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UNIVERSIDAD DE VALENCIA Facultad de Medicina Departamento de Medicina TESIS DOCTORAL Respuesta inmune en el Infarto Agudo de Miocardio Un estudio traslacional Presentada por: María José Forteza de los Reyes Dirigida por: Prof. Vicente Bodí Peris Prof. Isabel Trapero Gimeno Prof: Amparo Ruiz Saurí Valencia 2014
Transcript of core.ac.uk · AGRADECIMIENTOS A mi familia: A mi padre, a mi madre y a Salva. Por vuestra...
UNIVERSIDAD DE VALENCIA
Facultad de Medicina
Departamento de Medicina
TESIS DOCTORAL
Respuesta inmune en el Infarto Agudo de Miocardio
Un estudio traslacional
Presentada por:
María José Forteza de los Reyes
Dirigida por:
Prof. Vicente Bodí Peris
Prof. Isabel Trapero Gimeno
Prof: Amparo Ruiz Saurí
Valencia 2014
AGRADECIMIENTOS
A mi familia:
A mi padre, a mi madre y a Salva. Por vuestra comprensión y apoyo
incondicional durante todos estos años.
A mis directores:
A Vicent Bodí por darme la oportunidad de realizar el presente trabajo e
iniciarme en este mundo tan complejo como es la investigación.
A Isabel Trapero por tu apoyo.
A Amparo Ruiz por tus buenos consejos y tu experiencia.
A todas las personas que han contribuido en la realización de esta tesis:
A mi grupo: a Fabián por muchas cosas y sobretodo por los estudios de RMC,
a Cristina y Gema por vuestra ayuda con los experimentos con los cerditos. A Clara,
Elena, Arantxa y Nerea por todo lo que nos queda por hacer.
A todo el personal del animalario de la UCIM y en especial a Ana Díaz e
Inma Noguera por el duro trabajo con los cerditos y dedicación.
Al Servicio de Hematología del Hospital Clinico de Valencia y en especial a
Isana Benet por orientarme con la citometría e iniciarme en el mundo de la
Inmunología. Gracias también a Carlos Solano y Paula Amat por su colaboración.
Al Servicio de Cardiología del Hospital Clinico de Valencia: a Javier Chorro
por transmitirme su interés y curiosidad por la investigación experimental. A Luis
Mainar que probablemente es el catalizador de todo esto. A Juan Sanchis y Julio
Núñez por vuestra experiencia en cardiología. Gracias también a Patricia y Juan
Carlos por esos controles. También agradezco a todos los residentes que de alguna
manera también han contribuido en la recopilación de datos clínicos. No me olvido
de Ana, Estefanía, Isabel y Josep. Así como Vicen y Julia por ayudarme en todas las
gestiones.
A la Unidad de Resonancia Magnética de ERESA del Hospital Clínico de
Valencia por los estudios de RMC.
A Carlos Hermenegildo y Susana Novella por guiarme durante la primera
etapa de mi investigación y por estar ahí en muchas ocasiones.
A Juan Viña y Rosa Zaragozá por orientarme en los estudios de Biología
Molecular.
A la Unidad de Citometría de la Universidad de Valencia y en especial a Jose
Enrique O´Connor, Carmen, Marta, Nuria, Angi, Laura y Guadalupe.
A todos los amigos y compañeros:
A todos los LINCE: a Carlos, por nuestras charlas y buenos momentos, a
Andrés, por todo lo que aprendí de ti. También a Macarena, Dani, Ana y Xavi.
A Pepa por nuestros desayunos “energéticos”, a Teresa, Ivan, Marcelino,
Elena por hacer las comidas divertidas.
A María, Yoana, Fernando y Vicent por los almuerzos y comidas que hicimos
y los que nos quedan por hacer.
A los del grupo del restaurante chino, la semana que viene volvemos otra vez.
Me enseñaron que
el camino del progreso
no es ni rápido ni fácil
Marie Curie
ÍNDICE
Índice
i
ÍNDICE
ÍNDICE ............................................................................................................................. i
LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................................... 7
I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 11
1. La cardiopatía isquémica .............................................................................................. 12
1.1. Infarto agudo de miocardio con elevación del segmento ST .................................................. 14
2. La respuesta inmune en el IAMEST ............................................................................ 20
2.1. El modelo del peligro ............................................................................................................. 25
2.2. Respuesta inmune innata en el IAMEST ............................................................................... 26
2.3. Respuesta inmune adaptativa en el IAMEST ......................................................................... 29
3. Desregulación de la respuesta inmune en el IAMEST ............................................... 32
3.1. Apoptosis linfocitaria ............................................................................................................. 35
3.2. Recirculación de linfocitos ..................................................................................................... 36
3.3. Inmunoregulación y contrasupresión inmune ........................................................................ 38
II. HIPÓTESIS ........................................................................................................... 45
III. OBJETIVOS ........................................................................................................ 49
IV. MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................. 53
1. ESTUDIO EN PACIENTES ......................................................................................... 53
1.1. Grupos de estudio ................................................................................................................... 53
1.2. Características basales ............................................................................................................ 54
1.3. Resonancia Magnética Cardíaca (RMC) ................................................................................ 55
1.4. Extracciones seriadas ............................................................................................................. 56
1.5. Recuento leucocitario ............................................................................................................. 57
1.6. Aislamiento y criopreservación de PBMCs ........................................................................... 57
1.7. Análisis de subtipos linfocitarios por citometría de flujo ....................................................... 58
1.8. Análisis de linfocitos T reguladores por citometría de flujo .................................................. 60
1.9. Aislamiento de RNA total de PBMCs .................................................................................... 61
1.10. RT- qPCR ............................................................................................................................... 62
1.11. Inmunoensayo multiplex de citoquinas .................................................................................. 63
2. ESTUDIO EN ANIMALES .......................................................................................... 64
2.1. Infarto Porcino ....................................................................................................................... 64
2.2. Extracciones sanguíneas y aislamiento de PBMCs ................................................................ 65
2.3. Cuantificación del tamaño del infarto, área en riesgo y OMV ............................................... 65
Índice
ii
2.4. Recuento leucocitario ............................................................................................................. 66
2.5. Análisis de subpoblaciones linfocitarias mediante citometría de flujo................................... 67
2.6. Aislamiento de RNA total y RT-qPCR .................................................................................. 67
2.7. Cuantificación de la apoptosis linfocitaria por citometría de flujo ......................................... 68
2.8. Cuantificación de la expresión proteica mediante Western Blotting ...................................... 69
2.9. Caracterización inmunohistoquímica de infiltrado leucocitario ............................................. 69
2.10. Caracterización de la apoptosis en miocardio porcino mediante TUNEL .............................. 71
3. ANALISIS ESTADÍSTICO .......................................................................................... 71
3.1. Cálculo del tamaño muestral del estudio en humanos ............................................................ 71
3.2. Cálculo del tamaño muestral del estudio en animales ............................................................ 72
3.3. Análisis estadístico de los resultados. .................................................................................... 72
V. RESULTADOS ...................................................................................................... 75
1. Características basales de los grupos de estudio ......................................................... 75
2. Características clínicas y angiográficas del grupo IAMEST ..................................... 76
3. Características de RMC del grupo IAMEST .............................................................. 77
4. Dinámica de la respuesta inmune adaptativa en sangre periférica de pacientes con
IAMEST ................................................................................................................................. 78
4.1. Dinámica de los leucocitos en pacientes con IAMEST .......................................................... 78
4.2. Dinámica de las citoquinas en pacientes con IAMEST .......................................................... 80
4.3. Dinámica de los linfocitos T, linfocitos B y linfocitos NK en pacientes con IAMEST ......... 82
4.4. Dinámica de los linfocitos CD4 y CD8 en pacientes con IAMEST ....................................... 84
4.5. Dinámica de los linfocitos Th1, Th2 y Th17 en pacientes con IAMEST. ................................ 86
4.6. Dinámica de los linfocitos Treg en pacientes con IAMEST .................................................. 89
4.7. Dinámica de los linfocitos T CD4 memoria y naïve en pacientes con IAMEST ................... 91
4.8. Dinámica de los linfocitos T activados en pacientes con IAMEST ....................................... 92
4.9. Dinámica de los linfocitos T autorreactivos en pacientes con IAMEST ................................ 94
4.10. Resumen de la dinámica de los subtipos linfocitarios en pacientes con IAMEST ................. 95
5. Relación de la dinámica respuesta inmune adaptativa en sangre periférica de
pacientes con IAMEST con el tamaño del infarto ............................................................. 99
5.1. Relación del recuento leucocitario con el tamaño del infarto ................................................. 99
5.2. Relación de las citoquinas 24h post-reperfusión con el tamaño del infarto ......................... 100
5.3. Relación de las poblaciones linfocitarias 24h post-reperfusión con el tamaño del infarto ... 101
5.4. Relación de los genes linfocitarios 24h post-reperfusión con el tamaño del infarto ............ 102
6. Análisis de mecanismos asociados a la alteración de la respuesta inmune adaptativa
en el IAMEST ...................................................................................................................... 104
6.1. Análisis de la apoptosis linfocitaria en el modelo animal de IAMEST ................................ 104
Índice
iii
6.2. Análisis de la recirculación linfocitaria en el modelo animal de IAMEST .......................... 107
7. Análisis de mecanismos asociados a la regulación de la respuesta inmune
adaptativa en el IAMEST ................................................................................................... 111
7.1. Linfocitos Treg en el modelo animal de IAMEST ............................................................... 111
7.2. El eje PD-1/PD-L1 en pacientes con IAMEST .................................................................... 112
7.3. El eje PD-1/PD-L1 en el modelo animal de IAMEST ......................................................... 116
VI. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 121
1. Dinámica leucocitaria en el IAMEST ........................................................................ 121
2. Dinámica linfocitaria en el IAMEST ......................................................................... 124
2.1. Descenso de la respuesta inmune celular y citotóxica durante las primeras horas del infarto y
la reperfusión .................................................................................................................................. 124
2.2. Aumento de la respuesta inmune humoral en el IAMEST ................................................... 127
2.3. Dinámica de otras poblaciones linfocitarias en el IAMEST ................................................ 129
3. Respuesta inmune y relación con el tamaño del infarto ........................................... 132
4. Mecanismos de inmunoregulación. El modelo porcino de IAMEST ...................... 134
4.1. Apoptosis linfocitaria ........................................................................................................... 135
4.2. Recirculación e infiltración linfocitaria ................................................................................ 136
4.3. Inmunoregulación mediada por los linfocitos Treg .............................................................. 138
4.4. Inmunoregulación mediada por PD-1/PD-L1 ...................................................................... 140
5. Implicaciones clínicas .................................................................................................. 143
6. Limitaciones ................................................................................................................. 144
VII. CONCLUSIONES ............................................................................................ 147
VIII. SUMMARY OF RESULTS AND CONCLUSIONS ...................................... 151
IX. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................ 163
Índice
iv
LISTA DE ABREVIATURAS
Lista de Abreviaturas
7
LISTA DE ABREVIATURAS
7-AAD: 7-aminoactinomycina-D
ADA: Arteria Descendiente Anterior
AICD: Muerte Celular Inducida por Activación
ATP: Adenina Trifosfato
BSA: Seroalbumina Bovina
CPA: Célula Presentadora de Antígeno
CK-MB: Creatin Quinasa MB
CTLA-4: Antígeno Citotóxico Linfocitario 4
DAB: 3, 3´´-tetrahidrocloridro de diaminobencidina
DAMPs: Patrones moleculares asociados a peligro
DE: Desviación Estándard
DMSO: Dimetil Sulfóxido
DNA: Ácido Desoxiribonucleico
ECG: Electrocardiograma
EDTA: Ácido Etilendiaminotetraacético
ELB: Buffer de Lisis Eritrocitos
FE: Fracción de Eyección
GITR: Receptor Glucocorticoide Inducido por Factor de necrosis tumoral
HBSS: Hanks Balanced Salt Solution
HE: Hematoxilina- Eosina
HRP: Peroxidasa de Rábano
HSP: Proteína de Choque Térmico
IAM: Infarto Agudo de Miocardio
IAMEST: Infarto Agudo de Miocardio con Elevación del segmento ST
ICAM: Molécula de Adhesión Intercelular
IFN-: Interferón gamma
IL-1: Interleuquina 1 beta
IL: Interleuquina
IP: Yoduro de Propidio
MHC: Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Lista de Abreviaturas
8
NF-kB: Factor Nuclear kappa B
NK: Natural Killers
OMV: Obstrucción Microvascular
PBMCs: Células Mononucleares de Sangre Periférica
PBS: Phosphate Buffer Saline
PD-1: Proteína de Muerte1
PVDF: Polivinil Fluoride
RMC: Resonancia Magnética Cardiaca
RNA: Ácido Ribonucleico
ROS: Especies Reactivas de Oxígeno
RTG: Realce Tardío de Gadolinio
SBF: Suero Bovino Fetal
TA: Temperatura Ambiente
TCR: Receptor de Linfocito T
TGF-β: Factor de Crecimiento Transformante beta
Th: T colaboradores
TIMI: Thrombolysis In Myocardial Infarction
TLR: Receptores tipo Toll
TNF-: Factor de necrosis tumoral alfa
Treg: T reguladores
TUNEL: Terminal-deoxynucleotidyl-transferase dUTP Nick End Labeling
TTZ: 2, 3, 5-cloruro de trifeniltetrazolio
VEA: Vénulas del Endotelio Alto
VI: Ventrículo izquierdo
VTD: Volumen Telediastólico
VTS: Volumen Telesistólico
INTRODUCCIÓN
Introducción
11
I. INTRODUCCIÓN
Según la Organización Mundial de la Salud, las enfermedades cardiovasculares son
una de las principales causas de muerte en muchos países en vías de desarrollo; siendo
así la primera causa de muerte en adultos1.
Durante las últimas décadas se ha demostrado que la respuesta inmune es un
mecanismo clave en el desarrollo de las enfermedades cardiovasculares2. La respuesta
inmune es una reacción del organismo frente a una gran variedad de lesiones tisulares.
Cuando un estímulo inflamatorio es persistente o se repite continuamente se producirá
una reacción inmune crónica, que puede llegar a destruir el tejido y/o producir la
pérdida de la funcionalidad del órgano afectado. Por otro lado cuando tiene lugar un
daño tisular repentino se puede producir una reacción inmune aguda que debe ser
controlada, o en caso contrario, podría tener resultados perjudiciales.
Más de un 40% de las muertes que se producen anualmente en España son debidas
directa o indirectamente a una enfermedad cardiovascular; la suma del resto de
defunciones producidas por alguna otra enfermedad ni siquiera se aproxima a las tasas
de mortalidad debidas al amplio grupo de las enfermedades cardiovasculares, entre las
que destaca la cardiopatía isquémica3.
Introducción
12
1. La cardiopatía isquémica
La cardiopatía isquémica es una enfermedad del corazón secundaria a una
disminución del calibre de las arterias coronarias que provoca una reducción del aporte
de sangre en el miocardio, con el consiguiente déficit de oxígeno y nutrientes en las
células miocárdicas, fenómeno denominado isquemia3.
En situaciones normales, el miocardio recibe sangre en la que abunda el oxígeno para
evitar la deficiencia de perfusión de los miocitos y la aparición de isquemia. Los
factores determinantes de la necesidad de oxígeno por parte del miocardio son la
frecuencia cardíaca y la contractilidad del miocardio, así como la tensión parietal en
ella. Para que el aporte de oxígeno sea suficiente se requiere que la capacidad de
oxigenación de la sangre sea satisfactoria, así como de un nivel adecuado de flujo
coronario. En promedio, el 75% de la resistencia coronaria total al flujo tiene lugar en
tres grupos de arterias: 1) las grandes arterias epicárdicas; 2) los vasos prearteriolares, y
3) los capilares arteriolares e intramiocárdicos.
La circulación coronaria normal está dominada y controlada por las necesidades de
oxígeno del miocardio. Éstas se satisfacen por la capacidad del lecho vascular coronario
para variar en forma considerable su resistencia vascular coronaria (y por consiguiente
el flujo sanguíneo), mientras el miocardio extrae un porcentaje alto y relativamente fijo
del oxígeno. En condiciones normales, las arteriolas de resistencia intramiocárdica
poseen una inmensa capacidad de dilatación. Por ejemplo, el ejercicio y el estrés
emocional cambian las necesidades de oxígeno, las cuales afectan a la resistencia
vascular coronaria y de esta forma regulan el aporte de oxígeno y sustratos al miocardio
(regulación metabólica). Estos mismos vasos también se adaptan a alteraciones
fisiológicas de la presión arterial con la finalidad de mantener el flujo coronario en
niveles apropiados a las necesidades del miocardio.
La isquemia miocárdica se manifiesta según diferentes síndromes que se pueden
clasificar en síndromes isquémicos agudos o inestables y en síndromes isquémicos
crónicos o estables (Figura 1). El principal síndrome isquémico estable es la angina de
pecho estable; dentro de los síndromes isquémicos agudos se pueden distinguir, entre
otros, la angina inestable y el infarto agudo de miocardio (IAM). Estas enfermedades
afectan principalmente al ventrículo izquierdo (VI), provocando la disminución de la
contractilidad en las zonas afectadas como consecuencia de la necrosis o muerte celular
por la isquemia prolongada.
Introducción
13
Figura 1. Síndromes isquémicos crónicos y agudos
La angina de pecho estable se presenta como un dolor torácico de duración no
prolongada en situaciones que generan un aumento del consumo de oxígeno del
miocardio, por ejemplo, ejercicio físico de grandes o moderados esfuerzos4. Se debe en
general a la formación de placas ateroscleróticas estables. La evolución de la placa está
asociada a procesos de isquemia prolongada, pudiendo inducir el desarrollo de
circulación colateral.
La angina de pecho inestable se presenta como un dolor torácico agudo en
situaciones de ejercicio o reposo y un empeoramiento progresivo en la frecuencia,
intensidad y duración de los episodios en periodos menores de dos meses.
Frecuentemente se engloban bajo este término los procesos clínicos de gravedad
intermedia entre la angina estable y el infarto de miocardio4. Se corresponde a procesos
de rotura de placa y formación de trombosis coronaria en placas inestables. La angina
inestable produce isquemia prolongada, o bien necrosis parciales sin llegar a necrosis
total del territorio perfundido.
El IAM se manifiesta, al igual que la angina inestable, a partir de la rotura de placas
inestables y formación de trombos en la luz arterial. A diferencia de la angina inestable,
la obstrucción del vaso es completa y su desarrollo puede ser muy rápido. Si se produce
una obstrucción total durante un tiempo suficientemente prolongado, el tejido
Introducción
14
miocárdico perfundido por esta arteria sufre necrosis irreversible. Puede producir
fibrilación ventricular, con la consecuente muerte súbita. El inicio de infarto produce un
dolor torácico fuerte que se irradia hacia el cuello, mandíbula, hombro y brazo
izquierdo. A pesar de los grandes avances en el tratamiento del IAM, éste sigue
suponiendo un tercio de la mortalidad de pacientes con enfermedad coronaria5.
Sin embargo, la sintomatología clínica no permite una diferenciación con suficiente
certeza de los diferentes síndromes, por lo que resulta imprescindible la realización
precoz de un electrocardiograma (ECG). Los hallazgos de esta exploración permiten
agrupar a los pacientes en dos grandes bloques: infarto agudo de miocardio con
elevación del segmento ST (IAMEST) e infarto agudo de miocardio sin elevación del
segmento ST.
1.1. Infarto agudo de miocardio con elevación del segmento ST
En el IAMEST los pacientes presentan en el ECG una elevación persistente en
segmento ST, debido a la rotura de la placa inestable o la oclusión por trombos. En el
momento en el que tiene lugar la rotura de una placa se expone al medio externo una
serie de sustancias trombogénicas, de modo que el lumen arterial se obstruye por
completo por una combinación de agregados plaquetarios, fibrina y eritrocitos que en
conjunto producen un trombo que rápidamente ocupa un segmento de la arteria
afectada. La oclusión completa de la arteria coronaria por un trombo da lugar de modo
muy característico a una zona de necrosis que abarca a todo o casi todo el grosor de la
pared ventricular del lecho que irrigaba la arteria afectada de modo que se produce la
típica elevación del segmento ST en el EGC.
Figura 2. Coronariografía de un paciente con IAMEST
Introducción
15
Como ya se ha comentado anteriormente, el IAMEST surge cuando disminuye
repentinamente el flujo de sangre por las arterias coronarias después de que un trombo
ocluyera una de estas arterias afectadas de arteriosclerosis. Esta falta de flujo se pone en
evidencia al realizar una angiografía. En la figura 2 se observa la imagen de una
angiografía de un paciente con IAMEST en la que se advierte la falta de flujo de la
arteria ocluida (flecha).
La arterosclerosis implica la formación de lesiones en arterias que se caracterizan por
la acumulación de lípidos, inflamación, muerte celular y fibrosis6. Con el tiempo, estas
lesiones que se conocen como placas de ateroma, maduran y ganan nuevas
características. Al crecer la placa, la luz de las arterias se reduce disminuyendo la
cantidad de sangre que llega al miocardio. Esta reducción del volumen de sangre
implica un aporte insuficiente de flujo produciendo isquemia.
En la figura 3 se muestra una imagen en la que se observan dos cortes de arterias
coronarias de pacientes con placa de ateroma estable (A) e inestable (B).
Figura 3. Placas de ateroma en una arteria coronaria
La formación de estos depósitos tiene una relación directa con los llamados factores
Introducción
16
de riesgo que se pueden clasificar en modificables o no. Estos últimos son aquellos
como: edad, sexo y factores hereditarios. Los factores de riesgo modificables7 son
aquellos que actuando sobre ellos se puede cambiar el curso de la cardiopatía
isquémica, como lo son:
Tabaquismo
Hipercolesterolemia
Hipertensión arterial
Diabetes
Obesidad
La severidad del daño en el miocardio originado por la oclusión de la arteria
coronaria se determina mediante el tamaño del infarto, y éste depende de: 1) el territorio
que riega el vaso afectado; 2) el hecho de que haya o no oclusión total de dicho vaso; 3)
la duración de la oclusión coronaria; 4) la cantidad de sangre que aportan los vasos
colaterales al tejido afectado; 5) la demanda de oxígeno por parte del miocardio, cuyo
aporte de sangre sufrió menoscabo repentino; 6) factores naturales que pueden producir
lisis temprana y espontánea del trombo ocluyente, y 7) la adecuación del riego al
miocardio en la zona infartada cuando se restaura el flujo de sangre en la arteria
coronaria epicárdica ocluida8, 9
.
La evolución de infarto de miocardio incluye tres fases cronológicas: 1) aguda
(primeras horas a siete días): 2) recuperación o curación (siete a 30 dias); 3)
cicatrización (más de 30 días)10
.
Al evaluar los resultados de los métodos diagnósticos en el caso de IAMEST, hay
que tomar en consideración la fase cronológica del propio infarto. Los métodos de
laboratorio útiles para confirmar el diagnostico se dividen en tres grupos: 1) ECG; 2)
marcadores cardiacos en suero; 3) imagen cardiaca.
En la fase inicial de la etapa aguda, la oclusión total de una arteria epicárdica
produce elevación del segmento ST. La mayoría de los pacientes con IAMEST
desarrollan una serie de cambios electrocardiográficos. Muchos pacientes que tienen
como manifestación inicial la elevación del segmento ST, evolucionan y al final
presentan ondas Q en el ECG. Sin embargo, existen numerosos factores que limitan la
capacidad del ECG para diagnosticar y localizar el IAM, tales como la extensión del
daño miocárdico, la antigüedad del infarto, su localización, presencia de infartos previos
o pericarditis, cambios en las concentraciones de electrolitos y administración de
Introducción
17
fármacos arritmogénicos. Los cambios en el segmento ST y ondas T pueden ser
inespecíficos. Por lo que actualmente se recomienda realizar ECG seriados, de modo
que puedan ayudar a diferenciar estas condiciones de un IAMEST11
.
El tejido necrótico ya después del IAMEST libera a la sangre grandes cantidades de
proteínas llamadas marcadores cardíacos. Las troponinas T e I cardioespecíficas poseen
secuencias de aminoácidos diferentes a las isoformas de las mismas proteínas en el
músculo estriado. Después de un IAMEST estas proteínas pueden alcanzar un nivel de
hasta 20 veces mayor que el limite superior de referencia. Por tanto , la medición de las
troponinas cardiacas es de enorme utilidad diagnóstica y en la actualidad son los
marcadores preferidos de IAM. La medida de los niveles de troponinas especificas tras
varios días del infarto, incluso en casos de reperfusión completa, puede proporcionar
una estimación aproximada del tamaño del infarto ya que esos cambios de los niveles de
troponinas reflejan la liberación de del reservorio total de proteínas unidas a los
filamentos de los miocitos dañados12
.
La isoenzima MB de creatin quinasa (CK-MB) también es especifica de daño
miocárdico. La estimación del tamaño del infarto mediante el análisis de marcadores
cardiacos en suero requiere una recopilación de la cantidad de marcador perdida en el
miocardio y su tasa de liberación. Las determinaciones seriadas de proteínas liberadas
por el miocardio necrótico ayudan a determinar el tamaño del infarto. De modo clínico,
el pico de CK-MB puede aportar una estimación aproximada del tamaño del infarto y se
usa habitualmente como diagnóstico13
.
Sin embargo, la técnica de referencia para la cuantificación del tamaño del infarto es
la resonancia magnética cardiaca (RMC) de alta resolución, concretamente mediante
una técnica conocida como de contraste tardío. Se administra un agente corriente como
el gadolinio y se obtienen imágenes después de un lapso de espera de hasta 10 min. En
el miocardio normal hay poca penetración de gadolinio porque los miocitos están
perfectamente agrupados, pero dicho mineral penetra en la región intercelular expandida
en la zona del infarto y se advierte una señal brillante en zonas de infarto, en contraste
neto con las áreas oscuras del miocardio normal.
Además de la localización y determinación del tamaño del infarto, la RMC permite
la evaluación de la perfusión de tejido miocárdico infartado y no infartado, así como el
reperfundido de modo muy temprano. También permite identificar, entre otros, las áreas
dañadas pero no infartadas, el edema miocárdico, la fibrosis, el grosor de la pared
cardiaca y la hipertrofia. Así como la evaluación del tamaño ventricular, del
Introducción
18
movimiento de la pared y la transición temporal entre isquemia e infarto14
.
La figura 4 muestra imágenes de RMC de un mismo paciente con IAMEST, las
flechas indican el área infartada. Las figuras de la parte superior corresponden a
imágenes tomadas a partir de secuencias de cine. Estas secuencias permiten evaluar la
función cardiaca, así como la cuantificación de los volúmenes telediastólico (Figura 4A)
y telesistólico (Figura 4B). Las imágenes de la parte inferior de la figura corresponden
a secuencias de perfusión de primer paso (Figura 4C) y captación tardía de gadolinio
(Figura 4D) para evaluar el tamaño del infarto y la obstrucción microvascular (OMV)
respectivamente.
Figura 4. Imágenes de RMC de un paciente con IAMEST
La RMC de contraste permite detectar el infarto de modo muy preciso. La extensión
transmural de la captación de gadolinio en regiones donde el miocardio es disfuncional,
predice de modo muy preciso la posibilidad de recuperación de la contractilidad del
miocardio tras la revascularización coronaria por procedimientos mecánicos. Además
de la detección del infarto esta técnica puede caracterizar la presencia y la extensión de
la OMV tras un IAM, que asimismo está correlacionado con un peor pronóstico post-
infarto15
.
Realizar un tratamiento del IAMEST es de suma importancia y cuanto antes se re-
abra la arteria coronaria, tanto el tamaño del infarto como la mortalidad disminuyen. En
Introducción
19
la actualidad, varias organizaciones y sociedades científicas elaboran guías11
y
documentos para seleccionar la estrategia más adecuada para el manejo y tratamiento
del paciente con IAMEST. Estas estrategias incluyen la reperfusión mediante
angioplastia primaria o la reperfusión mediante fármacos fibrinolíticos (Figura 5).
Figura 5. Diagrama de las estrategias de reperfusión
El tratamiento fibrinolítico tiene como fin potenciar la trombólisis (disolución del
trombo) mediante la restauración de la circulación coronaria. Está dirigido a la
disolución o del trombo más que a la causa de la trombosis. Los fármacos fibrinolíticos
se deben administrar siempre con fármacos antiagregantes, con el fin de disminuir el
riesgo de re-trombosis y re-oclusión después de la fibrinólisis16
.
La angioplastia primaria es la técnica de elección en la actualidad, para conocer la
extensión de la obstrucción arterial se hace uso del cateterismo cardiaco. Para su
realización se utiliza anestesia local en las áreas cutáneas donde se va a efectuar la
punción arterial. Se introducen unos catéteres muy finos en el torrente sanguíneo a
través de una de las arterias, después los catéteres avanzan hasta el corazón gracias a la
ayuda de la imagen por rayos X. La presión de las cavidades se mide a través de un
catéter con un transductor para la monitorización de las constantes vitales conectado
externamente mediante conectores que permiten purgar el catéter, y se hacen avanzar
hasta el origen de las arterias del corazón. Una vez allí, se introduce a través del catéter
3. Conceptos Fisiológicos Básicos
41
Figura 3.9. Diagrama de las estrategias de reperfusión [ 12]
El tratamiento fibrinolítico tiene como fin potenciar la trombólisis
(disolución del trombo), restaurando la circulación coronaria. Está dirigido
a la disolución o del trombo más que a la causa de la trombosis. Los
fármacos fibrinolíticos se deben administrar siempre con fármacos
antiagregantes, con el fin de disminuir el riesgo de retrombosis y re-
oclusión después de la fibrinólisis [12].
La angioplastia primaria es la técnica de elección en la actualidad,
para conocer la extensión de la obstrucción arterial se hace uso del
cateterismo cardiaco. Para su realización se utiliza anestesia local en las
zonas de piel donde se va a efectuar la punción arterial. Se introducen
unos catéteres muy finos en el torrente sanguíneo a través de una de las
arterias (figura 3.10), después los catéteres avanzan hasta el corazón
gracias a la ayuda de la imagen por rayos X. La presión de las cavidades se
mide a través de un catéter con un transductor para la monitorización de
las constantes vitales conectado externamente mediante conectores que
permiten purgar el catéter, y se hacen avanzar hasta el origen de las
arterias del corazón. Una vez allí, se introduce a través del catéter un
Introducción
20
un contraste radiopaco en las arterias coronarias que hace visible la sangre con el equipo
radiológico y permite delinear la trayectoria y el tamaño de las arterias coronarias,
proporciona información sobre la ubicación y el grado de cualquier anomalía coronaria.
El flujo de las arterias se calcula con una escala llamada Thrombolysis In Myocardial
Infarction (TIMI), y está dividida en 4 grados, TIMI 0: oclusión completa de la arteria;
TIMI 1: débil flujo con llenado incompleto; TIMI 2: flujo lento con llenado completo y
TIMI 3: flujo normal.
Como ya se ha indicado anteriormente el tiempo de reperfusión es un elemento clave
para la recuperación de miocardio isquémico. Cuanto mayor es el tiempo de
reperfusión, mayor será el tamaño del infarto. Existe una ventana temporal en la que si
se reperfunde el miocardio a tiempo se puede salvar un alto porcentaje de la masa
ventricular afectada.
