CUANTIFICACIÓN Y EXTRACCIÓN DE PECTINA A PARTIR DE LOS ...

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CUANTIFICACIÓN Y EXTRACCIÓN DE PECTINA A

PARTIR DE LOS DESECHOS DE CÁSCARA DE FRUTA

Proyecto de grado

Por

ANGELA PATRICIA FIGUEROA FAJARDO

Presentado a la Facultad de Ingeniería de la

Universidad de los Andes

En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de

INGENIERO QUÍMICO

Departamento de Ingeniería Química

Diciembre 2017

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Cuantificación y extracción de pectina a partir de los desechos de cáscara de fruta

Copyright 2017 Angela Patricia Figueroa Fajardo

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CUANTIFICACIÓN Y EXTRACCIÓN DE PECTINA A

PARTIR DE LOS DESECHOS DE CÁSCARA DE FRUTA

Proyecto de grado

Por

ANGELA PATRICIA FIGUEROA FAJARDO

Presentado a la Facultad de Ingeniería de la

Universidad de los Andes

En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de

INGENIERO QUÍMICO

Aprobado por:

Asesora, Rocío Sierra Ramírez, Ph.D.

Co-asesor, Daniel David Durán Aranguren, M.Eng.

Jurado, Felipe Muñoz Giraldo, Ph.D.

Director del departamento, Oscar Álvarez Solano, Ph.D.

Departamento de Ingeniería Química

Diciembre 2017

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ABSTRACT

Quantification and extraction of pectin from fruit peel wastes

(December 2017)

Angela Patricia Figueroa Fajardo, Universidad de los Andes, Colombia

Advisor: Rocío Sierra Ramírez, Ph.D.

The treatment of agribusiness wastes, as well as the implied monetary loss generates

the need to look for alternatives for their use. In this work, it is studied the possibility of

obtaining pectin as value added product from the fruit peel. First, the content of galacturonic

acid (pectin's main constituent monosaccharide) in each of the fruits was quantified by use

of a colorimetric method to be able to determine the pectin’s recovery and process yield of

different pectin extraction protocols, likewise, the acid type influence was evaluated in these

protocols.

Additionally, a full factorial design of experiments was carried out to stablish

appropriate operation conditions, three factors were defined who could influence the pectin’s

recovery which are pH’s solution, the extraction time and temperature at two levels

corresponding to 1.5 – 2.5, 60 – 120 minutes and 70 – 90 °C. To stablish an appropriate

pectin extraction protocol, it was the purpose of all this work.

It was determined that the wavelength at which the quantification should be carried

out is 530 nm. Also, the content of total solids (1), galacturonic acid (2) and pectin (3) was

determined, on average for peels of mango, banana, pineapple, dragon fruit and gold berry

to be (1) 88.05±0.11%, 85.77±0.12%, 83.22±0.31%, 85.07±0.16%, 88.09±1.63%, (2)

11.14±0.07%, 7.65±0.94%, 4.94±0.59%, 12.86±0.79%, 3.05±0.46% and (3)

15.66±0.10%, 10.75±1.33%, 6.95±0.83%, 18.08±1.11%, 4.28±0.64% respectively.

On the other hand, the protocol with the highest pectin recovery and process yield

was protocol III with values of 29.93±2.89% and 5.41±0.52% in that order, protocol I has

values close to protocol III, however, due to advantages of protocol III this predominates

over I, also, these protocols were tested with citric acid (I) and glacial acetic acid (III), it was

found that the use of sulfuric acid recovers more pectin compared to organic acids.

5

Finally, the appropriate operation conditions for protocol III are pH at 1.5, 120

minutes at 90°C with pectin’s recovery and process yield values of 65.07±0.98% and

11.76±0.18%.

Key words: Quantification, extraction, pectin, galacturonic acid, fruit peel and operation

conditions.

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RESUMEN

Cuantificación y extracción de pectina a partir de los desechos de cáscara de fruta

(diciembre, 2017)

Angela Patricia Figueroa Fajardo, Universidad de los Andes, Colombia

Asesora: Rocío Sierra Ramírez, Ph.D

El tratamiento de desechos agroindustriales, así como la pérdida monetaria implícita

genera la necesidad de buscar alternativas en el uso de los mismos, para ello, este trabajo

aborda la posibilidad de obtener pectina como producto de valor agregado a partir de la

cáscara de fruta. En primer lugar, se cuantificó mediante un método colorimétrico el

contenido de ácido galacturónico (principal monosacárido constituyente de la pectina) en

cada una de las frutas, esto con el fin de poder determinar la recuperación de este compuesto

y rendimiento del proceso en diferentes protocolos de extracción, asimismo, se evaluó la

influencia del tipo de ácido en estos.

Adicionalmente, se realizó un diseño factorial con 3 factores los cuales pueden influir

en la recuperación de pectina correspondientes al pH de la solución, el tiempo y temperatura

de extracción con el fin de fijar las condiciones de operación del proceso, cada factor cuenta

con 2 niveles que corresponden a 1.5 – 2.5, 60 – 120 minutos y 70 – 90 °C. Todo esto con el

propósito de proponer un protocolo de extracción de pectina adecuado.

Se determinó que la longitud de onda a la cual realizar la cuantificación es de 530 nm,

asimismo, el contenido de sólidos totales de muestra seca (1), de ácido galacturónico (2) y

pectina (3) se estableció, en promedio estos para la cáscara de mango, banano, piña, pitahaya

y uchuva son de (1) 88.05±0.11%, 85.77±0.12%, 83.22±0.31%, 85.07±0.16%,

88.09±1.63%, (2) 11.14±0.07%, 7.65±0.94%, 4.94±0.59%, 12.86±0.79%, 3.05±0.46% y

(3) 15.66±0.10%, 10.75±1.33%, 6.95±0.83%, 18.08±1.11%, 4.28±0.64%

respectivamente.

Por otro lado, el protocolo con mejor recuperación de pectina y rendimiento de

proceso fue el III con valores de 29.93±2.89% y 5.41±0.52% en ese orden, el protocolo I

tiene valores muy cercanos a estos, sin embargo, por ventajas propias del protocolo III este

7

predomina sobre el I. Asimismo, se probaron estos protocolos con ácido cítrico (I) y ácido

acético glacial (III), se encontró que el uso de ácido sulfúrico recupera más pectina en

comparación a los ácidos orgánicos.

Finalmente, las condiciones apropiadas para operar el protocolo de extracción III son

a pH 1.5, por 120 minutos a 90°C con una recuperación de pectina y rendimiento del proceso

de 65.07±0.98% y 11.76±0.18% respectivamente.

Palabras clave: Cuantificación, extracción, pectina, ácido galacturónico, cáscara de fruta y

condiciones de operación.

8

DEDICACIÓN

Este trabajo está dedicado a mi familia y a todo aquel que desee ampliar sus

conocimientos.

9

AGRADECIMIENTOS

Primero que nada, agradezco a mi familia por todo el amor y compromiso, sin su

constante dedicación todo esto no hubiese sido posible. En especial, un agradecimiento a

Rocío Sierra y Daniel Durán por todo el apoyo y confianza brindada a lo largo de la

realización de este proyecto, quienes desempeñaron un rol fundamental en el mismo.

