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Marta Miguel Castro Elena Herrero Martínez Desarrollo de las Técnicas de Cultivos Celulares
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Marta Miguel Castro
Elena Herrero Martínez
Desarrollo de las Técnicas de Cultivos Celulares
DESARROLLO DE LAS TÉCNICAS DE CULTIVOS CELULARES
Autor:
Marta Miguel Castro
Elena Herrero Martínez
Maquetación:
Arturo Abal Novoa
Edita:
Escuela de Gestión Sanitaria.
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Los cultivos celulares vienen desarrollándose de manera importante en los
últimos años, con gran aplicación y utilidad en la Investigación Biomédica. Son una
herramienta básica de utilización en el laboratorio y requiere de un aprendizaje o
entrenamiento previo para llevar a cabo un desarrollo satisfactorio. Producir
células implica un alto grado de preparación y cualificación por parte del
profesional del laboratorio, para dar el adecuado manejo a los conceptos básicos
de esterilidad, así como destreza en la detección de problemas (requerimientos de
un cultivo en particular, estabilidad de algunos reactivos, etc.) Para realizar este
tipo de técnicas resulta obligado un buen conocimiento de la materia que garantice
la capacidad técnica y profesional necesaria para alcanzar con éxito nuestros
objetivos y evitar riesgos indebidos. El uso habitual de los cultivos celulares y la
necesidad de una formación de calidad, nos ha llevado a proponer la realización
de un curso de iniciación en esta disciplina, dirigido al personal Técnico Superior
Sanitario.
Objetivo general
El objetivo global de este curso es la adquisición de los conocimientos
teóricos básicos necesarios para el adecuado desarrollo de las técnicas de
cultivos celulares, así como el conocimiento de las ventajas y desventajas de esta
técnica y sus aplicaciones en las ciencias biomédicas, para aumentar las
posibilidades de desarrollo técnico-profesional de los técnicos superiores de
diagnóstico clínico y/o de anatomía patológica y citología.
Objetivos específicos
Al final de la actividad los alumnos sabrán:
1. Describir el fundamento teórico de las técnicas de los cultivos celulares, las
ventajas y desventajas de esta técnica, los tipos de cultivos de células que
existen, y el entorno más adecuado para su óptimo crecimiento.
2. Conocer el equipamiento y las normas de trabajo necesarias y obligatorias en
un laboratorio de cultivos celulares.
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3. Aprender en que consiste el seguimiento de un cultivo celular (viabilidad,
multiplicación, contaminaciones, congelación y descongelación)
4. Conocer el uso y aplicación de los cultivos celulares en el área de las Ciencias
Biomédicas y la Investigación.
5. Valorar el potencial de las nuevas técnicas de cultivos celulares para su
utilización y aplicación en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades.
6. Reconocer las técnicas de cultivos celulares más importantes que pueden
emplearse en el Laboratorio de Diagnóstico Clínico y de Anatomía Patológica y
Citología.
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ÍNDICE
MÓDULO 1
Introducción.
Origen e historia de los cultivos celulares
Diseño y equipamiento de un laboratorio de cultivos celulares
-Sistemas de esterilización
-Campanas de flujo laminar
-Incubadores
-Congeladores y sistemas de criogenia
Algunas normas básicas de trabajo en la sala de cultivos
Ventajas de los cultivos celulares
Desventajas de los cultivos celulares
Usos y aplicaciones de los cultivos celulares
MÓDULO 2
Medios de cultivo
Suplementación de los medios con suero
Tipos de contenedores para cultivo de células y sus capacidades Propiedades
físicoquímicas del medio de cultivo
Aislamiento de células
Subcultivo o pase de células
Fases del cultivo
MÓDULO 3
Tipos de cultivos celulares
-Cultivo en monocapa
-Cultivo en suspensión
-Cultivos primarios
-Cultivos secundarios
-Cultivos tridimensionales
-Cultivos continuos o líneas estables
-Hibridomas
-Transfección
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Métodos generales y parámetros más importantes en el seguimiento de un cultivo
celular
-Multiplicación
-Tripsinización
-Viabilidad y recuento celular
-Contaminaciones
-Congelación y descongelación
Microscopio invertido
6
MÓDULO
1
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Introducción
El cultivo celular es un proceso mediante el que las células (procariotas,
eucariotas o vegetales) pueden cultivarse en condiciones controladas. En la
práctica, el término "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de
células aisladas de eucariotas pluricelulares, y especialmente de células animales.
Los cultivos de células pueden definirse como en un sistema formado por células
provenientes de un órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios
de cultivo de composición química definida y en condiciones de temperatura, pH,
aireación y humedad controladas. De esta forma se asegura su supervivencia y
multiplicación, manteniendo todas sus funciones metabólicas de una manera
semejante a las que tenían en el huésped.
Los cultivos celulares vienen desarrollándose de manera importante en los
últimos años, con gran aplicación y utilidad en la Investigación Biomédica. Producir
células implica un alto grado de preparación por parte del recurso humano
especializado, para dar el adecuado manejo a los conceptos básicos de
esterilidad, así como destreza en la detección de problemas (requerimientos de un
cultivo en particular, estabilidad de algunos reactivos…). Para realizar este tipo de
técnicas resulta obligado un buen conocimiento de la materia que garantice la
capacidad técnica y profesional necesaria para alcanzar con éxito nuestros
objetivos y evitar riesgos indebidos.
El uso habitual de los cultivos celulares y la necesidad de una formación
de calidad nos ha llevado a proponer la realización de un curso de iniciación en
esta disciplina, dirigido al personal técnico sanitario.
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Origen e historia de los cultivos celulares
El cultivo celular tuvo su origen en el siglo XIX, surgió como un método
para el estudio del comportamiento de las células animales que, de este modo, se
encontraban libres de las variaciones sistémicas ocurridas dentro del organismo y
sometidas el estrés de un experimento. En la actualidad, pueden cultivarse en el
laboratorio células procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos
diferentes y constituyen una herramienta básica de aplicación fundamental en el
diagnóstico viral, en el campo Médico o en el Veterinario, en la Investigación y en
la Industria Farmacéutica.
El concepto de mantener líneas de células vivas separadas del tejido de
origen fue descubierto en el siglo XIX, cuando el fisiólogo inglés Sydney Ringer
desarrolló una solución salina, conocida como solución de Ringer, que contenía
cloruro de sodio, potasio, calcio y magnesio. Esta solución era capaz de mantener
latiendo el corazón de un animal fuera del cuerpo. Rechlinhausen en 1866,
mantuvo vivas células sanguíneas de anfibio, pero fue la utilización de bloques de
agar (utilizado como soporte) con plasma coagulado (utilizado como alimento) el
inicio del cultivo de células in vitro. En 1885, Wilhelm Roux inició el desarrollo del
cultivo de células de vertebrados y extrajo una porción de la médula de embrión de
pollo y la mantuvo varios días en cultivo en una solución salina tibia, estableciendo
el principio de los cultivos tisulares. Sin embargo, fue Ross Granville Harrison,
trabajando en la Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins y más
tarde en la Universidad de Yale, quién estableció la metodología del cultivo tisular
en una serie de trabajos publicados entre 1907 y 1910. Fue en el año 1907,
trabajando en la Universidad Johns Hopkins, cuando el Dr. Harrison publicó un
breve pero crítico artículo titulado “Observaciones de la fibra nerviosa viva en
desarrollo”, en el que introdujo exitosamente una nueva técnica, “el cultivo de
tejidos”, para demostrar experimentalmente cómo se originaban las fibras
nerviosas. Los experimentos originales con fibras nerviosas se basaron en el
cultivo de pequeños fragmentos de tejidos, llamados “explantos” (Figura 1).
Utilizando técnicas asépticas, Harrison tomó fragmentos del tubo neural (tejido
embrionario precursor del sistema nervioso) de un embrión de rana, y lo depositó
en una gota de líquido linfático de rana, que fue utilizado como medio de cultivo, y
colocado sobre un cubreobjetos estéril. Una vez que la linfa coaguló, invirtió el
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cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio que poseía una depresión, creando
así un cultivo en gota suspendida, técnica utilizada por los microbiólogos para
estudiar las bacterias. Tras varias y periódicas observaciones al microscopio, pudo
describir el desarrollo de fibras nerviosas in vitro a partir de las neuronas
presentes en el tejido extirpado. Así, además de argumentar sólidamente la
denominada “doctrina neural”, resolvió los problemas básicos del cultivo celular,
como el medio de cultivo, la observación y la contaminación.
Figura 1. Experimento de Ross Harrison (1907), donde el explanto es la porción
de tejido neural incluido en una gota de linfa.
Posteriormente, Carrel en 1912 aplicó esta técnica para el estudio de
cultivos de células y tejidos de animales de sangre caliente. Entre 1920 y 1940 se
establecen líneas celulares de diversos órganos animales. Las técnicas de cultivo
celular avanzaron significativamente en los años 40 y 50 como soporte a la
investigación en virología, y el cultivo de células animales empezó a ser una
técnica rutinaria de laboratorio durante los años 50. La utilización de cultivos
celulares para producir virus permitió preparar virus purificados para ser utilizados
en vacunas. La vacuna Salk de la polio fue uno de los primeros productos
producidos en masa usando técnicas de cultivos celulares. Esta vacuna fue
posible gracias a la investigación de John Franklin Enders, Thomas Huckle Weller
y Frederick Chapman Robbins, quienes fueron galardonados con el Premio Nobel
por el descubrimiento de un método de crecimiento de virus en cultivos celulares
de riñón de mono. Durante este periodo, concretamente en el año 1949, Alan Park
define las condiciones que permiten congelar las células en nitrógeno líquido.
Posteriormente, una serie de innovaciones como las técnicas de
tripsinización para el pasaje de células en el año 1952, el desarrollo de medios de
Portaobjetos de vidrio con una depresión
Cubreobjetos de vidrio
Explanto
Linfa
Portaobjetos de vidrio con una depresión
Cubreobjetos de vidrio
Explanto
Linfa
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cultivo por Eagle en el año 1955, el uso de antibióticos, o la suplementación del
medio con suero fetal bovino, permitieron el desarrollo y aplicabilidad de los
cultivos de células de vertebrados. En este periodo también se desarrollaron los
primeros medios de cultivo químicamente definidos y se comienzan a cultivar las
primeras células de insectos.