Sin embargo, paradójicamente, la restauración del flujo coronario no sólo es el
tratamiento de referencia para el IAMEST, si no que en ocasiones, la apertura de la
arteria puede exacerbar el daño producido por la isquemia y aumentarlo en la
reperfusión. Este fenómeno se conoce como el daño por isquemia-reperfusión17
y
genera una respuesta inmune.
2. La respuesta inmune en el IAMEST
La función principal de nuestro sistema inmune es la de protegernos contra las
infecciones y agresiones. Está compuesto por células y moléculas con una habilidad
especial para distinguir lo propio de lo ajeno, y eliminar estas sustancias extrañas. El
sistema inmune está organizado en dos líneas de defensa: la inmunidad innata y la
inmunidad adaptativa, ambas cooperan de manera eficiente y permiten la comunicación
célula-célula mediante receptores de superficie y mediante la secreción de mensajeros
solubles denominados citoquinas. La respuesta innata estimula y modula la respuesta
adaptativa, y la respuesta adaptativa potencia la actividad de la respuesta innata.
A pesar de que originalmente se pensó que el sistema inmune estaba diseñado para
proteger el organismo frente a amenazas exógenas y no-propias, existen numerosas
evidencias que indican que el sistema inmune se alerta cuando se produce daño en un
tejido sin producirse herida externa, la denominada “herida estéril”, con la consecuente
liberación de antígenos endógenos18, 19
.
Introducción
21
El papel del sistema inmune en el desarrollo de la enfermedad cardiovascular se hizo
evidente por primera vez cuando el patólogo alemán Rudolf Virchow sugirió en 1882
que el mecanismo que podía originar la aterosclerosis era un proceso inflamatorio.
Virchow planteó que existían una serie de factores “irritantes” que eran capaces de
afectar a la vasculatura de modo que ésta atraía sustancias de la sangre y las retenía20
.
De modo más específico, estos “irritantes” atraen a los leucocitos a la lesión
aterosclerótica. Posteriormente a finales de los años ochenta surgieron los primeros
trabajos que describían la presencia de células del sistema inmune en las lesiones de
aterosclerosis21, 22
. Desde entonces, la mayoría de investigaciones se han centrado en
describir la respuesta inmune que acontece durante la formación de la aterosclerosis,
pero no han prestado excesiva atención a lo que ocurre una vez un trombo se ha
formado y se produce el IAM.
En el IAMEST, la oclusión de una arteria coronaria importante conduce a isquemia y
potencialmente a muerte celular en toda la región anatómica irrigada por esa arteria (lo
que se conoce como área en riesgo) más pronunciada en el subendocardio. El resultado
de la muerte celular dependerá en gran parte de la duración de la privación de flujo.
La principal consecuencia bioquímica precoz de la isquemia miocárdica es la
interrupción de la glicólisis aerobia en cuestión de segundos, lo cual conduce a la
producción de fosfatos ricos en energía, como el creatin fosfato y adenina trifosfato
(ATP) y a la acumulación de productos catabólicos potencialmente perjudiciales, como
el ácido láctico. La función miocárdica es extremadamente sensible a la isquemia
intensa; se produce una pérdida notable da la contractilidad dentro de los 60 segundos
siguientes al comienzo de la isquemia. Esta pérdida puede precipitar la insuficiencia
cardíaca aguda mucho antes que la muerte de las células miocárdicas. También se
desarrollan cambios ultraestructurales (Figura 6), entre ellos relajación miofibrilar,
agotamiento del glucógeno, tumefacción celular y mitocondrial, todo ello pocos
minutos después del comienzo de la isquemia.
A pesar de todo, los cambios precoces son en potencia reversibles y la muerte celular
no se produce de modo inmediato. Como se ha demostrado experimentalmente, sólo la
isquemia intensa de al menos 20 a 40 minutos conduce a daño irreversible (necrosis) de
algunos miocitos cardíacos23
. La evidencia ultraestructural de lesión irreversible de los
miocitos (defectos estructurales primarios en la membrana del sarcolema) sólo aparece
después de 20 a 40 minutos de isquemia intensa del miocardio. En caso de isquemia
prolongada se produce además lesión de la microvasculatura.
Introducción
22
Figura 6. Imagen de miocroscopía electrónica de miocardio tras 6h de isquemia. La
flecha señala un cardiomiocito necrótico.
Así pues, las necrosis miocárdica comienza alrededor de 30 minutos después de la
oclusión coronaria. El mecanismo predominante de muerte celular es el denominado
necrosis coagulativa. Sin embargo, estudios recientes indican que otros mecanismos
podría jugar un papel importante en la muerte celular post-infarto, tal es el caso de la
apoptosis24
y la autofagia25
.
En contraste, si la restauración del flujo sanguíneo miocárdico (conocida como
reperfusión) se realiza del modo más temprano posible se puede evitar la pérdida de
viabilidad celular. Esta posibilidad proporciona la base racional para la detección clínica
muy precoz del IAMEST, para permitir la administración temprana de tratamientos
como la trombólisis, conseguir la reperfusión del área en riesgo, salvar la mayor
cantidad posible de miocardio isquémico pero todavía no muerto y minimizar de ese
modo el tamaño del infarto.
En determinadas circunstancias, tales como la reperfusión de la arteria coronaria
afectada tras un IAMEST, cuando el riego sanguíneo se restaura en las células que
previamente han estado sometidas a isquemia pero no han muerto, la lesión se exacerba
con frecuencia y se prosigue a ritmo acelerado.
El mecanismo descrito por el daño por reperfusión consiste en que al disponer las
células nuevamente de oxígeno se restablece la síntesis de ATP, esta molécula afecta a
las mitocondrias que habían resultado dañadas porque se encuentra alterado el proceso
oxidativo dando lugar a una sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (ROS)26
.
Durante los primeros minutos de la reperfusión se producen cambios dramáticos en
Introducción
23
la homeóstasis catiónica. El lavado extracelular de H+ y la actividad del intercambiador
Na+/H
+ y cotransportador Na
+/HCO3
- permite una rápida corrección de la acidosis
intracelular. Tras periodos breves de isquemia, la concentración intracelular de Na+ sólo
se encuentra moderadamente elevada y puede retornar rápidamente a los valores basales
con la inmediata reactivación de la Na+/K
+-ATPasa.
Sin embargo, después de periodos prolongados de isquemia, la concentración de Na+
permanece elevada durante minutos debido a una entrada adicional de Na+ a través del
intercambiador Na+/H
+ y cotransportador Na
+/HCO3
- asociada a la corrección de pH y a
la inhibición transitoria de la Na+/K
+-ATPasa.
Figura 7. Daño por isquemia-reperfusión. Adaptado de Yellon et al26
A esto hay que añadir la entrada masiva de Na+ que se produce a través de uniones
tipo gap desde cardiomiocitos adjacentes que han sufrido hipercontractura y rotura de la
membrana sarcolemal (Figura 7).
Introducción
24
De manera inmediata a la restauración de la disponibilidad de oxígeno, se reactiva la
Ca2+
-ATPasa ligada al retículo sarcoplasmático, que a su vez liberará más calcio al
citoplasma y se producirá una activación exagerada y de forma sostenida de la actividad
contráctil causando un acortamiento celular irreversible que daña las estructuras del
citoesqueleto. Esta incontrolada contracción del cardiomiocito dependiente del aumento
de calcio se denomina hipercontractura17
.
La necrosis por isquemia-reperfusión del miocardio es un evento progresivo. La
lesión irreversible de los miocitos necróticos comienza en la zona subendocárdica. Con
la isquemia más prolongada, el frente de muerte celular avanza a través del miocardio
para afectar a una proporción cada vez mayor del grosor transmural en la zona
isquémica.
La necrosis se completa en gran parte dentro de las 6 primeras horas, en modelos
experimentales y humanos, con afectación de casi todo el lecho miocárdico isquémico
en riesgo irrigado por la arteria coronaria ocluida.
Tras un IAM, la necrosis repentina de un gran número de cardiomiocitos da lugar a
la liberación de contenido intracelular que produce una reacción inflamatoria27
. La fase
inicial de la respuesta inflamatoria tras un insulto isquémico en el miocardio está
caracterizada por la activación y reclutamiento leucocitario, así como la producción de
citoquinas28
. Tras los primeros segundos del infarto, el flujo coronario se altera debido a
microembolismos, activación plaquetaria, “plugging” de neutrófilos y disfunción
endotelial, dando lugar a la OMV29
.
En paralelo se inicia una liberación de citoquinas seguida de activación de
neutrófilos, lo que causa daño directo a las células endoteliales mediante la producción
de ROS, proteasas, más citoquinas y lípidos30
. Como consecuencia las células
endoteliales incrementan la expresión de moléculas de adhesión, lo que facilitará la
unión de leucocitos. Además, las uniones intercelulares se ven comprometidas lo que
aumentará la permeabilidad vascular, con posibles consecuencias cardíacas tales como
el edema miocárdico31
. Una excesiva muerte celular y degradación de la matriz por
parte de enzimas proteolíticos puede comprometer la estructura del miocardio infartado
y dar lugar posteriormente a un mal remodelado cardiaco.
Durante la pasada década, han surgido numerosas evidencias que indican que la
respuesta inflamatoria en la isquemia cardíaca es un proceso muy bien orquestado.
Sabemos que esta respuesta se inicia por el daño al miocardio. Los cardiomiocitos
estresados liberan citoquinas y sintetizan proteínas de novo tras el infarto. Las porciones
Introducción
25
hidrofóbicas de las proteínas y lípidos de los cardiomiocitos forman parte de lo que se
conoce como patrones moleculares asociados a peligro (DAMPs) que activan a los
leucocitos, un concepto clave en el modelo de peligro de la inmunidad.
2.1. El modelo del peligro
El modelo del peligro “the danger model” fue descrito por primera vez por Polly
Matzinger en 1994 y proporcionó un marco teórico que explicaba las respuesta inmune
que tenía lugar tras el daño tisular sin infección32
. En el modelo clásico de inmunidad, el
sistema inmune se caracteriza por su función para discriminar lo propio de lo no propio
desde las etapas más tempranas del desarrollo del organismo. Sin embargo, el modelo
tradicional fallaba al explicar porqué el sistema inmune reaccionaba de modo distinto
frente a “lo propio” en ocasiones posteriores, tales como las enfermedades autoinmunes
o el desarrollo de cáncer. El modelo de peligro, en lugar de afirmar que el sistema
inmune discrimina entre “lo propio” (por ejemplo moléculas propias del organismo) y
lo “no propio” (por ejemplo patógenos externos), afirma que el organismo reacciona
frente a señales de alarma o DAMPS, estas señales pueden provenir de organismos
patógenos externos o de células del propio organismo. El modelo del peligro inicia la
investigación en la búsqueda de activadores endógenos de la respuesta inmune y de sus
receptores.
Los receptores tipo toll (TLR) son receptores que reconocen moléculas producidas
como resultado de un daño celular entre otros. Estos receptores han ganado mucha
atención en la activación del sistema inmune innato activado por DAMPS y la
consecuente inflamación por daño celular, como por ejemplo, la isquemia cardiaca33
.
Sin embargo, los mecanismos mediante los cuales se controla la activación leucocitaria
por los DAMPS y que podrían ser posibles dianas terapéuticas para modular las
respuestas inflamatorias permanecen desconocidos.
El miocardio postisquémico y reperfundido se caracteriza por una serie de eventos
celulares con efectos perjudiciales. Los productos derivados de la muerte celular pueden
actuar como DAMPS sobre la células miocárdicas adyacentes y producir la migración
celular de células inmunes tras la isquemia cardiaca (Figura 8). Estudios recientes han
identificado numerosas moléculas candidatas a ser posibles DAMPS, tal es el caso de la
proteína de choque térmico 60 (HSP 60), liberada por las células necróticas, que activa
Introducción
26
el receptor TLR-4 de macrófagos34
.
Figura 8. Producción de DAMPS tras el IAMEST. Adaptado de Arslan et al35
Otros posibles candidatos son: la proteína HMGB1, que se libera de modo pasivo en
el entorno extracelular de las células necróticas y produce respuestas inmunes
deletéreas36
; proteínas extracelulares como el ácido hialurónico y la fibronectina37
; o
bien proteínas cardiacas como la troponina o la miosina cardiaca38
.
Las DAMPS secretadas por las células dañadas activan a los receptores TLR e
inician una respuesta inmune innata.
2.2. Respuesta inmune innata en el IAMEST
La respuesta inmune innata en el IAM se produce de modo secuencial y muy bien
orquestado. Comenzando por los componentes humorales de la respuesta inmune
innata, tales como las proteínas del complemento, las moléculas DAMPs, la generación
de ROS, las citoquinas inflamatorias y las hormonas de estrés. Continuando por los
componentes celulares de la respuesta inmune innata como los granulocitos neutrófilos,
los monocitos y los linfocitos natural killers (NK). Sin olvidar la participación de las
células residentes como los cardiomiocitos, fibroblastos y células endoteliales que
debido a sus receptores de reconocimiento de patrones moleculares también alertan al
sistema inmune del daño inminente producido por el infarto.
En primer lugar, la liberación de componentes subcelulares debido a la rotura de
membranas da lugar a la activación de la cascada del complemento. Hace más de 40
Introducción
27
años atrás Hill y Ward observaron la hidrólisis de la proteína del complemento C3 en el
miocardio infartado e identificaron el papel que juega el complemento en la infiltración
de leucocitos39
. Durante las dos décadas siguientes, estudios experimentales mostraron
que la inhibición del complemento atenuaba la respuesta inflamatoria post-infarto40
,
incluso reducía el tamaño del infarto41
, sin embargo los ensayos que se realizaron
posteriormente en humanos no consiguieron los mismos efectos, incluso llegaron a ser
perjudiciales42
.
A continuación, las liberación de DAMPS por las células necróticas estimula la
activación de receptores TLR en las células del miocardio. De entre los 13 tipos de TLR
que se conocen actualmente destaca el TLR-4 como receptor clave en la mediación de la
respuesta inmune en el corazón infartado43
. Paralelamente, la producción de ROS por
parte del tejido isquémico también promueve una cascada inflamatoria. Concretamente,
la generación de ROS activa cascadas de citoquinas y quimioquinas mediante la
activación del inflamasoma, un complejo proteico receptor presente en numerosas
células, entre ellas las células del miocardio infartado44
. La formación del inflamasoma
resulta en la producción de interleuquina 1 beta (IL-1), que es una citoquina pro-
inflamatoria que dirige la expresión de otros mediadores inflamatorios durante las
primeras fases del infarto45
. Otro componente humoral de la respuesta inmune innata
que no hay que olvidar son las hormonas de estrés, tales como catecolaminas y el eje
angiotensina/aldosterona que también modulan la respuesta inmune, sin embargo tienen
mayor participación en los procesos reparativos y de fibrosis que tienen lugar en la fase
crónica del infarto.
Los tipos celulares responsables de la iniciación de la reacción inflamatoria todavía
no se han definido del todo. Sin embargo, existen evidencias que indican que los
fibroblastos residentes del tejido cardiaco, podrían servir de células centinela mediante
la detección de la isquemia y daño a cardiomiocitos y producir citoquinas inflamatorias
y quimiocinas46
. Las células microvasculares también son una fuente importante de
proteínas inflamatorias, la activación endotelial y la expresión de moléculas de adhesión
tales como selectinas y la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) es un paso
crucial para la adhesión y reclutamiento de los leucocitos47
, mientras que la producción
de quimioquinas por parte de la células endoteliales en la zona adyacente al infarto,
también ha sido documentada en modelos experimentales de infarto48
.
Otro tipo celular con un papel potencial en la iniciación de la respuesta inflamatoria
es el mastocito cardiaco. Localizados de modo estratégico en el espacio perivascular,
Introducción
28
los mastocitos contienen grandes cantidades de mediadores pre-formados, tales como
histamina o el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-) y son capaces de sintetizar
citoquinas y factores de crecimiento. En el miocardio infartado los mastocitos se
degranulan rápidamente en respuesta a la activación por el complemento, adenosina o
ROS y liberan su contenido granular, contribuyendo a la iniciación de la respuesta
inflamatoria post-infarto49
.
La activación de los receptores TLR, el inflamasoma y las cascadas del complemento
estimulan la señalización del factor nuclear kappa B (NF-kB) en las células endoteliales
y fibroblastos, lo cual promueve la expresión de moléculas de adhesión y quimiocinas.
La inmovilización de quimiocinas y moléculas de adhesión genera un gradiente
quimiotácico que promueve la movilización y extravasación de leucocitos al miocardio
infartado, los primeros leucocitos que se encuentran en el área dañada por el infarto son
los neutrófilos.
En ausencia de inflamación, los neutrófilos raramente interaccionan con la pared
vascular. Una vez se dispara el estímulo inflamatorio, se promueve el rodamiento y
anclaje de neutrófilos a la pared vascular por medio de moléculas de adhesión
denominadas selectinas, tales como L-selectina, E-selectina y P-selectina tras el anclaje
los leucocitos extravasan la pared vascular y penetran en los tejidos50
. Para los
neutrófilos, la adhesión firme requiere la activación de la integrina β2, también
conocida como CD18 y que ésta se una a ICAM-1. La migración transendotelial va
seguida de daño directo sobre las células del parénquima mediante la liberación de
productos tóxicos específicos35
. Las alteraciones patológicas que se asocian de modo
más significativo con la acumulación de neutrófilos en el IAM son el daño en el
miocardio y la OMV. Los neutrófilos son células grandes que se adhieren al endotelio
capilar y lo obstruyen de modo que evitan la reperfusión de los capilares tras la
trombólisis o la angioplastia primaria51
. Los neutrófilos son los primeros leucocitos que
se encuentran en el área dañada del miocardio infartado y son retirados del tejido
miocárdico tras fagocitar los restos celulares. Por otro lado, los monocitos migran de los
capilares a los espacios extravasculares y se transforman en macrófagos e incrementan
en número a los neutrófilos dos o tres días tras el episodio agudo. Las citoquinas
segregadas por los macrófagos estimulan la proliferación de fibroblastos y la
producción de colágeno y promueven la monocitosis.
Los macrófagos y los monocitos sintetizan y segregan una gran variedad de factores
humorales que incluyen TNF-α e interleuquina 6 (IL-6), que es el principal estímulo
Introducción
29
para la producción de la proteína C reactiva en el hígado. De entre todos los marcadores
de inflamación estudiados en pacientes con síndromes coronarios agudos, la proteína C
reactiva es el más ampliamente investigado52
. Estudios previos han demostrado que un
incremento en el número de monocitos circulantes en sangre relacionaba con una falta
de reperfusión o reperfusión deteriorada. Además, el recuento de monocitos se asoció
independientemente con una recuperación de la función sistólica en 6 meses. Lo cual
sugiere la importancia de la participación de los monocitos en el proceso de reparación
una vez la fase hiper-aguda se ha completado53
.
2.3. Respuesta inmune adaptativa en el IAMEST
Paralelamente al inicio de la respuesta inmune innata, en el tejido circundante al
daño celular, las células dendríticas inmaduras fagocitan los restos celulares, procesan el
antígeno, maduran y lo exponen en sus moléculas de histocompatibilidad de clase II
junto con los correceptores CD80/CD86. A continuación las células dendríticas migran
a los órganos linfoides secundarios (como ganglios linfáticos) y allí se lo presentarán a
los linfocitos T colaboradores vírgenes (Th0). En el desarrollo de la enfermedad
coronaria se han identificado células dendríticas circulantes vasculares que están
implicadas en la identificación de DAMPS y desarrollan la respuesta celular posterior54
.
Los linfocitos T son las células mas versátiles del organismo. Los linfocitos T
precursores se forman en la médula ósea y entran en el timo, donde maduran y son
sometidos a selección negativa y positiva para producir los denominados linfocitos
CD4+ y CD8
+. Los linfocitos CD4
+ reconocen antígenos presentados en moléculas del
complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de tipo II, es decir presentados por
células presentadoras de antígeno (CPA) profesionales y tienen funciones muy diversas
en el sistema inmune periférico, tales como linfocitos los T colaboradores (los linfocitos
Th1 median la respuesta inmune celular y los linfocitos Th2 median la respuesta inmune
humoral) o los linfocitos T reguladores (Treg), los cuales suprimen la respuesta inmune.
Los linfocitos CD8+ reconocen antígenos presentados en MHC de clase I, es decir en
todas las células del organismo y son citotóxicos para una gran variedad de dianas
celulares.
Los linfocitos T permanecen en los órganos linfoides secundarios hasta que
encuentran señales activadoras, tales como un antígeno que es presentado por una CPA.
Introducción
30
En el momento en el que se les presenta el antígeno, se activan y adquieren la capacidad
de llegar a los sitios de la inflamación.
Dependiendo de las citoquinas que se liberen en ese momento, los linfocitos Th0 se
diferenciarán en linfocitos T colaboradores 1 (Th1) o linfocitos T colaboradores 2 (Th2),
por ejemplo si se produce un aumento de interleuquina 12 (IL-12) la diferenciación de
Th0 se realizará en Th1, y si se produce un aumento de la interleuquina 4 (IL-4) la
diferenciación se realizará a favor de Th2. Dada la naturaleza del antígeno y las
citoquinas liberadas en el IAM, se ha hipotetizado que podría tener lugar un
desequilibrio de la balanza hacia la respuesta celular mediada por Th155
.
Los linfocitos Th1 migran a la zona del infarto y allí liberan citoquinas como el
interferón gamma (IFN-γ) o el TNF-α que son pro-inflamatorias y amplificarán toda
esta señal inflamatoria previa. Los linfocitos Th2 que se hayan diferenciado también
migrarán a la zona infartada y liberarán citoquinas como IL-4 o interleuquina 10 (IL-
10), ésta última frena la acción de Th1 para mitigar la reacción inflamatoria56
.
La figura 9 muestra parte de la extensa diversidad linfocitaria T que existe y está
descrita por el momento, así como algunos de los marcadores antigénicos que nos
permiten identificar los distintos subtipos de linfocitos57-59
.
Figura 9. Diversidad de linfocitos
Linfocito nTreg
Linfocito iTreg
Linfocito Th17
Linfocito Th1
Linfocito Th2
Linfocito ThF
CPA Linfocito Tc
Naive
CD
8C
D45
RA
CD62L
CCR7
CD
3
Linfocito Tc
Activado
CD
8
HLA
-DR
CD
3
Activación mediante
presentación de antígeno a
través del MHC Clase I
Unión al TCR + IL2
CPA Linfocito Th
Naive
CD
4C
D45
RA
CD62L
CCR7
CD
3
Linfocito Th
Activado
CD
4
HLA
-DR
CD
3
Activación mediante
presentación de antígeno
a través del MHC Clase II
Unión al TCR + IL2
CD
4C
XC
R3
CD
3
CC
R5
CD
4C
CR
4
CD
3
CD
4
CD
3
CC
R6
CD
4C
XC
R5
CD
3C
D4
CD
25 h
i
CD
3
CTLA
4
CD
4C
D25
hi
CD
3
CD
45R
A
HLA
-DR
IL-2
, IL-
12
IL-2, IL-4, IL
-33
TGF-b, IL-6, IL-23, IL-1b
IL-21, IL-6TGF-b, IL-2, Ácido retinoico
IFN-g
Perforina
Granzima
IFN-g
TNF-a
IL-4
IL-5
IL-13
IL-17A
IL-17F
TNF-a
IL-21
TGF-b
IL-10
TGF-b
IL-10
Introducción
31
Además, en los órganos linfáticos hay otra población de linfocitos T que se va a
diferenciar a partir de la presentación antigénica por parte de las células dendríticas,
estos son los linfocitos Treg. Estos linfocitos que se diferencian en los órganos linfoides
secundarios gracias a la coestimulación de las moléculas correceptoras CD80/CD86 de
las células dendríticas y la liberación por parte de éstas de IL-10, se denominan Treg
naturales por generarse en estos órganos. Los Treg también migrarán a la zona infartada
y liberarán citoquinas que regularán la inflamación hacia la supresión de ésta, allí
liberarán IL-10 y factor de crecimiento transformante beta (TGF-β)60
.
Recientemente, nuevos linajes de linfocitos T CD4+ se han identificado: como los
linfocitos Th17, Th22 o Th9.
Los linfocitos Th17 se caracterizan por producir la citoquina inflamatoria
interleuquina 17 (IL-17) al parecer inducida por la presencia de TGF-β e IL-6 o por
interleuquina 23 (IL-23)61
. Su presencia ha sido caracterizada en diversas enfermedades
autoinmunes como la artritis reumatoide, aunque hasta el momento no existen
evidencias claras de su presencia en aterosclerosis y enfermedad coronaria aguda62
.
Los linfocitos Th22, que se caracterizan por la producción de interleuquina 22 (IL-22)
pero no de IFN- o IL-17, han sido descritos junto con los Th17 en distintas
enfermedades auto-inmunes crónicas, tales como psoriasis63
o artritis reumatoide64
. Sin
embargo tampoco existen evidencias claras de su presencia en aterosclerosis o
enfermedad coronaria aguda65
.
Por último los linfocitos Th9, se caracterizan por la producción de interleuquina 9
(IL-9) y se piensa por el momento que derivan de los linfocitos Th2 en presencia de
TGF-66
. Sin embargo no existen evidencias previas que los relacionen en ninguna
enfermedad cardiovascular.
La contribución de la respuesta adaptativa en el IAM ha estado durante mucho
tiempo relegada a un segundo plano detrás de la respuesta inmune innata. En primer
lugar, debido a que la infiltración de linfocitos en el miocardio se ha considerado como
un evento poco habitual, y como consecuencia de ello existen pocos estudios
experimentales que estudien la participación de linfocitos en el infarto. Y en segundo
lugar, a primera vista, la activación de linfocitos contradice la noción clásica de que la
inmunidad adaptativa no se estimula por auto-antígenos. Sin embargo, existen
numerosas evidencias tanto clínicas como experimentales que implican la activación de
células del sistema inmune adaptativo tras un IAM. Se realizaron estudios in vivo que
demostraron que los esplenocitos de ratas infartadas presentaban un subtipo de
Introducción
32
linfocitos CD8 con actividad citotóxica in vitro frente a cardiomiocitos67
.
Otra línea de evidencia se origina a partir de los modelos animales de miocarditis
autoinmune creados a partir de linfocitos T específicos para proteínas miocárdicas, de
modo que la inmunización con péptidos derivados de troponina o miosina cardíacas y
de la transferencia de células dendríticas cargadas con estos péptidos, podrían inducir
miocarditis en una cepa de ratones susceptible a padecerla68
. En pacientes con
enfermedad coronaria, existe un aumento de la prevalencia de anticuerpos frente a las
proteínas contráctiles69
.
La presencia de linfocitos B en el infarto es muy significativa, de modo que se ha
identificado que los linfocitos B podrían favorecer la infiltración de monocitos tanto en
modelo experimental como en pacientes con IAM70
.
Por otro lado también se ha descrito la interacción de los linfocitos B con las
plaquetas, muy activadas en el IAMEST. Las plaquetas pueden estimular directamente
la proliferación y la producción de anticuerpos por parte de los linfocitos B mediante
contacto celular directo a través de los receptores CD40-CD40L71
. Las plaquetas no
sólo estimulan el cambio de isotipo en el linfocito B por medio del contacto célula-
célula, sino que también de modo remoto mediante la liberación de CD40L soluble. La
presencia de CD40L soluble en pacientes con IAMEST es muy elevada de modo que
los linfocitos B se activan y cambian de un isotipo IgM a IgG y se convierten en células
plasmáticas productoras de anticuerpos. Y ya que la producción de anticuerpos por los
linfocitos B normalmente requiere de la activación de linfocitos T CD4 , se ha sugerido
que éstos podrían activarse por autoantígenos liberados durante el daño por isquemia
reperfusión. De este modo distintos estudios han mostrado la activación de linfocitos T
activados con un desequilibrio funcional de Th1 frente a Th2 y de Th17 frente a Treg en
pacientes con síndrome coronario agudo72, 73
.
3. Desregulación de la respuesta inmune en el IAMEST
Existe una correlación entre el grado de leucocitosis y la extensión del área del
infarto. Además de la necrosis miocárdica, también se ha correlacionado el elevado
número de leucocitos en sangre con una peor perfusión coronaria51
. El hecho de que el
recuento leucocitario es una determinación sencilla que no requiere un gasto económico
excesivo y se puede realizar de manera rutinaria, ayuda a convertirlo en un marcador
Introducción
33
pronóstico en potencia. Su utilidad ha sido confirmada en el espectro completo del IAM
desde una perspectiva tanto a corto como a largo plazo51
.
A pesar de la evidencia de la asociación del recuento total de leucocitos con eventos
cardiovasculares en pacientes con IAM, se han publicado escasos estudios relacionados
con la habilidad predictiva del recuento leucocitario. Estudios recientes han demostrado
que existen diferentes asociaciones entre los subtipos de leucocitos y el pronóstico74
. La
neutrofilia y, en un menor grado la monocitosis y la linfopenia han estado relacionados
con un peor pronóstico en pacientes con IAM. Finalmente el recuento leucocitario es un
resultado de todas las evoluciones de cada tipo celular. En pacientes con IAMEST, una
neutrofilia basal es un predictor del tamaño del infarto y una perfusión coronaria
alterada75
.
Mientras que la existencia de leucocitosis y neutrofilia son signo de peor pronostico
en síndromes coronarios agudos, un incremento del numero de linfocitos no se
correlaciona de la misma manera, es más los linfocitos se comportan de modo opuesto,
es por ello que se utiliza la linfopenia como predictor de futuros eventos en pacientes
que han sufrido un infarto76
. Una linfopenia aguda también tiene lugar en pacientes con
IAM, y sus implicaciones pronosticas y fisiopatológicas no han sido exploradas en
profundidad hasta el momento.
Estudios en pacientes con y sin IAM demostraron que un recuento linfocitario más
bajo y una tasa de neutrófilos más elevada estaba relacionado con una mayor tasa de
eventos cardiovasculares durante el seguimiento.
El recuento linfocitario se presenta como una herramienta sencilla y fácil de obtener,
que permite una mejora significativa de la predicción del riesgo de un IAM. Sin
embargo, a penas refleja la extensa complejidad celular y de las interacciones que
subyacen esta denominación. Por lo que se necesita profundizar en el conocimiento de
los subtipos linfocitarios y su regulación a un nivel fisiopatológico y terapéutico.
Es un hecho reconocido que la linfopenia puede ser un desencadenante de distintas
enfermedades autoinmunes, debido a la expansión oligoclonal de linfocitos T
autoreactivos con un fenotipo efector. Una perturbación del repertorio de los linfocitos
T está relacionada fuertemente en la fisiopatología de IAM77
. Las células efectoras
parecen una diana terapéutica atractiva y experimentalmente consolidada. A pesar de
ello deben explorarse en profundidad otras partes de la cascada inflamatoria.
Se ha descrito una incidencia elevada de eventos cardiovasculares en enfermedades
con inmunosupresión mediada por linfopenia. Situaciones como las que se ven en
Introducción
34
pacientes que padecen el síndrome de inmunodeficiencia adquirida, inmunodepresión
desarrollada tras un trasplante, o supervivientes de bomba atómica, se asocian con un
incremento en linfocitos CD4+ y un desarrollo acelerado del proceso de aterosclerosis78
.