10

NOMENCLATURA

AGA Ácido galacturónico

xi Dato en la posición i de una muestra de n datos ordenados ascendentemente

n Tamaño de la muestra de datos

T Temperatura [°C]

t Tiempo [min]

RP Porcentaje de recuperación de pectina [%]

Qcalculado Valor Q calculado

Qtabla Valor Q de tabla

HM Pectina de alto metoxilo

LM Pectina de bajo metoxilo

DM Grado de esterificación [%]

SAG Grado de gelificación [°]

11

TABLA DE CONTENIDO

ABSTRACT ........................................................................................................................... 4

RESUMEN ............................................................................................................................. 6

DEDICACIÓN ....................................................................................................................... 8

AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................... 9

NOMENCLATURA ............................................................................................................. 10

LISTA DE FIGURA ............................................................................................................. 15

LISTA DE TABLAS ............................................................................................................ 17

OBJETIVOS ......................................................................................................................... 18

Objetivo general ................................................................................................................ 18

Objetivos específicos ........................................................................................................ 18

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 19

CAPÍTULO 1. CUANTIFICACIÓN DE PECTINA ........................................................... 23


Metodología ...................................................................................................................... 23

2.1 Barrido espectral ..................................................................................................... 23

2.2 Curva de calibración................................................................................................ 23

12

2.3 Sólidos totales de muestra seca ............................................................................... 24

2.4 Cuantificación de ácido galacturónico de cada fruta .............................................. 24

2.5 Cuantificación de ácido galacturónico por unidad de pectina................................. 24

Resultados ......................................................................................................................... 24

3.1 Barrido espectral ..................................................................................................... 24

3.2 Curva de calibración................................................................................................ 25

3.3 Porcentaje de sólidos totales de muestra seca ......................................................... 26

3.4 Cuantificación de ácido galacturónico de cada fruta .............................................. 27

3.5. Cuantificación de ácido galacturónico por unidad de pectina................................ 27

Análisis de resultados ....................................................................................................... 27

CAPÍTULO 2. EXTRACCIÓN DE PECTINA ................................................................... 30


Metodología ...................................................................................................................... 30

2.1 Comparación entre protocolos de extracción .......................................................... 30

2.2 Comparación entre ácidos orgánicos y minerales ................................................... 30

Resultados ......................................................................................................................... 31

13

3.1 Comparación entre protocolos de extracción .......................................................... 31

3.2 Comparación entre ácidos orgánicos y minerales ................................................... 31

3.3 Porcentaje de sólidos totales de muestra seca ......................................................... 32


CAPÍTULO 3. CONDICIONES DE OPERACIÓN ............................................................ 34


Metodología ...................................................................................................................... 34

Resultados ......................................................................................................................... 34


CONCLUSIONES ................................................................................................................ 43

TRABAJO FUTURO ........................................................................................................... 44

REFERENCIAS ................................................................................................................... 45

ANEXOS .............................................................................................................................. 47

1. Protocolos de cuantificación de ácido galacturónico ................................................ 47

1.1 Tratamiento de cáscara ............................................................................................ 47

1.2 Extracción de ácido galacturónico .......................................................................... 47

14

1.3 Reacción colorimétrica ............................................................................................ 48

2. Protocolo de determinación del porcentaje sólidos totales en muestra seca ............. 48

3. Protocolos de extracción de pectina .......................................................................... 49

3.1 Extracción de pectina I propuesta por S.Q. Liew, N.L. Chin y Y.A. Yusof (Liew,

Chin, & Yusof, 2014) .................................................................................................... 49

3.2 Extracción de pectina II propuesta por N. Berardini, M. Knödler, A. Schieber y R.

Carle (Berardini, Knödler, Schieber, & Carle, 2005).................................................... 51

3.3. Extracción de pectina III propuesta por dos referencias: CP Kelco: A Huber

Company (CPKelco, 2011) y A.K.M. Azad, M.A. Ali, Mst. Sorifa Akter, Md. Jiaur

Rahman y, Maruf Ahmed (Azad, Ali, Akter, Rahman, & Ahmed, 2014) .................... 52

4. Test Q (Harris, 2007) ................................................................................................. 53

15

LISTA DE FIGURA

Figura 1 Pectina en la célula …………………………………………………………….… 20

Figura 2 Estructura de pectina …………………………………………………………..… 21

Figura 3 Diagrama de bloques del proceso de extracción y recuperación de pectina ..…… 22

Figura 4 Barrido espectral de una solución a 80 μg/mL de AGA ……………………….… 25

Figura 5 Curva de calibración del ácido galacturónico a 530 nm ………………….……… 26

Figura 6 Comparación entre curvas de calibración ……………………………………...… 28

Figura 7 Gráfica de residuos para la recuperación de pectina …………………………..… 35

Figura 8 Prueba de Bartlett, igualdad de varianzas ……………………...………………… 36

Figura 9 A. (Izquierda) Gráfica de efectos normales estandarizados absolutos. B. (Derecha)

Gráfica de efectos normales estandarizados ………………………………….…………… 38

Figura 10 Diagrama de Pareto ………………………………………….…………………. 38

Figura 11 Gráfica de efectos principales ………………………………..………………… 39

Figura 12 Gráfica de interacciones ………………………………………...……………… 40

Figura 13 Gráfica de contorno …………………………………………………………..… 41

Figura 14 Gráfica de cubo ………………………………………………………………… 42

Figura 15 A. (Izquierda) Acondicionamiento para entrar al equipo de liofilización. B.

(Derecha) Molido de cáscara seca ……………………………………………………...…. 47

Figura 16 A. (Izquierda) Molido de cáscara de fruta en solución de EDTA. B. (Derecha)

Soluciones problema de AGA de cada cáscara de fruta …………………………………... 48

Figura 17 A. (Izquierda y central) Tratamiento térmico de reacción colorimétrica. B.

(Derecha) Curva de calibración después de la reacción colorimétrica ………………….… 48

Figura 18 A. (Izquierda) Secado de crisoles en mufla. B. (Derecha) Reposo de crisoles en

desecador …………………………………………………………………………………. 49

16

Figura 19 A. (Izquierda) Secado de cáscara en horno. B. (Derecha) Molido de cáscara

mecánico tamaño 1mm ………………………………………………………………...…. 49

Figura 20 Extracción de pectina en frasco Schott …………………………………...…….. 50

Figura 21 A. (Izquierda) Solución de extracción en tubos Falcon. B. (Derecha) Precipitación

de pectina sin exposición a la luz ………………………………………………………..… 50

Figura 22 A. (Izquierda) Pectina precipitada en Schott. B. (Derecha) Pectina recuperada en

papel filtro ………………………………………………………………………..……….. 51

Figura 23 A. (Izquierda) Cáscara secada por horno. B. (Derecha) Molido manual …….… 51

Figura 24 A. (Izquierda) Extracción de pectina con plancha de calentamiento. B. (Derecha)

Filtrado de solución de extracción …………………………………………...……………. 52

Figura 25 A. (Izquierda) Triturado con licuadora. B. (Central y Derecha) Secado de cáscara

triturada antes y después del horno ………………………………………………………... 53

Figura 26 Filtrado y lavado de pectina en embudo ………………………………………... 53

17

LISTA DE TABLAS

Tabla 1 Absorbancia promedio para cada solución de la curva de calibración …………… 25

Tabla 2 Contenido de sólidos totales de muestra seca en cada cáscara de fruta ………...… 26

Tabla 3 Contenido de AGA en cada cáscara de fruta …………………………………...… 27

Tabla 4 Contenido de pectina en cada cáscara de fruta …………………………………… 27

Tabla 5 Comparación entre protocolos de extracción ………………………………...…… 31

Tabla 6 Comparación entre ácidos orgánicos y minerales en los protocolos de extracción . 31

Tabla 7 Contenido de sólidos totales de muestra seca de los protocolos de extracción ...… 32

Tabla 8 Resultados del diseño factorial …………………………………………………… 35

Tabla 9 Análisis de varianza …………………………………………………………….… 37

Tabla 10 Valores Q para eliminar datos …………………………………………………… 54

18

OBJETIVOS

Objetivo general

Cuantificar y extraer pectina a partir de desechos de cáscara de fruta con el fin de

proponer un protocolo de extracción con el mayor porcentaje de recuperación de pectina y

rendimiento de proceso.

Objetivos específicos

1. Determinar el contenido de pectina de los cinco diferentes residuos de cáscara de fruta

que maneja Fruandes.

2. Determinar el protocolo de extracción con mayor porcentaje de recuperación de

pectina y rendimiento de proceso.

3. Establecer la identidad del ácido con mayor porcentaje de recuperación de pectina y


4. Especificar las condiciones de operación para el protocolo de extracción definido que

brinde mayor porcentaje de recuperación de pectina y rendimiento de proceso.