El empleo de técnicas de fusión celular estableció las bases de la genética
de células somáticas para el análisis de especies animales (incluyendo al
hombre); igualmente la técnica de anticuerpos monoclonales desarrollada por
Kohler y Milstein, en 1975 permitió el desarrollo de la inmunología y su aplicación
a nivel terapéutico.
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Diseño y equipamiento de un laboratorio de cultivos celulares
Un laboratorio de cultivo celular debe contar con una infraestructura básica
en la cual se disponga de 3 áreas independientes
1. Un área destinada a llevar a cabo la preparación y esterilización
de medios y reactivos,
2. Un espacio independiente para el proceso de lavado y
preparación de material
3. Un área propiamente destinada al trabajo con cultivos
celulares.
Dentro de la infraestructura física básica se debe contar con sistemas de
refrigeración y congelación, incubadoras, centrífugas, balanzas, microscopios y
cabinas de flujo laminar. Adicionalmente, se debe disponer de un buen
suplemento de material plástico y de vidrio, y sistemas de esterilización
apropiados para los diferentes tipos de reactivos y material utilizados.
TABLA 1. EQUIPAMIENTO BÁSICO
DE UN LABORATORIO DE CULTIVO CELULAR
Campana de flujo laminar
Baño termostatizado
Incubador
Autoclave
Nevera y congelador
Microscopio invertido
Centrifuga
Depósito de nitrógeno líquido
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Sistemas de esterilización
Desde el punto de vista de los sistemas de esterilización se pueden citar
los siguientes:
Calor Húmedo: Mediante el empleo de autoclaves que proporcionan una
temperatura de 121oC y una elevada presión. Se utilizan para la esterilización
de soluciones cuyos componentes no se degradan por éste método, material
plástico y de vidrio y equipos de filtración.
Un autoclave de laboratorio (Figura 2) es un dispositivo que sirve para
esterilizar material de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y
temperatura, evitando con las altas presiones que el agua llegue a hervir a pesar
de su alta temperatura. El fundamento del autoclave se basa en la coagulación de
las proteínas de los microorganismos debido a la presión y temperatura.
Recientemente se ha llegado a saber que algunas formas acelulares, como los
priones, pueden soportar las temperaturas del autoclave. Los autoclaves
funcionan permitiendo la entrada o generación de vapor de agua pero
restringiendo su
salida, hasta
obtener una
presión interna
de 103 kPa, lo
cual provoca
que el vapor
alcance una
temperatura de
121 ºC. Un
tiempo habitual
de esterilización
a esta
temperatura y
presión es de
15-20 minutos.
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Calor Seco: lo constituye el uso de hornos a temperatura de 200oC por
espacio de tiempo de 3 horas. El calor seco en "Horno Pasteur" (Figura 3)
se emplea para esterilizar el material de vidrio como matraces, probetas,
tubos, pipetas etc. objetos de porcelana y también para objetos metálicos. La
esterilización se consigue a temperaturas de 160-180 ºC durante 2-3 horas.
Figura 3. Horno de Pasteur.
Filtración: Este método se basa en el uso de equipos con membrana de nitrato
de celulosa (nitrocelulosa) o acetato de celulosa con un tamaño de poro de
0.22 ó 0.1 µm de diámetro, mediante la aplicación de presión positiva o
negativa. Por éste sistema se esterilizan la mayor parte de los medios de
cultivo, suero, solución de antibiótico-antimicótico y suplementos.
La esterilización por filtración se logra por el paso de un líquido o un gas a
través de un material capaz de retener los microorganismos presentes. La
esterilización por filtración se emplea para materiales sensibles al calor, tales
como ciertos medios de cultivo, azúcares, soluciones de antibióticos y otros
medicamentos, etc.
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Hay varios tipos de filtros, entre ellos los que más se usan son los filtros de
superficie o filtros de membrana (Figura 4).
Figura 4. Distintos tipos de filtros de membrana
Filtros de membrana. Son filtros elaborados generalmente de acetato de
celulosa o nitrocelulosa y contienen poros de tamaño uniforme. Este tipo de filtro
tiene como ventaja que, al conocer exactamente el tamaño de poro que presentan,
se pueden seleccionar filtros capaces de retener la totalidad de los
microorganismos presentes en una solución. Sin embargo, se saturan
rápidamente y la velocidad de filtración a través de ellos es lenta. Para que la
filtración tenga un efecto esterilizante se puede usar un filtro que tenga un tamaño
de poro de 0.22 μm. La mayor parte de los filtros de membrana se pueden
esterilizar en autoclave y luego se manipulan asépticamente al ensamblar el
equipo.
Existen diferentes equipos de filtración, la selección del mismo está
determinada principalmente por el volumen de líquido a filtrar. Así tenemos
equipos de filtración para pequeños volúmenes, los cuales generalmente se
esterilizan por separado y se ensamblan asépticamente en el momento de la
filtración. Cuando se requiere filtrar volúmenes mayores, el filtro de membrana se
dispone en un cartucho y se coloca en un estuche de acero inoxidable. También
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existen pequeños cartuchos de plástico que se pueden esterilizar después de la
inserción de un filtro de membrana; con estos dispositivos la filtración se hace
utilizando una jeringa que permite forzar el líquido a filtrar a través del filtro hasta
un recipiente estéril. Antes de utilizar cualquier sistema de filtración hay que
determinar que los filtros no presenten ninguna ruptura, ya que esto puede
ocasionar fallos en el proceso de filtración.
Campanas de Flujo laminar
La campana de flujo laminar es una cámara donde se establece un flujo de
aire vertical, a modo de cortina, que evita que las micropartículas y aerosoles que
se puedan crear al manipular los cultivos salgan al exterior y no contaminen al
manipulador y al ambiente, creando una barrera entre la zona donde se está
manejando el cultivo y donde se sitúa el trabajador. Mediante un sistema de
aspiración se recoge el aire contaminado y después de pasarlo por unos filtros,
devuelve una parte a la campana y otra la expulsa al exterior. La campana se
debe poner en funcionamiento de 15 a 20 minutos antes de empezar a trabajar
para que se estabilice la circulación del aire.
Antes de comenzar a trabajar se limpia la superficie en la que vamos a
trabajar con una solución antiséptica (habitualmente alcohol 70%). Debe además
colocarse todo el material necesario que vayamos a utilizar con el fin de realizar
todas las manipulaciones sin tener que salir y volver a entrar en la zona de trabajo
Ya hemos comentado que la función de las cabinas de flujo laminar es la
de mantener un área libre de partículas, especialmente de posibles contaminantes
(bacterias, levaduras,...) que puedan acceder al cultivo. Esto se consigue
mediante un dispositivo mecánico que fuerza el paso del aire a través de un filtro
de gran superficie (filtro HEPA). Las cabinas de flujo laminar pueden ser de dos
tipos, dependiendo de la posición del filtro HEPA y por ello de la dirección del flujo
laminar. Si el filtro HEPA está situado en el techo (flujo laminar vertical) y si está
situado en la pared frontal (flujo laminar horizontal) (Figura 5). El filtro HEPA
retiene las partículas por debajo de un cierto calibre, que es en general de 0,2 m,
con una eficiencia del 99,999 %. El flujo del aire es laminar, sin turbulencias en las
que puedan quedar retenidas partículas contaminantes. El flujo laminar se asegura
por la gran superficie del filtro HEPA y por la velocidad constante del aire, como
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por la ausencia de fuentes intensas de calor (mecheros bunsen) en el interior de
las cabinas, generadores de intensas corrientes de convección.
A B
Figura 5. Campanas de flujo laminar A) vertical y B) horizontal.
Los diferentes tipos de cabinas de flujo laminar se diseñan con diferentes
propósitos:
a) Protección personal: protección del personal de los posibles
agentes dañinos del interior de la cabina.
b) Protección del producto: protección del experimento o cultivo
que se encuentra en el interior de la cabina de los contaminantes
exteriores o de la contaminación cruzada con otros productos o
cultivos situados en la misma cabina.
c) Protección medioambiental: protección para evitar la salida al
medio ambiente de productos o agentes contaminantes.
Las cabinas de flujo laminar horizontal son muy adecuadas para una
buena protección del producto, pero no son adecuadas para el trabajo con
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materiales peligrosos o con algún tipo de riesgo pues el operador queda
completamente expuesto.
En las cabinas de flujo laminar vertical, más sofisticadas, se asegura una
buena protección del producto, y, dependiendo de su diseño, se puede asegurar
una protección total del operador. Son por ello más adecuadas para el trabajo con
agentes peligrosos.
Dependiendo de la importancia que se le conceda a cada uno de estos
factores en el diseño de la cabina, existen diferentes tipos de cabinas de flujo
laminar vertical, de clase I, II o III.
Clase I. Las campanas de clase I son adecuadas para la manipulación de
agentes de bajo riesgo, donde existe una necesidad de protección del operario
y del medio pero no del producto. Este es el tipo de cabinas normalmente
denominadas "de gases", y no son de uso común en el laboratorio de cultivos
celulares.
Clase II: Este tipo de campanas protegen el producto, al personal y al medio
ambiente. En general las cabinas de clase II se describen como un equipo de
protección con un panel frontal de acceso y que mantienen un flujo laminar
estable en el interior, con un filtro HEPA para el aire recircularizado en cada
ciclo, y un filtro HEPA del aire exhausto (de salida al exterior). Los sucesivos
diseños que se han realizado para cubrir necesidades diferentes permiten
clasificar asimismo las cabinas de tipo II en tres subclases:
Tipo A. En este tipo el 30 % del aire se elimina en cada ciclo y el
70 % recirculariza. El escape al medio de los agentes
potencialmente peligrosos se previene mediante una corriente de
aire entrante en una rejilla frontal.
Tipo B. Se trata de una cabina de flujo laminar para uso general,
y en ella se recirculariza sólo el 30 % del aire en cada ciclo,
eliminándose el 70 % del aire restante.
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Tipo 100 % exhausto. Se trata de una cabina en la que el 100
% del aire de cada ciclo es eliminado hacia dispositivos que
puedan retener los posibles agentes peligrosos. Este tipo de
cabinas se emplean fundamentalmente en laboratorios de
toxicología en los que se requieren áreas de contención limpias y
eliminación del aire posiblemente contaminado.
Las diferencias entre estos tres subtipos se refieren especialmente a la
protección del usuario, superior en el caso del tipo A, y a la eliminación de la
cabina de posibles contaminaciones de tipo aerosol, no retenibles por el filtro
HEPA. La tipo A, que es la más adecuada para el trabajo con agentes patógenos
particulados (filtrables), es la menos adecuada para el trabajo con vapores o
aerosoles peligrosos.