Estas evidencias apoyan el hecho de que una pérdida de linfocitos podría dar lugar a una
alteración en la enfermedad coronaria aguda.
En pacientes con IAM, se ha sugerido que una desregulación aguda del sistema
inmune daría lugar a consecuencias deletéreas55
. Mediante un incremento de citoquinas
pro-inflamatorias y un desequilibrio a favor de Th1 éstos contribuyen a la activación de
las células endoteliales, inducen la expresión de moléculas de adhesión y activan
leucocitos. Además, un desequilibrio pro-inflamatorio sería capaz de disparar una
respuesta inflamatoria muy dañina y pleiotrópica. Estudios experimentales apoyan la
idea del papel causal del desequilibrio pro-Th1 en la fisiopatología del IAM.
Además de los linfocitos Th1 y Th2, los pacientes con IAM experimentan también
una falta de marcador CD28 en células CD4. Estas células conocidas como CD4
CD28null, expresan receptores auto-agresivos con las características de los NK y tienen
función citolítica. El hecho de que son capaces de producir niveles elevados de
interferón gamma junto con el hecho de que pueden ser aislados de las placas apoya el
hecho de que los linfocitos CD4 CD28null tienen efectos dañinos en el IAM79
.
Estudios previos han planteado que la linfopenia que tiene lugar en el IAMEST
provoca un desequilibrio en la respuesta inmune, de modo que tiene lugar una
desregulación inmune en el IAM.
Este fenómeno de desregulación inmune podría estar mediado por tres mecanismos:
1. La apoptosis linfocitaria, como mecanismo de la supresión con el fin de frenar una
respuesta inflamatoria exacerbada.
2. La recirculación linfocitaria, los linfocitos T naïve se dirigen a los ganglios
linfáticos en busca de las células dendríticas para que allí les presenten el antígeno que
ellas han captado en el tejido periférico y una vez activados y convertidos en efectores
migran al tejido inflamado y lo infiltran.
3. La inmunoregulación a través de la inhibición de la proliferación de linfocitos T
efectores, así como la diferenciación en distintos fenotipos Th que los dirigirán a
infiltrarse en el tejido periférico.
La figura 10 muestra los tres posibles mecanismos que podrían mediar la
desregulación inmune que tiene lugar tras un IAMEST.
Introducción
35
Figura 10. Mecanismos de desregulación del sistema inmune adaptativo. Adaptado
de Takada et al80
3.1. Apoptosis linfocitaria
El sistema inmune mantiene la homeostasis de modo correcto mediante la regulación
de la muerte celular y de la proliferación. Para mantener la homeóstasis tras la
expansión clonal, los linfocitos T activados tienen que ser eliminados una vez el
antígeno has sido retirado y solamente permanecerán unos pocos linfocitos T
activados81
. Estas células se convierten en células de memoria, las cuales además son
células especializadas que responden rápidamente a una posterior exposición al
antígeno. Las células de memoria son más resistentes a la muerte celular82
. Por lo que el
hecho de que los linfocitos T sobrevivan o mueran depende en gran medida de la
necesidad de una reacción inmune o no.
En la periferia, los linfocitos T mueren por apoptosis. Una de las causas de apoptosis
linfocitaria es la ausencia de señales de supervivencia. Este tipo de muerte celular
también se denomina muerte por privación de citoquinas o por abandono83
. La re-
estimulación del receptor del linfocito T (TCR) en las células ya expandidas y en
ausencia de una co-estimulación apropiada puede dar lugar a un tipo de muerte
Célula dendrítica
MHC II
Adenosina IL-10
TGFb²Privación de IL-2 CD95L
CD95
IL-10
PDL1
Célula dendrítica
Treg T naïve
CD80 or CD86
CTLA4
TH1
TH17
Los Treg bloquean la proliferación de T
efectores e inducen la apoptosis
Apoptosis de
linfocitos T
efectores
Migración del linfocito T naïve al ganglio
linfático
Inhibición de la diferenciación de T efectores Infiltración en los tejidos periféricos
CTLA4 CD80 CD86
CD40L CD40
Linfocito T efector
IL-10
Linfocito B
CD
T naïve
T naïve
PD-1
Treg
CTLA4
TCR
CD
Ganglio linfático
TCR
Linfocito T
Célula necrótica
Péptido-MHC Clase II
Migración al ganglio linfático
CD80/CD86 molécula co-estimuladora
Maduración de CD
CD
Receptor de DAMP
Liberación de
DAMPS
M odelo del
peligro
CD28
CD80 CD86
3. Inmunoregulación
2. Recirculación linfocitaria
1. Apoptosis linfocitaria
Introducción
36
linfocitaria denominada muerte celular inducida por activación (AICD)84
. La AICD
implica la estimulación de muerte a través de receptores como el CD95 (también
conocido como FASL), o los receptores del TNF- como el TNFR1 y TRAILR85
.
La re-estimulación del TCR tras 4-7 días de cultivo in vitro da lugar a expresión de
CD95, lo que induce la muerte celular mediada por FASL. Tanto si es la misma célula
la que lo expresa (suicidio) como si son las células vecinas (fratricidio). Por lo que el
sistema CD95 está considerado como un regulador de suma importancia en la
homeostasis de linfocitos T (Figura 11).
Figura 11. Apoptosis linfocitaria. Adaptado de Strasser et al81
3.2. Recirculación de linfocitos
El sistema inmune mantiene la homeostasis de linfocitos mediante un número de
mecanismos que gobiernan la distribución y el número de células.
La recirculación constitutiva de linfocitos entre la sangre y los órganos linfoides
secundarios es esencial para la distribución adecuada de los linfocitos y aumenta la
posibilidad de que el linfocito se encuentre con el antígeno.
Los linfocitos T naïve migran preferencialmente a los tejidos linfoides secundarios
mediante un proceso que se conoce como “homing” o asentamiento80
. Un encuentro con
Apoptosis
Apoptosis
Introducción
37
un antígeno induce la proliferación de clones de linfocitos T, dando lugar
aproximadamente a 1000 descendientes idénticos a la célula T de la que se dividieron y
con especificidad para el mismo antígeno.
El proceso de homing más estudiado es el homing de los linfocitos T naïve a los
ganglios linfáticos (Figura 12).
Los linfocitos circulantes acceden al ganglio mediante las vénulas del endotelio alto
(VEA). Los linfocitos se adhieren selectivamente a las VEA de los ganglios linfáticos
para entrar a éstos. Esta adhesión depende de modo crítico de la molécula de adhesión
L-selectina y de la producción de quimiocinas tales como CCL19 y CCL21, de este
modo los linfocitos naïve que se dirigen al ganglio linfático para activarse mediante el
encuentro con un antígeno, poseen en su superficie el receptor de la molécula de
adhesión L-selectina llamado CD62-L y el receptor de las quimiocinas CCL19 y CCL21
llamado CCR7.
Figura 12. Recirculación linfocitaria. Adaptado de von Adrian et al86
Introducción
38
Inicialmente los linfocitos T naïve deben determinar si un antígeno está presente y si
supone una amenaza para el organismo. Esta información se la proporcionan las células
dendríticas en los órganos linfoides secundarios, las cuales captan y procesan el
antígeno que ha sido producido en el lugar de la inflamación. Durante el curso de una
respuesta inmune, la activación de células T mediante el encuentro con el antígeno, da
lugar a la proliferación y diferenciación de células efectoras y de memoria. La
activación de células T también induce cambios rápidos en la expresión de las
moléculas de adhesión de superficie, como la inhibición de la expresión de L-selectina,
por lo que los linfocitos efectores y de memoria son negativos para CD62-L.
3.3. Inmunoregulación y contrasupresión inmune
La magnitud de la respuesta inmune viene determinada por el balance entre señales
reguladoras positivas y negativas. De este modo, la presencia de mecanismos
inmunosupresores distintos es esencial para el mantenimiento de un control efectivo de
la respuesta inmune frente a diferentes condiciones patológicas sin causar un daño al
tejido y al mismo tiempo, preservando la homeostasis y las condiciones fisiológicas.
La tolerancia central tiene lugar en el timo y se establece mediante la delección de
linfocitos autoreactivos a través de la presentación de antígenos propios87
. Sin embargo,
existe una pequeña proporción de linfocitos reactivos T que no son deleccionados
durante la selección tímica negativa y son capaces de alcanzar la periferia. Ya que el
sistema inmune esta constantemente expuesto a auto-antígenos, el organismo ha
desarrollado distintas estrategias que permiten evitar la generación de respuestas auto
inmunes deletéreas, incluyendo la activación de muerte inducida, la anergia clonal y la
inmuno-supresión mediante linfocitos Treg, así como receptores de superficie, proteínas
solubles y moléculas de señalización que proporcionan señales críticas para limitar la
respuesta inmune inflamatoria.
Algunas de estas moléculas muestran una función reguladora bien definida, algunos
ejemplos son las citoquinas IL-10 y el TGF-, las cuales además de ejercer su efecto
anti-inflamatorio sobre las células también controlan la diferenciación y función de los
linfocitos Treg.
La inmunoregulación es crítica para mantener el balance entre inmunidad y
tolerancia, en la cual están involucradas tanto la prevención de la infección como la
Introducción
39
limitación del daño tisular colateral. La tolerancia inmune periférica tiene lugar para
evitar enfermedades autoinmunes. Sin una regulación, los procesos fisiológicos corren
riesgo de convertirse en patológicos. En ese sentido la regulación es de extrema
importancia. Esto se aplica directamente a las reacciones inmunes. La regulación
inmunológica ofrece la oportunidad de terminar respuesta inmune.
El concepto de contrasupresión se introdujo por primera vez por Richard Gershon y
colaboradores hace más de un cuarto de siglo como una actividad inmunoreguladora
que inhibía las funciones de linfocitos T en ratones88
. La aproximación experimental
obtenida fue que el programa genético de células imunológicamente competentes
expresan moléculas en la superficie celular que contienen información para otras células
reguladoras o supresoras.
El descubrimiento de los linfocitos Treg CD25+CD4+ dio lugar al resurgimiento de
la supresión como un mecanismo de control de la inmunidad89
. Actualmente se conocen
distintos tipos de linfocitos Treg, sin embargo los más conocidos son los Treg naturales
y los Treg inducidos.
Los Treg naturales se caracterizan por la expresión constitutiva de niveles elevados
de CD25, el antígeno citotóxico linfocitario 4 (CTLA-4) y el receptor glucocorticoide
inducido por factor de necrosis tumoral (GITR), además de la expresión del factor de
transcripción FOXP3, el cual es el marcador específico de este tipo celular90
. Los
linfocitos Treg naturales se desarrollan en el timo y se encuentran en los tejidos
periféricos linfoides. El mecanismo de supresión que los caracteriza está mediado por la
producción de IL-10 y de TGF-, así como a través de CTLA-4.
Los linfocitos Treg inducibles se desarrollan a partir de linfocitos CD4
convencionales bajo la influencia de citoquinas e interfieren con señales co-
estimuladoras, estos linfocitos pueden resultar en Tr1 o Th3.
Además, elevados niveles de IL-10 o IL-2 pueden inducir que células CD4+ CD25-
desarrollen una actividad supresora, además la presencia de altas concentraciones de
TGF- puede inducir la expresión del factor de transcripción FOXP391
.
Los linfocitos CD4+CD25+FOXP3+ previenen las respuestas autoinmunes, así como
una reacción exacerbada del sistema inmune. Las células Treg suprimen la inmunidad,
sin embargo requieren que la tolerancia se module de acuerdo a las necesidades para
controlarla.
Distintas citoquinas pueden modular respuestas inmunes, tales como la IL-6 o la IL-
23 y revertir la actividad de los linfocitos Treg en linfocitos contrasupresores. La IL-6
Introducción
40
que es una citoquina producida como reactante de la fase aguda durante la inflamación,
inhibe de modo eficiente la generación de linfocitos Treg92
. Es más, la IL-6 inhibe la
generación de linfocitos Treg y aumenta la expresión de linfocitos Th17 que son pro-
inflamatorios mediante el incremento de la generación de IL-17.
Los linfocitos Treg controlan selectivamente un tipo de linfopenia denominado
proliferación inducida por linfopenia, caracterizada por un aumento repentino de la
actividad celular y de la diferenciación de linfocitos T efectores (proliferación
espontánea). La forma espontánea de proliferación inducida por linfopenia es una fuente
de expansión oligoclonal que da lugar a linfocitos autoreactivos. Los linfocitos Treg
limitan la expansión oligoclonal mediante mecanismos supresores como la producción
de IL-10.
Figura 13. Mecanismos de inmunoregulación mediados por los linfocitos Treg.
Adaptado de Vignali et al93
Los receptores de superficie miembros de la familia B7:CD28, tales como la proteína
de muerte programada 1 (PD-1) y CTLA 4 tienen papeles clave en la regulación de la
activación y tolerancia, pero también originan señales secundarias criticas que limitan la
Introducción
41
activación de linfocitos T.
La función de CTLA-4 en el control de las respuestas de linfocitos T se produce
tanto en linfocitos Treg como sobre los linfocitos T efectores. CD28 está
constitutivamente expresado en los linfocitos T y CTLA-4 aumenta su expresión tras la
activación del TCR. Los linfocitos T expresan constitutivamente niveles muy elevados
de CTLA-4, lo cual sugiere que esta molécula participa en su capacidad supresora94
.
PD-1 es una proteína transmembrana similar a CTLA-4, pero no se une a CD80-
CD86. PD-1 se expresa en linfocitos T activados, tanto CD4 como CD8, además de
células mieloides. Los ligandos de PD-1 son PD-L1 y PD-L2, los cuales son miembros
de la familia B7 de receptores. La interacción de PD-1-PD-L1 inhibe la proliferación de
CD4 y la producción de citoquinas. Estudios recientes sugieren que el bloqueo de la via
de PD-1/PD-L1 anula la actividad de linfocitos Treg95
.
En resumen, en el IAMEST podrían producirse una serie de cambios generados por
la respuesta inmune al daño tisular. Existen distintos mecanismos que regularían la
respuesta inmune en el IAMEST. Hasta el momento no se conocen las implicaciones
clínicas y su relación con la severidad del infarto.
En función de todo lo expuesto, se deduce que son necesarios más estudios para
elucidar el papel de la dinámica de la respuesta inmune en el IAMEST, los mecanismos
fisiopatológicos que la regulan y las implicaciones clínicas.
HIPÓTESIS
Hipótesis
45
II. HIPÓTESIS
En el contexto del IAMEST tiene lugar una importante alteración de la inmunidad
adaptativa con cambios dinámicos en distintos subtipos linfocitarios tanto a nivel
periférico como tisular.
Existe una asociación entre la alteración de la inmunidad adaptativa en el contexto
del IAMEST con el tamaño final del infarto cuantificado mediante RMC.
Mecanismos encargados de regular el sistema inmune adaptativo como son los
linfocitos Treg y el eje PD-1/PD-L1 están implicados en la alteración de la inmunidad
adaptativa en el IAMEST tanto a nivel periférico como tisular.
OBJETIVOS
Objetivos
49
III. OBJETIVOS
Objetivo 1. Estudiar la dinámica de la respuesta inmune adaptativa en sangre periférica
de pacientes con IAMEST.
Objetivo 2. Analizar la asociación existente entre la dinámica de la respuesta inmune
adaptativa en sangre periférica de pacientes con IAMEST con el tamaño
del infarto cuantificado mediante RMC.
Objetivo 3. Analizar mecanismos asociados a la alteración de la respuesta inmune
adaptativa en un modelo porcino de IAMEST tanto a nivel periférico como
tisular, tales como la apoptosis linfocitaria y la infiltración linfocitaria
tisular.
Objetivo 4. Analizar mecanismos asociados a la regulación de la respuesta inmune
adaptativa en pacientes con IAMEST y en un modelo porcino de IAMEST,
tales como los linfocitos Treg y el eje PD-1/PD-L1.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material y Métodos
53
IV. MATERIAL Y MÉTODOS
1. ESTUDIO EN PACIENTES
1.1. Grupos de estudio
Este estudio cumple los principios éticos contemplados en la Declaración de Helsinki
y fue aprobado por el comité de ética de la Fundación Hospital Clínico Universitario de
Valencia. Todos los sujetos firmaron el consentimiento informado.
El estudio se compuso de dos grupos de estudio:
1. Grupo IAMEST
Durante el periodo comprendido entre marzo de 2011 y marzo de 2013 se incluyeron
116 pacientes consecutivos ingresados en la Unidad de Medicina Intensiva y en el
Servicio de Cardiología del Hospital Clínico Universitario de Valencia. Los pacientes
fueron incluidos en base al criterio de un cardiólogo con experiencia en el manejo de
pacientes con IAMEST.
Los criterios de inclusión fueron los siguientes: un primer IAM con elevación del
segmento ST revascularizados con angioplastia primaria dentro de las primeras 6 horas
del inicio del dolor o bien con trombólisis dentro de las primeras 12 horas, sin
antecedentes de síndrome coronario agudo previo o revascularización coronaria anterior
a la realización de la angioplastia primaria, sin enfermedad neoplásica, sin enfermedad
autoinmune o de carácter inflamatorio no relacionado con el infarto.
El manejo y el tratamiento médico se dejaron según el criterio de los cardiólogos
responsables de los pacientes.
De entre los 116 pacientes incluidos en primer lugar, 18 fueron excluidos de modo
que el grupo final IAMEST se compuso de 98 pacientes.
Los criterios de exclusión fueron los siguientes: muerte durante el ingreso, reinfarto
durante el ingreso, inestabilidad clínica o hemodinámica, cirugía de revascularización o
no realización de la RMC en caso de contraindicación para la RMC (pacientes
claustrofóbicos, portadores de marcapasos…) y por decisión médica.
En la figura 14 se muestra un diagrama de flujo de los pacientes incluidos y
excluidos en el estudio.
Material y Métodos
54
Figura 14. Diagrama de flujo de pacientes IAMEST incluidos en el estudio
2. Grupo Control
Se incluyeron 30 sujetos a los que se les había programado un estudio angiográfico
en el Servicio de Cardiología del Hospital Clínico Universitario de Valencia. Los
sujetos controles no padecían cardiopatía isquémica y presentaron arterias coronarias
normales diagnosticadas mediante el estudio angiográfico según criterios del cardiólogo
con experiencia en el manejo de pacientes con IAMEST.
1.2. Características basales
Las características basales de ambos grupos se recogieron exhaustivamente en una
base de datos. Variables clínicas comunes a ambos grupos:
Edad
Sexo
Diabetes mellitus
Hipertensión arterial
Hipercolesterolemia
Tabaquismo
Antecedentes de enfermedad coronaria
Material y Métodos
55
Además de las variables anteriores comunes en ambos grupos, se recogieron las
siguientes variables clínicas y angiográficas pertenecientes al grupo IAMEST:
Frecuencia cardiaca
Presión sistólica
Clase Killip
Tiempo de reperfusión
Angioplastia primaria
Trombólisis
Angioplastia de rescate
Infarto anterior
Flujo TIMI
“Blush” miocárdico
1.3. Resonancia Magnética Cardíaca (RMC)
Para la cuantificación del tamaño del infarto, la OMV y la fracción de eyección (FE)
se realizó un estudio de RMC a todos los pacientes durante la primera semana (52
días) tras el infarto.
Los estudios fueron realizados por 2 cardiólogos expertos en RMC (10 años de
experiencia). Se estudió a todos los sujetos mediante un equipo de 1,5 Tesla (Sonata
Magnetom, Siemens, Erlangen, Alemania). La RMC se realizó según el protocolo
utilizado en la unidad de Resonancia Magnética de ERESA96
que consiste en la
realización de secuencias de cine en reposo y posteriormente perfusión de primer paso
en reposo y realce tardío de gadolinio (RTG).
Los estudios de RMC fueron analizados por 1 observador con amplia experiencia
utilizando un software estándar (Syngo, Siemens, Erlangen, Germany). Los datos de los
estudios fueron registrados inmediatamente en la base de datos. La variabilidad
intraobservador fue inferior al 5%, estos datos son consistentes con estudios previos de
nuestro grupo97
.
La fracción de eyección se cuantificó con la siguiente fórmula:
FE= (VTD-VTS)/(VTD)
Donde VTD: volumen telediastólico; VTS: volumen telesistólico;
Los volúmenes indexados VTD y VTS (ml/m2), la FE (%), y la masa ventricular
Material y Métodos
56
izquierda (g/m2) se cuantificaron con definición manual de los bordes endocárdico y
epicárdico en todos los cortes de eje corto en las imágenes de cine.
A partir de las imágenes de captación tardía se cuantificó la transmuralidad de la
necrosis. Se consideró que un segmento muestra RTG cuando presenta una intensidad
de señal > 2 desviaciones estándar con respecto a segmentos remotos no infartados. El
tamaño del infarto de VI se definió98
como el porcentaje de masa del VI que presenta
RTG en g/m2
(Figura 15).
Figura 15. Determinación del tamaño del infarto mediante RMC
La presencia de OMV se definió visualmente como aquellas áreas hipodensas
localizadas dentro de un área con RTG99
. El tamaño de masa del VI con OMV se
definió como el porcentaje de masa del VI con OMV en g/m2.
1.4. Extracciones seriadas
Se extrajeron 20 ml de sangre venosa periférica a todos los pacientes y controles.
A los 18 primeros pacientes se les realizaron las siguientes extracciones seriadas:
antes de la reperfusión (en situación de necrosis miocárdica), 24h después de la
reperfusión, 96h después de la reperfusión y 30 días después de la reperfusión. A los 80
pacientes restantes solamente se les extrajo una muestra 24h después de la reperfusión.
A los 30 controles se les extrajo una muestra en el momento del estudio angiográfico
(Figura 16).
De los 20 ml de sangre venosa periférica extraída, se recogieron 12 ml en tubos con
Material y Métodos
57
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (Vacutainer, BD, Madrid, España) para
posterior aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y de
ácido ribonucleico (RNA). Y los 8 ml restantes fueron recogidos en tubos secos
(Terumo, Madrid, España) para la posterior separación de suero.
Figura 16. Esquema de las extracciones sanguíneas en pacientes con IAMEST y
controles
1.5. Recuento leucocitario
En todos los pacientes y controles se realizaron los recuentos totales de leucocitos,
neutrófilos, monocitos y linfocitos en un auto-analizador hematológico (COULTER®
LH 500, Beckman Coulter, Madrid, España) del Servicio de Hematología del Hospital
Clínico Universitario de Valencia siguiendo las indicaciones del técnico operador.
Estos datos se registraron exhaustivamente en la base de datos.
1.6. Aislamiento y criopreservación de PBMCs
Para el aislamiento y criopreservación de PBMCs se siguió el procedimiento estándar
de operación del Servicio de Hematología del Hospital Clínico Universitario de
Valencia. El procedimiento consiste en una separación en gradiente de densidad en
Lymphoprep (Axis-shield, Oslo, Noruega) en una relación de volumen 2 partes de
sangre por 1 parte de Lymphoprep seguido de un centrifugado a 1500 RCF durante 20
min a 4ºC. A continuación, se realizaron dos lavados con Hanks Balanced Salt Solution
128 Pacientes
30 Controlescornarias normales
18 IAMEST Pre-
angioplastiaReperfusión
24h post-reperfusión
96h post-reperfusión
30d post-reperfusión
Muestra
80 IAMEST 24h post-
reperfusión
Material y Métodos
58
(HBSS) (Gibco, Alcobendas, España) y un lisado de los eritrocitos con Eritrocyte Lysis
Buffer (ELB) (Qiagen, Barcelona, España).
Seguidamente se contaron las células en cámara de Neubauer y se congelaron 106
células por mililitro de medio de congelación. El medio de congelación se compuso de
un 40% de medio RPMI 1640 (Sigma, St.Louis, EEUU), 50% de suero bovino fetal
(SBF) (Thermofisher, Madrid, España) inactivado a 56ºC durante 30min y 10% de
Dimetil Sulfóxido (DMSO) (Origene, Helsingborg, Suecia).
La congelación de las células se realizó de modo progresivo para mantener en todo
momento su máxima integridad, en primer lugar se mantuvieron durante 24h a -80ºC en
un recipiente con isopropanol (Mr Frosty, Nalgene, Lyon, Francia) para su congelación
progresiva de 1 grado por cada minuto y seguidamente pasaron a ser almacenadas en el
congelador de -80ºC.
1.7. Análisis de subtipos linfocitarios por citometría de flujo
Para el análisis citométrico de muestras criopreservadas se siguió el protocolo
publicado previamente por el consorcio “Human Immunology Project”100
. En primer
lugar partiendo de muestras congeladas anteriores a 6 meses, se descongelaron las
células rápidamente en un baño a 37ºC e inmediatamente se realizaron dos lavados con
HBSS para retirar rápidamente los restos de DMSO que son tóxicos para las células.
A continuación se procedió al recuento en el auto-analizador hematológico
(COULTER® LH 500, Beckman Coulter, Madrid, España) y comprobación de la
viabilidad en cámara de Neubauer con Azul Tripán (Sigma, St.Louis, EEUU). Se
resuspendieron 106 células en un 1ml phosphate buffer saline (PBS) con 0,02% de azida
sódica (Gibco, Alcobendas, España).
Seguidamente se incubaron 105 células con el correspondiente panel de anticuerpos
(ratón anti-humano, Beckman Coulter, Madrid, España) durante 15 min a TA y en
oscuridad.
Los paneles de anticuerpos utilizados fueron los siguientes:
Controles de isotipo: IgG-PE, IgG-FITC, IgG-PeCy5, IgG-APC
Linfocitos T y B: CD3-PeCy5, CD4-PE, CD8-FITC, CD19-APC
Linfocitos Th1 y Th2 y autorreactivos: CD4-FITC, CXCR3-APC, CCR4-PE,
CD28-PeCy5
Material y Métodos
59
Linfocitos CD4 naïve/ memoria/ memoria central y efectores de memoria:
CD4-FITC, CD62L- PeCy5, CD45R0-PE
Linfocitos T activados y NK: CD3-FITC, CD(56+16)PE, HLA-DR PECy5
Tabla 1: Anticuerpos monoclonales utilizados en la determinación de
subpoblaciones linfocitarias en pacientes y controles
Anticuerpos Fluorocromo Clon
CD3 PeCy5 UCHT1
CD4 PE SFCI12T4D11
CD8 FITC SFCI21Thy2D3
CD19 APC HIB19
CXCR3 (CD184) APC 1C6
CCR4 (CD194) PE 1G1
CD28 PeCy5 CD28.2
CD16 PE 3G8
CD56 PE NKH-1
CD45R0 PE UCHL1
CD62L PeCy5 DREG56
HLA-DR PeCy5 mmu357
La muestras se analizaron en un citómetro FacsCalibur (Beckton Dickinson, Spain)
perteneciente al Servicio de Hematología del Hospital Clínico Universitario de
Valencia. Se adquirieron 10 000 eventos por panel. Los resultados se adquirieron y se
analizaron con el software Cellproquest 2.0 acquisition software (Beckton Dickinson,
Spain) y con el software FlowJo 8.7 (TriStar, Oregon, EEUU).
En primer lugar, para la discriminación de las células vivas de las muertas se
incubaron 105 células con 3l de 7-aminoactinomycina-D (7-AAD) (Beckman Coulter,
Madrid, España) durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA) y se analizaron por
citometría de flujo. Una vez establecido el gate de las células muertas se estableció el
umbral mínimo de adquisición de las PBMCs. La figura 18 muestra el establecimiento
de la región de células viables (las negativas para 7-AAD) que se utilizó para el análisis
de las muestras descongeladas de los pacientes.
Material y Métodos
60
Figura 18. Establecimiento del umbral de células muertas y restos celulares tras la
descongelación
1.8. Análisis de linfocitos T reguladores por citometría de flujo
Para la determinación de linfocitos T reguladores se realizó en primer lugar un doble
marcaje con anticuerpos de superficie celular CD4-FITC y CD25-PeCy5 (ambos de
Beckman Coulter, Madrid, España) incubando a TA durante 15min. Seguidamente se
permeabilizaron y fijaron las células mediante el uso de buffers de permeabilización y
fijación del Kit FOXP3 Stainning Buffer Set Kit (Miltenyi Biotech, Gladbach,
Alemania).
A continuación se bloquearon las uniones inespecíficas incubando con Fc Blocker
(Miltenyi Biotech, Gladbach, Alemania) 15 min a TA. Finalmente se incubó con el
anticuerpo Mouse anti Human FOXP3-PE (clon PCH101) (eBioscience, San Diego,
EEUU) durante 45min a TA. Tras dos lavados se procedió a la lectura de los resultados
en el citómetro, se adquirieron 40 000 eventos.
Se utilizó en todos los casos un tubo control en el que se marcaron las células
solamente con CD4 y CD25 para discriminar los negativos para FOXP3. El gate de
adquisición se estableció en las células CD4 positivas. Se consideraron linfocitos Treg
como las células CD4+ CD25hi FOXP3+ en base a estudios previos101
.
De modo que la estrategia de gating es la mostrada en la figura 19.
Material y Métodos
61
Figura 19. Estrategia de gating en el análisis de los linfocitos T reguladores. Se
consideraron linfocitos T reguladores las células CD4+ CD25 high (hi) FOXP3
1.9. Aislamiento de RNA total de PBMCs
Para el aislamiento del RNA total de las PBMCs se usó Trizol isolation reagent (Life
technologies, Barcelona, Spain) seguida de purificación en columna mediante el kit
RNeasy kit (QIAGEN, Madrid, Spain) y una digestión del ácido desoxiribonucleico
(DNA) genómico en columna mediante DNAsa (Life Technologies, Barcelona,
España).
A continuación se determinó la concentración y pureza del RNA mediante el uso del
Nanodrop ND-2000 (Nanodrop, LabTech International, Reino Unido). La
comprobación de la pureza del RNA se llevó a cabo teniendo el cuenta el ratio de
absorbancia λ=260nm/λ=280nm, de forma que valores comprendidos entre 1,8 y 2,0
indican que se obtuvo un RNA de buena calidad. Además de las medidas de
concentración y pureza, y con el fin de asegurar la integridad del RNA, se evaluó la
integridad del RNA mediante el uso de RNA 6000 Nano Labchips en un bioanalizador
Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA, USA).
Linfocitos CD4+
CD4+ CD25hi CD4+ CD25hi FOXP3+
Material y Métodos
62
1.10. RT- qPCR
La reacción de RT-PCR se llevó a cabo en un único paso en el que el RNA total se
retrotranscribió a cDNA con el kit High-Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied
Biosystems, California, EEUU) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para ello se
utilizó un termociclador T-100 (Biorad, Madrid, España).
Las condiciones de PCR fueron las siguientes: un ciclo de 60min a 37ºC, 5min a
95ºC e a 4ºC. El volumen de la reacción fue variando en función de las necesidades
de la cuantificación posterior de los niveles de mRNA mediante PCR cuantitativa.
La PCR cuantitativa (qPCR) se llevó a cabo en un termocilcador ABI Prism 7900
sequence detection system (Applied Biosystems, California, EEUU), mediante el uso de
ensayos Taqman Gene Expression Assays (Applied Biosystems, California, EEUU).