19

INTRODUCCIÓN

Fruandes es una empresa colombiana dedicada principalmente a la producción y

exportación de fruta deshidratada que, para 2017, corresponde a mango, banano, piña,

pitahaya y uchuva. A raíz de eso, actualmente la empresa genera poco más de 245 toneladas

de desechos agroindustriales, esto implica una pérdida monetaria para la compañía pues sus

desechos representan desde el 10% hasta el 56% de su materia prima. Los desechos

corresponden a todo aquello que no sea la pulpa de la fruta. Esto quiere decir que la cáscara,

residuos de pulpa, semillas y demás restantes son desechados. (Fruandes, 2017)

En general, la problemática sobre la pérdida monetaria en los desechos industriales,

así como el tratamiento de los mismos es una situación que se extiende a toda la industria.

Por ello, se desea abordar el caso de Fruandes mediante la línea de aprovechamiento de

residuos correspondiente a la obtención de productos de valor agregado a partir de la

extracción de biomoléculas, debido a la identidad de los desechos, una de estas es la pectina.

Para 2010 Colombia importo más de 463 millones de kilogramos de pectina para usos

industriales, lo que le generó una inversión aproximada de 2.335 millones de dólares

(Acevedo Berger & Ramírez Diaz, 2011), por lo cual, es adecuado evaluar la producción de

pectina a nivel nacional con el fin de suplir la demanda interna.

La pectina es un polisacárido compuesto principalmente por polímeros lineales de

ácido galacturónico unidos por el enlace 1-4 en los cuales el grupo carboxilo se encuentra

metil esterificado (Barazarte, García, Garrido, Pérez, & Terán, 2010); (Mojsov, 2016);

(Chan, Choo, Yong, & Loh, 2017). Se encuentra en la pared celular primaria y la laminilla

media de frutos y vegetales (Chan, Choo, Yong, & Loh, 2017) donde cumple con la función

de cemento intercelular (Chasquibol Silva, Arroyo Benites, & Morales Gomero, 2008), lo

cual se puede apreciar en la Figura 1.

20

Figura 1 Pectina en la célula (Chan, Choo, Yong, & Loh, 2017)

Debido a sus propiedades gelificantes y de absorción, tiene amplios usos en la

industria de alimentos, cosmética y farmacéutica (Chasquibol Silva, Arroyo Benites, &

Morales Gomero, 2008) donde se emplea como emulsificante, agente gelificante,

estabilizante y espesante (Chan, Choo, Yong, & Loh, 2017). Esto se debe a que la pectina se

clasifica como un hidrocoloide capaz de formar redes que retienen el agua y así, generar geles

(Chan, Choo, Yong, & Loh, 2017).

La pectina se clasifica principalmente en dos grupos según el grado de esterificación,

donde la pectina de alto metoxilo (HM) tiene un grado mayor al 50% mientras aquella de

bajo metoxilo (LM) tiene un grado menor al 50% (Acevedo Berger & Ramírez Diaz, 2011);

(Araque Arango & Moscoso Mendez, 2013). El grado de esterificación (DM) es una

propiedad de la pectina y se define como el porcentaje de grupos carboxil urónicos que se

esterifican con metanol, valor que determina la capacidad de la pectina para formar geles

(Acevedo Berger & Ramírez Diaz, 2011).

Adicional al DM, la pectina comercial de buena calidad está definida por otras

propiedades como el grado de gelificación, solubilidad en agua y pureza, donde lo primero

se define como los gramos de azúcares necesarios para que un gramo de pectina forme un

gel de firmeza estándar y se expresan como °SAG. La pectina comercial de alta calidad tiene

valores entre 130 a 150 °SAG, es soluble en agua casi por completo y tiene una pureza por

encima del 74% según la National Formulary. Por último, propiedades como la viscosidad,

acidez, peso molecular y grado de amidación también son importantes en la clasificación de

la pectina. (Acevedo Berger & Ramírez Diaz, 2011)

21

Figura 2 Estructura de la pectina (Chasquibol Silva, Arroyo Benites, & Morales Gomero, 2008)

Con el fin de proponer un protocolo de extracción de pectina adecuado, se hace

necesario determinar su contenido en primera instancia. Con la Figura 2 es evidente que una

alternativa para la cuantificación de pectina es definiendo la cantidad de ácido galacturónico

de las muestras, esto se realiza a partir del método propuesto por McCready y McComb,

quienes proponen un tratamiento químico y enzimático junto con un método

espectrofotométrico de cuantificación. El uso de pectinasa como agente enzimático funciona

de manera tal que ataca la integridad del enlace glucosídico (1-4) rompiendo el polímero en

sus unidades, en este caso, los monosacáridos (Mojsov, 2016). Esto con el fin de generar

muestras con unidades de AGA disuelto en fase líquida a la que se le aplica un protocolo

colorimétrico.

Por otro lado, el proceso de extracción y recuperación de pectina convencional cuenta

con las siguientes operaciones características, en primer lugar, se realiza un tratamiento a la

cáscara que consta de secado y trituración, no necesariamente en ese orden, con el fin de ser

guardada para emplearse cuando se requiera. Se prefiere almacenar en frío con el fin de

inhibir el crecimiento microbiano asociado al contenido de agua que puede aún retener la

muestra (Azad, Ali, Akter, Rahman, & Ahmed, 2014), microorganismos como Aspergillus

eventualmente generan enzimas pectinasas cuya función es degradar la pectina (Mojsov,

2016).

22

El procesamiento de la muestra empieza con la fase de extracción en el cual variables

como el tipo de ácido, el pH de la concentración, el tiempo y temperatura influyen en la

cantidad recuperada de pectina (Rehman, Salariya, Habib, & Shah, 2004). El compuesto de

interés se encuentra disuelto en la fase líquida, por lo que pasa por un proceso de filtración

para eliminar los restos sólidos de materia orgánica. Al filtrado se le adiciona un agente

precipitante de pectina, el cual corresponde a etanol debido a que mostro mejores cantidades

recuperadas (Rehman, Salariya, Habib, & Shah, 2004), una vez la pectina este

completamente precipitada, se recupera mediante filtración y secado de la muestra. Esto se

puede observar en la Figura 3.

Figura 3 Diagrama de bloques del proceso de extracción y recuperación de pectina

23

CAPÍTULO 1. CUANTIFICACIÓN DE PECTINA


Determinar el contenido de pectina de los cinco diferentes residuos de cáscara de fruta

que maneja Fruandes.

Metodología

Para la cuantificación de pectina, se utilizará un método colorimétrico de

determinación de ácido galacturónico y luego se relaciona el contenido de AGA por unidad

de pectina. En primera instancia, se hará un barrido espectral para establecer la longitud de

onda a la cual medir la absorbancia de las muestras. Seguido, se construirá la curva de

calibración de ácido galacturónico y se cuantificará este en cada muestra de fruta utilizando

la curva. Por último, se realizará un protocolo de sólidos totales con el fin de calcular los

resultados en base seca y se establecerá la relación de contenido de ácido galacturónico por

pectina.

2.1 Barrido espectral

Se realizarán dos muestras: 2 mL del blanco de la solución, en este caso

correspondiente a agua destilada, y 2 mL de una solución patrón de 80 μg/mL de ácido

galacturónico monohidratado. A ambas muestras se les aplicará un procedimiento de

reacción colorimétrica (Anexo 1.3) donde no se mide la absorbancia a una longitud

determinada, sino que se realiza un barrido espectral donde se reporta la absorbancia a

diferentes valores de longitud de onda entre 400 nm y 800 nm que corresponde al rango

ampliado del espectro visible.

2.2 Curva de calibración

Con el fin de tener una relación absorbancia – concentración de ácido galacturónico,

se realizará una curva de calibración con 6 muestras correspondientes a: 2 mL de un blanco,

2 mL de las siguientes soluciones patrón de ácido galacturónico a 5, 20, 40, 60 y 80 μg/mL.

A dichas muestras se les aplicará un procedimiento de reacción colorimétrica (Anexo 1.3)

para determinar su absorbancia. (Barazarte, García, Garrido, Pérez, & Terán, 2010)

24

2.3 Sólidos totales de muestra seca

Con el fin de determinar el porcentaje de contenido de sólidos totales presente en las

muestras molidas de cáscara de fruta, se utilizará el protocolo de sólidos totales (Anexo 2)

para cada una de las cinco muestras que se obtendrán a partir del tratamiento de cáscara

(Anexo 1.1).

