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Convocatoria Premio de Investigación Instituto de Estudios Marinos para la Nutrición y el Bienestar (INESMA)

AGRADECIMIENTOS

Este Trabajo de Investigación se ha realizado en el Instituto de Fermentaciones

Industriales (IFI), y en el actual Instituto de Investigación en Ciencias de la

Alimentación (CIAL), perteneciente a la unidad asociada CSIC-UAM, bajo la dirección

de la Dra. Elena Ibáñez y el Dr. Miguel Herrero, a quienes agradezco su apoyo,

confianza, paciencia y por compartir sus conocimientos y enseñanzas.

A la Dra. Elena Ibáñez, me gustaría dedicarle además un especial agradecimiento, por

darme la oportunidad, junto con el Dr. Alejandro Cifuentes, de adentrarme en el

mundo de la investigación, y de realizar este trabajo en su grupo de investigación.

Además, quiero hacer una mención especial a la colaboración mantenida con el Dr.

Agustín Olano y la Dra. Nieves Corzo, que junto a su grupo de investigación, mucho

han contribuido a los resultados que aquí se presentan. En especial quiero dar las

gracias a la Dra. Toñi Montilla, por todos los conocimientos que ha compartido

conmigo y el interés y simpatía demostradas.

Finalmente, me gustaría dar las gracias a todo el personal del Centro de Química

Orgánica "Lora Tamayo" (CENQUIOR), lugar donde se encuentra el IFI, por la ayuda y

amabilidad con las que he contado en todo momento. Y por supuesto, a todos los

compañeros con los que comparto laboratorio, por todo lo que me han enseñado, y por

compartir conmigo buenos momentos.

Septiembre 2010

RESUMEN

El quitosano es en la actualidad uno de los biopolímeros con mayor crecimiento en número de

artículos científicos y patentes en la comunidad internacional, tanto en los aspectos científicos como

de aplicación. En el laboratorio y en la industria se obtiene principalmente del exoesqueleto de los

crustáceos (cangrejos, langostinos, langostas, camarones, centollas y nécoras entre otros), debido a la

gran cantidad de cáscaras disponibles como desechos de la industria pesquera sin uso ni valor actual.

Pese a las numerosas aplicaciones potenciales de este biopolímero, su utilización en el sector

alimentario no se ha consolidado, fundamentalmente por la necesidad de más investigación así como

por las limitaciones de solubilidad del mismo a pH neutros y básicos. El objetivo principal de este

Trabajo de Investigación titulado “En búsqueda de nuevos ingredientes funcionales procedentes del

quitosano para la valorización de los subproductos y excedentes de crustáceos”, es diseñar un nuevo

proceso de impregnación de quitosano con lactulosa en medio supercrítico con el fin de conferir al

quitosano una serie de propiedades funcionales adicionales y mejorar sus propiedades de solubilidad

mediante la formación de un complejo glicosilado, lo que aumentaría el interés para su uso en

alimentación. De esta manera, se contribuiría además al aprovechamiento de los excedentes y

subproductos de crustáceos, agregándoles un valor al generar productos útiles para su uso en la

industria alimentaria u otras. Esta es la razón por la que tiene sentido evaluar tecnologías alternativas

para su aprovechamiento, como son los fluidos supercríticos, cuya propiedad principal es la

capacidad de poder modular su poder de solvatación según las condiciones de presión y temperatura

de trabajo. Debido a esta propiedad, sumado a la consideración que reciben de tecnologías

medioambientalmente limpias, su uso se ha extendido en múltiples aplicaciones entre las que destacan

la extracción y la impregnación, recibiendo gran importancia y atención en los últimos años.

PALABRAS CLAVE

Alimentos Funcionales, Crustáceos, Quitosano, Lactulosa, Fluidos Supercríticos.

