DESARROLLO DE UNA TÉCNICA PARA EL ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD IN VITRO A ANFOTERICINA B MEDIANTE...

DESARROLLO DE UNA TÉCNICA PARA EL DESARROLLO DE UNA TÉCNICA PARA EL

ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD IN VITROIN VITRO

A ANFOTERICINA B MEDIANTE A ANFOTERICINA B MEDIANTE

CITOMETRÍA DE FLUJO CITOMETRÍA DE FLUJO

MULTIPARAMÉTRICAMULTIPARAMÉTRICA

- Lourdes Cordón –Lourdes Cordón –

Servicio de Hematología y HemoterapiaServicio de Hematología y Hemoterapia

Hospital Universitario La FeHospital Universitario La Fe

22 de abril de 201022 de abril de 2010

IntroducciónIntroducción-- Proyecto Proyecto

-- Antecedentes Antecedentes ObjetivoObjetivo Material y métodosMaterial y métodos ResultadosResultados

-- Puesta a punto de la técnica Puesta a punto de la técnica

-- Actividad sobre Actividad sobre Candida Candida sppspp

-- C. albicansC. albicans

-- C. parapsilosis C. parapsilosis

-- Otras especies de Otras especies de CandidaCandida ConclusionesConclusiones

DESARROLLO DE UNA TÉCNICA PARA EL ESTUDIO DESARROLLO DE UNA TÉCNICA PARA EL ESTUDIO

DE LA SENSIBILIDAD DE LA SENSIBILIDAD IN VITROIN VITRO A ANFOTERICINA B A ANFOTERICINA B

(AMB) MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO (AMB) MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO

MULTIPARAMÉTRICAMULTIPARAMÉTRICA

INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN- PROYECTO -- PROYECTO -

-Estudio Colaborativo: Hematología – Microbiología ExperimentalEstudio Colaborativo: Hematología – Microbiología Experimental

-Financiación con Fondos PrivadosFinanciación con Fondos Privados

-Autorización por la Fundación para la Investigación Hospital Autorización por la Fundación para la Investigación Hospital

Universitario La Fe (Grupo MICELIUM, Proyecto nº 2010/004)Universitario La Fe (Grupo MICELIUM, Proyecto nº 2010/004)

-Equipamiento: CMF FACSCalibur (Becton Dickinson)Equipamiento: CMF FACSCalibur (Becton Dickinson)

-Investigadores: Dr. Javier Pemán Dr. Isidro JarqueInvestigadores: Dr. Javier Pemán Dr. Isidro Jarque

Dra. Amparo Sempere Dra. Emilia CantónDra. Amparo Sempere Dra. Emilia Cantón

Eva González Lourdes CordónEva González Lourdes Cordón

INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN- ANTECEDENTES -- ANTECEDENTES -

- Aumento de la incidencia de infecciones fúngicas invasorasAumento de la incidencia de infecciones fúngicas invasoras

- Infecciones oportunistas por Infecciones oportunistas por Candida Candida spp: elevada morbi-spp: elevada morbi-

mortalidad en pacientes inmunodeprimidosmortalidad en pacientes inmunodeprimidos

- Prevalencia variablePrevalencia variable

- Anfotericina B: AF de referenciaAnfotericina B: AF de referencia


-- Métodos estandarizados para estudio de sensibilidad Métodos estandarizados para estudio de sensibilidad in vitro in vitro

a los antifúngicos a los antifúngicos (1, 2)(1, 2)

- Escasa precisión en la detección de resistencia a AMBEscasa precisión en la detección de resistencia a AMB

- Limitado crecimiento de algunos organismosLimitado crecimiento de algunos organismos

- Lectura visual imprecisa en ocasionesLectura visual imprecisa en ocasiones

- Larga duración de la técnica: 24–48 horasLarga duración de la técnica: 24–48 horas

(1) Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing (ASFT) of the ESCMID European Committee for

Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), EUCAST Definitive Document E.DEF 7.1. Method for

the determination of broth dilution of antifungal agents for fermentative yeasts. Clin. Microb. Infect.