2.4 Cuantificación de ácido galacturónico de cada fruta

Para determinar el contenido de ácido galacturónico se realizará el protocolo de

tratamiento de cáscara (Anexo 1.1), de extracción de ácido galacturónico (Anexo 1.2) y de

reacción colorimétrica (Anexo 1.3) para cada una de las frutas.

2.5 Cuantificación de ácido galacturónico por unidad de pectina

Se realizará un protocolo de extracción de ácido galacturónico (Anexo 1.2) y de

reacción colorimétrica (Anexo 1.3) utilizando 0.1 g de pectina con el fin de establecer una

relación entre la pectina y el AGA.

Resultados

3.1 Barrido espectral

Se determinó que la longitud de onda para medir las muestras es 530 nm. En este

valor se encontró la máxima absorbancia para ambas réplicas. A continuación, se presenta la

tendencia obtenida en ambos resultados experimentales en la Figura 4.

25

Figura 4 Barrido espectral de una solución a 80 𝜇g/mL de AGA

3.2 Curva de calibración

Se realizaron 3 réplicas experimentales para la determinación de la curva de

calibración, a los datos encontrados se les aplico el test Q (Anexo 4) con el fin de eliminar

los valores ‘outliers’ (Harris, 2007) . A continuación, se presenta la absorbancia promedio

encontrada junto con su respectiva desviación estándar en la Tabla 1, así mismo el ajuste

lineal de los datos en la Figura 5.

Tabla 1 Absorbancia promedio para cada solución de la curva de calibración

Concentración de AGA [𝛍g/mL] 5 20 40 60 80

Absorbancia promedio 0.0433 0.1379 0.2993 0.4638 0.6489

Desviación estándar 0.0055 0.0058 0.0071 0.0150 0.0059

26

Figura 5 Curva de calibración del ácido galacturónico a 530nm

3.3 Porcentaje de sólidos totales de muestra seca

Se realizaron 2 réplicas experimentales con el fin de determinar el contenido de

sólidos totales del molido de cáscara de cada fruta. A continuación, se presenta el porcentaje

de dicha medición junto con su respectiva desviación estándar y porcentaje de diferencia

relativa entre muestras en la Tabla 2.

Tabla 2 Contenido de sólidos totales de muestra seca en cada cáscara de fruta

Mango Banano Piña Pitahaya Uchuva

Contenido de sólidos totales [%w/w] 88.05 85.77 83.22 85.07 88.09

Desviación estándar [%w/w] 0.11 0.12 0.31 0.16 1.63

Diferencia relativa entre muestras [%w/w] 0.25 0.29 0.75 0.38 3.71

27

3.4 Cuantificación de ácido galacturónico de cada fruta

Se realizaron 3 réplicas experimentales para la determinación del contenido de AGA

en cada una de las frutas, a los datos encontrados se les aplico el test Q (Anexo 4) con el fin

de eliminar los valores ‘outliers’ (Harris, 2007). A continuación, se presenta el porcentaje de

contenido de ácido galacturónico en base seca de cada fruta con su respectiva desviación

estándar en la Tabla 3.

Tabla 3 Contenido de AGA en cada cáscara de fruta


Contenido de AGA [%w/w] 11.14 7.65 4.94 12.86 3.05


3.5. Cuantificación de ácido galacturónico por unidad de pectina

Se realizaron 2 réplicas experimentales para determinar el contenido de AGA por

unidad másica de pectina. Se determinó que, mediante el método colorimétrico propuesto por

McCready y McComb, la pectina tiene 71.14 ± 4.78 % de ácido galacturónico. Con este

valor es posible establecer el contenido de pectina de cada fruta a partir de su contenido de

AGA que se presenta en la Tabla 4.

Tabla 4 Contenido de pectina en cada cáscara de fruta


Contenido de pectina [%w/w] 15.66 10.75 6.95 18.08 4.28


Análisis de resultados

En resumen, se puede afirmar que la longitud de onda encontrada para la lectura de

absorbancia del ácido galacturónico a diferentes concentraciones es adecuada. En primer

lugar, porque ambas réplicas coinciden que a 530 nm la lectura de absorbancia es máxima,

28

en segundo lugar, porque dicho valor es aproximadamente igual al reportado de 520 nm por

el artículo de referencia para el trabajo (McCready & McComb, 1952).

Para la curva de calibración se encontró que el ajuste lineal que representaba los datos

en un 99.67% es Y = 0.0081X − 0.0139. Se puede comparar esta información con una

regresión previa realizada para ácido galacturónico monohidratado utilizando carbazol donde

en un 99.97% los datos se ajustan a Y = 0.00846X − 0.0185

(Barazarte, García, Garrido, Pérez, & Terán, 2010). Como se observa, tanto la pendiente

como el punto de corte se encuentran dentro del mismo orden de magnitud, con el fin de

visualizar mejor la diferencia de comportamientos entre ambas tendencias, se graficaron

ambas en la Figura 6.

Figura 6 Comparación entre curvas de calibración

Como se puede observar, utilizando cualquier curva de calibración se van a predecir

concentraciones aproximadamente iguales de AGA para valores de absorbancia entre 0.04 y

0.14, por otro lado, entre más lejos se esté de este rango la predicción va a variar

significativamente. Adicionalmente, las absorbancias de la cáscara de fruta se encuentran

29

entre valores de absorbancia de 0.0030 y 0.0600, por lo cual, la diferencia entre las

predicciones no va a ser significativa, por lo que se puede decir que el uso de la regresión

encontrada para predecir concentraciones de AGA es apropiado.

Con respecto al porcentaje de sólidos totales de muestra seca, se puede observar que

las magnitudes se encuentran dentro de un rango del 83.22% al 88.09%, esto implica que el

secado mediante un equipo de liofilización no es tan efectivo. Además, la presencia de agua

en las muestras promueve el crecimiento de microorganismos (Azad, Ali, Akter, Rahman, &

Ahmed, 2014), tales como Aspergillus, un hongo filamentoso presente en tejido vegetal que

produce varios tipos de enzimas como lipasas, proteasas, celulasas y pectinasas, estas últimas

tienen como función degradar la pectina (Mojsov, 2016).

Adicionalmente, empleando la curva de calibración hallada se determinó el contenido

de ácido galacturónico de cada fruta y se encontró que el orden por contenido de mayor a

menor es pitahaya, mango, banano, piña y uchuva, lo cual es análogo para el contenido de

pectina, que corresponde a 18.08%, 15.66%, 10.75%, 6.95% y 4.28% respectivamente.

Los valores reportados del contenido de pectina son 5.60-26.38%, 9.20-31.80% y

2.40-21.70% para pitahaya, mango y banano en ese orden (Chan, Choo, Yong, & Loh, 2017),

adicionalmente, para la piña se encontraron valores de rendimiento de proceso entre 0.1-2.4%

dependiendo del medio de extracción (Ukiwe & Alinnor, 2011), mientras que para la uchuva

no se encontraron datos reportados del contenido de pectina. Como se puede observar, los

valores determinados para pitahaya, mango y banano se encuentran dentro del rango

establecido por otras referencias, lo cual indica que son valores apropiados que pueden variar

dependiendo del estado de maduración y la especie de la fruta (Azad, Ali, Akter, Rahman, &

Ahmed, 2014), por otro lado, la piña tiene un valor por encima al rango referenciado debido

a que el reportado es un rendimiento mas no una cuantificación por lo cual es acertado que

sea mayor y este sujeto a las mismas dependencias de las otras frutas, por último, es el primer

dato de contenido de pectina reportado para la uchuva, por lo cual este se verifica a medida

que se realicen más investigaciones.

30

CAPÍTULO 2. EXTRACCIÓN DE PECTINA


Determinar el protocolo de extracción con mayor porcentaje de recuperación de

pectina y rendimiento de proceso.

Establecer la identidad del ácido con mayor porcentaje de recuperación de pectina y


Metodología

Según los resultados obtenidos en el Capítulo 1, se determinó que la cáscara de fruta

a emplear en esta sección es la pitahaya, debido a que, al tener mayor contenido de pectina,

los pesos recuperados serán más representativos pues el número de cifras significativas

utilizadas corresponde a 3.