Clase III. Se trata de una cabina de seguridad, estanca, para el trabajo con
agentes biológicos de alto riesgo. Permite mantener al agente patógeno en un
ambiente completamente estanco. Permiten controlar tanto los contaminantes
particulados, como aerosoles y contaminantes gaseosos mediante sistemas
de filtración y disolución de éstos.
Incubadores
Las células en cultivo son capaces de soportar sin daños importantes
variaciones de temperatura, siempre que sean por debajo de la temperatura
corporal del animal del que proceden. Así pues, las células humanas soportan
incubaciones a 4 ºC durante días y pueden ser congeladas a -196 ºC durante años
(con sustancias criopreservantes). Sin embargo no sobreviven más de unas pocas
horas a variaciones de 2 ºC por encima de 37ºC. Las células procedentes de
animales poiquilotermos (animales de sangre fría o ectodermos) soportan mejor
un amplio rango de temperaturas de incubación. Las células de homeotermo
(animales de sangre caliente o endodermos) suelen crecer bien entre 33 y 37 ºC,
pero en ese margen presentan importantes variaciones en su tasa de crecimiento.
En un incubador de células es por tanto más importante la consistencia de la
temperatura (invariabilidad durante prolongados periodos de tiempo, con
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oscilaciones inferiores a 0,5 ºC) que su precisión a fin de mantener a las células en
condiciones en las que las tasas de crecimiento sean constantes. Por ello se
deben usar incubadores con movimiento de aire forzado en el interior, y colocar
los contenedores de células sobre estanterías agujereadas y nunca sobre el fondo
o las paredes del incubador.
Las necesidades de asepsia en el incubador son considerablemente
menores que en el área de trabajo (cabina de flujo laminar) pero sin embargo es
muy recomendable mantener una estricta limpieza, desinfección periódica del
incubador, y especialmente no introducir, o eliminarlos inmediatamente, cultivos
contaminados en el incubador.
Para determinar el número y tipo de incubadores requeridos se debe tener
en cuenta:
1. El tipo de cultivos a realizar: primarios o de líneas celulares estables. Es
conveniente no cultivar en el mismo incubador cultivos primarios con líneas
celulares estables, pues los primeros son una importante fuente de contaminación.
Las condiciones del cultivo: temperatura, humedad atmosférica y niveles
de CO2 son característicos de cada línea celular.
2. La especie y el tipo de células a cultivar. Es importante la determinación
exacta de la temperatura de incubación para la que se tendrá en cuenta la
temperatura corporal del animal del que proceden las células, así como cualquier
variación regional de temperatura (la piel suele tener una temperatura inferior).
Algunos autores sugieren incorporar asimismo un factor de seguridad a la
temperatura de incubación. Por ejemplo para la incubación de células humanas
sugieren el cultivo a 36.5 ºC, cercano al valor de la temperatura corporal pero un
poco inferior para mayor seguridad. Esto es en la actualidad innecesario en los
incubadores modernos, capaces de regular la temperatura de incubación con gran
precisión. Así pues serán necesarios tantos incubadores como diferentes
temperaturas de incubación se precisen. Asimismo existen algunos tipos celulares
que no requieren CO2 para su incubación. Esto ha de tenerse en cuenta a la hora
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de diseñar la sala de cultivos, para comprar un incubador más, o apagar esa
función en caso de que no se necesite su utilización
Incubador de CO2
El mantenimiento de la temperatura en una atmósfera con una tensión
controlada de CO2 y adicionalmente de humedad elevada es el objetivo del
incubador de CO2 (Figura 6). El nivel de CO2 se establece para mantener el
equilibrio carbonato-bicarbonato en el medio de cultivo, y suele ser habitualmente
del 5%.
Figura 6. Incubador de CO2
Un incubador moderno dispone de:
1. Dispositivos de control de temperatura, con un termostato de seguridad
que desconecta la función en caso de anomalía. La estabilidad de la temperatura
es una característica esencial del incubador, y por ello suelen estar equipados con
camisas de agua ('water jacket') que incrementan notablemente la inercia térmica.
Por ello, la estabilización de un incubador puede tardar varios días.
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2. Dispositivo de inyección de una mezcla de aire y CO2, en la proporción
deseada, entre el 4 y el 7 %. El CO2 de elevada pureza se suministra en botellas
presurizadas, y se mezcla en el dispositivo de inyección. El control de la mezcla se
realiza fundamentalmente mediante un dispositivo IRGA ("infra-red gas analyzer").
En incubadores modernos este dispositivo analiza constantemente el porcentaje
de CO2 presente en la cámara de incubación, y realiza las correcciones
necesarias. Un problema usual del dispositivo de medida de CO2 es la pérdida de
calibración que se produce periódicamente. Para evitarlo algunos fabricantes
dotan al sistema de un mecanismo de autocalibración periódica (basado en la
toma de una muestra de aire exterior que se considera tiene un valor x de CO2).
3. Dispositivo de control de la humedad ambiente. Para mantener el cultivo
se requiere una humedad ambiente elevada, a fin de reducir la evaporación de
agua del medio de cultivo. En los incubadores menos sofisticados esto se
consigue mediante bandejas de agua en el fondo del incubador. Este recurso es
peligroso pues son una fuente importante de contaminaciones al convertirse a los
pocos días en caldos de cultivo. Para evitarlo, se suele añadir al agua del
incubador productos antibacterianos y/o antifúngicos. En los instrumentos más
modernos se dispone de dispositivos que controlan la humedad atmosférica,
inyectando agua estéril y filtrada.
4. Dispositivo de recircularización de aire. Es importante una recirculación
del aire en el interior del incubador, a fin de homogeneizar la temperatura en su
interior. Si además en el circuito de circulación de aire se intercala un filtro HEPA
se consiguen eliminar las posibles partículas contaminantes, y se asegura la
esterilidad del ambiente
Congeladores e instalación de criogenia (depósito de N2 líquido)
Es recomendable que los congeladores y la instalación de criogenia estén
en recintos separados de la unidad de cultivo propiamente dicha, pues los
ventiladores y compresores son una fuente importante de turbulencias y suciedad
en el laboratorio.
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Es preciso el almacenamiento de soluciones y células a diferentes
temperaturas, para lo que se requiere:
1. Neveras (4 ºC) para el almacenamiento de medios, PBS,…
2. Congeladores de -20 ºC para el almacenamiento de suero, aditivos
(glutamina, antibióticos) y soluciones enzimáticas (tripsina,
colagenasa,...).
3. Congeladores de -80 ºC para el almacenamiento a largo plazo de los
aditivos del medio (suero, glutamina, antibióticos,...) y de sustancias
especialmente sensibles (factores de crecimiento, mitógenos,
inductores,...).
4. Unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196 ºC), para el
almacenamiento de las células (Figura 7).
A
B
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Figura 7. A) Tanques de diferentes capacidades para almacenar células en
nitrógeno líquido; B) Rack para almacenaje de células en un tanque de nitrógeno
líquido
Algunas normas básicas de trabajo en la sala de cultivos
Es de extrema importancia lavarse las manos antes, después, y
frecuentemente durante el trabajo en cultivos. Preferentemente, y es, además, lo
más habitual, suelen pulverizarse las manos con alcohol al 70%, para evitar
contaminaciones en los experimentos, y contaminación del usuario con material
biológico y posible diseminación de éste. Asimismo, la superficie de trabajo de la
campana de cultivo se descontaminará antes y después de trabajar con material
biológico. Dentro de la sala de cultivos se debe hablar lo menos posible y cuando
es necesario dar alguna charla o explicación en el interior de la sala de cultivos es
obligatorio ponerse una mascarilla.
Se debe trabajar siempre con material estéril, y éste solo debe abrirse
dentro de la campana de cultivos. Por defecto, todo aquello de lo que no se esté
seguro al 100% de su esterilidad ha de ser considerado como no estéril, y debe
ser desechado o esterilizado nuevamente.
Es imprescindible marcar cualquier tubo o recipiente que contenga cosas
necesarias para el trabajo en la sala de cultivos de la forma más segura posible, y
para ello se debe marcar tanto la tapa como el tubo o recipiente que lo contenga.
Así mismo se deben marcar siempre las placas de cultivos en la tapa y en un
lateral de la base, de manera distinta para cada placa, para evitar en intercambio
entre ellas.
Todo el material biológico (células o material que haya estado en contacto
con ellas) ha de ser inactivado antes de tirarlo. Lo mas usual es recoger los
residuos en un recipiente o matraz que contiene lejía diluída, o también se
autoclavan los residuos antes de eliminarlos
No se debe comer ni beber, y tampoco se debe pipetear con la boca.
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Ventajas del cultivo celular
Las dos ventajas principales cuando se utilizan los cultivos celulares son:
el control del medio fisicoquímico, (pH, temperatura, presión osmótica, tensión de
oxígeno (O2) y gas carbónico (CO2) de las células cultivadas), y las condiciones
fisiológicas que deben ser constantes.
La mayoría de las líneas celulares requieren para su buen desarrollo de
suplementos en el medio en que se cultivan, ejemplo de esto es el suero, que
proporciona infinidad de elementos como hormonas y otras sustancias
reguladoras. El control del medio fisicoquímico y de las condiciones fisiológicas
permite el cultivo de células específicas.
Los cultivos de células permiten someter a las mismas a una baja y
definida concentración de reactivos asegurando un acceso directo en ellas, lo que
ahorra en un 90% lo requerido para la inyección del reactivo in vivo, su excreción y
su posterior distribución a los tejidos en estudio. Aunque los estudios in vivo
pueden, en algunos casos, resultar más económicos que los estudios in vitro, los
primeros son descartados debido a los aspectos legales, morales y éticos que
conlleva la utilización de animales de experimentación. Además, los cultivos
permiten el estudio del transporte y la utilización de metabolitos.
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Desventajas del cultivo celular
Las técnicas de cultivo celular necesitan unas estrictas condiciones de
asepsia porque las células animales crecen menos rápido que la mayoría de los
contaminantes comunes como las bacterias, los hongos y las levaduras. Además,
las células precedentes de animales no pueden desarrollarse en medios de
cultivo, por lo que es necesario agregar a los medios suplementos como suero,
plasma y fluidos intersticiales, entre otros, para proporcionar a las células
cultivadas un medio lo mas semejante posible al in vivo.