14: 398-405 (2008)

(2) Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility

Testing of Yeasts, Approved Standard. CLSI Document M27-A3. Clinical and Laboratory Standards

Institute, Wayne, PA, USA (2008)


NECESIDAD ESTUDIOS NECESIDAD ESTUDIOS SENSIBILIDAD SENSIBILIDAD IN VITROIN VITRO A LOS A LOS

ANTIFÚNGICOSANTIFÚNGICOS

CRECIENTE INCIDENCIA CRECIENTE INCIDENCIA INFECCIONES FÚNGICAS INFECCIONES FÚNGICAS

INVASORASINVASORAS

INTRODUCCIÓN NUEVOS INTRODUCCIÓN NUEVOS ANTIFÚNGICOSANTIFÚNGICOS

TÉCNICAS DE TÉCNICAS DE REFERENCIAREFERENCIA

NO SON PRÁCTICASNO SON PRÁCTICAS

SON LABORIOSAS Y SON LABORIOSAS Y LARGASLARGAS

CMFCMF

• Detección hongos en cultivo– Características morfométricas

– Marcadores específicos viabilidad y actividad


La Citometría de Flujo Aplicada al Estudio de la La Citometría de Flujo Aplicada al Estudio de la

Sensibilidad Sensibilidad in vitroin vitro a los Antifúngicos a los Antifúngicos

• VentajasVentajas– Mayor objetividad y sensibilidad– Análisis multiparamétrico individual de gran número de

microorganismos– Disminución de los periodos de incubación– Rápida evaluación del patrón de sensibilidad antifúngica

• DesventajasDesventajas– Elevado coste de equipos– Operadores experimentados– Escasa disponibilidad de fluorocromos


Desarrollo de una Desarrollo de una técnica rápidatécnica rápida para el estudio para el estudio

in vitroin vitro de la sensibilidad a los antifúngicos de la sensibilidad a los antifúngicos

utilizando la citometría de flujo como alternativa a utilizando la citometría de flujo como alternativa a

los métodos de microdilución estandarizados y los métodos de microdilución estandarizados y

comercializados en la actualidadcomercializados en la actualidad

OBJETIVOOBJETIVO

FLUOROCROMOFLUOROCROMO λ λ exex (nm)(nm) λ λ em (máx)em (máx) (nm) (nm) CÉLULAS MARCADASCÉLULAS MARCADAS

NARANJA DE TIAZOL (NT)

488 533 TODAS

YODURO DE PROPIDIO (IP)

488 630 NO VIABLES

FUN®-1 488 588 ACTIVAS METABÓLICAMENTE

MATERIAL Y MÉTODOSMATERIAL Y MÉTODOS


CEPA / AISLADO CLÍNICOCEPA / AISLADO CLÍNICO INTERVALOS DE CMI (µg/mL) DE AMBINTERVALOS DE CMI (µg/mL) DE AMB

C. albicans CA-365C. albicans CA-365 0,5 – 10,5 – 1

C. albicans CA-354C. albicans CA-354 0,12 – 0,250,12 – 0,25

C. albicans CA-361C. albicans CA-361 0,5 – 10,5 – 1

C. parapsilosis ATCC-22019C. parapsilosis ATCC-22019 0,25 – 20,25 – 2

C. krusei ATCC-6258C. krusei ATCC-6258 0,5 – 20,5 – 2

C. albicans ATCC-200955C. albicans ATCC-200955 1 – 21 – 2

Conservación en suspensión en suero salino a T.A. Dos pases en agar Sabouraud

dextrosa (SDA, Bionica S.L., España) previo al procesamiento para estimular el

crecimiento


PREPARACIÓN SUSPENSIÓN LEVADURASPREPARACIÓN SUSPENSIÓN LEVADURAS

Colonias en SS a D.O. 0,5 Mc. Farland (5x106 ufc/mL)

1/10

5x105 ufc/mL en RPMIDiluciones

1/10

1/102

1/103

1/104

1/105

Autoclave 121ºC 10 min

PREPARACIÓN ANFOTERICINA BPREPARACIÓN ANFOTERICINA B

10000 μg/mL

1/100

100 μg/mL

Diluciones seriadas [AMB] 8; 4; 2; 1; 0,5;

0,25; 0,125; 0 μg/mL

VIVAS

MUERTAS


PREPARACIÓN MUESTRAS CMFPREPARACIÓN MUESTRAS CMF

2 mL diluciones AMB2 mL diluciones AMB 2 mL suspensión levaduras2 mL suspensión levaduras++

NT + IP: 5; 2,5; 1 o 0,20 NT + IP: 5; 2,5; 1 o 0,20 μμL (5 min, T.A.)L (5 min, T.A.) FUN-1: 10; 5 o 2,5 FUN-1: 10; 5 o 2,5 μμL (30 min, 35,5 ºC)L (30 min, 35,5 ºC)