Tabla 2. Sondas de oligonucleótidos utilizadas para los distintos genes analizados
en el estudio en humanos
Gen Referencia de ensayo taqman
18S Ribosomal 4319413E
TBX21 Hs00203436_m1
GATA-3 Hs00231122_m1
ROR- Hs01076122_m1
FOXP3 Hs01085834_m1
PD-1 Hs01550088_m1
PD-L1 Hs01125301_m1
CTLA-4 Hs00175480_m1
Las reacciones de PCR se realizaron por triplicado y en formato duplex, en placas de
384 pocillos en las que se cuantificó de modo simultáneo un gen de expresión
constitutiva, en este caso se uso el gen 18S ribosomal conjugado con un fluoróforo VIC
y el gen de interés conjugado con el fluororomo FAM.
En todos los casos se utilizaron sondas taqman ® y el Gene Expression Master Mix
Material y Métodos
63
(Applied Biosystems, California EEUU).
Las condiciones de amplificación de la qPCR fueron las siguientes: 40 ciclos de 3
seg a 95ºC y 1 ciclo de 1min a 60ºC.
El incremento (fold change) de la expresión del gen se calculó en las muestras de
IAMEST respecto de controles mediante el método de CT donde ΔΔCT = ΔCT
(muestra) – ΔCT (control = media de los valores CT de todas las muestras controles), y
el segundo ΔCT es el CT del gen constitutivo 18SR menos el CT del gen de interés102
(Tabla 2).
1.11. Inmunoensayo multiplex de citoquinas
El inmunoensayo Luminex permite medir simultáneamente hasta 100 analitos
diferentes mediante la tecnología XMap.
Se cuantificaron las concentraciones de las citoquinas: IFN-, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-
10, IL-17 y TNF-α, mediante el kit multiplex de alta sensibilidad Milliplex MAP High
Sensitivity (HSCYTO-60K) (Millipore, EEUU) para determinación de 7 citoquinas.
El límite mínimo de detección fue de 1,3 pg/ml para todas las citoquinas. La
concentraciones de las muestras de sueros se analizaron mediante interpolación en una
curva patrón ajustada mediante regresión logística con 7 puntos.
La concentración de TGF-
kit Singleplex MAP (Millipore, EEUU). El límite de detección fue de 3200 pg/ml. Las
muestras se diluyeron 30 veces para alcanzar el rango de trabajo.
Todas determinaciones se realizaron por duplicado. Se incubó una mezcla de 2500
microesferas por citoquina junto con los blancos, estándares y muestras de sueros según
el protocolo establecido por el fabricante.
A continuación se procedió a la lectura de la placa en el analizador LumineX 100 del
servicio de la Unidad Central de Investigación en Medicina (UCIM) de la Facultad de
Medicina de la Universidad de Valencia.
El análisis de las determinaciones se realizó mediante el software LumineX 100 IS
v2.3 del mismo fabricante (Millipore, EEUU).
Material y Métodos
64
2. ESTUDIO EN ANIMALES
Este estudio fue aprobado por el Comité de Experimentación Animal de la
Universidad de Valencia y cumplió todas las normas vigentes en el manejo de animales
de experimentación.
2.1. Infarto Porcino
En 12 cerdos comunes (Sus Scrofa) hembras (peso en torno a 30 kg) sometidos a 6
horas de ayuno de sólidos se realizó una inyección intramuscular lenta con
ketamina/medetomidina 8 mg/kg. Se procedió a la entubación endotraqueal del animal y
ventilación mecánica. A continuación se mantuvo la anestesia con propofol mediante
infusión intravenosa continua a 8-9 mg/kg/h durante todo el experimento. Se realizó
monitorización continua de presiones y ECG. Antes del infarto se pre-trataron con
heparina (100 U/kg), amiodarona (150 mg) y lidocaína (30 mg) para prevención de
arritmias y se dispuso de desfibrilador.
Se provocó un infarto mediante introducción percutánea de un catéter de angioplastia
JR4 a través de la arteria femoral derecha con un introductor 6F. Se accedió a la arteria
descendente anterior (ADA) mediante una guía de angioplastia y catéter Amplatz Left
0.75 y se hinchó un balón de angioplastia de 2 x 20 mm (Abbot Vascular, Santa Clara,
CA, USA) a 4 atmósferas distal a la arteria diagonal durante 90 minutos. Se confirmó
la obstrucción del flujo coronario mediante la inyección intracoronaria de contraste
angiográfico y mediante la elevación del segmento ST en el ECG.
Tras 90 min se reperfundió la arteria (deshinchando el balón) durante 2 horas y se
permitió que el animal se recuperara. Durante el experimento se administraron fármacos
si fue preciso para la estabilidad hemodinámica por un catéter en la vena yugular (6F).
En ninguno de los casos se observó disección de la ADA u obstrucción mantenida de la
arteria tras la reperfusión.
Tras 48h, se anestesió el animal y se inyectaron selectivamente en la ADA 20 mL de
una solución al 4% de tioflavina-S (Sigma, St Louis, EEUU) mediante un microcateter
2.8 F (Progreat, Terumo. Japan). Inmediatamente se procedió a la eutanasia del animal
mediante la infusión intravenosa de 2ml de cloruro de potasio 0,9%.
Se incluyó un grupo control de 5 cerdos sin infarto a los que se les extrajo el corazón
Material y Métodos
65
para posterior comparación con miocardio de cerdos infartados.
2.2. Extracciones sanguíneas y aislamiento de PBMCs
Durante el experimento se extrajeron 20ml de muestras sanguíneas a distintos
tiempos de sangre periférica o bien extraídas del seno venoso con un catéter MPA (6F)
tal y como se muestra en el diagrama (Figura 20).
El aislamiento y criopreservación de PBMCs a partir de las muestras sanguíneas se
realizó siguiendo el mismo protocolo que en el estudio en humanos.
Figura 20. Diagrama de las extracciones seriadas en el modelo animal.
2.3. Cuantificación del tamaño del infarto, área en riesgo y OMV
Una vez sacrificados los animales se procedió a la extracción del corazón, ganglios
mesentéricos, ganglios mediastinales y bazo.
Los corazones se midieron y se seccionaron en 4 rodajas de 0,8 cm. En primer lugar,
con el fin de detectar la OMV, cada rodaja se observó bajo luz ultravioleta para poder
ver las áreas teñidas con tioflavina-S y se fotografió.
Seguidamente, las rodajas se incubaron con una solución al 2% de 2, 3, 5-cloruro de
trifeniltetrazolio (TTZ) (Sigma, Illinois, USA) durante 20min a TA. Finalmente se
Basal Isquemia Necrosis Reperfusión
Suero
Células
RNA
Suero
Células
RNA
Suero
Células
RNA
Suero
Células
RNA
Suero
0h 5m 75m 2h 72h
0h 5min 90min 2h 48h
Material y Métodos
66
observaron a luz ambiental y fueron fotografiadas (Figura 21).
Las imágenes se digitalizaron y se delimitó manualmente la definición de los bordes
epicárdicos y endocárdicos de todas las rodajas usando el paquete informático
MATLAB 6.5 (The Mathworks, Inc., Nattick, MA, USA).
El área en riesgo se definió como el porcentaje de volumen miocárdico que mostraba
marcaje de tioflavina-S, la OMV se definió como las áreas oscuras dentro del área en
riesgo. El área infartada se definió como el área miocárdica que no captó TTZ. La
extensión del infarto se cuantificó como el porcentaje de volumen miocárdico que
mostraba falta de captación de TTZ. El área adyacente se definió como el área no
infartada contigua al área de TZZ y perfundida por tioflavina-S. El área remota se
definió como la zona no perfundida por tioflavina y no marcada con TTZ.
Figura 21. Derecha: corte macroscópico de corazón de un cerdo incubado con
tetrazolio TTZ, la flecha indica el área de infarto. Izquierda: Expuesto a luz
ultravioleta para ver tinción por tioflavina-S, las flechas blancas indican el área en
riesgo y la flecha roja indica la OMV.
2.4. Recuento leucocitario
El recuento absoluto de leucocitos, granulocitos, monocitos y linfocitos se llevó a
cabo usando fluorosferas Flow-count© (Beckman Coulter, Madrid, España). En breve,
100l de sangre total se incubaron durante 15 min a TA en oscuridad con el
correspondiente mix de anticuerpos (Abdserotec, Oxford, Reino Unido), para la
Material y Métodos
67
determinación de leucocitos totales se usó mouse anti PIG CD45-FITC (clon
K252.1E4), y para la discriminación de monocitos se usó mouse anti Human CD14-
Alexa 647 (clon TÜK4). Las poblaciones de granulocitos y linfocitos se determinaron
por marcaje con CD45 y por Forward Scatter (FSC) y Side Scatter (SSC) y por
discriminación de los monocitos con CD14. El recuento con las fluorosferas, de
cantidad conocida (930 fluorosferas por l en el lote usado) de modo que por cada 930
eventos que pasan por el citómetro, se puede saber que han pasado 1l. Las muestras se
adquirieron en el citómetro Epics-XL de la unidad mixta de Citometría de la
Universidad de Valencia. Se usó el software FloJo versión 8.7 para el análisis de los
resultados (TriStar, Oregon, EEUU).
2.5. Análisis de subpoblaciones linfocitarias mediante citometría de flujo
Para el análisis de las subpoblaciones linfocitarias porcinas se analizó la expresión de
marcadores de superficie correspondientes a los linfocitos CD4+, CD8+ y NK en las
PBMCs criopreservadas previamente y descongeladas según protocolo usado en
humanos. Para ello se incubaron 100 l de PBMCs durante 15min a TA con el siguiente
mix de anticuepos (Abdserotec, Oxfordshire, Reino Unido): CD4-FITC (mouse anti-
PIG, clon MIL17), CD8-RPE (mouse anti- PIG wCD8a, clon MIL12) y CD16-RPE
(mouse anti-PIG, clon G7). Las células se adquirieron en el citómetro Epics-XL de la
unidad de Citometría de la Universitat de Valencia.
Para el análisis de los linfocitos Treg porcinos se realizó el mismo protocolo que en
humanos. Sin embargo en este caso se emplearon los siguientes anticuerpos para cerdo:
CD4-FITC (mouse anti-PIG, clon MIL17), CD25-Alexa 610 (clon K231.3B2) y
FOXP3-APC (rat anti-mouse, clon FJK-16S).
2.6. Aislamiento de RNA total y RT-qPCR
Para las terminaciones de biología molecular en tejido, muestras de las áreas infarto,
adyacente, remota y controles, así como los órganos linfoides extraidos previamente, se
congelaron en nitrógeno líquido siguiendo la técnica de “freeze clampling”, mediante el
uso de pinzas de congelación.
Material y Métodos
68
Tabla 3. Genes y sondas taqman usados en el modelo porcino.
Gen Referencia de ensayo taqman
18S Ribosomal 4319413E
TBX21 Ss03373719_s1
GATA-3 Ss03388351_m1
IL-17A Ss03391803_m1
FOXP3 Ss03376695_u1
PD-1 Ss03395429_s1
PD-L1 Ss03391948_m1
FAS Ss03392398_m1
Se aisló el RNA total de PBMCs, así como de tejido ultracongelado de la zona
infarto, adyacente, remoto y controles. Seguidamente se realizaron RT-PCR y qPCR
siguiendo el mismo protocolo que en humanos. Los genes cuantificados y las
correspondientes sondas se muestras en la tabla 3.
2.7. Cuantificación de la apoptosis linfocitaria por citometría de flujo
Para la cuantificación de la apoptosis linfocitaria se incubaron 100l de sangre total
con Anexina-V y Yoduro de Propidio (IP) durante 15 min a TA con el KIT Annexin V
Apoptosis Kit (Immunostep, Salamanca, España) siguiendo las instrucciones del
fabricante.
Tras haber incubado la sangre se procedió a la determinación del porcentaje de
linfocitos apoptóticos mediante citometría de flujo. Los linfocitos positivos para
Anexina V se consideraron apoptóticos y los positivos para IP se consideraron
necróticos.
Material y Métodos
69
2.8. Cuantificación de la expresión proteica mediante Western Blotting
Se extrajeron proteínas totales a partir de tejido ultracongelado (0,1g) mediante
homogeneización en Ultraturrax ® (IKA, Barcelona, Eapaña) en buffer RIPA con un
coctel de inhibidores de fosfatasas y proteasas (Sigma, St Louis, EEUU).
Se cuantificaron las concentraciones de proteína de las muestras mediante el Kit
BCA (Thermoscientific, Madrid, España). Seguidamente se separaron cantidades
iguales de proteína (20 μg) mediante electroforesis en gel de acrilamida SDS-PAGE y
se transfirieron a una membrana de polivinil fluoride (PVDF) (Biorad, Barcelona,
España).
Las membranas se bloquearon con 5% de seroalbumina bovina (BSA) durante 1h a
TA. A continuación se incubaron toda la noche a 4ºC con el correspondiente anticuerpo
primario goat anti human PD-1 (Abcam, Oxford, UK), goat anti-human PD-L1 (Abcam,
Oxford, UK). Seguidamente los inmunocomplejos se pusieron en evidencia con el
anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (HRP): anti Goat-HRP
(DAKO, Madrid, España).
Las membranas se revelaron mediante reacción quimioluminiscente (ECL Detection
Kit), (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). La intensidad de las bandas se midió por
análisis de imagen densitométrico mediante el software ImageJ (NIH, Maryland,
EEUU).
Por último para confirmar la cantidad de carga de proteína en cada carrera del gel, se
realizó “stripping”, que consiste en la retirada de los anticuerpos adsorbidos en la
membrana mediante un tratamiento con elevada temperatura (55ºC) durante 15 min en
una solución que contenia agentes desnautralizantes como el -Mercaptoetanol y SDS.
Tras el “stripping”, las membranas se volvieron a incubar con anticuerpo primario
frente a Actina (mouse anti human alfa-beta-Actin) (Sigma, St Louis, EEUU), proteína
que se expresa de modo constitutivo en todas las muestras.
2.9. Caracterización inmunohistoquímica de infiltrado leucocitario
Para la carcaterización del infarto a nivel tisular, se partió de las rodajas de corazón
incubadas con TTZ y de los órganos linfoides secundarios extraidos del cerdo. Para ello
se cortaron biopsias de 1 x 0,5cm que se fijaron en 10% de formalina y se incluyeron en
Material y Métodos
70
parafina. Seguidamente, se cortaron en micrótomo cortes de 5 μm de grosor y se
tiñieron con hematoxilina-eosina (HE) (DAKO, Madrid, España). Además se tiñeron
muestras de ganglio mesentérico, mediastinal y bazo.
Todas las muestras se observaron en un microscopio óptico Leica DMD 108 (Leica
Systems, Madrid España) y se fotografiaron para su posterior análisis. Se caracterizaron
histológicamente las áreas infarto, adyacente y remota del miocardio. Para caracterizar
el infiltrado de los distintos tipos leucocitarios se recurrió al marcaje por
inmunohistoquimica.
Tabla 4. Anticuerpos usados en inmunohistoquímica del modelo animal
Célula Proteína marcador Anticuerpo
Neutrófilos Mieloperoxidasa Mouse anti human MPO clon 30-F11
Monocitos Calprotectina Mouse anti human L1 clon MAC 387
Linfocitos T CD3 Rabbit anti Human CD3 clon CD3-12
Linfocitos B CD79a Mouse anti human CD79a clon HM57
Linfocitos Treg FOXP3 Rat anti Mouse FOXP3
En breve, tras desparafinar y rehidratar los cortes, se bloquearon durante 15min con
Dako Blocking solution (DAKO, Madrid, España). A continuación las secciones se
lavaron y se incubaron toda la noche a 4ºC con el correspondiente anticuerpo primario
(tabla 4).
Tras lavar las secciones se incubaron con el correspondiente anticuerpo secundario
conjugado con HRP (DAKO, Madrid, España) durante 1h a TA. Tras lavar de nuevo los
cortes se revelaron con 3, 3´´-tetrahidrocloridro de diaminobencidina (DAB) (Dako,
Madrid, España).
Todas las muestras se observaron en un microscopio óptico Leica DMD 108 (Leica
Systems, Madrid España) y se fotografiaron para su posterior análisis.
El análisis de imagen de las muestras de inmunohistoquímica se realizó con el
software Image Proplus 6.0. (Media Cybernetics, Washington, EEUU)
Material y Métodos
71
2.10. Caracterización de la apoptosis en miocardio porcino mediante
TUNEL
Para la caracterización de la apoptosis en tejido porcino se recurrió a la técnica
Terminal-deoxynucleotidyl-transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL), que
consiste en la detección de la fragmentación del DNA que tiene lugar en la apoptosis
mediante el marcaje de los extremos terminales fragmentados del DNA con nucleótidos
de uridina marcados con fluorescencia.
Para ello se utilizó el Kit MEBSTAIN APOPTOSIS KIT II (MBL, Japan) y se
siguieron las instrucciones del fabrcante. En breve tras desparafinar por completo las
muestras, se digirieron con Proteinasa K durante 30min a 37ºC, se hibridaron los
extremos terminales del DNA con dUTPs biotinilados y la enzima dTTP durante 1h
30min a 37ºC, seguidamente se reveló la hibridación con Avidin-FITC II. Finalmente se
contrastaron los núcleos con IP.
Las muestras se observaron y fotografiaron en un microscopio de fluorescencia Leica
DMI 3000.
3. ANALISIS ESTADÍSTICO
3.1. Cálculo del tamaño muestral del estudio en humanos
Para el cálculo del tamaño de la muestra se tuvieron en cuenta los datos provenientes
de 180 pacientes con IAM previamente estudiados con RMC en nuestra institución y
con las mismas características que el grupo de estudio del presente proyecto de los
cuales sabíamos que el porcentaje medio de masa infartada esperable es 25±8%.
Se consideró a partir de la fórmula para cálculo de tamaño muestral en función de la
comparación de proporciones (con un error alfa=5% y un error beta=20%) que 89
pacientes era un número suficiente para detectar diferencias entre los grupos con y sin
alteración de todos los índices de citometría y de biología molecular. Por seguridad se
planeó incluir al menos 98 pacientes en el grupo de estudio.
Material y Métodos
72
3.2. Cálculo del tamaño muestral del estudio en animales
Para el cálculo del tamaño de la muestra se tuvo en cuenta la experiencia previa del
equipo investigador en el infarto experimental en cerdos en los que hay muy poca
variabilidad. Se consideró a partir de la fórmula para cálculo de tamaño muestral en
función de la comparación de proporciones (con un error alfa=5% y un error beta=20%)
que 10 cerdos era un número suficiente para detectar diferencias entre cerdos infarto y
cerdos controles. Sin embargo teniendo en cuenta en número de muertes por fibrilación
en el momento de la reperfusión se decidió que por seguridad el tamaño de la muestra
fuera de 12 cerdos.
3.3. Análisis estadístico de los resultados.
Todos los datos fueron analizados para estudiarlos si seguían una distribución normal
utilizando el test de Kolmogorov-Smirnov para una muestra. Las variables continuas se
expresaron como la media ± la desviación estándar (DE) y fueron comparadas con el
test de la T de student para datos no pareados. El test de ANOVA de una vía se utilizó
para comparar más de dos grupos y el test de Bonferroni para detectar diferencias entre
ellos. Los porcentajes se compararon mediante el estadístico chi-cuadrado y el test
exacto de Fischer se utilizó cuando alguno de los valores esperados en una de las celdas
era menor de 10.
Se consideró significación estadística si p<0,05. Se utilizaron los paquetes
estadísticos SPSS 19.0 (Illinois, EEUU) y GraphPad 6.0 (La Jolla, EEUU).
RESULTADOS
Resultados
75
V. RESULTADOS
1. Características basales de los grupos de estudio
En la tabla 5 se muestran las características basales de los grupos de estudio.
El grupo IAMEST, como ya se ha indicado anteriormente, se compuso finalmente de
98 pacientes con una edad media de 60 ± 11 años y un 71% de hombres. Los pacientes
de IAMEST mostraron un perfil cardiovascular de riesgo elevado en muchos casos:
23% eran diabéticos, 39% hipertensos y más de un 40% tenían hipercolesterolemia.
En cuanto al grupo control la edad media fue de 57 ± 13, un alto porcentaje eran
varones (76%), y al igual que en el grupo IAMEST, también presentaron distintos
factores de riesgo cardiovascular: 17% diabetes, y casi la mitad hipercolesterolemia
(41%) e hipertensión (45%).
No se observaron diferencias significativas entre los grupos control e IAMEST.
Tabla 5. Características basales de los grupos de estudio
IAMEST (n=98) Controles (n=30) p
Edad (años) 60 ± 11 57 ± 13 0,06
Sexo varón (%) 71 (71) 23 (76) 0,08
Diabetes Mellitus (%) 23 (23) 5 (17) 0,2
Hipertensión arterial (%) 39 (39) 13 (45) 0,3
Hipercolesterolemia (%) 41 (41) 12 (41) 1
Tabaquismo (%) 68 (68) 19 (64) 0,4
Enfermedad coronaria previa (%) 0 (0) 0 (0) 1
Resultados
76
2. Características clínicas y angiográficas del grupo IAMEST
Tras el IAMEST, un 65% de los infartos fueron anteriores y un 32% inferiores. El
tiempo medio desde el inicio del dolor hasta la reperfusión fue de 4,15 3,13 horas. En
un 51% de los casos la estrategia de reperfusión empleada fue la angioplastia primaria,
mientras que en un 49% de los casos fue trombólisis. De ellos, el 12% de los pacientes
requirieron la realización de una angioplastia de rescate ya que no cumplieron criterios
clínicos y/o electrocardiográficos de reperfusión tras la trombólisis. Al analizar las
características angiográficas, la mayoría de pacientes (91%) presentaron un flujo TIMI
III tras la angioplastia, mientras que en un 74% se vio un “Blush” miocárdico 2-3.
La tabla 6 muestra las características clínicas y angiográficas de los pacientes con
IAMEST.
Tabla 6. Características clínicas y angiográficas del grupo IAMEST
IAMEST (n=98)
Frecuencia cardiaca (latidos por min) 79 ± 23
Presión sistólica (mm Hg) 132 ± 31
Clase Killip (%)
I 82 (82)
II 16 (16)
III 1 (1)
IV 1 (1)
Tiempo de reperfusión(min) 249 ± 188
Angioplastia primaria (%) 51 (51)
Trombólisis (%) 49 (49)
Angioplastia de rescate (%) 12 (12)
Infarto anterior (%) 65 (65)
Flujo TIMI 3 (%) 91 (91)
“Blush” 2-3 (%) 74 (74)
TIMI: Thrombolysis In Myocardial Infarction
Resultados
77
3. Características de RMC del grupo IAMEST
Las características de la RMC del grupo IAMEST se recogen en la tabla 7. Como ya
se ha referido anteriormente, se excluyeron aquellos pacientes que murieron durante el
ingreso, sufrieron un re-infarto, con inestabilidad clínica o hemodinámica, aquellos
sometidos a cirugía de revascularización o en caso de contraindicación para la
realización de la RMC (pacientes claustrofóbicos, portadores de marcapasos…) y por
decisión médica.
Los pacientes a los que se realizó una RMC tras el IAMEST presentaban entre otros,
una media de masa infartada de 22 ± 15 % y una media de masa con OMV del 2 ± 5 %.
Un 47% de los 98 pacientes presentaron infartos extensos, se consideró infarto
extenso un porcentaje de masa de VI infartada superior a la mediana (19,8%).
Además, se observó en un 37% de los pacientes la presencia de OMV (presente en
más de 1 segmento con defecto en la captación tardía de gadolinio).
Tabla 7. Características de RMC del grupo IAMEST
IAMEST (n=98)
Volumen telediastólico (ml/m2) 80 ± 24
Volumen telesistólico (ml/m2) 40 ± 21
Fracción de eyección (%) 52 ± 13
Masa VI (g/m2) 71 ± 16
Porcentaje de masa VI infartada 22 ± 15
Porcentaje de masa VI con OMV 2 ± 5
Pacientes con Infarto extenso (%) 47 (47)
Pacientes con OMV (%) 37 (37)
VI: Ventrículo izquierdo; OMV: Obstrucción Microvascular.
Resultados
78
4. Dinámica de la respuesta inmune adaptativa en sangre periférica de pacientes
con IAMEST
4.1. Dinámica de los leucocitos en pacientes con IAMEST
Con la finalidad de estudiar la dinámica de las células de la respuesta inmune
adaptativa, se realizó un análisis inicial de la dinámica de los tipos de leucocitos en
sangre en pacientes con IAMEST a distintos tiempos (Figura 21). Basándose en los
resultados de los hemogramas recogidos secuencialmente del hospital.
En comparación con la muestra pre-reperfusión (0h) los leucocitos aumentaron
significativamente durante las primeras horas del infarto, para luego descender
progresivamente tras la reperfusión.
Figura 21. Dinámica del recuento leucocitario (células/l) en sangre periférica en
pacientes con IAMEST antes y después de la reperfusión. (*p<0,05; **p<0,01;
***p<0,001; ****p<0,0001).
Los neutrófilos aumentaron durante primeras horas sin embargo comenzaron a
0h 12h 24h 48h 72h 96h0
10000
20000
30000
cels
/μl
Leucocitos
Mean
Std. Deviation
0h
12058
4007
12h
11733
3971
24h
10721
3588
48h
10057
3370
72h
9488
3077
* ******** **** ****
0h 12h 24h 48h 72h 96h0
2000
4000
6000
cels
/μl
Linfocitos
Mean
Std. Deviation
0h
2357
1455
12h
1768
835
24h
1926
859
48h
1893
755
72h
1878
746
**** **** **** **** ****
0h 12h 24h 48h 72h 96h0
5000
10000
15000
20000
ce
ls/μl
Neutrofilos
Mean
Std. Deviation
0h
8838
3732
12h
9200
3771
24h
7910
3401
48h
7229
3085
72h
6762
3233
*****
**** **** ****
0h 12h 24h 48h 72h 96h0
500
1000
1500
2000
cels
/μl
Monocitos
Mean
Std. Deviation
0h
585
262
12h
621
278
24h
678
373
48h
684
286
72h
662
282
******* **** **** ****
Resultados
79
descender tras 24h de la reperfusión. Por otro lado, los monocitos aumentaron de modo
más tardío, observándose un incremento progresivo a partir de 24h, este incremento se
mantuvo durante las 96h siguientes.
Por otro lado, los linfocitos se comportaron de modo distinto al resto de las
poblaciones leucocitarias, éstos descendieron significativamente respecto de la muestra
pre-reperfusión (0h), este descenso se mantuvo hasta las 96h después.
En comparación con los controles (Figura 22), los leucocitos se incrementaron
durante las primeras 96 horas del infarto. Los neutrófilos, al igual que los leucocitos,
aumentaron significativamente respecto de controles durante las primeras 96h.
Figura 22. Dinámica del recuento leucocitario (células/l) en sangre periférica en
pacientes con IAMEST respecto de controles. (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001;
****p<0,0001. ns: no significativo).
Los linfocitos, por el contrario, descendieron significativamente tras 24h de la
reperfusión para volver a recuperarse. Los monocitos, al igual que lo observado en la
Leucocitos
Controles 0h 24h 96h 30d0
5000
10000
15000
20000
cels
/μl
****
****
Mean
Std. Deviation
Controles
6525
1915
0h
12103
4560
24h
11403
3290
96h
8675
2227
30d
7676
1915
**ns
IAMEST (n=18)
Controles (n=30)
Neutrófilos
Controles 0h 24h 96h 30d0
5000
10000
15000
cels
/μl
********
Mean
Std. Deviation
Controles
3989
1387
0h
9639
4130
24h
9197
3193
96h
5897
1987
30d
4737
1276
**
ns
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
Linfocitos
Controles 0h 24h 96h 30d0
1000
2000
3000cels
/μl
ns
**
Mean
Std. Deviation
Controles
1905
676
0h
1650
611
24h
1406
473
96h
1841
491
30d
1927
620
nsns
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
Monocitos
Controles 0h 24h 96h 30d0
200
400
600
800
1000
cels
/μl ns
**
Mean
Std. Deviation
Controles
418
141
0h
465
158
24h
575
209
96h
638
184
30d
522
173
****
ns
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
Resultados
80
figura 21, incrementaron progresivamente tras la reperfusión para alcanzar su pico
máximo al cabo de 96h.
4.2. Dinámica de las citoquinas en pacientes con IAMEST
Con la finalidad de describir el contexto inflamatorio del infarto se analizó la
dinámica de citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias en suero de pacientes con
IAMEST y en suero de controles.
Figura 23. Dinámica de los niveles de citoquinas IFN-, IL-1, IL-6 y TNF-,
(pg/ml) en suero de pacientes con IAMEST y en controles. (*p<0,05; **p<0,01;
***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no significativo).
En primer lugar se observó un incremento global de las citoquinas pro-inflamatorias
IFN-, IL-1, IL-6 y TNF- en pacientes con IAMEST respecto de controles (Figura
23).
El IFN- se incrementó de modo significativo durante las primeras 24h del infarto,
descendió ligeramente tras 96h y volvió a ascender tras 30d.
Se observó que la citoquina IL-1 aumentaba significativamente durante las primeras
pg
/ml
Controles 0h 24h 96h 30d0
2
4
6
8
Mean
Std. Deviation
Controles
2.7
0.95
0h
4.1
2.0
24h
4.1
1.6
96h
3.6
0.99
30d
4.4
1.4
**
ns
**
IFN-gControles (n=30)
IAMEST (n=18)
IFN-g
Controles 24h0
2
4
6
8
pg
/ml
**
Mean
Std. Deviation
Controles
3.1
1.3
24h
4.4
2.5
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
pg
/ml
Controles 0h 24h 96h 30d0
1
2
3
4
5
Mean
Std. Deviation
Controles
1.9
1.2
0h
2.8
0.66
24h
3.0
0.25
96h
3.1
1.2
30d
3.0
0.92
* **
****
IL-1 b
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
IL-1 b
Controles 24h0
1
2
3
4
pg
/ml
**
Mean
Std. Deviation
Controles
1.9
1.2
24h
2.6
1.2
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
pg
/ml
Controles 0h 24h 96h 30d0
10
20
30
40
50
Mean
Std. Deviation
Controles
3.5
0.82
0h
5.8
3.5
24h
14
8.4
96h
25
17
30d
9.8
7.1
ns
***
****
ns
IL-6
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
IL-6
Controles 24h0
5
10
15
20
25
pg
/ml
****
Mean
Std. Deviation
Controles
3.5
0.82
24h
14
7.5
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
pg
/ml
Controles 0h 24h 96h 30d0
5
10
15
Mean
Std. Deviation
Controles
4.2
1.1
0h
5.3
0.98
24h
6.1
2.2
96h
7.4
2.7
30d
6.5
2.1
ns
******
***
TNF-a
IAMEST (n=18)
Controles (n=30)
TNF-a
Controles 24h0
2
4
6
8
10
pg
/ml
****
Mean
Std. Deviation
Controles
4.2
1.1
24h
6.6
2.1
Controles (n=30)IAMEST (n=98)
Resultados
81
horas de la isquemia y que su efecto incluso aumentaba tras la reperfusión y además se
mantenía al cabo de 30 días.
Por otro lado, el TNF- se incrementaba progresivamente tras 24h de reperfusión, y
alcanzaba su pico máximo al cabo de 96h para luego mantenerse durante 30 días.
La citoquina IL-6 aumentó de modo más tardío experimentando un pico muy elevado
tras 96h coincidiendo con el pico de TNF- y de IL-1. Al cabo de 30 días los niveles
de IL-6 descendieron a sus valores basales.
