DETERMINACION DE CONSTITUYENTES VOLATILES LIBRES Y ...

Mady Carolina Garcia Vergara IQ-2003-2-08

DETERMINACION DE CONSTITUYENTES VOLATILES LIBRES Y ENLAZADOS GLICOSIDICAMENTE EN HOJAS DE GUAYABA PERA

(Psidium guajava L.)

MADY CAROLINA GARCIA VERGARA

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERIA

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA

SANTAFÉ DE BOGOTÁ, D.C.

2004


DETERMINACION DE CONSTITUYENTES VOLATILES LIBRES Y ENLAZADOS GLICOSIDICAMENTE EN HOJAS DE GUAYABA PERA

(Psidium guajava L.)

MADY CAROLINA GARCIA VERGARA

Proyecto de grado para optar al título de

Ingeniera Química.

Directora Clara E. Quijano

Química

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERIA

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA

BOGOTA, D.C.

2004


iv

Nota de aceptación

____________________

____________________

____________________

____________________ Profesor Asesor

____________________ Jurado

____________________ Jurado

Bogota, Febrero 2 de 2004


v

AGRADECIMIENTOS

La autora expresa sus agradecimientos a: Clara E. Quijano, Química y Directora de la Investigación, por sus valiosas orientaciones. Al CITEC y al CIMIC por su colaboración..


vi

CONTENIDO

pág.

INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 0 OBJETIVOS........................................................................................................ 1 1 COMPUESTOS VOLATILES ........................................................................... 2 1.1 GLICOSIDOS................................................................................................ 2 1.2 VOLATILES LIBRES................................................................................... 12 2 TÉCNICAS UTILIZADAS EN LA EXTRACCIÓN, SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE VOLÁTILES................................................................... 18 2.1 CROMATOGRAFÍA .................................................................................... 18 2.1.1 Cromatografía de gases........................................................................................... 19 2.2 ESPECTROMETRÍA DE MASAS ............................................................... 24 2.3 DESTILACIÓN EXTRACIÓN CON SOLVENTE ORGANICO (DES) ......... 25 3 A NIVEL INDUSTRIAL ................................................................................... 26 4 METODOLOGÍA ............................................................................................ 29 4.1 ENSAYOS PRELIMINARES ....................................................................... 29 4.2 EXTRACCIÓN DE GLICÓSIDOS ............................................................... 33 4.3 EXTRACCIÓN DE VOLÁTILES LIBRES..................................................... 38 5 COSTOS........................................................................................................ 40 6 RENDIMIENTO.............................................................................................. 41 6.1 AZÚCARES................................................................................................. 41


vii

6.2 CELULOSA................................................................................................. 42 7 CUANTIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN........................................................ 45 8 RESULTADOS............................................................................................... 47 9 CONCLUSIONES .......................................................................................... 51 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 55 ANEXOS.............................................................................................................59


viii

LISTA DE TABLAS

pág.

Tabla 1. Peso de los recipientes después de la liofilización. 41 Tabla 2. Composición de volátiles libres a pH= natural. 63 Tabla 3. Composición de volátiles libres a pH= 7. 65 Tabla 4. Composición de volátiles enlazados glicosídicamente. 66 Tabla 5. Composición total de volátiles libres y enlazados glicosídicamente. 67


ix

LISTA DE FIGURAS

pág.

Figura 1. Estructura de un N-glicósidos. 3 Figura 2. Estructura de un O-glicósidos. 3 Figura 3. Foto de la columna de un cromatografía. 21 Figura 4. Esquema de funcionamiento del detector de llama (FID). 21 Figura 5. Áreas del analito y estándar en el cromatograma. 23 Figura 6. Foto del Equipo de Destilación, Extracción con Solvente Orgánico DES. 25 Figura 7. Punto triple del CO2. 27 Figura 8. Diagrama de flujo de la extracción con fluido supercrítico. 27 Figura 9. Foto de un Equipo para extracción con fluido supercrítico. 28 Figura 10. Foto de la Centrífuga. 31 Figura 11. Esquema de un Soxhlet. 33 Figura 12. Foto del Rotavapor. 35 Figura 13. Embudo de decantación. 37 Figura 14. Cromatógrafo de gases con FID. 45 Figura 15. Distribución porcentual en peso de volátiles libres a pH = natural. 48 Figura 16. Distribución porcentual en peso de volátiles libres a pH = 7. 49 Figura 17. Distribución porcentual en peso de volátiles enlazados. 49


x

LISTA DE ANEXOS

pág.

Anexo A. Cromatógramas. 58 Anexo B. Tablas de resultados. 61


62

INTRODUCCIÓN El cultivo de guayaba en Colombia es el sustento de muchas familias

campesinas de Cundinamarca, Tolima, Santander, Costa Atlántica, Antioquia y

de otras zonas del país. Es un producto que se exporta a países como USA,

Alemania, Japón, Francia y Canadá en sus diversas presentaciones ya sea

como conserva, jugos y como la fruta en sí ya sea congelada o fresca y es a lo

largo de todo el año. Su producción anual en Colombia es de180000 ton/año

[29].

Es por esto que el estudio de ella, o de una de sus variedades, es de amplia

importancia ya que los resultados de esta investigación podrían representar un

ingreso nuevo a los cultivadores. Si se parte del hecho de que las hojas de la

fruta, materia prima para realizar esta investigación, son desperdicio, cualquier

provecho que se le pueda sacar es ganancia.


1

OBJETIVOS

GENERAL Determinación de constituyentes volátiles libres y enlazados

glicosídicamente en hojas de guayaba-pera (Psidium guajava L) mediante el

uso de técnicas cromatográficas.

ESPECIFICOS

Contribuir al conocimiento de la composición de volátiles libres a pH 7 y pH

natural.

Contribuir al conocimiento de la composición de enlazados glicosídicamente

en hojas.

Determinar la cantidad obtenida de volátiles libres, glicósidos y de volátiles

enlazados glicosídicamente.

Teóricamente estudiar otras técnicas como alternativa para ejecutar la

determinación de los volátiles y glicósidos a nivel industrial.


2

1 COMPUESTOS VOLÁTILES

1.1 GLICOSIDOS

Los glicósidos son azúcares no reductores. Igualmente ellos no presentan

rotación en la ausencia de ácido ni reaccionan con reactivos que ataquen el

grupo carbonilo ya que contienen un carbono anomérico bloqueado.

Un glucósido está formado por uno o varias unidades de azúcares unidos a

través de diferentes grupos hidroxilo mediante una unión O-glicosídica o N-

glicosídica. Especialmente unida al carbono anomérico se han encontrado otras

moléculas llamadas agliconas que se liberan mediante hidrólisis enzimática o

ácida [21].

Dependiendo del compuesto que enlace la aglicona con el azúcar se pueden

clasificar como N-glicósidos y O-glicósidos. En los alimentos las agliconas se

obtienen debido a cortes de estos o por condiciones ácidas. Los glucósidos son

obtenidos industrialmente como azúcares y los volátiles o compuestos

aromáticos son liberados por variaciones en el pH o por actividad enzimática a

T° altas. Los azúcares mas encontrados son principalmente glucosa, fructosa,


3

maltosa y lactosa por el lado del azúcar y algunas aminas para enlazados N-

glicosídicos [8].

Figura 1. Estructura de un N-glicósido.

Los O-glicósidos se encuentran en la naturaleza como glicolípidos,

glicoproteinas y glicósidos flavonoides en diversos alimentos. Estos son

fácilmente hidrolizables por ácidos iniciando con una protonación, eliminación

de alcohol y adición de agua.

Figura 2. Estructura de un O-glicósido.

O

HH

H

OHOH

H OH

H

OH

O

N

Azúcar

Aglicona

H

O

HH

H

OHOH

H OH

H

OH

O

O

Azúcar Aglicona


4

Los glicósidos son compuestos no volátiles los cuales por medio de una

hidrólisis, ya sea enzimática o ácida, generan volátiles. La generación de estos

volátiles se encuentra en la aglicona la cual puede ser un alcohol, ácido, fenol,

fenilpropanoides, norisoprenoides o hidroxiácidos entre otros.

Los glicósidos flavonoides o flavonoles han sido estudiados debido a su

hipotética importancia como factores protectivos en diferentes tipos de

enfermedades cardiacas y degenerativas. Ellos se encuentran en diversas

frutas y verduras y se encuentran en forma conjugada de aglicones como

quercetina, camferol y mircitina como propiedades como la reducción de la

agregación de plaquetas [3].

En las plantas se encuentra un tipo de glicósidos llamados glicósidos

cardiotónicos. Estos son derivados de esteroides cuya aglicona se una al

azúcar por uno de sus grupos hidroxilos ya sea del carbono 3 o 14. El azúcar

contiene entre 3 y 5 monosacáridos como la metilpentosa.

Se han encontrado en familias como la apocinácea, asclepiadácea, liliácea, y

morácea entre otras. La convalotoxina se ha encontrado en hojas y raíces de

Convallaria majalis y la digitoxina (f) en el látex del Antiaristoxicaria así como se

han encontrado en raíces, semillas, tallos y cada una de las partes de la planta

[3].


5

Acerca de estos precursores de aroma existen diversos estudios en frutas y

hojas. La enzima comúnmente utilizada en es una β-Glicosidasa ya que en la

naturaleza el tipo de enlace β es mucho mas común que el α1.