500 500 μμL cada [AMB] con levadurasL cada [AMB] con levaduras

++

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

++

Adquisición a 0, 2, 4, 6, 8 y 22 horasAdquisición a 0, 2, 4, 6, 8 y 22 horas Adquisición a intervalos entre 30 min y 2 Adquisición a intervalos entre 30 min y 2 horas durante un máximo de 6 horashoras durante un máximo de 6 horas

35,5 ºC agitación suave35,5 ºC agitación suave

Lavado a 3000g 10 minutosLavado a 3000g 10 minutos

Resuspensión pellet en HResuspensión pellet en H22OO


CALIBRACIÓN CMFCALIBRACIÓN CMF

FACSCalibur (Becton Dickinson)FACSCalibur (Becton Dickinson)

Calibración específica fluorocromoCalibración específica fluorocromo

SSC y FSC: log, umbral: SSCSSC y FSC: log, umbral: SSC

ADQUISICIÓN DE MUESTRASADQUISICIÓN DE MUESTRAS

ANÁLISIS DE DATOSANÁLISIS DE DATOS

CellQuest Pro (Becton Dickinson)CellQuest Pro (Becton Dickinson)

Velocidad media / altaVelocidad media / alta

10000 eventos en región de células por SSC/FSC10000 eventos en región de células por SSC/FSC

Limpieza con CONTRADLimpieza con CONTRAD

InfiniCyt (Cytognos): estrategia de análisis secuencialInfiniCyt (Cytognos): estrategia de análisis secuencial


LECTURA VISUALLECTURA VISUAL

-- Suspensiones de levaduras con antifúngico a 35 ºC Suspensiones de levaduras con antifúngico a 35 ºC

-- Lectura visual de los tubos a las 24 y a las 48 horas Lectura visual de los tubos a las 24 y a las 48 horas

-- Comparación de la turbidez del tubo control sin AMB con el resto de Comparación de la turbidez del tubo control sin AMB con el resto de

tubos con concentraciones crecientes de AMBtubos con concentraciones crecientes de AMB

-- CMI (CLSI): concentración más baja de AMB que inhibía por completo CMI (CLSI): concentración más baja de AMB que inhibía por completo

el crecimiento (no turbidez)el crecimiento (no turbidez)

RESULTADOSRESULTADOS- PUESTA A PUNTO DE LA TÉCNICA -- PUESTA A PUNTO DE LA TÉCNICA -

PREPARACIÓN DEL CMFPREPARACIÓN DEL CMF

C. albicans vivas

C. albicans muertas

C. parapsilosis vivas

C. parapsilosis muertas

C. albicans (NT + IP)

C. albicans (FUN-1)


CONCENTRACIÓN DEL INÓCULOCONCENTRACIÓN DEL INÓCULO

5x106 ufc/mL en RPMI + DILUCIONES SERIADAS 1/10, 1/102, 1/103, 1/104, 1/105

CÉLULAS MUERTASCÉLULAS MUERTASCÉLULAS VIVASCÉLULAS VIVAS

5X105X1055 ufc/mL: ufc/mL:

- Adecuada tasa de eventos- Adecuada tasa de eventos

- Buena discriminación- Buena discriminación

NT + IPNT + IP FUN-1FUN-1 NT + IPNT + IP FUN-1FUN-1


VOLUMEN DE LOS FLUOROCROMOSVOLUMEN DE LOS FLUOROCROMOS

NT + IP: 5, 2,5, 1 o 0,20 NT + IP: 5, 2,5, 1 o 0,20 μμLL

FUN-1: 10, 5 o 2,5 FUN-1: 10, 5 o 2,5 μμLL

0,20 0,20 μμLL

2,5 2,5 μμLL

- Discriminación de poblaciones celulares- Discriminación de poblaciones celulares

- No producía ruido de fondo- No producía ruido de fondo

- Ahorro de reactivo- Ahorro de reactivo

SENSIBILIDAD A AMB MEDIANTE CMFSENSIBILIDAD A AMB MEDIANTE CMF


C. parapsilosis ATCC-22019C. parapsilosis ATCC-22019

AMB 0 μg/mL

T=0 hs

AMB 0 μg/mL

T=0 hs

AMB 8 μg/mL

T=22 hs

AMB 8 μg/mL

T=22 hs

AMB 0 μg/mL

T=0 hs

AMB 0 μg/mL

T=0 hs

AMB 8 μg/mL

T=2 hs

AMB 8 μg/mL

T=2 hs


Cepa/Aislado clínicoCepa/Aislado clínico MarcadorMarcador[AMB][AMB]ACTIVAACTIVA

((μμg/mL)g/mL)T (min)T (min) LECTURA (24 hs) LECTURA (24 hs)

