a

Determinación de anticuerpos neutralizantes producidos por astrovirus porcino y un

péptido de su cápside.

Autor:

Andrés Enrique Perugache Rodríguez

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA DE BIOLOGÍA

Bogotá D.C. Diciembre de 2013

b

Determinación de anticuerpos neutralizantes producidos por astrovirus porcino y un

péptido de su cápside.

Autor:

Andrés Enrique Perugache Rodríguez

_________________________

Ingrid Schuler, PhD

Decana Académica

________________________

Andrea Forero Ruiz

Directora carrera de Biología

c

Determinación de anticuerpos neutralizantes producidos por astrovirus porcino y un

péptido de su cápside.

Autor:

Andrés Enrique Perugache Rodríguez

_________________________

Juan Carlos Ulloa Rubiano, PhD

Director

_____________________________ ______________________________

Alfonso Barreto Prieto, PhD María Fernanda Gutiérrez Fernández, PhD

Jurado Biología Jurado Microbiología Industrial

d

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus

trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica

y por qué las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en

ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

e

Agradecimientos

Agradezco a mi director de trabajo de grado Juan Carlos Ulloa, PhD por toda la ayuda prestada y

sobre todo por darme la oportunidad de realizar éste trabajo, así como a mis compañeras del

laboratorio de Virología de la Pontificia Universidad Javeriana quienes me brindaron su apoyo.

Agradezco especialmente a Ángela García Vega y Juan Mario Torres quienes han sido un soporte

vital en toda mi carrera y mis más queridos amigos, finalmente agradezco a mis padres por tan

grande apoyo con el que siempre he contado.

1

Resumen

Los Astrovirus (AstV) son agentes infecciosos causantes de gastroenteritis en varios animales, se

asocian aproximadamente a un 10% de los cuadros diarreicos en humanos causando morbilidad

principalmente en infantes menores de 5 años. Los poco conocidos astrovirus porcinos también

se han encontrado en animales asintomáticos lo que no permite dejar claro cuál es su papel en la

enfermedad. Uno de los aspectos básicos desconocidos sobre este virus es su capacidad de

generar anticuerpos neutralizantes en infecciones naturales y tampoco se han realizado estudios

para caracterizar los epítopes responsables. En el presente trabajo se estudió si la cepa de

astrovirus porcino PUJP5 adaptada a cultivo celular y un péptido sintetizado a partir de una

región altamente accesible de su cápside, con alta similaridad en su secuencia primaria entre

astrovirus porcinos genotipos 1 y 2, son capaces de generar anticuerpos neutralizantes en conejos

Nueva Zelanda inoculados con estos. Los resultados de las pruebas permitieron determinar que

la partícula viral completa de PUJP5 puede generar los anticuerpos buscados los cuales

inhibieron la infección in vitro completamente a una multiplicidad de infección de 0,1 y 0,01

usando un título hasta de 1/400 y parcialmente a diluciones mayores hasta 1/6400, mientras que

el péptido evaluado HDSS no mostró este efecto a ninguna dilución. Esto sugiriere un posible

papel de la generación de anticuerpos neutralizantes tras la infección viral y la regulación de la

patogénesis. Adicionalmente los resultados sugieren que el péptido HDSS no representa una

región importante para la entrada de PUJP5 a las células susceptibles in vitro.

Palabras clave: Anticuerpos neutralizantes. Astrovirus porcino. Epítope neutralizante. Infección

viral.

Abreviaturas:

AstV: Astrovirus

PAstV: Astrovirus Porcino

HAstV: Astrovirus Humano

AN: Anticuerpos Neutralizantes

2

Introducción

Los Astrovirus son virus desnudos con RNA de cadena positiva causantes de gastroenteritis en

diversos animales incluidos mamíferos y aves y están asociados entre el 5 al 10% de las diarreas

en humanos a nivel mundial (Schultz, 2013; De Benedicts et al., 2011; Finkbeiner et al., 2008).

