marcadores del DNA con diferentes propósitos:

1.- Identificación individuos en diferentes etapas del proceso productivo (de la granja a la mesa)- Verificación de otros sistemas de identificación- Sistema trazabilidad

2.- Identificación de origen genético (raza). Verificación denominaciones de origen o marcas de calidad

3.- Identificación de especies. Identificación de especies en mezclas o sustituciones

Seguridad alimentaria

Crisis de las vacas locas, listeriosis, dioxinas, etc

PREOCUPACIÓN CRECIENTE ENTRE LOS CONSUMIDORES

OBLIGATORIEDAD DE ESTABLECIMIENTO DE UN SISTEMA DE TRAZABILIDAD

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¿ Qué significa TRAZABILIDAD ?

“Establecimiento de un sistema que permitaidentificar un animal y poder llevar a cabo el

seguimiento de sus movimientos a lo largo de todasu vida desde el nacimiento hasta la llegada de

su carne hasta el consumidor”

Sistema de trazabilidad genéticaSistema basado en el análisis del ADN

FUNDAMENTO: Los animales presentan diferencias en su ADN, a excepción de los gemelos monocigóticos o los

clones.

Como media, 1 de cada 1000 bases del ADN (de los 3.000.000.000) es diferente entre animalesSISTEMA FIABLE Y REPETIBLELa información genética contenida en las

células es igual en todas las partes del cuerpo del animal y no varía con el tiempo

Marcadores utilizados :

MICROSATÉLITES

SNPs

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IDENTIFICACIÓN DE ORIGEN RACIAL

CONTROL DE CALIDAD Ejemplo: productos derivados de cerdo ibérico(UTILIZACIÓN DE MARCADORES ESPECÍFICOS DE RAZA)

ANÁLISIS DE LOS GENES MC1R Y Pink PCR/RFLPs

MC1R- Receptor de la melanocortina 1

Pink

Genes que determinan el color de la capa

MC1R y Pink presentan alelos fijados en la raza Duroc que no aparecen en poblaciones de cerdo ibérico

Datos obtenidos de Fernández et al 2003

> Demanda de productos de calidad

IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES

Autentificación

Fraudeseconómicos

Razones filosóficasy religiosas

Cuestiones legales

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C/Pt Pt O Pv Pll C Pt

Identificación de especies mediante RAPDsAplicable a la detección de fraudes en patés

Identificación de especies mediante RAPDs

310 pb290 pb

750 pb

340 pb

Caprino Ovino Bovino

Aplicable a carne o a quesos

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Identificación de especie mediante amplificación de fragmento específico de porcino

( Patente LAGENBIO- Universidad de Zaragoza )

b o cp cv pll pv pt e -

Muestras sanguíneas de diferentes especies- solamente se amplifica en cerdo

Pietrain Chato Murciano Landrace Large White

AMPLIFICACIÓN DEL FRAGMENTO ESPECÍFICO DE CERDO EN DIFERENTES RAZAS

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Cuantificación

1% 5% 10% 25% 50% 75% 100%

Nos permite demostrar no solo que hay presencia de cerdo, sino en que proporción en una mezcla.

CASO PRACTICO.Identificación de especies por sustitución

•Denuncia de venta de cordero en lugar de cabrito en Navidad 08•Utilización de RAPDs•Recepción en el laboratorio: muestra de carne

Cabra 1 Cabra 2Muestraproblema

Muestraproblema Oveja 1 Oveja 2 vaca

SOLUCIÓN: LA MUESTRA PROBLEMA ES CORDERO Y NO CABRITO

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4.- DETECCIÓN DE MICRORGANISMOS EN ALIMENTOS

-Imprescindible en la Seguridad alimentaria

- En los Estados Unidos se dan aproximadamente 76 millones de casos de intoxicación alimentaria (26.000 casos por cada 100.000 habitantes),5 de los que:350.000 son hospitalizados (111 por 100.000 hab.) 5.000 mueren (1,7 por 100.000 hab.)

