8/20/2019 Cuantificación de Oligonucleótidos y Proteínas

http://slidepdf.com/reader/full/cuantificacion-de-oligonucleotidos-y-proteinas 1/4

Cuantificación de Oligonucleótidos y Ácidos Nucleicos por Espectroscopia deUV 

Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia de bases aromáticasnitrogenadas a lo largo de las cadenas de DNA. La absorción de UV de DNA es una característica de lamolécula, que es usada eficientemente para determinar su concentración. Cada una de las bases tiene su

propio y único espectro de absorción y por lo tanto contribuye de manera diferente a la propiedad total deabsorción de UV de una molécula de DNA. Para muchas aplicaciones, el porcentaje de contribución de cadauna de las bases al espectro de absorción de UV de una molécula de DNA de doble cadena de alto pesomolecular (dsDNA) puede ser ignorado . Sin embargo, esas contribuciones son mas significativas cuando setrata de oligonucleótidos y deben ser consideradas si se requiere determinar correctamente la concentración.

Concentración de Oligonucleótido en pmol/µl 

Los ácidos nucleicos tiene un máximo de absorción a una longitud de onda de 260 nm. A esta longitud por lotanto, la absorción es proporcional a la concentración.

C (pmol/µl)= (A260 * 100 * Factor de dilución) / (1.54*nA + 0.74*nC + 1.15*nG + 0.87*nT)

En la fórmula:

C, es la concentración calculada en picomolas por microlitro (pmol/µl).

A260 es la absorbancia a 260nm.

El denominador consiste de la suma de los coeficientes de cada base multiplicados por el número de vecesque aparece en el oligonucleótido.

El factor de dilución es igual a el volumen final de la dilución dividido entre la cantidad alicuotada para ladilución.

Protocolo para medir la absorbancia de un oligonucleótido. 

1.  Encender 20 min la lámpara de UV en el espectrofotómetro para su calentamiento y seleccionar lalongitud de onda a 230 y 260nm

2.  Usar agua destilada en una celda de cuarzo y utilizarla como blanco de referencia (una celda de

plástico no trasmite eficientemente la luz ultravioleta y por lo tanto NO debe utilizarse para

este procedimiento).

3.  A 990 µl de agua destilada en un tubo de 1.5ml, agregar 10µl de solución de oligonucleótido,mezclar bien y transferir a la celda de cuarzo que se utilizó para el blanco.

4. 

Leer la absorbancia a 260nm de la muestra

NOTA:- A 260nm, el DNA debe mostrar una absorbancia máxima.

Ejemplo.

Se tiene un 21mero con la secuencia 5' ACT CCT GGC CAG GAC TTA TTG 3' . El oligo se diluyó 100µl +900µl de agua. La lectura de absorbancia a 260nm= 0.285736. ¿Cuál es la concentración del oligo?

8/20/2019 Cuantificación de Oligonucleótidos y Proteínas

http://slidepdf.com/reader/full/cuantificacion-de-oligonucleotidos-y-proteinas 2/4

C = 0.286 x 100 x (1000/10) / [(1.54 x 4) + (0.74 x 6) + (1.15 x 5) + (0.87 x 6)]C = 2860/21.57C = 132.6pmol/µl

Concentración de Oligonucleótido en Unidades de Densidad Óptica(O.D.'s) 

La cantidad de oligonucleótido también se expresa como Unidades de Densidad Óptica (O.D.); esto es, lacantidad de Oligo disuelto en 1ml de agua con un valor de A260 igual a 1.00 en una celda de 1cm de longitud,y se calcula por la ecuación:

Unidades O.D.= (A260)  (volumen del stock) (factor de dilución)

Para el ejemplo anterior tenemos que la solución stock es de 1.2ml.Unidades O.D.= 0.286 x 1.2ml x (1000/10µl) = 34.32 O.D.'s

Concentración de Oligonucleotido en µg/ml 

El valor de A260 se convierte a µg/ml usando el coeficiente de extinción para ssDNA la cual es 1ml/33µg parauna celda de 1cm de longitud. Por lo tanto, para un valor de O.D. de 1.0, en principio la muestra contiene33µg de ssDNA por ml o en la ecuación:

1unidad de O.D.de ssDNA=33µg

Nuevamente para el ejemplo anterior:

33µg/ml/1.0 O.D. = µg/ml/0.286 = 9.43µg/ml/

Multiplicando por el factor de dilución la concentración en la solución stock9.43µg/ml/ x (1000µl/10µl) = 943µg/ml

Concentración en µg/ml de ssDNA de Alto Peso Molecular. 

La concentración de ssDNA de alto peso molecular puede expresarse como pmol/µl, tomando en cuenta elpromedio del peso molecular de un nucleótido en la molécula de DNA. que para ssDNA es 330 daltons. (eltermino "dalton" es una unidad definida como 1/12 de la masa atómica del 12C. El cual es utilizado como pesomolecular expresado cuantitativamente como g/mol).