Recientemente fue descrita la presencia de astrovirus en un caso de encefalitis en un niño con

agammaglobulinemia y se reportó asociado a desórdenes neurológicos en visones (Quan et al.,

2010; Blomström et al., 2010). Además, se han encontrado AstVs en individuos asintomáticos,

por lo tanto todavía no se tiene claro cuál es el verdadero papel de estos en la patogénesis de

dichas enfermedades (Méndez-Toss et al., 2004; De Benedicts et al., 2011).

Los Astrovirus porcinos (PAstV) están igualmente asociados a la producción de gastroenteritis en

cerdos (Jonassen et al., 2001; Wang et al., 2001) pero también se han descrito en animales

asintomáticos (Luo et al., 2011). Hasta la fecha se reconoce una especie y cinco genotipos

(PAstV 1-5) (King et al., 2012; Ulloa y Gutiérrez 2010). PAstV ha sido poco estudiado y “se

desconocen aspectos básicos de su comportamiento, su impacto epidemiológico y de su

patogénesis” (Ulloa et al., 2011), como por ejemplo si la infección por estos genera anticuerpos

neutralizantes que estén eventualmente involucrados en el control de la enfermedad que

producen.

En el laboratorio de virología de la Pontificia Universidad Javeriana se aisló y se adaptó una cepa

silvestre de PAstV denominada PUJP5. Esta cepa es capaz de infectar células embrionarias de

riñón de cerdo (ESK-4) y asimismo conserva su infectividad in vivo. PUJP5 fue reportada por

compartir características genómicas y antigénicas con astrovirus humanos (Ulloa, et al. 2011).

Justificación y planteamiento del problema

Los astrovirus de cerdos se han descrito por estar altamente emparentados con astrovirus

humanos y se ha propuesto que pueden darse recombinaciones génicas naturales entre cepas de

estos con astrovirus principalmente en la región hipervariable del ORF2 que codifica para la

cápside y que conforma las espículas virales (Ulloa y Gutiérrez, 2010; Wang et al., 2001).

Actualmente están reportados 5 genotipos virales de PAstV y no se conoce si corresponden

respectivamente a los serotipos como sucede para los astrovirus humanos, para los que además se

3

conoce cuáles son los serotipos más prevalentes. La patogenia de astrovirus en general es

desconocida, algunos estudios han sido desarrollados principalmente en pavos (Koci et al., 2004;

Jackwood, Spackman & Day, 2008; Thouvenelle et al., 1995), sin embargo, estudios controlados

en mamíferos incluyendo cerdos, no han sido reportados.

Dentro de los aspectos desconocidos de la biología de los astrovirus se incluye el carácter

autolimitado de la enfermedad gastrointestinal que produce, lo que ha definido un bajo impacto

en salud por lo menos en humanos (Luo et al., 2011; Koopmans et al., 1998). Sin embargo, en el

caso de astrovirus de cerdo, no se tiene claro cuál es su papel en la producción de diarrea, ni se

conoce con certeza si los viriones generan anticuerpos neutralizantes durante la infección viral

natural, tampoco se han realizado estudios de posibles epítopes neutralizantes. A partir de un

estudio in sillico previo se determinaron teóricamente los péptidos más accesibles (altamente

hidrofílicos) de la cepa de referencia de PAstV 1 (Gen Bank Q9JG99). Posteriormente se

compararon con las regiones homólogas de PUJP5 y otras cepas reportadas del mismo genotipo y

del genotipo 2 identificándose que el péptido HDSSGSEPEDEDVENNRVTL tiene una alta

similaridad entre estos. Con esto se planteó que con base en las características teóricas

encontradas, este péptido pudiese representar una región peptídica importante que pueda generar

anticuerpos que neutralicen al menos parcialmente la infección in vitro por PUJP5.

