Cromatografía 7° CONGRESO INTERNACIONAL DE QUÍMICOS FARMACOBIÓLOGOS Y XXII JORNADAS...

Cromatografía

7° CONGRESO INTERNACIONAL DE QUÍMICOS FARMACOBIÓLOGOS Y

XXII JORNADAS CIENTÍFICAS

Definición

• Técnica analítica de separación de componentes químicos de una mezcla a partir de las diferencias de velocidad a la que son transportados por una fase móvil a través de una fase fija o estacionaria.

Clasificación

• Columna– FE, contenida en

tubo estrecho

– FM, se fuerza el paso de la fase móvil a través de la fase estacionaria

• Plana– FE, contenida sobre

una superficie plana o en los poros de una papel

– FM, se desplaza por capilaridad o por efecto de la gravedad

Cromatografía en columna

• Se lleva a cabo en tubos de diámetro variado (1cm – 30cm), aunque se puede hacer columnas mucho más amplias o bien reducirlas hasta mm

• La columna es empaquetada con un sólido finamente dividido y éste debe ser inerte al tubo y a la muestra (no siempre)

• Se llevan a cabo equilibrios entre la cantidad de soluto contenido en FM y en FE.

FM-S FE-S

• La capacidad de cada soluto de permanecer en la FM es la que determina el orden de elución de los analitos.

Tipos de cromatografÍa en

columna• Se tienen varios tipos de cromatografía en

columna, los más representativos son:

– Partición– Afinidad– Intercambio iónico– Filtración en gel

CROMATOGRAMA

Where:tR = retention timetM = void timeWb = baseline width of the peak in time unitsWh = half-height width of the peak in time units

Wh

Wb

Inject

Tiempo de retención ajustado = t’r = tr - tm

Volumen de retención ajustado = V’r = Vr - Vm

Cromatograma

SEÑAL

ANALÍTICA

tM =tiempo muerto

tR = tiempo de retención

Tiempo

Volumen

La separación depende de dos factores

Peak width & peak positiondetermine separation of peaks

VELOCIDAD DE ELUCIÓN

FACTOR DE RETENCIÓN

k’ = (tR –tM)/tM

o k’ = (VR –

VM)/VM

Factores de separación

POR DEFINICIÓN

k’ Está directamente ligado a la interacción entre un soluto con la fase eStacionaria

k’ =

moles Astationary phase

moles Amobile phase

Si k‘ es <1.0, la separación es mala

Si k‘ es >30.0, la separación es lenta

When 2<k‘<10 la separación es buena

Wh

EFICIENCIA

ESTA RELACIONADA EXPERIMENTALMENTE AL ANCHO DE PICO- Picos delgados son mejores

TEORICAMENTE ESTA RELACIONADA AL PROCESO CINÉTICO DE TRANSPORTE DE LOS SOLUTOS EN LA COLUMNA

Wb = 4s

Wh = 2.354s

Dependent on the amount of time that a solute spends in the column (k’ or tR)

NOS SIRVE PARA ESTIMAR LA EFICIENCIA DE LA COLUMNA O SEPARACIÓN

N = (tR/s)2

O TOMANDO EN CUENTA QUE LOS PICOS SON GAUSSIANOS

N = 16 (tR/Wb)2

N = 5.54 (tR/Wh)2

• Entre más grande sea, se considerá que la columna es capaz de separar un par de compuestos cercanos

• Mejores separaciones en pequeñas diferencias de retención

• N es dependiente del largo de la columna

PLATOS TEÓRICOS

Compara la eficiencia de separación entre columnas de diferentes longitudes

H = L/N

where: L = Longitud de la columna N = Número de platos teóricos

H can be also used to relate various chromatographic parameters (e.g., flow rate, particle size, etc.) to the kinetic processes that give rise to peak broadening:

Why Do Bands Spread?a. Eddy diffusionb. Mobile phase mass transferc. Stagnant mobile phase mass transferd. Stationary phase mass transfere. Longitudinal diffusion

Altura equivalente de plato teóricoAEPT=H

a.) Eddy diffusion – a process that leads to peak (band) broadening due to the presence of multiple flow paths through a packed column.