Estos compuestos comenzaron a estudiarse alrededor de 1913 por Bourquelot

y Bridel pero solo hasta la década del 60 con el desarrollo de técnicas

analíticas de gran sensibilidad los estudios comienzan a ser más confiables.

Algunas de ellas son la Cromatografía de Gases acoplada a la llama (CGAR-

FID) y la Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas

(CGAR-EM) que han causado una gran revolución como ayuda analítica a

procesos industriales2.

La Mentha aquatica L. es una planta que crece silvestremente en zonas

húmedas en muchas partes de Europa. Un investigación realizada, sobre una

especie de Croacia, acerca de sus constituyentes glicosídicos en Mayo del

2000 revela que sus agliconas volátiles significativas son 1-octen-3-ol (30.22

mg/kg), eugenol (10.21 mg/kg), 2-feniletanol (6.81 mg/kg), 3-hexen-1-ol (5.35

mg/kg), 1-hexanol (3.58 mg/kg) y 3-octanol (2.44 mg/kg), que son

principalmente alcoholes alifáticos y derivados de compuestos terpénicos y

fenilpropanonas. La presencia de aldehídos y cetonas había sido reportada

anteriormente por Stahl et al. Un total de 17 agliconas fueron identificados por

1 Tomado de: Kustrak, D., Mastelic, J., Milos, M. & Radonia, A., (1998). The Essential Oil and Glycosidically Bound Volatile Compounds of Calamintha nepeta (L) Savi. Croatia Chemica Acta, 71, 148. 2 Tomado de: http://www.ktf-split.hr/en/projekti/011003.htm


6

Jerkovic & Mastelic (2001) que corresponden a 50 mg/kg del material utilizado

[23].

Acerca de bayas verdes de la especie de Juniperus oxycedrus (L) que crecen

en la región central de Dalmatia se encontraron nueve aglicones volátiles

mayormente 3-fenil-2-propen-1-ol, eugenol y mirtenol que corresponden al

0.0004% del porcentaje en peso inicial. Los resultados de la investigación

fueron publicados en el año 2000, revelando que en maduras solo se

encontraron trazas de glicósidos. El estudio es de especial interés para la

industria alimentaria y farmacéutica debido al potencial uso de estos

compuestos como precursores de aroma y medicinas [28].

En un estudio realizado sobre la fresa (fragaria ananassa cv. Elsanta) se

identificaron 11 aglicones, principalmente ácidos y alcoholes. Groyne, Lognay

& Marlier (1999) encontraron que en el estado sobre madurado de la fruta se

encontraba el mayor numero de glicósidos ya que el estudio se realizó en cinco

etapas de maduración diferentes. La presencia de glicósidos solo se vio desde

la etapa madura en adelante. A la fecha de la publicación poco se conocía

acerca de la composición de glicósidos en la fresa a diferencia de la maracuyá,

uvas o mangos que han sido ampliamente estudiados y cuyas resultados serán

reportados a continuación. Sin embargo, algunos compuestos como el 2,5-

dimetil-4-hidroxi-3(2H)-furanona y el ácido-E-cinámico ya habían sido

identificados en otras especies de fresa [22].


7

De acuerdo al reporte sobre la identificación de glicósidos en la maracuyá,

hasta 1998 los compuestos glicosídicos habían sido identificados en 170

plantas pertenecientes a 50 familias. La presencia de estos en maracuyá

morada y amarilla había sido determinada a la fecha de la publicación, sin

embargo, la estructura de estos había sido poco estudiada. El estudio realizado

con los jugos de la pulpa de cuatro diferentes especies en estado de

maduración muestra que las principales agliconas son β-D-glucopiranósidas, α-

L-ramnopiranosil-β-D-glucopiranósido y α-L-arabinofuranosil-β-D-

glucopiranósido. (S)-linalool se encuentra presente sólo en la especie Passiflora

edulis y (6R,7E,9S)-3-Oxo-α-ionol y 4-Oxo-β-ionol en la especie Pasiflora

edulis y Pasiflora edulis flavicarpa [6].

En la misma publicación otro articulo trata sobre la identificación de glicósidos

nuevos como precursores del aroma en el azafrán. Si bien ya se habían

determinado 14 compuestos glicosídicos anteriormente, Bau, Ecstein et al.

advierten que las técnicas de separación influyen en los compuestos obtenidos

ya que durante la separación ocurren procesos oxidativos. Utilizando una

cromatografía en contracorriente de bobina multicapa (MLCCC) y HPLC

encontraron siete compuestos nuevos como el (4R)-4-hidroxi-2,6,6-

trimetilciclohex-1-encarboxaldehido O-β-D-gentiobiosido. La estructura de estos

compuestos se dedujo mediante el uso de resonancia magnética nuclear (NMR)

uni y bi-dimensional [4].


8

Sobre el mango se realizó un estudio en 1998 con cuatro especies de mango

diferentes, dos con semilla de origen poliembriónico y dos de origen

monoembriónico. En esta fruta tropical, segunda en producción a nivel mundial,

la cantidad de glicósidos encontradas fueron 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg y

2.1 mg/kg de la pulpa fresca de los cultivos de Amélie, Palmer, M´Bingue y Tete

de Chat respectivamente. Los glicósidos identificados eran principalmente

monoterpenoides, C13 norisoprenoides y ácidos como el palmítico y mirístico [5].

En un estudio previo llevado a cabo en 1997 sobre el mango africano se reportó

principalmente la glucosa como el constituyente de la parte el azúcar y la

arabinosa se encontró en cantidades significativas mientras solo se encontraron

trazas de ramnosa. Se encontraron ácidos grasos como el ácido mirístico y

esteárico entre las agliconas así como se identificaron 10 nuevos glicósidos

nunca antes encontrados en mango como el carvacrol y el p.cime.-7-ol [5][18].

En Enero de 1998 Kustrak et al. publicaron los resultados de un estudio nunca

antes realizado sobre Calamintha nepeta (L), una planta silvestre que crece en

la región Mediterránea. Se encontraron 18 compuestos en su mayoría alcoholes

alifáticos, compuestos terpénicos, derivados de acetofenona y fenilpropanonas

que correspondían al 0.00081% en peso del material seco utilizado para el

análisis. Los aglicones principales fueron alcohol benzílico, carveol, 3-octanol,

2-butanol y eugenol entre otros. Esta última ha sido encontrada como la

principal aglicona en diferentes plantas de la familia Lamiaceae [24].


9

Los resultados de un estudio realizado en el mismo mes y año sobre los conos

de Cupressus Sempervirens L., un árbol ampliamente distribuido en la cuenca

del mar Mediterráneo y cuyos componentes han sido utilizados en la industria

farmacéutica, revelan que las principales agliconas encontradas son la

timoquinona, carvacrol, 3-fenil-2-propen-1-ol, alcohol bencílico, mirtenol y 2-

feniletanol. El 95% de agliconas se liberaron por medio de una hidrólisis

enzimática con β-glucosidasa y el restante 5% por medio de una hidrólisis ácida

lo que revela que la mayoría de las agliconas estaban unidas a una unidad de

glucosa. Los autores recomiendan el uso de diferentes tipos de enzimas tales

como maltasa o α-L-ramnoidasa para estudiar en detalle este 5% de agliconas

restantes. Al comparar las agliconas encontradas en los conos del árbol con las

de las hojas del mismo encontraron mucha similaridad [25].

En 1997 año se llevo acabo una investigación similar sobre dos cultivos de

bananas, uno en las Islas Canarias en España y el otro en Costa Rica, donde

se identificaron 25 nuevas agliconas que se pueden clasificar biogenéticamente

en derivados del ácido shikimico y ácidos grasos. Si bien ya se habían realizado

este tipo de estudios, la biogénesis de estos compuestos no había sido

estudiada. De las agliconas los alcoholes más significativas son el decan-1-ol y

el 2-feniletanol mientras que entre los ácidos lo son el ácido 3-oxo-pentanoíco,

el 3-metilbutanoico y el ácido benzoico. La enzima comúnmente utilizada para

este tipo de estudios es la β-glucosidasa y la hidrólisis generalmente se hace

por 48 horas a 37°C, sin embargo en esta investigación se realizó además con


10

la pectinasa y se vario igualmente el tiempo de incubación. La pectinasa había

demostrado anteriormente en un estudio sobre las uvas su mayor eficiencia

sobre glicósidos monoterpénicos, sin embargo, los resultados de la

investigación demostraron que un mayor número de agliconas fueron

hidrolizadas al utilizar la β-glucosidasa en concordancia con la metodología

usual. Respecto al tiempo de incubación, en este caso 24 horas fueron

suficientes para la hidrólisis de los glicósidos. Los resultados indicaron un

mayor número de glicósidos en el cultivo de Costa Rica. Cert, Olias et al.

destacan que el estudio de glicósidos puede ser importante desde dos puntos

de vista como lo son la contribución al conocimiento de la biogénesis del flavor,

ya se ha demostrado que los glicósidos forman parte de este, y para predecir el

flavor de jugos y frutas [16].

El aroma de diversa especies de uvas, así como el de su jugo y vino ha sido

ampliamente analizado debido a su importancia en la comercialización de estos.