Si PAstV produce anticuerpos neutralizantes durante una infección natural podría ser un

componente importante en términos de inmunidad que estaría involucrado en el desarrollo de su

patogénesis aun no caracterizada. Adicionalmente, encontrar regiones peptídicas con capacidad

neutralizante de la infección podría ser muy importante también para la búsqueda de regiones

involucradas en la entrada del virus.

Pregunta de investigación: ¿Puede Astrovirus porcino o un segmento peptídico de su cápside

generar anticuerpos neutralizantes?

4

Marco teórico

Los AstV están asociados a gastroenteritis en varios animales incluyendo al hombre, siendo el

segundo agente infeccioso asociado a diarreas humanas reportadas a nivel mundial (King et al.,

2012, Dong et al., 2012; Pativada et al., 2012; De Benedicts et al., 2011), principalmente en

niños, sobre todo en países subdesarrollados con condiciones sanitarias inadecuadas, sumado al

estrecho contacto con animales infectados como cerdos, felinos y aves, su transmisión es oro-

fecal (Jonassen et al., 2001; Ulloa et al., 2010). También se ha reportado asociado a nefritis fatal

en patos y nefritis intersticial que causa el retraso del crecimiento en pollos (King et al., 2012). A

pesar de que AstV se relaciona esencialmente a problemas del sistema gastrointestinal,

recientemente se describió como agente etiológico asociado a encefalitis en un niño con

agammaglobulinemia, aumentando así la importancia de su estudio pues esta es una de las

mayores causas de muerte a nivel mundial (Quan et al., 2010). Asimismo se detectaron

secuencias metagenómicas de AstV en visones con “Shaking Mink syndrome”, una patología del

sistema neurológico (Blomström, 2010). Existe el raro reporte de secuencias genicas de AstV en

mucosas nasales de niños con fiebres altas, pero es incierto el papel de los AstV en ésta

enfermedad (Pennisi, 2011). Otro aspecto importante es que se ha encontrado AstV en individuos

sin patología aparente por lo que todavía se desconoce exactamente cuál es el rol de este virus en

la patogénesis de estas enfermedades (Mendez-Toss et al., 2004; Van Kraaij et al., 2000; De

Benedicts et al., 2011). Hasta el momento no existe una vacuna, ni antivirales que controlen la

infección por astrovirus.

En cuanto a su biología, los Astrovirus (AstV) son un grupo de virus pequeños, desnudos, con

RNA de cadena sencilla, polaridad positiva, con cápside icosahédrica de 28-30 nm de diámetro y

con un genoma de aproximadamente 7 Kb (Schultz, 2013; King et al., 2012; De Benedicts et al.,

2011). Según King et al. (2012) para replicarse utiliza el RNA del virión el cual es infeccioso y

sirve como RNA mensajero para las proteínas no estructurales, nsp1a y nsp1ab, emplea un

mecanismo “frame-shifting” para traducir la RNA polimerasa dependiente de RNA, esto ocurre

en el citoplasma. Los AstVs se encuentran dentro de la familia Astroviridae y se clasifican en

dos géneros de acuerdo a sus hospederos: Mamastrovirus (mamíferos) y Avastrovirus (aves),

dentro de los primeros, el Astrovirus porcino (PAstV) y humano (HAstV) son filogenéticamente

cercanos, compartiendo un alto porcentaje de similitud en sus secuencias nucleotídicas (Wang et

5

al., 2001; De Benedicts et al., 2011; King et al., 2012). Existen 5 genotipos de Astrovirus

porcinos, entre ellos PAstV tipo 1 que incluye a la cepa PUJP5, aislada en el laboratorio de

Virología de la Pontificia Universidad Javeriana en 2010, a partir de muestras fecales de cerdos

recolectadas en Colombia, PUJP5, al igual que los PAstV contiene 3 marcos abiertos de lectura,

ORF1a y OR1b que codifican para 2 proteínas no estructurales y ORF2 codifica una poliproteína

estructural (Ulloa et al., 2010). Sin embargo, no se cuenta con información sobre aspectos

biológicos fundamentales (Schultz, 2013; Xiao et al., 2013; Luo et al., 2011; Indik et al., 2006),

por ejemplo se desconoce la razón por la cual la diarrea es autolimitante, aspecto que puede

deberse a que el organismo infectado produce anticuerpos neutralizantes (AN), inmunoglobulinas

que bloquean la entrada del virus a las células del hospedero impidiendo la continuación del ciclo

replicativo viral. Así mismo se desconoce cuáles son las epítopes responsables de generar los

AN, algo que ya ha sido en parte reportado para HAstV (Koopmans et al., 1998; Matsui et al.,

1993; Bass & Upadhyyayula, 1997).