As solute molecules travel through the column, some arrive at the end sooner then others simply due to the different path traveled around the support particles in the column that result in different travel distances.

Longer path arrives at end of column after (1).

A solute in the center of the channel moves more quickly than solute at the edges, it will tend to reach the end of the channel first leading to band-broadening

The degree of band-broadening due to eddy diffusion and mobile phase mass transfer depends mainly on:

1) the size of the packing material2) the diffusion rate of the solute

b.) Mobile phase mass transfer – a process of peak broadening caused by the presence of different flow profile within channels or between particles of the support in the column.

c.) Stagnant mobile phase mass transfer – band-broadening due to differences in the rate of diffusion of the solute molecules between the

mobile phase outside the pores of the support (flowing mobile phase) to the mobile phase within the pores of the support (stagnant mobile phase).

Since a solute does not travel down the column when it is in the stagnant mobile phase, it spends a longer time in the column than solute that remains in the flowing mobile phase.

The degree of band-broadening due to stagnant mobile phase mass transfer depends on:

1) the size, shape and pore structure of the packing material2) the diffusion and retention of the solute3) the flow-rate of the solute through the column

d.) Stationary phase mass transfer – band-broadening due to the movement of solute between the stagnant phase and the stationary phase.

Since different solute molecules spend different lengths of time in the stationary phase, they also spend different amounts of time on the column, giving rise to band-broadening.

The degree of band-broadening due to stationary phase mass transfer depends on:

1) the retention and diffusion of the solute2) the flow-rate of the solute through the column3) the kinetics of interaction between the solute and the stationary phase

e.) Longitudinal diffusion – band-broadening due to the diffusion of the solute along the length of the column in the flowing mobile phase.

The degree of band-broadening due to longitudinal diffusion depends on:

1) the diffusion of the solute2) the flow-rate of the solute through the column

Van Deemter equation: relates flow-rate or linear velocity to H: H = A + B/m + Cm

where:

m = linear velocity (flow-rate x Vm/L)H = total plate height of the columnA = constant representing eddy diffusion & mobile phase mass transferB = constant representing longitudinal

diffusionC = constant representing stagnant mobile

phase & stationary phase mass transfer

One use of plate height (H) is to relate these kinetic process to band broadening to a parameter of the chromatographic system (e.g., flow-rate).

This relationship is used to predict what the resulting effect would be of varying this parameter on the overall efficiency of the chromatographic system.

Number of theoretical plates(N) (N) = 5.54 (tR/Wh)2peak width (Wh)

H = L/N

m optimum

Plot of van Deemter equation shows how H changes with the linear velocity (flow-rate) of the mobile phase

Optimum linear velocity (mopt) - where H has a minimum value and the point of maximum column efficiency:

mopt = rB/C

mopt is easy to achieve for gas chromatography, but is usually too small for liquid chromatography requiring flow-rates higher than optimal to separate compounds

Factor de Separación o Selectividad Parámetro usado para describir si dos compuestos se separan bien en un sistema cromatográfico.

a = k’2/k’1 k’ = (tR –tM)/tM

donde:k’1 = the capacity factor of the first

solutek’2 = the capacity factor of the second

solute, with k’2 >k’1

Un valor de k´1.1 indica que hay una buena separaciónDoes not consider the effect of column efficiency or peak widths, only retention.

MEDICIÓN DE LA SEPARACIÓN DE SOLUTOS

La retención relativa indica si los picos están separadospero no si están resueltos.

t't'

relativaRetención r1

r2

tm

MEDICIÓN DE LA SEPARACIÓN DE SOLUTOS

Resolución Es el párametro más comun usado para definir si dos compuestos se separan bien en un sistema cromatográfico.

