CRIOPROTECCION
-
Upload
pepearanda -
Category
Documents
-
view
4 -
download
0
Transcript of CRIOPROTECCION
CRIOPROTECCION
Métodos de elección o de conservación a largo plazo. Son los mejores porque en ellos se paraliza el
crecimiento de las células microbianas, pero éstas no han muerto. Así se garantiza al máximo la
estabilidad genética, por evitarse la aparición de generaciones sucesivas. Aun así no se puede
descartar algún cambio originado por el método preparatorio en sí mismo. Los métodos de
conservación pertenecientes a este grupo son dos: Congelación y liofilización.
Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a
temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al
no disponer las células de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con
las células así conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de
conservación desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos
especiales, y además existe el peligro de que algún fallo del sistema produzca una subida no
deseada de la temperatura durante el almacenamiento. También resulta ser el método más molesto
para realizar el envío de las cepas. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de
las células conservadas por este método son los siguientes:
Edad de las células
Velocidad en la congelación y descongelación.
Temperatura de almacenamiento
Empleo de agentes crioprotectores.
Estas sustancias protegen del daño que se pueda producir en las células microbianas en el momento
de la congelación. Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como
crioprotectores, pero el que se utiliza con más frecuencia es el glicerol, a una concentración del 15
al 20%. También se pueden utilizar el dimetilsulfóxido etc. En su elección influye el tipo de
microorganismo que se quiera conservar.
CONTAMINACION:
¿Cómo se introduce una contaminación en nuestro cultivo?
• Operador
• La manipulación
• La atmósfera
• Las superficies
• Los utensilios
• Los medios y soluciones
Tipos de contaminación
• BIOLÓGICA
Bacterias:
Fácil de detectar a microscopía:
• Formas motiles (cocos, bacilos..)
• Origina cambios en el pH del medio
• Origina turbidez en el medio
• Control: penicilina/estreptomicina, gentamicina
• No utilizar antibióticos, al menos durante algún tiempo, para su control
• Eliminar los cultivos contaminados
▫ Levaduras:
Fáciles de detectar a microscopía.
• Partículas redondeadas u ovoides formando cadenas
• No causan cambios rápidos en el pH del medio
• El medio se vuelve turbio
• Pueden causar alcalinización del medio
• Olor típico a “pan”
▫ Hongos:
Fácilmente observables a microscopía o incluso a simple vista.
• No provocan cambios inmediatos en el pH del medio
• Generalmente no son citotóxicos
• Esporas difíciles de detectar
• Blanquecinos, amarillentos o negros
• Control: AnfotericinaB (Fungizone) o Nistatina
▫ Virus:
Difíciles de detectar por su tamaño
• Requerimientos muy específicos (hospedero)
• Peligro potencial para el operador al manipular cultivos infectados
• El riesgo de manifestación de virus ‘latentes’ se incrementa con las modificaciones genéticas y los
cambios en las condiciones de cultivo.
Para prevenir este tipo de contaminantes se recomienda:
Antes de utilizar la cabina: Apagar la lámpara UV, encender la luz, desinfectar las superficies con
el desinfectante apropiado, desinfectar y colocar el material necesario dentro de la cabina.
Manipular cada línea celular por separado: No compartir medios de cultivo entre diferentes
líneas, manipular las líneas celulares con mayor capacidad de proliferación las últimas, verificar
periódicamente las propiedades del cultivo.
CURVA DE CONGELACION
AS: Se enfría por debajo de su punto de congelación es inferior a 0º C.
SB: La temperatura aumenta rápidamente hasta alcanzar el punto de congelación.
BC: El calor se elimina a la misma velocidad que en las fases anteriores.
CD: Uno de los solutos alcanza la sobre saturación y cristaliza.
DE: La cristalización del agua y los solutos continúa.
EF: La temperatura de la mezcla de agua y hielo desciende.
CONTEO CELULAR:
Cuantificación celular es necesario para: la caracterización de líneas celulares, establecer
condiciones reproducibles de cultivo, consistencia de cultivos primarios.
Conteo celular: El numero células por ml = promedio del numero de células de los cuadros de
las esquinas x104. Si el conteo es muy alto se debe diluir la suspensión para evitar errores de
muestreo.