La figura 24 muestra la concentración de citoquinas de carácter no inflamatorio en
suero de pacientes con IAMEST y controles.
Figura 24. Dinámica de los niveles de citoquinas IL-10, IL-4 y TGF- (pg/ml) en
suero de pacientes con IAMEST y en controles. (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001;
****p<0,0001. ns: no significativo).
No se observaron cambios estadísticamente significativos en los niveles de IL-10. La
citoquina IL-4 descendió de modo significativo tras 24h en comparación con controles.
Por otro lado, la citoquina pleiotrópica TGF- aumentó de modo significativo tras 24h
de la reperfusión.
Controles 0h 24h 96h 30d0
2
4
6
8
10
pg
/ml
Mean
Std. Deviation
Controles
4.1
1.6
0h
3.2
0.69
24h
3.1
1.3
96h
3.4
1.0
30d
3.3
0.79
nsns ns ns
IL-10
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
IL-10
Controles 24h0
2
4
6
8
pg
/ml
ns
Mean
Std. Deviation
Controles
4.3
1.7
24h
3.6
1.7
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
pg
/ml
Controles 0h 24h 96h 30d0
2
4
6
8
Mean
Std. Deviation
Controles
4.3
2.2
0h
3.8
1.3
24h
2.7
0.88
96h
3.6
0.66
30d
3.3
0.71
ns
*ns ns
IL- 4
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
IL-4
Controles 24h0
2
4
6
8
pg
/ml ****
Mean
Std. Deviation
Controles
4.3
2.2
24h
2.8
1.2
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
pg
/ml
Controles 0h 24h 96h 30d0
10000
20000
30000
40000
Mean
Std. Deviation
Controles
16225
5931
0h
22194
10677
24h
23695
9915
96h
20926
10213
30d
21382
7132
ns *ns
ns
TGF-β
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
TGF-β
Controles 24h0
10000
20000
30000
40000
pg
/ml
****
Mean
Std. Deviation
Controles
16225
5931
24h
26747
8638
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
Resultados
82
4.3. Dinámica de los linfocitos T, linfocitos B y linfocitos NK en pacientes con
IAMEST
Con la finalidad de analizar los cambios dinámicos que acontecen en el IAMEST se
analizaron los distintos subtipos linfocitarios. En primer lugar se cuantificaron los tres
grandes grupos de linfocitos: linfocitos T, linfocitos B y linfocitos NK.
Figura 25. Dinámica de linfocitos T (CD3+CD19) y linfocitos B (CD3-CD19+)
(células/l). Arriba: gráficos dot plot de citometría de flujo correspondientes a un
control y un paciente con IAMEST. Abajo: análisis secuencial y análisis tras 24h.
(*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no significativo).
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
0h 96h10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD3
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD
19
24h 30dControl
Linfocitos T
Controles 0h 24h 96h 30d0
500
1000
1500
2000
2500
CD
3+ c
els/μl ns
*
Mean
Std. Deviation
Controles
1371
558
0h
1152
679
24h
894
425
96h
1396
675
30d
1401
608
ns ns
IAMEST (n=18)
Controles (n=30)
Linfocitos T
CD
3+ c
els/μl
Controles 24h0
500
1000
1500
2000
2500
**
Mean
Std. Deviation
Controles
1371
558
24h
1055
460
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
Linfocitos B
Controles 0h 24h 96h 30d0
100
200
300
400
CD
3- C
D19
+ c
els/μl
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
**
Mean
Std. Deviation
Controles
90
59
0h
172
117
24h
228
80
96h
169
99
30d
176
114
**
*
Linfocitos B
CD
3- C
D19
+ c
els/μl
Controles 24h0
100
200
300
400
500
**
Mean
Std. Deviation
Controles
90
59
24h
222
162
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
Resultados
83
Los linfocitos T considerados como CD3+CD19-, descendieron de modo
significativo tras 24h de la reperfusión en comparación con los controles, seguidamente
se recuperaron hasta alcanzar los valores normales (Figura 25).
Contrariamente, los linfocitos B, definidos como CD3- CD19+ aumentaron de modo
paulatino durante el infarto, alcanzaron el pico máximo tras 24h de la reperfusión y se
mantuvieron significativamente elevados hasta 30 días después (Figura 25).
Por otro lado, los linfocitos NK, definidos como CD3- CD56+CD16+, descendieron
de modo muy significativo tras 24h, alcanzado su valor mínimo al cabo de 96h de la
reperfusión para luego recuperar los valores basales (Figura 26).
Figura 26. Dinámica de linfocitos NK (CD3-16+) (células/l). Arriba: gráficos dot
plot de citometría de flujo correspondientes a un control y un paciente con
IAMEST. Abajo: análisis secuencial y análisis tras 24h. (*p<0,05; **p<0,01;
***p<0,001; ****p<0,0001) (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no
significativo).
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD16 CD56
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD
3
0h 24h 96h 30d10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
Control
Natural Killers
Controls 0h 24h 96h 30d0
200
400
600
800
CD
3-
CD
16
+ C
D5
6+
ce
ls/μl
ns
*
Mean
Std. Deviation
Controls
359
228
0h
352
165
24h
227
128
96h
200
66
30d
298
144
**
ns
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
Natural Killers
CD
3-
CD
16
+ C
D5
6+
ce
ls/μl
Controles 24h0
200
400
600
800
***
Mean
Std. Deviation
Controles
358
227
24h
228
122
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
Resultados
84
4.4. Dinámica de los linfocitos CD4 y CD8 en pacientes con IAMEST
En comparación con los controles, los linfocitos T helper (Th) CD4+ descendieron
significativamente durante las primeras horas del infarto y la reperfusión. Esta tendencia
se mantuvo en el grupo de 98 pacientes pero no fue significativa (Figura 27).
Figura 27. Dinámica de linfocitos Th (CD3+CD4+) y linfocitos Tc (CD3+CD8+)
(células/l). Arriba: gráficos dot plot de citometría de flujo correspondientes a un
control y un paciente con IAMEST. Abajo análisis secuencial y tras 24h. (*p<0,05;
**p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no significativo).
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD8
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD
4
0h 24h 96h 30d10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
Control
CD4
Controles 0h 24h 96h 30d0
500
1000
1500
CD
3+
CD
4+
ce
ls/μl
ns
**
Mean
Std. Deviation
Controles
819
308
0h
697
193
24h
532
208
96h
890
326
30d
816
306
nsns
IAMEST (n=18)
Controles (n=30)
CD4
CD
3+
CD
4+
ce
ls/μl
Controles 24h0
500
1000
1500
ns
Mean
Std. Deviation
Controles
819
308
24h
712
335
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
CD8
Controles 0h 24h 96h 30d0
200
400
600
800
CD
3+
CD
8+
ce
ls/μl
**
Mean
Std. Deviation
Controles
459
292
0h
301
144
24h
240
143
96h
310
136
30d
328
147
nsns
IAMEST (n=18)
Controles (n=30)
*
CD8
CD
3+
CD
8+
ce
ls/μl
Controles 24h0
200
400
600
800
**
Mean
Std. Deviation
Controles
459
292
24h
319
189
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
Resultados
85
Por otro lado los linfocitos T citotóxicos (Tc) (CD8+) descendieron
significativamente, esta tendencia se manutuvo en el grupo de 98 pacientes con
IAMEST.
Un parámetro que se suele observar es el ratio CD4/CD8 ya que indica si las células
predominantes en la respuesta inmune son los linfocitos Th o los Tc. En este caso el
ratio CD4/CD8 de los pacientes con IAMEST fue significativamente más elevado
respecto de controles tras 24h de la reperfusión (Figura 28).
Figura 28. Ratio CD4/CD8. (*p<0,05).
CD4/CD8
Controles 24h0
1
2
3
4
5*
Mean
Std. Deviation
Controles
2.2
1.1
24h
2.8
1.6
Resultados
86
4.5. Dinámica de los linfocitos Th1, Th2 y Th17 en pacientes con IAMEST.
A continuación se estudió la dinámica de los linfocitos Th (CD3+ CD4+).
En primer lugar se estudiaron los linfocitos Th1, definidos como
CD3+CD4+CXCR3+ (Figura 29) y mediante la expresión génica del factor de
transcripción Tbetx.
Figura 29. Arriba: Gráficos dot plot de citometría de flujo correspondientes a un
control y un paciente con IAMEST Th1 (CD3+CD4+CXCR3) y linfocitos Th2
(CD3+CD4+CCR4+). Abajo: Dinámica de linfocitos Th1 (CD3+CD4+CXCR3)
(células/l) y expresión génica del factor T-betx en pacientes con IAMEST y
controles. (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no significativo).
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
0h 96h10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CXCR3
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CC
R4
24h 30dControl
Linfocitos Th1
Controles 0h 24h 96h 30d0
500
1000
1500
CD
3+
CD
4+
CX
CR
3+
ce
ls/μl
ns
*
Mean
Std. Deviation
Controles
662
310
0h
487
252
24h
400
224
96h
616
291
30d
549
207
nsns
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
Linfocitos Th1
CD
3+
CD
4+
CX
CR
3+
ce
ls/μl
Controles 24h0
500
1000
1500
*
Mean
Std. Deviation
Controles
662
310
24h
499
295
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
Controles 0h 24h 96h 30d0
2
4
6
8
Tbetx
mR
NA
fo
ld c
han
ge
ns
** *
ns
Mean
Std. Deviation
0h
4.5
2.9
24h
1.8
1.5
96h
2.4
1.1
30d
4.0
2.9
Controles
4.9
1.8
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
Tbetx
Controles 24h0.0
0.5
1.0
1.5
mR
NA
fo
ld c
han
ge
Mean
Std. Deviation
24h
0.67
0.38
Controles
1.2
0.67
***
IAMEST (n=98)
Controles (n=30)
Resultados
87
En comparación con los controles, los linfocitos Th1 descendieron significativamente
durante las primeras horas del infarto y la reperfusión. Se observó un descenso de
linfocitos Th1 analizados mediante citometría de flujo y mediante la expresión génica
del factor de transcripción TbetX (Figura 29).
Seguidamente se estudiaron los linfocitos Th2, definidos mediante citometría de flujo
como CD3+ CD4+ CCR4+ (Figura 29), y mediante la expresión génica del factor Gata3
(Figuras 29 y 30).
Figura 30. Dinámica de linfocitos Th2 (CD3+CD4+CCR4) (células/l) y expresión
génica del factor GATA3 en pacientes con IAMEST y controles. (*p<0,05;
**p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no significativo).
En el grupo de 98 pacientes se observó un aumento de linfocitos Th2 24h post-
reperfusión en comparación con controles y analizado mediante citometría de flujo. Este
resultado no se correspondió con cambios significativos de la expresión génica de
Linfocitos Th2
Controles 0h 24h 96h 30d0
200
400
600
CD
3+
CD
4+
CC
R4
+ c
els
/μl
nsns
Mean
Std. Deviation
Controles
257
108
0h
234
123
24h
211
125
96h
301
151
30d
322
156
nsns
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
Linfocitos Th2
CD
3+
CD
4+
CC
R4
+ c
els
/μl
Controles 24h0
200
400
600
800
**
Mean
Std. Deviation
Controles
257
108
24h
395
249
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
Controles 0h 24h 96h 30d0
2
4
6
8
GATA3
mR
NA
fo
ld c
han
ge
**
ns
*
***
Mean
Std. Deviation
0h
3.9
1.4
24h
2.4
0.86
96h
3.7
2.0
30d
4.6
2.0
Controles
1.6
0.54
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
GATA3
Controles 24h0.0
0.5
1.0
1.5
mR
NA
fo
ld c
han
ge
Mean
Std. Deviation
24h
0.94
0.58
Controles
1.1
0.42
ns
IAMEST (n=98)
Controles (n=30)
Resultados
88
GATA3 tras 24h a pesar de incrementarse durante la isquemia y volver a aumentar
después de 96h y 30dias de la reperfusión.
Los linfocitos Th17 se analizaron mediante la expresión del factor de transcripción
ROR y mediante los niveles de IL-17 en suero. Se observó que los linfocitos Th17
aumentaron significativamente antes de la reperfusión, en condiciones de isquemia
cardiaca, sin embargo durante las primeras 24 horas de la reperfusión descendieron
significativamente, para volverse a recuperar y mantenerse elevados tras 96h y 30 días
de la reperfusión (Figura 31).
Los niveles de IL-17 en suero, por otro lado se mantuvieron significativamente bajos
respecto controles durante todos los tiempos de extracciones.
Figura 31. Dinámica de la expresión del factor ROR- en pacientes con IAMEST y
controles. Dinámica de la concentración de IL-17 (pg/ml) en suero de pacientes con
IAMEST y controles. (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no
significativo).
Controles 0h 24h 96h 30d0
1
2
3
4
5
RORγ
mR
NA
fo
ld c
han
ge *
ns
**
Mean
Std. Deviation
0h
2.4
1.6
24h
1.7
0.60
96h
2.4
1.5
30d
2.5
1.6
Controls
1.1
0.54
Controles (n=30)IAMEST (n=18)
RORγ
Controles 24h0.0
0.5
1.0
1.5
mR
NA
fo
ld c
han
ge
Mean
Std. Deviation
24h
0.68
0.37
Controls
0.99
0.55
*
IAMEST (n=98)
Controles (n=30)
pg
/ml
Controles 0h 24h 96h 30d0
2
4
6
8
10
Mean
Std. Deviation
Controles
4.9
3.1
0h
1.4
1.6
24h
1.5
1.8
96h
1.2
1.3
30d
1.4
1.9
* **
*
IL-17
IAMEST (n=18)
Controles (n=30)
IL-17
Controles 24h0
2
4
6
8
10
pg
/ml
*
Mean
Std. Deviation
Controles
4.9
3.1
24h
1.5
1.8
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
Resultados
89
4.6. Dinámica de los linfocitos Treg en pacientes con IAMEST
En comparación con controles, los linfocitos Treg (CD3+ CD4+ CD25hi FOXP3+)
no mostraron cambios significativos durante las primeras horas del infarto y de la
reperfusión. Sin embargo se observó un incremento significativo de la expresión de
FOXP3 a partir de las 96h post-reperfusión, este incremento se acrecentó tras 30 días en
el estudio de citometría así como la expresión de FOXP3 (Figura 32).
Figura 32. Dinámica de linfocitos Treg (células/l) y dinámica de la expresión
génica de FOXP3 en pacientes con IAMEST y controles. (*p<0,05; **p<0,01;
***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no significativo).
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
0h 96h10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
FOXP3
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD
25
hi
24h 30dControl
Treg
Controles 0h 24h 96h 30d0
10
20
30
40
CD
4+
CD
25h
i F
OX
P3+
cels
/μl
nsns
Mean
Std. Deviation
Controles
7.3
5.7
0h
7.4
4.4
24h
5.9
2.7
96h
12
9.2
30d
20
14
ns
****Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
Treg
CD
4+
CD
25h
i F
OX
P3+
cels
/μl
Controles 24h0
5
10
15
20
ns
Mean
Std. Deviation
Controles
7.3
5.7
24h
8.7
5.8
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
Controles 0h 24h 96h 30d0
2
4
6
8FOXP3
mR
NA
fo
ld c
han
ge
ns ns *
***
Mean
Std. Deviation
0h
3.1
1.3
24h
2.8
1.8
96h
3.2
1.6
30d
4.4
1.4
Controles
1.5
1.5
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
FOXP3
Controles 24h0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
mR
NA
fo
ld c
han
ge
Mean
Std. Deviation
24h
1.4
1.4
Controles
1.1
0.44
nsControles (n=30)
IAMEST (n=98)
Resultados
90
La expresión del receptor CTLA-4 siguió la misma distribución que FOXP3 y los
linfocitos Treg. De modo que se incrementó de forma significativa tras 30 dias de la
reperfusión.
Figura 33. Dinámica de la expresión génica de CTLA-4 en pacientes con IAMEST
y controles. (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no significativo).
Controles 0h 24h 96h 30d0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
mR
NA
fo
ld c
han
ge ns
ns
ns
*
Mean
Std. Deviation
0h
1.4
0.65
24h
1.0
0.37
96h
0.71
0.20
30d
1.7
0.53
Controles
1.0
0.24
CTLA- 4
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
Resultados
91
4.7. Dinámica de los linfocitos T CD4 memoria y naïve en pacientes con IAMEST
En conjunto no se observaron diferencias significativas en los linfocitos T CD4 de
memoria (CD3+ CD4+ CD45R0+) (Figura 34).
Sin embargo se observó un ligero descenso de los linfocitos CD4 naïve (CD3+ CD4+
CD45R0-) tras la reperfusión , para luego aumentar significativamente tras 96h.
Figura 34. Dinámica de CD4 memoria y naïve (células/l) en pacientes con
IAMEST y controles. (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no
significativo).
Por otro lado, el análisis en detalle de los linfocitos T CD4 memoria, en forma de los
dos subtipos de memoria descritos: memoria central (CD3+ CD4+ CD45R0+ CD62L+)
y efectores de memoria (CD3+ CD4+ CD45R0+ CD62L-), mostró que existía un
0h 96h10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD45R0
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD
4
24h 30d10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
Control
Linfocitos Th Memoria
Controles 0h 24h 96h 30d0
200
400
600
800
CD
4+C
D45
R0h
i (ce
ls/μl)
nsns
Mean
Std. Deviation
Controles
401
202
0h
317
140
24h
256
161
96h
436
163
30d
444
217
nsns
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
Linfocitos Th naïve
Controles 0h 24h 96h 30d0
100
200
300
400
CD
4+C
D45
R0-
(ce
ls/μl)
nsns
Mean
Std. Deviation
Controles
149
86
0h
102
65
24h
140
53
96h
233
107
30d
181
104
*ns
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
Linfocitos Th Memoria
CD
4+C
D45
R0h
i (ce
ls/μl)
Controles 24h0
200
400
600
800
ns
Mean
Std. Deviation
Controles
401
202
24h
341
186
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
Linfocitos Th naïve
CD
4+C
D45
R0-
(ce
ls/μl)
Controles 24h0
100
200
300
400
ns
Mean
Std. Deviation
Controles
149
86
24h
169
118
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
Resultados
92
descenso muy significativo de los linfocitos CD4 memoria central durante las primeras
horas del infarto y la reperfusión. Por otro lado los linfocitos CD4 efectores de memoria
aumentaban de manera significativa antes de la reperfusión y tras 30 días (Figura 35).
Figura 35. Dinámica de linfocitos CD4 memoria central y CD4 efectores de
memoria (células/l) en pacientes con IAMEST y controles. (*p<0,05; **p<0,01;
***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no significativo).
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD45R0
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD
62
L
0h 96h24h 30dControl
Linfocitos Th memoria central
Controls 0h 24h 96h 30d0
100
200
300
400
500
CD
4+
CD
45
R0
hi
CD
62
L+
(c
els
/μl)
* *
Mean
Std. Deviation
Controls
252
150
0h
156
110
24h
144
109
96h
188
85
30d
205
101
nsns
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
Linfocitos Th efectores de memoria
Controls 0h 24h 96h 30d0
100
200
300
400
CD
4+
CD
45R
0h
i C
D62L
- (c
els
/μl)
***
ns
Mean
Std. Deviation
Controls
119
63
0h
238
79
24h
115
52
96h
164
67
30d
230
150
ns
***Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
Linfocitos Th memoria central
CD
4+
CD
45R
0h
i C
D62L
+ (
cels
/μl)
Controles 24h0
100
200
300
400
500
*
Mean
Std. Deviation
Controles
252
150
24h
178
123
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
Linfocitos Th efectores de memoria
CD
4+
CD
45R
0h
i C
D62L
- (c
els
/μl)
Controles 24h0
100
200
300ns
Mean
Std. Deviation
Controles
150
105
24h
164
98
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
Resultados
93
Para el análisis de la activación linfocitaria se consideraron linfocitos T activados los
linfocitos CD3 positivos para HLA-DR mediante citometría de flujo.
Respecto de controles se observaron dos incrementos significativos de linfocitos T
activados: antes de la reperfusión y tras 30 días (Figura 36). Sin embargo, no se
observaron diferencias entre controles y pacientes con IAMEST a las 24h.
Figura 36. Dinámica de linfocitos T activados (CD3+ HLA-DR+) (células/l) en
pacientes con IAMEST y controles. (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001;
****p<0,0001. ns: no significativo).
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
0h 96h10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD3
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
HL
A-D
R
24h 30dControl
Linfocitos T activados
Controles 0h 24h 96h 30d0
100
200
300
400
CD
3+
HL
A-D
R+
(c
els
/μl)
*
ns
Mean
Std. Deviation
Controles
135
67
0h
221
87
24h
167
89
96h
178
94
30d
236
93
ns
**
Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
Linfocitos T activados
CD
3+
HL
A-D
R+
(c
els
/μl)
Controles 24h0
100
200
300
400
ns
Mean
Std. Deviation
Controles
201
106
24h
179
111
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
4.8. Dinámica de los linfocitos T activados en pacientes con IAMEST
Resultados
94
4.9. Dinámica de los linfocitos T autorreactivos en pacientes con IAMEST
Los linfocitos autorreactivos son una población de interés en nuestro estudio, por lo
que se realizó el análisis de la población CD4+CD28null en pacientes con IAMEST y
en controles.
Se observó que se producia un incremento estadísticamente siginificativo de los
CD4+CD28null al cabo de 30 días del infarto. Sin embargo, no se observaron
diferencias significativas entre controles y pacientes tras 24h (Figura 37).
Figura 37. Dinámica de linfocitos Th autorreactivos (CD4+ CD28null) (células/l)
en pacientes con IAMEST y controles. (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001;
****p<0,0001. ns: no significativo).
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
0h 96h10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD
28
24h 30dControl
Linfocitos Th autorreactivos
Controles 0h 24h 96h 30d0
50
100
150
CD
4+
CD
28
- (c
els
/μl)
ns ns
Mean
Std. Deviation
Controles
30
21
0h
31
19
24h
28
18
96h
42
32
30d
63
63
ns
*Controles (n=30)
IAMEST (n=18)
LInfocitos Th autorreactivos
CD
4+
CD
28
- (c
els
/μl)
Controles 24h0
20
40
60
ns
Mean
Std. Deviation
Controles
30
20
24h
27
20
Controles (n=30)
IAMEST (n=98)
Resultados
95
4.10. Resumen de la dinámica de los subtipos linfocitarios en pacientes con
IAMEST
A continuación se muestra un resumen de los cambios dinámicos acontecidos en las
poblaciones linfocitarias en pacientes con IAMEST en comparación con controles.
La figura 38 muestra la relación de la subpoblaciones linfocitarias cuantificadas
mediante citometría de flujo en pacientes con IAMEST antes de la reperfusión respecto
de controles.
Durante las primeras horas del infarto y antes de la reperfusión se produce un
aumento de linfocitos B pero no de linfocitos T.
Sin embargo, a pesar de no observarse cambios en la población global de linfocitos
T, se observan una serie de cambios en distintos subtipos T: se produce un aumento de
los linfocitos T activados así como los linfocitos CD4 efectores de memoria.
Contrariamente los linfocitos CD4 de memoria central descienden junto con los
linfocitos citotóxicos CD8.
Figura 38. Relación del recuento de subtipos linfocitarios (Células/l) en pacientes
con IAMEST antes de la reperfusión respecto de controles (*p<0,05). Las flechas
indican los cambios respecto de controles.
0h
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Control
0h
Linfocitos T
Linfocitos B
CD4
CD8
Th1
Th2
T activados
Treg
Auto-reactivos
CD4 Memoria
CD4 Naïve
CD4 Ef Memoria
CD4 Memoria Cnt
NK
**
*
*
*
cels/μl
Resultados
96
La figura 39 muestra la relación de la subpoblaciones linfocitarias cuantificadas
mediante citometría de flujo en pacientes con IAMEST tras 24h de la reperfusión
respecto de controles.
En este momento se produce el mayor número de cambios dinámicos.
En primer lugar los linfocitos B aumentan un poco más respecto de antes de la
reperfusión y en comparación con controles. Sin embargo los linfocitos T descienden de
modo significativo.
La mayoría de subpoblaciones de linfocitos T descienden, predomina un descenso de
la respuesta inmune celular mediada por un descenso de CD4 y de Th1. Así como un
descenso de la respuesta citotóxica mediada por una caída de los CD8 y NK.
Además de todo esto, los linfocitos CD4 memoria central continúan el descenso que
ya iniciaron antes de la reperfusión.
Figura 39. Relación del recuento de subtipos linfocitarios (Células/l) en pacientes
con IAMEST tras 24h de reperfusión respecto de controles (*p<0,05). Las flechas
indican los cambios respecto de controles.
La figura 40 muestra la relación de la subpoblaciones linfocitarias cuantificadas
mediante citometría de flujo en pacientes con IAMEST tras 96h de la reperfusión
24h
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
24h
Linfocitos T
Linfocitos B
CD4
CD8
Th1
Th2
T activados
Treg
Auto-reactivos
CD4 Memoria
CD4 Naïve
CD4 Ef Memoria
CD4 Memoria Cnt
NKControl*
*
*
**
**
cels/μl
Resultados
97
respecto de controles.
Este periodo no es una etapa de muchos cambios, algunas poblaciones mantienen los
niveles que tenían a las 24h. Como se puede observar en la figura 40, los linfocitos B se
mantienen elevados y los linfocitos NK se mantienen disminuidos.
Sin embargo es especialmente significativo el incremento de CD4 naïve ya que
aumentan significativamente únicamente durante este periodo.
Figura 40. Relación del recuento de subtipos linfocitarios (Células/l) en pacientes
con IAMEST tras 96h de reperfusión respecto de controles (*p<0,05). Las flechas
indican los cambios respecto de controles.
La figura 41 muestra la relación de la subpoblaciones linfocitarias cuantificadas
mediante citometría de flujo en pacientes con IAMEST tras 30d de la reperfusión
respecto de controles.
Se observan algunos cambios similares a los observados antes de la reperfusión.
Los linfocitos B se mantienen elevados.
Y se produce un nuevo incremento de linfocitos T activados y de linfocitos CD4
96h
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
96h
Control
Linfocitos T
Linfocitos B
CD4
CD8
Th1
Th2
T activados
Treg
Auto-reactivos
CD4 Memoria
CD4 Naïve
CD4 Ef Memoria
CD4 Memoria Cnt
NK *
*
cels/μl
*
Resultados
98
efectores de memoria.
Además hay cambios especialmente significativos como son el incremento de
linfocitos Treg y de linfocitos autorreactivos.
Figura 41. Relación del recuento de subtipos linfocitarios (Células/l) en pacientes
con IAMEST tras 30d de reperfusión respecto de controles (*p<0,05). Las flechas
indican los cambios respecto de controles.
30d
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
30d
Linfocitos T
Linfocitos B
CD4
CD8
Th1
Th2
T activados
Treg
Auto-reactivos
CD4 Memoria
CD4 Naïve
CD4 Ef Memoria
CD4 Memoria Cnt
NK
Control
***
*
cels/μl
*
Resultados
99
5. Relación de la dinámica respuesta inmune adaptativa en sangre periférica de
pacientes con IAMEST con el tamaño del infarto
Con la finalidad de determinar la relación del tamaño del infarto con la respuesta
inmune adaptativa se clasificaron a los pacientes a los que se les había cuantificado el
tamaño del infarto mediante RMC en dos grupos: infarto extenso e infarto no extenso,
utilizando como punto de corte la mediana (porcentaje de masa infartada de VI superior
a 19,8%). Y se analizó los cambios dinámicos de la respuesta inmune y su relación con
el tamaño del infarto.
5.1. Relación del recuento leucocitario con el tamaño del infarto
En pacientes con infarto extenso se observó a nivel general un incremento de la
inflamación celular mediada por un aumento de leucocitos totales en sangre, así como
células de respuesta innata tales como neutrófilos y monocitos (Figura 42).
Figura 42. Recuento leucocitario (Células/l) respecto del tamaño del infarto.
(*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001; ns: no significativo).
Sin embargo se advirtió que los pacientes que presentaron un tamaño de infarto más
Resultados
100
extenso, presentaban también un descenso significativo de linfocitos en sangre durante
la fase aguda del infarto (Figura 42).
5.2. Relación de las citoquinas 24h post-reperfusión con el tamaño del infarto
La figura 43 muestra la concentración de citoquinas pro-inflamatorias, anti-
inflamatorias y de carácter pleiotrópico en suero de pacientes con IAMEST tras 24h de
la reperfusión y su relación con el tamaño del infarto. Como se observa en la figura, los
pacientes con infartos extensos presentaron una mayor concentración de citoquinas pro-
inflamatorias IFN-, IL-6, IL-1 y TNF- en suero tras 24h de reperfusión.
Figura 43. Relación de las citoquinas IFN-, IL-10, IL-1, IL-4, IL-6, TNF-, IL17
y TGF- con el tamaño del infarto (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001;
ns: no significativo).
Por otro lado, no se observaron diferencias entre en tamaño del infarto y la
IFN-g IL-10 IL-1b IL-4 IL-6 TNF-a IL-17 TGF-b0
10
20
3020000
30000
40000
pg
/ml
Citoquinas en suero
Infarto extenso (n=47)
Infarto no extenso (n=51)
***ns
**
****
ns
****
ns
*
Resultados
101
concentración de las citoquinas anti-inflamatorias IL-10 e IL-4. Sin embargo, los
pacientes con infartos extensos presentaron una mayor concentración de TGF- suero.
5.3. Relación de las poblaciones linfocitarias 24h post-reperfusión con el tamaño
del infarto
Partiendo del resultado de que un menor número de linfocitos tras 24h de reperfusión
se asocia a un tamaño extenso de infarto. Se estudiaron los subtipos linfocitarios de los
pacientes con IAMEST tras 24h de reperfusión en relación con el tamaño del infarto.
La figura 44 muestra la relación los subtipos linfocitarios estudiados mediante
citometría de flujo con el tamaño del infarto.
Figura 44. Relación de las subpoblaciones linfocitarias con el tamaño del
infarto(*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no significativo).
Tras 24h de reperfusión, los pacientes con infartos extensos, tenían
Linfos
T
Linfos
B CD4
CD8
Th1
Th2
T Act
ivad
osNK
CD4 M
emor
ia
CD4 N
aÏve
Memoria
Central
Efec
tores M
emoria
CD8 S
enes
centes
0
500
1000
1500
2000
cels
/μl
Subpoblaciones linfocitarias
Infarto extenso (n=47)
Infarto no extenso (n=51)
**
ns
ns
*
*
ns
nsns ***
**
* nsns
Resultados
102
significativamente menos linfocitos T en sangre. Sin embargo, no se observaron
cambios en los linfocitos B.
En lo que respecta a los linfocitos CD4 y CD8, o los linfocitos T CD4 no cambiaron
pero los CD8 descendieron significativamente en los pacientes con infartos extensos.
De entre los linfocitos CD4, se observó un descenso muy significativo de la
subpoblación linfocitaria Th1, caracterizada como CD3+ CD4+ CXCR3+, en pacientes
con infarto extenso.
Por otro lado, no se observaron cambios significativos asociados a la relación de
linfocitos Th2 (CD3+ CD4+ CCR4+), los linfocitos T activados, o los NK con el tamaño
del infarto.