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN..................................................................................................... 1

1.1. ALIMENTOS FUNCIONALES ......................................................................................... 1

1.2. QUITOSANO ......................................................................................................................... 2

1.2.1. Fuentes de quitina y obtención del quitosano ........................................................... 3

1.2.2. Caracterización química del quitosano ....................................................................... 5

1.2.2.1. Peso molecular................................................................................................. 5

1.2.2.2. Grado de desacetilación.................................................................................. 6

1.2.3. Aplicaciones y propiedades funcionales del quitosano ............................................ 7

1.2.4. Procesado y obtención de geles a partir de quitosano.............................................. 9

1.3. LACTULOSA ........................................................................................................................ 10

1.3.1. Efectos fisiológicos beneficiosos de la lactulosa ..................................................... 10

1.3.2. Solubilidad de la lactulosa en medio supercrítico.................................................... 11

1.3.3. Análisis de lactulosa por cromatografía de gases (GC) .......................................... 12

1.4. FLUIDOS SUPERCRÍTICOS............................................................................................ 13

1.4.1. Generalidades sobre los fluidos supercríticos.......................................................... 13

1.4.2. Fluidos supercríticos para la industria alimentaria .................................................. 15

1.4.3. Impregnación con Fluidos Supercríticos.................................................................. 16

2. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 19

2.1. MUESTRAS Y REACTIVOS............................................................................................. 19

2.2. PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DE QUITOSANO................................ 19

2.2.1. Preparación de scaffolds de quitosano ..................................................................... 19

2.2.2. Preparación de microesferas de quitosano............................................................... 20

2.3. CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL QUITOSANO ............................................ 20

2.3.1. Cromatografía de Exclusión Molecular .................................................................... 20

2.3.2. Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier...................................... 21

2.3.3. Microscopia Electrónica de Barrido.......................................................................... 21

2.4. PROCESO DE IMPREGNACIÓN CON FLUIDOS SUPERCRÍTICOS............... 21

2.4.1. Sistema de impregnación ............................................................................................ 21

2.4.2. Condiciones de impregnación.................................................................................... 24

2.5. CUANTIFICACIÓN DE LA CARGA DE LACTULOSA.......................................... 25

2.5.1. Preparación de la muestra........................................................................................... 25

2.5.2. Preparación de trimetil-silil derivados de oximas de lactulosa .............................. 26

2.5.3. Condiciones cromatográficas ..................................................................................... 26

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................... 27

3.1. CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL QUITOSANO DE PARTIDA................ 27

3.1.1. Cromatografía de Exclusión Molecular .................................................................... 28

3.1.2. Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier...................................... 29


3.2. PROCESO DE IMPREGNACIÓN SUPERCRÍTICA................................................. 32

3.2.1. Experimentos realizados y condiciones de operación............................................ 32

3.2.2. Rendimiento del proceso de impregnación.............................................................. 34

3.3. CARACTERIZACIÓN QUÍMICA COMPLEJO QUITOSANO-LACTULOSA... 38

3.3.1. Espectroscopia Infrarroja con Transformada de Fourier...................................... 38


4. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS DE FUTURO........................................... 41

5. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 42

Introducción

1

1. INTRODUCCIÓN

1.1. ALIMENTOS FUNCIONALES

En los últimos años, se ha observado una creciente preocupación por la relación entre una

determinada alimentación y la influencia de ésta sobre la salud, interés que se traduce en un gran

número de publicaciones científicas. Estas investigaciones no han hecho sino demostrar las

fantásticas posibilidades que proporcionan los alimentos para proteger o promocionar la salud

(Roche, 2006). Por esta razón, actualmente los alimentos o productos alimentarios eficaces para la

promoción de la salud están centrando una gran atención, tanto desde el punto de vista del

consumidor, como para la industria alimentaria, y por tanto también, para el investigador (Sloan,

1999). Estos alimentos se vienen denominando de forma genérica alimentos funcionales. Esta

denominación fue acuñada por primera vez en Japón durante la década de los ochenta, a través del

Ministerio de Salud, preocupado por los elevados gastos en salud de la población japonesa con alta

expectativa de vida, refiriéndose a alimentos procesados que contenían ciertos ingredientes capaces

de producir un efecto fisiológico beneficioso. Es así como se creó un marco regulatorio que

favorecía el desarrollo de estos alimentos, conocidos como FOSHU (Foods Of Specific Health Use)

(Arai, 1996). En Europa, en la segunda mitad de los años noventa, un grupo de trabajo coordinado

por el International Life Science Institute (ILSI) y patrocinado por la Comisión Europea promovió

dentro del IV Programa Marco, la Acción Concertada FUFOSE (Functional Food Science in Europe)

para estimular el estudio científico de los alimentos funcionales.

