COPROCULTIVOPRACTICA NO. 8 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

UNIVERSIDAD MARIANO GALVEZ DE GUATEMALA

MICROORGANISMOS PATÓGENOS CAUSANTES DE ENFERMEDADES ENTÉRICAS

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CAPÍTULO 3

COPROCULTIVO

PROPÓSITO:

Demostrar por medio de cultivo, la presencia de bacterias enteropatógenas,es decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea,dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte.

Las principales especies enteropatógenas que se buscan en el coprocultivo,en orden de importancia en Guatemala son:

- Shigella flexneri (Shigella grupo B)- Salmonella typhi (agente de fiebre tifoidea)- Shigella sonnei (Shigella grupo D)- Salmonella enteritidis- Shigella dysenteriae tipo 1 (Shigella A-1 o “Bacilo de Shiga”,

causa severa disentería epidémica)- Shigella boydii (Shigella grupo C, rara en Guatemala)- Salmonella choleraesuis- Arizona hinshawii (rara)- Edwardsiella tarda (muy rara)- Yersinia enterocolitica (muy rara)

Las bacterias de la familia Enterobacteriaceae, normalmente habitan en el in-testino humano, por lo que se conocen comúnmente como “enterobacterias”. For-man aproximadamente el uno por ciento de la microbiota fecal, el resto son bacte-rias anaerobias. Por esta razón es muy importante que el laboratorio esté en capaci-dad de aislar, diferenciar e identificar correctamente los enteropatógenos de la listaanterior.

MUESTRA:

Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras:

- heces frescas (la mejor muestra)- hisopo rectal (cuando no se obtienen heces)

Shigella è disentería bacilarCarácterísticas:´ Son no fermentadoras de la lactosa´ Tienden a ser bioquímicamente inertes´ En casos típicos, producen gas a partir de hidratos de carbono,

con excepción de ciertos biogrupos de S. flexneri que sonaerógenos

´ Pocas cepas de S. sonnei pueden fermentar lentamente la lactosa(2%), y la sacarosa (1%) y la mayoría de las cepas puedendescarboxilar ornitina.

Salmonella´ S. typhi tiene también un antígeno capsular o de virulencia (Vi)´ Es un agente productor de zoonosis de distribución universal. Se transmite por

contacto directo o contaminacióncruzadadurante la manipulación, en el hogar.´ La salmonelosis es una enfermedad de transmisión alimentaria, en especial por

alimentos de origen animal; pueden aparecer en brotes en escuelas, guarderías,restaurantes y residencias de ancianos. El período de incubación es por logeneral entre 12 y 36 horas, a veces hasta 6 y 48 horas.

´ Fiebre tifoidea

Vibrio cholerae´ Es el agente etiológico del cólera epidémico´ Es el prototipo de los síndromes diarreicos en los cuales la enfermedad

no es causada por invasión tisular de los microorganismos sino a travésde la producción de toxinas que afectan el intercambio intraintestinalnormal de agua y electrolitos.

Campylobacter jejuni´ Es el patógeno humano más importantes entre las

campilobacterias. La enteritis con este microorganismose caracteriza por dolor abdominal, cólico, diarreasanguinolenta, escalofríos y fiebre.

Yersinia Enterocolítica´ Aunque las especies de Yersinia califican desde el punto de vista bioquímico

para la inclusión en las enterobacterias, las células parecen pequeñas ycocobacilares en los frotis teñidos con Gram y pueden ser pequeñas ypuntiformes luego de 24 hrs de incubación en agar MacConkey.

´ Se multiplica en las mucosas y se puede transmitir a través del contacto conanimales, ingestión de productos alimenticios o contaminados o aguacontaminada. Raramente causa infecciones mortales. Habita en el intestinode animales domésticos.

Escherichia coli.Características:´ Especie recuperada con mayor frecuencia en el laboratorio´ Incriminada en enfermedades infecciosas que afectan casi cualquier

tejido del cuerpo´ Microorganismo involucrado con mayor frecuencia en sepsis por

gramnegativos y en el shock inducido por endotoxinas

Escherichia coli

Y todas estas bacterias causan: DIARREA

´ Por definición, se dice que una persona tiene diarrea si se presentan las siguientes situaciones:

´ Las deposiciones son frecuentes (más de tres veces al día)´ La consistencia de las deposiciones es menor o líquida (más del 75% acuoso)´ La cantidad de las deposiciones aumenta (más de 250 gramos por día)Si la diarrea se presenta derrepente y no dura más de dos semanas, los médicos hablan de diarrea aguda. Por el contrario, si dura más de dos semanas, se trata de una diarrea crónica.