En especial, el estudio de los glicósidos como precursores aromáticos “ocultos”

ha venido siendo estudiado desde hace ya algún tiempo en diferentes tipos de

cultivos empleado diferentes técnicas de extracción así como diferentes tipos de

solventes. En un estudio realizado por Gunata, Bayonove, Baumes &

Cordonnier se reportó la presencia de alcoholes aromáticos y de terpenos como

agliconas en 15 variedades de uvas diferentes. Las uvas de la variedad Muscat

presentaban la mayor cantidad de compuestos terpénicos siendo estas las que

producían los vinos más aromáticos. Estos terpenos son geraniol, linalool, nerol


11

y α-terpinol. Las especies que no eran del genero Muscat presentaban mayores

cantidades de alcoholes aromáticos como el benzil y el 2-feniletil. Se llegó a la

conclusión que el origen de estos alcoholes esta relacionado con el proceso de

fermentación ya que en los niveles en vinos son mayores que en la fruta [1] [2]

[7] [11] [30].

En otro estudio realizado sobre el aroma del jugo de la uva Muscat en

especifico se logro identificar el furanol, una gran cantidad de 2-feniletanol y de

monoterpenos en la forma glicosídica siendo el furanol el de mayor intensidad

aromática como un aroma dulce. Igualmente se hallaron hidroxi esteres,

terpenos y alcoholes en forma glicosídica. Se hace enfatiza en el p-Vinilguaicol

ya que es un aroma indeseable con bajo umbral olfativo que se encontraba en

cantidades significativas en forma enlazada contribuyendo este en forma

desfavorable al aroma del jugo [2].

Incluso otro estudio realizado específicamente en el mesocarpio y la piel de las

uvas Muscat en una cosecha en California revela que el 90% de los

monoterpenos se encontraban en la forma de glicósidos, de estos el 31% se

encontraba en la piel y el restante en el mesocarpio. El articulo resalta que para

obtener la máxima intensidad de aroma posible es necesario controlar factores

como: la recolección de la cosecha cuando se encuentre la mayor

concentración de terpenos, obtener el mayor contacto de de la piel con el


12

mesocarpio y finalmente hidrolizando enzimaticamente los terpenos enlazados

[1].

La lista podría seguir extendiéndose reportando los resultados de diversas

investigaciones. Sin embargo, se pretendía mostrar el auge que el estudio de

los glicósidos esta teniendo debido a su importancia como precursores de

aroma y en el campo medicinal si se emplean las técnicas de hidrólisis

adecuadas.

1.2 VOLATILES LIBRES

El aroma se divide en aroma primario y aroma secundario. El aroma primario se

refiere a los volátiles libres que caracterizan un aroma cualquiera. Los volátiles

libres son los compuestos que se encuentran en la naturaleza de forma natural

como por ejemplo el olor a verde es caracterizado por el hexanal, el de

caramelo por compuestos furánicos, el olor a cebolla por compuestos azufrados

y el olor floral por diversos esteres, entre otros. Estos compuestos son de

mucha importancia para la industria de la perfumería, pesticidas, fragancia,

flavor y alimentaria.

En las hojas cortadas de tres diferentes especies de Eucalyptus se identificaron

30 compuestos otros 30 tentativamente identificados y otros 60 no identificados


13

que correspondían a menos del 1% del área total utilizando una técnica de HS-

SPME acoplada con cromatografía de gases y espectrometría de masas de 30

minutos de extracción a 30ºC. El estudio resalta que es mejor manejar estas

temperaturas ya que los compuestos terpénicos sufren transformaciones con

altas temperaturas. Este estudio sirve de complemento con otros realizados con

las hojas en sí, con otras partes del árbol y con diferentes técnicas ya que por lo

general siempre se obtienen diferentes resultados. Se hace un análisis

interesante acerca de los volátiles de hojas verdes (green leaf volatiles o GLV)

que son los que se liberan tan pronto hay una disrupción celular y se empiezan

a dar los procesos enzimáticos. Se demuestra que la concentración de estos

varía durante el tiempo de la extracción. Se identificaron compuestos en las tres

especies como el α-pinen0, limoneno, terpinoleno, β-pineno y p-cimeno entre

otros [15].

En otro estudio realizado en Psidium salutare (H.B.K.), ó guayabita del pinar,

una fruta verde del tamaño de un olivo que crece en el oeste de Cuba se

identificaron 150 compuestos volátiles por medio de una destilación con vapor

simultanea con extracción con solvente a pH neutro. Esto último se realizó con

el fin de que los compuestos terpénicos no sufrieran transformaciones con el

pH= natural de la fruta. Esta fruta es utilizada para la fabricación de un licor

bastante aromático por lo cual los resultados de la investigación resultan ser

interesantes. Se identificaron mono y sesqui terpenos, diversos alcoholes,

cetonas y esteres alifáticos siendo los terpenos los que se encontraron en


14

mayor cantidad como el limoneno que corresponde al 17.3% del total de los

volátiles, el mirceno que corresponde al 16.2% y el α-pineno que corresponde

al 9.3% [9].

Acerca de la especie Psidium se han venido realizando estudios desde la

década de los sesenta3. Para ser mas precisos de la Psidium guajava L., guava

o guayaba. En un estudio publicado en 1999 en la revista Colombiana de

Química se muestran los resultados de un estudio sobre los volátiles de dos

variedades de guayaba colombiana. Se analizaron las variedades de Palmira-

ICA-1 o guayaba pera y la Glum Sali o guayaba manzana. Se identificaron 30

hidrocarburos para ambas especies de los cuales el limoneno sólo se encontró

en la guayaba pera siendo éste muy importante para el aroma. Luego le siguen

en concentración los ésteres para la guayaba pera y los aldehídos para la

guayaba manzana con un 23.5% y 25% respectivamente del extracto total. En

concentraciones mas bajas se encuentran alcoholes, compuestos furánicos y

ácidos [29].

En un estudio realizada anteriormente por Nishimura et al. (1989) se habían

analizado unos cultivos de la isla Amami, Japón y un puré enlatado del sur de

África de guayaba. Se identificaron 122 compuestos en total principalmente

hexanal correspondiendo al 8% de una especie de pulpa blanca y 34% de una 3 Tomado de: Mihara, S., Nishimura, O., Shibamoto, T. & Yamaguchi, K., (1989). Volatile Constituents of Guava Fruits (Psidium guajava L.) and Canned Puree. Journal of Agricultural and Food Science. 37, (1), 139-142.


15

especie de pulpa rosada de la isla. Además se identificaron 17 cetonas como la

acetona o la 3-pentanona, 31 alcoholes como el acetoína hallado, por primera

vez en la guayaba y el hexanol presente en las tres muestras, 10 ácidos como

el acético, isopentanóico y benzoico, 28 ésteres, 10 hidrocarburos y 13 diversos

compuestos. Los autores afirman que el compuesto que hace que el flavor sea

diferente para las frutas es el 6-mercaptohexanol que se encontraba en mayor

cantidad en la pulpa blanca que la rosada [27].

Sobre la feijoa o Pineapple guava también se han realizado estudios. De los 85

compuestos identificados, 47 no habían sido reportados anteriormente. La

motivación de esta investigación fue la hipótesis de que el aroma de la fruta

atraía a ciertos insectos mostrando un aporte mas de este tipo de investigación.

El 53% de los volátiles corresponden a sesquiterpenos con un total de 23 de los

29 hidrocarburos. Alcoholes como el linalool, viridiflorol y globulol se encuentran

en grandes cantidades [10].

Sobre la Eruca sativa, una hoja utilizada para ensaladas, salsas y vegetales al

vapor se realizó un estudio para identificar sus compuestos aromáticos

identificando mas de 50 de los cuales los isocianatos y los derivados de butano,

hexano, octano y nonano se clasificaron como lo compuestos de impacto de

aroma. Estos quiere decir que estos necesitan de una baja concentración para

producir un aroma intenso. El estudio se realizó sobre una especie cultivada en

Austria. Perfumeros profesionales evaluaron las muestras por medio de la


16

olfatometría identificando su olor como verde, levemente floral-frutal, levemente

como almendra y levemente graso en el fondo. También se dijo que el olor iba

dirigido en la dirección de la col, brócoli y mostaza. El aroma a verde es

producido por el hexanal, trans-2-hexenal y cis-3-hexen-1-ol entre otros. El

aroma floral-frutal se le atribuyen al limoneno, acetofenona, nonanal, decanol,

β-citronelol y undecanal. El aroma herbal al hexanol, tran-2-hexenal, heptan-3-

ol, 3-octanol y alcohol bencílico, entre otros. El aroma a almendra es producto

del furfural, benzaldehido, 3-octanol, acetofenona, dodecanol y benzoato de

bencilo. El aroma Brasisaceae (mostaza, brócoli) se relaciona con la

tetrahidrotiofeno, 4-metiltiobutil y el 5-metiltiopentil isocianato, entre otros. El

aroma a grasa es producto del hexanal, ácido hexanóico, octanal, trans,trans-

2,4-heptadienal y ácido octonóico, entre otros. En total 54 compuestos fueron

identificados en las hojas y pasta de las hojas [14].

En un estudio realizado en el departamento de alimentos y tecnología de

Dinamarca se identificaron volátiles en Pisum sativum L. o arveja verde. El

estudio se realizó con el fin de mejorar el flavor de estas. Para ello se

identificaron 47 compuestos, la influencia del tamaño y genotipo y las

evaluaciones realizadas por cuatro jueces. Principalmente se hallaron aldehídos

de seis carbonos saturados y monoinsaturados, cetonas, alcoholes y ésteres.