De modo destacable, se observó una relación muy significativa entre los linfocitos
naïve, memoria y el tamaño del infarto. Los pacientes con un infarto extenso tenían un
recuento más elevado de linfocitos CD4 memoria. Además, de entre los linfocitos
memoria, los linfocitos de memoria central estaban más elevados en pacientes con un
tamaño del infarto más extenso, por otro lado los linfocitos efectores de memoria, a
pesar de mostrar una tendencia más elevada en los pacientes con infartos extensos, la
diferencia no fue significativa en comparación con infartos menos extensos. De modo
opuesto se observó que los linfocitos CD4 naïve estaban significativamente disminuidos
en los pacientes con infartos extensos.
5.4. Relación de los genes linfocitarios 24h post-reperfusión con el tamaño del
infarto
La figura 45 muestra la relación de la expresión génica en los linfocitos de los
pacientes con IAMEST tras 24h de la reperfusión.
El factor de transcripción TBETX, cuya expresión es característica de linfocitos Th1,
estaba significativamente disminuida en pacientes con infarto extenso, así como la
expresión de FOXP3, asociada a linfocitos Treg.
Por otro lado, la expresión del gen GATA3, característico de los linfocitos Th2, no
cambió respecto al tamaño del infarto, al igual que ROR-, expresado principalmente en
linfocitos Th17.
Resultados
103
Figura 45. Relación de la expresión génica linfocitaria y el tamaño del infarto
(*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no significativo).
TBETX GATA3 RORγ FOXP30.0
0.5
1.0
1.5
2.0m
RN
A f
old
ch
an
ge
Expresión génica linfocitaria
Infarto extenso
Infarto no extenso
**
ns
ns*
Resultados
104
6. Análisis de mecanismos asociados a la alteración de la respuesta inmune
adaptativa en el IAMEST
Para el análisis de los mecanismos que dan lugar a una posible desregulación del
sistema inmune se utilizó en la mayoría de los casos el modelo animal para la
realización de determinaciones experimentales.
6.1. Análisis de la apoptosis linfocitaria en el modelo animal de IAMEST
La figura 46 muestra la dinámica de la apoptosis linfocitaria en cerdos a los que se
les indujo un IAMEST. Se observa que la apoptosis linfocitaria, determinada mediante
el porcentaje de células positivas para AnexinaV en citometría de flujo, se incrementaba
progresivamente y alcanzaba su pico máximo respecto de la muestra basal (0h) tras 2
horas de reperfusión, para seguidamente descender al cabo de 48h.
Figura 46. Dinámica de la apoptosis linfocitaria en cerdos respecto muestra basal
(0h) (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no significativo).
0h 90min 2h 48h-5
0
5
10
15
20
% A
nn
exin
V +
cells
% Apoptosis linfocitaria
ns
*ns
Mean
Std. Deviation
0h
2.6
3.4
90min
3.2
3.6
2h
7.2
4.7
48h
5.4
3.4
Resultados
105
A continuación se estudió la presencia de apoptosis linfocitaria en el infiltrado
inflamatorio del tejido infartado en comparación con el tejido remoto del mismo cerdo.
Como se puede observar en la figura 47, se advirtió presencia de apoptosis de
células mononucleares infiltradas en la región infartada, pero no en la región remota.
Figura 47. Imagen de células mononucleares infiltradas mediante hematoxilina
eosina y apoptóticas mediante TUNEL. (HE: Hematoxilina- eosina); TUNEL:
Terminal-deoxynucleotidyl-transferase dUTP Nick End Labeling.
Se cuantificó la apoptosis linfocitaria del infiltrado inflamatorio en el miocardio
mediante la expresión del factor de apoptosis linfocitaria ligando FAS (FASL). Se
Resultados
106
estudió el miocardio infartado, adyacente y remoto y se comparó con tejido de cerdos
controles.
Como se observa en la figura 48, la expresión génica de FASL en el área infartada
estaba significativamente elevada respecto a miocardio de cerdos controles, así como
del miocardio remoto y adyacente.
Figura 48. Expresión génica de ligando FAS (FASL) en miocardio de cerdos
infartados (áreas infartada, adyacente y remota) y controles (*p<0,05; **p<0,01;
***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no significativo).
Control Remoto Adyacente Infartada0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
mR
NA
fo
ld c
han
ge
FASL
ns
ns
**
Mean
Std. Deviation
Control
0.30
0.10
Remoto
0.72
0.21
Adyacente
0.73
0.45
Infartada
1.2
0.38
Resultados
107
6.2. Análisis de la recirculación linfocitaria en el modelo animal de IAMEST
Con la finalidad de analizar la dinámica de los linfocitos en el modelo animal y
estudiar el tráfico linfocitario de los órganos linfoides secundarios al tejido infartado y
viceversa, se estudiaron en primer lugar las poblaciones linfocitarias mediante
citometría de flujo, seguidamente se estudió el infiltrado inflamatorio en el miocardio y
por último se estudio el infiltrado en los órganos linfoides secundarios.
6.2.1. Poblaciones linfocitarias en sangre periférica
En primer lugar se cuantificó el número de leucocitos en sangre a distintos tiempos.
Figura 49. Dinámica de leucocitos, neutrófilos, linfocitos y monocitos (células/l)
en cerdos con IAMEST (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no
significativo).
Como se observa en la figura 49, en comparación con la muestra basal, durante los
primeros minutos del infarto el número de leucocitos ascendió progresivamente,
0h 90min 2h 48h0
10000
20000
30000
40000
ce
ls/μl
Leucocitos
ns
*
ns
Mean
Std. Deviation
0h
11447
3211
90min
13531
3130
2h
17389
5731
48h
13555
3935
0h 90min 2h 48h0
5000
10000
15000
cels
/μl
Neutrófilos
*
**
ns
Mean
Std. Deviation
0h
4014
1603
90min
6563
2727
2h
8319
3204
48h
4350
2069
0h 90min 2h 48h0
5000
10000
15000c
els
/μl
Linfocitos
nsns
*
Mean
Std. Deviation
0h
5356
1514
90min
5363
2218
2h
5605
3266
48h
4555
1516
0h 90min 2h 48h0
500
1000
1500
2000
ce
ls/μl
Monocitos
**
*
ns
Mean
Std. Deviation
0h
421
242
90min
713
338
2h
1146
536
48h
864
511
Resultados
108
alcanzándose su pico máximo tras 2h de la reperfusión.
Los neutrófilos y los monocitos ascendieron a medida que avanzaba el infarto,
alcanzando también su pico máximo tras 2h de reperfusión, para luego recuperar los
valores basales tras 48h.
Sin embargo, al igual que ocurrió en pacientes, el número de linfocitos descendió tras
la reperfusión, además de agruparse los valores de un modo significativo respecto el
valor basal.
Como se muestra en la figura 50, los linfocitos CD4, definidos por citometría de
flujo como CD3+ CD4+ CD8- ascendieron durante las primeras horas del infarto para
luego descender hasta niveles basales.
Figura 50. Dinámica de linfocitos CD4 (%) y Th1 (células/l) en cerdos con
IAMEST (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no significativo).
Respecto a la evolución de los linfocitos citotóxicos, definidos como CD3+ CD4-
CD8+ y NK, definidos como CD3-CD16+. Se observó que al igual que ocurrió en
pacientes con IAMEST, en el modelo animal tuvo lugar un descenso significativo de los
linfocitos CD8 y NK tras la reperfusión.
0h 90min 2h 48h0
10
20
30
% C
D4+
CD
8-
Linfocitos CD4
* *ns
Mean
Std. Deviation
0h
9.0
3.9
90min
17
5.9
2h
18
5.5
48h
14
6.0
0h 90min 2h 48h0
10
20
30
% C
D4-
CD
8+
Linfocitos CD8
nsns
*
Mean
Std. Deviation
0h
14
5.8
90min
11
3.3
2h
11
5.6
48h
8.2
3.0
0h 90min 2h 48h0
5
10
15
20
% C
D16+
Linfocitos NK
ns
*
**
Mean
Std. Deviation
0h
6.2
1.5
90min
8.1
1.7
2h
12
4.6
48h
3.8
1.4
Resultados
109
6.2.1. Poblaciones linfocitarias en el infiltrado de tejido
Tras analizar la dinámica linfocitaria en sangre en el modelo animal, se estudió la
infiltración leucocitaria en el miocardio infartado, adyacente y remoto. Mediante
marcaje con inmunohistoquímica de linfocitos T, B, macrófagos y neutrófilos (Fig 51)
Se observó una predominancia de infiltrado de neutrófilos, sin embargo, también se
observó un importante infiltrado mononuclear, representado por macrófagos y linfocitos
T pero no linfocitos B.
Figura 51. Inmunohistoquímica de miocardio infartado, adyacente y remoto.
Linfocitos T (CD3), Linfocitos B (CD79a), macrófagos (SL1) y neutrófilos (MPO).
Con la finalidad de cuantificar los subtipos de linfocitos T infiltrados se analizó la
expresión génica de Tbetx, para determinar el infiltrado de linfocitos Th1, Gata3, para
CD3
SL1
MPO
Remoto Adyacente Infarto
CD79a
Resultados
110
determinar el infiltrado de linfocitos Th2 y la citoquina IL-17 para determinar el
infiltrado de Th17.
Como se observa en la figura 52, en el miocardio infartado se produjo un incremento
del infiltrado de células pro-inflamatorias Th1 y Th17 pero no de Th2.
Figura 52. Expresión génica de los genes Tbetx, Gata3 e IL-17 en miocardio de
cerdos infartados (áreas infartada, adyacente y remota) y controles (*p<0,05;
**p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. ns: no significativo).
Con la finalidad de analizar cambios de densidad de población tras un infarto, se
compararon cortes de bazo y ganglios mesentéricos de cerdos controles e infartados. No
se observaron diferencias en cuanto a la densidad de población en bazo y en ganglio
entre cerdos infartados y controles (Figura 53).
Figura 53. Cortes histológicos de bazo y ganglio mesentérico (hematoxilina-eosina).
Bazo
Ganglio
Mesentérico
Infarto Control
Resultados
111
7. Análisis de mecanismos asociados a la regulación de la respuesta inmune
adaptativa en el IAMEST
7.1. Linfocitos Treg en el modelo animal de IAMEST
Se estudiaron dos mecanismos de inmunoregulación en el IAMEST: un mecanismo
celular mediado por los linfocitos Treg y otro mediado por la vía PD-1/PD-L1.
Los linfocitos Treg en el cerdo han sido descritos muy recientemente y presentan las
mismas características que los linfocitos Treg humanos, se pueden definir mediante
citometría de flujo como CD4+ CD25hi FOXP3+. Y mediante biología molecular
mediante la expresión de FOXP3.
Figura 54. Dinámica de los linfocitos Treg en cerdos con IAMEST. Arriba:
ejemplo representativo de análisis de Treg mediante citometría de flujo. Abajo:
recuento celular, expresión génica de FOXP3 e inmunohistoquímica de FOXP3 en
ganglio mesentérico (control positivo) y miocardio infartado y control.
La figura 54 muestra la dinámica de los linfocitos Treg en cerdos infartados. Se
observó que se producía un descenso significativo a medida que avanzaba el infarto y se
Resultados
112
mantuvo hasta 48h después de la reperfusión.
Sin embargo, no se observó infiltrado de Treg en el miocardio de cerdos infartados
mediante la expresión génica de FOXP3 ni mediante la presencia de células FOXP3
positivas en cortes histológicos de miocardio infartado, adyacente o remoto.
7.2. El eje PD-1/PD-L1 en pacientes con IAMEST
PD-1 es un receptor que regula la respuesta de linfocitos T mediante la inhibición de
su proliferación y la inactivación.
Para el análisis de vía PD-1/ PD-L1 se estudió en primer lugar la expresión de PD-1
en linfocitos T, linfocitos CD4 y linfocitos CD8 mediante citometría de flujo
Figura 55. Expresión de PD-1 (Células/l) en linfocitos T (CD3+PD-1+), en
linfocitos Th (CD4+ PD-1+) y linfocitos Tc (CD8+ PD-1+) en pacientes con
IAMEST tras 24h de reperfusión
CD3
Control
IAMEST
PD-1
PD1
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
PD-1
CD4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD8
Control IAMEST0
500
1000
1500
CD3+ PD-1+
celsμl *
Mean
Std. Deviation
IAMEST
696
261
Control
1057
443
Control IAMEST0
200
400
600
800
CD3+ CD4+ PD-1+
cels
/ul
*
Mean
Std. Deviation
IAMEST
286
222
Control
521
283
Control IAMEST0
100
200
300
400
500CD3+ CD8+ PD-1+
cels
/ul
*
Mean
Std. Deviation
IAMEST
343
181
Control
199
79
Resultados
113
Como se observa en la figura 55, la presencia de linfocitos T PD-1+ descendió
significativamente en pacientes con IAMEST respecto de controles. De entre los
linfocitos T, los linfocitos CD4 PD-1 descendieron, sin embargo se observó un
incremento de los CD8 PD-1 positivos en pacientes con IAMEST respecto de controles.
Seguidamente se procedió a calcular la expresión del ligando de PD-1, PD-L1 en las
células mononucleares, puesto que PD-L1 en sangre se expresa mayoritariamente en
células mononucleares, en este caso se determinó el número de células monocitos
CD14+ positivas para PD-L1.
Como se observa en la figura 56 en pacientes con IAMEST se produjo un ascenso
significativo de monocitos PD-L1 positivos respecto de controles.
Figura 56. Expresión de PD-1 (Células/l) en monocitos (CD14+PD-L1+) en
pacientes con IAMEST tras 24h de reperfusión
La expresión génica de PD-1 y PD-L1 en PBMCs de pacientes con IAMEST tras 24h
de reperfusión siguió el mismo patrón que la expresión proteica. Se observó un
descenso global de los niveles de mRNA en PBMCs de pacientes con IAMEST respecto
de controles. Por el contrario los niveles de mRNA de PD-L1 estaban más elevados que
en controles (Figura 57).
102
0
20
40
60
80
100
103 0 104 105
CONTROL'
STEMI'
Control IAMEST0
5
10
15
20
CD14+ PD-L1+
%
**
Mean
Std. Deviation
IAMEST
13
4.7
Control
7.4
5.1
Resultados
114
Figura 57. Relación de la expresión génica de PD-1 y PD-L1 en pacientes con
IAMEST tras 24h de reperfusión
Adicionalmente se estudió la relación de PD-1/PD-L1 con el tamaño del infarto. Para
ello se analizó la expresión génica de los genes de PD-1 y PD-L1 en mRNA de PBMCs
de pacientes con IAMEST con tamaño del infarto extenso y no extenso.
Como se observa en la figura 58, tras 24h de reperfusión los pacientes con un tamaño
del infarto extenso presentaron una expresión más baja de PD-1.
Por otro lado, los pacientes con infartos extensos presentaron una expresión más
elevada de PD-L1 tras 24h de reperfusión.
Figura 58. Relación de la expresión génica de PD-1 y PD-L1 con el tamaño del
infarto en pacientes con IAMEST tras 24h de reperfusión.
A continuación se estudió la dinámica de la expresión de PD-1 y PD-L1 en pacientes
con IAMEST y controles.
Como se puede observar en la figura 59, la expresión de PD-1 estaba muy aumentada
PD-1
Controles 24h0.0
0.5
1.0
1.5m
RN
A f
old
ch
an
ge
Mean
Std. Deviation
24h
0.82
0.49
Controles
1.2
0.72
*
PD-L1
Controles 24h0
1
2
3
4
mR
NA
fo
ld c
han
ge
Mean
Std. Deviation
24h
2.7
2.1
Controles
0.90
0.46
***
PD-1
Infarto extenso Infarto no extenso0.0
0.5
1.0
1.5
mR
NA
fo
ld c
han
ge
Mean
Std. Deviation
Infarto extenso
0.58
0.21
Infarto no extenso
1.1
0.66
*
PD-L1
Infarto extenso Infarto no extenso0
1
2
3
4
5
mR
NA
fo
ld c
han
ge ns
Mean
Std. Deviation
Infarto extenso
3.4
1.8
Infarto no extenso
3.3
2.5
Resultados
115
antes de la reperfusión en situación de isquemia miocárdica, seguidamente la expresión
de PD-1 desciende bruscamente durante las 24 y 96h siguientes a la reperfusión.
Por otro lado el ligando PD-L1 aumentó progresivamente desde el infarto hasta
alcanzar un pico tras 24h de la reperfusión, para descender seguidamente.
Figura 59. Dinámica de la expresión génica de PD-1 y PD-L1 en pacientes con
IAMEST.
Controls 0h 24h 96h 30d0
1
2
3PD-1
Rela
tive m
RN
A levels
*
Mean
Std. Deviation
0h
1.8
0.99
24h
0.74
0.30
96h
0.60
0.33
30d
0.72
0.50
Controls
1.1
0.62
* *ns
Controles 0h 24h 96h 30d0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
PD-L1
Rela
tive m
RN
A levels
ns
*
ns
ns
Mean
Std. Deviation
0h
0.94
0.41
24h
1.2
0.37
96h
0.78
0.21
30d
0.99
0.33
Controles
0.84
0.23
Resultados
116
7.3. El eje PD-1/PD-L1 en el modelo animal de IAMEST
Con el fin de elucidar el papel del PD-1 a tiempos más cortos de reperfusión, se
analizó la expresión de PD-1 y PD-L1 en PBMCs de cerdos a los que se les indujo un
IAMEST.
La figura 60 muestra el análisis de la expresión génica de PD-1 y PD-L1 en linfocitos
porcinos en situación basal (0h), tras 90 min de isquemia, tras 2h y 48h de la
reperfusión. Se observó un incremento significativo de la expresión de PD-1
inmediatamente después de la reperfusión, para luego volver a niveles basales. La
expresión de PD-L1 no cambió.
Figura 60. Dinámica de la expresión génica de PD-1 y PD-L1 en cerdos con
IAMEST.
A continuación, se estudió el papel de la vía PD-1/PD-L1 en la infiltración
linfocitaria en el miocardio infartado.
La figura 61 muestra la expresión génica y proteica de PD-1 y PD-L1 en el
miocardio infartado, adyacente y remoto de cerdos con IAMEST y de cerdos controles.
La expresión génica y proteica de PD-1 aumentó significativamente en la zona del
infarto en comparación con controles.
Además, la expresión de PD-L1 también aumento a nivel génico y proteico, sin
embargo este incremento fue global en todas las áreas de cerdos con IAMEST en
comparación con controles.
0h 90min 2h 24h0
1
2
3
4
PD-1 en linfocitos porcinos
mR
NA
fo
ld c
han
ge
ns
**
ns
Mean
Std. Deviation
0h
1.0
0.0
90min
1.9
1.0
2h
3.1
0.71
24h
1.2
0.95
0h 90min 2h 24h0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
PD-L1 en linfocitos porcinos
mR
NA
fo
ld c
han
ge
ns
ns
ns
Mean
Std. Deviation
0h
1.0
0.0
90min
0.95
0.47
2h
0.81
0.37
24h
0.81
0.71
Resultados
117
Figura 61. Dinámica de la expresión génica de PD-1 y PD-L1 en cerdos con
IAMEST.
Por último se confirmó la presencia de PD-1 y PD-L1 en tejido mediante
inmunohistoquímica. Como se puede observar en la figura 62, se evidenció la presencia
de PD-1 en células infiltradas de la zona infartada. Por otro lado PD-L1 también se puso
en evidencia mediante la expresión a nivel vascular y células infiltradas.
Control Remoto AdyacenteInfartada0
5
10
15
20
25
PD-1
AU
InfarctAdjacentRemoteControl
PD-1
Actin
**
nsns
PD-1
Control Remoto Adyacente Infartada0
2
4
6
8
10
mR
NA
fo
ld c
han
ge
nsns
*
Mean
Std. Deviation
Control
1.0
0.27
Remoto
1.7
1.0
Adyacente
1.7
1.5
Infartada
4.5
4.1
Control Remoto AdyacenteInfartada0
5
10
15
20
PD-L1
AU
InfarctAdjacentRemoteControl
PD-L1
Actin
**
*
ns
PD-1L
Control Remoto Adyacente Infartada0
1
2
3
mR
NA
fo
ld c
han
ge
ns ns
*
Mean
Std. Deviation
Control
1.0
0.20
Remoto
1.4
0.66
Adyacente
1.3
0.69
Infartada
2.0
0.77
Resultados
118
Figura 62. Inmunohistoquímica de PD-1 y PD-L1 en miocardio de cerdos con
IAMEST
PD-1
PD-L1
Infarto Adyacente Remoto
DISCUSIÓN
Discusión
121
VI. DISCUSIÓN
En el presente estudio se ha explorado la dinámica de la respuesta inmune adaptativa
en el IAMEST y su implicación con un parámetro clínico de suma importancia en
cardiología como es el tamaño del infarto. Además, se ha demostrado que existe una
desregulación del sistema inmune adaptativo en pacientes con IAMEST y se han
explorado distintos mecanismos que la regulan y la desregulan mediante una
aproximación traslacional en un modelo porcino de infarto agudo de miocardio con
reperfusión.
1. Dinámica leucocitaria en el IAMEST
El análisis de la dinámica leucocitaria en el IAMEST reveló que la respuesta inmune
innata predomina durante las primeras horas del infarto. En pacientes con IAMEST se
produjo un incremento global del número de leucocitos en sangre, de entre los tipos
leucocitarios, los neutrófilos y los monocitos aumentaron de modo significativo durante
las primeras horas del infarto. Este fenómeno ya ha sido previamente descrito por
nuestro grupo y otros103, 104
. La respuesta leucocitaria en el IAMEST ha sido
considerada tradicionalmente como una respuesta inmune innata. Esta respuesta se
desencadena debido al daño tisular por necrosis y está considerada como un
componente central del proceso reparativo.
Nuestros resultados indican que los cambios más dramáticos que se producen en
sangre durante la fase aguda del infarto son debidos principalmente a los neutrófilos.
Existen estudios previos en otros escenarios tales como la angina inestable en la que se
ha descrito una neutrofilia severa que tiene lugar debido a la activación de distintas
moléculas de adhesión, tales como la L-selectina, E-selectina y P-selectina que a su vez,
promueven el rodamiento y la adhesión leucocitaria, lo cual facilita la infiltración en el
tejido miocárdico a través de las vénulas post-capilares105
. En el caso de la adhesión
firme de los neutrófilos al endotelio, se requiere la activación de las integrinas 2 y la
unión con ICAM-1. A continuación tendrá lugar la migración transendotelial, lo que
dará lugar a un daño directo sobre las células parenquemáticas ya que los neutrófilos
liberan especies reactivas de oxígeno, como la NADPH oxidasa y enzimas proteolíticos
Discusión
122
como la MPO106
. En estudios posteriores en pacientes con IAM la presencia de una
neutrofilia durante la fase subaguda, se ha empleado en distintas ocasiones como un
factor pronóstico del tamaño del infarto y una peor perfusión vascular. Nuestro grupo
describió que la neutrofilia y un ratio neutrófilo/linfocito elevado eran predictores de
muerte durante los meses siguientes de seguimiento en una serie de 515 pacientes con
IAMEST75
. Sin embargo, la dinámica de estas células en el IAMEST junto con los
demás leucocitos todavía no ha sido explorada.
Las otras células de la respuesta inmune innata que participan del incremento global
del número de leucocitos en nuestro estudio son los monocitos. En contraste con los
neutrófilos que son las primeras células en llegar al lugar de la inflamación, los
monocitos se expanden de un modo más retardado. Los resultados del presente estudio
son consistentes con los que ya han sido publicados previamente: los monocitos
comienzan a aumentar en sangre a partir del segundo o tercer día del infarto. Existen
numerosos estudios previos en los que se describen la dinámica de los monocitos en el
infarto de miocardio107
. Nuestros resultados no hacen más que confirmar los datos
previos existentes al respecto, pero son necesarios para ofrecer una visión global del
contexto inflamatorio que tiene lugar durante las pirmeras horas del inafrto.
El presente estudio muestra que, al contrario del incremento de la respuesta inmune
innata, la respuesta inmune adaptativa encabezada por los linfocitos descendía
significativamente en pacientes con IAMEST respecto de controles. Además el
descenso se produjo durante las primeras horas de isquemia y se mantuvo tras 24h de
reperfusión. La reperfusión mediante angioplastia primaria o bien mediante fármacos
trombolíticos produjo un efecto de agrupamiento en los niveles de los linfocitos en
sangre. Además de descender, se agruparon, lo que sugiere que la reperfusión tiene un
efecto homogéneo sobre la respuesta inmune adaptativa. Existen estudios previos que
asocian una alta incidencia de eventos cardiovasculares tras una inmunosupresión
mediada por linfopenia. Situaciones como síndrome de inmunodeficiencia adquirida o
supervivientes de bomba atómica relacionan un descenso en el número de linfocitos
CD4 con el desarrollo de aterosclerosis78
. Sin embargo, a pesar de que la linfopenia
aguda también ocurre en pacientes con IAM, sus implicaciones fisiopatológicas y
pronosticas no han sido estudiadas todavía.
Otro parámetro que ilustra el contexto inflamatorio que tiene lugar en el IAMEST es
el análisis de la dinámica de las citoquinas en los sueros de pacientes. Los resultados
obtenidos demuestran que en el IAMEST tiene lugar una inflamación moderada
Discusión
123
mediada por un incremento de las citoquinas inflamatorias y un descenso de las anti-
inflamatorias. Es destacable que estos valores no resultan del todo elevados al
compararlos con otras enfermedades inflamatorias tales como la artritis reumatoide o la
sepsis. Este hecho ya se puso en evidencia en un estudio previo donde comparaban
valores de citoquinas pro- y anti-inflamatorias en insuficiencia cardíaca frente a otras
patologías inflamatorias108
, en el citado estudio concluyeron que la diferencia en los
valores de las determinaciones de citoquinas entre estudios dependió principalmente de
los reactivos y kits empleados. En el presente estudio se empleó un inmunoensayo
multiplex de alta sensibilidad y los valores obtenidos son bastante bajos en comparación
con otros kits de tipo ELISA. Ello es debido a que el anticuerpo de detección solamente
detecta un epítopo muy en concreto de la proteína de interés con el fin de no interferir
con los otros anticuerpos. En el presente estudio se realizó un análisis multiplex en el
que se midieron en una misma muestra varias citoquinas a la vez y en el mismo ensayo
se compararon muestras bien del mismo individuo a distintos tiempos, o bien de
pacientes IAMEST con controles. Las diferencias entre ensayos fueron mínimas y muy
reproducibles, lo que hizo posible establecer diferencias significativas entre el grupo
control y el grupo IAMEST.
Se observó un predominio de las citoquinas pro-inflamatorias producidas por células
de la respuesta inmune innata, tales como IL-1 , IL-6 y TNF- y un descenso de las
citoquinas anti-inflamatorias producidas por las células de respuesta inmune adaptativa
principalmente, tales como IL-4 e IL-10. Las citoquinas IL-6 y TNF- se caracterizan
por mediar la fase aguda de las inflamaciones. En el momento en el que se produce una
inflamación bien sea de tipo microbiano o bien de tipo endógeno como lo es el daño por
isquemia reperfusión se desencadena la liberación de estas citoquinas en el hígado, una
consecuencia de ello es el incremento de la proteína C reactiva en pacientes con
IAMEST109
. Además la IL-1 es la precursora de la formación del inflamasoma, que se
activa en respuesta a DAMPS110
y está producida por macrófagos en la fase inflamatoria
del IAMEST111
. Nuestros resultados indican también que la citoquina pro-inflamatoria
IFN- se encuentra elevada en los pacientes con IAMEST. Estudios recientes
relacionaron un desequilibrio entre la citoquina IFN- y la IL-4 en pacientes con
IAMEST reperfundidos con angioplastia primaria y que un aumento de IFN- en suero
estaba asociado a una fracción de eyección menor del 30%112
.
Por otro lado se observó un aumento de TGF- que es una citoquina de carácter
Discusión
124
pleiotrópico. El incremento de TGF- en sangre podría estar asociado a un incremento
de la actividad plaquetaria por el aumento de la trombosis en el IAMEST, ya que las
plaquetas son una de las principales fuentes de TGF- en sangre. Además de todo ello,
existen estudios recientes en los que se ha observado que las plaquetas podrían modular
la diferenciación de los linfocitos T CD4 en los síndromes coronarios agudos113
.
El aumento de citoquinas pro-inflamatorias producidas por unas poblaciones
leucocitarias principalmente células de la respuesta inmune innata, y la disminución de
otras poblaciones leucocitarias como son los linfocitos es un primer indicio de que en la
respuesta inmune al IAMEST se produce una desregulación de la respuesta inmune
adaptativa.
2. Dinámica linfocitaria en el IAMEST
2.1. Descenso de la respuesta inmune celular y citotóxica durante las primeras
horas del infarto y la reperfusión
El presente estudio es el primero que analiza la respuesta inmune adaptativa durante
las primeras horas en pacientes con IAMEST tratados con terapia de reperfusión en
comparación con un grupo control compuesto de pacientes con los mismos factores de
riesgo. La comparación de estos grupos de estudio reduce significativamente las
diferencias causadas por factores de riesgo, aterosclerosis o inflamación peri-
procedimiento, de modo que se asume que se han analizado las diferencias entre grupos
debidas principalmente al IAM y a la reperfusión en el corto espacio temporal.
La primera conclusión que se obtiene a partir de los resultados de este estudio es que
en el IAMEST se produce un descenso agudo de la respuesta inmune celular mediada
por los linfocitos Th1 y Th17 y de la respuesta citotóxica mediada por los linfocitos CD8
y NK durante las primeras horas de la reperfusión.
Existen estudios previos en ratones a los que se les provocó infarto de miocardio con
reperfusión y se observó que las primeras células en infiltrarse en el miocardio tras la
reperfusión eran los neutrófilos y seguidamente eran los linfocitos. Concretamente se
observó una migración masiva de linfocitos T CD4 al miocardio infartado114
. Estos
estudios sugieren que nuestro resultado correspondiente a un descenso de los linfocitos
Th1 y Th17 podría ser debido a una infiltración en el área infartada. Otros estudios con
Discusión
125
ratones knockout Rag1, que se caracterizan por tener deficiencia tanto de linfocitos T
como de linfocitos B, mostraron protección frente al daño por isquemia-reperfusión en
el miocardio. En el mismo estudio la infusión de linfocitos T CD4 productores IFN- en
ratones Rag1 aumentó el tamaño del infarto, lo cual sugirió que los linfocitos Th1
productores de IFN- son los principales contribuyentes al daño por isquemia-
reperfusión115
.
A pesar de existir estudios en modelos experimentales, existen escasos trabajos que
describan la respuesta inmune adaptativa en pacientes con IAM. En todos ellos el grupo
de estudio es muy pequeño y ninguno de ellos analiza diferencias entre pacientes con
IAMEST reperfundidos y controles con coronarias normales y con factores de riesgo
cardiovascular. Recientemente, Hoffman y colaboradores116
utilizaron la citometría de
flujo para analizar la dinámica de distintos subtipos linfocitarios en 30 pacientes con
IAMEST, 24 con angina estable y los compararon con 18 controles sanos; tras realizar
un análisis multiparamétrico en el que analizaron más de 13 subtipos linfocitarios
consiguieron identificar un único subtipo característico de los pacientes con IAMEST,
los linfocitos CD4+ CD57+ que al parecer aumentaban significativamente respecto de
controles sanos. Probablemente si el grupo de estudio hubiera sido mayor, habrían
podido detectar diferencias en otras poblaciones linfocitarias.