Herramientas para su identificación ?

´ El coprocultivo es la herramienta por excelencia para el personal del laboratorio.

Coprocultivo =è Cultivo de heces fecales ´ Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes

muestras: ´ - heces frescas (la mejor muestra) ´ - hisopo rectal (cuando no se obtienen heces) ´ - material obtenido por proctoscopía - biopsia de mucosa intestinal

´ Las principal utilidad que tiene este estudio, es la identificación de enterobacterias (Vibrio cholerae, Shigella, Salmonella, Campylobacter jejuni, Yersinia enterolitica), que son siempre las principales causantes de una enfermedad gastrointestinal.

TOMA DE MUESTRA.´ La muestra del coprocultivo es tomada en un vaso especial para recolectar

muestra que el paciente puede conseguir en la farmacia, es un frasco de bocaancha que debe estar estéril.

´ La muestra se toma en el momento en el que el paciente este defecando, secolocara el vaso debajo del ano y se depositara una muestra de heces deltamaño aproximado de una nuez, (5 a 10 ml en caso de que el pacientedefeque liquido).

´ No se requiere ayuno ni dieta especial´ No se debe de estar ingiriendo antibióticos´ En adultos mayores y niños la toma se muestra con un hisopo.´ Enviar al laboratorio en no más de dos horas para su procesamiento, o

refrigerar, por no más de 4 horas.

´ El cultivo de las heces es de gran ayuda en la determinación del agenteetiológico de la diarrea, asi como el estado de portador (Salmonella yShigella).

´ La identificación final puede realizarse por métodos bioquímicos y serológicos.´ El coprocultivo se fundamenta en el equilibrio del aparato gastrointestinal

(diarrea, moco y sangre en las heces) ocasionado por las bacteriasmencionadas.

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Fig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVOFig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVOFig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVOFig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVOFig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO

Muestras:

I N O C U L A RRutina

HektoenXLD ó SSMacConkey

Diseminar por estrías, incubar a 36o C

Heces frescas

Medios:

Seleccionar colonias según el caso,trasladar a TSI/LIA/urea

Material deproctoscopía,biospia intestinal

Hisopo rectal Sedimento deenema salino

Opcional

Medios´ Medios para aislamiento-Agar MacConkey--Agar de Salmonella y Shigella (S.S)- Agar XLD (Xilosa, Lisina, Desoxicolato)- Agar Hektoen (disentería)

S.S. McConkey

AGAR SALMONELLA Y SHIGELLA´ Las bacterias Gram positivas, algunas especies de Proteus y

bacilos coliformes son inhibidos por las sales biliares, citratode sodio y verde brillante. La diferenciación de losmicroorganismos se lograpor la lactosa.

CONTROL DE ACTIVIDAD MICROORGANISMO RESULTADO

Escherichia coli Marcada inhibición o colonias rosa intenso con halo de precipitación

Salmonella typhimurium Colonias medianas, incoloras transparentes con centro negro

Shigella flexneri Colonias pequeñas, incoloras transparentes

Salmonella typhi Colonias pequeñas, incoloras transparentes con o sin centro negro

Staphylococcus aureus Crecimiento inhibido Enterococcus faecalis Crecimiento inhibido o colonias

puntiformes, rosa opacas

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Efectúe el coprocultivo así:

1- Inocular una porción anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de mues-tra similar, directamente en una caja de MacConkey y una caja de SS. El inóculose coloca con asa en anillo (flameada y fría) o con hisopo en las cajas de ambosmedios. Inocular sólo 1/2 cm en un extremo en el MacConkey y 1 cm en el SS.El Hektoen se inocula igual que el MacConkey.

2- Diseminar el inóculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asasmientras la otra se enfría (ver figura 3, pág. 40).

3- Ya diseminadas de esta manera las muestras en la superficie de las cajas,incubar a 36°C por 18 a 24 horas, en la incubadora, con esa temperatura con-trolada diariamente (ver figura 4, pág. 45).