Hoy en día, un alimento funcional puede definirse como aquel alimento que además de satisfacer las

necesidades energéticas y nutricionales es capaz de proporcionar algún efecto beneficioso a una o

más funciones fisiológicas del organismo, aumentando el bienestar o disminuyendo el riesgo de

padecer alguna enfermedad (Goldberg, 1996). Dentro de esta definición relativamente amplia,

conviene destacar que el alimento funcional debe ejercer su función en el organismo en las

Introducción

2

cantidades normales de consumo dentro de la dieta, manteniendo su estructura y forma equivalentes

a su análogo no-funcional. Los alimentos funcionales son, con frecuencia, alimentos tradicionales a

los cuales se les ha añadido algún ingrediente adicional que les confiere la funcionalidad descrita.

Estos ingredientes son los denominados ingredientes funcionales.

En esta misma línea se introdujo el término de nutracéutico; estos productos son preparados que

también poseen actividad funcional beneficiosa para el organismo, pero que no respetan la

presentación y la estructura de un alimento convencional. Son comercializados en forma de

comprimidos, cápsulas y otras presentaciones no habituales en alimentos, siendo empleados

comúnmente como suplementos alimenticios (Diplock y col., 1999).

1.2. QUITOSANO

El quitosano es un polisacárido catiónico de origen natural, derivado de la quitina, compuesto de

cadenas distribuidas aleatoriamente de glucosamina (2-amino-2-deoxi-β-D-glucopiranosa) y N-acetil

glucosamina (2-acetoamido-2-deoxi-β-D-glucopiranosa) unidas por enlaces glucosídicos β(1→4) (ver

Figura 1). Por su parte, la quitina, constituida por unidades de N-acetil-D-glucosamina, es un

polisacárido blanco, duro, inelástico y nitrogenado. Los distintos tipos de quitosano difieren entre sí

según el método de obtención y la procedencia de la quitina utilizada, lo que les confiere distintas

propiedades y diversifica sus aplicaciones.

Introducción

3

Figura 1. Estructura química de la quitina y el quitosano.

1.2.1. Fuentes de quitina y obtención del quitosano

El quitosano se produce comercialmente por métodos químicos o enzimáticos, mediante la

desacetilación parcial de la quitina (Kurita, 2006). La purificación de la quitina se lleva a cabo en dos

pasos fundamentales: la separación de las proteínas o desproteinización y la separación del

carbonato de calcio y otras sales minerales o desmineralización (ver Figura 2).

Figura 2. Esquema simplificado de la obtención de quitina y quitosano a partir de caparazones de crustáceos.

La quitina, considerada el segundo biopolímero más abundante en la naturaleza después de la

celulosa, es el principal componente estructural de los caparazones (exoesqueleto) de crustáceos, alas

de insectos y de la pared celular de algunos hongos y algas. La producción industrial de quitosano

Desproteinización

Desmineralización Quitosano Quitina

Desacetilación parcial

Exoesqueleto crustáceos

Quitosano

Quitina

Introducción

4

prácticamente se basa en el tratamiento de las conchas de diversos tipos de crustáceos (cangrejos,

langostas, camarones, centollas) debido a la facilidad de encontrar estos materiales como desecho de

las plantas procesadoras de estas especies. En la Figura 3, se muestra un esquema simplificado del

aprovechamiento de crustáceos.

Figura 3. Esquema simplificado del aprovechamiento de crustáceos.

