DetecciDeteccióón de Aln de Aléérgenos en Alimentos ...

CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN

Jornada sobre Alergias Alimentarias. Madrid, 21 de noviembre de 2012

Centro Nacional de Alimentación

Detección de Alérgenos en Alimentos. Actuaciones del Centro Nacional de

Alimentación

DetecciDeteccióón de Aln de Aléérgenos en Alimentos. rgenos en Alimentos. Actuaciones del Centro Nacional de Actuaciones del Centro Nacional de

AlimentaciAlimentacióónn

Mª Isabel Prieto SantosServicio de BiotecnologíaMMªª Isabel Prieto SantosIsabel Prieto SantosServicio de BiotecnologServicio de Biotecnologííaa



Los alLos aléérgenos alimentarios son rgenos alimentarios son proteproteíínas o glicoprotenas o glicoproteíínas nas presentes de forma natural en presentes de forma natural en los alimentos, tanto de origen los alimentos, tanto de origen vegetal como animalvegetal como animal

ALALÉÉRGENOS ALIMENTARIOSRGENOS ALIMENTARIOS

http://www.google.es/imgres?imgurl=http://www.vitadelia.com/images/2008/08/alimentos007.jpg&imgrefurl=http://www.vitadelia.com/tag/alimentos/page/15&usg=__DbORHaxrX08M_CfRBn2abvZuVYQ=&h=552&w=442&sz=32&hl=es&start=18&zoom=1&tbnid=aDm5_xxFthp6mM:&tbnh=133&tbnw=106&ei=9K3rTfqOPI-FswaXrJCCCQ&prev=/images?q=imagenes+alimentos&hl=es&sa=X&tbm=isch&itbs=1



PROTEPROTEÍÍNAS ALERGNAS ALERGÉÉNICAS NICAS

Alimento Proteínas Totales Proteína Alergénica PM

Cacahuete 29% Ara h1 Ara h2 Otras (arah3 a arah8)

63‐64 kD 17 kD

20% (proteínas del suero)

β‐lactoglobulinas α‐ lactoglobulinas

18 kD 13‐14 kD Leche

80% caseína α, β,κ,γ caseínas 19‐33kD

Huevo 11‐13%

Ovomucoide (Gal d 1) Ovoalbumina (Gal d 2) Ovotransferrina (Gal d 3) Lisozima

Trigo (Gluten)

10‐15 % α, β,γω Gliadinas y Gluteninas

Nuez

Ber e 1 9‐ 3 kD

Soja 70% Glicinina β‐Conglicinina Inhibidor de la tripsina

13‐14 kD 22‐25 kD

Mostaza Sin a 1 Bra j 1

15 kD 16 kD

Crustáceos Tropomiosina (Pen a1, Met e 1, Sa I y Sa II)

36 kD

Pescado Parvalbúmina (Gad c1 o alergeno M) 12 kD


A) MA) Méétodos Inmunoltodos InmunolóógicosgicosDetección de las proteínas alergénicas mediante anticuerpos específicos

B) MB) Méétodos basados en Biologtodos basados en Biologíía Moleculara MolecularDetección de secuencias diana de ADNmediante PCR

C) MC) Méétodos todos cromatogrcromatográáficosficosUtilizados en investigación

ANANÁÁLISIS DE ALLISIS DE ALÉÉRGENOS EN ALIMENTOSRGENOS EN ALIMENTOS



Métodos basados en la detección de una o más proteínas o fragmentos proteicos (alérgeno), mediante la unión especifica antígeno‐anticuerpo

A) MA) MÉÉTODOS INMUNOLTODOS INMUNOLÓÓGICOS GICOS

a) Enzimoinmunoensayo ELISAELISA sandwichELISA competitivoELISA directo

b) Métodos rápidos (tiras inmunocromatográficas)



SISTEMAS DE FLUJO LATERAL (LFD) o TIRAS REACTIVASSISTEMAS DE FLUJO LATERAL (LFD) o TIRAS REACTIVASSISTEMAS DE FLUJO LATERAL (LFD) o TIRAS REACTIVAS