COLORANTES DEINOCULAR

rosado

rosadoligeramenteamarillento

verde claro

rojo

MEDIO

MacConkey

SS

Hektoen

XLD

COLONIASCON ÁCIDO

SULFHÍDRICO

no cambian

negro

negro

negro

COLONIASLACTOSA-NEGATIVO

incoloras

incoloras

verdeazuladas

rojas

COLONIASLACTOSA-POSITIVO

rojo (rosado)

rojo

anaranjado-salmón

amarillas

Identificar las colonias

´ Si el paciente es un niño menor de un año, se marcará adicionalmente en el MacConkey una colonia típica de Escherichia coli (roja, brillante y de bordes lisos pero no mucosa),

´ Colonias lactosa-negativo (incoloras) empezando por las más pequeñas, e incluyendo una colonia con centro negro

Medios para identificación (pruebas bioquímicas)

-TSI (triple azúcar hierro contiene tres carbohidratos (glucosa, lactosa y sacarosa ).)-Descarboxilación de la lisina (LIA)

- MIO (Movilidad, indol y ornitina)-Citrato de Simmons

-Caldo urea

LIACitrato de Simmons

Caldo urea

TSI MIO

TSI ´ Resultados´ 1-Pico alcalino/fondo ácido (pico

rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa.2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares.4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas.5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.

Los tubos de TSI, marcados “g” y que corresponden a coprocultivos de niños menores de un año deben aglutinarse para investigar Escherichia coli enteropatógena (“pools” A, B y C)

´ Basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina

´ Producción de ácido sulfhídrico.

´ 1- Decarboxilación de la lisina:

-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.

2-Desaminación de la lisina:

Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp.

3-Producción de ácido sulfhídrico:

-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo)

MEDIO MIO

Indol: 3 -4 gts del reactivo indol

AGAR CITRATO DE SIMMONS ´ Para identificación biquímica de Enterobacterias en base a la utilización del

citrato como única fuente de carbono. ´ Cuando las bacterias utilizan el citrato, el medio se alcaliniza y cambia el color

inicial verde.

CONTROL DE ACTIVIDAD MICROORGANISMO

RESULTADO

Escherichia coli Negativo Enterobacter cloacae Positivo Klebsiella pneumoniae Positivo Salmonella typhi Negativo Serratia marcescens Positivo Shigella flexneri Negativo

CALDO UREA´ Se emplea para la diferenciación de bacterias por medio de la utilización de la

urea como única fuente de carbono.

CONTROL DE ACTIVIDAD MICROORGANISMO

CRECIMIENTO(hidrolisis )

Escherichia coli -Salmonella typhimurium -Proteus vulgaris + Proteus mirabilis + Shigella flexneri -Enterobacter aerogenes -

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Reacción yaincubada

Medio sininocular

TSI(rojo)

LIA(morado)

ácidosulfhídrico(h) (-a+++)

negro

negro

A=ácido

Amarillo

Amarillo

K=alcalino

rojo

violeta

R=rojo

noaplicable

Superficieroja

N=neutro

noaplicable

antreamarillo

y morado

Gas (g)(-a+++)

burbujaso

rupturas

burbujaso

rupturas

Urea de Christensen: (amarillo ligeramente anaranjado), positivo = rosado fuerte;negativo = no hay cambio

Bacteria

Shigella spp.

Salmonella sp.

Yersinia enterocolitica

TSI

K/A,g-,h-

K/A,g+,h++

A/A,g-,h-

LIA

K/A (N),g-,h-

K/K,g+,h+

A (K)/A,g-,h-

UREA

-

-

+

Reacción yaincubada

Medio sininocular

Para expresar en clave y abreviadamente las reacciones en TSI o LIA use lasabreviaturas A, K, R, N, -, +, g, h, según la tabla anterior en este orden: superficie/fondo, gas, ácido sulfhídrico.

Por ejemplo las reacciones de Escherichia coli en TSI; LIA se expresan así:

TSI;LIA = A/A, g+; h-/ K/K, g+, h- oTSI;LIA = K/A, g-; h-/K/N, g-, h-

Las reacciones coloreadas en TSI/LIA, son muy útiles para la identificaciónde los enterobacterias, por lo que en el laboratorio debe contarse con una tablaactualizada de reacciones en TSI/LIA y pruebas bioquímicas en general.

Reacciones a las cuales debe ponerse especial atención:

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Reacción yaincubada

Medio sininocular

TSI(rojo)

LIA(morado)

ácidosulfhídrico(h) (-a+++)

negro

negro

A=ácido

Amarillo

Amarillo

K=alcalino

rojo

violeta

R=rojo

noaplicable

Superficieroja

N=neutro

noaplicable

antreamarillo

y morado

Gas (g)(-a+++)

burbujaso

rupturas

burbujaso

rupturas

Urea de Christensen: (amarillo ligeramente anaranjado), positivo = rosado fuerte;negativo = no hay cambio

Bacteria

Shigella spp.

Salmonella sp.