Señ

al2

tiempo

Resolución = 0.5

Señ

al3

tiempo

Resolución = 0.75

Señ

al

4

6

Señ

al

tiempo

tiempo

Resolución = 1.0

Resolución = 1.5

Ejemplos de Fase Reversa

Selección de columnas cromatográficas y sus

aplicaciones.

Dr. Victor Hugo Abrego Reyes

Cromatografía

Definición

• Técnica analítica de separación de componentes químicos de una mezcla a partir de las diferencias de velocidad a la que son transportados por una fase móvil a través de una fase fija o estacionaria.

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La capacidad de cada soluto de permanecer en la FM es la que determina el orden de elución de los analitos

Cromatografía en columna

• Se lleva a cabo en tubos de diámetro variado (1cm – 30cm), aunque se puede hacer columnas mucho más amplias.

• La columna es empaquetada con un sólido finamente dividido y éste debe ser inerte al tubo y a la muestra (no siempre)

Cromatografía de Líquidos de Alto desempeño HPLC

• Tipos

– Cromatografía de reparto

• Normal o Reversa

– Adsorción

– Exclusión (GPC, GFC)

– Interacción hidrofóbica

– Interacción Hidrofílica

– Iónica

– Quiral

Algunos tipos de analitos

COLUMNAS CROMATOGRÁFICAS

Tipos de columnas

• Fase Normal• Fase Reversa (C18, C8, Fenilo)

COLUMNAS BASE SÍLICE•Fases antes mencionadas•Largos variables

–1.0 – 30 cm o más

•Presiones máximas 5000-6000psi

•D partícula 3, 5 y 10um

• pH de trabajo 3-10

• T limite a pH bajo 60°C

• T límite a pH alto 40°C

• D poro 135 A

• Volumen de inyección 5 -10 uL

Columnas Poliméricas

Mayor resistencia a la presiónAltas temperaturasMejores platos teoricosAumento en resolución Menor gasto de disolventeMayor rapidezMenos costo

(1) Polystylene (Styrene divinylbenzene copolymer)(2) Polymethacrylate(3) Polyhydroxymethacrylate(4) Polyvinyl alcohol

Polímero v/s Gel de Sílice

GRUPOS DE MUESTRASToma de decisiones

Grupos de Muestras

Grupo A

Grupo C

Grupo B

Grupo D

Baja Polaridad Alta

Baj

o

P

.M.

A

lto

Exclusión por tamaño

(Solvente Orgánico)


(Acuoso)

Grupos de Muestras

Grupo A

Grupo C

Grupo B

Grupo D

Baja Polaridad Alta

Baj

o

P

.M.

A

lto

Fase Normal

Intercambio iónico

Exclusión de ión

Fase Normal

Grupos de Muestras

Grupo A

Grupo C

Grupo B

Grupo D

Baja Polaridad Alta

Baj

o

P

.M.

A

lto

Intercambio iónico

Grupos de Muestras

Grupo A

Grupo C

Grupo B

Grupo D

Baja Polaridad Alta

Baj

o

P

.M.

A

lto

Fase reversa

ELECCIÓN DE COLUMNAS. Ejemplos

Grupos de Muestras• PM > 2000 Baja Polaridad

– Resinas epoxicas, Policarbonatos.

• SEPARACIÓN EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS – GPC: Columnas SHODEX series K, KD, KF, SB, HFIP, GF-HQ,


(Solvente Orgánico)

Exclusión por Tamaños

Fase Móvil: THF, DMF, Cloroformo, Tolueno, etc.

Se necesitaa al menos 0% de diferencia en el PM.

Alto PM/Baja polaridad

Grupos de Muestras• PM > 2000 Ata Polaridad

– Polisacaridos, proteínas, polímeros en agua.