(μg/mL)(μg/mL)CMI (CLSI) CMI (CLSI)

(μg/mL)(μg/mL)

C. parapsilosis ATCC-22019 NT + IP 1 >480 ND 0,25 – 2

C. krusei ATCC-6258 NT + IP 1 >120 ND 0,5 – 2

C. albicans CA-354 NT + IP 0,5 >480 0,125 0,12 – 0,25

C. albicans CA-361 FUN-1 0,125 30 0,25 0,5 – 1

C. albicans CA-365 FUN-1 0,125 30 0,5 0,5 – 1

C. parapsilosis ATCC-22019 FUN-1 0,125 30 0,125 0,25 – 2

C. albicans ATCC-200955 FUN-1 >8 >120 >8 1 – 2


C. parapsilosis ATCC-22019 FUN-1 0,125 >140 0,125 0,25 – 1

C. albicans ATCC-200955 FUN-1 >8 >120 0,25 1 – 2



Cepa/Aislado clínicoCepa/Aislado clínico MarcadoMarcadorr

[AMB][AMB]ACTIVAACTIVA

((μμg/mL)g/mL)T (min)T (min) LECTURA (24 hs) LECTURA (24 hs)

(μg/mL)(μg/mL)CMI (CLSI) CMI (CLSI)

(μg/mL)(μg/mL)

C. parapsilosis ATCC-22019 NT + IP 1 >480 ND 0,25 – 2

C. krusei ATCC-6258 NT + IP 1 >120 ND 0,5 – 2

C. albicans CA-354 NT + IP 0,5 >480 0,125 0,12 – 0,25

C. albicans CA-361 FUN-1 0,125 30 0,25 0,5 – 1

C. albicans CA-365 FUN-1 0,125 30 0,5 0,5 – 1


C. albicans ATCC-200955 FUN-1 >8 >120 >8 1 – 2


C. parapsilosis ATCC-22019 FUN-1 0,125 >140 0,125 0,25 – 1



RESULTADOSRESULTADOS- ACTIVIDAD SOBRE - ACTIVIDAD SOBRE Candida spp -Candida spp -

• Candida albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata• AMB: 0,03125 – 8 μg/mL• FUN-1 (actividad metabólica)• Células no lavadas• Lectura turbidez a 24 y 48 horas

• CMI (CMF): concentración más baja de AMB que, en el menor tiempo, disminuye la actividad metabólica por debajo de un 80%

RESULTADOSRESULTADOS - ACTIVIDAD SOBRE - ACTIVIDAD SOBRE Candida albicans -Candida albicans -

VIABILIDAD CELULAR DE C. albicans CA-357 A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE AMB Y TIEMPO

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

0 30 60 90 120 150 tiempo (min)

Nº

célu

las

(%)

AMB 0 ug/mL

AMB 0,03125 ug/mL

AMB 0,0625 ug/mL

AMB 0,125 ug/mL

AMB 0,25 ug/mL

AMB 0,5 ug/mL

AMB 1 ug/mL

AMB 2 ug/mL

CMI (CMF): 0,125 μg/mL AMB (T=60 minutos)

RESULTADOSRESULTADOS - ACTIVIDAD SOBRE - ACTIVIDAD SOBRE Candida albicans -Candida albicans -

AISLADOAISLADO CMI (CMF)CMI (CMF) CMI 24 hs (CLSI)CMI 24 hs (CLSI) CMI 48 hs (CLSI)CMI 48 hs (CLSI)

C. albicans CA-369 0,125 NV NV

C. albicans CA-368 0,0625 0,25 0,25

C. albicans CA-367 0,0625 0,25 0,25

C. albicans CA-364 0,03125 0,125 0,25

C. albicans CA-362 0,125 0,0625 >2

C. albicans CA-361 0,125 0,125 0,125

C. albicans CA-363 0,0625 0,0625 >2

C. albicans CA-360 0,03125 >2 >2

C. albicans CA-359 0,125 >2 >2

C. albicans CA-358 0,125 0,5 0,5

C. albicans CA-357 0,125 0,125 0,25

RESULTADOSRESULTADOS - ACTIVIDAD SOBRE - ACTIVIDAD SOBRE Candida parapsilosis -Candida parapsilosis -

VIABILIDAD CELULAR DE C. parapsilosis CP-396 A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE AMB Y TIEMPO

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

0 30 60 90 120 150 tiempo (min)

Nº

célu

las

(%)

