CROMATOGRAFÍA Y COMPONENTES DE UN SISTEMA CROMATOGRÁFICO

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CROMATOGRAFÍA Y COMPONENTES DE UN SISTEMA CROMATOGRÁFICO. Catedrática: Dra. Silvia Echeverría, Ph.D., Depto. Fisicoquímica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, USAC. FUNDAMENTOS DE SEPARACIÓN. PRINCIPIOS GENERALES TÉCNICAS DE SEPARACIÓN TEORÍA MECANISMOS DE SEPARACIÓN. - PowerPoint PPT Presentation

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  • CROMATOGRAFA Y COMPONENTES DE UN SISTEMA CROMATOGRFICOCatedrtica: Dra. Silvia Echeverra, Ph.D., Depto. Fisicoqumica, Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia, USAC.

  • FUNDAMENTOS DE SEPARACINPRINCIPIOS GENERALES

    TCNICAS DE SEPARACIN

    TEORA MECANISMOS DE SEPARACIN

  • Mezclas y la necesidad de mtodos de separacinComplejidad de las muestras: Sangre, agua de ro, alimentos licuados, entre otros. Las muestras pueden contener mezclas de solutos, micelas, coloides y otras partculas en suspensin.

  • Tcnicas de separacin clsicas

    Separacin de componentes de inters Precipitacin DestilacinExtraccin Soxhlet

  • (Lquido-lquido)Extraccin con disolventes Extraccin con ultrasonido (USE) Extraccin en fase slida (SPE)

  • Extraccin con Lquidos presurizados (PLE) Extraccin con microondas

  • CROMATOGRAFANombre genrico asignado a muchas y distintas tcnicas de separacin. El nombre se debe al botnico ruso Mikhail Tsweet, quin acu el trmino a principios de la dcada de 1900, cuando logr separar varios pigmentos de plantas tales como xantofilas y clorofilas, al hacer pasar soluciones de esta mezcla por columnas de vidrio empacadas con carbonato de calcio finamente dividido. Cada pigmento recorri la columna con diferente velocidad y termin apareciendo cada componente como bandas de color. Chroma, palabra griega para color y Graphein que significa escribir.

  • CLASIFICACIN DE LOS MTODOS CROMATOGRFICOSBasada en la forma en que se ponen en contacto la FASE MVIL y la FASE ESTACIONARIA: En COLUMNA y en PLANO.

    Basada en el tipo de FASE MVIL: CG, CL, CFS.

  • Todas las formas de cromatografa se basan en la separacin de muestras de mezclas al entrar en contacto con dos fases: fase mvil y fase estacionaria. Una de las fases se mueve en relacin con la otra. Los componentes de la muestra se distribuyen entre las dos fases de acuerdo con sus solubilidades (o afinidades) relativas hacia ellas.Los componentes que no interaccionan con la fase estacionaria pasan rpidamente con la fase mvil. Al revs, los componentes que si interaccionan con la fase estacionaria, se mueven con mayor lentitud.

  • Los componentes de la muestra se mueven con velocidades determinadas por los tiempos relativos que pasan en las fases mvil y estacionaria. A su vez, dichos tiempos quedan determinados por los coeficientes de particin para cada componente entre las dos fases. De esta forma, se pueden separar distintos componentes debido a la velocidad relativa con que atraviesan la fase estacionaria.

  • Se puede realizar la cromatografa de elusin (con dos fases lquidas) en varias formas distintas. En muchos casos la fase estacionaria es un disolvente (por ejemplo agua) adsorbido y por consiguiente, inmovilizado en un soporte slido, como papel de celulosa, o slice en una columna empacada. La muestra que se va a resolver o separar en sus partes componentes se disuelve en un pequeo volumen de un segundo disolvente que tendr el papel de fase mvil. A continuacin se agrega la solucin de la muestra al soporte slido (que contiene la fase estacionaria inmovilizada).

  • A medida que la fase mvil atraviesa la fase estacionaria, los solutos se distribuyen entre las fases de acuerdo con sus coeficientes de particin respectivos. Se pueden agregar ms fases mviles para ELUIR los componentes de la fase estacionaria a distintas velocidades. (Puede imaginarse este tipo de cromatografa como una serie continua de extracciones lquido-lquido). Al final todos los componentes sern eluidos del sistema del que se trate y as la mezcla quedar separada.

  • TEORA DE LAS SEPARACIONES CROMATOGRFICASCoeficientes de particinTodas las separaciones cromatogrficas estn gobernadas por coeficientes de particin KD de solutos, entre las fases estacionaria y mvil. Para un soluto S se establece un equilibrio dinmico, esto es: S mvil S estacionario

  • El coeficiente de particin o de distribucin, KD, es igual a la relacin de la concentracin del soluto en las dos fases, tal como en la ecuacin:KD = [S]est/[S]mv (croma 01)Donde KD es el coeficiente de particin y [S]est y [S]mv son las concentraciones molares del soluto S en las fases estacionaria y mvil respectivamente.En el caso ideal, el valor de KD debe permanecer constante dentro de un amplio margen de concentraciones de soluto, para asegurar que la relacin misma de [S] est y [S] mv quede constante. Se puede suponer que la cromatografa efectuada bajo estas condiciones tiene comportamiento lineal, lo cul permite hacer determinaciones cuantitativas a partir del cromatograma.