• SEPARACIÓN EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS – GFC: Columnas SHODEX series, KW, SB, GS, KS. OH-pak– IEC: Columnas SHODEX series IEC, PIKESS, Asahipak, CXPak

Exclusión

por tamaño

Intercambio iónico

Alto PM/Alta polaridad

Intercambio iónico (Aniones)

Alto PM/Alta polaridad (carga -)

Alto PM/Alta polaridad (carga +)

Grupos de Muestras• PM < 2000 Baja o media Polaridad

– Ácidos Grasos, vitaminas liposolubles.

• SEPARACIÓN Fase Normal / Fase Reversa – NPC: Columnas SHODEX series, KW, SB, GS, KS. OH-pak– RPC: Columnas SHODEX series IEC, PIKESS, Asahipak, CXPak


Fase Normal Fase Reversa

Fase reversa

Separación Fase Normal (NPC)

PM bajo/ baja o media polaridad

65

Fase Reversa (RPC)

SOLVOPHOBIC THEORY


Analgésicos Locales


Antibióticos


Anticonvulsivos


Análisis de aminas sin el uso de pares iónicos.Columna Polimérica

Grupos de Muestras• PM < 2000 Alta o media Polaridad

– Ácidos orgánicos, iones inorgánicos, sacaridos,

• SEPARACIÓN Fase Normal / Fase Reversa – NPC: Columnas SHODEX series, KW, SB, GS, KS. OH-pak– RPC: Columnas SHODEX series IEC, PIKESS, Asahipak, CXPak– Exclusión iónica series SH, KC

•Exclusión por tamaño.

•HILIC•Intercambio

iónico•Fase Normal •Fase Reversa

Interacción hidrofílica (HILIC)

• Grupos Aminos• Ciano

Separación mediante HILIC

Carácter hidrofóbic

o

Exclusión iónica: Alta o media Polaridad

• Es contraria a la cromatografía de intercambio iónico.

• Repulsión por cargas.

73

Análisis de ácidos orgánicos por exclusión iónica

Intercambio de Ligando: Alta o media Polaridad

• Azúcares y compuestos ricos en electrones – “complejación”

con metales unidos a la fase estacionaria.

• Pb y Zn forman complejos muy estables.

75

J. Braz. Chem. Soc. vol.13 no.5 São Paulo Sept.Oct. 2002

Mecanismo de selección del ligando

Alta o media Polaridad: Azúcares

Serie SUGAR… doble mecanismo de separación

Quiral…

Cromatografía de inmunoafinidad

Inmunoafinidad Aplicaciones

85

TroubleshootingSistema y Método

Troubleshooting

• Localizar el problema en “orden” de probabilidades.• Revisar la causa más problale.• Corregir• Saltal a la siguiente probabilidad.

86

No hay procedimientos estándar para resolver problemas en HPLC.

Patrón General:

De qué se trata?

MétodoSistema

Troubleshooting

87

Método• Velocidad de flujo• Tipo de eluyente• Composición del

eluyente• pH• Volumen de inyección• Temperatura• Perfil del gradiente

Sistema• Estabilidad de flujo• Backpressure• Taponeamiento• Detector• Inyección• Temperatura

Parámetros del sistema

• Verificación preeliminar

88

Solvente Degas bomba automuestrador

Columna Detector

Reservorio

lleno

Backpressure Estabilidad de Flujo

Revisar las válvulas

Viales llenos

Revisar conecciones

Conexiones de la columna

LO

Secuencia de Detectores

Volúmenes de inyección

Conexiones críticas

System Suitability

Consejos iniciales.• Celda de detección de 20 ml incompatible con columnas con <3

mm D.I• Loop de muestra de 10 ml incompatible con columnas <1 mm D.I.• micro-inyectores 0.2 ml son inútiles con columnas convencionales

Regla Básica Volumen de inyección < Volumen de ceda

89

HPLC System set up

• Minimize the volume and connections between autosampler, column, and detector.

• No guard, no prefilter

90

Tubing & connections

91

• Importante recordar que la viscosidad aumenta a su vez la P final aplicada.