•Sistemas cualitativos (puede ser utilizados como semicuantitativoscon precaución) •Utilidad para muestreo ambiental, verificación zonas de limpieza, screening•Disponibles para muchos alérgenos•Rápidos•Sencillos•Sensibilidad declarada (5 mg/kg (ppm))



MMéétodo ELISA todo ELISA SandwichSandwich : Etapas: EtapasExtracto de laExtracto de lamuestramuestra

IncubaciónAnticuerpo Anticuerpo conjugadoconjugado

lavado

SustratoSustrato

FrenadoFrenado




TEPNEL BIOKITS

SISTEMAS ELISASISTEMAS ELISASISTEMAS ELISA

AgraQuant®Métodos directos :DETECTAN LAS PROTEDETECTAN LAS PROTEÍÍNASNAS

ALERGALERGÉÉNICASNICAS

Cuantitativos

RápidosNo requiere equipos demasiado

complejos (lector de placas)

ALTA SENSIBILIDADALTA SENSIBILIDAD: La mayoría de los ELISA declaran una sensibilidad suficiente para detectar concentraciones relativamente pequeñas de alérgenos (adecuados para proteger al consumidor)

(Límite de detección : entre 0,5 mg/kg (ppm) a 5mg/kg (ppm))

http://www.r-biopharm.com/index.php?


Limitaciones analLimitaciones analííticas en el control de alticas en el control de aléérgenos: rgenos:

A) Extracción de proteínas alergénicas

B) Diferencias en los distintos sistemas ELISA

C) No disponibilidad de MR certificados

A)A) ExtracciExtraccióón de proten de proteíínas alergnas alergéénicasnicas

B)B) Diferencias en los distintos sistemas ELISADiferencias en los distintos sistemas ELISA

C)C) No disponibilidad de MR certificadosNo disponibilidad de MR certificados


http://www.google.es/imgres?imgurl=http://www.vitadelia.com/images/2008/08/alimentos007.jpg&imgrefurl=http://www.vitadelia.com/tag/alimentos/page/15&usg=__DbORHaxrX08M_CfRBn2abvZuVYQ=&h=552&w=442&sz=32&hl=es&start=18&zoom=1&tbnid=aDm5_xxFthp6mM:&tbnh=133&tbnw=106&ei=9K3rTfqOPI-FswaXrJCCCQ&prev=/images?q=imagenes+alimentos&hl=es&sa=X&tbm=isch&itbs=1

http://fitnessvirtual.files.wordpress.com/2011/04/frutos-secos-1.jpg

http://www.midieta.com/uploadedImages/z_zTemp/Spanish_Content/Article/Pescados y mariscos para tu familia 1907.jpg

http://www.google.es/imgres?imgurl=http://www.blogalimentos.com/files/uploads/la-soja-estrella-de-las-legumbres.jpg&imgrefurl=http://blogalimentos.com/la-soja-estrella-de-las-legumbres/&usg=__8FuMfbuFpGx3_MTWUTzkwFZCKJM=&h=275&w=320&sz=38&hl=es&start=2&zoom=1&tbnid=1o-P2wBTd0UvQM:&tbnh=101&tbnw=118&ei=bV_tTZjmPIeX8QO6nrSWAQ&prev=/images?q=imagenes+soja&hl=es&sa=X&tbm=isch&itbs=1


A)Dificultad de la extracción de proteínas alergénicas en los alimentos

A)A) Dificultad de la extracciDificultad de la extraccióón de proten de proteíínas alergnas alergéénicas nicas en los alimentosen los alimentos

a) Influencia del procesado en las propiedades de las proteínas alergénicas

b) Complejidad de la matriz que contiene el alérgenoPolifenoles y taninosGrasaspH

c) Distribución en el alimento

a) Influencia del procesado en las propiedades de las proteínas alergénicas

b) Complejidad de la matriz que contiene el alérgenoPolifenoles y taninosGrasaspH

c) Distribución en el alimento

La facilidad y/o dificultad de la extracción depende:



Desarrollo de adecuadosprocedimientos de extracción

Kits comerciales suministran sus propios tampones de extracciónProcesos rápidos y fáciles de realizar

•Composición desconocida (PBS, Tris/ClNa,....)•Similares para todos los alérgenos

Necesidad de aditivos especiales:• gelatina de pescado• leche en polvo• sustancias reductoras ( β-mercaptoetanol)• urea 6 mol/litro• agentes surfactantes (1% Tween 20® 0,4% Triton X-100®,

4% SDS)Jornada sobre Alergias Alimentarias. Madrid, 21 de noviembre de 2012

RETORETO



ESTUDIOS SOBRE EL EFECTO MATRIZ ( CNA)ESTUDIOS SOBRE EL EFECTO MATRIZ ( CNA)

Efecto de la matriz en alimentos ricos en taninos y polifenoles

• Cacao, chocolate y derivados• Café y Té• Frutas ricas en taninos: • Uvas, platano, manzana, pera…• Frutos secos con piel:

castaña…..


““Efecto de matriz rica en taninos (muestras con alto contenido eEfecto de matriz rica en taninos (muestras con alto contenido en chocolate) n chocolate) en la deteccien la deteccióón de gluten en alimentos.n de gluten en alimentos.

OBJETIVOOBJETIVO: Mejorar el rendimiento de la extracciMejorar el rendimiento de la extraccióónn


Valor esperado 20 Valor esperado 20 mgmg//kgkgde glutende gluten

Muestra extraMuestra extraíída con da con ““solucisolucióón n cocktailcocktail””RecuperaciRecuperacióón < 80%n < 80%

Muestra extraMuestra extraíída con da con ““solucisolucióón n cocktailcocktail”” con leche con leche desnatadadesnatada

RecuperaciRecuperacióón > 80%n > 80%

mg/

kgde

Glu

ten

Datos : Procedentes de los Estudios de ValidaciDatos : Procedentes de los Estudios de Validacióón del procedimiento de n del procedimiento de ““DeterminaciDeterminacióón de glutenn de glutenen alimentosen alimentos”” realizados en el CNA realizados en el CNA


““La influencia de los polifenoles en la detecciLa influencia de los polifenoles en la deteccióón de gluten en alimentos infantiles n de gluten en alimentos infantiles hidrolizados a base de fruta . Efectos de la matriz en la extrachidrolizados a base de fruta . Efectos de la matriz en la extraccicióón de las proten de las proteíínas del nas del glutengluten””

OBJETIVOOBJETIVO: Comprobar el efecto inhibidor de los polifenoles presentes en alComprobar el efecto inhibidor de los polifenoles presentes en alimentos con imentos con alto contenido en fruta en la extraccialto contenido en fruta en la extraccióón de gluten.n de gluten.

PROCEDIMIENTO: PROCEDIMIENTO: ComprobaciComprobacióón del Rendimiento de extraccin del Rendimiento de extraccióón de diferentes tipos de n de diferentes tipos de soluciones en alimentos infantiles ricos en fruta (papillas infasoluciones en alimentos infantiles ricos en fruta (papillas infantiles de frutas):ntiles de frutas):

1.1.‐‐ SoluciSolucióón n CocktailCocktail con Etanol al 80%con Etanol al 80%2.2.‐‐ SoluciSolucióón de n de GuanidinaGuanidina / / ββ‐‐mercaptoetanolmercaptoetanol / / IsopropanolIsopropanol3.3.‐‐ SoluciSolucióón 1 con Gelatina de pescadon 1 con Gelatina de pescado4.4.‐‐ SoluciSolucióón 1 con leche desnatadan 1 con leche desnatada



RESULTADOSRESULTADOS:

1.1.‐‐ SoluciSolucióón n CocktailCocktail con Etanol al 80% con Etanol al 80% ‐‐‐‐ 2.2.‐‐ SoluciSolucióón de n de GuanidinaGuanidina / / ββ‐‐mercaptoetanolmercaptoetanol / / IsopropanolIsopropanol‐‐‐‐3.3.‐‐ SoluciSolucióón 1 con Gelatina de pescadon 1 con Gelatina de pescado‐‐‐‐ 4.4.‐‐ SoluciSolucióón 1 con leche desnatadan 1 con leche desnatada