Los crustáceos (Crustacea) son un extenso subfilo de artrópodos, con más de 67.000 especies. Los

crustáceos son fundamentalmente acuáticos y habitan, tanto en el medio marino, salobre, como en

agua dulce, desde zonas costeras hasta zonas más profundas y desde los trópicos hasta las aguas

árticas. El cuerpo de los crustáceos está dividido normalmente en tres regiones: cabeza, tórax y

abdomen. Normalmente los primeros segmentos del tórax se unen a la cabeza formando lo que se

conoce como cefalotórax. El abdomen puede ser alargado o ensanchado según sean del tipo

Macruros o del tipo Branquiuros (ver Figura 4). Poseen además antenas, antenulas y pinzas.

Quitosano

Quitina

Crustáceos

Carne Desechos de proteínas Conchas

Productos congelados

Productos enlatados

Cremas y Salsas

Alimentos peces

Introducción

5

Figura 4. Crustáceo tipo Macruro (izquierda) y tipo Branquiuro (derecha).

Por tanto, aunque los recursos marinos constituyen por sí mismos una riqueza natural única,

podríamos decir que los caparazones de crustáceos esconden unas propiedades extraordinarias,

debidas al quitosano.

1.2.2. Caracterización química del quitosano

Los estudios de caracterización del quitosano se centran fundamentalmente en la determinación del

grado de desacetilación y su distribución de pesos moleculares, lo que nos permitirá conocer tanto la

composición de las cadenas que lo forman como sus dimensiones. Ambos parámetros tienen una

gran incidencia en las propiedades del polímero.

1.2.2.1. Peso molecular

El peso molecular del quitosano representa una media de los pesos de las moléculas presentes en su

estructura. Su determinación, se puede llevar a cabo empleando diferentes metodologías basadas en

técnicas cromatográficas (Nguyen, 2009), medidas de dispersión de luz (Tsaih, 2003) y de viscosidad

(Okuyama, 2000). La cromatografía de exclusión molecular (SEC) o de permeación en gel (GPC),

técnica empleada en este trabajo, consiste en pasar una disolución diluida de quitosano a través de

una columna rellena de un gel rígido poroso, de tal forma que las moléculas más grandes penetran

Langosta roja (Eunephrops bairdii) Cangrejo buey de mar (Cancer pagurus)

Introducción

6

ligeramente en los poros del gel y fluyen más rápido, mientras que las pequeñas realizan un recorrido

mayor a través de la estructura porosa del relleno y retrasan su avance por la columna,

produciéndose así, una separación por tamaño molecular.

El quitosano se comercializa generalmente en forma de tres tipos de productos: bajo, medio y alto

peso molecular, con valores medios de 120, 400 y 600 kDa, respectivamente.

1.2.2.2. Grado de desacetilación

El grado de acetilación (AD) se define como el contenido de residuos N-acetilglucosamina presentes

en la cadena polimérica de quitosano, expresado en tanto por ciento. El porcentaje de grupos amino

libres indica el grado de desacetilación (DD). En el caso del quitosano comercializado, este valor

habitualmente se sitúa en el rango del 70 - 95%, siendo difícil alcanzar rendimientos de desacetilación

superiores sin que se degrade la estructura polimérica.

La determinación del grado de acetilación puede realizarse mediante diversas técnicas (Kassai, 2009),

entre las que se pueden mencionar la espectroscopia infrarroja (Brugnerotto y col, 2001; Baxter y

col., 1992), la resonancia magnética nuclear (Duarte y col., 2001), la potenciometría (Qin y col.,

2003), la espectroscopia UV mediante el método de la primera derivada (Tan y col., 1998), el

dicroísmo circular (Domard y col., 1987) y el análisis elemental (Kasaai y col., 2003). En este trabajo

sólo se menciona la Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier (FT-IR) por ser la que

se ha empleado. Este método nos permite relacionar las absorbancias de dos bandas de absorción

determinadas con el porcentaje de acetilación del quitosano. La selección de las bandas de absorción

involucra una señal que depende del grado de acetilación (normalmente una de las bandas amida) y

otra que sirve de referencia interna para corregir las posibles diferencias de concentración.

El método de Brugnerotto y colaboradores (2001) ha sido usado con frecuencia en la literatura. En

éste, el grado de acetilación se calcula por la siguiente ecuación [1]:

AD (%) = 31.92 × (A1320 / A1420) − 12.20

donde A1320 y A1420 son las absorbancias del pico correspondiente a la banda amida III y de la banda

tomada como referencia, respectivamente.