Por otro lado, con el fin de determinar cuál de los tres protocolos empleados produce

mayor porcentaje de recuperación de pectina y rendimiento del proceso (variables objetivo),

se realizará una comparación entre protocolos. Adicionalmente, se determinará la influencia

del uso de ácidos minerales y orgánicos en el valor de mencionadas variables objetivo. Por

último, se hará un protocolo de sólidos totales (Anexo 2) para cada una de las muestras secas

de los tres protocolos con el fin de reportar los resultados en base seca.

2.1 Comparación entre protocolos de extracción

Se realizarán los protocolos de extracción I (Anexo 3.1), II (Anexo 3.2) y III (Anexo

3.3) utilizando ácido sulfúrico a pH 2 (0.01 M) en todos ellos, con el fin de que, al estandariza

estas variables significativamente influyentes (pH y tipo de ácido), se pueda apreciar la

diferencia entre las operaciones unitarias de los mismos en el porcentaje de recuperación de

pectina y rendimiento del proceso.

2.2 Comparación entre ácidos orgánicos y minerales

Se realizarán los protocolos de extracción I (Anexo 3.1) y III (Anexo 3.3) utilizando

ácido cítrico y ácido acético glacial respectivamente, a pH 2 (0.01 M) en ambos, con el fin

de visualizar la influencia del ácido en el porcentaje de recuperación de pectina y rendimiento

31

del proceso, pues la única diferencia respecto a la experimentación 2.1 es el tipo de ácido

empleado.

Resultados

3.1 Comparación entre protocolos de extracción

Se realizaron 3 réplicas experimentales en cada protocolo para determinar el

porcentaje de recuperación de pectina y rendimiento de proceso en base seca, junto con sus

respectivas desviaciones estándar, los resultados se reportan en la Tabla 5.

Tabla 5 Comparación entre protocolos de extracción

Protocolo Tipo de

ácido

Rendimiento del

proceso [%w/w]

Desviación

estándar [%w/w]

Recuperación de

pectina [%w/w]

Desviación

estándar [%w/w]

I

Ác.

Sulfúrico

5.53 0.36 30.58 1.97

II 2.65 0.72 14.68 4.00

III 5.41 0.52 29.93 2.89

3.2 Comparación entre ácidos orgánicos y minerales

Se realizaron 3 réplicas experimentales en cada protocolo para determinar el

porcentaje de recuperación de pectina y rendimiento de proceso en base seca, junto con sus

respectivas desviaciones estándar, los resultados se reportan en la Tabla 6.

Tabla 6 Comparación entre ácidos orgánicos y minerales en los protocolos de extracción

Protocolo Tipo de ácido Rendimiento del

proceso [%w/w]

Desviación

estándar [%w/w]

Recuperación de

pectina [%w/w]

Desviación

estándar [%w/w]

I Ác. Cítrico 3.73 0.27 20.65 1.49

III Ác. Acético Glacial 2.83 0.44 15.64 2.46

32

3.3 Porcentaje de sólidos totales de muestra seca

Se realizaron 2 réplicas experimentales para cada muestra de cada protocolo con el

fin de determinar el porcentaje de sólidos totales en base seca, junto con sus respectivas

desviaciones estándar y diferencia relativa entre muestras, los resultados se reportan en la

Tabla 7.

Tabla 7 Contenido de sólidos totales de muestra seca de los protocolos de extracción

Protocolo I II III

Contenido de sólidos totales [%w/w] 92.84 22.60 95.49

Desviación estándar [%w/w] 0.02 1.94 0.06

Diferencia relativa entre muestras [% w/w] 0.05 17.16 0.13


En resumen, se puede observar que, a pesar de estandarizar variables como el pH y

tipo de ácido, junto con otras propias del proceso como el volumen de etanol agregado (1:2

v/v), volumen y concentración de lavado, y condiciones de secado de pectina, los protocolos

presentan diferentes recuperaciones y rendimientos entre sí. Esto se puede deber a diferencias

características de cada protocolo como el tamaño de partícula del molido, el mecanismo de

calentamiento, la presencia de agitación y el tiempo de reposo en la precipitación de pectina.

De estas variables de cada proceso, se puede decir que las más significativas son el tamaño

de partícula (Rehman, Salariya, Habib, & Shah, 2004) y el tiempo de precipitación, esto se

respalda al observar que no existe una diferencia significativa entre el protocolo I y III, los

cuales mantienen constante dicho tiempo y tienen los diámetros de molido pequeños,

asimismo, varían en el mecanismo de calentamiento y agitación, adicionalmente, el protocolo

I usa un medio líquido con agitación (baño shaker) mientras el III usa aire sin agitación

(horno), factores que no parecen afectar las variables objetivo.

De igual manera, el protocolo que es diferente al I y III resulta ser el II que presenta

un tiempo de precipitación sustancialmente menor, de 30 minutos en lugar de 24 horas,

33

adicionalmente, debido a que la trituración es manual, el diámetro es sustancialmente mayor

a los otros que presentan asistencia mecánica, lo cual refuerza la hipótesis mencionada.

Debido a esto, se escogió como mejor protocolo en función de las variables objetivo

el número III, a pesar de que I y III son aproximadamente iguales en dichos términos, el III

presenta ventajas respecto al I, por ejemplo, un tiempo de ejecución total del proceso de 3

días en lugar de 4, adicionalmente, el tiempo de secado en horno para el tratamiento de

cáscara son 24 horas en lugar de 54 horas, asimismo el uso de este equipo tiene un consumo

energético asociado que incrementa conforme el tiempo de empleo del mismo. Por otro lado,

el protocolo I requiere más variedad de equipos como un baño shaker, centrifugadora y

horno, mientras el III solo requiere de un horno, por esta razón y las demás, el número III

resulta ser más versátil, económico y rápido.

Respecto al uso de ácidos orgánicos y minerales, se puede decir que comparando los

resultados para el protocolo I entre el ácido sulfúrico y ácido cítrico monohidratado, Tabla 5

y 6 respectivamente, el inorgánico presenta mayor rendimiento y recuperación que el

orgánico, situación similar que ocurre al evaluar el protocolo III con ácido sulfúrico y ácido

acético glacial. Por lo cual, se puede resumir que el valor de las variables objetivo es mayor

con el uso de ácidos minerales. Una relación adicional que se puede concluir, debido a que

el rendimiento y recuperación entre el protocolo I y III es aproximadamente igual, la

influencia del ácido se comportara de la misma manera, por lo que es posible compararlos

entre sí, y definir que el ácido cítrico presenta mejores valores para las variables objetivo que

el ácido acético glacial.

Por último, el contenido de sólidos totales del protocolo I y III es 92.84% y 95.49%

respectivamente, valores adecuados para la conservación y análisis de la muestra, sin

embargo, el contenido del protocolo II corresponde a 22.60%, este es un valor muy bajo que

puede comprometer la maduración de la muestra y no generar recuperaciones representativas

debido a que la biomasa de donde se extrae la pectina es pequeña respecto a la masa total

utilizada.

34

CAPÍTULO 3. CONDICIONES DE OPERACIÓN


Especificar las condiciones de operación para el protocolo de extracción definido que

brinde mayor porcentaje de recuperación de pectina y rendimiento de proceso.

Metodología

Según los resultados obtenidos en el Capítulo 2, se determinó que el mejor protocolo

de extracción respecto a los evaluados es el proceso III (Anexo 3.3), asimismo, se estipulo

que el uso de ácidos minerales, en específico el ácido sulfúrico, generan porcentajes de

recuperación de pectina y rendimiento del proceso significativamente mayores, por lo cual,

se utilizará dicho protocolo empleando ácido sulfúrico en el siguiente diseño factorial para

determinar las mejores condiciones de operación para el proceso de extracción de pectina.