Una de las principales limitaciones en el cultivo de células es el gasto de
esfuerzo y materiales para la producción de una pequeña cantidad de células o de
tejido. Los costes de producir células en cultivo son diez veces más que el uso de
tejido animal, ya que se invierte bastante en ensayos o procedimientos
preparativos que pueden ayudar en la estandarización del proceso reduciendo
tiempo de manipulación, volúmenes de muestra, tiempos de centrifugación, etc.
En los cultivos celulares es difícil relacionar las células cultivadas con las
células funcionales ubicadas en el tejido del cual derivan, ya que en la mayoría de
los casos presentan propiedades muy diferentes; para esto es necesario utilizar
marcadores de células que van a ser de gran ayuda en el momento de
caracterizar las células en cultivo porque van a garantizar que las células crecidas
en cultivo son las mismas que las que se sembraron y no otras. Otro
inconveniente es que también suelen presentarse problemas de inestabilidad
genética cuando se realizan varios pases de cultivos de células no transformadas,
lo que va a originar una gran heterogeneidad en el crecimiento de las células y en
su diferenciación.
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Usos y aplicaciones de los cultivos celulares
Los cultivos de células animales tienen aplicación, como técnicas únicas o
complementarias de otras, en un gran número de líneas de investigación. De esta
forma han sido fundamentales para numerosos avances científicos alcanzados en
distintas ramas de las ciencias biomédicas. Así por ejemplo, las técnicas de cultivo
celular permiten el estudio de las propias células, su metabolismo, el control del
ciclo celular, la modulación de la expresión génica, el cultivo de virus, la clonación
y el estudio de numerosos aspectos relacionados con el cáncer y su diagnóstico,
por citar sólo algunos ejemplos.
Otra área de gran interés se centra en la biología del desarrollo, mediante
la búsqueda de modelos experimentales que permitan explicar cómo el gran
número de células presentes en organismo maduro derivan de una sola célula a
partir de la fertilización. Por ello las líneas celulares que conservan la capacidad
de diferenciarse in vitro son objeto de un intenso estudio.
Hay cierto tipo de investigaciones que no pueden realizarse sin el cultivo
de células, por ejemplo, el trabajo con animales transgénicos, que conduce a que
organismos maduros expresen genes nuevos, se basa totalmente en las técnicas
de cultivo celular para la inserción de genes extraños en las células receptoras.
Asimismo se han desarrollado numerosas aplicaciones para investigación
en biología celular y bioquímica, en farmacología y toxicología, etc. La industria
farmacéutica utiliza estas técnicas en los estudios para el desarrollo de nuevos
fármacos. Además, se han desarrollado procesos industriales para la obtención de
anticuerpos u hormonas y técnicas diagnósticas para el diagnóstico prenatal de
enfermedades y para el cáncer, entre otras patologías.
A continuación se muestra un listado de algunas de las aplicaciones de los
cultivos celulares:
Actividad intracelular: transcripción de DNA, síntesis de proteínas
etc.
Flujo intracelular: movimientos del RNA, de proteínas etc.
28
Ecología celular: estudios de necesidades nutricionales,
infecciones, estudio de la transformación celular inducida por
agentes químicos, virus.., cinética de la población celular etc.
Interacciones celulares: cooperación metabólica, inhibición por
contacto, por adhesión, interacciones célula-célula, etc.
Virología: establecimiento de condiciones de cultivo de virus
animales y vegetales.
Inmunología: producción de anticuerpos monoclonales, análisis de
la genética de la célula somática, etc.
Ingeniería de proteínas: producción de proteínas en líneas
celulares, etc.
Estudios de diferenciación y desarrollo celular: estudio de
receptores, vías de señalización, etc.
29
30
MÓDULO
2
31
32
Medios de cultivo
Hasta los años 70, el cultivo de tejidos parecía ser producto de una mezcla
de ciencia y alquimia. Poco a poco, los fluidos coagulados (como en el
experimento de Harrison) fueron reemplazados por placas con medios líquidos
que contenían pequeñas cantidades de una serie de moléculas necesarias para la
supervivencia y multiplicación celular como sales, glucosa, aminoácidos y
vitaminas. La mayoría de los medios incluían, además, una mezcla poco definida
de macromoléculas adicionadas bajo la forma de suero fetal bovino o equino, o
extracto crudo de embriones de pollo. Dichos medios se siguen utilizando en la
actualidad para los cultivos de rutina, y por lo tanto es difícil saber qué
macromoléculas requiere un determinado tipo celular para funcionar y
multiplicarse. Como consecuencia, se desarrollaron numerosos medios
químicamente definidos, denominados “libres de suero”, que poseen, además de
las pequeñas moléculas mencionadas, varias proteínas específicas necesarias
para la supervivencia y proliferación, como los factores de crecimiento. Así,
gracias a estudios que buscaban establecer las condiciones mínimas de cultivo
para un comportamiento celular adecuado, se descubrieron muchas moléculas de
señalización extracelulares esenciales para la supervivencia, desarrollo y
proliferación de determinados tipos celulares.
A continuación se muestra en la tabla 2 la composición de los medios de
cultivo para células de mamífero.
33
TABLA 2. COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO PARA CÉLULAS DE
MAMÍFERO
Aminoácidos Vitaminas Sales Otros
compuestos
Proteínas requeridas
en los medios
definidos libres de
suero
Arginina
Cisteína
Glutamina
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina
Biotina
Colina
Folato
Nicotinamida
Pantotenato
Piridoxal
Tiamina
Riboflavina
NaCl
KCl
NaH2PO4
NaHCO3
CaCl2
MgCl2
Glucosa
Penicilina
Estreptomicina
Anfotericina
Rojo fenol
Suero fetal
bovino
Insulina
Transferrina
Factores de
crecimiento
específicos
34
En la mayoría de los cultivos se utilizan unos medios base (Eagle’s Basal
Medium, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), RPMI1640, etc) que
contienen hidratos de carbono, ácidos grasos esenciales y otros lípidos,
aminoácidos, sales minerales y oligoelementos. A estos medios suelen añadirse
una serie de aditivos ya que cada cultivo celular tiene unos requerimientos que
hacen que crezca mejor en un determinado tipo de medio.
Los medios de cultivo son generalmente tamponados (hepes, bicarbonato)
para mantener un pH alrededor de 7,4 y tienen, además, indicadores de pH, como
el rojo fenol, que cambian de color a medida que aparecen catabolitos ácidos en el
medio de como resultado del metabolismo celular (Figura 8).
Figura 8.
Cambio de coloración del medio de cultivo según el pH.
Suelen añadirse también antibióticos y antimicóticos para impedir la
contaminación con microorganismos, como la penicilina (antibiótico frente a
microorganismos Gram +) y la estreptomicina (antibiótico frente a
microorganismos Gram +/-) y la anfotericina (antimicótico frente a levaduras y
hongos). Los cultivos crecen usualmente en contenedores de plástico o vidrio con
una superficie apropiada para la adhesión celular, y se mantienen en una estufa o
35
incubador normalmente a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2, 95% de aire.
También suele añadirse suero fetal: bovino, ovino, humano (2-50%) y otros
aditivos específicos como el piruvato, glucosa, etc.
La tabla 3 muestra un resumen de las propiedades físicas de los medios
de cultivos celulares.
Propiedades fisicoquímicas del medio de cultivo
CO2 Normalmente 5% (2-8%
depende de tipo celular)
pH 7.0-7.7
Osmolaridad 290-320) mOsm/Kg
Viscosidad Suero
Temperatura
37ºC (mamífero)
Aves: 38,5ºC
Insectos y peces: 33-35ºC
36
Suplementación de los medios con suero
El papel del suero, especialmente el suero fetal bovino en el
establecimiento y mantenimiento de líneas y cultivos celulares, es fundamental;
cuando los cultivos se han establecido en medios libres de suero, el crecimiento
celular requiere, la suplementación con hormonas y otros factores de crecimiento
involucrados en el transporte de nutrientes, mantenimiento del balance de energía
celular, control de la síntesis de macromoléculas y factores que estimulan la
formación del producto deseado. Muchos de los factores suplementados son
purificados del mismo suero, lo que hace que los cultivos a gran escala con medio
libre de suero no sean rentables.
Uno de los inconvenientes que presentan los laboratorios de investigación y
diagnóstico es el alto porcentaje de cultivos contaminados por un virus como
consecuencia de la infección intrauterina de los bovinos donantes del suero. Las
líneas celulares y los cultivos primarios se pueden contaminar con el virus cuando
son suplementados con el suero contaminado. El porcentaje de contaminación del
suero fetal comercial oscila entre el 10 y el 70%. Por eso conviene filtrarlo (0,22
m) antes de añadirlo al medio de cultivo.
Un aspecto importante a tener en cuenta es la necesidad de llevar a cabo la
descomplementación del suero para inactivar las proteínas del complemento que,
en algunos casos, pueden producir alteraciones en los cultivos celulares. Para
ello, basta con mantener el suero en el baño a 56ºC, durante 30 minutos.
37
Tipos de contenedores para cultivo de células y sus capacidades
Existen numerosos tipos de contenedores y recipientes para cultivar células y
tejidos, dependiendo de las características de las células a cultivar y de la escala
deseada. Cuando se cultivan células para hacer experimentos, se hacen cultivos a
pequeña escala. En esta escala, las células de multiplican en frascos que tienen
una base de 25 a 175 cm2
denominados frascos, (Figura 8). En un recipiente
típico de 175 cm2
pueden obtenerse aproximadamente 1x107
células adheridas, y
unas 1x108
células cuando se trata de líneas que crecen en suspensión. En los
frascos T estándares no es posible producir cantidades mayores de células, dada
la cantidad de tiempo que hay que invertir para realizar los pases necesarios a
medio fresco, la demanda de espacio que se necesitaría en el incubador y el coste
de los materiales.
La tabla 4 muestra las diferentes superficies de cultivo de algunos de los
recipientes más utilizados en los cultivos a pequeña escala, la densidad de células
que pueden crecer en cada una de ellas según el momento del cultivo (siembra o
confluencia), y el volumen de los distintos medios y soluciones que debe de
añadirse en cada caso.
