Cristal.lografia de Proteïnes per RX

Cristal.lografia de Proteïnes per RX

Marta Costa Guillem Galofré Meritxell Pellicer

Biologia Estructural UPF, 2004

INTRODUCCIÓ

DIFRACCIÓ

FUNCIÓ DE DISPERSIÓ

PROBLEMA DE LES FASES

MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES

REFINAMENT

SUMARI

Procés pel qual a través de la incidència de Raig X sobre un cristall de proteïna podem obtenir un mapa de densitat electrònica i a partir d’aquest trobar l’estructura de la proteïna.

Què és la Cristal·lografia de Proteïnes?

La determinació del mapa de densitat electrònica de la molècula s’obté de l’anàlisi del patró de difracció que experimenta un feix de Raigs X al atravessar el cristall.

INTRODUCCIÓ

Per què cristalls?

El cristall és una xarxa de molècules ordenades en la mateixa orientació repetida, això fa que les ones difractades es sumin i assoleixin prou intensitat.Al ser irradiats produeixen un efecte de difracció que depèn de les distàncies entre els àtoms.El patró de difracció està relacionat amb l’estructura de la proteïna.

INTRODUCCIÓ

Per què Raigs X?Poden atravessar la matèria.La seva longitud d’ona és tan petita com les distàncies interatòmiques, cosa que permet diferenciar i identificar els àtoms de la molècula.

INTRODUCCIÓ

Un sincrotró és un accelerador de partícules circular, que permet escollir la longitud d’ona de la radiació. Augmenta l’energia cinètica dels electrons mantenint-los en trajectoria circular s’obtenen 2 components de l’acceleració:- V- canvi de direcció del moviment emissió de radiació electromag.

Radiació de Sincrotró

I rradiació del cristall

El SincrotróINTRODUCCIÓ

INTRODUCCIÓ

DIFRACCIÓ




REFINAMENT

SUMARI

Condició: sortir en fase!

Suma d’amplituds

S’ha d’amplificar la senyal de la radiació dispersada per a la seva detecció

Interacció amb e- !!!

DIFRACCIÓ

= longitud d’ona distància

1 cicle complert angle 2

2 / (quantitat d’angle / distància recorreguda)

xd

/ xPer regla de tres... = x . (2 / )

DIFRACCIÓ

•Tenint... = x . (2 / ) ...i... x = d . sin

n *(n ha de ser nº sencer!)

n2 = (d . sin. 2) / n = d . sin

xd

/ x•Perque surti en fase... = 2

= (d . sin. 2) /

DIFRACCIÓ

Condicions de Laue

n = d. sinperò cristall no és només 1 D...

h = a . ΔSk = b . ΔS LAUE!l = c . ΔS

Nombres sencers!

Incident So

Difractat S

0S ss

n = r12.(S-S0)3d

DIFRACCIÓ

a = (a,0,0) b = (0,b,0) c = (0,0,c)

r

Gràcies a les Condicions de Laue,definim la forma i dimensió de la cel.la que permetrà la difracció!

...per tant, qualsevol punt en l’espai de la cel.la podrà ser definit per un vector posició r:r = x a + y b + z c...i recordant a Laue...r.ΔS = x h + y k + z l (...que són nombres sencers i més endavant veurem que ens serveix en les fórmules...)

DIFRACCIÓ

Mapa de Dispersió

Espai Recíproc i Esfera d’Ewald

A nivell experimental, el que nosaltres observem és l’espai recíproc i no el directe:

DIFRACCIÓ

L’esfera d’Ewald com a model matemàtic, ens ajuda a entendre-ho...

(a*,b*,c*) és l’espai recíproc de (a,b,c), siguent:

a*= 1/ab*= 1/b c*= 1/c

DIFRACCIÓ

, , ...*http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/Course/Basic_diffraction/data_animation.html

1 2 3

Funció de Dispersió!

