Expresión y purificación de proteínas...

Universidad de Buenos AiresFacultad de Ciencias Exactas y Naturales

Expresión y purificación de proteínas recombinantes

(breve puesta en común)

Curso CELFI – Cristalización de Macromoléculas Biológicas

Buenos Aires Agosto 2018

Dr. Martín M. Dodes Traian

Un poco de historia

• Hemoglobina de lombriz (Hünefeld, 1840)

• Excelsina (nuez brasilera) (Hartig, 1855)• Cocosina (cacao), edestina (cáñamo) (Ritthausen, 1880)• Albúmina de huevo (Hofmeister, 1890)

• Insulina (Abe et al, 1927)• Tripsina, Pepsina, Ribonucleasa, etc.. etc. (Northrup, 30’s,

Premio Nobel de Química 1946)

Curso CELFI – Cristalización de Proteínas – UBA – FCEyN - Buenos Aires 2018

Primeros cristales de proteína

McPherson, A. (1991) Journal of Crystal Growth

Un poco de historia


Primeras estructuras tridimensionales resueltas

Kendrew JC et al. (1958). A Three-Dimensional Model of the Myoglobin Molecule Obtained by X-Ray Analysis. NaturePerutz MF et al.(1960). Struct of haemoglobin: a three-dimensional Fourier synthesis at 5.5 A. res., obtained by X-ray analysis. Nature

Hemoglobina (MF Perutz, 1960)Mioglobina (JC Kendrew, 1958)

Premio nobel de Química 1962

Un poco de historia

• Entre los años ‘60 y ’80 se trabajó fuertemente con los cristales que ya había disponibles.

• Se dependía de la habilidad de los químicos de proteínas para poder generar nuevos cristales que puedan ser sometidos a difracción de rayos X

• La demanda de nuevas estructuras comenzó a exceder la oferta….

• Combinar el interés biológico de una pregunta con la disponibilidad de cristales y eventuales estructuras.


Cristalización y primeras estructuras

Un poco de historia

• Trabajo fundacional de Stanley Cohen: creación de plásmidos recombinantes (PNAS 1972) y posibilidad de expresión de proteínas interespecífica (Annie Chang, JF Morrow y S Cohen PNAS 1974)

• La invención de la PCR (Kary Mullis 1983 y publicado en Saiki et al Science 1985 y en Mullis et al 1986), y la flexibilidad que sumó a las técnicas de clonado.


Revolución del ADN recombinante

Un poco de historia

• La combinación de la biología molecular junto con las técnicas ya desarrolladas de cristalografía, sumado al desarrollo de las computadoras personales y mejores herramientas de visualización, se combinaron para producir un incremento notable en la variedad y disponibilidad de estructuras.


Incremento en el número de estructuras cristalográficas resueltas

http://www.rcsb.org/pdb/statistics/contentGrowthChart.do?content=total

Ventajas

• Posibilidad de incrementar la cantidad y por ende la variedad de material de partida.

• La variedad no solo en cuanto a expresar proteínas o marcos de lectura cuya secuencia conocemos, sino también en cuanto a mutaciones, dominios particulares, quimeras, etc.

• Introducción de elementos que faciliten la purificación, principalmente el uso de tags para cromatografía de afinidad.


Rol de las tecnologías de DNA recombinantes

Flujo de trabajo típico



Clonado y/o Diseño por ingeniería

genética de las secuencias a

expresar

Inserción / transformación de los vectores

en el organismo

modelo

Crecimiento y inducción de la producción de

proteína recombinante

Extracción o colección de la

proteína producida

Purificación de la proteína

recombinante

Cristalización(…resto del

curso)

Sistemas de expresión

• Sistemas procariotas (Escherichia coli, Bacillus subtilis, Caulobacter crescentus, Pseudomonas sp, Streptomyces lividans, Lactobacillus lactis)

• Sistemas eucariotas

Levaduras (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenulapolymorpha, Yarrowia lipolytica, etc)

Algas (Chlamydomonas reinhardtii, Phaeodactylum tricornutum, etc)

Cultivos celulares de vertebrados (CHO, BHK21, HEK293, etc) Cultivos celulares de insectos (Sistema de baculovirus) Organismos completos (Bos Taurus)



Sistemas de expresión

¿Cómo elegimos el sistema adecuado?

• Aplicación. Plegado complejo o necesidad de modificaciones post-traduccionales (glicosilaciones princ.)