Objetivo general

Determinar la capacidad neutralizante de anticuerpos presentes en sueros de conejos inoculados

con astrovirus de cerdo, cepa PUJP5 y de un péptido de cápside sintético.

Objetivos específicos

Determinar la capacidad neutralizante de anticuerpos presentes en sueros hiperinmunes

producidos en conejos Nueva Zelanda contra la partícula de astrovirus porcino PUJP5

completa.

Determinar la capacidad neutralizante de anticuerpos presentes en sueros hiperinmunes

producidos en conejos raza Nueva Zelanda contra el péptido

HDSSGSEPEDEDVENNRVTL diseñado a partir de la cápside de astrovirus porcino

genotipos 1 y 2.

Comparar el efecto neutralizante sobre la infección in vitro con PUJP5 de los sueros

evaluados.

6

Metodología

Obtención de un antisuero policlonal contra la partícula completa de astrovirus porcino

cepa PUJP5

Inicialmente se produjo un lote de astrovirus porcino cepa PUJP5 en la línea celular ESK-4

siguiendo protocolo previamente descrito (Ulloa, et al. 2011). Posteriormente las partículas

virales se concentraron mediante ultra-centrifugación a 100.000 g durante 15 h y luego se

purificaron usando un gradiente de CsCl. Las partículas purificadas fueron nuevamente

concentradas, resuspendidas en solución salina y pasadas a través de un filtro de 0,22m. La

suspensión viral fue titulada por inmunocitoquímica siguiendo asimismo un protocolo

previamente establecido (Ulloa, et al. 2011).

Posteriormente y siguiendo procesos de inmunización estándar, se inoculó subcutáneamente a

nivel de la espina dorsal, un conejo macho raza Nueva Zelanda, cada 15 días durante 3 sesiones,

la primera vez con 1 ml que contenía 0,5mL de PAstV cepa PUJP5 (Título 2x106 UFF/ml)

purificado y 0,5mL de Adyuvante completo de Freunds. Las dos siguientes inoculaciones se

hicieron con adyuvante incompleto. A los 45 días se obtuvo la sangre completa del animal, la

cual fue recolectada en tubos tapa amarilla (BD) y se transportaron inmediatamente a temperatura

ambiente al Laboratorio de Virología de la PUJ donde fueron centrifugados a 16.000 g durante 15

min para separar el suero. Finalmente se realizaron alícuotas de 0,5 mL en tubos cónicos de

1,5mL adicionando glicerol en proporción 1:1 con azida de sodio 0,03% y se almacenaron a -70

°C, hasta su uso.

Obtención de un antisuero policlonal contra el péptido sintético

Utilizando el mismo proceso de inmunización estándar, se inoculó subcutáneamente a nivel de la

espina dorsal durante 3 sesiones cada 15 días, un conejo de raza Nueva Zelanda, con 1 ml de

péptido sintético HDSSGSEPEDEDVENNRVTL (0,5mg cada vez) diseñado previamente. Tras

45 días se obtuvo la sangre completa del animal, que fue recolectada en tubos tapa amarilla (BD)

e inmediatamente transportados a temperatura ambiente en el Laboratorio de Virología de la

Pontificia universidad Javeriana donde fueron centrifugados a 16.000 g durante 15 min para

separar el suero, luego se realizaron alícuotas de 0,5 mL en tubos cónicos de 1,5mL adicionando

glicerol en proporción 1:1 con azida de sodio 0,03% y se almacenaron a -70 °C, hasta su uso.