Se aislaron monoterpenos como α y β-pineno, mirceno y limoneno. Además se

hallaron compuestos azufrados en las arvejas que habían tenido tratamiento

térmico durante el blanqueamiento que se les hace. En cuanto a la influencia


17

del tamaño se observó que el contenido de hexanal decrecía proporcionalmente

al tamaño en algunos selecciones. Los evaluadores concluyeron que el aroma

era una roma verde fuerte producido por la concentración de hexanal, dulce por

el acetato de hexilo, naranja dulce por el octanal y fuertemente como hongo por

el 1-octen-3-ona [16].

Acerca del té Roselle se hizo una extracción y análisis con cuatro muestras

diferentes: sin tratar, congeladas, secadas con aire a 50ºC y secadas con aire a

75ºC. Los resultados se clasificaron en cuatro grupos. En el primer grupo, del

aroma verde o de los derivados de ácidos grasos se encuentran los alcoholes y

aldehídos alifáticos como el hexanol diferente en cada muestra. En el grupo dos

o de los derivados de azúcar se observaron grandes cantidades de furfural en

las muestras secas mientras que las húmedas no contenían en grandes

proporciones. En el grupo tres de los derivados fenólicos se observó la

presencia de eugenol en las cuatro muestras mientras que el grupo cuatro, los

compuestos terpénicos, se hallaron el limoneno, linalool y α-terpinol entre otros

[19].

Además de estos estudios se han realizado muchos más en diversas frutas [20]

y hojas e incluso vinos [30], ya que el aroma de éste es de suma importancia

para la industria y su comercio.


18

2 TÉCNICAS UTILIZADAS EN LA EXTRACCIÓN, SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE VOLÁTILES

2.1 CROMATOGRAFÍA4

La cromatografía es una técnica que consiste en la transferencia de un soluto

de una fase estacionaria a una fase móvil para obtener una separación. La fase

móvil puede ser un líquido o un gas mientras que la estacionaria es un líquido

viscoso que recubre el interior de la columna o son partículas sólidas

empacadas en la columna.

Dependiendo del tipo interacción entre el soluto y la fase estacionaria se hace

una clasificación de cromatografía: Cromatografía de adsorción, cromatografía

de partición, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de exclusión

molecular y cromatografía de afinidad.

La cromatografía utilizada en este trabajo es la cromatografía de adsorción. En

esta se tiene una fase estacionaria sólida y una fase móvil liquida o gaseosa. La

4 Tomado de : Harris, D. C. (1999) Quantitative Chemical Analysis (5ta Ed.) New York, EE.UU.: W. H. Freeman and Company. 481.


19

separación se obtiene al llegar ambas fases al equilibrio. El analito es adsorbido

directamente por partículas sólidas en la fase estacionaria.

Un cromatograma se utiliza para mostrar la respuesta de un detector como

función del tiempo de elusión, tiempo que demora la fase móvil en pasar por la

columna. De un cromatograma se puede determinar el tiempo de retención de

cada compuesto analizado.

Los factores que influyen en la eficiencia de separación son los tiempos de

elusión entre picos del cromatograma y el ancho de los picos, entre más ancho

peor la separación.

2.1.1 Cromatografía de gases

La cromatografía de gases es una técnica en donde el analito en forma gaseosa

se transporta a través de la columna por una fase móvil llamada el gas potador.

El líquido volátil es inyectado a un puerto donde se caliente y es parcialmente

evaporado. Este vapor es transportado a través del gas portador por la

columna del horno y los analitos ya separados fluyen a través de un detector

que muestra la respuesta en un computador.


20

El gas portador influye en el desempeño del detector. Los gases comúnmente

utilizados son el Hidrógeno, Helio y Nitrógeno. El Hidrógeno y Helio dan una

mejor resolución que el Nitrógeno a altos flujos mientras que éste ofrece una

mejor resolución a bajos flujos. El H2 es un buen gas portador si se requiere de

rapidez y eficiencia, sin embargo, no se debe utilizar con un espectrómetro de

masas. El N2 no se utiliza en columnas abiertas para alta resolución. Las

impurezas en estos gases degradan la fase estacionaria por lo cual gases de

alta pureza y calidad deben ser utilizados.

Existen diferentes tipos de detectores entre los cuales se encuentran el detector

de conductividad térmica usado para columnas empacadas y para columnas

abiertas con un diámetro de 0.53 mm o mayor, el detector de ionización de

llama utilizado en columnas abiertas y empacadas para la detección de

hidrocarburos en general, el detector de captura de electrones para la detección

de halógenos, nitrilos, compuestos nitro y órgano metálicos, el detector de

fósforo-nitrógeno sensitivo a compuestos que contienen fósforo y nitrógeno, el

detector fotométrico de llama para analitos que contienen fósforo, azufre, lata y

otros compuestos selectivos y el detector de fotoionización, entre otros, utilizado

para detectar compuestos insaturados y aromáticos.


21

Tomado de: http://orgchem.colorado.edu/hndbksupport/GC/GC.html

Figura 3. Foto de la columna de un cromatógrafo de gases.

El utilizado en este caso es el detector de ionización de llama. Este tipo de

detector es ampliamente utilizado en cromatografía de columnas empacadas y

en capilares abiertos. En este tipo de detector la elusión se quema en una

mezcla de Hidrógeno y aire. Los átomos de carbono producen radicales CH que

producen iones CHO+ en la llama. Los cationes producidos en la llama llevan

una corriente eléctrica del ánodo al colector de cationes la cual es la señal que

recibe el detector.

Tomado de www.synspec.nl/FID.htm

Figura 4. Esquema de funcionamiento del detector de llama (FID).


22

En un cromatógrafo de gases es necesario hacer una programación de

temperatura para incrementar la presión de vapor del soluto teniendo en cuenta

que esta no puede ser tan alta como para descomponer los análitos.

Hoy en día los cromatógrafos vienen equipados para controlar la presión del

gas portador. Al incrementar la presión de este gas a la entrada aumenta el flujo

de la fase móvil y por ende disminuye el tiempo de retención. En muchos casos

se programa la presión en vez de la temperatura

El índice de retención es una medida que relaciona el tiempo de retención de un

soluto al tiempo de retención de los alcanos lineales. El índice de retención de

Kovats es el de un alcano lineal y es igual a 100 veces se su número de

carbonos.

Índice de retención = Ik =

−

−−+

)(log)(log)(´log)(log

)(100 ´´

´

ntNtntodesconocidtnNn

rr

rr

Donde N es el número de carbonos del alcano mas grande, t´r(n) es el tiempo

de retención ajustado al alcano menor y t´r(N) es el tiempo de retención

ajustado al alcano mayor.


23

2.1.1.1 Método del patrón interno

Un patrón interno se adiciona al desconocido y su señal es comparada con el

analito para cuantificarlo. En la cromatografía, donde los flujos no varían mucho,

la respuesta relativa del detector del analito y el estándar es constante sobre

una gama amplia de condiciones.

Figura 5. Áreas del analito y estándar en el cromatograma.

Cada área de cada pico del cromatograma es proporcional a la concentración

de las especies inyectadas. Si S es el estándar interno, X el analito y F el factor

de respuesta:

[ ] [ ]

==

=

SA

FXA

darciondelesConcxnetradarñaldelesAreadelaseF

itoiondelanalConcentracitoñaldelanalAreadelase sx

tantan


24

de donde se conoce As, Ax, F y S.

2.2 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

En este tipo de espectrometría las moléculas son ionizadas, aceleradas por un

campo eléctrico y separadas de acuerdo a sus masas. El espectro de masas

muestra la abundancia relativa de las moléculas. La ordenada del espectro es la

masa del ión dividido por el número de cargas que carga mientras que la abcisa

es la abundancia relativa.

Después de pasar por el cromatógrafo de gases la elusión va directamente al

espectrómetro de masas que almacena la corriente total de los iones de

diferentes masas. Cada pico tiene su propio espectro el cual es comparado con

una librería espectral.


25

2.3 DESTILACIÓN EXTRACIÓN CON SOLVENTE ORGANICO (DES)

Esta técnica fue desarollada por Flath y Forrey [20]. Consiste en una fase

acuosa y una fase orgánica que se volatilizan. Luego estas se condensan y

coeluyen y por efecto sifón cada fase cae a su respectivo balón. La fase

orgánica, rica en los compuestos volátiles es la que se recoge.

Figura 6. Foto del Equipo de Destilación Extracción con Solvente Orgánico (DES).


26

3 A NIVEL INDUSTRIAL

La extracción de volátiles se puede realizar a nivel industrial por medio de

diferentes técnicas tales como micro extracción de espacio de cabeza en fase

sólida (HS-SPME), extracción con fluido supercrítico, diferentes variaciones de

destilación y extracción con solvente [15]. En la destilación se manejan altas

temperaturas y al igual que la extracción con solventes son procesos que

consumen tiempo. La micro extracción de espacio de cabeza en fase sólida es

una técnica relativamente nueva, bastante simple y de alta confiabilidad y se

utiliza tanto para hojas secas como hojas frescas manejando una temperatura

media y corto tiempo.