En el presente estudio en el grupo IAMEST con 98 pacientes se observó que los
resultados de subpoblaciones linfocitarias se agrupan de modo muy homogéneo tras 24h
de reperfusión. Y observamos un descenso global de la respuesta inmune celular y
aumento de la respuesta inmune humoral tras 24h de reperfusión. Este resultado en
principio podría contradecir a lo descrito previamente en los síndromes coronarios
agudos en los que existe un aumento de la respuesta inmune celular mediado por
incremento del ratio Th1/Th2. Sin embargo en ninguno de los estudios realizados
estudian el efecto de la reperfusión sobre las poblaciones linfocitarias en pacientes con
IAMEST. Liuzzio y colaboladores117
describieron en pacientes con angina inestable un
aumento en sangre de los linfocitos Th1, definidos como células productoras de IFN-
en comparación con pacientes de angina estable. Estudios posteriores describieron que
también tenía lugar un incremento de linfocitos productores de IFN- en pacientes con
IAM pero sin reperfusión. Además en un modelo experimental de infarto en ratas
aparecia un infiltrado severo de los linfocitos Th1 (CXCR3+) en el miocardio infartado
tras 48h del infarto72
.
Discusión
126
El hecho de que no se haya estudiado el efecto de la reperfusión sobre la respuesta
inmune adaptativa es la principal aportación novedosa del presente estudio. En el
momento de la reperfusión se exacerba el daño tisular, por lo que la respuesta inmune
que se podría haber producido a raíz de la isquemia miocárdica puede incrementarse.
Tras la reperfusión se libera al medio extracelular cantidades ingentes de ATP que la
célula no pudo procesar debido a la necrosis tisular. Este ATP es rápidamente procesado
por ectonucleasas como CD39, también conocida como nucleósido trifosfato
defosforilasa o por la ectonucleasa CD73, también conocida como 5´-ectonucleotidasa.
Una vez la adenosina se libera al medio externo, se puede unir a distintos receptores de
adenosina (los receptores A1, A2A, A2B y A3) estos receptores los expresan distintas
células del sistema inmune innato, como neutrófilos, macrófagos, mastocitos, células
dendríticas y natural killers, o también en células del sistema inmune adaptativo como
los linfocitos Treg118, 119
. De modo que, dependiendo el tipo de receptor al que se una la
adenosina, modula un tipo de respuesta distinta en función del tipo celular que esté
presente en ese momento. Estudios en clínica también han descrito en numerosas
ocasiones los efectos cardioprotectores de la adenosina cuando se administra antes o
durante la reperfusión, de modo que reduce de modo significativo el daño en el
miocardio. Sin embargo ninguno de ellos hace referencia a la posibilidad de la
mediación de la inmunidad en el efecto de la adenosina, por lo que este campo es un
área de posible interés a estudiar en futuros trabajos.
En consonancia con los resultados obtenidos previamente, el presente estudio
demuestra que existe una desregulación de la respuesta inmune adaptativa mediada por
un descenso de la respuesta inmune citotóxica (NK y CD8). Los linfocitos NK
descendieron de modo muy significativo durante las primeras 24-96h. Este hecho podría
estar mediado, bien por la acción de la adenosina, como se ha mencionado
anteriormente, o bien por la presencia de hormonas immunosupresoras que se liberan en
situación de estrés, como las prostaglandinas. Los escasos estudios previos que
observaron que tenía lugar un descenso de la función celular de los linfocitos NK tras
un infarto de miocardio120
acusaron al incremento de estrés producido por el infarto y el
efecto inmunosupresor de catecolaminas y prostaglandinas. Sin embargo, el efecto
inmunosupresor producido por las hormonas de estrés es un efecto transitorio y no es un
efecto mantenido en el tiempo por lo que no se hubieran observado cambios en la
evolución de las subpoblaciones linfocitarias tras 24-96h.
Previamente ya se había descrito que existía una disminución de la actividad de NK
Discusión
127
así como un descenso del número de células en pacientes con enfermedades
autoinmunes y malignas121, 122
. Poco tiempo después algunos grupos observaron que en
pacientes con angina estable e inestable tenía lugar una redución de la actividad y el
número de NK 123
. Recientemente han aparecido estudios en los que se ha confirmado
que en pacientes con IAM tiene lugar una pérdida de los linfocitos NK en comparación
con controles sanos, y esta pérdida podría estar relacionada con el incremento de estrés
oxidativo tras el IAM124
. Al parecer la presencia de ROS principalmente derivado de
enzimas oxidativos producidos por neutrófilos y macrófagos aumentaban la
susceptibilidad de los NK a morir por apoptosis. Este hecho que ya había sido probado
de modo ex vivo por otro grupo125
, partía de la hipótesis de que los monocitos presentes
en el entorno inflamatorio de una enfermedad coronaria aguda inducen la muerte por
apoptosis mediante la liberación de metabolitos derivados de ROS.
A pesar de los estudios realizados y nuestros resultados obtenidos, todavía no se ha
elucidado el papel de los linfocitos NK en el IAMEST y para ello harían falta estudios
adicionales que demostraran si existen mecanismos inmunoprotectores que intentaran
frenar el incremento de células citotóxicas en el IAM con el fin de evitar una posible
reacción auto-inmune exacerbada.
2.2. Aumento de la respuesta inmune humoral en el IAMEST
A diferencia del descenso significativo de las células que median la respuesta celular,
los linfocitos B, que median respuesta inmune humoral caracterizada por la liberación
de anticuerpos, aumentan significativamente antes de la reperfusión y se mantienen con
niveles significativamente elevados hasta 30d después del infarto.
Los linfocitos B reaccionan frente a proteínas en estado nativo. En este sentido, ya se
ha comentado anteriormente la liberación masiva de proteínas que tiene lugar durante el
IAMEST,la mayoría de la proteínas se encuentran sin degradar, es decir, en estado
nativo.
Existen evidencias previas en las que se ha detectado un numero elevado de
anticuerpos tras el infarto, frente a distintos antígenos. Por ejemplo se ha detectado un
incremento significativo de anticuerpos frente a esfingolípidos126
, que son componentes
lipídicos de la membrana celular, en pacientes con IAM y con ictus cerebral. De entre
los distintos tipos de esfingolípidos, se ha estudiado que los pacientes que presentan un
Discusión
128
incremento de anticuerpos frente al esfingolípido cardiolipina, tienen mayor riesgo de
sufrir un IAM127
. El incremento de linfocitos B y de anticuerpos durante el desarrollo
de un IAM es un hecho que todavía causa controversia, ya que existen estudios que
demuestran tanto el efecto perjudicial de los linfocitos B y los anticuerpos, como
estudios que muestran un efecto protector frente a antígenos propios.
Los linfocitos B juegan un papel crucial y no redundante tanto en la respuesta
inmune innata como la respuesta inmune adaptativa mediante mecanismos tanto
dependientes como independientes de la producción de anticuerpos. Existen estudios
recientes en los que se ha identificado nuevas funciones para los linfocitos B durante la
respuesta innata en infecciones agudas128
, en donde los linfocitos B se necesitan para
iniciar una respuesta inflamatoria protectora y eficiente. Sin embargo, la contribución de
los linfocitos B en la respuesta inflamatoria seguida de otras formas de daño tisular
agudo, en particular en el IAM, no se ha definido todavía. Los resultados de Mallat y
colaboradores descubrieron que los linfocitos B juegan un papel clave en la respuesta
patogénica al daño por isquemia-reperfusión mediado por la ruta del receptor Baff 70
.
Por otro lado también se ha descrito la interacción de los linfocitos B con las
plaquetas, muy activadas en el IAMEST. Las plaquetas pueden estimular directamente
la proliferación y la producción de anticuerpos por parte de los linfocitos B mediante
contacto celular directo a través de los receptores CD40-CD40L71
. Las plaquetas no
sólo estimulan el cambio de isotipo en el linfocito B por medio del contacto célula-
célula, sino que también de modo remoto mediante la liberación de CD40L soluble. La
presencia de CD40L soluble en pacientes con IAMEST es muy elevada de modo que
los linfocitos B se activan y cambian de un isotipo IgM a IgG y se convierten en células
plasmáticas productoras de anticuerpos.
Los escasos estudios previos que existen respecto al papel de los linfocitos B en el
daño por isquemia reperfusión, se han centrado en otras patologías como el ictus, o bien
el daño renal por isquemia reperfusión, todos ellos en modelos animales y con
resultados contradictorios. Algunos estudios destacan el aspecto protector de los
linfocitos B y otros el efecto perjudicial129, 130
.
Inclusive existen estudios que utilizan los linfocitos B como posible terapia celular
para la recuperación de la función cardiaca tras un IAM, en ese caso se emplearon
linfocitos B provenientes de médula ósea tras un infarto de miocardio en ratas, lo cual
mejoró la función cardiaca131
. De modo opuesto, el grupo de Mallat y colaboradores
mostraron que la depleción de linfocitos B mediante anticuerpos anti-CD20 durante la
Discusión
129
fase aguda del infarto, mejoraba la función cardiaca70
.
2.3. Dinámica de otras poblaciones linfocitarias en el IAMEST
En primer lugar se observaron dos incrementos muy diferenciados en el número de
linfocitos T activados (CD3+HLA-DR+). Lo cual sugiere que en el IAMEST tienen
lugar dos activaciones linfocitarias: se observó un pico de activación antes de la
reperfusión, en situación de isquemia cardiaca, seguido de la linfopenia durante las
siguientes 24h, y luego otro pico de activación tras 30 dias. De modo que existe una
renovación del pool de linfocitos y durante ese cambio de poblaciones podrían tener
lugar eventos clave para desarrollarse una respuesta autoinmune.
La primera activación de linfocitos T en situación de isquemia cardiaca coincide con
un incremento de Th17 definidos mediante la expresión del factor Ror-. Los linfocitos
Th17 se activan mediante la interacción con neutrófilos y durante la fase hiperaguda del
infarto ya se ha comentado anteriormente que tiene lugar un incremento muy
significativo de neutrófilos. Este hecho, junto con el incremento de citoquinas pro-
inflamatorias, sugiere que en la fase de isquemia cardiaca tiene lugar un aumento
masivo de la inflamación. En estudios anteriores se ha observado que en el infarto existe
un desequilibrio de linfocitos Th17/Treg a favor de los Th17 en pacientes con angina
inestable e IAM73
.
La primera activación linfocitaria, antes de la reperfusión en situación de isquemia
cardiaca, también coincide con el incremento de linfocitos CD4 efectores de memoria y
con el descenso de los CD4 memoria central.
Los linfocitos CD4 de memoria central son células reserva, presentes sobretodo en
los ganglios linfáticos y que se pueden diferenciar rápidamente en células efectoras de
memoria en respuesta a un antígeno que pase por el ganglio.
Por otro lado linfocitos CD4 efectores de memoria proporcionan protección
inmediata frente a un antígeno ante el cual ya habían sido activados. De este modo son
los primeros en aumentar, y también poseerán marcadores de linfocitos T activados en
su superficie. Por lo que se podría concluir que la primera activación que tiene lugar en
la fase de isquemia cardiaca es debida a la activación de los linfocitos CD4 efectores de
memoria que además podrían haberse originado a partir de la diferenciación de los
memoria central en memoria efectores y el Th17.
Discusión
130
Inmediatamente después de la activación de linfocitos T, se produce una separación
entre el tipo de respuesta inmune: los linfocitos T de respuesta celular descienden
significativamente y los linfocitos B mediadores de la respuesta inmune humoral
aumentan, tal y como se ha descrito anteriormente en el presente estudio.
A continuación, a partir de 96h de la reperfusión, tiene lugar una recuperación de las
poblaciones linfocitarias, y la primera que aumenta tras las 96h son los linfocitos T
naïve, que probablemente se hayan generado “de novo” en respuesta al infarto. En
nuestros resultados, se observó un aumento muy significativo de los linfocitos CD4
naïve tras 96 de la reperfusión. Los linfocitos T naïve tienden a proliferar en entornos
linfopénicos, mediante un mecanismo que se denomina “proliferación inducida por
linfopenia” o también conocida como proliferación mediada por la homeóstasis del
sistema inmune132
. De modo que la formación de nuevos linfocitos “rellena” el espacio
que han dejado los anteriores tras la linfopenia. Además, los linfocitos T naïve también
se incrementan en número rápidamente si están siendo estimulados por un antígeno, en
ese sentido requieren receptores de activación.
En nuestro estudio, la siguiente “oleada” de linfocitos activados tiene lugar tras 30
días. La proliferación homeostática tras un episodio de linfopenia se ha considerado
como un mecanismo para evitar reacciones auto-inmunes80
.
En el presente estudio se ha observado que los linfocitos autorreactivos (CD4+
CD28null) aumentan tras 30 días del infarto. Coinciden con la nueva oleada de
linfocitos T activados que tiene lugar tras 30 dias del infarto. Ese momento es crítico y
el hecho de que se formen linfocitos T autorreactivos podría derivar en reacciones auto-
inmunes. Los linfocitos T CD4 CD28null son linfocitos T diferenciados de modo
terminal y se caracterizan por la liberación de citoquinas pro-inflamatorias, tales como
el IFN- y el TNF- y la IL-2133
. Además estos linfocitos son citotóxicos y tienen la
habilidad de matar células in vitro al igual que los linfocitos NK o los CD8. También se
ha descrito que son resistentes a la apoptosis linfocitaria mediante la falta de expresión
del ligando FAS134
. Y además no poseen CD40L por lo que no pueden activar a los
linfocitos B para que produzcan anticuerpos. En individuos sanos, esta población
linfocitaria está muy disminuida, sin embargo, en pacientes que presentan un alto
porcentaje de estos linfocitos, muestran también signos de producción defectuosa de
anticuerpos por parte de los linfocitos B135
.
Liuzzo y colaboradores investigaron el papel de los linfocitos CD4 CD28 null en
síndromes coronarios agudos, por lo que estudiaron los linfocitos CD4 CD28null en
Discusión
131
pacientes con angina inestable, y observaron que la frecuencia de linfocitos CD4
CD28null en pacientes con angina inestable era mayor que la de pacientes con angina
estable136
. Además confirmaron que estos linfocitos producían una mayor cantidad de
IFN- sugiriendo de esta manera que estas células podrían ser la principal fuente de
producción de IFN- en el IAM. Además también comprobaron que la expansión de
linfocitos CD4 CD28null era oligoclonal, por lo que se habrían originado a partir de una
exposición crónica a un antígeno común.
Un hallazgo que ha apoyado esta hipótesis es el hecho que la comparación de las
secuencias de aminoácidos de las cadenas beta del receptor de los clones de CD4
CD28null generados en pacientes con angina inestable fueron todas muy similares. De
entre los distintos clones, se han identificado linfocitos reactivos frente a proteínas
como la proteína HSP 60, un antígeno que está presente tanto en placa de aterosclerosis
como en el medio extracelular tras un IAM137
. Por lo que la expansión de los linfocitos
CD4 CD28null podría ser debido a una estimulación antigénica repetida frente a la HSP
60 o bien frente a otros antígenos propios.
La expansión de linfocitos T CD4 CD28null permanece estable en el tiempo en
pacientes con angina estable tras un episodio agudo de isquemia miocárdica. Existen
estudios previos que demostraron que tras 3 meses de un IAM la frecuencia y la
identidad clonal de los linfocitos CD4 CD28null permanecía constante79
. Más
recientemente, se ha demostrado que una frecuencia elevada de linfocitos CD4
CD28null es un predictor de futuros eventos coronarios en pacientes con angina
inestable133
. Otro estudio mostró que la expansión de CD4 CD28null estaba
directamente relacionado con la extensión del síndrome coronario agudo138
.
En el presente estudio, otra población que también aumenta de modo significativo
tras 30 dias del infarto son los linfocitos Treg. Los linfocitos Treg, definidos como
CD4+CD25hiFOXP3+, poseen la capacidad de suprimir la respuesta efectora de los
linfocitos T. Como ya se ha comentado anteriormente, tras 30 días del infarto se
produce una expansión de linfocitos T que coincide con un aumento de linfocitos
autorreactivos, pero también de linfocitos Treg. Estos últimos podrían proliferar para
contener la posible respuesta auto-inmune y un incremento del daño miocárdico.
Este reultado se discute más adelante en el apartado mecanismos de
inmunoregulación.
Discusión
132
3. Respuesta inmune y relación con el tamaño del infarto
Durante los últimos años, la RMC ha emergido como la técnica de referencia para
evaluar el tamaño del infarto y la función ventricular en pacientes con IAMEST139
. La
RMC permite cuantificar de modo muy preciso el tamaño del infarto y la OMV. Ya que
es una técnica no invasiva, actualmente se ha incorporado en la práctica clínica rutinaria
para el diagnósico y la evaluación de pacientes con IAMEST mediante las secuencias de
captación tardía de gadolinio97
. En varios estudios de nuestro grupo y otros se ha
validado la utilidad de la RMC como valor diagnóstico y pronóstico del tamaño del
infarto139
es por ello que se ha empleado esta técnica para cuantificar la extensión del
infarto en pacientes con IAMEST en el presente trabajo.
Tal y como se ha demostrado en los resultados del presente trabajo, en pacientes con
un tamaño de infarto extenso tiene lugar un incremento global de la respuesta inmune
innata, mediada por un incremento de neutrófilos y monocitos y un descenso de la
respuesta inmune adaptativa mediada por un descenso en el número de linfocitos.
Previamente se describió que existe una correlación entre el grado de leucocitosis y
la extensión del área infartada140
. Además del tamaño del infarto, también se ha
demostrado una asociación del recuento leucocitario con una peor perfusión coronaria o
como pronóstico de eventos fatales141, 142
. La respuesta leucocitaria en el síndrome
coronario agudo y más concretamente durante el IAMEST ha sido considerada
tradicionalmente como consecuencia de la respuesta inmune innata. En este sentido se
han realizado numerosos dirigidos a elucidar el papel pronóstico del recuento total
leucocitario en el IAMEST así como su relación con el tamaño del infarto103, 140
y se
llegó a la conclusión de que un incremento del número de leucocitos en sangre está
directamente relacionado con un mayor tamaño del infarto y un peor pronostico. Al
igual que nuestros resultados.
Se ha descrito que un incremento del número de neutrófilos en sangre durante el
infarto está relacionado con un mayor tamaño del infarto y con OMV143
. La relación del
número de neutrófilos respecto de los linfocitos es decir el ratio neutrófilo/linfocito es
un índice pronóstico ampliamente empleado en la clínica y ha sido relacionado con un
peor diagnóstico como mayor tamaño del infarto y una peor perfusión microvascular144
.
Concretamente, el ratio neutrófilo/linfocito ha sido empleado sobretodo como factor
pronóstico de eventos fatales tales como muerte o reingreso145, 146
.
Además también se ha descrito la relación entre incremento de monocitos en sangre
Discusión
133
y el tamaño del infarto así como el valor pronóstico de la monocitosis en el IAMEST147
.
Estudios previos ya mostraron que en un grupo de 238 pacientes con IAMEST tratados
con angioplastia primaria el incremento en el número de monocitos se relacionó con una
reperfusión defectuosa o incompleta53
.
En pacientes con IAM, se ha descrito una desregulación aguda del sistema inmune y
parece que ello podría dar lugar a consecuencias deletéreas. Sin embargo ninguno de los
estudios anteriormente citados relaciona la dinámica de la respuesta inmune adaptativa
con el tamaño del infarto o cualquier otro índice de daño en el miocardio tras un IAM.
En los resultados del presente trabajo, se ha demostrado que existe un desequilibrio a
favor de citoquinas pro-inflamatorias en pacientes con tamaño de infarto extenso. Estos
resultados son consistentes con los publicados anteriormente por otros grupos, los
cuales describieron el desequilibrio pro-inflamtorio que tiene lugar a nivel de citoquinas
en suero de pacientes con síndromes coronarios agudos112
. En referencia a la relación de
la concentración de citoquinas en suero y el tamaño del infarto, solamente existen
estudios en modelos animales148
, no existen estudios realizados en pacientes con
IAMEST. El presente trabajo es el primer estudio que relaciona la concentración de
citoquinas con el tamaño del infarto. La liberación de citoquinas pro-inflamatorias en el
IAMEST daría lugar a la activación de células endoteliales, a la expresión de moléculas
de adhesión, y a la activación leucocitaria149
. Por lo que un desequilibrio a favor de
citoquinas pro-inflamatorias podría desencadenar una respuesta mas dañina sobre el
miocardio infartado.
Respecto a la relación de las distintas poblaciones linfocitarias y el tamaño del
infarto. En los resultados obtenidos en el presente trabajo se ha demostrado que en
pacientes con un infarto extenso existe en sangre una menor concentración de células de
respuesta inmune celular. Especialmente menos linfocitos T, menos CD8 y menos Th1.
Hasta el momento, no existen datos previos que relacionen un descenso de estas
poblaciones linfocitarias con el tamaño del infarto en pacientes con IAMEST. Existen
estudios previos que relacionan la función cardiaca con un desequilibrio Th1/Th2 sin
embargo se realizaron en otros escenarios. Cheng y colaboradores, midieron en un
grupo de 33 pacientes con angina inestable los linfocitos Th1 y Th2; detectaron un
desequilibrio pro-inflamatorio a favor de los linfocitos Th1 (en comparación con un
grupo control), en todas las determinaciones se asoció con dilatación del VI, disfunción
sistólica y una peor clase funcional72
.
En la patología de angina inestable no se produce un episodio de
Discusión
134
isquemia/reperfusión y en el caso del presente estudio, se ha relacionado el descenso de
las poblaciones linfocitarias citotóxicas y de respuesta celular en pacientes con
IAMEST y tras la reperfusión. Este resultado sugiere que tras la reperfusión tiene lugar
una depleción de esas poblaciones linfocitarias, y que los pacientes que se queden con
un numero menor de linfocitos de respuesta celular, presentan un infarto mayor. Lo que
sugiere bien que las células deplecionadas ejercían un papel beneficioso, que éste no
sería el caso, o bien que van a otro lugar que no es la circulación sanguínea donde
pueden ejercer su efecto citotóxico y dañino, con la consecuencia de aumentar el daño
miocárdico y el tamaño del infarto. Posiblemente eso es lo que ocurre, nuestros
resultados sugieren que un mayor descenso de células citotóxicas en sangre que está a
su vez asociado con un mayor tamaño del infarto podría ser debido a un infiltrado
masivo de estas células en el área infartada.
Paralelamente al descenso de linfocitos citotóxicos y de respuesta celular, tiene lugar
un aumento de los linfocitos T naïve y un descenso de los linfocitos T de memoria. Este
resultado podría ser consecuencia de la infiltración de los linfocitos T memoria en los
tejidos dañados y un incremento de los naïve debido a la proliferación post-linfopenia
anteriormente mencionada.
4. Mecanismos de inmunoregulación. El modelo porcino de IAMEST
Si no existiera immunoregulación, los procesos fisiológicos mediados por el sistema
inmune, tales como la terminación de una respuesta inmune después de un episodio
inflamatorio se convertirían fácilmente en patológicos. Para analizar distintos
mecanismos de inmunoregulación en el IAMEST, en el presente estudio se ha empleado
en varias ocasiones el modelo porcino de IAM con reperfusión.
El modelo porcino de infarto con reperfusión empleado es un modelo que ha sido
validado en distintos estudios150
. El cerdo es un animal grande que presenta una serie de
ventajas respecto otros modelos animales: en primer lugar el sistema cardiovascular
porcino y más concretamente la circuación coronaria es muy similar a la del humano, lo
cual a permitido trabajar con los mismos materiales quirúrgicos (catéteres,
introductores) que en humanos y extrapolar fácilmente los parámetros hemodinámicos y
angiográficos; en segundo lugar el sistema inmune del cerdo es más similar al del
humano que en otros animales de experimentación, tal es el caso de la rata o el ratón,
Discusión
135
que presentan una frecuencia de linfocitos mayor respecto a otras poblaciones
leucocitarias o la no existencia de algunos receptores celulares como marcadores de
poblaciones, por lo que la comparación entre especies hubiera sido distinta en ese caso.
4.1. Apoptosis linfocitaria
La apoptosis de linfocitos tiene lugar por dos mecanismos principalmente: la muerte
inducida tras activación por antígeno (AICD), la cual está mediada principalmente por
miembros de la familia de receptores del TNF- y la muerte pasiva, también conocida
como muerte por abandono, que tiene lugar por falta de citoquinas y factores de
crecimiento.
Algunos estudios previos observaron que en pacientes con angina inestable tenía
lugar una perturbación del repertorio de células T151
y esta perturbación venía precedida
de una activación linfocitaria152
. Posteriormente, Pasqui y colaboradores describieron
también en pacientes con angina inestable que tiene lugar una depleción masiva de
linfocitos T tras un episodio de activación antigénica153
.
En el modelo animal se confirmó que la apoptosis linfocitaria ya es detectable de
modo muy temprano tras 2h de la reperfusión, lo cual sugiere que la reperfusión es un
evento clave que podría descontrolar la reacción inmune y que una supresión mediada
por la muerte linfocitaria intentaría frenar el descontrol. Teniendo en cuenta que durante
la isquemia cardiaca se produce un aumento de la activación de linfocitos T, según lo
observado en pacientes y se produce apoptosis linfocitaria en el momento de la
reperfusión, según lo observado en el modelo animal, podría ocurrir que la
sobreactivación que tiene lugar tras la isquemia los linfocitos potencialmente auto-
reactivos podrían ser eliminados durante la reperfusión.
Durante el transcurso de una respuesta inmune, los linfocitos T recativos frente a un
antígeno se expanden clonalmente y seguidamente son retirados para mantener la
homeóstasis inmune mediante el mecanismo de AICD154
.
Otra causa de la apoptosis linfocitaria podría ser debido al incremento de ROS y
citoquinas proinflamatorias que también son apoptóticas como el TNF-, pudiera dar
lugar a muerte linfocitaria por apoptosis. Existen estudios que han demostrado que las
ROS producidas tras un periodo de isquemia prolongado como es el ejercicio físico
seguido de periodos de reoxigenación se produce apoptosis linfocitaria155
. Este estudio
Discusión
136
sugiere que la isquemia y reperfusión miocárdica que tiene lugar en el modelo porcino
de infarto podría provocar la muerte de linfocitos por apoptosis.
El modelo experimental de infarto también permitió mostrar una aspecto de la
respuesta inmune escasamente explorada en el IAMEST, la muerte leucocitaria en el
infiltrado inflamatorio cardiaco. Takemura y colaboradores156
fueron los primeros que
describieron a nivel expermiental que la apoptosis es uno de los mecanismos
responsables para la eliminación de los leucocitos infiltrados en el IAM durante la fase
de inflamación. Este resultado es coherente con el concepto y el propósito de la muerte
celular por apoptosis, cuando una célula muere por apoptosis por definición no inicia
una respuesta inmune debido a que no libera contenido extracelular al medio y ésta es
eliminada de modo discreto por los macrófagos también infiltrados en el tejido. El
grupo de Takemura, además observaron que el “hueco” que dejaban las células
infiltradas retiradas, era rellenado por miofibroblastos. Es por ello que la apoptosis en el
infiltrado inflamatorio tendría un efecto beneficioso para la regeneración de la ciactriz
durante el proceso de fibrosis cardiaca. Existen estudios recientes en donde se ha
descrito que la apoptosis de los leucocitos infiltrados en tumores y más concretamente
de linfocitos, tendría lugar debido a macrófagos también infiltrados en el mismo lugar
de la inflamación157
.
En nuestros resultados no se distinguió el tipo celular que moria por apoptosis. Sin
embargo por la morfología, al igual que en estudios previos se mostró que las células
apoptoticas eran células leucocitarias infiltradas y no miocitos, por lo que no podemos
concluir que fueran linfocitos necesariamente.
Por otro lado el estudio de expresión génica del factor FASL en tejido cardiaco
muestra que hay un incremento global de este receptor en miocardio infartado a
diferencia del adyacente o el remoto. El ligando FAS es un receptor de la familia del
receptor de TNF- que se encuentra sobre-expresado en linfocitos T activados que
mueren por apoptosis.
Existen estudios previos en otros escenarios donde se ha descubierto que en el
infiltrado tisular de CD4 de pacientes con VIH tiene lugar una muerte por apoptosis
mediada tanto por el ligando FAS como por TNF-158
.
4.2. Recirculación e infiltración linfocitaria
A pesar de las ventajas que supone la utilización del modelo porcino como modelo
Discusión
137
experimental de infarto y reperfusión, su empleo como modelo de desregulación
inmune presenta una serie de limitaciones. La inmunología suina es diferente de la
humana y para la realización del presente estudio han representado una limitación. Tal
es el caso de que todos los linfocitos T y B tienen los dos tipos del MHC, sean CPAs o
no, es por ello por lo que no se ha podido emplear el marcador HLA-DR, que en cerdos
se denomina SLA-DR de “Swine Leukocyte antigen” como marcador de activación. O
que los ganglios porcinos presentan “morfología inversa”, es decir, en la periferia
predomina el tejido linfoide difuso, donde están presentes los linfocitos T, en la médula
predomina el tejido linfoide folicular, donde predominan los linfocitos B. Sin embargo,
la principal limitación a la hora de trabajar con el cerdo como modelo animal de
respuesta inmune ha sido la escasa disponibilidad en el mercado de marcadores de
células inmunes y que muchos de los marcadores empleados durante el desarrollo de
esta tesis doctoral han sido testados por primera vez o bien se han ido descubriendo por
otros grupos durante el transcurso de este estudio.
A pesar de todo ello, la disponibilidad de anticuerpos permitió poder identificar los
subtipos leucocitarios y linfocitarios descritos en el presente trabajo.
La dinámica leucocitaria en los cerdos a los que se les había provocado IAM con
reperfusión mostró una dinámica similar a los pacientes con IAMEST. Sin embargo el
empleo del modelo animal permitió analizar los cambios más agudos; tras 2h de
reperfusión ya se observó un incremento muy significativo de leucocitos. De entre los
tipos leucocitarios, los neutrófilos y monocitos se incrementaron progresivamente
durante el infarto y alcanzaron el pico tras 2h de la reperfusión. Del mismo modo que en
humanos, los linfocitos se comportaron de manera distinta, en este caso disminuyeron
tras 48h de la reperfusión. Al igual que en pacientes se observó una disminución de la
respuesta citotóxica en sangre.
Tras 48h del infarto se observó en el miocardio un infiltrado leucocitario severo,
predominio de los neutrófilos y monocitos. Sin embargo también se observó infiltrado
de linfocitos T pero no de linfocitos B. Este resultado sugiere que el descenso de
linfocitos T que se observa en sangre podría estar mediado en parte por el infiltrado de
células T en el miocardio infartado.
Un estudio muy reciente demostró que en ratones a los que se les ha provocado un
IAM existe una mayor predominancia de linfocitos CD4 y CD8 pero no de linfocitos B
en el infiltrado del miocardio. Además si se provocaba infarto a ratones knockout
deficientes en CD4, el infarto era mayor y con un peor remodelado cardiaco, de modo
Discusión
138
que se se generaba una cantidad menor de colágeno y una cicatriz más laxa159
. Este
resultado sugiere que la presencia de CD4 en el miocardio infartado mejora la
formación de la cicatriz y aumenta la supervivencia tras un infarto experimental en
ratones.