- Salmonella , Listeria , Toxoplasma, Campilobacter, E.coli O157 son los agentes màs frecuentes en las infecciones causadas por alimentos

Tests genéticos aplicados a la detección de microorganismos

- Se aplica la técnica de PCR

- Se basa en la identificación de un fragmento de DNA específico del microrganismo contaminante

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Bacterias en alimentos pueden ocasionar grandes pérdidas económicas

• Deterioran los alimentos

• Origina enfermedades en consumidores por su dificultad de eliminación

VENTAJAS

1.Sensibilidad 2.Especificidad 3.Capacidad de procesamiento de gran número de muestras

Detección rápida de bacterias productoras de exopolisacáridos del tipo beta-glucano. El uso de este método podría permitir la prevención del ahilamiento de bebidas alcohólicas en el que están implicados estos polisacáridos (especialmente la sidra).

Detección gen gtf mediante PCR

DENTRO DEL PRIMER GRUPO (deterioran los alimentos):

DENTRO DEL SEGUNDO GRUPO (causan enfermedades)

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Microrganismos Trastorno Posible producto Métodoque ocasiona portador

Acrobacter spp

Bacillus cereus

Campilobacter spp

Clostridium botulinum

Clostridium perfringens

E.Coli

Listeria spp

Salmonella spp

Shigella spp

Vibrio cholera

Yersinia enterocolitica

Diarrea

Diarrea, vómitos

Diarrea

Botulismo, vómitos

Diarrea, dolor abd.

Diarrea, colitis

Listeriosis

Gastroenteritis

Fiebre , calambres

Cólera

Yersiniosis

Carne de aves

Arroz, prod. LacteosY cárnicos

Aves, cerdo , res y Leche cruda

Pescado, miel, latas

Carne de res y aves,Salsas

Carne y productosLácteos

Pate, leche, queso, carneMariscos, ensalada de col

Leche, huevo crudo, carnede res y ave

Mayonesa, vegetales crudosLeche y aves

Ostras crudas, pescado

Leche, tofu, canales de cerdo

RAPD-PCR

PCR

PCR múltiple

PCR anidado

PCR duplex

PCR múltipleRT- PCRPCR-múltipleRT- PCRRT- PCR

PCR simple

RT- PCR

RT- PCR

EXISTEN KITS COMERCIALES

BAX (Qualicom, USA) Salmonella

Listeria

E.Coli O157:H7

PROBELIA (Sanofi, France) Salmonella

Listeria

TAQMAN (Perkin Elmer, USA) Salmonella

Listeria

E.Coli O 157

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VENTAJAS DE LA TÉCNICA DE PCR EN LA DETECCIÓN DE PATÓGENOS

- Rapidez- Simplicidad (disponibilidad de Kitscomerciales)- Alta sensibilidad ( permite diferenciar

cepas)- PCR cuantitativo permite la cuantificación del nivel de patógenos

+ + + + + - -

Presencia de banda - Diagnóstico +Ausencia de banda - Diagnóstico -

PCR

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ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO

(Directiva 2001/18/CE)

Cualquier organismo, con excepción de los seres humanos, cuyo material genético ha sido

modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento ni en la

recombinación natural

5.- Detección de transgénicos

ETIQUETADO

-La UE “reconoce el derecho de los consumidores a la información y el etiquetado como herramienta para una elección responsable”

- La obligatoriedad del etiquetado se regula en los reglamentos 1829 y 1830 / 2003 del Reglamento Europeo y del Consejo de 22 de Septiembre de 2003

- El etiquetado indicando la presencia de un OMG es obligatorio en todos los casos y sin depender de la cantidad de OMG presente

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Creación de plantas transgénicas

Detección de transgénicos en una mezcla con una sensibilidad 0,1%

Aplicación a la verificación de etiquetas, seguimiento y detección de fraudes

Mediante técnica PCR

DETECCIÓN POR PCR DE MAÍZ TRANSGÉNICO