A continuación se explicará el funcionamiento de la extracción de compuestos

por medio de la técnica de fluido supercrítico.

La extracción con fluido supercrítico es una técnica en donde se controla la

temperatura y presión llegando al punto crítico y obteniendo un fluido


27

despresurizar el compuesto de interés se precipita y se recolecta. El fluido se

condensa y se reutiliza o es venteado a la atmósfera.

Tomado de: http://www.iq.uva.es/dep/invest/hpp/extracti.html#inicio

Figura 7. Punto triple del CO2.

El CO2 es el fluido supercrítico mas utilizado ya que además de ser económico,

tiene una temperatura crítica baja , es amigable con la atmósfera, no es tóxico

ni inflamable y se consigue con gran pureza.

Tomado de: http://www.nateco2.com/html/basics.htm

Figura 8. Diagrama de flujo de la extracción con fluido supercrítico.


28

Esta técnica ha venido siendo cada vez más utilizada debido a que las

extracciones son de alta pureza y se obtienen con buena concentración, a

diferencia de otras técnicas, donde se obtienen compuestos muy diluidos. Una

ventaja que presenta es la no se utilización de solvente, permitiendo que los

daños ambientales disminuyan. Además tiene aplicación en muchas áreas tales

como la industria farmacéutica, cosmética, alimentaria y hasta en tintorería. La

extracción con fluido supercrítico, incluso se ha utilizado para eliminar la cafeína

de ciertos productos.

Tomado de: Tomado de: http://www.edenlabs.net/equip.htm

Figura 9. Foto de un equipo para extracción con fluido supercrítico.


29

4 METODOLOGÍA

Para hacer la extracción de los glicósidos fue necesario dejar secando las

hojas, previamente separadas de los tallos, limpiadas, cortadas y maceradas,

por un tiempo aproximado de un mes a temperatura ambiente. Todas las hojas

con las que se trabaja en esta tesis se recolectaron en una finca en Flandes,

Tolima donde existen cultivos de esta fruta. La recolecta se realizó cuando las

frutas se encontraban en estado de maduración y listas para ser consumidas ya

que en esta etapa es cuando hay mayor número de glicósidos.

A pesar de que la teoría nos confirma que todas las plantas contienen

glicósidos se llevaron a cabo ensayos preliminares para corroborar esto.

4.1 ENSAYOS PRELIMINARES

Lo primero que se realizó fue la preparación de un buffer de fosfatos a pH = 7

para preparar una solución estable con las hojas. El buffer se utilizó con la

ayuda de la página web www.bi.umist.ac.uk/users/mjfrbn/buffer/makebuf.asp y

los reactivos necesarios se pesaron en una balanza analítica OHAUS la cual se

utilizó para hacer todas las . mediciones.


30

Reactivos utilizados:

NaHPO4.2H2O grado R.A.: 17.8455 g

K2HPO4 grado R.A: 9.07036 g

Estos reactivos fueron mezclados en un balón aforado de 250 mL el cual se

llenó con agua destilada. Esta solución fue llevada a 1 litro en un recipiente.

En un homogenizador OSTERIZER se mezclaron 22.6185 g de hojas secas con

400 mL del buffer preparado. La solución se coló obteniendo aproximadamente

300 mL de solución ya que se produjo mucha de espuma.

Debido a la turbiedad de la solución fue necesario hacer una centrifugación por

30 min a 90 rpm en un Dynac Centrifuge de Clay Adams. El sobrenadante se

separó y filtró. Este extracto fue guardado a 4 ºC hasta volver a utilizarlo al igual

que todas las soluciones preparadas y obtenidas para evitar así reacciones

producidas a otras temperaturas.


31

Tomado de: http://www.medused.com/PagBgn/ProductPagedotasp/PagEnd/QStr/TargetInve

ntoryID/Eql/38764/Page.htm

Figura 10. Foto de la centrífuga.

Para la cromatografía de adsorción se utilizó Amberlita XAD-2 como resina

adsorbente. En una columna de 30 cm de largo y 0.5 cm de φi con un poco de

algodón en el fondo para evitar el paso de la resina se empaco la resina. Esta

fue lavada con 6 L de agua destilada con una rapidez aproximada de 50

gotas/min. Luego se adiciono la solución de las hojas a una rata de 20

gotas/min para permitir que se realizara la adsorción. La columna se empezó a

tornar mas oscura, del color de la solución.

Después de pasar toda la solución se hizo un lavado con 450 mL agua

destilada para eliminar los compuestos solubles en agua a la misma rata que la

adsorción.


32

Luego de que se escurriera el agua se empezaron a adicionar 150 mL acetato

de etilo tornándose la columna mas clara. Cuando este cambio de coloración

llego al fondo de la columna se empezó a recoger la elusión en un balón

aforado de 250 mL. Esta fracción contiene los compuestos glicosídicos por lo

cual es muy lenta, aproximadamente a 8 gotas/min.

Para “secar “ la solución, o más bien quitarle lo que queda de agua, se le

adiciono a este extracto 2 g. de sulfato de sodio y se refrigeró a 4 ºC durante la

noche.

Seguido de una filtración se procedió a hacer una concentración en una

columna Vigreaux. En un balón aperado se adicionó el extracto. El agua se

mantuvo en seis en un Lab-Line Pyro Magíster de Lab-Line Instruments, Inc.

para evitar así la evaporación de los glicósidos.

La columna Vigreaux se conectó a un sistema de refrigeración RMG Lauda

Brinkmann a 1.3 ºC. El solvente se recupera para ser utilizado con otros fines. A

medida que se evapora el acetato de etilo la solución se iba tornando más

oscura hasta terminar con una especie de cáscara en el balón aperado. Esta

cáscara es la que contiene los glicósidos.


33

Ya teniendo este resultado se comprobó la existencia de los compuestos

glicosídicos en las hojas de la guayaba-pera y se procedió a realizar la

extracción en grande, es decir con mayor cantidad de hojas, solventes, resina y

tiempo , además se usó una columna en mayor escala.

4.2 EXTRACCIÓN DE GLICÓSIDOS

Debido a la pureza de los reactivos y solventes que se requiere se utilizó una

nueva resina la cual tenía que ser activada. Para esto se utilizaron tres Soxhlet

en serie. Se utilizó 200 mL de metanol en cada balón de fondo plano de 250

mL. La resina se adicionó en tres dedales diferentes. Se utilizó un sistema de

enfriamiento de 4.6 ºC y de calentamiento a cuatro hasta obtener un flujo

continuo de gotas. El equipo de calentamiento que se utilizó fue un Mistral Pyro

Multi-stirrer de Lab-Line. Esta activación se realizó por 13 horas.

Tomado de: http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/extraction/

Figura 11. Esquema de un Soxhlet.


34

Para preparar 2 L del mismo buffer a pH = 7 se necesitó de 41.4714 g de

NaHPO4.2H2O y 51.4232 g de K2HPO4 con peso molecular de 137.99 g/mol y

174.18 g/mol respectivamente.

500 mL de buffer se mezclaron con 100 g de hojas secas para reducir la

cantidad de espuma obtenida en los ensayos preliminares en donde la

proporción es de 20:1. Esta corrección se hizo en base en la teoría donde se

utilizan proporciones de 5:1 o similares.

Esta solución se centrífugo por 30 min a 90 rpm y se almacenó a 4 ºC.

Después de empacar la resina en una columna de 1 m con 5 cm de φi se hizo

un lavado con sólo 2 L de agua destilada a una razón de 80 gotas/min ya que la

resina era nueva. El extracto se pasó a una razón de 20 gotas/min lo que

equivale aproximadamente a 2 mL/min.

Ya que la pureza y precisión de esta extracción necesariamente es mayor, el

lavado con agua destilada se realizó con 6 L a 40 gotas/min para evitar así

cualquier tipo de impurezas en el extracto de los glicósidos.


35

Se utilizaron 800 mL de metanol en esta ocasión ya que la revisión bibliográfica

nos muestra que el uso de metanol es mas común que el del acetato de etilo

debido a su polaridad. Esto se realizó a una razón de 8 gotas/min. La solución

se dejo escurrir durante la noche. El metanol utilizado es de Aldrich, 99.93% de

pureza, A.C.S. de grado HPLC.

La concentración se realizó en un Büchi Rotavapor R-114 y Büchi Waterbath B-

480 recogiendo el metanol para activar nuevamente la resina. Se utilizó un

rotavapor en vez de la una columna Vigreaux ya que con el rotavapor se

garantiza una mayor concentración al graduar la temperatura. El balón se pesó

vació y luego de la concentración cuando se obtuvo la cáscara para calcular el

porcentaje de humedad.

Tomado de: http://www.brinkmann.com/products/Buchi_Rotavapor_Collegiate_Description.a

sp

Figura 12. Foto del rotavapor.


36

El baño se hizo a 70 ºC teniendo en cuenta que el punto de ebullición del

metanol es de 64.7 ºC. El tiempo total de la concentración fue de 30 min.

Este procedimiento se hizo por triplicado obteniendo así los tres extractos, o

cáscaras, concentrados de glicósidos.