8/20/2019 Cuantificación de Oligonucleótidos y Proteínas

http://slidepdf.com/reader/full/cuantificacion-de-oligonucleotidos-y-proteinas 3/4

Ejemplo:El Bacteriófago de ssDNA M13mp18 consiste de 7250 nucleotidos. Para expresar esto como µg/pmol:

(7250nts) 330µg/mol x 106 µg x _1mol___ =2.39µg/molnt g 1012pmol

Si diluyes tu stock de ss DNA M13mp18 a razon de 10µl/1000µl y da una lectura de A260 = 0.163, laconcentración es:

(xµg/µl) / (0.163) = (33µg/µl) / (1.0 OD) x= 5.38 µg/µl multiplicando por (1000 µl/10 µl) = 538 µg ssDNA/ml

Para convertir a pmol / µl:(538µg / ml ) (1pmol / 2.39µg )( 1ml / 1000µl ) = 0.225 pmol/µl 

Concentración en µg/ml de dsDNA de Alto Peso Molecular.  

Para determinar la concentración de ssDNA de Alto Peso Molecular, plásmidos o productos de PCR, serealizan mediciones a 260 y 280 nm. Concentraciones tan bajas como 2.5µg/ml pueden ser detectadas. A pH

neutro, una solución de DNA a 1 mg/ml  tiene una absorción máxima a 260nm de 20 cuando se lee en unacelda de 1cm. (este valor es para moléculas de dsDNA con un contenido G+C de 50%. Sin embargo paramuchas aplicaciones en Biología Molecular el contenido de G+C no es necesario considerarlo a menos quesea muy extremo). En principio una solución de dsDNA con una concentración de 50 µg  /ml debe tener una

A260 igual a1.0. 

1 (A260) unidad de dsDNA=50 µg /ml 

Ejemplo: de una solución del plásmido pUC19 se diluyo una alícuota a razón de 5µl / 1000µl en agua, las lecturas deabsorbancia son: 260 = 0.395; 280 = 0.2237

(xµg/ml) / (0.395) = (50µg / ml) / (1.0 OD) x= 19.74 µg/ml multiplicando por (1000 µl / 5 µl) = 3950µg dsDNA/ ml 

La relación A260 /A280 del dsDNA es 0.395 / 0.2237 = 1.76 

Las proteínas tienen un máximo de absorción a A280 (principalmente por residuos de triptófano) las lecturas aesta longitud pueden mostrar si existe algún contaminante proteico. El cálculo de la relación A 260 /A280 es unamanera común para expresar la pureza del DNA. Dependiendo de la composición nucleica, un valor de 1.65

a 1.9 indican una muestra pura. 

Debido a otros contaminantes una muestra con una relación alta de A260  /A280  puede no necesariamenteproducir buenos datos de secuencia. A veces también, una muestra con una baja relación A 260  /A280  puedesecuenciarse bien.

El método mas común de purificación de DNA es extrayendo la preparación con fenol para remover laproteína contaminante. El fenol tiene una absorción máxima a 270nm. Las preparaciones que contienenresiduos de fenol pueden dar lecturas artificiales altas a A 260 y la concentración de DNA será sobrestimada.

Midiendo la Concentración de RNA en µg/ml. 

La concentración de RNA de determina por el mismo protocolo que el utilizado para la medición de DNA.Sin embargo se aplica la siguiente relación:

1 unidad A260 de ssRNA = 40µg / ml Las preparaciones puras de RNA tienen una relación A260 /A280 de 2.0

8/20/2019 Cuantificación de Oligonucleótidos y Proteínas

http://slidepdf.com/reader/full/cuantificacion-de-oligonucleotidos-y-proteinas 4/4

 

Cuantificación de proteínas

a) Absorbancia a 205-210nm

La mayor parte de las proteínas poseen un pico de absorción máxima a 280 nm. Los grupos responsables detal característica son los aminoácidos aromáticos (Tirosina y Triptófano).

Las proteínas poseen coeficientes de extinción molar (E280nm) que puede variar de acuerdo a su composiciónaminoacídica entre 0,4-1,5. Como aproximación se puede considerar que una unidad de absorbancia secorresponde con una concentración (C) de 1mg/ml de proteínas:

 Abs280nm / E280nm = C, si E280nm se considera = 1 mg -1 ml cm-1 

 Abs280nm = 1 mg/ml

Si la solución de proteínas contiene DNA y/o RNA se introduce un error en la medición, dado que estosabsorben a 280 nm.

b) Absorbancia a 205-215nm

A dicha longitud de onda absorbe la unión peptídica (grupo amida), por lo tanto es un método más sensible yno dependiente de los aminoácidos que componen la proteína en estudio.

La limitación de esta técnica esta dada por que la mayoría de los buffers utilizados también absorben a esalongitud de onda y otros compuestos con el grupo amida.