DIFRACCIÓ

http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/Course/Basic_diffraction/data_animation.html

http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/Course/Basic_diffraction/data_animation.html

INTRODUCCIÓ

DIFRACCIÓ




REFINAMENT

SUMARI

Entrem a la dimensió desconeguda...

? ?

? ? ?The Twilight Zone...

n = d. sinn = d. sinn = d. sinn = d. sinn = d. sinn = d. sin

n = d. sin

n = d. sin

lzkyhx2

1,0

lzkyhx2

Sr2

lk,h,1zy,x,

dxdydz zy,x,lk,h,

dVr

i

h k l

i

Celda

i

eFV

eV)F(

eS)F(

-La suma de totes les dispersons de tots els e- ...

...per cada un dels punts en l’espai de la cel.la ...

-...per la funció d’ona.

A nosaltres el que ens interessa és la densitat electrònica!!!

...per tant, necessitarem l’ajuda de...


Laue!!!

dx

dt

itx

itx

exFtf

etfxF

)()(

)()(

La Transformada de Fourier ens permet passar de l’espai “matemàtic” Fourier, a l’espai real, i viceversa. (En termes més senzills i pràctics; ens permet passar elements de la funció d’un costat a l’altre...)

La Transformada de Fourier


Transformada de Fourier

lzkyhx2

1,0

lzkyhx2

Sr2

lk,h,1zy,x,

dxdydz zy,x,lk,h,

dVr

i

h k l

i

Celda

i

eFV

eV)F(

eS)F(...així:

lk,h,i lk,h,lk,h, eFFComplex(a funció)

Part real(el que observem –mòdul-)

descomposem

+ Part imaginària


INTRODUCCIÓ

DIFRACCIÓ




REFINAMENT

SUMARI

lk,h,lzkyhx lk,h,zy,x, iαi

h k leF

V 21

Per tant, apliquem a l’equació anterior, i...

és un angle de desfase adicional... Que no coneixem!!!Ens trobem amb el Problema de les Fases!!!


lk,h,i lk,h,lk,h, eFFComplex(a funció)

Part real(el que observem –mòdul-)

+ Part imaginària

COM RESOLDRE’L...?

“El problema de les fases pot comparar-se a una orquestra en la que cada músic només rep la part de partitura que li toca interpretar. Un violoncel·lista sap quines notes tocar i amb quin ritme, però per coordinar el moment en què cada intèrpret ha de començar, existeix el mestre. Si aquest falta, no hi haurà coordinació i el resultat serà desastrós. D’aquesta manera, en les dades que el detector recull en la cristal·lografia falta saber “l’hora” en la que cada un entra, perquè la suma de les ones sigui el resultat real. És a dir, que la determinació de les fases de les ones informa de quan considerar cada una, i així sumar els pics i les valls.”


HI HA SOLUCIONS!


INTRODUCCIÓ

DIFRACCIÓ




REFINAMENT

SUMARI


1. Determinació directa2. Multiple Isomorphus Replacement (MIR)3. Multiwavelenght Anomalous Diffraction (MAD)4. Molecular Replacement (MR)

Però abans cal conèixer...

Slk,h,hkl

uF

VuP 21 2 cos)()(

dVurruPr

)(

2022

3

lk,h,e2

FImcV

VIcelda

cr

...l’empenta que ens dóna la Funció de Patterson:

Ens ajuda, doncs ens dóna un valor real per F (F2 , relacionat amb la intensitat de les radiacions difractades captades) sense introduir-nos una fase desconeguda, eliminant així el problema de les fases. Obtenim:

Fent la Transformada de Fourier, aïllarem la part de dins de l’equació que fa referència a la densitat electrònica!!!... Però no és la densitat electrònica, sinó una Funció de Correlació, que ens estarà dient la distància entre dos centres electrònics.És un bon començament per aproximar-nos-hi...