Una vez obtenidos los tres extractos se procedió a hacer una liofilización la cual

se llevó a cabo por tres horas a – 40 ºC. Cada uno de las cáscaras se disolvió

en un buffer de citrato-fosfato a pH = 5.7. Este se realizó disolviendo 1.92 g de

ácido cítrico, de Carlo Erba, hecho en Italia, en 100 mL de agua destilada para

tener una solución 0.1 M y mezclándolo con 7.17 g de Na2HPO4.12H2O 0.2 M.

Cada uno de los extractos se disolvió en aproximadamente 3 mL del buffer y

cada mL se agregó a un recipiente para la liofilización- enumerándolos de 1-10

llenando el recipiente 10 con agua para tenerlo como control positivo.

Luego se procedió a la hidrólisis enzimática por triplicado, las cuales se llevaron

a cabo por 48 horas a 37 ºC . Esto se hizo en un baño termostatado controlado

con el mismo equipo que se utilizó para las refrigeraciones.


37

Para llevar a cabo esto se pesaron 0.3 g de los glicósidos liofilizados. A esto se

le adicionó 500 µg de patrón y 0.5 mL de la enzima β-glucosidasa. Se debía

tener especial cuidado con que el recipiente estuviera bien tapado y asegurado

con cinta de parafina para que no se contaminara. Luego se le hizo un baño

refrigerado a 1 ºC por 30 min. Cada uno de los recipientes se refrigeró a 4 ºC.

Para liberar las agliconas se trasvasó la solución a un embudo de decantación

de 50 mL. Anteriormente se había preparado una solución de 270 mL de

pentano:eter (50:50). Se agregan 30 mL de este a el embudo de decantación.

Se voltea y mueve un poco buscando el equilibrio de las dos fases y se recoge

la fase acuosa que queda en el fondo en un vaso precipitado. Luego se recoge

la fase etérea. Se vuelve a adicionar la fase acuosa y otros 30 mL de pentano:

éter y se sigue el mismo procedimiento. Esto se hace una vez mas recogiendo

en un balón toda la fase etérea que contiene las agliconas. Este procedimiento

se realiza con las 3 hidrólisis. Se adiciona un poco de sulfato de sodio a cada

extracto y se refrigera a 4 ºC.

Tomado de: http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/index.html

Figura 13. Embudo de decantación.


38

Luego se procede a hacer la concentración en una columna Vigreaux como se

explicó en los ensayos preliminares recogiendo el pentano: éter y obteniendo

en vez de una cáscara una solución bastante aromática que se guardó en un

dedal para la cromatografía de gases y la cromatografía de gases acoplada a

espectrometría de masas.

4.3 EXTRACCIÓN DE VOLÁTILES LIBRES

Para realizar la extracción de los volátiles libres se licuaron 200 g de hojas

frescas con 600 mL de agua destilada. La materia sólida se deja secando a

temperatura ambiente por un mes y el liquido se agrega a un balón de 1000 mL

una vez separado el precipitado a la solución se le agregó 25 µL de n-decanol

que equivalen a 250 µg de patrón/kg de hojas.

La extracción de los volátiles libres es una extracción DES con pentano: éter

para poder recoger o extraer tanto los compuestos polares como los no polares.

El balón pequeño contiene 50 mL de esta solución.

Al estar en ebullición la solución de las hojas se procedió a prender el

Thermolyne type 45500 Input Control en uno para calentar levemente el

pentano: éter mientras que la solución se calentaba en un Heating Mantle

marca PyP ref. MC-1000 hecho en Medellín.


39

Una vez hecha la extracción se retira el balón pequeño que contiene los

volátiles libres y se guarda el extracto bajo refrigeración con sulfato de sodio a

4 ºC para extraerle la humedad.

Luego se procede a hacer la concentración del extracto en una columna

Vigreaux. Esto se realiza por triplicado.

Adicionalmente se realizó este mismo procedimiento homogenizando esta vez

las hojas con un buffer de fosfatos de pH = 7 preparado igual que el anterior.


40

5 COSTOS A continuación se hará un costo estimado para la obtención de un extracto de

volátiles libres y enlazados glicosídicamente a nivel de laboratorio sin contar

con los análisis cromatográficos.

Reactivos. 150 mL de pentano: grado RA 37920 pesos 150 mL de éter etílico grado RA 26100 pesos 800 mL de metanol grado RA 80000 pesos 600 mL de buffer de fosfatos 20000 pesos 100 mL de buffer de citarto-fosfato 8543 pesos 25 µL de n- decanol grado cromatográfico 250000 pesos 0.5 mL de enzima glucosidasa grado cromatográfico 125678 pesos Fenil -β-D- glucopiranósido grado cromatográfico 238670 pesos 500 g Resina Amberlita XAD-2 ultrapura 72000 pesos Sulfato de sodio 1200 pesos TOTAL 860111 pesos


41

6 RENDIMIENTO

6.1 AZÚCARES

Después de la liofilización se obtiene un polvo que corresponde a los azúcares

extraídos de la hoja. Se pesaron los recipientes antes y después de la

liofilización para así calcular la cantidad de azúcar obtenida.

El recipiente vacío antes de la liofilización pesaba 9.02 g. Los otros nueve

recipientes pesaban:

Tabla 1. Peso de los recipientes después de la liofilización.

Recipiente Peso Recipiente 1 9.20 g Recipiente 2 9.57 g Recipiente 3 9.29 g Recipiente 4 9.46 g Recipiente 5 9.37 g Recipiente 6 9.45 g Recipiente 7 9.34 g Recipiente 8 9.35 g Recipiente 9 9.33 g


42

Los primeros 3 recipientes correspondieron a la primera cromatografía de

adsorción, del 4-6 a la segundo y del 7-9 a la tercera, Así se obtuvo 1.09 g, 1.22

g y 0.96 g de extracto glicosídico en cada una de las cromatografías

respectivamente. La media de estos datos fue de 1.09 y la desviación estándar

0.13.

Rendimiento:

ó

%09.1100*100

09.1

deg9.10100

deg09.1

=

=kgdehojas

licósidosggdehojas

licósidosg

6.2 CELULOSA

Si se parte del hecho de que las hojas son principalmente celulosa, el material

que queda después de colar la solución de hojas y buffer o agua se podría

utilizar una vez seco para la obtención de celulosa pero purificándola para ver el

rendimiento real.


43

De los 100 g que se utilizaron para cada extracción de volátiles enlazados

glicosídicamente 42.73 g, 75.67 g y 83.71 g de materia seca se obtuvo en cada

una de las extracciones respectivamente, ó 67.37 ± 21.71.

%37.67100*100

37.67

7.673100

37.67

=

=kgdehojas

ggdehojas

g

De los 200 g que se utilizaron para cada extracción de volátiles libres a pH

natural 157.97 g, 108.65 g y 113.36 g de materia seca se obtuvo en cada una

de las extracciones respectivamente, ó 126.66 ± 27.21.

%33.63100*200

66.126

3.633200

66.126

=

=kgdehojas

ggdehojas

g

De los 200 g que se utilizaron para cada extracción de volátiles libres a pH 7

124.43 g, 109.87 g y 132.06 g de materia seca se obtuvo en cada una de las

extracciones respectivamente, ó 122.12 ± 11.27.


44

%06.61100*200

12.122

6.610200

12.122

=

=kgdehojas

ggdehojas

g

.


45

7 CUANTIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN

Para la cuantificación se utilizó un cromatógrafo de gases de alta resolución HP

6890 con un detector de llama ionización de llama FID. Este cromatograma

consta de una columna capilar HP-Innovax de polietilenglicol, La columna es de

60 m de longitud con un φi de 0.25 mm y 0.25 µm de espesor de película.

Figura 14. Cromatógrafo de gases con FID.

El programa de temperatura del cromatógrafo era el siguiente: temperatura

isotérmica en el horno de 50 ºC por 4min, incremento a una rata de 4 ºC/min

hasta llegar a 220 ºC donde se mantenía constante por 10 min. La temperatura

del detector se mantuvo en 220 ºC


46

El gas de arrastre fue el Helio a una razón de 1 mL/min y el Nitrógeno se utilizó

como gas auxiliar a una razón de 30 mL/min. El volumen de inyección fue 1µL.

Para la identificación se utilizó un cromatógrafo de gases HP-5890 acoplado a

un espectrómetro de masas con energía de ionización de 70 eV. Este

cromatograma consta de una columna capilar Innovax de polietilenglicol, La

columna es de 60 m de longitud con un φi de 0.25 mm y 0.25 µm de espesor de

película.

El mejor cromatograma de cada extracción, es decir el de mejor resolución, se

encuentra en el anexo A.


47

8 RESULTADOS

La cuantificación se realizó utilizando los cromatógramas que se obtuvieron del

CGAR- FID mediante el método de estándar interno. La concentración de fenol,

patrón interno para la identificación de los compuestos enlazados

glicosídicamente, fue de 500 µg/kg de hojas. La concentración de n-decanol,

patrón interno para la identificación de los compuestos libres, fue de 250 µg/kg

de hojas.

La identificación se realizó con los espectros obtenidos del CGAR-EM y con la

ayuda del software de la computadora del equipo.

Las tablas con los resultados se encuentran en el Anexo B.