Introducción

7

1.2.3. Aplicaciones y propiedades funcionales del quitosano

El procesado de productos de la pesca como los crustáceos, genera gran cantidad de residuos que

ocasionan graves daños al medioambiente. Entre estos residuos, se encuentran importantes

volúmenes de quitina, lo que, unido a su lenta capacidad de degradación, ha estimulado una

investigación centrada en el estudio de los posibles usos de esta sustancia, buscando por un lado, la

eliminación del problema medioambiental, y por otro, una explotación económica beneficiosa. La

producción de un biomaterial renovable, como es el quitosano, a partir de la quitina se puede

considerar de gran interés ecológico. Por otra parte, las propiedades físico-químicas y biológicas del

quitosano junto con la posibilidad de procesarlo de diferentes formas, lo convierten en un excelente

material con múltiples aplicaciones en el campo de la alimentación, la agricultura y la biotecnología,

la medicina y la farmacia, la industria textil y del papel, etc. (Kumar y Majeti, 2000), como se muestra

en la figura 5 de forma esquemática.

Figura 5. Aplicaciones del quitosano.

Aplicaciones del Quitosano

Medicina

Cirugía

Oftalmología

Odontología

Farmacia y Cosmética

Dosificación de fármacos

Cremas y lociones

Tratamiento del cabello

Agricultura

Antifúngico

Protección de semillas

Estimulador del crecimiento

Industria Alimentaria

Aditivo Alimentario: Conservante Antioxidante Estabilizante

Envases activos

Encapsulación de nutracéuticos

Industria del papel

Brillo

Fortaleza

Resistencia al agua

Industria Textil

Formación de fibras

Adsorción de colorantes

Estabilizador del color

Introducción

8

Entre las propiedades físico-químicas del quitosano se incluyen la reactividad, la solubilidad y la

biodegradabilidad. El quitosano es altamente reactivo debido fundamentalmente a los grupos amino,

que son los que le confieren el carácter catiónico, y a los grupos hidroxilos que posee en su

estructura (Acosta y col., 1993). Dicho carácter catiónico, lo hace único entre los polímeros de

origen natural, pudiendo interaccionar con compuestos cargados negativamente tales como

proteínas, polisacáridos aniónicos, ácidos grasos, ácidos biliares y fosfolípidos (Agulló y col., 2003),

formando derivados que amplían enormemente su campo de acción.

De igual modo, la presencia de grupos amino con valores de pKa de 6,5 a lo largo de la cadena de

quitosano aumenta su capacidad hidrofílica permitiendo una cierta solubilidad de esta macromolécula,

en contraste con la quitina, en disoluciones acuosas de ácidos inorgánicos como el clorhídrico,

bromhídrico, yodhídrico o nítrico y orgánicos tales como fórmico, acético, oxálico y láctico.

La biodegradación del quitosano, química o enzimática, tiene lugar mediante la hidrólisis de los

enlaces glucosídicos que unen las unidades de N-acetilglucosamina y glucosamina. La degradación

química se refiere a la degradación ácida catalizada por ejemplo por las condiciones ácidas del

estómago. La degradación enzimática puede ser catalizada por enzimas hidrolasas entre las que se

incluyen la quitosanasa, la quitinasa, la lipasa, la glicosidasa y la lisozima (Kean y col., 2010). Sus

productos de degradación son oligosacáridos o monosacáridos, metabolitos naturales que son luego

absorbidos y pueden ser incorporados a las rutas metabólicas de glicosaminoglicanos o

glicoaminoproteínas, o bien, excretados.

Además, otras propiedades a mencionar son su acción floculante derivada del carácter catiónico del

quitosano, y su viscosidad, que le proporciona capacidad espesante, gelificante y emulsificante

(Speiciene y col., 2007).