Mapa de Patterson bidimensional

Mapa de Patterson. És un mapa de vectors de les distàncies entre els centre electrònics.

dVurruPr

)(

S’utilitza com a complement d’altres mètodes per resoldre les estructures protèiques.APLICACIONS

...Per tant, buscarem situar algun/s centre electrònic i, sabent la correlació de distàncies, ja podrem saber la posició de la resta, o sigui, el mapa de Densitat electrònica!


1. Determinació directaMètode directe que utilitza les relacions estadístiques entre els sistemes dels factors de dispersió per deduir els possibles valors de les fases.

hkl

calcobs FF 2 lk,h,lk,h, lk,h,

F OBSERVAT EXPERIMENTALMENT

F HIPOTÈTIC

- molècules petites ( < 200 àtoms)- sub-estructures de macromolècules- últims desenvolupaments ( ~ 2000 àtoms)

APLICACIONS


AVANTATGES

INCONVENIENTS

No necessiten derivats isomòrfs No necessiten dispersors anòmals No necessiten un model semblant Poden completar tots els altres mètodes

X Difraccions a molt alta resolució (1.2 Å o més) X A mesura que augmenta el nombre d’àtoms funcionen pitjor


2. REEMPLAÇAMENT ISOMÒRFIC MÚLTIPLE (MIR)

Cristalls derivats de la proteïna a la qual se li han introduït alguns àtoms de metalls pesats.

Patró de difracció de RX del cristall de la proteïna nativa i dels derivats.

Aplicació de la funció de Patterson per determinar les coordenades dels àtoms pesats.

Refinament dels paràmetres dels àtoms pesats i càlcul de les fases dels angles.

Càlcul de la densitat electrònica de la proteïna nativa (aplicació de la transformada de Fourier un cop ja tenim les fases)


La introducció d’un àtom pesat canvia significativament el mapa de dispersió.

La contribució dels àtoms lleugers tendeix a anul·lar-se ja que dispersen en fases diferents; en canvi, els electrons d’un àtom pesat solen dispersar en la mateixa fase.

Com a resultat, el canvi en la intensitat degut a l’addició d’un àtom pesat a la proteïna serà fàcilment mesurable.

Com que la quantitat d’àtoms de metalls és reduïda podem obtenir el mapa de Patterson i per mètodes directes trobar les coordenades d’aquests metalls.


Per poder solucionar el problema, la dispersió dels àtoms en la proteïna nativa no ha de variar per l’addició dels àtoms pesats, llavors les diferències en els patrons es deuran només a la incorporació dels nous àtoms.

FPH = FP + FH

Coneixem el mòdul i orientació d’un costat: FH; i el mòdul dels altres dos (FPH i FP).

Com veiem hi ha dos possibles triangles, d’acord amb les dues possibles fases de FP.


Construcció de Harker

1. Dibuixem un cercle de radi igual al mòdul de FP, centrat a l’origen; aquest cercle indica tots els vectors que es poden obtenir en totes les fases de FP (blau)

2. Dibuixem un altre cercle de radi FPHcentrat a -FH (rosa)

3. Les interseccions entre els dos cercle són possibles valors de FP que satisfan l’equació FPH = FP + FH i estan en consonància amb els mòduls mesurats i amb el model de l’àtom pesat.


Llavors, si tracem un altre cercle a partir dels valors obtinguts amb un altre cristall derivat només una opció serà concordant amb totes les observacions.

Cal tenir en compte que en els segon cristall derivat canvies el metall però els has de situar en la mateixa posició.

Si la proteïna ja conté metalls es poden aprofitar i no n’has d’afegir tants.

Ja que es necessita més d’un cristall derivat, el mètode és anomenat Reemplaçament Isomòrfic Múltiple.

És el mètode més usat quan no tenim cap informació sobre l’estructura.