• Disponibilidad y costos (cepas, medios, fermentadores)

• Experiencia con los sistemas. Tanto en sus manipulaciones en general como en su biología molecular.


Escherichia coli

Ventajas:• Fácil manejo. Tiempos cortos de duplicación.• Fisiología y genética muy estudiadas.• Gran variedad de vectores y cepas modificadas

disponibles.• Altos niveles de producción de proteína recombinante

(hasta 30% de la biomasa total).• Cultivos económicos.• Elevada densidad de crecimiento.• Escalado relativamente sencillo.


El caballito de batalla

Escherichia coli

Desventajas:• Generación de cuerpos de inclusión.• Escasas modificaciones post traduccionales de interés• Dificultades para la generación de puentes di-sulfuro en el

plegado (hay cepas y señales para expresión periplásmica pero con menor rendimiento).


El caballito de batalla

Escherichia coli


Medios de cultivo

LB (Lisogeny Broth) TB (“Terrific Broth”) 2x YT SOB (“Super Optimal Broth”)

10 g/L Peptona.5 g/L extracto de

levaduras.10 g/L NaCl.

12 g/L Peptona.24 g/L extracto de levaduras.0.5 % glicerol.89 mM Buffer Fosfato.

16 g/L Peptona.10 g/L extracto de levaduras.

5 g/L % NaCl.

20 g/L Peptona.5 g/L extracto de

levaduras.0.5 g/L % NaCl.2.5 mM KCl.10 mM MgCl2 y 10 mM de MgSO4.20 mM Glucosa(medio “SOC”).

Formulaciones más comunes para expresión deproteínas recombinantes en E coli

Escherichia coli



Escherichia coli


Algunas cepas

http://wolfson.huji.ac.il/expression/bac-strains-prot-exp.html

Cepa Descripción Resistencia

BL21 (DE3) Contiene el gen que codifica para la polimerasa T7, inducible por IPTG.

Origami Derivadas de K-12. Favorecen la formación de puentes disulfuro (mutantes en trxB y gor).

Kanamicina; Tetraciclina.

Rosetta Derivadas de BL21 lacZY (Tuner), diseñadaspara mejorar la expresión de proteínaseucariotas. poseen tRNAs que reconocencodones raros para la bacteria (AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA).

Cloranfenicol

Rosetta-gami-pLysS Combina el reconocimiento de codones extraños para la bacteria, con un la regulación de la inducción de la lisozima T7, y favorecido para la formación de puentes disulfuro (origami).

Kanamicina; Tetraciclina; Cloranfenicol.

ArticExpress(DE3)RP Crece a bajas temperaturas (para mejorar la solubilidad)

TratraciclinaGentamicinaEstreptomicina

Pichia pastoris

Ventajas:

• Utiliza promotores fuertes y regulados con una gran eficiencia(AOX1).

• Vectores de expresión y cepas disponibles comercialmente.• Fácil manejo de cultivos, así como de los pasos de biología

molecular necesarios.• Buen sistema para producir proteínas secretadas al medio de

cultivo (secreción eficiente de la proteína recombinante, y bajasecreción de las endógenas).

• Necesita medios de cultivo de fácil formulación y económicos. • Se puede trabajar con cultivos de elevada densidad.• Elevados niveles de producción de proteína recombinante (10

a 100 veces mayor que S. cerevisiae).


Combinando ventajas

Pichia pastoris

Ventajas:• Pueden formar puentes disulfuro de manera adecuada• Tiene la capacidad de glicosilar en asparaginas (N-glicosi-

lación) y/o residuos de serinao treonina (O-glicosilación)

Desventajas:

• Los patrones de glicosilación suelen ser diferentes de los obtenidos en sistemas de expresion de células de mamíferos.

• El uso de metanol para inducer puede volver más complejo el escalado por riesgos de incendio.


Combinando ventajas

Baculovirus


Expresión en células de insecto

• Utiliza el genoma modificado de AcNPV (Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus), para infectar líneas celulares de Spodoptera frungiperda(Sf9, Sf21), o Trichoplusia ni (High Five®).

• Introduce el gen de interés en el genoma linealizado de AcNPV empleando elsistema a través del cual el bacteriófago lambda se integra en el genoma deEscherichia coli (a través de un proceso de recombinación molecular sitioespecífica).

Baculovirus

Ventajas:• Alto rendimiento y calidad (plegado, glicosilaciones)

de las proteínas obtenidas.