92

Back Pressure

93

From Pump To Column

SamplingNeedle Metering

Syringe

Automuestreador – Conexiones Columna Bomba

Conexión correctaConexiones equivocadas

From Pump To Column

SamplingNeedle Metering

Syringe

94

Sample Diluent Effect

12345

Sample diluent:1- 50/50 MeOH/Water2 - 80/20 MeOH/Water3 - 90/10 MeOH/Water4 - 95/5 MeOH/Water5 - 100 MeOH

La imcompatibilidad de disolventes puede causar precipitación de la muestra y taponamiento

Diferentes valores de pH pueden causar picos defectuosos

Sobrecargado de Columna

95

1 ml

5 ml

96

Chromatographic Conditions Eluent: 90% Aqueous:10% MeCNAqueous: 15 mM K2HPO4•7H2O adj. to

pH 1 - 9 with H3PO4

Flow rate: 1 ml/minTemp: 25oC

Efecto del pH UV-Vis

sspH 5.2-9.2

sspH 3.2

sspH 1.2-2.2

sspH 4.2

Ab

s.

Wavelength (nm)

97

Effect of pH on Aniline Retention and UV response (220 nm)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Det

ecto

r R

esp

onse

(m

V)

wwpH 2

wwpH 4

wwpH 5

wwpH 6

wwpH 9

Time (min.)Chromatographic Conditions Column: 15 cm x 0.46 cm C18 Eluent: 90% Aqueous: 10% MeCN

Aqueous: 15 mM K2HPO4•7H2O adj. to wwpH 1.5 - 9 with H3PO4

Flow rate: 1 ml/min Temp: 25oC

98

Equlibrio de la columna

• 30 minutos de eluyente

• Checar la estabilidad de la retención con “estándares probados” inyectando de 3 a 4 veces.

• Proporciones orgánicas y o acuosas muy elevadas en fase móvil requieren estabilizaciones de columna a 1 ml/min.

• Mentira que usar solo agua acaba con las columnas...

99

Gradiente

• Alta presión vs. baja presión de mezclado mixing

J.Dolan, LC-GC V.16 #1, 16

“Method troubleshooting”

• Problemas relacionados a:

100

1. Sistema

2. Columna

3. Muestra

4. Fase móvil

Sistema

• System-to-system compatibility

–Configuraciones diferentes–Volúmenes de permanencia diferentes (conexiones)–Sensibilidades de Detectores (marcas)–Selección exacta de la longitud de onda–Ancho de banda–Factores ambientales

101

Muestra

102

Filtrar y sonicar las muestras Causa tipicamente taponamiento

Filter

Centrifuge

Algunas veces puede cambiar composición de las muestras

Viales Portamuestra

Tipos de septas y tapas.

Volúmenes de llenado

Secuencia lógica

• Bomba– Algun patrón reciproco en el cromatograma– Fluctuaciones en la presión– Cambios en la linea base impurezas o contaminación

• Automuestreador– Injection marks (baseline disturbance)– Contaminación cruzada

• Detector– Respuesta (linea base ruidosa, sucia, etc.)– Wavelength (bandwidth, accuracy, etc.)

103

• Cheque siempre la “plomeria” (Bajo flujo, presión, conexiones)

• Evaluación del cromatograma.

-0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 1 2 3 4 5 6

0.49

0.5

0.51

0.52

0.53

0.54

0.55

0.56

0.57

0.58

0.59

0.6

0 1 2 3 4 5 6

104

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 1 2 3 4 5 6

1 2 31- flow or detection problem 2 – possible injection problem3 – correct chromatogram

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6

1

Secuencia lógica

Troubleshooting sequence

• Analysis of chromatogram– Compare con

cromatogramas previos– Revise la forma del

cromatograma– Cambios en tiempos de

retención– Elución reversa?

-1

4

9

14

19

24

0 1 2 3 4 5 6

-1

4

9

14

19

24

0 1 2 3 4 5 6

105

-1

4

9

14

19

24

0 1 2 3 4 5 6

-1

4

9

14

19

24

0 1 2 3 4 5 6

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