7

Detección de PUJP5 con anti-PUJP5 y anti-HDSS

La cepa de astrovirus porcino PUJP5 fue proporcionada por el laboratorio de Virología de la

Pontificia Universidad Javeriana. Para su multiplicación se utilizó la línea celular ESK-4

(“Embryonic swine kidney”, pasaje 30 hasta 37) sembrando células en botellas de 75 cm2 en

medio advanced DMEM (Invitrogen) suplementado con 5% de suero fetal bovino (SFB), L-

glutamina 0,2 mM, antibiótico y antimicótico. Para la valoración de la detección del virus se

sembraron en placa multipozos de 96 pozos, 50.000 células por pozo y a los 4 días esperando una

confluencia del 100% y después de una lavado con PBS se infectaron durante una hora a 37 °C,

5% de CO2 con PUJP5 previamente activado con 100 g/ml de tripsina pancreática.

Adicionalmente se incluyeron controles negativos de infección. Pasado este tiempo se retiró el

inoculo y se lavaron las células con PBS una vez y se agregaron 70 µl de medio Advanced

DMEM sin SFB durante 10h a 37 °C. A este tiempo se retiró el medio de cultivo y las células

fueron fijadas con acetona-PBS al 80% durante 15 min y se realizadon 3 lavados con PBS para

proceder a realizar la inmunomarcación utilizando como anticuerpo primario el suero anti-PUJP5

o anti-HDSS diluidos 1/2 desde 1/25 hasta 1/6400 y como anticuerpo secundario un anti-IgG de

conejo marcado con peroxidasa de rábano picante. Para revelar la reacción se usó AEC (aminoetil

carbazol).

Ensayos de neutralización de la infección in vitro de PUJP5 con anti-HDSS y anti-PUJP5

Para los ensayos de neutralización se tuvieron en cuenta los procedimientos realizados por Ting

et al. (2001); Koopmans et al. (1998); Hudson, Herrmann & Blacklow 1989. Así, primero se

inactivó con calor el sistema de complemento de cada suero a 55 °C por 0,5 h. En seguida se

activó PUJP5 con 100 mg/ml de tripsina pancreatica por 1h a 37 °C, posteriormente se agregó

inhibidor de tripsina de soya (Gibco). A continuación se co-incubaron diluciones ½ de los sueros

desde 1/25 hasta 1/6400 en advanced DMEM suplementado sin SFB con PUJP5 usando dos MOI

de infección (0,1 o 0,01), durante 1h a 37 °C. pasado este tiempo se agregaron 50 µl de esta

mezcla sobre la monocapa de células ESK-4 previamente lavadas con PBS una vez, se incubó

durante 1h a 37 °C. Adicionalmente se incluyó un control positivo de células infectadas con

PUJP5 sin suero hiperinmune y un control negativo de infección. Se retiró la mezcla y se hizo un

lavado con PBS, se añadieron 70 µl de DMEM sin SFB y se dejó por 10 h a 37C, 5% de CO2. A

este tiempo se retiró el medio de cultivo y las células fueron fijadas con acetona-PBS al 80%

8

durante 15 min y se realizaron 3 lavados con PBS para proceder a realizar la inmunomarcación

utilizando como anticuerpo primario el suero anti-PUJP5 a una dilución 1/3000 y como

anticuerpo secundario un anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa de rábano picante. Para

revelar la reacción se usó AEC (aminoetil carbazol). Todos los experimentos se realizaron 3

veces de forma independiente por triplicado.