3. Multiwavelenght Anomalous Diffraction (MAD)

Variant del reemplaçament isomòrfic múltiple.Es basa en l’existència de metalls que al ser irradiats amb diverses longituds d’ona presenten un comportament diferent i, per tant, diferents Fs.

D’aquesta manera ens estalviem haver de fer un segon derivat.


- Es basa en el coneixement previ de l’estructura tridimensional d’una altra proteïna homòloga cristal·litzada.

- El model ha de posseir d’un 30 a un 50% de la seva seqüència d’aminoàcids idèntica a la que s’està analitzant.

- Bancs de dades cristal·logràfiques PDB.

- S’utilitza quan es disposa d’un bon model conegut que es correlaciona amb una fracció raonable de l’estructura del cristall de la proteïna problema.

4. Molecular Replacement (MR)


METODOLOGIA

1- S’empra la estructura homòloga i es genera un mapa de densitat teòric. 2- Es produeix la superposició del mapa de densitat teòric amb l’observat. 3- Es minimitza la funció R-factor (funció de resolució), fent ús d’ una funció de rotació i translació.

hkl

hkl

obsF

calcFkobsFR

)(

)()(

Model

Mapa densitats

F

F’

Mapa de densitats’

Rotació i translació

Model’

...


INTRODUCCIÓ

DIFRACCIÓ




REFINAMENT

SUMARI

Segueix un procés igual que el Reemplaçament molecular.

Un cop s’obté el mapa de densitats de la proteïna problema, s’apliquen les funcions de rotació i de translació per tal de millorar-lo i ajustar-lo el màxim possible.

Per ajustar-lo el màxim possible H2O

Fcalc nova

R menor

REFINAMENT

REFINAMENT

El model 3D al que s’arriba, pot deixar alguna part d’un aminoàcid fora de la densitat electrònica, i això exigeix un refinament.

REFINAMENT

CONCLUSIONS

Resumint...

Irradiem Cristall

Funció de Correlació (Mapa de Patterson)

Mapa de Dispersió

Obtenim Cristall

Aïllem la Proteïna

Transformada de Fourier (amb la funció de Patterson)

Mètodes + Refinament

Funció de Dispersió

X Grans quantitats de proteïna per purificar

X Cristalls de molt bona qualitat

X Possibles artefactes cristal·lins

X Resultats a mitjà-llarg plaç

Permet determinar estructura 3D de compostos biològics

Alta exactitud i resolució estructural a nivell atòmic

No hi ha límit en la mida de la molècula

AVANTATGES INCONVENIENTS

CONCLUSIONS

•CANTOR, CR., 1998 Biophysical chemistry. Part II: Thecniques for the study of biological structure and function, New YorkCantor,WH Freeman and Co.

•DRENTH, J., 1994, Principles of protein X ray crystallography, Nueva York, Springer-Verlag.

•http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/course.html

•http://www-structure.llnl.gov/Xray/101index.html

•http://www.ciencia-hoy.retina.ar/hoy60/luz.htm

•http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/parte_01.html •http:// info.main.conacyt.mx/secobi/bancos/cyd/pdf/133-38.pdf

BIBLIOGRAFIA

PEMs

1- Quina de les següents afirmacions sobre la Cristal·lografia de proteïnes és correcta:

a). La longitud d’ona dels raigs X utilitzats és més gran que les distàncies interatòmiques.

b). Aquesta tècnica és la més emprada després de la Ressonància Magnètica Nuclear.

c). Una de les avantatges del sincrotró és que permet escollir la longitud d’ona amb la que s’irradia el cristall.

d). Perquè hi hagi difracció, a cada cel·la unitària només hi pot haver una molècula de la nostra proteïna.

e). Totes les anteriors són falses.

2- Pel que fa a la Cristal·lografia de proteïnes, quina de les següents afirmacions és correcta:

a). Perquè es produeixi el fenòmen de la difracció no és necessari que les ones es dispersin en fase.

b). En la següent expressió : n = d · sin , n pot ser qualsevol nombre real.

c). El vector S0 fa referència a la radiació dispersada.

d). Gràcies a les condicions de Laue, definim la forma i dimensió de la cel·la que permetrà la difracció.

e). En les condicions de Laue no es té en compte la longitud d’ona de la radiació emprada.