Muestras adicionadas con 40 Muestras adicionadas con 40 mgmg//kgkg de Glutende Gluten



Detectan diferentes proteínas(Diferente sistemas antígeno‐anticuerpo)

Utilizan diferentes calibrantes

Diferentes unidades de expresión de resultados

B) Diferencia de resultados entre distintos sistemas ELISAB) Diferencia de resultados entre distintos sistemas ELISA


ESTUDIOS SOBRE EL COMPORTAMIENTO DEESTUDIOS SOBRE EL COMPORTAMIENTO DELOS DISTINTOS SISTEMASLOS DISTINTOS SISTEMAS


ESPECIFICACIONES DE LOS KITS DE DETECCIESPECIFICACIONES DE LOS KITS DE DETECCIÓÓN DE PROTEN DE PROTEÍÍNAS DE HUEVONAS DE HUEVO

SISTEMA ELISA ESPECIFICIDADUNIDADES DE

MEDIDACALIBRANTE

RANGO DE CUANTIFICACIONmg/kg (ppm)

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

LCmg/kg (ppm)

AAnticuerpo policlonalOvomucoide(Gald1)

Proteína blanca de huevo (EWP)

NIST SRM8445(Huevo seco entero en polvo)

0,5 – 10 0,5

B ‐Huevo entero en polvo

Proteína total de huevo 2,5 ‐ 25 2,5

CAnticuerposOvomucoide(Gald1)

Huevo entero en polvo

‐ 1‐ 10 1

DOvoalbúmina y ovomucoide(Gald 1 y Gald 2)

Huevo entero en polvo

NIST SRM8445(Huevo seco entero en polvo)

0,5‐ 13,5 0,5

DIFERENTES

PROTEIN

AS

DIFERENTES

PROTEIN

AS

DIFERENTES

UNIDA

DES D

E MEDIDA

DIFERENTES

UNIDA

DES D

E MEDIDA

DIFERENTE CALIB

RANTE

DIFERENTE CALIB

RANTE

DIFEREN

TE LC

DIFEREN

TE LC



Preparación de muestras cargadas con NIST SRM 8445 ( Huevo entero enPolvo , Valor de referencia 48% ± 1% Proteína total de Huevo)

1 2 3 4MUESTRAS

Valor Esperado

mg/kg (ppm) proteína blanca de

huevo

mg/kg (ppm)Huevo entero en

polvo


polvo


polvo

Galleta 3 mg/kg huevo entero en polvo 1,1 5,6 3,15 4

Pasta 6 mg/kg huevo entero en polvo 2,6 8,2 5,58 8

Bollo 3 mg/kg huevo entero en polvo 1,21 6,8 3,05 3

Helado1,5 mg/kg huevo entero en polvo 0,53 3,4 1,72 1,6

Vino 1,5 mg/kg huevo entero en polvo 1, 35 2,4 1,7 1,6

Estudio Comparativo kits ELISA determinaciEstudio Comparativo kits ELISA determinacióón de proten de proteíínas de huevonas de huevo

Resultados con muestras de valor conocido Resultados con muestras de valor conocido



Valor esperado en mg/kg de huevo entero en polvo1234

Resultado expresado en mg/kg de huevo entero en polvo




Estudio Comparativo kits ELISA determinaciEstudio Comparativo kits ELISA determinacióón de Avellanan de Avellana

Sistema ELISASistema ELISA ExpresiExpresióón de resultadon de resultado Limite de Limite de cuantificacicuantificacióónn

1 Proteína de avellana 0,5 mg/kg

2 Avellana 1 mg/kg

3 Avellana 2,5 mg/kg

4 Avellana 2,5 mg/kg



Nº de Muestras DETECTADO NO DETECTADO

Puede contener trazas de avellana….Rastros de avellana……….Trazas de frutos secos…..Frutos de cascara…….No Figura Avellana entre sus ingredientes No contiene Frutos secosContiene avellanasCon un x% de avellanaPasta de avellana