Análisis de datos

Se realizó un registro fotográfico representativo y un análisis cualitativo de cada prueba. Se

compararon los resultados obtenidos y se determinó la capacidad neutralizante de cada antisuero

obtenido en cada uno de los tratamientos

Resultados

Se produjeron dos antisueros policlonales en conejos blancos Nueva Zelanda para valorar la

capacidad que tienen la partícula viral completa de astrovirus porcino cepa PUJP5 y el péptido

sintético de cápside HDSSGSEPEDEDVENNRVTL de generar anticuerpos neutralizantes de la

infección in vitro por PUJP5. Inicialmente se evaluó la inmunoreactividad de anti-PUJP5 y de

anti-HDSS usando varias concentraciones (½) de estos desde 1/25 hasta 1/6400. Los resultados

mostraron que anti-PUJP5 detecta específicamente el antígeno intracelular de PUJP5 a una

dilución mayor de 1/100, mientras a una dilución menor el antisuero es capaz de detectar

adicionalmente proteínas celulares (Datos no mostrados). Los ensayos de neutralización de la

infección in vitro por PUJP5 usando el antisuero obtenido contra la partícula viral completa

evidenciaron la presencia en este de anticuerpos capaces de neutralizar la infección totalmente

usando multiplicidades de infección de 0,1 y 0,01, a concentraciones iguales o menores de 1/400.

A partir de 1/800, se vio igualmente una neutralización parcial de la infección observándose una

proporción menor de células infectadas en comparación con el control positivo de infección sin el

antisuero (Fig. 1).

9

En el caso del antisuero producido contra HDSS, los resultados sugieren la detección intra-

citoplasmática del antígeno viral en células ESK-4 infectadas a una MOI de 0,1 usando

diluciones entre 1/25 y 1/100. Sin embargo, se vio que células no infectadas tienen una señal

similar cuando anti-HDSS es usado a una concentración de 1/25 sugiriendo reconocimiento de

proteínas celulares citoplasmáticas (Figura 2).

Los ensayos de neutralización indicaron que el antisuero obtenido contra el péptido sintético

HDSS no tienen la capacidad de neutralizar la infección in vitro por PUJP5 (Fig. 3).

10

Discusión

Como se puede observar en la figura 2, no fue clara la detección especifica de PUJP5 con el suero

anti-HDSS debido a que las células infectadas mostraron una tinción similar intra-citoplasmática

a las no infectadas particularmente en la dilución evaluada más concentrada. Adicionalmente, la

inmunoreactividad mostrada evidenció una detección hasta una dilución 1/100 la cual es muy

concentrada indicando que la estructura del péptido no permite considerarlo como una región útil

para la detección de PUJP5, no obstante, los análisis in sillico iniciales que mostraron una alta

accesibilidad del péptido sobre la cápside viral. Los análisis in sillico previos a este trabajo con el

péptido HDSS utilizando el software BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) no indicaron

similaridad de este con proteínas celulares reportadas, en cambio sí confirmaron su similaridad

con secuencias proteicas de astrovirus (Fig. 4).

11

Figura 4. Comparación de la secuencia del péptido HDSS con otras incluidas en BLAST

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blastho

me).

Adicionalmente en la prueba de neutralización de la infección por PUJP5 con anti-HDSS (figura

3) no se observó actividad neutralizante parcial ni total en comparación con el control positivo de

infección, no hubo bloqueo de la entrada del virus lo cual se correlaciona con los ensayos de

detección sugiriendo que la estructura de HDSS no permite desarrollar una respuesta humoral

suficiente para expresar anticuerpos que detecten o neutralicen al PUJP5. Asimismo, de los 20 aa

que componen HDSS, 4 no están presentes en la estructura homologa de PUJP5 sugiriendo que

estos pueden ser necesarios para una detección satisfactoria del antígeno viral en condiciones

nativas (Fig. 5).

Figura. 5. Comparación mediante alineamiento múltiple (Clustal W – MEGA 5) de la secuencia

del péptido HDSS con la región homologa de PUJP5.