38
TABLA 4. SUPERFICIES
DE CULTIVO
DENSIDADES DE
CÉLULAS
(millones)
VOLÚMENES
(ml)
Placas multipocillo (multiwell-plates)
Nombre Pocillos/
diámetro
Área/
pocillo
Área/p
laca Siembra
Com-
fluencia Medio Lavados
Trip-
sini-
zación
P96 96/8
mm
0,5
cm2
48
cm2
0,015 0,06 0,1 0,1 0,06
P48 48/11
mm 1 cm
2 48
cm2
0,03 0,12 0,25 0,25 0,125
P24 24/16
mm 2 cm
2 48
cm2
0,06 0,24 0,5 0,5 0,25
P12 12/22
mm 4 cm
2 48
cm2
0,12 0,5 1 1 0,3
P6 6/33
mm 10 cm
2 60
cm2
0,3 1,2 2 2 0,5
Placas Petri (Petri-dish)
P35 1 35 mm 10 cm2
0,3 1,2 2 2 1
P60 1 60 mm 28 cm2
0,8 3,2 3 3 2
P100 1 100
mm 78 cm
2 2,2 8,8 10 10 3
Botellas (flasks)
T-25 1 ---- 25 cm2
0,7 2,8 4 4 1
T-75 1 ---- 75 cm2
2,2 8,8 12 12 3
39
Cuando se necesita aumentar la escala del cultivo (escalado o scaling-up),
deben tenerse en cuenta numerosos parámetros, incluyendo los problemas
asociados con la falta de nutrientes, el intercambio gaseoso (especialmente la
escasez de oxígeno), y la aparición de metabolitos tóxicos como el amonio y el
ácido láctico.
Existen muchos sistemas para escalar los cultivos celulares, que se muestran
en la Figura 9. Entre ellos, es posible encontrar desde arreglos de frascos triples y
botellas cilíndricas, hasta biorreactores más complejos en su estructura. En todos
los casos, es necesario asegurar el correcto intercambio gaseoso y la
disponibilidad de nutrientes. Por ejemplo, el sistema formado por botellas de
cultivo sobre rodillos que se muestra en la figura 9c, está diseñado de forma tal
que las células cubren toda la superficie interna de la botella, con rodillos que al
girar aseguran que el medio de cultivo bañe a todas las células, aportándole
nutrientes y retirando desechos. Otro ejemplo es el biorreactor (9d) que permite
obtener un rendimiento importante de anticuerpos a partir de un cultivo celular.
Figura 9. Sistemas para escalar los cultivos celulares
40
La adición de bolitas de distintos materiales inertes puede ayudar también a
aumentar la densidad celular en cultivos al aumentar la superficie de cultivo entre
10 y 100 veces.
En la tabla 5 se muestran algunos de los tipos de contenedores para cultivo de
células y sus capacidades.
Tabla 5. Tipo de contenedores para cultivo de células y sus capacidades
Contenedor Máx Vol (ml) Máx células
(suspensión)
Máx células
(adhesión)
Frasco T a 150 1.5x108
~107
Frasco triple b 150 1.5x108
3x107
Biorreactor d 8000 ------ 1.5x1010
Botellas rodantes c 1000 1x109
1x108
Frascos para agitación
(Erlenmeyer) f 1000 1 x 10
9 -------
Frascos con paletas e 1000 1 x 109
-------
Aislamiento de células
Las células pueden aislarse de los tejidos para cultivos in vitro de muchas
maneras. Las células pueden ser purificadas con facilidad de la sangre, sin
embargo sólo los leucocitos son capaces de crecer en cultivo. Las células
mononucleares también pueden liberarse de los tejidos blandos mediante
hidrólisis enzimática con enzimas como la colagenasa, tripsina o pronasa, que
degradan la matriz extracelular. Como alternativa se pueden colocar trozos de
tejido en medio de crecimiento, y las células que crecen son aptas para el cultivo.
Este método es el conocido como cultivo de explantes.
Las células que se cultivan directamente desde un sujeto se conocen
como células primarias. A excepción de algunos derivados de tumores, la mayoría
de los cultivos celulares primarios tienen un periodo de vida limitado. Después de
41
un cierto número de divisiones las células entran en el proceso de senescencia y
dejan de dividirse, generalmente manteniendo la viabilidad.
Una línea celular establecida o inmortal ha adquirido la capacidad de
proliferar indefinidamente bien debido a la mutación al azar o a una modificación
deliberada, como la expresión artificial del gen de la telomerasa. Hay numerosas
líneas celulares bien establecidas representativas de tipos celulares particulares.
Subcultivo pase de células
El subcultivo supone transferir un pequeño número de células a un nuevo
continente. Al estar generalmente las células en continua división durante el
cultivo, es normal que crezcan hasta ocupar todo el área o volumen disponible.
Las células pueden cultivarse más tiempo si se pasan regularmente, ya que así se
evita la senescencia asociada a situaciones prolongadas de alta densidad celular.
Usualmente los subcultivos se realizan al llegar a confluencia y hay que evitar que
los nutrientes del medio de cultivo se agoten, que se produzca una acumulación
de células apoptóticas o necróticas, la inhibición de la división celular por contacto
(los contactos entre células pueden desencadenar una parada en el ciclo celular) y
una elevada diferenciación celular provocada por los contactos intercelulares.
Para realizar el subcultivo de células adheridas, las células han de ser
inicialmente despegadas y para ello se debe proceder al levantamiento de las
mismas, mediante procesos enzimáticos (tripsinización) o procesos mecánicos
(levantamiento mecánico mediante raspado). Un pequeño número de las células
despegadas pueden sembrarse de nuevo. En cultivos de células en suspensión es
suficiente con realizar una dilución en medio nuevo (o bien adición de medio tras
centrifugación). El cambio de medio de cultivo sirve para renovar los nutrientes y
evitar la acumulación de productos metabólicos potencialmente tóxicos y de
células muertas (Figura 10).
42
Figura 10. Etapas de un cultivo de células en monocapa.
43
Fases del cultivo
En un cultivo celular podrían distinguirse cuatro etapas o fases:
1. Fase de latencia (período lag). Se define como El período de fijación al
sustrato e inicio del ciclo celular.
2. Fase de crecimiento exponencial. Durante esta fase el número de
células se duplica aproximadamente cada 24 horas.
3. Fase de confluencia. Esta fase ocurre cuando las células del cultivo, que
se ha saturado, dejan de dividirse (monocapa: inhibición por contacto;
suspensión: consumo del medio).
4. Fase de muerte. Cuando el cultivo se prolonga durante demasiado
tiempo, las células entran en una fase de senescencia que termina con la
muerte de las células en cultivo.
Figura 11. Fases del cultivo celular.
0 2 4 6 8 10 12 14 100
Cultivo
primario
Transformación
Línea celularLínea celular finita
Senescencia y
muerte celular
Semanas en cultivo
106
108
1010
1012
1014
1016
1018
Explante
Nº
cé
lula
s
Intervalo del subcultivo
Primer subcultivo
Segundo subcultivo
0 2 4 6 8 10 12 14 100
Cultivo
primario
Transformación
Línea celularLínea celular finita
Senescencia y
muerte celular
Semanas en cultivo
106
108
1010
1012
1014
1016
1018
Explante
Nº
cé
lula
s
Intervalo del subcultivo
Primer subcultivo
Segundo subcultivo
0 2 4 6 8 10 12 14 100
Cultivo
primario
Transformación
Línea celularLínea celular finita
Senescencia y
muerte celular
Semanas en cultivo
106
108
1010
1012
1014
1016
1018
Explante
Nº
cé
lula
s
Intervalo del subcultivo
Primer subcultivo
Segundo subcultivo
44
MÓDULO
III
45
46
Tipos de cultivos celulares
Existen varios criterios para clasificar los cultivos celulares. Los cultivos de
células animales se pueden clasificar de acuerdo a su capacidad de anclaje
(adherencia). Teniendo en cuenta su capacidad de adherencia o no a una
superficie determinada pueden crecer formando una monocapa o en suspensión,
respectivamente. En este caso el tipo de crecimiento de crecimiento está
estrechamente asociado con el tipo de célula de la cual derivan. Por lo general las
células provenientes de órganos, crecen en monocapa; Sin embargo, también
existen células que pueden crecer indistintamente tanto en monocapa como en
suspensión; También pueden clasificarse teniendo en cuenta si las células han
sido aisladas recientemente de un órgano determinado o si provienen de células
que han sufrido modificación. Cuando el cultivo proviene de células que han sido
disgregadas de un tejido original tomado de un órgano de un animal recién
sacrificado, reciben el nombre de Cultivo Primario. Cuando este cultivo primario es
sometido a procesos de transformación que le confieren capacidad ilimitada de
multiplicación, recibe el nombre de Línea Celular. Aunque potencialmente se
puede obtener un cultivo primario a partir de cualquier tipo de tejido, normalmente
los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a que su
grado de diferenciación es menor y su capacidad de división mayor.
Como ya se mencionó anteriormente, los cultivos se establecen
principalmente a partir de suspensiones celulares generadas por disgregación de
tejidos. A diferencia de las bacterias, la mayoría de las células que forman parte
de tejidos no pueden vivir en suspensión, y requieren una superficie sólida sobre
la cual crecer y multiplicarse. Este soporte generalmente es la base de una placa o
frasco de plástico, aunque a veces los requerimientos son más complejos y el
plástico debe antes recubrirse con componentes de la matriz extracelular
(sustancia que rodea y contiene a las células en los tejidos, y con la cual
interactúan), como por ejemplo el colágeno o la laminina.
47
Cultivos en monocapa
Las células que crecen en monocapa exhiben una variedad de
"comportamientos sociales", lo que hace que su multiplicación sea inhibida cuando
establecen contacto entre sí, permitiendo la formación de una monocapa que
cubrirá la correspondiente superficie de crecimiento. Las células provenientes de
cultivos primarios son las que mejor crecen en ésta condición, dada su estabilidad
genética y su naturaleza diploide normal.
Los recipientes para el cultivo de células estacionarias son placas de Petri,
frascos para el cultivo de tejido (T-25, T-75), entre otros, que pueden ser de
material de plástico o de vidrio previamente tratado, y su desprendimiento para
transferirlas a superficies mayores se realizan con agentes proteolíticos como la
tripsina. Cuando se requiere la producción de éste tipo de cultivo en una escala
mayor, se debe incrementar el área de la superficie de crecimiento, siendo ideal
utilizar botellas en rotación (roller). Mediante éste sistema, las células pueden
crecer en toda la parte interna de la pared de la botella, usando un aparato que
permite la rotación del roller a una baja velocidad; de esta forma un roller de 1 litro
que requiere 100 ml de medio, confiere una superficie de crecimiento de 500 cm2.