AMB 0 ug/mL

AMB 0,03125 ug/mL

AMB 0,0625 ug/mL

AMB 0,125 ug/mL

AMB 0,25 ug/mL

AMB 0,5 ug/mL

AMB 1 ug/mL

AMB 2 ug/mL


RESULTADOSRESULTADOS - ACTIVIDAD SOBRE - ACTIVIDAD SOBRE Candida parapsilosis -Candida parapsilosis -

AISLADOAISLADO CMI CMI (CMF)(CMF) CMI 24 hs (CLSI)CMI 24 hs (CLSI) CMI 48 hs (CLSI)CMI 48 hs (CLSI)

C. parapsilosis CP-406 0,125 NV NV





C. parapsilosis CP-400 0,125 0,125 0,125



C. parapsilosis CP-397 0,03125 0,125 NV


RESULTADOSRESULTADOS- ACTIVIDAD SOBRE OTRAS ESPECIES DE - ACTIVIDAD SOBRE OTRAS ESPECIES DE Candida -Candida -

VIABILIDAD CELULAR DE C. tropicalis CT-068 A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE AMB Y TIEMPO

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

0 30 60 90 120 150 180 210 240 tiempo (min)

Nº

célu

las

(%)

AMB 0 ug/mL

AMB 0,03125 ug/mL

AMB 0,0625 ug/mL

AMB 0,125 ug/mL

AMB 0,25 ug/mL

AMB 0,5 ug/mL

AMB 1 ug/mL

AMB 2 ug/mL


VIABILIDAD CELULAR DE C. glabrata CG-053 A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE AMB Y TIEMPO

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

0 30 60 90 120 150 tiempo (min)

Nº

célu

las

(%)

AMB 0 ug/mL

AMB 0,03125 ug/mL

AMB 0,0625 ug/mL

AMB 0,125 ug/mL

AMB 0,25 ug/mL

AMB 0,5 ug/mL

AMB 1 ug/mL

AMB 2 ug/mL



VIABILIDAD CELULAR DE C. krusei ATCC-6258 A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE AMB Y TIEMPO

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

0 30 60 90 120 150 180 tiempo (min)

Nº

célu

las

(%)

AMB 0 ug/mL

AMB 0,125 ug/mL

AMB 0,25 ug/mL

AMB 0,5 ug/mL

AMB 1 ug/mL

AMB 2 ug/mL

AMB 4 ug/mL

AMB 8 ug/mL



AISLADOAISLADO CMI (CMF)CMI (CMF) CMI 24 hs (CLSI)CMI 24 hs (CLSI) CMI 48 hs (CLSI)CMI 48 hs (CLSI)

C. tropicalis CT-068 0,03125 0,125 0,25

C. glabrata CG-056 0,25 0,25 0,25

C. glabrata CG-054 0,125 0,25 0,25

C. glabrata CG-053 0,125 0,125 0,125

ATCC-22019 0,125 0,25 2

ATCC-6258 0,5 0,5 2


CONCLUSIONES (I)CONCLUSIONES (I)

• La CMF permite discriminar células levaduriformes del

ruido de fondo, principalmente causado por la AMB

• Los lavados de las células disminuyen significativamente

este ruido de fondo, pero no parecen mejorar los

resultados finales y prolongan la duración de la técnica

• La concentración del inóculo que proporciona mejores

resultados es 5x105 ufc/mL

• En el estudio de sensibilidad a AMB por CMF se observa un

descenso de la población de células viables proporcional al

tiempo de incubación y a la concentración de antifúngico

• El FUN-1 permite obtener resultados más rápidos que NT +

IP

CONCLUSIONES (II)CONCLUSIONES (II)

• Los datos obtenidos mediante CMF son equiparables a los

intervalos de CMI para las cepas ensayadas, pero se

requieren más ensayos para confirmar estos resultados

preliminares

• Los resultados obtenidos con CMF son 2-3 diluciones más

bajos que los obtenidos con el método de referencia

• Se observa una idiosincrasia en el comportamiento por

CMF especie-dependiente, similar a la observada por el

método de referencia

• No se ha observado ninguna discrepancia de

categorización entre ambos métodos

CONCLUSIONES (II)CONCLUSIONES (II)

• Esta técnica debe adaptarse según la especie intentando

estandarizar la metodología, debiendo ser fácil y

reproducible para su incorporación en la rutina diagnóstica

• En el futuro está previsto validar la técnica para otras

especies fúngicas, analizar otros antifúngicos (Candinas y

Azoles) y estudiar la sensibilidad directamente en

muestras de sangre periférica de pacientes con infección

fúngica

DESARROLLO DE UNA TÉCNICA PARA EL ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD IN VITRO A ANFOTERICINA B MEDIANTE...

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