  • En la prctica, bajo la mayor parte de condiciones normales de trabajo, se puede suponer que KD es constante, aunque a concentraciones muy altas la fase estacionaria puede volverse parcial o totalmente saturada.

  • TIEMPO DE RETENCIN

    En esta figura se observa un cromatograma caracterstico para una muestra que contiene un solo analito. El tiempo que transcurre luego de la inyeccin de la muestra hasta que se alcanza la concentracin mxima del analito en el detector, se denomina Tiempo de Retencin (tR) TIEMPO DE RETENCIN

  • El tiempo que tarda un analito en eluirse de una columna, tambin se llama tiempo de retencin o tiempo de residencia.Si un soluto en la fase mvil no interacciona en absoluto con la fase estacionaria, se mover con la misma velocidad que la fase mvil, dicho tiempo se puede representar como tmv y tambin se le denomina, en algunas ocasiones, tiempo muerto (tM).Si el analito pasa una parte del tiempo en la fM y otra parte en la fE, su velocidad de avance estar determinada por el coeficiente de particin KD y en consecuencia, distintos analitos sern eluidos de la columna en tiempos distintos que dependen de sus coeficientes de particin dentro de la columna.

  • La velocidad lineal promedio del movimiento, u, de la fase mvil, se puede expresar de acuerdo a la ecuacin: u = L/tmv (croma 02)En donde L es la longitud de la columna.En forma similar, para cualquier pico cromatogrfico, se puede expresar la velocidad lineal promedio de migracin del soluto por medio de la ecuacin: = L/tR (croma 03)El tiempo de retencin tR de un soluto se puede relacionar con su coeficiente de particin KD expresando la velocidad de migracin del soluto en funcin de una fraccin de la velocidad de la fase mvil, tal como en la ecuacin:

  • = u * (fraccin del tiempo en la fase mvil) (croma 04) Sin embargo, se deben tomar en cuenta los volmenes de las fases estacionaria y mvil, a los cules se les llama Vest y Vmv respectivamente.Basados en lo anterior, la velocidad de migracin del soluto para determinado pico cromatogrfico, se puede expresar as:

    = u * (1)/(1+KD Vest/Vmv) (croma 05)

  • EL FACTOR DE CAPACIDADEs un parmetro para comparar las velocidades relativas de migracin de soluto en las columnas. Dicho factor k se puede calcular con la ecuacin:

    k = (tR tmv)/tmv (croma 06) En el caso ideal, k debe estar dentro del intervalo de 1 a 5. Si k es mucho menor que 1, la elucin ser tan rpida que ser difcil determinar con exactitud los tiempos de retencin. Por lo contrario, si el factor capacidad es mucho mayor que 20, los tiempos de retencin sern excesivos.

  • Ejemplo para calcular k:Si el tiempo de retencin tR de un pico cromatogrfico es 65 y tmv es 30s, calcular k, el factor de capacidad.Mtodo: Calcular k de acuerdo con la ecuacin: k= (tR tmv)/tmv k = 65 30/30 = 1.17 s- EL FACTOR DE SELECTIVIDAD , para dos solutos A y B, se define como = KB/KA (croma 07) donde KB es el coeficiente de distribucin para la especie ms fuertemente retenida y KA es el factor de distribucin para la menos retenida.

  • De acuerdo con esta definicin, siempre ser mayor que la unidad.Sustituyendo una de las ecuaciones anteriores y la anloga para la especie B en la ltima ecuacin, se obtiene, despus de reordenar, una relacin entre el factor de selectividad para dos analitos y sus factores de retencin: = kB/kA (croma 08)Donde kB y kA son los factores de retencin de A y de B respectivamente. La sustitucin en la ecuacin croma 06, para las dos especies en la ecuacin croma 07 da otra ecuacin que permite la determinacin de a partir de un cromatograma experimental:

  • = [(tR)B tmv]/[(tR)A tmv] (croma 09) EFICIENCIA de las COLUMNAS CROMATOGRFICASSe puede describir la eficiencia de una columna ya sea en funcin de El nmero de platos tericos N, o de la Altura de plato H (HETP).Ambas acepciones se relacionan con la ecuacin de Van Deemeter, en honor del primer cientfico que describi tericamente una ecuacin para cuantificar la eficiencia de las columnas cromatogrficas.

  • Ecuacin de Van Deemeter: H = L/NH es HETP L es longitud de la columna

  • La terminologa de platos tericos y altura de plato para describir la eficiencia de las columnas usadas en cromatografa es un legado histrico de un modelo terico de cromatografa que ya se ha superado en gran parte. El uso del trmino Plato terico no debe concebirse como una representacin fsica de la columna ni de su operacin, ms bien es un parmetro arbitrario para describir su eficiencia. La eficiencia de la columna mejora a medida que: a) Aumenta el nmero de platos y b) Se reduce la altura de