Otra forma de aumentar el número de células adherentes por volumen de
frasco, es utilizando microperlas (microportadores), que son compuestos en base
a dextranos o a vidrio, que flotan cuando se emplean en cultivos con agitación, lo
que le da una mayor disponibilidad de superficie para el crecimiento celular: con
100 ml de medio de cultivo, se logra una superficie de 0,24 m2. La relación
superficie-volumen para los rollers es de 0,2-0,7, mientras que para los
microportadores es de 122-153.
Existen otras consideraciones que influyen en la utilización de sistemas en
monocapa a pesar de las ventajas que tienen los cultivos en suspensión, entre las
que están la flexibilidad para desarrollar cultivos primarios o de líneas
heteroploídes, la facilidad para la retirada del medio gastado y la alta
concentración que se obtiene del producto.
48
Cultivos en suspensión
Las líneas celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento
de anclaje a superficies, tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o
en suspensión después de un período de adaptación.
Existe evidencia experimental de que los sistemas en suspensión también
requieren de matrices, macromoléculas, que sirven de protectores a la superficie
celular; Estas macromoléculas se encuentran en el suero, que contribuye junto
con el medio de cultivo y ambos proporcionan un sistema balanceado de
nutrientes. Dentro de éstas matrices está el Methocel, esencial para el crecimiento
de cultivos en suspensión.
Aunque el cultivo estacionario es ideal cuando se busca la elaboración de
productos extracelulares, el cultivo en suspensión es deseable cuando los
productos son intracelulares o cuando se presentan problemas con la capacidad
de anclaje de un determinado tipo de célula.
El proceso de cultivo continuo ofrece factores económicos decisivos
(utilización de mejores equipos, reducida manipulación) cuando se trata de
producir cultivos a una mayor escala de operación.
Cultivos primarios
Los cultivos primarios tienen características especiales que los diferencian
de las líneas celulares: conservan la morfología de las células del órgano del que
fueron aisladas, sus cromosomas tienen un número diploide (2n), su crecimiento in
vitro es limitado y hay inhibición por contacto.
El estar más cercanas a las células que las originaron, se ve reflejado en
una mejor actividad y funcionalidad similar a su ambiente natural, por lo que en
aislamientos primarios de cepas virales éstas tienen mayor sensibilidad que una
línea Celular ya establecida. Igualmente para la producción de vacunas los
cultivos primarios son recomendables por tener una baja probabilidad de que se
49
transformen en malignos. Dentro de las desventajas está la de una mayor
probabilidad de presentar virus adventicios o latentes, lo que implica el desarrollo
de la adecuada tecnología para el control de calidad.
Los cultivos primarios pueden iniciarse con o sin fraccionamiento previo
para separar los distintos tipos celulares. En estos cultivos las células están vivas,
conservan sus características originales y su proliferación es limitada. Pueden ser
retiradas del recipiente de cultivo para formar cultivos secundarios
Cultivos secundarios
En estas condiciones las células suelen multiplicarse hasta cubrir la
superficie del recipiente de cultivo, formando una monocapa (capa de una célula
de espesor). Como consecuencia del contacto entre las células se detiene
temporalmente su proliferación, hasta que se las subcultiva (pase de células) a un
recipiente con medio fresco. Así, podrán subcultivarse durante semanas o meses.
En este estadío las células frecuentemente mostrarán distintas propiedades según
su origen.
Cultivos tridimensionales
Son aquellos que buscan mantener la característica o arquitectura del
tejido in vivo. Los sistemas tridimensionales permiten estudiar la proliferación y
morfología epitelial y su interacción con otras células como son las del tejido
conectivo; igualmente con ellos se puede evaluar el efecto de sustancias que
pueden influenciar en tales interacciones intercelulares.
50
Cultivos contínuos o líneas celulares
Las Líneas Celulares están formadas por células que se diferencian
genética y morfológicamente de las células de las cuales se originaron. Pueden
provenir de células que se derivan de tumores o de un proceso de transformación
de un cultivo primario mediante transfección con oncogenes o con tratamiento con
carcinogenéticos, lo que les confiere un nuevo fenotipo. En la siguiente tabla (tabla
6) se muestran las ventajas y desventajas de las líneas celulares.
TABLA 6. LÍNEAS CELULARES
VENTAJAS DESVENTAJAS
Control del entorno celular Falta de diferenciación
Homogeneidad celular Inestabilidad de la línea (mutaciones DNA)
Conocimiento del tipo celular
Economía
Este tipo de cultivo tiene la característica de ser aneuploide, de no tener
inhibición por contacto y de crecer de manera indefinida. El paso de un cultivo
primario a línea se denomina transformación. Una transformación puede inducirse
fisiológicamente a través de hormonas como la hidrocortisona o utilizando
inductores no fisiológicos como el dimetilsulfóxido (DMSO). La mayoría de las
células de los vertebrados dejan de dividirse tras un determinado número de
divisiones en cultivo, por un proceso llamado senescencia celular. Por ejemplo, los
fibroblastos humanos normales se dividen solamente entre 25 y 40 veces en
cultivo, antes de detenerse. En estas células, así como en muchas otras, la
capacidad limitada de proliferación es el resultado de un acortamiento progresivo
de los telómeros (porción de ADN que se encuentra en los extremos de los
cromosomas). En las células somáticas (todas las células que no son células
sexuales) se encuentra “silenciado” el gen que codifica para la enzima telomerasa,
que se encarga de mantener la integridad de los telómeros; como consecuencia,
los telómeros se acortan en cada división celular. Por ejemplo, los fibroblastos
humanos se los puede forzar a proliferar indefinidamente si se les introduce el gen
que codifica para la telomerasa; así, pueden propagarse como una línea celular
51
“inmortalizada”. Pero como se ha comentado anteriormente, no todas las células
humanas se inmortalizan de la misma manera. Algunas células, a pesar de que
sus telómeros permanezcan largos, pueden frenar sus divisiones celulares como
consecuencia de la activación de mecanismos denominados “puntos de control”
(check points) del ciclo celular. Para inmortalizar estas células, hay que lograr la
inactivación de los check-points. Una forma de hacerlo es introducir ciertos
“oncogenes” (genes promotores del cáncer) que pueden obtenerse de virus que
causan cáncer, como algunas cepas del virus del papiloma humano, adenovirus,
etc.
A diferencia de las células humanas, las de los roedores no tienen
“silenciado” el gen de la telomerasa, por lo que sus telómeros mantienen su
longitud a través de las divisiones celulares. Pero en algunos casos, cuando se
cultivan, esas células experimentan cambios genéticos que inactivan los
mecanismos de check-point, produciendo líneas celulares inmortalizadas
espontáneamente. Ambos tipos de líneas celulares son muy útiles en la
investigación celular, como fuente de un gran número de células uniformes, que
pueden ser conservadas y almacenadas en nitrógeno líquido (a -196 °C) por un
período muy largo de tiempo, manteniendo su viabilidad y siendo un buen modelo
experimental para las primeras etapas de una investigación.
A pesar de la gran similitud que las células de una línea tienen entre sí, no
son idénticas. La uniformidad genética en una línea celular puede mejorarse por
clonado celular. Mediante este procedimiento se aísla una sola célula, que
prolifera para formar una colonia de células clonales (idénticas). Una de las
aplicaciones más importantes de esta estrategia es el aislamiento de líneas
celulares mutantes que poseen defectos en ciertos genes. Su estudio puede servir
para investigar el papel que tiene la proteína ausente o alterada en las células
normales.
Una de las primeras líneas celulares humanas son las células HeLa
(Figura 13), obtenidas de Henrietta Lacks, quien falleció de cáncer de útero, a
partir de cuál se obtuvieron estas células, que pueden considerarse la primera
línea de células inmortales humanas.
52
Figura 13. Células HeLa teñidas con colorante Hoeshst, que se une al
ADN coloreando de azul el núcleo.
Las líneas celulares originadas a partir de tejido de seres humanos
presentan controversias bioéticas, ya que pueden sobrevivir a los organismos
parentales y pueden utilizarse para el descubrimiento de tratamiento médicos muy
lucrativos después del fallecimiento de las personas que las produjeron. Una
decisión pionera a este respecto fue el fallo de la Corte Suprema de California,
que en 1990 determinó que los pacientes no tienen derechos propietarios sobre
las líneas celulares derivadas de órganos retirados con su consentimiento.
Entre los cultivos celulares más prometedores, desde el punto de vista
clínico, se encuentran las líneas de células madre embrionarias humanas (Figura
14). Estas células, obtenidas del macizo celular interno de un embrión en los
primeros estadios del desarrollo, pueden proliferar indefinidamente reteniendo la
capacidad de originar cualquier tipo celular del organismo. Estos cultivos celulares
podrían revolucionar la medicina al proveer de células capaces de reemplazar o
53
reparar tejidos dañados. Hay otras fuentes de células madre que se están
investigando en tejidos adultos, como la médula ósea y el cordón umbilical.
Figura 14. Cultivo de células madre embrionarias.
Huevo fecundado Células pluriopotentes Blastocisto
Aislamiento de células
células pluripotentes
Cultivo de
células
pluripotentesHuevo fecundado Células pluriopotentes Blastocisto
Aislamiento de células
células pluripotentes
Cultivo de
células
pluripotentes
54
Hibridomas
Se sabe que es posible fusionar dos células formando un heterocarionte (o
heterocarion), es decir, una célula con dos núcleos separados pero con los
contenidos citoplasmáticos compartidos. Para lograrlo, se trata una suspensión de
células con compuestos que inducen la fusión de membranas (fusógenos), tales
como el polietilenglicol (PEG) o ciertos virus. Eventualmente, un heterocarionte
puede entrar en mitosis, produciendo una célula híbrida en la cual las envolturas
de ambos núcleos se han disgregado, permitiendo juntar los cromosomas de
ambos en un único gran núcleo. Tales células híbridas pueden clonarse
estableciendo una línea celular, pero se sabe que en muchos casos la línea
resultante es inestable genéticamente, y tiende a perder parte del material
genético. De este modo es posible fusionar células normales con una línea celular
inmortalizada.