Yersinia enterocolitica

TSI

K/A,g-,h-

K/A,g+,h++

A/A,g-,h-

LIA

K/A (N),g-,h-

K/K,g+,h+

A (K)/A,g-,h-

UREA

-

-

+

Reacción yaincubada

Medio sininocular

Para expresar en clave y abreviadamente las reacciones en TSI o LIA use lasabreviaturas A, K, R, N, -, +, g, h, según la tabla anterior en este orden: superficie/fondo, gas, ácido sulfhídrico.

Por ejemplo las reacciones de Escherichia coli en TSI; LIA se expresan así:

TSI;LIA = A/A, g+; h-/ K/K, g+, h- oTSI;LIA = K/A, g-; h-/K/N, g-, h-

Las reacciones coloreadas en TSI/LIA, son muy útiles para la identificaciónde los enterobacterias, por lo que en el laboratorio debe contarse con una tablaactualizada de reacciones en TSI/LIA y pruebas bioquímicas en general.

Reacciones a las cuales debe ponerse especial atención:

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REACCIONES DE VARIAS ENTEROBACTERIAS EN TSI Y LIA

Enterobacteria

Escherichia coli

Shigella spp.*

Salmonella typhi*

Salmonella spp.*

Arizona hinshawii*

Yersinia enterocolitica*

Citrobacter sp.

Edwarsiella tarda

Klebsiella sp.

Enterobacter sp.

Serratia sp.

Proteus vulgaris

Proteus mirabilis

Morganella morganii(antes Proteus morganii)

Providencia sp.

LIA

K/KóN, g-ó+, h-

K/A, g-, h-

K/K, g-, h-(+)

K/KóN, g-, h+ (-)

K/KóN, g-, h+ (-)

A(K)/A, g-, h-

K/A, g-ó+, h+ó-

K/K, g-ó+, h+

KóN/KóN, g+ó, h-

KóN/KóN, g+(-), h-

KóN/KóN, g-, h-

R/A, g-, h-(+)

R/A, g-, h-(+)

KóR/A, g-, h-

R/A, g-, h-

UREA

-

-

-

-

-

+

+ ó -

-

+

-(+)

- ó +

+

+

+

-

TSI

A(K)/A, g+ (-), h-

K/A, g-, h-

K/A, g-, h+ (poco)

K/A, g-, h+++(-)

K(A)/A, g+, h+++

A/A, g-, h-

K(A)/A, g+, h+++(-)

K/A, g+, h+++(indol +)

A/A, g++, h-(mucosidad ++)

A/A, g++, h-

KóA/A, g-, h-

A(K)/A, g+, h+++

K(A)/A, g+, h+++

K/A, g-(+), h-

K/A, g+ ó-, h

Nota Importante:Solamente reportar como coprocultivo positivo las enterobacterias marcadas con * el restoes microbiota normal y no debe reportarse nunca. Reacciones menos probables entreparéntesis. Todas las reacciones con reacción roja (R) en la superficie de LIA, presuntivamenteson Proteus sp., Morganella sp. o Providencia sp., no tienen importancia clínica en coprocultivosy no deben tomarse en cuenta. Esta tabla es sólo una guía, que debe actualizarseconstantemente.

+-

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DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO SHIGELLA:

TSI y LIA = K/A,g-,h-

Oler el medio de TSI sin tocarlo con nariz o boca, el olor a “semen” es caracte-rístico de Shigella spp., especialmente de Shigella grupo B (Shigella flexneri), la másfrecuente en Guatemala. El fondo de los tubos de TSI y LIA no presentan gas, niácido sulfhídrico y tienen un color “amarillo canario”. La reacción K (alcalino) dela superficie del TSI es roja de un tono fresa no muy intenso. Aglutinar el creci-miento del TSI sospechoso, o del LIA así:

Utilice la tapadera limpia y seca de una caja de Petri, ráyela con crayón grasopor detrás a manera de hacer rayas paralelas y perpendiculares que formen cuadritosde aproximadamente un centímetro cuadrado. Coloque todas sus parejas TSI/LIAcon reacción sospechosa de Shigella, en orden numérico en una gradilla. En la mis-ma gradilla pero en otro extremo ordene en pares los TSI/LIA con reacción sospe-chosa de Salmonella y los TSI marcados “C” (Escherichia coli) para proceder a aglutinar.Por cada pareja sospechosa de Shigella (K/A,g-,h-; K/A,g-,h-) coloque en el centrode un cuadrito una gotita de antisuero “Shigella grupo B” (Shigella flexneri). Aglutinetomando una porción pequeña del crecimiento en TSI (puede ser también del LIA)con asa en anillo estéril; coloque el crecimiento sobre la caja (mueva el asa en óvalopequeño sin tocar la gota), luego suspenda bien el crecimiento en la gota a manerade obtener una suspensión ligeramente lechosa. Observe inmediatamente despuésde inclinar la tapadera de la caja hacia adelante y hacia atrás la aparición deaglutinación franca y obvia.