Los resultados obtenidos en el modelo animal, también indicaron que los Treg
disminuían en sangre tras el infarto. Sin embargo, no se observó infiltrado de Treg tras
48h de la reperfusión. Existen estudios previos que indican que los linfocitos Treg
disminuían en sangre en pacientes con insuficiencia cardiaca160
. También se ha indicado
que el reclutamiento insuficiente de Treg en el miocardio da lugar a un peor remodelado
cardiaco161
. Más recientemente, se ha demostrado experimentalmente que la infusión de
Treg en ratas a las que se les provoca un IAM, mejora el remodelado cardiaco y la
función miocárdica162
. Sin embargo en estos estudios previos el análisis de Treg en el
IAM se realizó tras 3 semanas del infarto en la fase de fibrosis cardiaca. Y el presente
estudio se ha centrado en la fase aguda del infarto.
4.3. Inmunoregulación mediada por los linfocitos Treg
Los linfocitos Treg están implicados directamente en la tolerancia periférica para
suprimir la respuesta inflamatoria en los tejidos60
. Los linfocitos Treg poseen numerosas
moléculas del receptor CTLA-4. Esta proteína inhibe la proliferación de los linfocitos T
efectores, de modo que si se sobre-expresa en algún momento de la respuesta
inflamatoria es debido a que se debe frenar la inflamación. En nuestros resultados se
observaron dos picos de sobre-expresión de CTLA-4: uno antes de la reperfusión,
coincidiendo con el pico de linfocitos T activados, y otro tras 30 días, coincidiendo con
el pico de linfocitos Treg. Este resultado sugiere que los linfocitos Treg incrementan su
frecuencia tras 30 dias del infarto para frenar una posible respuesta auto-agresiva
mediada por el incremento de CD4 CD28null y podrían ejercen este efecto mediante el
incremento de la expresión de CTLA-4.
Existen estudios previos que apoyan el papel de los linfocitos Treg en la formación y
el desarrollo de la placa de ateroma. Mallat y colaboradores demostraron que la
transferencia de linfocitos Treg en ratones knockout que desarrollaban aterosclerosis,
evitaba el desarrollo de la placa de ateroma y reducía la infiltración de linfocitos T y de
macrófagos en la lesión. De modo contrario, la depleción de Treg dio lugar a un
Discusión
139
incremento en el tamaño de la lesión, una menor acumulación de colágeno, y una mayor
infiltración de linfocitos T y de macrófagos163
. Sin embargo, a pesar de encontrarse en
mayor proporción en el interior de placas de ateroma, en síndromes coronarios agudos
se han encontrado en número reducido164
. Esta reducción en el número de linfocitos
Treg en los síndromes coronarios agudos no ha sido del todo elucidado, podría ser
debido a un defecto global de los treg o bien podría ser debido a una redistribución de
los Treg en los tejidos inflamados o en la sangre165
.
Existen resultados muy recientes que indican que la pérdida de Treg durante un
episodio inflamatorio agudo, podría dar lugar a una linfopenia transitoria166
. Tal y como
ocurre en el presente estudio, los niveles de Treg durante las primeras horas del infarto
están significativamente disminuidos, por lo que este hecho podría originar una
depleción de los linfocitos más agresivos mediante mecanismos todavía no explorados.
Una vez superado este episodio de linfopenia (por ejemplo tras 30 dias del infarto), la
presencia de Treg durante la reconstitución inmune preserva la estructura de receptor de
linfocito T y permite la acumulación de linfocitos T específicos de antígeno en los
tejidos secundarios linfoides tras un aclaramiento del antígeno. Este resultado parece en
principio paradójico, ya que los Tregs son células típicamente supresoras. En un estudio
muy reciente en pacientes con IAMEST a los que se les realizó una agioplastia primaria
con aspiración de material trombótico, se observó que hay una alta frecuencia de
linfocitos Treg en el trombo. Además demostraron que esos linfocitos Treg eran
mayoritarimente clones que reconocían un antígeno común, lo que sugiere que
proliferaron in situ en respuesta a un mismo antígeno167
.
Sin embargo, esta habilidad para mantener la homeostasis inmune a través de la
preservación de la diversidad periférica, es una habilidad intrínseca de los linfocitos
Treg dentro del sistema inmune, la respuesta a vacunas, la patogénesis de la auto-
inmunidad y la senescencia inmunitaria. El origen de un mal funcionamiento de la
regulación es un hecho que debe ser estudiado en profundidad. Debido a su importante
función inmunoreguladora, los linfocitos Treg se han propuesto en numerosas ocasiones
como terapia celular y como opción terapéutica prometedora.
El concepto de la utilización de linfocitos Treg expandidos in vitro frente a un
antígeno concreto para disminuir la inflamación y así evitar futuros eventos
aterotrombóticos ya ha sido explorada por otros grupos168
. Mediante estrategias de
inmunización, se han identificado antígenos específicos de Treg como componentes
críticos en el desarrollo de la aterosclerosis en modelos experimentales murinos169
. Sin
Discusión
140
embargo, todavía se necesitan más datos sobre el reclutamiento y cinética en sangre de
los Treg durante el infarto, de modo que estas céulas puedan ser empleadas en ensayos
clínicos en el IAMEST.
4.4. Inmunoregulación mediada por PD-1/PD-L1
En pacientes con IAMEST se produce un descenso en el numero de linfocitos T CD4
que expresan PD-1. Este resultado es consistente con algunos estudios recientes que han
demostrado que tras un episodio de linfopenia aguda, los linfocitos T expresan niveles
muy bajos de PD-1. El estudio de Thangavelu y colaboradores170
reveló que en ratones
con deficiencia de PD-1 tiene lugar a una pérdida profunda de la auto-tolerancia, dando
lugar a la muerte asociada por una infiltración rápida de linfocitos en varios órganos.
También revelaron que existe una pérdida general de auto-tolerancia en los linfocitos T
deficientes para PD-1, y el efecto más critico tiene lugar en los tejidos de la periferia y
no en los tejidos linfoides.
En el presente estudio se ha demostrado que la disminución de PD-1 está asociada
con infarto extenso. Hasta el momento no existen estudios que hayan identificado el
papel de PD-1 en el infarto. Sin embargo, el papel protector de PD-1 ha sido
previamente explorado en otras patologías cardiovasculares, tales como la
arteriosclerosis o la miocarditis171, 172
. Además se ha descrito que los pacientes
portadores de una variante del gen de PD-1 (PDC1) presentan niveles bajos de TNF- y
un menor riesgo de IAM173
.
Contrariamente a los resultados observados en linfocitos T CD4+PD-1+, en el
presente estudio se observó un incremento de CD8+PD-1+. En este sentido, estudios
recientes indican que tiene lugar un incremento de CD8 PD-1+ en entornos
linfopénicos, y este hecho iba asociado a un incremento de la apoptosis linfocitaria y un
resultado efector reducido174
. Propusieron que PD-1 podría tener un papel en la
prevención de la enfermedad auto-inmune que se genera tras un episodio de linfopenia.
Por otro lado, por definición los linfocitos T CD8 se comportan de modo distinto una
vez se encuentran con un antígeno, los CD8 rápidamente aumentan su expresión de PD-
1. Tradicionalmente, la expresión de PD-1 está regulada en linfocitos CD8 mediante un
mecanismo de agotamiento en infeciones víricas. En estudios previos se observó que un
incremento en la expresión de PD-1 en linfocitos CD8 se asociaba con una mayor
Discusión
141
apoptosis linfocitaria sobre los linfocitos de nueva generación en pacientes con VIH175
.
Estos estudios sugieren que PD-1 podría controlar la respuesta temprana frente a auto-
antigenos y mediante la regulación de la respuesta homeostática de nuevos linfocitos T.
En paralelo, también detectamos un incremento de PD-L1 en monocitos tras 24h de
la reperfusión. PD-L1 habitualmente está expresado en CPAs, entre ellas en monocitos.
Existen estudios previos que indican que la expresión de PD-L1 en monocitos es
inducida por citoquinas pro-inflamatorias como IFN- y TNF- y está mediada por la
activación antigénica176
. Este dato se podría confirmar con los resultados obtenidos en
el presente estudio, en el que se observó que previamente a la reperfusión tenia lugar un
incremento de la expresión de PD-1, así como del ligando PD-L1. PD-L1 interacciona
con PD-1 de modo que transmite una señal coinhibidora que limita la proliferación de
linfocitos T y de efectos citotóxicos, dando lugar a la protección tisular frente a una
respuesta inmune exacerbada.
La desregulación del eje PD-1/PD-L1 que tiene lugar tras 24h de la reperfusión,
viene precedida de un incremento de ambos durante la fase de isquemia cardiaca. Este
resultado confirma la hipótesis que durante el infarto se produce una activación de
linfocitos T y que la expresión de PD-1 podría frenar la respuesta exacerbada. Sin
embargo tras la reperfusión, bien los linfocitos que expresaban PD-1 mueren por
apoptosis, o bien se infiltran en el miocardio. PD-1 incrementa su expresión en
linfocitos T activados y debe de volver a niveles basales tras el aclaramiento del
antígeno. En otros escenarios tales como infecciones virales y en cáncer177
PD-1
permanece sobre-expresada, sin embargo en enfermedades auto-inmunes como la
artritis reumatoide, muestra un pico de expresión durante la inflamación aguda y
desciende bruscamente durante la fase crónica178
. Los resultados de este estudio
sugieren que en el IAMEST tiene lugar una situación análoga a la de una enfermedad
auto-inmune y que mecanismos inmunomoduladores como el eje PD-1/PD-L1 podrían
evitar una respuesta autoinmune. Además este hecho podría afectar a los linfocitos Treg
ya que estudios recientes sugieren que el bloqueo de la via de PD-1/PD-L1 anula la
actividad de linfocitos Treg95
.
Para estudiar el posible desequilibrio del eje PD-1/PD-L1 se uso el modelo animal.
Los resultados observados en la sangre periférica del modelo animal, coincidieron con
los de pacientes. La dinámica de la expresión del mRNA de PD-1 en sangre mostró un
incremento progresivo durante el infarto y un pico de expresión tras 2h de la
reperfusión, para seguidamente descender tras 48h. Por otro lado, la dinámica de PD-L1
Discusión
142
no mostró cambios significativos.
El análisis de biología molecular y la inmunohistoquímica mostró que tras 48h de la
reperfusión tenia lugar un incremento de la expresión de PD-1 en el miocardio
infartado, así como de PD-L1. Este resultado sugiere que los linfocitos T que se infiltran
en el miocardio podrían aportar la expresión de PD-1 al miocardio. PD-1 podría
participar en la regulación del trafico linfocitario a la zona del infarto. Del mismo modo
existen evidencias que han demostrado que los linfocitos T PD-1+ presentan un estado
de diferenciación que los habilita para infiltrarse en algunos tejidos inflamados179
.
Finalmente se observó incremento significativo de PD-L1 en todas la áreas del
miocardio en cerdos con infarto, pero especialmente en las areas infartada y adyacente.
La proteina PD-L1 regula la inflamación en todos los tejidos. Estudios previos, que
coinciden con nuestros resultados, indican que la alteración de la ruta de PD-1/PD-L1
acelera la enfermedad autoimmune180
. Se observó también marcaje positivo de PD-L1
en las células endoteliales. En ese sentido también se ha descrito un papel protector de
PD-L1 cuando esta expresado en células endoteliales181
.
Para finalizar se muestra una figura resumen de los eventos clave que tienen lugar a
nivel de la respuesta inmune adaptativa en el IAMEST (Figura 63).
Al comienzo del desarrollo del infarto, se produce necrosis miocárdica, la liberación
masiva de auto-antígenos al medio externo provocaría la primera activación linfocitaria
mediada principalmente por el incremento de linfocitos memoria efectores que ya
reconocen esos antígenos como alarma. Así como el incremento de los Th17 que
interaccionan con los neutrófilos que en ese momento son las células predominantes,
junto con un aumento de citoquinas pro-inflamatorias. En ese mismo momento también
se produce el primer intento de regulación inmune mediante la expresión de PD-1.
A continuación, tras la reperfusión, el organismo no puede mantener la exposición
masiva de antígenos y citoquinas pro-inflamatorias, de modo que permite la muerte
linfocitaria por AICD y la infiltración en el miocardio infartado entre 24 y 48h después
del infarto. En ese momento se observa una depleción masiva de las células de respuesta
celular y citotóxica y un descenso de la inmunoregulación por PD-1. Ambos descensos
agudos están asociados con un mayor tamaño del infarto.
Después de 96h de la reperfusión comienza una nueva etapa de proliferación
inducida por la linfopenia, dominada por un incremento de los linfocitos naïve.
Por último al cabo de 30 días la respuesta inmune intenta volver a regular el sistema
mediante una nueva activación, sin embargo en este momento muchos de los nuevos
Discusión
143
linfocitos que han proliferado son autorreactivos y para frenar esta autoreactividad se
aumenta la respuesta supresora y reguladora de los Treg y la expresión de CTLA-4.
Figura 63. Dinámica de la respuesta inmune en el IAMEST
5. Implicaciones clínicas
El análisis de los distintos mecanismos de la respuesta inmune en el modelo animal,
permite abrir una posible ventana hacia nuevas opciones terapéuticas basadas en el
mejor conocimiento de los mecanismos fisiopatológicos y un mejor entendimiento de la
inmunoregulación.
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Discusión
144
Un control de la apoptosis linfocitaria masiva que tiene lugar en el IAMEST podría
modular la respuesta inmune y las consecuencias como una disminución del tamaño del
infarto y la OMV.
Los linfocitos Treg también podrían ser buenos candidatos a modular la respuesta
inmune en el IAMEST, especialmente en la fase crónica, para regular la proliferación de
nuevos tipos linfocitarios y que las futuras células generadas no sean fenotipo auto-
reactivo. Existen estudios experimentales en los que se han empleado Treg para mejorar
el remodelado cardiaco tras el IAM162
.
Finalmente, es especialmente destacable el papel que tiene el eje PD-1/PD-L1 en el
IAM. Actualmente se están utilizando anticuerpos frente a PD-1 como diana terapéutica
en distintos cánceres182
, ya que en el IAMEST el efecto que causa PD-1 es contrario al
visto en algunos cánceres, en este caso un fármaco agonista del efecto que ejerce PD-1
podría ser utilizado en el tratamiento del IAMEST.
6. Limitaciones
Las principales limitaciones que ha habido en el presente estudio han sido, tal y
como se ha comentado anteriormente, el uso del cerdo como animal de investigación.
Ha sido una ventaja su uso como modelo en cardiología experimental pero ha sido una
limitación como modelo de respuesta inmune por la falta de disponibilidad en el
mercado de reactivos y por lo poco conocido que permanece todavía su sistema inmune,
siendo algunos tipos celulares descubiertos en el hombre o ratón, todavía desconocidos
en el cerdo.
CONCLUSIONES
Conclusiones
147
VII. CONCLUSIONES
1. En pacientes supervivientes de un IAMEST se produce una importante
alteración de la respuesta inmune durante las primeras horas de la reperfusión.
Esta alteración se caracteriza por una linfopenia aguda de la respuesta celular,
como los linfocitos Th1 y Th17 y citotóxica, como los linfocitos CD8 y los NK.
2. Existe un incremento agudo del entorno inflamatorio mediado por un aumento
de citoquinas pro-inflamatorias y de linfocitos B.
3. En pacientes supervivientes de un IAMEST existe una relación del tamaño del
infarto cuantificado mediante RMC con la alteración de la respuesta inmune, de
modo que un mayor descenso de respuesta celular y citotóxica se produce en los
pacientes con mayor tamaño del infarto.
4. Un incremento agudo del entorno inflamatorio mediado por aumento de
citoquinas pro-inflamatorias en suero se asocia a un mayor tamaño del infarto.
5. En un modelo porcino de IAMEST la redistribución de la inmunidad adaptativa
se caracteriza por una mayor pérdida de linfocitos circulantes en sangre debida
en parte a apoptosis linfocitaria e infiltración en el tejido infartado.
6. Los linfocitos Treg descienden durante las primeras horas del infarto tanto en el
modelo porcino como en pacientes con IAMEST. En estos últimos además
proliferan significativamente un mes después de la reperfusión en paralelo con
un aumento de linfocitos autorreactivos.
7. El eje PD-1/PD-L1 está asociado con la alteración de la respuesta inmune en el
IAMEST y con el tamaño del infarto. De modo que en pacientes supervivientes
de un IAMEST tiene lugar una disminución de la expresión de PD-1 tras la
reperfusión y está asociada con un mayor tamaño del infarto.
SUMMARY
Summary
151
VIII. SUMMARY OF RESULTS AND CONCLUSIONS
PREFACE
The World Health Organization has identified cardiovascular diseases as one of the
leading causes of death in many developing countries, according to that they are the first
cause of death in adults1.
During the last decades it has been shown that the immune response is a key
mechanism during the development of cardiovascular disease2. The immune response is
a reaction of the body against a wide range of tissue injury.
In ST-segment Elevation Acute Myocardial Infarction (STEMI) a persistent
elevation on ST-segment on the ECG takes place mainly due to the rupture of an
unstable plaque or thrombi occlusion. Thrombogenic material is exposed to the external
environment so the arterial lumen becomes fully blocked by a combination of platelet
aggregates, fibrin and red blood cells, which together produce a thrombus that quickly
fill a segment of the affected artery.
In patients with acute ST-elevation myocardial infarction (STEMI), early and
successful reopening of the infarct related coronary artery by reperfusion treatment is
vital. These strategies include reperfusion with Percutaneous Coronary Intervention
(PCI) or reperfusion with fibrinolysis.
Paradoxically, the restoration of coronary flow can exacerbate the damage caused by
ischemia and increase it in reperfusion. This phenomenon is known as ischemia-
reperfusion injury17
and generates an immune response.
Over the past decades, numerous evidences have emerged indicating that the
inflammatory response in cardiac ischemia is a very well orchestrated process. We
already know that this response is initiated by damage to the myocardium. Stressed
cardiomyocytes release cytokines and synthesize de novo proteins after the infarction.
hydrophobic proteins and lipids activate leukocytes and are known as danger associated
molecular patterns (DAMPs) a key concept in “the danger model of immunity”.
“The danger model of immunity" was first described by Polly Matzinger in 1994 and
provided a theoretical framework for explaining the immune response that took place
after the tissue damage without infection32
. Post-ischemic and reperfused myocardium
Summary
152
is characterized by a series of adverse cellular events. Products derived from cell death
can act as DAMPS and produce migration of immune cells after cardiac ischemia.
The innate immune response in the IAM occurs in a sequential and very well
orchestrated manner. Starting with the humoral components of the innate immune
response, such as complement proteins, DAMPs, the generation of inflammatory
cytokines and stress hormones. Continuing along with the cellular components of the
innate immune response as neutrophils, monocytes, and natural killers (NK). Not to
mention the participation of the resident cells such as cardiomyocytes, fibroblasts and
endothelial cells that due to molecular pattern recognition receptors can also alert the
immune system to the imminent myocardial damage.
The contribution of adaptive immune response in IAM has long been relegated to the
background behind the innate immune response. First, since infiltration of lymphocytes
into the myocardium has been considered as an unusual event and as a result, there are
few experimental studies that analyse the participation of lymphocytes in the infarction.
And secondly, activation of lymphocytes contradicts the classical notion that adaptive
immunity is not stimulated by auto-antigens. However, there are both clinical and
experimental evidences involving the activation of cells of the adaptive immune system
after an AMI. Recently one study showed in vitro cytotoxic activity of splenocyte-
derived CD8 lymphocytes from infarcted rats with reactivity against cardiomyocytes67
.
Another line of evidence comes from autoimmune myocarditis animal models
created from specific anti-myocardial T cells so that immunization with peptides
derived from cardiac troponin or myosin and the transfer of dendritic cells loaded with
these peptides could induce myocarditis in mice susceptible to develop it68
. In patients
with coronary artery disease there is an increased prevalence of antibodies to contractile
proteins69
.
The presence of B cells in infarction is very significant, so that has been identified
that B cells could favour the infiltration of monocytes in patients with AMI70
.
Previous studies have raised that lymphopenia which takes place in the STEMI
causes an imbalance in the immune response, so that immune deregulation appears after
an IAM.
This phenomenon of immune deregulation could be mediated by three mechanisms:
1. Lymphocyte apoptosis as a mechanism of suppression in order to curb an
exacerbated inflammatory response.
2. Lymphocyte recirculation, naïve T cells migrate to lymph nodes in search of
Summary
153
dendritic cells and once activated they differentiate into effector T cells and migrate to
inflamed tissue in order to infiltrate it.
3. Immunoregulation through inhibition of T effector cells proliferation as well as
modulation of Th cells differentiation will induce them to infiltrate the peripheral tissue.
HYPOTHESIS
In the context of STEMI important alterations of adaptive immunity occurs by means
of dynamic changes in different lymphocyte subsets both at peripheral and tissue level.
There is an association between the alterations of adaptive immunity in the context of
STEMI with RMC-quantified infarct size.
Mechanisms regulating adaptive immune system in STEMI such as Treg cells and
PD-1/PD-L1axis are involved in the alterations of adaptive immunity both at peripheral
and tissue levels.
OBJECTIVES
1. Study the dynamics of adaptive immune response in peripheral blood of STEMI
patients.
2. Analyse the existing relationship between the dynamics of adaptive immune
response in peripheral blood of STEMI patients with RMC-quantified infarct size.
3. Analyse mechanisms associated with the alteration of adaptive immune response,
such as apoptosis and infiltration of lymphocytes, in a porcine model of STEMI both
at peripheral and tissue level.
4. Analyse the mechanisms associated with the regulation of adaptive immune
response, such as Treg cells and PD-1/PD-L1 axis in STEMI patients and in a
porcine model of STEMI.
Summary
154
METHODS
98 patients were recruited with a first STEMI treated with reperfusion therapy. One
blood sample was collected after 24 h of reperfusion from all of them. In the first 18
patients, blood was drawn before reperfusion and 24 h 96 h and 30 days afterwards.
We analysed a variety of lymphocyte subtypes (T cells, B cells, CD4, CD8, Th1,
Th2, Th17, Treg, NK, etc.) by means of flow cytometry.
Gene expression of genes that characterize lymphocyte subsets was also carried out
by molecular biology techniques.
Serum concentration of cytokines: IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-, TNF-
TGF-
Expression of Programmed Death 1 (PD-1) and PD-L1 ligand was quantified in
blood cells by means of flow cytometry and molecular biology techniques.
Infarct size was quantified by means of Cardiac Magnetic Resonance (CMR) in all
patients during the first week of infarction.
A control group made up of 30 age-and-sex-matched patients, with angiographically
normal coronaries and with the same cardiovascular risk factors as STEMI patients, was
included.
In parallel, a series of 12 pigs with experimentally induced STEMI was included.
Infarction was induced by means of balloon inflation in the left coronary artery
angioplasty during 90 min. Subsequently balloon was deflated and swine were allowed
to recover during 48 h until death of the animal.
Serial blood extractions were performed: before reperfusion (at baseline), after 90
min of myocardial ischemia and after 2 h and 48 h of reperfusion.
Different lymphocyte subsets and lymphocyte apoptosis as well as the analysis of
gene expression by molecular biology were examined in blood.
Infarction, adjacent and remote areas were identified by 2, 3, 5-trifeniltetrazolium
chloride (TTZ) staining. A group of five control swine without infarction was included.
Apoptosis of leukocyte infiltrate, inflammatory infiltrate and gene expression of
different lymphocyte subtypes was determined using immunohistochemistry and
molecular biology respectively, in infarcted, adjacent, remote and control myocardium.
Expression of Programmed Death 1 (PD-1) and its ligand, PD-L1 was also quantified
both in blood and myocardium.
Summary
155
RESULTS AND DISCUSSION
1. Overview of the dynamics of adaptive immune response in peripheral blood of
STEMI patients
0h (before reperfusion)
During the first hours of the infarction there was a global prevalence of the
inflammatory context characterised by an increase of pro-inflammatory cytokines such
as: IL-1, IL-6, IFN- and TNF-.
Humoral immune response mediated by B cells started to peak, while cellular
immune response mediated by T cells did not change.
However, despite no global changes changes in T cell repertoire were observed,
modifications of different T cell subtypes occurred: a first activation of T cells took
place, therefore activated T cells increased significantly. CD4 memory effector cells
increased too, however CD4 central memory along with cytotoxic CD8 cells decreased.
These data suggest that during cardiac ischemia prevails a pro-inflammatory milieu
and humoral response. This could be mainly due to the massive release of cellular
debris. Cell debris will lead to the activation of memory effector cells and stimulate
central memory cell migration to lymph nodes.
24h after reperfusion
At this moment the majority of dynamic changes take place.
Inflammatory context still dominates; pro-inflammatory cytokines and B cells still
augmented.
However, after 24h of reperfusion a sharp lymphopenia occurred. Lymphopenia was
characterised by a decrease of cellular response, such as Th1 and Th17 cells and
cytotoxic cells, such as NK and CD8 cells.
These results suggest that restoration of blood flow could exacerbate immune
response. Disappearing of T cells from blood could be due to the infiltration in the
infarcted tissue or to exhaustion and consequent apoptosis of T cells for the massive
stimulation of antigens.
The mechanism that could explain recirculation of disappearing T cells will be
analysed in the porcine model of STEMI.
Summary
156
96h after reperfusion
Not many changes take place during this phase.
Some populations maintain the same numbers as 24h after reperfusion. B cells
continue elevated and NK are descended.
However, is especially significant a sharp increase of CD4 naïve cells.
This result suggests that new cells proliferate after 24h-post-reperfusion
lymphopenia, and these new cells are T cells that will react with the previously released
antigens.
30d after reperfusion
After 30 days of reperfusion some similar changes to those observed before
reperfusion (0h) occurred.
B-lymphocytes maintained elevated.
A new activation of T cells took place: activated T cells and effector memory CD4
cells increased.
In addition, a striking increase of Treg and autoreactive lymphocytes occurred.
Altogether these results indicate that after the new proliferation of naïve T cells
activation of T cells due to the previously released antigens could lead to an increase of
autoreactive cells. T regulatory lymphocytes proliferate after 30 days of infarction to
supress the autoreactive wave of cells.
2. Relationship between the dynamics of adaptive immune response in peripheral
blood of STEMI patients with RMC-quantified infarct size
In order to determine the relationship of infarct size with adaptive immune response
patients were classified in two groups: extensive infarction and not extensive infarction,
using as a cut-off point the median (greater than 19.8% VI infarcted mass percentage
quantified by CMR).
Since the majority of dynamic changes occurred 24h after reperfusion, analysis of the
relation of infarct size and immune response after 24h of reperfusion was carried out.
A larger infarct size was associated to an increase of pro-inflammatory cytokines
such as, IL-1, IL-6, IFN- and TNF- and a global decrease of lymphocyte count after
24h of reperfusion.
Besides a reduction of cellular immune response mediated by a decrease in T cells,
Summary
157
Th1, CD8 and reduced expression of FOXP3 after 24 h of reperfusion was also related
to extensive infarction.
These result suggest that patients that did not recover from the acute decrease of T
cells could develop an auto-immune reaction against previously released antigens and
exacerbate infarct size.
3. Analysis of mechanisms associated with the alteration of adaptive immune
response
Analysis of different mechanisms that alterate adaptive immune response in the
experimental model of STEMI revealed that infarction also produces a deregulation of
the immune response mediated by:
1. A sharp increase of lymphocyte apoptosis after 2 h of reperfusion.
2. A decrease in circulating lymphocytes after 48 h of myocardial directed by a
decrease of cytotoxic T cells and Treg cells.
3. Increase of infiltration of inflammatory cells and specially T cells in the infarcted
myocardium. As well as increased expression of Th1 and Th17 genes.
4. Leukocyte apoptosis in the inflammatory infiltrate in myocardium 48 h post-
reperfusión
These results suggest that alteration of adaptive immune response characterised by a
decrease of cellular and cytotoxic cells could be due in part to lymphocyte apoptosis,
because of exhaustion of T cells after a massive expose to antigens, and due in part to
the infiltration of T cells into the infarcted myocardium.
4. Analysis of mechanisms associated with the regulation of adaptive immune
response
Analysis of different mechanisms that regulate adaptive immune response both in
patients and in the experimental model of STEMI revealed that infarction also produces
a deregulation of the immune response mediated by:
1. A decrease of Treg cells during first hours of infarction both in experimental
model and patients.
2. This decrease was not mediated by Treg infiltration in infarcted myocardium.
Summary
158
3. However a significant increase of Treg after 1 month of infarction revealed an
attempt to supress a possible autoreactive reaction.
4. Likewise, a deregulation of PD-1/PD-L1 axis occurs also in patients with STEMI.
Therefore, both factors were over-expressed before reperfusion.
5. Next, a sharp decrease of PD-1 expression happened 24 h post-reperfusion.
6. This decline is associated with extensive infarctions.
7. Experimental model presented the same trend in blood as well as PD-L1 and PD-1
increase in the infarcted myocardium.
These results suggest that there are two attempts to regulate adaptive immune
response in STEMI: one, during first hours of infarction characterised by an increase of
PD-1 expression, and second after one month characterised by Treg expansion.
The present study has explored the dynamics of adaptive immune response in
STEMI and his involvement with a clinical parameter of utmost importance in
cardiology: the size of the infarction.
In addition, it has been shown that there is a deregulation of the adaptive immune
system STEMI, thus various mechanisms that lead alteration and regulation have been
explored from a translational point of view.
Summary
159
CONCLUSIONS
1. A major alteration of the immune response occurs in survivor STEMI patients during
the first hours of reperfusion. This disorder is characterized by acute lymphopenia of
cellular response, such as Th1 and Th17 cells and cytotoxic cells, such as NK and
CD8 cells.
2. There is a sharp increase of the inflammatory environment characterised by an
increase of pro-inflammatory cytokines and B cells.
3. In survivor STEMI patients there is a relationship of the infarct size quantified by
RMC with the alteration of the immune response, so that a further decline of cellular
response and cytotoxic cells occurs in patients with extensive infarct size.
4. A sharp increase in the inflammatory environment characterised by an increase of
pro-inflammatory cytokines is associated with extensive infarct size.
5. In a porcine model of STEMI the alteration of adaptive immunity is characterized by
a greater loss of circulating lymphocytes in blood due in part to lymphocyte
apoptosis and infiltration in the infarcted tissue.
6. Treg cells decreased during first hours of infarction both in experimental model and
STEMI patients. In the latter, Treg proliferate a month after reperfusion in parallel
with an increase of autoreactive lymphocytes.
7. PD-1/PD-L1 axis is associated with the alteration of the immune response in STEMI
and also with the size of the infarction. So that survivor STEMI patients show a
decrease in PD-1 expression after reperfusion and it is associated with extensive
infarct size.
BIBLIOGRAFÍA
Bibliografía
163
IX. BIBLIOGRAFIA
1. World Health Organization WHO. Global atlas on cardiovascular disease
prevention and control: Policies, strategies and interventions. 2011.
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![Vicent estelles biografia[1]](https://static.fdocuments.ec/doc/165x107/55adf05f1a28abaa2c8b4838/vicent-estelles-biografia1.jpg)
