DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE KJELDAHL1a. OBJETIVO: Determinar, mediante el mtodo de Kjeldahl, el porcentaje de protena presente en una muestra biolgica. 2. FUNDAMENTO: El nitrgeno presente en los compuestos orgnicos se puede determinar mediante el mtodo de Kjeldahl, en un proceso que comprende tres pasos: digestin, destilacin y titulacin. DIGESTIN: El nitrgeno presente en una muestra biolgica se extrae al digerir la muestra con cido sulfrico concentrado, en presencia de un catalizador y con calentamiento fuerte. Este proceso se realiza en un baln Kjeldahl. El dixido de carbono que se produce se evapora o se disuelve en la solucin. N, C, H, O + H2S04 Muestra biolgica catalizador calor > C02 + H20 + NH4HSO4DESTILACIN: A la solucin anterior se le adiciona, dentro de un destilador especial - denominado destilador Kjeldahl- hidrxido de sodio concentrado, con lo cual se neutraliza el cido sulfrico residual y el sulfato cido de amonio (NH4HSO4) formado en la digestin se transforma en amoniaco: indicador NH4HSO4 + NaOH > NH3 + Na2S04 + 2 H20 Amoniaco El amoniaco se destila y se recibe en una solucin dbilmente acida (con cido brico) que, adems, contiene un indicador. Este indicador cambia de rosado, en medio cido, a azul, en medio bsico. El amoniaco con el agua forma hidrxido de amonio (NH4OH) que es alcalino y, por tanto, cambia el color del indicador y sirve para comprobar la presencia del amoniaco. TITULACIN: NH3 + HOH > NH4OHEl amoniaco liberado se puede titular con cido clorhdrico o con otro cido exactamente titulado:NH4OH + HC1 NH4CI + HjODebido a que el mtodo de Kjeldahl es sencillo, bastante exacto no requiere de un equipo sofisticado y los resultados son reproducibles, se utiliza comnmente para Simultneamente con el anterior es conveniente realizarbiolgicas. A partirun blanco, en determinar el nitrgeno presente en muestras todo el proceso con del contenido de el nitrgeno se puede calcular el porcentajemi de agua destilada, cual la muestra biolgica se reemplaza por 1 de protena. El clculo se basa en el hecho de que en una muestra animal o vegetal casi todo el nitrgeno presente se encuentra formando parte de las protenas. En las protenas el nitrgeno constituyeaproximadamente el 16 por ciento en peso: Protena = 100 6.25 Nitrgeno 16 O sea que multiplicando la cantidad de nitrgeno obtenido por 6.25 se obtiene la cantidad aproximada de protena presente en una muestra dada. 3. MATERIALES Y REACTIVOS: 1 baln Kjeldahl de 250 mi digestor Kjeldahl destilador Kjeldahl 1 erlenmeyer de 125 mi 1 bureta Muestra biolgica: harina de frjol, maiz, arveja, haba, cebada, etc. o 1 mi de leche, sangre, clara de huevo (la muestra trabajada para humedad y cenizas) Mezcla catalizadora. Hay diferentes formulaciones. ( 60 g de CuS04,100 g de K2S04 y 1 g de Selenio) Acido sulfrico concentrado Acido brico al 4 % NaOH al 40 % HC1 0.1 N Iindicador de Tashiro ( Este se prepara mezclando un volumen de rojo de metilo al 0.2% en etanol, con cinco volmenes de verde de bromocresol al 0.2 % en etanol)a. PROCEDIMIENTO: DIGESTIN: En un baln Kjeldahl de 250 mi, limpio y seco, agregue 200 mg de muestra biolgica slida (harina de frjol, maiz, etc.) o 1 mi de muestra lquida (leche, clara de huevo, etc), 1g de mezcla catalizadora y 5 ml de cido sulfrico concentrado. Procure que todos los reactivos lleguen al fondo del baln y no queden adheridos a las paredes. En caso de que queden adheridos, aydelos a rodar hasta el fondo con una pequea cantidad de agua destilada. Coloque el baln en el digestor y caliente suavemente durante quince minutos para evaporar el agua. Aumente la temperatura de tal forma que los vapores de cido sulfrico lleguen slo hasta la mitad del cuello del baln. Mantenga estas condiciones hasta que el contenido adquiera un tono verde amarillento (aproximadamente despus de 60 -120 minutos) y deje enfriar el baln al aire. Deposite el contenido en el baln de destilacin. Lave las paredes internas del baln Kjeldahl con unos 20 o 30 mi de agua destilada y agrguelo al baln de destilacin. DESTILACIN: Ponga a calentar el equipo de destilacin. Una vez caliente, agregue lentamente hidrxido de sodio al 40 % hasta que el contenido del baln adquiera un tono cafoscuro. En el extremo del condensador coloque un erlenmeyer de 125 mi con 20 ml de cido brico al 4 % y tres gotas de indicador de Tashiro. La punta del condensador debe estar bajo la superficie de la solucin de cido brico. Se3 contina el proceso hasta que la solucin de cido brico vire completamente a azul. Se deja pasar vapor durante cinco minutos ms, se saca la punta del condensador de tal manera que quede por encima de la superficie del lquido, se deja pasar vapor tres minutos ms, se cierra la llave de paso y se retira el erlenmeyer. TITULACIN: El destilado recogido sobre el cido brico se titula con cido clorhdrico 0.1 N hasta obtener una coloracin similar a la del cido brico original (rosado). Blanco: Se trabajo un baln para digestin y en lugar de muestra se coloca el equivalente en agua, realizando todas las partes del proceso que se realiza a la muestra.b. RESULTADOS: Determine el porcentaje de protena en la muestra biolgica utilizada. Compare este valor con el que se encuentra en la literatura. Para hallar el porcentaje de nitrgeno presente en la muestra se puede utilizar la siguiente frmula (dedzcala): % N = 1400 fVa - Vh). N /Pm Donde: Vm volumen de HCL, en mililitros, gastado en la titulacin de la muestra Vb volumen de HC1, en militros, gastado en la titulacin del blanco N = normalidad del cido clorhdrico peso de la muestra, en miligramos P= porcentaje de protena es igual a % N x 6.25TRABAJO DE INVESTIGACIN. Consulte cinco alimentos con sus caractersticas nutricionales, entre ellos tres de inters en su carrera, justifique su respuesta.