Sólo tomar en cuenta aglutinaciones que ocurren antes de 1 minuto despuésde mezclar. Si aglutina reportar Shigella B en el libro de trabajo. Si no aglutina sigaaglutinando pero siempre en este orden para ahorrarse trabajo y anti-sueros, queson muy caros:

1- Shigella flexneri, grupo B - La más frecuente en Guatemala2- Shigella sonnei, grupo D - La segunda más frecuente en

Guatemala3- Shigella dysenteriae, grupo A - Rara pero grave y epidémica, debe

darse alerta al médico.4- Shigella boydii, grupo C - Muy rara vez se aisla en el país.

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DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO SALMONELLA:

La taxonomía moderna del género Salmonella ha cambiado, sin embargo para finesprácticos de diagnóstico y de investigación, se recomienda usar la clasificación an-tigua simplificada así:

- Salmonella typhi: causa fiebre tifoidea con diseminación genera-lizada de la bacteria (puede aislarse de heces,médula ósea, sangre, orina, etc).

- Salmonella enteritidis: causa infección intestinal y puede diseminarsea la sangre.

- Salmonella choleraesuis: rara, causa infección en animales y rara vezen el hombre.

Salmonella typhi presenta en TSI dos características muy importantes parasu identificación, las que se complementan con LIA, citrato de Simmons yaglutinación:

1- No produce gas.2- Produce poco ácido sulfhídrico (una pequeña mancha negra,

a veces difícil de apreciarse en el área del tubo donde empieza elinclinado).

3- Generalmente, el LIA es todo morado (K/K,g-,h-(+)4- Es citrato-negativo.5- Aglutina con el antisuero anti-antígeno Vi.

El agar inclinado de citrato de Simmons es un medio verde que se preparainclinado con las mismas medidas del TSI/LIA. Debe inocularse con una asada delcrecimiento de los tubos TSI o LIA sospechosos de Salmonella, luego se incuba a36°C de 18 a 24 horas y los cambios de color se interpretan así:

verde = negativoazul = positivo

Identificación serológica´ Antisueros para identificar Escherichiacoli (polivalente I, II, III)´ Antisueros para identificar Salmonella del subgrupo I´ Antisuero para identificar Shigellas (A, B, C y D)´ Antisuero para identificar Vibrio cholerae

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Patógenos frecuentemente identificados en niños con diarreaaguda, atendidos en centros de tratamiento, en países en desarrollo

Patógeno Porcentaje de Antimicrobianoscasos recomendados en

base clínica*

Virus Rotavirus 15-25 Ninguno***

Bacterias Escherichia coli 10-20 Ningunoenterotoxigénica

Shigella 5-15 Trimetoprim-sulfametoxazol,Ácido nalidíxico

Campylobacter jejuni 10-15 Ninguno

Vibrio cholerae 01 5-10** Tetraciclina,Doxiciclina,otros

Salmonella (no tifoidea) 1-5 Ninguno***

Escherichia coli 1-5 Ningunoenteropatógena

Protozoos Cryptosporidium parvum 5-15 Ninguno***

Ningún patógeno 20-30 Ninguno***aislado

* Para cepas sensibles** En áreas endémicas; puede ser más alto durante epidemias*** Ningún antimicrobiano efectivo

PROCEDIMIENTO 1. Observación de medios de cultivo previamente inoculados2. Observación de baterías inoculadas3. Identificar la bacteria aislada

POST-LABORATORIO´ Describa en un cuadro sus resultados, las especies de bacterias encontradas en

cada uno de los medios de cultivo, las caracteristicas de las diarreas´ Haga un listado de las enterobacterias que más afectan al ser humano y su

respectivo tratamiento para cada una. ´ Describa el cuadro clínico de fiebre tifoidea´ Rotavirus y norovirus cuadro clinico y como se realiza el diagnóstico´ Investigar las caracteristicas de las infecciones intestinales que producen:

Bibliografia

´ MANUAL DE MICROBIOLOGIA MÉDICA. QFB. GARCIA ARACELI. UNAM 9 SEMESTRE.

´ MICROBIOS Y ENFERMEDADES. PEREZ TAMAYO. LA CIENCIA/169 PARA TODOS. 200 MEXICO.

´ MANUAL DE BACTERIOLOGIA CLINICA. GERARDO CRUZ JIMENEZ. UNAM. MEXICO 1994. PP. 9-12.