Para ello, se fijaron como factores importantes en el proceso de extracción el pH, la

temperatura y el tiempo. Adicionalmente, se estipulan dos niveles para cada factor,

correspondientes a 1.5 y 2.5 para el pH, 70°C y 90°C para la temperatura, y 60 y 120 minutos

para el tiempo. Por último, se utilizará como referencia el valor del porcentaje de sólidos

totales del protocolo III obtenido en el Capítulo 2 – Tabla 7, con el fin de reportar los

resultados en base seca.

Resultados

Se realizaron 3 réplicas experimentales de cada punto del diseño factorial para

determinar el porcentaje de recuperación de pectina y rendimiento de proceso en base seca,

junto con sus respectivas desviaciones estándar, a los datos encontrados se les aplico el test

Q (Anexo 4) con el fin de eliminar los valores ‘outliers’ (Harris, 2007). Los resultados se

reportan en la Tabla 8.

35

Tabla 8 Resultados del diseño factorial

pH 1.5 2.5

Tiempo [min] 60 120 60 120

Temperatura [°C] 70 90 70 90 70 90 70 90

ID A B C D E F G H

Rendimiento del proceso [%] 4.89 6.04 6.32 11.76 3.18 3.46 2.76 4.05

Desviación estándar [%] 0.22 0.22 0.05 0.18 0.13 0.09 0.49 0.30

Recuperación de pectina [%] 27.03 33.40 34.95 65.07 17.57 19.12 15.25 22.40

Desviación estándar [%] 1.19 1.19 0.27 0.98 0.72 0.47 2.69 1.66


Con ayuda de Minitab 18, los resultados del diseño factorial fueron analizados y se

encontró la siguiente información. En primer lugar, se presentan las gráficas de residuos de

la recuperación de pectina (Figura 7) con el fin de constatar los supuestos requeridos para

que los análisis de resultados del diseño factorial sean adecuados.

Figura 7 Gráficas de residuos para la recuperación de pectina

36

Los supuestos del modelo se cumplen debido a que, en la gráfica de probabilidad normal, los

valores se ajustan a la recta normal por lo que se podría decir que son normales,

adicionalmente el histograma tiene la forma de una campana Gaussiana confirmando este

supuesto de normalidad. (Montgomery, 2004)

Por otro lado, la gráfica de valor ajustado no presenta un patrón por lo que se podría decir

que se cumple la homocedasticidad, adicionalmente, se aplicó una prueba de Bartlett a los

datos para constatar la afirmación (Figura 8), la cual mostró como resultado un valor p mayor

a la significancia de 0.05, esto quiere decir que las varianzas son iguales y sí cumple este

supuesto. Asimismo, la gráfica de orden de observación tampoco muestra una tendencia

afirmando que existe independencia entre los datos. (Montgomery, 2004)

Figura 8 Prueba de Bartlett, igualdad de varianzas

Confirmados los supuestos del modelo, se procede a analizar los resultados que corresponden

a los siguientes, empezando por la Tabla 9.

pH Tiempo [min] Temperatura [°C]

2,5

1,5

120

60

120

60

90

70

90

70

90

70

90

70

6050403020100

Valor p 0,192

Prueba de Bartlett

Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para Desv.Est.

ualdad de varianzas: Recuperación de pectina [%] vs. pH. Tiempo [min]. Tem

37

Tabla 9 Análisis de varianza

Fuente GL SC MC Valor F Valor p

Modelo 7 5459.10 779.87 284.52 0.000

Lineal 3 4163.40 1387.80 506.31 0.000

pH 1 2781.23 2781.23 1014.67 0.000

Tiempo 1 616.55 616.55 224.93 0.000

Temperatura 1 765.61 765.61 279.32 0.000

Interacciones de 2 términos 3 1172.18 390.73 142.55 0.000

pH∙Tiempo 1 559.23 559.23 204.02 0.000

pH∙Temperatura 1 289.95 289.95 105.78 0.000

Tiempo ∙Temperatura 1 323.00 323.00 117.84 0.000

Interacciones de 3 términos 1 123.52 123.52 45.07 0.000

pH∙Tiempo ∙Temperatura 1 123.52 123.52 45.07 0.000

Error 16 43.86 2.74

Total 23 5502.96

38

De la Tabla 9 se puede observar que el valor p es menor a la significancia de 0.05, por lo

cual, se afirma que tanto los factores como las interacciones entre los mismos tienen un efecto

significativamente diferente (Montgomery, 2004) sobre el porcentaje de recuperación de

pectina, esto se podrá apreciar también en las Figuras 9 y 10.

Figura 9 A. (Izquierda) Gráfica de efectos normales estandarizados absolutos B. (Derecha) Gráfica de efectos normales

estandarizados

Se generó la gráfica de efectos normales estandarizados absolutos en la Figura 9, se obtuvo

que tanto los factores como las interacciones tienen un efecto significativo sobre la

recuperación de pectina, adicionalmente, se puede observar en la gráfica de efectos normales

estandarizados que la temperatura y el tiempo tienen una influencia positiva, mientras que

las interacciones con el pH y este mismo presentan un efecto negativo, más adelante, la razón

de este comportamiento se explicará con los resultados obtenidos en las gráficas de efectos

principales e interacciones.

Figura 10 Diagrama de Pareto

39

Adicionalmente, se obtuvo la gráfica de Pareto donde aquellos factores o interacciones

mayores a 2.12 presentan un efecto significativo en la variable objetivo, además, este

diagrama presenta un orden descendente de importancia de las variables, donde se puede

afirmar que la fijación del pH es la más significativa en la recuperación de pectina, mientras

que la combinación pH, tiempo y temperatura es la menos relevante, sin embargo, todas

tienen significancia. (Montgomery, 2004)

Figura 11 Gráfica de efectos principales

Por otro lado, la gráfica de efectos principales presenta la influencia de cada factor sobre la

variable objetivo de manera individual. Se observa que para valores altos de pH (nivel

negativo) la recuperación es mayor, de manera similar, para tiempos y temperaturas altas

(nivel positivo) esta variable incrementa.

Adicionalmente, un pH alto implica una magnitud menor respecto a un pH bajo, lo cual está

directamente relacionado y explica el hecho de que el pH alto sea el nivel negativo en el

diseño experimental, por ende, este factor tenga un efecto negativo como se vio en la Figura

9.

40

Figura 12 Gráfica de interacciones

Por otro lado, se puede observar que no existe ninguna interacción nula (Montgomery, 2004),

esto implica que la combinación de dos factores tiene repercusiones en la variable objetivo.

Por ejemplo, para un pH de 1.5 junto con el tiempo o la temperatura en sus respectivos niveles

altos van a generar mejores recuperaciones que en sus niveles bajos, también, para un pH

bajo de 2.5 casi no existe diferencia entre usar altas o bajas temperaturas, análogo a lo que

ocurre con el tiempo al fijar el pH en su nivel alto. Adicionalmente, si se fija la temperatura

o el tiempo en cualquier nivel, el cambio de pH genera diferentes recuperaciones en todos

los casos. Respecto a la interacción tiempo-temperatura, se puede observar que para

temperaturas bajas de 70°C no existe diferencia entre exponer la muestra a tiempos altos o

bajos en la recuperación, también ocurre en sentido contrario, al fijar el tiempo en su nivel

bajo y variar la temperatura.

Debido a que los supuestos del modelo se cumplen, es posible generar una regresión para el

diseño factorial que relacione el efecto de los factores y sus interacciones con la recuperación

de pectina, esta ecuación está dada continuación.

Ec (1) RP = 148.7 − 45.9 ∙ pH − 2.586 ∙ t − 1.868 ∙ T + 0.888 ∙ pH ∙ t + 0.666 ∙ pH ∙ T

+ 0.04248 ∙ t ∙ T − 0.01512 ∙ pH ∙ t ∙ T R2 = 0.9920

41

Se puede decir que este modelo va a predecir la recuperación de pectina en función del pH,

tiempo y temperatura en un 99.20%, teniendo en cuenta que es más exacto para los puntos

axiales del cubo en el diseño factorial aplicado (Figura 14). Debido a que no se tienen datos

para los puntos centrales del cubo, no es posible conocer apropiadamente el comportamiento

en dichas zonas ni tener una superficie de respuesta completa.