En 1975, un equipo integrado por el científico argentino César Milstein,
desarrolló, mediante la técnica de fusión, una línea celular híbrida clave para la
producción de anticuerpos monoclonales (todos iguales) para fines terapéuticos y
de diagnóstico: los hibridomas (este desarrollo llevó al Dr. Milstein a ser
galardonado con el Premio Nóbel). Los hibridomas son líneas resultantes de la
fusión de dos tipos celulares (Figura 15). Los linfocitos B secretores de
inmunoglobulinas (anticuerpos) aislados del bazo o médula ósea de un ratón
inmunizado y que tiene una vida limitada cuando crecen en cultivo, se combinan
con células derivadas de una línea celular de mieloma inmortalizada (células del
linaje B). De la fusión se obtiene una mezcla heterogénea de células, y con un
medio de cultivo especial se seleccionan las células fusionadas. Las células de
mieloma sin fusionar se seleccionan en un medio de cultivo selectivo. El medio de
cultivo selectivo utilizado después de la fusión celular contiene un inhibidor que
bloquea las rutas de síntesis de los nucleótidos (hidroxiaminopterina). Como
consecuencia, las células deben utilizar una vía alternativa para fabricar sus
ácidos nucleicos. Esta vía es defectiva en la línea celular mutante derivada del
tumor de linfocitos B, pero está intacta en las células de bazo (linfocitos B)
obtenidas del ratón inmunizado. Debido a que ninguna de las células utilizadas
para la fusión inicial puede crecer por sí sola, sólo las células híbridas o
hibridomas sobreviven. Los hibridomas resultantes poseen la especificidad de
55
producir los anticuerpos de los linfocitos primarios y la inmortalidad de la línea
celular de mieloma, y proliferan indefinidamente. Los hibridomas productores del
anticuerpo deseado se seleccionan a partir de grupos hasta llegar a colonias
individuales.
Estos hibridomas se propagan como clones individuales, y cada uno de
ellos sirve como una fuente estable y permanente de un anticuerpo monoclonal.
Dicho anticuerpo reconoce un único epítopo antigénico (es decir, una pequeña
porción de una proteína). Una de las ventajas de los hibridomas, en comparación
con los cultivos clonales de linfocitos B, es que estos últimos tienen una vida
limitada en cultivo.
Figura 15. Preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales
contra un antígeno en particular.
56
Transfección
Otro método común en la manipulación de las células es la introducción de
un DNA externo por transfección. Esto se lleva a cabo a menudo para conseguir
que las células expresen una proteína de interés. Más recientemente, la
transfección de RNA interferentes se ha llevado a cabo para suprimir la expresión
de un gen en particular.
El DNA puede ser introducido en las células mediante distintos métodos,
usando virus (transducción, infección o transformación). Los virus, como agentes
parásitos, son considerados los vehículos adecuados para introducir DNA en
células, ya que esto forma parte de su ciclo normal de reproducción.
Las transfecciones pueden ser de dos tipos transitoria o estable, y existen
varios métodos para transfectar células como la electroporación, fosfato cálcico,
lipofección o mediante microinyección.
57
Métodos generales y parámetros más importantes en el seguimiento de un
cultivo
Multiplicación
Al estar generalmente las células en continua división durante el cultivo, es
normal que crezcan hasta ocupar todo el área o volumen disponible. Esto puede
generar varios problemas:
Agotamiento de los nutrientes del medio
Acumulación de células apoptóticas o necróticas
Inhibición de la división celular por contacto: los contactos entre células
pueden desencadenar una parada del ciclo celular
Diferenciación celular promiscua provocada por los contactos
intercelulares
Para evitar todo esto es conveniente hacer unas de las manipulaciones más
comunes llevadas a cabo en cultivos celulares, los cambios de medio y los pases
de las células que ya hemos comentado brevemente con anterioridad. El objetivo
de los cambios de medio es renovar los nutrientes y evitar la acumulación de
productos metabólicos potencialmente tóxicos y de células muertas. El pase de las
células supone transferir un pequeño número de células a un nuevo continente.
Las células pueden cultivarse más tiempo si se pasan regularmente, ya que así se
evita la senescencia asociada a situaciones prolongadas de alta densidad celular.
Cambios de Medio. Mantenimiento
Cuando las condiciones de crecimiento son adecuadas, la mayoría de las
células doblan su número tras 24-48 h en cultivo. De esta forma el número de
células se multiplica en cualquier cultivo en unos pocos días (ocupando toda la
superficie de la placa, en el caso de células adherentes). Esto ocasiona un
empobrecimiento del medio al consumirse los nutrientes y acumularse productos
de deshecho. Por ello, si se desea mantener el cultivo algunos días mas, se deben
58
reponer los nutrientes de manera periódica y se deben eliminar los productos de
deshecho.
Los cambios de medio suelen hacerse con una frecuencia ligeramente
flexible, y esta frecuencia aumenta al aumentar la densidad celular. Es fácil de
observar pues el pH del medio empieza a acidificarse y se torna naranja-
amarillento si la densidad celular es elevada.
En ocasiones, cuando se realiza un cambio de medio y no se disminuye la
densidad celular, suele cambiarse solamente 2/3 del medio, dejando 1/3 del medio
inicial para que el cultivo prospere mejor, ya que los cultivos necesitan de factores
u hormonas liberados para su mejor acondicionamiento.
Dilución de la densidad. Pase de células
La mayoría de las células que crecen adheridas al plástico sufren una
parada en su crecimiento a densidades elevadas, debido a lo que se conoce como
inhibición por contacto. En algunos casos las células paran su división cuando
ocupan toda la superficie de la placa y en otras ocasiones dejan de dividirse
cuando entran en contacto unas con otras, aunque no hayan cubierto totalmente la
superficie de la placa de cultivo. A esta situación se le denomina confluencia del
cultivo y nunca se debe dejar un cultivo en confluencia durante periodos de tiempo
prolongados. Para ello, tenemos que reducir la densidad celular para permitir su
crecimiento de forma continuada.
Si lo que se pretende es expandir el cultivo se distribuirán todas las células
en un número mayor de placas. La reducción en la densidad celular dependerá del
tipo de cultivo con el que estemos trabajando, que suele variar entre un 80 y un
90%. Si lo que se pretende es mantener el cultivo se dividirán las células en una
superficie igual a la utilizada hasta ese momento y se desecharán parte de las
células. Es importante tener en cuenta que diluciones excesivas o periodos
prolongados de las células en confluencia pueden alterar seriamente las
propiedades del cultivo.
Tripsinización
Para la mayoría de las células que crecen adheridas a un substrato, la
59
forma más conveniente de levantarlas para qe formen una suspensión celular y
manejarlas fácilmente, es mediante el uso de enzimas como la tripsina, una
proteasa que digiere las proteínas celulares implicadas en la adhesión celular.
Solo en el caso de que se necesiten preservar las proteínas de membrana se
desaconseja este procedimiento, y debe recurrirse a métodos mecánicos como el
pipeteo o el barrido de la superficie de cultivo.
Para que la tripsinización sea efectiva, tenemos que asegurarnos de que
no queda suero en la placa de cultivo, ya que éste contiene un inhibidor de la
tripsina. También hay que eliminar los cationes divalentes presentes en el medio
que median la interacción célula-substrato y para ello se utiliza un quelante como
el EDTA.
Este procedimiento es muy importante porque si las células pasan
demasiado tiempo en contacto con la enzima pueden dañarse e incluso morir, por
eso este paso es crítico y el tiempo de permanencia con la tripsina dependerá del
tipo celular con el que estemos trabajando.
Una vez levantadas las células se resuspenden en un volumen adecuado
de medio con suero de manera que la tripsina se inactiva y se siembra en la
superficie adecuada. En algunos casos si el cultivo lo requiere se centrifuga la
suspensión de células con el objetivo de retirar la tripsina y el EDTA y el
sedimento celular se resuspende de nuevo en un volumen adecuado de medio de
cultivo.
Viabilidad y recuento de células
Las células se cultivan y mantienen a una apropiada temperatura y mezcla
de gases (habitualmente, 37ºC, 5% CO2 y 95% O2) en un incubador de células.
Las condiciones de cultivo varían ampliamente para cada tipo celular, y la
variación de las condiciones para un tipo celular concreto, puede dar lugar a la
expresión de diferentes fenotipos.
Además de la temperatura y la mezcla de gases, el factor más
comúnmente variado en los sistemas de cultivo es el medio de crecimiento. Las
60
recetas para los medios de crecimiento pueden variar en pH, concentración de
glucosa, factores de crecimiento y la presencia de otros componentes nutritivos.
En la actualidad se tiende a minimizar o eliminar el uso de estos ingredientes
cuando sea posible.
Para mantener unas determinadas condiciones de cultivo reproducibles
entre pases y experimentos se recomienda sembrar las células a la misma
densidad. Para ello es necesario saber cuál es el número de células que tenemos
en la suspensión celular (para aquellos cultivos que crecen en adherencia habrá
que levantar las células mediante el procedimiento de tripsinización y obtener una
suspensión celular).
La manera más habitual de determinar el número de células es
contándolas en un hemocitómetro, como por ejemplo una cámara de Neubauer
(Figura 16).
Figura 16. Recuento de células en cámara de Neubauer
La cámara de Neubauer (A) es una cámara de contaje adaptada al
microscopio de campo claro o al de contraste de fases (B). Se trata de un
portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo del cual se ha marcado
con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen (C).
Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas
de 0.25 mm. Así pues el área redondeada y marcada L (C) corresponde a 1
milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm
respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste
Cámara de
Neubauer
Microscopio
invertido
A B C D
Cámara de
Neubauer
Microscopio
invertido
A B C D
61
dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la
superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 l.
Si contamos las cuatro áreas sombreadas (L) observando un total de x
células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será:
Concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4)
En la Figura 17 se puede observar con más detalle el aspecto de una de
las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como una
cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de lado. Esta imagen ha
sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.
Figura 17. Aspecto detallado de una de las regiones marcadas como L de la
cámara de Neubauer.
Una vez calculado el número de células, añadimos el medio de cultivo
necesario para obtener la concentración requerida, que suele ser habitualmente
de 106 células/ml.
62
Durante todo el procedimiento de recuento celular puede que algunas
células se mueran por ello es conveniente llevar a cabo un estudio de viabilidad
celular en el que pueden emplearse varios métodos. El más común consiste en
teñir de alguna manera las células, de forma que se puedan distinguir y contar las
células vivas y muertas, y el total. Para llevar a cabo la distinción entre células
vivas y muertas se utilizan colorantes vitales. El más común es el azul tripán. El
azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que
presentan roturas en la membrana. Así pues las células que aparecen en la
imagen (Figura 16D), claramente de color azul, son consideradas no viables.