12

Pese a contar solo con un análisis cualitativo, es posible afirmar que al comparar los resultados

obtenidos con los ensayos de neutralización cualitativamente se observó que anti-HDSS tuvo una

capacidad de bloqueo nula en comparación con la capacidad neutralizante observada con anti-

PUJP5 el cual bloqueo la infección de aproximadamente 330.000 uff/mL de PUJP5 a diluciones

menores de 1/400 sugiriendo que las partículas de astrovirus porcino contienen epítopes

neutralizantes de la infección, aspecto que podría ser tenido en cuenta para estudios posteriores

sobre la patogénesis que produce.

Previamente fue reportado que HAstV1 tiene en su estructura epítopes neutralizantes en una

región homologa a la estudiada en este trabajo (Matsui et al., 1993), concordando con los

estudios de Koopmans et al. (1998) y Bass & Upadhyayula (1997) en los que la infección por

algunos tipos de Astrovirus es autolimitada por anticuerpos neutralizantes e inclusive, en algunos

casos puede haber ausencia de sintomatología, sobre todo en individuos adultos quienes han

desarrollado defensas humorales muy efectivas contra HAstVs los cuales protegen ante dicha

infección. A pesar de la presencia de este tipo de inmunoglobulinas, para lograr una

neutralización completa de la infección viral también suele requerirse una sinergia entre estas y

otros componentes del sistema inmune del hospedero (Oyvind et al., 2004; Koci et al., 2004).

Finalmente se recomienda realizar ensayos de neutralización del PUJP5 producido en cerdos,

para ver si se producen AN en los hospederos naturales del virus.

Conclusiones

La estructura de la partícula viral de astrovirus porcino cepa PUJP5 tiene epítopes neutralizantes

de la infección in vitro. El péptido HDSS no es útil para la detección y neutralización de la

infección in vitro por la cepa de astrovirus porcino PUJP5.

Bibliografía

Bass, D. M., & Upadhyayula, U (1997) Characterization of human serotype 1 astrovirus-

neutralizing epitopes. Journal of virology 71 (11), 8666–71.

13

Blomström, A.-L., Widén, F., Hammer, A.-S., Belák, S., & Berg, M (2010) Detection of a novel

astrovirus in brain tissue of mink suffering from shaking mink syndrome by use of viral

metagenomics. Journal of clinical microbiology 48 (12), 4392–6.

De Benedictis, P., Schultz-Cherry, S., Burnham, A., & Cattoli, G (2011) Astrovirus infections in

humans and animals - molecular biology, genetic diversity, and interspecies transmissions.

Infection, genetics and evolution : journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics

in infectious diseases 11(7), 1529–44.

Dong, J., Dong, L., Méndez, E., & Tao, Y (2011) Crystal structure of the human astrovirus capsid

spike. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108

(31), 12681–6.

Herrmann, JE, Nowak, N. A., Perron-Henry, D. M., Hudson, R. W., Cubitt, W. D., & Blacklow,

N. R (1990) Diagnosis of astrovirus gastroenteritis by antigen detection with monoclonal

antibodies. Journal of Infectious Diseases, 161(2), 226-229.

Hudson, R., Herrmann, J., & Blacklow, N (1989) Plaque quantitation and virus neutralization

assays for human astroviruses. Archives of Virology, 108(1-2), 33-38.

Indik S, Valicek l, Smid B, Dvorakova H, Rodak L (2006) Isolation and partial characterization

of a novel porcine astrovirus. Veterinary Microbiology 117: 276–283.

Jonassen, C. M., Jonassen, T. O., Saif, Y. M., Snodgrass, D. R., Ushijima, H., Shimizu, M., &

Grinde, B ( 2001) Comparison of capsid sequences from human and animal astroviruses. The

Journal of general virology 82 (Pt 5), 1061–7.

King Andrew M.Q., Adams Michael J., Carstens Eric B., y Lefkowitz Elliot J (2012) Virus

taxonomy, Classification and Nomenclature of Viruses Ninth Report of the International

Committee on Taxonomy of Viruses. International Union of Microbiological Societies Virology

Division. Elsevier Academic press. Amsterdam 1272 p.