En la extracción de volátiles libres a pH natural se obtuvo un total de 61

compuestos, 35 sesquiterpenos (4.9 mg/kg), nueve terpenos (0.5 mg/kg), siete

alcoholes (0.3 mg/kg), cuatro no identificados (0.2 mg/kg), tres aldehídos (0.3

mg/kg), un óxido (0.03 mg/kg), un ácido (0.01 mg/kg) y un hidrocarburo (0.01


48

mg/kg). La siguiente figura muestra la distribución porcentual en peso de cada

uno de estos grupos:

Figura 15. Distribución porcentual en peso de volátiles libres a pH = natural.

La cantidad obtenida fue 6.3 mg/kg y sus componentes mayoritarios fueron β--

cariofileno (1.3 mg/kg), α-copaeno (0.4 mg/kg), β-selineno (0.3 mg/kg), 1,8-

cineol (0.3 mg/kg) y 2-Hexenal (0.2 mg/kg).

En la extracción de volátiles libres a pH 7 se obtuvo un total de 39 compuestos,

22 sesquiterpenos (1.5 mg/kg), seis hidrocarburos (0.1 mg/kg), tres terpenos

(0.07 mg/kg), tres son esteres (0.1 mg/kg), dos no identificados (0.1 mg/kg),

dos alcoholes (0.7 mg/kg) y una cetona (0.02 mg/kg).

0%

78%

8%5%4% 5%0%

0%


49

Figura 16. Distribución porcentual en peso de volátiles libres a pH = 7.

La cantidad obtenida fue 3.8 mg/kg y sus componentes mayoritarios fueron

trans-cariofileno (1.2 mg/kg), Etanol (0.7 mg/kg), α-copaeno (0.4 mg/kg) y α-

humuleno (0.1 mg/kg).

En la extracción de glicósidos a pH = 7 se obtuvo un total de 34 agliconas, 16

alcoholes (11 mg/kg), seis ácidos (1.6 mg/kg), cinco éteres (1.4 mg/kg), tres

esteres (2.9 mg/kg), un no identificados (0.1 mg/kg), un terpeno (0.2 mg/kg), un

hidrocarburo (0.3 mg/kg) y un aldehído (0.07 mg/kg).

Figura 17. Distribución porcentual en peso de volátiles enlazados.

3%

56%28%

4%

1%4% 4%

63%1%

16%

8%9%

0%1%2%


50

La cantidad obtenida fue 17.5 mg/kg y sus componentes mayoritarios fueron 2-

Propanol (4 mg/kg), Etanol (4 mgkg), Benzoato de Metilo (2 mg/kg) y cis-3-

hexenol (1 mg/kg)


51

9 CONCLUSIONES

Los alcoholes aromáticos que se identificaron en los volátiles libres a pH =

natural son de bajo peso molécular. Entre los aldehídos se identificó el

benzaldehido el cual es un aldehído muy aromático que se utiliza como

saborizante artificial y el 2-Hexenal que es uno de los responsables al aroma

verde de la hoja.

Los hidrocarburos identificados en los volátiles libres a pH = 7 son

hidrocarburos lineales como el tetracosano y pentacosano. Entre los terpenos,

el limoneno es un compuesto con características de aroma frutal. De la figura

16 se observa que los dos alcoholes corresponden al 28% en peso.

En ambos extractos de volátiles libres se obtiene una gran cantidad de

sesquiterpenos y terpenos. Esto es un hallazgo importante ya que estudios

recientes han demostrado que ciertos compuestos de estos tienen propiedades

antiinflamatorias5, antitumorales y anticancerígenos, entre otras.

5 Tomado de: Bruneton, J., (1991). Elementos de Fitoquímica y de Farmacognesia. España: Editorial Arabia, S.A.


52

Las agliconas encontradas son principalmente alcoholes de bajo peso

molecular como el 2-propanol, 2-butanol y etanol. Un éster se encuentra como

componente mayoritario y el naftaleno es el único hidrocarburo. Además, en

esta extracción sólo se encuentra un solo terpeno. Esto se puede explicar ya

que los terpenos (10 carbonos) y los sesquiterpenos (15 carbonos) son

compuestos de alto peso molecular y los compuestos enlazados

glicosídicamente al ser compuestos estables son de peso molecular mas bajo.

El mayor número de compuestos se observó en la extracción de volátiles libres

a pH = natural. Esto es lógico ya que al estar las hojas en su pH = natural se da

un mayor número de reacciones, como oxidaciones, y de actividades

enzimáticas.

En los resultados de la extracción de volátiles libres a pH = 7 no se observa

ningún aldehído ni oxido lo que se puede deducir del hecho de que al estar a un

pH neutro no se dan mucha reacciones.

En la tabla 5 del Anexo B se observa la relación entre los tres resultados. Los

compuestos que están en rojo son los que se encuentran en los tres extractos.

Esto se traduce en que se forman por diferentes rutas, es decir, se encuentran

como volátiles libres a pH = natural y 7 y también se encuentran unidos a una

azúcar. Estos compuestos son el 2-propanol y el etanol. Ambos son alcoholes.


53

Los compuestos que están en azul se encuentran sólo como volátiles libres y no

unidos a un azúcar . Estos compuestos son el limoneno, α-copaeno, isómero de

α-copaeno, α-humuleno, β-cardineno, α-selineno, cadina-1,4-dieno, 1S, cis-

calameno, oxido cariofileno, δ-nerolidol, α-cedreno, Cariofila-4(12),8(13)-dien-5-

β-ol, Isómero de cariofilenol-II, 2-Isopropil-5-metil-9-metileno-biciclo-[4.4.0]-dec-

1-eno y dos no identificados para un total de 16 compuestos.

Los compuestos que están en naranja son los que se encuentran como

glicósidos y como volátiles libres a pH = natural. Estos son cinco compuestos

de los cuales dos son alcoholes como el 2-penten-1-ol y el cis-3-hexenol, 1

aldehído como el benzaldehido, un ácido como el ácido acético y el 1,8-Cineol.

Los compuestos que se encuentran resaltados sólo se encuentran de una

forma. De esto se puede deducir que un isómero de 1-1-dietoxi-propano,-2,4,5-

trimetil-1,3-dioxolano y un isómero de éste, 2-butanol, hexanal, 3-pentanol, 2-

pentanol, alcohol Isoamílico, 3-metil-3-buten-1-ol, acetato de etilo, 2-butoxi-

etanol, oxido de linalool, benzoato de metilo, α-terpineol, naftaleno, 2-hidroxi

benzoato de metilo, ácido hexanoico, exo-2-hidroxicineol, alcohol bencílico,

feniletil alcohol, acido (E)-3- hexenoico, acido trans 2-hexenoico, ácido

octanoico, glicol limoneno, ácido octadecanoico y un no identificado se

encuentran sólo como agliconas. Es decir 27 de las 34 agliconas no se

encuentran como volátiles libres.


54

Con respecto a la viabilidad económica de la obtención de azúcares a partir de

las hojas de la guayaba pera se puede decir que al grado de pureza que se

obtuvo no es una proyecto viable si se miran los costos y el rendimiento. Sin

embrago, si se deseasen hacer infusiones aromáticas con estos azúcares si

puede ser viable al diluirla con otros compuestos.

Lo mismo pasa con los volátiles libres. Una aplicación del aislamiento de estos

compuestos es la obtención de aceites esenciales. Comercialmente estos

compuestos se encuentran en concentraciones bastantes diluidas por lo cual el

extracto obtenido puede servir para estos fines.

Por otra parte, si se tiene en cuenta el material que puede ser utilizado para la

obtención de celulosa, la viabilidad de realizar este proyecto a gran escala es

muy buena.


55

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59

Anexo A

Cromatograma de volátiles libres a pH = natural.


60

Cromatograma de volátiles libres a pH = 7.


61

Cromatograma de volátiles enlazados glicosídicamente.


62

Anexo B

Tabla 2. Composición de volátiles libres a pH = natural.

Tiempo(min) Nombre ug/kg 6.91 2-Propanol 81 7.09 Etanol 101 9.35 α-pineno 19 11.38 Hexanal 13 14.03 1-Penten-3-ol 12 14.27 Mirceno 9 15.71 Limoneno 52 16.11 1,8-Cineol 292 16.62 2-Hexenal 224 17.47 γ−terpineno 8 17.65 trans-β−ocimeno 3 18.46 p-cimeno 3 20.19 2-Penten-1-ol 15 21.35 1-Hexanol 6 22.65 cis-3-hexenol 79 23.35 (E)-2-Hexen-1-ol 5 25.75 Acido acetico 7 26.4 (+)-cicloisosativeno 9 26.93 α-copaeno 423 27.97 Benzaldehido 86 29.65 cis-cariofileno 22 30.87 β-cariofileno 1295 30.97 Alloaromadendreno 24 32.06 Isomero de alloaromadendreno 51 32.47 δ-cardineno 23 32.92 α-humuleno 243 33.15 Aristoleno 79 33.33 Terpinoleno 74 34.18 Eremofileno 189 34.46 β-selineno 311 34.58 Isomero de β-selineno 294 34.75 α-selineno 6 35.15 n-decanol 250 35.5 Isomero de δ-cardineno 176 35.78 N.I. 20


63

Tiempo(min) Nombre ug/kg 36.3 cadina-1,4-dieno 124 37.73 1s, cis-calameno 62 40.16 1,4,5,8-Tetrametil-1,4-dihidronaftaleno 1,4-endoxido 26 42.24 Oxido 2-cariofileno 250 42.99 δ-nerolidol 131 43.25 N-I. 102 43.65 Epoxido 2-Humuleno 30 43.78 Alcohol α-cariofileno 19 43.95 Isomero de α−copaeno 47 44.13 α-cedreno 82 44.34 Globulol 16 45.96 α-patchuleno 63 46.21 N.I. 80 46.33 β-copaen-4-α-ol 17 46.7 2-Isopropil-5-metil-9-metileno-biciclo[4.4.0]dec-1-eno 41 47.11 α-cadinol 44 47.41 Isomero de α-copaeno 115 48.09 α-eudesmol 27 48.35 T-Cadinol 46 48.54 Junipeno 14 49.15 (+-)-7-Epi-Amiteol 360 49.67 Isomero de α−selineno 6 49.91 N.I. 31 50.15 Cariofila-4(12),8(13)-dien-5-β-ol 52 50.36 Isomero de cariofilenol-II 180 50.59 ( R)-1-metil-4-(1,2,2-trimetilciclopentil) 12 52.63 Cariofilenol-II 51

TOTAL 61 compuestos 6283


64

Tabla 3. Composición de volátiles libres a pH =7.