Asimilar células blancas, por exclusión, a células viables es un error pues por este
método se sobrevalora la viabilidad de las células en la suspensión, determinando
como inviables sólo aquellas con la membrana rota.
Para llevar a cabo esta técnica las células se suspenden en buffer fosfato
salino (PBS) y se colocan en hielo hasta que se realiza el contaje celular. Un
pequeño volumen de Trypan Blue preparado al 0.4 %. Se añade a un volumen
igual de suspensión celular y la mezcla se incuba durante 5 minutos. La muerte
celular se determina por la presencia del Trypan Blue citoplasmático. El número
total de células y el porcentaje de células no viables se determina usando un
hemocitómetro bajo microscopia óptica. La viabilidad celular se expresa como el
porcentaje del número de células vivas/ número de células totales.
Existen otros métodos de determinación de la viabilidad celular más
precisos como la tinción con ioduro de propidio o la utilización de contadores
electrónicos de células (cell counter) o más recientemente la citometría de flujo.
Contaminaciones
Uno de los problemas más frecuentes en el cultivo de células en general
es el de las contaminaciones. Las células eucariotas en cultivo crecen lentamente,
con tiempos de duplicación superiores en muchos casos a las 24 h. Sin embargo,
los microorganismos tienen usualmente una tasa de crecimiento superior. Si se da
el caso de una contaminación por estos microorganismos pueden provocar la
muerte del cultivo en poco tiempo o incluso cambios en su fenotipo. Para evitarlo
63
se utilizan una serie de técnicas de trabajo que suponen la máxima asepsia, así
como la esterilización del material y el trabajo en ambientes estériles (cabina de
flujo laminar). Asimismo se utilizan cócteles de sustancias antimicrobianas y
antifúngicas en el medio aunque en multitud de ocasiones no es posible usarlas o
bien no son suficientes para prevenir la aparición de microorganismos.
Los tipos de contaminaciones más frecuentes son:
- bacterias
- hongos y levaduras
- micoplasmas
- virus
Se pueden realizar controles del medio de cultivo para detectar
contaminantes de crecimiento rápido y que producen cambios notables en el
medio de cultivo, pues estos se detectan fácilmente incubando alícuotas de medio
en la estufa durante 24 o 48 h.
Teniendo en cuenta que una de las fuentes más frecuente de
contaminación es la atmósfera se pueden tomar las siguientes precauciones:
1. Trabajo en ambiente estéril, en una cabina de flujo laminar.
2. Usar pipeteadores automáticos y pipetas automáticas. Si no se
dispone de estos nunca pipetear directamente con la boca sino
mediante un tubo de goma y intercalando algodón en la boca de la
pipeta.
3. Mantener los recipientes abiertos tan poco tiempo como sea posible...
4. Todas las botellas de medio y de soluciones atemperadas en un baño
deben secarse cuidadosamente antes de usarlas y deben impregnarse
con alcohol 70%.
64
5. Ante cualquier duda limpiar con alcohol 70 % el material que pueda
estar contaminado si no es reemplazable, o reemplazarlo si es posible.
6. Si se descubre un recipiente contaminado no se debe abrir. Si se han
de tomar muestras para su análisis conviene hacerlo en ambiente
estéril y depués limpiar cuidadosamente el área de trabajo y conectar
la iluminación UV.
Congelación/Descongelación
Es importante disponer de alícuotas congeladas de las células con el fin
de minimizar la acumulación de cambios genéticos en las líneas continuas, evitar
la senescencia y la transformación en las líneas finitas, y evitar la pérdida
accidental de una línea por muerte o contaminación.
En la actualidad el mejor método de almacenamiento es la congelación en
nitrógeno líquido. Las células crecidas hasta un 70-80% de confluencia (fase
logarítmica del cultivo) se resuspenden en presencia de algún agente preservante
como el glicerol o el DMSO. La suspensión celular, idealmente de alta
concentración celular, debe ser congelada lentamente (descenso de
aproximadamente 1ºC/min). Posteriormente las células se transfieren rápidamente
a nitrógeno líquido (-196ºC) cuando alcanzan una temperatura inferior a -50ºC
donde se almacenan sumergidas en nitrógeno o en la fase gaseosa superior
durante largos periodos de tiempo (años) sin deterioro celular apreciable. El
almacenamiento a temperaturas tan bajas como -80ºC es posible aunque se
detecta deterioro de las células a las pocas semanas y/o meses.
La descongelación de los stocks congelados es una fase crítica y se ha de
realizar rápidamente, diluyendo la suspensión y eliminando el agente preservante
con la máxima rapidez.
Existen muchas soluciones aptas para la congelación de células.
Habitualmente se recomienda el uso de 10% DMSO en suero bovino fetal (FCS),
aunque algunas líneas continuas se congelan con la misma eficacia en 10%
DMSO en medio completo (usualmente DMEM 10% FCS).
65
La manipulación de las células durante la congelación y descongelación es
un proceso que conlleva riesgo de contaminar las células. Habrá que prestar
especial atención a no tocar las roscas de los tapones de los crioviales/criotubos, y
tras descongelar las células en el baño, es imprescindible esterilizar el exterior del
tubo con abundante alcohol al 70%, antes de abrirlo y/o manipularlo.
Figura 18.
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66
Figura 19.
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67
Microscopio Invertido
El microscopio invertido permite observar organismos o tejidos en cultivo
sin una preparación previa, favoreciendo el seguimiento del estado de crecimiento,
comportamiento y demás parámetros involucrados en el desarrollo del cultivo.
Como su nombre indica un microscopio invertido tiene una disposición
inversa de sus componentes respecto a un microscopio convencional (Figuras 20
y 21). La fuente de luz y el condensador están sobre la plataforma apuntando
hacia abajo y los objetivos están debajo de la plataforma apuntando hacia arriba.
Los únicos componentes que están en la misma posición son los oculares, y de la
misma forma la muestra se coloca sobre la platina mecánica.
En el caso del microscopio invertido la observación se realiza a través de
las bases de diferentes recipientes con espesores y características ópticas
variable.. El material plástico es ópticamente superior que el de vidrio debido a que
son más delgados y uniformes. Una desventaja del microscopio invertido es su
limitada magnificación, debido a que los objetivos más potentes son de 40X o de
60X. Sin embargo, estos objetivos tienen la ventaja de sobrepasar el límite del
grosor del recipiente y observar la imagen con fineza.
Figura 20. Diferencias entre un microscopio óptico y un microscopio invertido
68
En el microscopio invertido se identifican los siguientes componentes:
1. Portalámpara: Es un casquillo dentro del cual se encuentra la lámpara
que es la fuente de luz halógena.
2. Soporte de filtros: Es un contenedor en el que se insertan filtros
específicos para el tipo de iluminación requerida en la observación. El
filtro de cobalto es de color azul, pasa la luz de amarillo a blanco,
viéndose la imagen en campo claro (es un tipo de iluminación que
permite observar la muestra oscura contra un fondo claro). El filtro
verde es indispensable para el contraste de fases (es un tipo de
iluminación que diferencia la imagen en grado de tono, brillo o color,
observándose las células traslúcidas).
3. Portanillos de luz: Es una corredera de anillos, que se maneja de
acuerdo con el tipo de iluminación requerida (contraste de fases o
contraste en relieve). No se emplean anillos para campo claro.
4. Apertura del diafragma: Es un dispositivo mediante el cual se gradúa
el nivel de luz emitido por la lámpara. Puede mantenerse bajo para
enfocar fácilmente sobre muestras no coloreadas o abierto para
contraste de fases.
5. Condensador: Es un sistema de lentes que recoge los rayos de luz y
los converge dentro de un foco. Se localiza directamente por encima de
la plataforma del microscopio y se acopla con la apertura del diafragma
para controlar el incremento de la resolución, realzar el contraste,
reducir el resplandor y garantizar óptimos resultados con todas las
combinaciones ocular–objetivos.
6. Soporte: Es el que sostiene el condensador y la lámpara manteniendo
la estabilidad del microscopio.
69
7. Plataforma mecánica: Platina metálica donde se colocan las muestras
a observar, presenta un orificio central que comunica la luz proveniente
del condensador con los objetivos.
8. Carro mecánico: Soporte hueco en el cual se acopla el recipiente del
cultivo, posee una regleta que permite el movimiento del carro sobre la
plataforma mecánica, de derecha a izquierda o de arriba hacia abajo.
De acuerdo con el tipo de recipiente se emplea un soporte específico.
En el caso de los frascos no se emplea este soporte. Sin embargo éste
es un accesorio que puede ser reemplazado, colocando cualquier
recipiente directamente sobre la plataforma mecánica y haciendo el
monitoreo del cultivo manualmente, con movimientos diagonales o en
zig zag.
9. Objetivos: Es un sistema de lentes complejas localizadas debajo de la
plataforma mecánica. Los objetivos corrientes tienen muy corta
distancia de trabajo y por lo tanto deben acercarse a la muestra para su
enfoque. En el microscopio invertido los objetivos estan adaptados para
trabajar a largas distancias debido a que el grosor de los recipientes
impide el contacto estrecho entre el objetivo y la muestra. Además, los
objetivos se corrigen o modifican para enfocar muestras sobre
diferentes bases.
El aumento de las lentes se identifica con un código de colores;
- 4X - rojo,
- 10X – amarillo,
- 20X – verde,
- 32 o 40X – azul.
El objetivo de 100X no está disponible para este microscopio.
10. Revolver de portaobjetivos: Es un dispositivo donde se ensamblan los
objetivos.
70
11. Otras piezas: Los botones micro y macrométrico, tubo binocular o
trinocular (en caso de poseer un fototubo para adaptar cámara
fotográfica), oculares, anillo de ajuste de dioptrías (para la corrección de
la diferencia de dioptrías entre ambos ojos), botón para ajustar el bulbo
de voltaje (dispositivo que regula la entrada de voltaje al microscopio
prolongando su tiempo de duración), o el receptáculo para el cable de
conexión comunicado con el fusible del microscopio. En la siguiente
tabla (tabla 7) se muestra a modo de resumen una lista de los
componentes de un microscopio invertido.
TABLA 7 .COMPONENTES DE UN MICROSCOPIO INVERTIDO
Portalámpara
Soporte de filtros
Portanillos de luz
Apertura del diafragma
Condensador
Soporte
Plataforma mecánica
Carro mecánico
Objetivos
Revólver de portaobjetivos
Otras piezas
(botones micro y macrométrico,
tubo binocular,
oculares…)
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Figura 21. Microscopio invertido
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