14

Koci, M. D., Kelley, L. A., Larsen, D., & Schultz-Cherry, S (2004) Astrovirus-induced synthesis

of nitric oxide contributes to virus control during infection. Journal of Virology, 78(3), 1564-

1574.

Koopmans, M. P., Bijen, M. H., Monroe, S. S., & Vinjé, J (1998) Age-stratified seroprevalence

of neutralizing antibodies to astrovirus types 1 to 7 in humans in The Netherlands. Clinical and

diagnostic laboratory immunology 5(1), 33–7.

Luo, Z., Roi, S., Dastor, M., Gallice, E., Laurin, M.-A., & L’homme, Y (2011) Multiple novel

and prevalent astroviruses in pigs. Veterinary microbiology 149(3-4), 316–23.

Matsui, S. M., Kim, J., Greenberg, H., Young, L., Smith, L., Lewis, T., Reyes, G (1993) Cloning

and characterization of human astrovirus immunoreactive epitopes. Journal of Virology, 67(3),

1712-1715.

Mendez-Toss., Griffin, D. D., Calva, J., Contreras, J. F., Puerto, F. I., Mota, F., Cedillo, R., Mun,

O., et al. (2004) Prevalence and Genetic Diversity of Human Astroviruses in Mexican Children

with Symptomatic and Asymptomatic Infections. Juournal of clinical microbiology 42(1), 151–

157.

Pativada, M., Nataraju, S. M., Ganesh, B., Rajendran, K., Ramamurthy, T., Ganguly, S.,

Bhattacharya, M. K., et al. (2012) Emerging trends in the epidemiology of human astrovirus

infection among infants, children and adults hospitalized with acute watery diarrhea in Kolkata,

India. Infection, genetics and evolution : journal of molecular epidemiology and evolutionary

genetics in infectious diseases 12 (8), 1685–93.

Pennisi (2011) Going Viral : Exploring the Role of Viruses in Our Bodies. Science VOL 331 25.

Schultz-Cherry, S (2013) Astrovirus research. Essential Ideas, Everyday Impacts, Future

Directions. Springer.

Ting, S H, Tan, H C, Lee, M A, & Ooi, E E (2001) Development of a simplified assay for the

detection of neutralizing antibodies to japanese encephalitis virus. Journal of Virological

Methods, 93(1), 43-47.

15

Thouvenelle, M L., Haynes, J S., & Reynolds, D L (1995) Astrovirus infection in hatchling

turkeys: Histologic, morphometric, and ultrastructural findings. Avian Diseases, 328-336.

Ulloa JC, and Gutierrez MF (2010) Genomic analysis of two ORF2 segments of new porcine

Astrovirus isolates and their close relationship with human astroviruses. Canandian Journal of

Microbiology 56: 569–577.

Ulloa, J. C., Guzmán, F., Guerrero, C. a, & Gutiérrez, M. F (2011) Identification of two

immunoreactive peptides useful for the detection of porcine astrovirus. Intervirology 55 (4), 311–

7.

Van Kraaij, M. G., Dekker, a W., Verdonck, L. F., Van Loon, a M., Vinjé, J., Koopmans, M. P.,

& Rozenberg-Arska, M (2000) Infectious gastro-enteritis: an uncommon cause of diarrhoea in

adult allogeneic and autologous stem cell transplant recipients. Bone marrow transplantation

26(3), 299–303.

Wang, Q.-H., Kakizawa, J., Wen, L.-Y., Shimizu, M., Nishio, O., Fang, Z.-Y. and Ushijima, H.(

2001). Genetic analysis of the capsid region of astroviruses. Journal of Medical Virology 64:

245–255.

Xiao, C.-T., Giménez-Lirola, L. G., Gerber, P. F., Jiang, Y.-H., Halbur, P. G., & Opriessnig, T(

2013) Identification and characterization of novel porcine astroviruses (PAstVs) with high

prevalence and frequent co-infection of individual pigs with multiple PAstV types. The Journal

of general virology 94(Pt 3), 570–82.