A partir del efecto de los factores y sus interacciones en la variable de respuesta, es posible

construir gráficas de contorno que predigan el comportamiento de la recuperación de pectina

en las caras centrales del cubo como se muestra en la Figura 13.

Figura 13 Gráfica de contorno

Como se puede observar, un pH menor a 1.75 genera recuperaciones de pectina mayores al

50% para tiempos por encima de los 105 minutos trabajando a 80°C, ocurre similar al usar

temperaturas arriba de los 85°C operando en 90 minutos. Respecto a la relación tiempo-

temperatura, recuperaciones de más del 35% se encuentran en combinaciones superiores a

los 90 minutos y 80°C fijando el pH en 2.

pH 2

Tiempo [min] 90

Temperatura [°C] 80

Valores fijos

Tiempo [min]*pH

2,502,252,001,751,50

120

105

90

75

60

Temperatura [°C]*pH

2,502,252,001,751,50

90

85

80

75

70

Temperatura [°C]*Tiempo [min]

120105907560

90

85

80

75

70

>

–

–

–

–

–

–

< 20

20 25

25 30

30 35

35 40

40 45

45 50

50

[%]

de pectina

Recuperación

Gráficas de contorno de Recuperación de pectina [%]

42

Figura 14 Gráfica de cubo

Dentro de todas las condiciones evaluadas se determinó que la combinación pH – tiempo –

temperatura que produce una mayor recuperación de pectina fue 1.5 – 120 min – 90°C, con

un valor promedio de 65.07%. Esto se puede observar en la gráfica de cubo donde se presenta

el valor de variable objetivo en cada una de las corridas experimentales, y ubicada según el

nivel de sus factores. Se puede decir que los resultados son acordes a lo esperado (Rehman,

Salariya, Habib, & Shah, 2004), que corresponde a pH, temperaturas y tiempos de extracción

altos.

43

CONCLUSIONES

Se determinó que la longitud de onda a la cual medir concentraciones en μg por mL

de ácido galacturónico, utilizando la reacción colorimétrica con carbazol, es 530 nm.

Adicionalmente, se definió que la curva de calibración encontrada hace predicciones

aproximadamente iguales a lo reportado por las referencias.

Se encontró que el contenido de pectina de las cáscaras de mango, banano, piña,

pitahaya y uchuva son 15.66±0.10%, 10.75±1.33%, 6.95±0.83%, 18.08±1.11% y

4.28±0.64% respectivamente, donde se determinó que la pitahaya es la fruta con mayor

contenido de pectina en su cáscara respecto a las frutas evaluadas, mientras que la uchuva

tiene el menor. En ese orden de ideas, residuos de cáscara de mango, banano y pitahaya son

ideales para emplearse en la producción de pectina. Adicionalmente, este cálculo fue posible

gracias a la determinación del factor de conversión de contenido de AGA por unidad de

pectina correspondiente a 71.14 ± 4.78 %.

Se estableció que el mejor protocolo para la extracción de pectina según los evaluados

es el III (Anexo 3.3), tanto en temas de recuperación y rendimiento como en aspectos

económicos, de versatilidad y tiempo. Adicionalmente, el uso de ácido sulfúrico como medio

de extracción tuvo mejores resultados en términos de las variables objetivo que los obtenidos

con ácidos orgánicos.

Por último, se determinó que las mejores condiciones para operar la etapa de

extracción en el protocolo III, empleando ácido sulfúrico, son a pH de 1.5 durante 120

minutos a 90°C, estas condiciones generan porcentajes de recuperación de pectina y

rendimiento de proceso de 65.07±0.98% y 11.76±0.18% respectivamente, valores que

fueron los máximos encontrados en todo el diseño experimental.

44

TRABAJO FUTURO

Sería interesante establecer un perfil de degradación de pectina debido al estado de

maduración de la fruta, esto con el fin de establecer un momento apropiado para la extracción

de dicha biomolécula. Asimismo, estandarizar variables que se contemplaron hasta el análisis

de resultados como lo son el diámetro de partícula y el tiempo de precipitación de la pectina,

de estas también se podría obtener un perfil para establecer valores adecuados.

Adicionalmente, en el presente trabajo se evalúan tres protocolos de extracción de

pectina convencionales, podría evaluarse si empleando procesos no convencionales, como

las microondas, el ultrasonido, o la extracción con fluidos supercríticos (Adetunji, Adekunle,

Orsat, & Raghavan, 2017), la recuperación del producto de valor agregado aumenta o

disminuye. Asimismo, emplear otros medios de extracción no necesariamente ácidos, como

tricloruro de aluminio (Ukiwe & Alinnor, 2011) u oxalato de amonio (Ramli & Asmawati,

2011)

Por otro lado, debido a que la finalidad de producir pectina (aparte del

aprovechamiento de residuos agroindustriales) es generar un producto de valor agregado que

pueda ser vendido como materia prima para otras industrias o bien ser utilizado en Fruandes

como parte de su cadena de producción, se debe clasificar el producto obtenido mediante la

determinación de sus propiedades, tales como grado de gelificación, esterificación y

amidación, peso molecular, viscosidad, solubilidad en agua, acidez y pureza (Acevedo

Berger & Ramírez Diaz, 2011).

Finalmente, se podría realizar un diseño central compuesto, pues este incluye tanto

puntos centrales como axiales del cubo y así obtener una superficie de respuesta, esto con el

fin de poder predecir mejor el comportamiento de la recuperación de pectina en función de

los factores evaluados.

45

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Sluiter, A., Hames, B., Hyman, D., Payne, C., Ruiz, R., Scarlata, C., . . . Wolfe, J. (2008,

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Ukiwe, L., & Alinnor, J. (2011). Extraction of Pectin from Pineapple (Ananas comosus) Peel

using Inorganic/Organic Acids and Aluminum Chloride. Fresh Produce, 5(1), 80-83.

47

ANEXOS

1. Protocolos de cuantificación de ácido galacturónico

1.1 Tratamiento de cáscara

Se congelarán las cáscaras de mango, banano, piña, pitahaya y uchuva a -60 °C con

el fin de ingresarlas en un equipo de liofilización, donde permanecerán durante 24 horas.

Luego, cada una de las muestras iniciará un proceso de trituración mecánica hasta tener un

molido de 1 mm de diámetro de partícula, para finalizar, se almacenará cada muestra en

envases de vidrio Schott a temperatura ambiente. (Barazarte, García, Garrido, Pérez, &

Terán, 2010).

Figura 15 A. (Izquierda) Acondicionamiento para entrar al equipo de liofilización. B. (Derecha) Molido de cáscara seca

1.2 Extracción de ácido galacturónico

Se realizará el lavado de 1 g de muestra problema con etanol al 96%, recuperando el

sólido para posteriormente agregarle 200 mL de EDTA al 0.5%. Cada muestra se llevará a

un pH de 11.5 con hidróxido de sodio 1M mientras se mezcla manualmente. La solución se

mantendrá en reposo por 30 minutos y se llevará a un pH entre 5.0-5.5 con ácido acético

glacial 0.25M. Finalmente, se agregará 0.05g de pectinasa (Aspergillus niger; 1.0 U/mg)

(Barazarte, García, Garrido, Pérez, & Terán, 2010) y se agitará por 1 hora, al finalizar se

diluye la solución hasta 250 mL, y se filtrará recuperando el líquido. De la solución resultante

se toma una alícuota de 2 mL y se diluye hasta un volumen de 100 mL que se almacenará en

frío hasta su análisis. (McCready & McComb, 1952)

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Figura 16 A. (Izquierda) Molido de cáscara de fruta en solución de EDTA. B. (Derecha) Soluciones problema de AGA de

cada cáscara de fruta

1.3 Reacción colorimétrica

Se enfriarán 12 mL de ácido sulfúrico al 98% a una temperatura menor a 3°C para

agregar 2 mL de la solución a analizar mientras se mezcla manualmente y se vuelve a enfriar

a una temperatura menor a 5°C. Luego, se calentará durante 10 minutos en agua hirviendo y

se permite reposar a la muestra hasta temperatura ambiente, momento en el que se agregará

1 mL de carbazol al 0.15% mientras se mezcla manualmente, por último, se dejará reposar

por 25 minutos e inmediatamente se medirá la absorbancia de la muestra. (McCready &