Tiempo (min) Nombre ug/kg 6.91 2-Propanol 66 7.1 Etanol 682

15.62 Limoneno 13 16.97 cis-ocimeno 21 24.41 Caprilato de etilo 51 25.37 α-cubebeno 16 25.86 Acetato de n-octil 19 26.73 α-copaeno 361 29.96 Hexadecano 14 30.54 trans-cariofileno 1199 31.28 Caprato de etilo 35 31.94 Aromadendreno 36 32.75 α-humuleno 136 33.12 Heptadecano 11 33.21 α-amorfeno 29 34.26 trans-α-bisaboleno 93 34.42 α-selineno 13 35.12 n-decanol 250 35.33 δ-cadineno 84 35.47 Isomero de α-amorfeno 36 36.16 Cadina-1,4 dieno 111 37.66 1s,cis-calameneno 63 39.05 Germacreno 19 42.11 Oxido de cariofileno 89 42.91 Isomero de nerolidol 75 43.18 N.I. 47 43.9 Isomero de α-amorfeno 23 44.05 α-cedreno 30 44.36 Heneicosano 13 44.53 2,6-di(t-butil)-4-hidroxi-4-metil-2,5-ciclohexadien-1-ona 23 46.16 N.I. 69 46.66 2-Isopropil-5-metil-9-metileno-biciclo[4.4.0]dec-1-eno 35 46.88 Docosano 14 47.06 T.Muurolol 36 47.34 Isomero de α-copaeno 37 48.28 Isomero de T-Muurolol 52 50.09 Cariofila-4(12),8(13)-dien-5-β-ol 31 50.26 Isomero de Cariofila-4(12),8(13)-dien-5-β-ol 112 52.58 Tetracosano 32 56.21 Pentacosano 20



65

Tabla 4. Composición de volátiles enlazados glicosídicamente.

Tiempo(min) Nombre ug/kg 6.9 2-Propanol 4029 7.07 Etanol 4399 7.31 2,4,5-trimetil-1,3-dioxolano 259 7.57 1,1-dietoxi-Propano 56 8.25 Isomero de 2,4,5-trimetil-1,3-dioxolano 334 9.34 2-Butanol 95 11.28 1,1-dietoxi-Etano 213 12.06 3-Pentanol 61 12.51 2-Pentanol 65 15.84 Alcohol Isoamílico 69 15.96 1,8-Cineol 150 17.53 3-metil-3-Buten-1-ol 95 20.19 (Z)-2-Penten-1-ol 78 21.22 Acetato de etilo 48 22.61 Cis-3-Hexenol 959 23.3 2-butoxi-Etanol 82 24.76 Oxido de Linalool 56 25.87 Ácido Acético 160 27.95 Benzaldehido 69 31.2 Benzoato de metilo 2724 33.3 α-Terpineol 86 35.12 Naftaleno 273 36.11 2-hidroxi Benzoato de metilo 30 38.12 Ácido hexanoico 190 38.21 exo-2-hidroxicineol 82 38.83 Alcohol bencílico 710 39.05 N.I. 121 39.85 Feniletil alcohol 125 41.61 Ácido (E)-3- Hexenoico 546 41.79 Ácido Trans 2-hexenoico 308 42.49 Fenol 500 43.91 Ácido Octanoico 39 49.19 Glicol Limoneno 108 55.5 Acido Octadecanoico 342



66

Tabla 5. Composición total de volátiles libres y enlazados glicosídicamente.

pH = natural pH = 7 Glicósidos Tiempo(min) Nombre (ug/kg) (ug/kg) (ug/kg)

6.91 2-Propanol 81 66 4029 7.31 2,4,5-trimetil-1,3-dioxolano 259 7.57 Isomero de 1,1-dietoxi-Propano 56 7.09 Etanol 101 682 4399 8.25 Isomero de 2,4,5-trimetil-1,3-dioxolano 334 9.34 2-Butanol 95 9.35 α-pineno 19 11.28 Isomero de 1,1-dietoxi-Etano 213 11.38 Hexanal 13 12.06 3-Pentanol 61 12.51 2-Pentanol 65 14.03 1-Penten-3-ol 12 14.27 Mirceno 9 15.84 Alcohol Isoamílico 69 15.71 Limoneno 52 13 16.11 1,8-Cineol 292 150 16.62 2-Hexenal 224 16.97 cis-ocimeno 21 17.47 γ-terpineno 8 17.53 3-metil-3-Buten-1-ol 95 17.65 trans-β-ocimeno 3 18.46 δ-cimeno 3 20.19 2-Penten-1-ol 15 78 21.22 Acetato de etilo 48 21.35 1-Hexanol 6 22.65 cis-3-hexenol 79 959 23.3 2-butoxi-Etanol 82 23.35 (E)-2-Hexen-1-ol 5 24.41 Caprilato de etilo 51 24.76 Oxido de Linalool 56 25.37 α-cubebeno 16 25.75 Acido acetico 7 160 25.86 Acetato de n-octil 19 26.4 (+)-cicloisosativeno 9 26.93 α-copaeno 423 361 27.97 Benzaldehido 86 69 29.65 cis-cariofileno 22 29.96 Hexadecano 14 30.54 trans-cariofileno 1199 30.87 β-cariofileno 1295


67


30.97 Alloaromadendreno 24 31.94 Aromadendreno 35 31.2 Benzoato de metilo 2724 31.28 Isomero de caprato de etilo 36 32.06 Isomero de alloaromadendreno 51 32.47 δ-cardineno 23 84 32.92 α-humuleno 243 136 33.12 Heptadecano 11 33.15 Aristoleno 79 33.21 α-amorfeno 29 33.3 α-Terpineol 86 33.33 Terpinoleno 74 34.18 Eremofileno 189 34.26 trans-α-bisaboleno 93 34.42 α-selineno 311 13 34.46 β-selineno 294 34.58 Isomero de β-selineno 6 35.12 Naftaleno 273 35.15 n-decanol 250 250 35.47 Isomero de α-amorfeno 36 35.5 Isomero de δ-cardineno 176 84 35.78 N.I. 20 36.11 2-hidroxi benzoato de metilo 30 36.3 cadina-1,4-dieno 124 111 37.73 1s, cis-calameno 62 63 38.12 Ácido hexanoico 190 38.21 exo-2-hidroxicineol 82 38.83 Alcohol bencílico 710 39.05 N.I. 121 39.05 Germacreno 19 39.85 Feniletil Alcohol 125 40.16 1,4,5,8-Tetrametil-1,4-dihidronaftaleno 1,4-endoxido 26 41.61 Ácido (E)-3- Hexenoico 546 41.79 Ácido Trans 2-hexenoico 308 42.24 Oxido cariofileno 250 89 42.99 δ-nerolidol 131 75 43.25 N-I. 102 47 43.65 Epoxido 2-Humuleno 30 43.78 Alcohol α-cariofileno 19 43.9 Isomero de α-amorfeno 23 43.91 Ácido Octanoico 39 43.95 Isomero de α-copaeno 47 44.13 α-cedreno 82 30 44.34 Globulol 16 44.36 Heneicosano 13 44.53 2,6-di(t-butil)-4-hidroxi-4-metil-2,5-ciclohexadien-1-ona 23 45.96 α-patchuleno 63 46.21 N.I. 80 69


68


46.33 β-copaen-4-α-ol 17 46.7 2-Isopropil-5-metil-9-metileno-biciclo[4.4.0]dec-1-eno 41 35 46.88 Docosano 14 47.06 T.Muurolol 36 47.11 α-cadinol 44 47.41 Isomero de a-copaeno 115 37 48.09 α-eudesmol 27 48.28 Isomero de T-Muurolol 52 48.35 T-Cadinol 46 48.54 Junipeno 14 49.15 (+-)-7-Epi-Amiteol 360 49.19 Glicol Limoneno 108 49.67 Isomero de α−selineno 6 49.91 N.I. 31 50.15 Cariofila-4(12),8(13)-dien-5-β-ol 52 31 50.36 Isomero de cariofilenol-II 180 112 50.59 ( R)-1-metil-4-(1,2,2-trimetilciclopentil) 12 52.58 Tetracosano 32 52.63 Cariofilenol-II 51 55.5 Acido Octadecanoico 342 56.21 Pentacosano 20

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