Desventajas:

• Puede llevar 3-4 semanas todo el ciclo de infección/transformación de las células, expresión, verificaciónde la producción de proteína. Antes de los kits de recombinación era aún más engorroso el screening.

• Manipulación más compleja que en sistemas bacterianos o de levaduras.


Expresión en células de insecto

Cultivo de células de mamíferos

Ventajas:• Excelentes para proteínas eucariotas con puentes disulfuros

en disposición correcta.• Tiene la capacidad de realizar las modificaciones post

traduccionales deseadas (sobre todo para aplicacionesrelacionadas con la industria farmacéutica).

Desventajas:

• Medios de cultivo, sistemas de escalado, muy costosos.• Crecimiento de baja densidad.• Bajos rendimientos de expresión (menos de 5 g/L típico).• Screening y selección de clones puede llevar 2-3 meses

aunque algunos métodos están reduciendo estos tiempos.


CHO y HEK293 las más utilizadas




Clonado y/o Diseño por ingeniería

genética de las secuencias a

expresar

Inserción / transformación de los vectores

en el organismo

modelo

Crecimiento y inducción de la producción de

proteína recombinante

Extracción o colección de la

proteína producida

Purificación de la proteína

recombinante

Cristalización(…resto del

curso)

Purificación


Uso de tags – Cromatografía de afinidad

• La cromatografía de afinidad, a pesar de su alta especificidad, típicamente conlleva la dificultad de unir un ligando a una matriz para posteriormente capturar la proteína de interés.

• Con las mencionadas ventajas del uso de la biología molecular se puede proceder al agregado de tags a la proteína a expresar. Estos tags pueden ser desde un oligopéptido (6xHis) hasta dominios de decenas de kDa (MBP). Esto facilita mucho el procesamiento de los lisados o medios obtenidos posteriormente a la expresión de la proteína de interés.

Purificación



• El uso de colas de poli-histidinas (6 típicamente, 6xHis) es uno de los métodos más utilizados en cromatografía de afinidad (IMAC, Immobilized Metal AffinityChromatography)

Purificación



Cromatograma

SDS-PAGE

• La elución se hace con un gradiente de concentración creciente de imidazol, que termina desplazando a la histidina de los sitios de unión a la columna.

Imidazol

Histidina

Purificación


Fast Protein Liquid Chromatography

• Los equipos de FPLC permiten de manera controlada combinar y aplicar distintos buffers por las columnas y monitorear los diferentes perfiles de elución: sean éstos gradientes de imidazol, fuerza iónica, pH, etc.

Purificación


“Limpiando” la proteína

Típicamente se busca quitar el exceso de sales e imidazol del buffer de elución de la cromatografía de afinidad. También puede ser necesario hacer un cambio de buffer previo a guardar o hacer un paso más de purificación.Lo más frecuente es hacer una o dos diálisis, o utilizar algún otro método de desalado como una columna de desalado o utilizar concentradores que también se pueden usar para hacer un cambio de buffer. También algunos protocolos de remoción enzimática de tags se hacen en este paso.

Purificación


“Limpiando” la proteína. SEC.

Tras una cromatografía exitosa, por lo general se obtiene la proteína de interés más concentrada que en la siembra original y con una pureza mayor al 80-90 %.

Es común sin embargo, previo a cristalizar, hacer un paso más de purificación que además nos puede brindar algo de información sobre la estructura cuaternaria de la proteína. Esto es, una cromatografía de exclusión molecular.

Purificación


“Limpiando” la proteína. SEC.

Cromatografía de Exclusión Molecular oSEC (Size Exclusion Chromatography)

Purificación


Cuantificación. Concentración. Controles biofísicos/bioquímicos.

• En general se busca para comenzar a intentar una cristalización tener un stock de la proteína purificada en el orden de, 5-20 mg/mL

• La cuantificación puede realizarse por un método colorimétrico clásico como Bradford o por absorción UV a 280 (el coeficiente de absortividad molar se puede determinar a partir de la secuencia proteica).

• De ser posible, ensayos bioquímicos de actividad nos pueden asegurar que la proteína adoptó mayormente una conformación activa (siempre un buen indicio).

• También se pueden efectuar ensayos biofísicos, como por ejemplo de dicroísmo circular o de fluorescencia que nos dan una idea de la estructura secundaria y/o terciaria.

¡¡Muchas gracias por su atención!!

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