McComb, 1952)

Figura 17 A. (Izquierda y central) Tratamiento térmico de reacción colorimétrica. B. (Derecha) Curva de calibración

después de la reacción colorimétrica

2. Protocolo de determinación del porcentaje sólidos totales en muestra seca

Se secará un crisol vacío durante 4 horas a 105°C, al finalizar, se dejará enfriar en un

desecador por 30 minutos para posteriormente pesarlo y agregarle entre 1 a 2 g de muestra

seca. Luego, se ingresará el conjunto a la mufla durante 24 horas a 105°C, al otro día, se

sacará el crisol del equipo y se dejará enfriar por 30 minutos en el desecador, seguido se

registrará el peso del conjunto. (Sluiter, y otros, 2008)

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Figura 18 A. (Izquierda) Secado de crisoles en mufla. B. (Derecha) Reposo de crisoles en desecador

3. Protocolos de extracción de pectina

3.1 Extracción de pectina I propuesta por S.Q. Liew, N.L. Chin y Y.A. Yusof (Liew,

Chin, & Yusof, 2014)

3.1.1 Tratamiento de cáscara

Se secarán las cáscaras de fruta a 55°C en un horno hasta que su peso sea constante,

y luego se triturarán las muestras utilizando un diámetro de partícula de 1 mm, por último,

se almacenarán en una bolsa de polietileno en el congelador.

Figura 19 A. (Izquierda) Secado de cáscara en horno. B. (Derecha) Molido de cáscara mecánico tamaño 1mm

3.1.2 Extracción de pectina

Se preparará una solución de ácido cítrico monohidratado con pH 2 (0.01M) de la

cual se agregan 25 mL en un frasco Schott junto con 1 g de molido. La mezcla permanecerá

durante 75 minutos en un baño a 70°C con agitación constante e igual a 180 rpm para luego

dejarla en reposo por 24 horas a temperatura ambiente.

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Figura 20 Extracción de pectina en frasco Schott

3.1.3 Precipitación de pectina

La mezcla en reposo se dividirá en dos Falcon de 15 mL para ser ingresada en una

centrifugadora durante 10 minutos a 6000 rpm, al finalizar, el sobrenadante se filtrará y

recuperará en frascos Schott donde se le adicionarán 50 mL de etanol al 96% (1:2 v/v

sobrenadante-etanol), esta solución se dejará reposar por 24 horas a temperatura ambiente

sin exposición a la luz.

Figura 21 A. (Izquierda) Solución de extracción en tubos Falcon. B. (Derecha) Precipitación de pectina sin exposición a la

luz

3.1.4 Recuperación de pectina

Se filtrará al vació la muestra y se realizará un lavado de la torta con 13.7 mL de

etanol al 70%, luego, el papel filtro utilizado se ingresará al horno a 65°C durante 12 horas,

al finalizar la recuperación de pectina y rendimiento del proceso serán calculados mediante

la diferencia de pesos del papel antes y después del procedimiento.

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Figura 22 A. (Izquierda) Pectina precipitada en Schott. B. (Derecha) Pectina recuperada en papel filtro

3.2 Extracción de pectina II propuesta por N. Berardini, M. Knödler, A. Schieber y R.

Carle (Berardini, Knödler, Schieber, & Carle, 2005)


Se secarán cáscara de fruta durante 270 minutos a 50°C en el horno, luego de este

tiempo, se triturarán la muestra de manera manual y se almacenarán en bolsas de polietileno

en el congelador.

Figura 23 A. (Izquierda) Cáscara secada por horno. B. (Derecha) Molido manual

3.2.2 Extracción de pectina

En un frasco Schott se adicionarán 1 g de molido junto con 30 mL de agua desionizada

para ser calentados hasta 90°C en una plancha de calentamiento con agitación permanente y

equivalente a 4 rpm. La muestra se dejará reposar por 1 hora y se agregará 1 mL de ácido

sulfúrico 1M para llevar la solución a pH 1.5, seguido se calentará en el horno a 90°C por

150 minutos, terminado el tiempo, se dejará enfriar por 1 hora para ser filtrado al vacío y

recuperar la fase líquida, esta será guardada en el refrigerador hasta su uso.

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Figura 24 A. (Izquierda) Extracción de pectina con plancha de calentamiento. B. (Derecha) Filtrado de solución de

extracción

3.2.3 Precipitación y recuperación de pectina

Se agregará 60 mL de etanol al líquido recuperado (1:2 v/v líquido-etanol) y se dejará

reposar por 30 minutos, terminado este tiempo, se filtrará al vacío la muestra y se realizará

un lavado de la torta con 13.7 mL de etanol al 70%. Luego, el papel filtro utilizado es

ingresado al horno a 65°C durante 12 horas, al finalizar la recuperación de pectina y

rendimiento del proceso serán calculados mediante la diferencia de pesos del papel antes y

después del procedimiento.

3.3. Extracción de pectina III propuesta por dos referencias: CP Kelco: A Huber

Company (CPKelco, 2011) y A.K.M. Azad, M.A. Ali, Mst. Sorifa Akter, Md. Jiaur

Rahman y, Maruf Ahmed (Azad, Ali, Akter, Rahman, & Ahmed, 2014)


Se triturará la cáscara de fruta en una licuadora en presencia de agua, la mezcla

resultante se filtrará con ayuda de un colador y se lavará con más agua, finalmente, las fibras

son colocadas en bandejas de aluminio esparciendo la materia en forma de lámina delgada

con grosor de 6 mm aproximadamente, y se ingresarán al horno por 24 horas a 60°C, luego

de este tiempo, la muestra se retirará de las bandejas para ser almacenada en bolsas de

polietileno en el congelador.

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Figura 25 A. (Izquierda) Triturado con licuadora. B. (Central y Derecha) Secado de cáscara triturada antes y después del

horno

3.3.2 Extracción y precipitación de pectina

Se preparará una solución de ácido acético glacial con pH 2 (0.01M), luego se tomará

una alícuota de 30 mL de esta muestra y se agregará en un frasco Schott junto con 1 g de

molido, el conjunto se calentará en un horno a 90°C durante 1 hora, al finalizar, se dejará

enfriar por otra hora y la muestra se filtrará al vacío recuperando el líquido, a este se le

agregarán 60 mL de etanol al 96% (1:2 v/v líquido-etanol) y se dejará reposar por 24 horas a

temperatura ambiente.

3.3.3 Recuperación de pectina

Se filtrará al vació la muestra y se realizará un lavado de la torta con 13.7 mL de

etanol al 70%, luego, el papel filtro utilizado es ingresado al horno a 65°C durante 12 horas,

al finalizar la recuperación de pectina y rendimiento del proceso serán calculados mediante

la diferencia de pesos del papel antes y después del procedimiento.

Figura 26 Filtrado y lavado de pectina en embudo

4. Test Q (Harris, 2007)

Si algunos datos parecen ser inconsistentes respecto a los demás de la muestra, se puede

aplicar un test Q el cual indica si incluirlo o no en los reportes. Para ello, hay que considerar

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una serie de datos de tamaño n, y unos valores dados por x1, x2 hasta xn, ordenados de menor

a mayor. Donde el valor Q calculado se define por:

Ec (2) Qcalculado =Desfase

Rango

Donde el rango es el delta entre el dato menor y el mayor (incluyendo el valor inconsistente),

mientras que el desfase es la diferencia entre el dato cuestionable y el siguiente más cercano,

ambos cálculos están definidos por:

Ec (3) Rango = xn − x1 y Ec (4) Desfase = xn − xn−1

Donde xn es el valor inconsistente. Se puede decir que el dato xn definitivamente es un

‘outlier’ o dato cuestionable si el Qcalculado>Qtabla y debe ser eliminado, por otro lado, si

esta desigualdad no se cumple el dato debe permanecer en la muestra.

Adicionalmente el valor Q de tablas se presenta en la Tabla 10 y está dado según el tamaño

de la muestra n. Este cálculo tiene un porcentaje de confianza del 90%.

Tabla 10 Valores Q para eliminar datos

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