PEMs

3-Referent a la cristal·lografia de proteïnes per raigs X, quines de les següents afirmacions són falses :

1). A nivell experimental, les dades obtingudes fan referència a l’espai recíproc.

2). Aplicant la Transformada de Fourier a la Funció de Dispersió ja podem conéixer la densitat electrònica.

3). Per obtenir els diferents Mapes de Dispersió canviem l’angle d’incidència de la radiació respecte el cristall.

4). L’esfera d’Ewald és l’espai real que delimita el cristall.

a). 1,2,3

b). 1,3

c). 2,4

d). 4

e). 1,2,3,4

4-Què és el mapa de Patterson?

a). És la representació en l’espai de la densitat electrònica de la nostra proteïna.

b). S’utilitza en el procés de refinament.

c). Les dues anteriors són correctes

d). És un mapa de vectors de les distàncies entre els centres electrònics.

e). Totes són correctes.

PEMs

5-Quin dels següents no és un dels mètodes per resoldre el problema de les fases?

a). Multiwavelenght Anomalous Diffraction (MAD)

b). Molecular Replacement (MR)

c). Multiple Isomorphus Replacement (MIR)

d). Molecular Multiwavelenght Replacement (MMR)

e). Determinació directa

6-Quina o quines de les següents afirmacions sobre el Multiple Isomorphus Replacement (MIR) és falsa?

1). Requereix l’ús de metalls pesats.

2). Com a mínim cal l’obtenció de dos cristalls derivats diferents.

3). A l’inici, del factor d’estructura (vector) de la nostra proteïna i del derivat, només en coneixem el mòdul

4). Aquest mètode només es fa servir quan disposem d’informació sobre l’estructura de la proteïna.

a). 1,2,3

b). 1,3

c). 2,4

d). 4

e). 1,2,3,4

PEMs

7-Referent als mètodes per resoldre el problema de les fases:

a). En el Multiwavelenght Anomalous Diffraction (MAD) s’utilitzen metalls que donen lloc a patrons de difracció diferents depenent de la longitud d’ona amb la que han estat irradiats.

b). En el Molecular Replacement (MR) es busca maximitzar el valor de R mitjançant les funcions de rotació i translació.

c). Les dues anteriors són falses.

d). En el Multiwavelenght Anomalous Diffraction (MAD), com a mínim cal l’obtenció de dos cristalls derivats diferents.

e). Totes les respostes són falses.

8-Pel que fa al procés de refinament, quins recursos podem utilitzar per millorar el model?

a). Afegir molècules d’aigua.

b). Fer una dinàmica restringida a la densitat electrònica.

c). Les dues anteriors són correctes.

d). Aplicar les funcions de rotació i translació.

e). Totes les anteriors són correctes.

PEMs

9-Quin o quins són els passos més problemàtics en el procés de determinació de l’estructura tridimensional d’una proteïna per cristal·lografia per raigs X?

a). Determinació de la fase

b). Formació del cristall

c). Les dues anteriors són correctes

d). Obtenir la funció de dispersió

e). Totes són correctes

10-Quina o quines de les següents afirmacions sobre la Cristal·lografia de proteïnes és correcta:

1). S’obté un alt grau de resolució estructural a nivell atòmic.

2). Es necessiten cristalls de molt bona qualitat.

3). Cal una gran quantitat de proteïna purificada.

4). S’obtenen resultats a mitjà-llarg plaç.

a). 1,2,3

b). 1,3

c). 2,4

d). 4

e). 1,2,3,4

Cristal.lografia de Proteïnes per RX

Documents

Transcript of Cristal.lografia de Proteïnes per RX