ETIQUETADO PRESENCIA DE AVELLANA

10 2 8

10 9 1

10 6 4

DUDOSA

SDUDOSA

SNEG

ATIVAS

NEG

ATIVAS

POSITIVAS

POSITIVAS

RESULTADOS INICIALES CON UN RESULTADOS INICIALES CON UN ÚÚNICO KITNICO KIT



DISTINTOS SISTEMAS ELISA

1 2 3 4

LC 0,5 mg/kg (ppm) de Proteína de

avellana

LC 1 mg/kg (ppm) de Avellana

LC 2,5 mg/kg (ppm) de Avellana

LC 2,5 mg/kg (ppm) de Avellana

MUESTRAS POSITIVAS /NO ETIQUETADAS

Galleta con chocolateNo figura avellana entre sus ingredientes > 5 mg/kg 35 mg/kg 15,5 mg/kg > 20 mg/kg

Galleta multivitaminada

No figura avellana entre sus ingredientes 0,7 mg/kg 2,9 mg/kg 4,9 mg/kg 8,3 mg/kg

MUESTRAS POSITIVAS / ETIQUETADAS

Pastel Avellana 2% NO DETECTADO NO DETECTADO 3,6 mg/kg NO DETECTADO

MUESTRAS ETIQUETADO DUDOSO

Chocolate Rastros de avellana NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO

BarquilloPuede contener trazas de nueces, almendras y soja

NO DETECTADO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO

Turrón Trazas de frutos secos NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO

ChocolateRastros de cacahuete,avellana y almendra

NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO



RecuperaciRecuperacióón con muestras fortificadas con 5 n con muestras fortificadas con 5 mgmg//kgkg de avellanade avellana

Preparación de muestrasfortificadas, mediantemezcla de variedades de avellana

PreparaciPreparacióón de muestrasn de muestrasfortificadas, mediantefortificadas, mediantemezcla de variedades mezcla de variedades de avellanade avellana

C) No Disponibilidad de Materiales de Referencia C) No Disponibilidad de Materiales de Referencia



Detección mediante PCR de secuencias de ADN :especificas del alimento alergénicosecuencias de ADN que codifican la proteína alergénica

Desarrollo de kits comerciales (Límite de sensibilidad declarado menos de 2,5 ppm de alimento alergénico )

B) MB) MÉÉTODOS BIOLOGTODOS BIOLOGÍÍA MOLECULAR A MOLECULAR –– ReacciReaccióón de la n de la Polimerasa en Cadena Polimerasa en Cadena ‐‐ PCRPCR



VENTAJASVENTAJAS

Gran sensibilidadGran especificidadFácil de usarMayor estabilidad

Cumple con el Reglamento (UE) 1169/2011Útil si no existe ELISAVerificar resultados

cuestionables (ej: proteínas hidrolizadas)Bueno como método confirmativo

INCONVENIENTESINCONVENIENTES

No detectan la proteNo detectan la proteíínanaalergalergéénicanicaNo relaciNo relacióón constanten constante

entre presencia deentre presencia deADN y ProteADN y ProteíínanaCualitativo o Cualitativo o

semicuantitativosemicuantitativo( no se puede comparar( no se puede compararunidades de medida)unidades de medida)


CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACION

Alcance actual de acreditación del CNA bajo la Norma UNE‐EN ISO 17025, en el campo de alérgenos

Gluten, en 2009Cacahuete, en 2010Proteínas lácteas, en 2010

β‐lactoglobulinaCaseína

Proteínas de huevo, en 2012Ampliación de alcance de Acreditación ( Próxima

auditoria de ENAC, 2013) Detección de avellana




Centro Nacional de Alimentación

Muchas Gracias Muchas Gracias

Directora del CNADirectora del CNAMMªª Teresa LTeresa Lóópez Esteban pez Esteban [email protected]@msssi.esServicio de BiotecnologServicio de BiotecnologííaaMMªª Isabel Prieto Santos Isabel Prieto Santos [email protected]@msssi.es

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