En cuanto a sus propiedades biológicas, con interés en el ámbito de la alimentación destaca su

actividad antimicrobiana frente a bacterias, hongos y levaduras (Rabea y col., 2003), su capacidad

antioxidante (Kamil y col., 2002), hipocolesterolémica e hipolipidémica (Ormrod y col., 1998),

Introducción

9

hipoglucémica (Miura y col., 1995), antihipertensiva (Park y col., 2003), inmunológica (Okamoto y

col., 1997) y antitumoral (Qin y col., 2002).

1.2.4. Procesado y obtención de geles a partir de quitosano

Una de las particularidades del quitosano que hacen que tenga, como se ha comentado

anteriormente, una amplia gama de aplicaciones, es la posibilidad de modificar su estructura

mediante diferentes procesos. De interés para el presente trabajo es la preparación de hidrogeles y

aerogeles, que se comentan a continuación.

La preparación más simple de hidrogeles consiste en disolver quitosano en una disolución ácida

diluida. Posteriormente, se puede precipitar añadiendo la solución de quitosano en una disolución

alcalina de hidróxido sódico o amoníaco. Si se añade con una jeringa se obtienen esferas de un

diámetro proporcional al tamaño de la jeringa (Valentin y col., 2003). El hidrogel así obtenido, se

puede neutralizar lavando con agua hasta neutralidad, y se transforma en un alcogel sustituyendo el

agua residual por un disolvente con menor polaridad (etanol, metanol, acetona…) mediante

inmersión en una serie sucesiva de mezclas diluidas con cantidades crecientes de alcohol.

El secado de un hidrogel puede resultar en un xerogel o un aerogel en función del método de secado

utilizado. Un xerogel es un gel seco que se ha encogido considerablemente durante el secado,

mientras que un aerogel es un gel seco que ha mantenido el volumen poroso de la matriz hidrogel

(Valentin y col., 2007). Mediante liofilización se mantienen en parte las propiedades del hidrogel, sin

embrago, la estructura secundaria se altera en gran medida debido al crecimiento de cristales de hielo

durante la congelación. Si se lleva a cabo una congelación rápida (-80ºC) se consigue una mejor

conservación de la estructura de los geles. Otra forma de secar el hidrogel es mediante CO2 en

condiciones supercríticas (Okano y col., 2009). El flujo de CO2 se hace pasar a través de la muestra

con el fin de eliminar los disolventes orgánicos (Rinki y col., 2009).

Introducción

10

1.3. LACTULOSA

La lactulosa (4-o-β-D-galactopiranosil-D-fructosa) fue el primer carbohidrato utilizado como

ingrediente prebiótico en alimentos, siendo capaz de estimular las bifidobacterias presentes en el

tracto gastrointestinal. Se trata de un disacárido semisintético obtenido a partir de la isomerización

alcalina de la lactosa (componente que se encuentra en alta concentración en la leche y en el

lactosuero) empleando diferentes catalizadores.

En la Figura 6 se muestran las estructuras bidimensionales de la lactulosa y su isómero, la lactosa.

Figura 6. Representación bidimensional de la lactulosa y la lactosa.

1.3.1. Efectos fisiológicos beneficiosos de la lactulosa

La lactulosa es el ingrediente prebiótico de mayor consumo en el mundo, se comercializa en

soluciones acuosas con distintos grados de pureza, para el tratamiento del estreñimiento, de la

hiperamonemia, de la encefalopatía hepática y de infecciones intestinales (Schumann y col., 2002).

La lactulosa también ha mostrado su eficacia en el incremento de la absorción de calcio y magnesio

(Olano y Corzo, 2009).

Lactosa

Lactulosa

Introducción

11

Según se muestra en la Figura 7, la lactulosa presenta baja absorción en el intestino delgado (ya que

no es hidrolizado por los enzimas específicos de la mucosa intestinal) y llega al intestino grueso

donde es degradada por la flora microbiana. Fermenta en el colon transformándose en ácidos láctico

y acético, proveyendo al intestino grueso de una fuente de carbono junto con el desarrollo de un pH

bajo que favorece el crecimiento de un gran número de bifidobacterias.

Figura 7. Mecanismo principal de acción de la lactulosa (Schumann y col., 2002).

1.3.2. Solubilidad de la lactulosa en medio supercrítico

Dado el carácter polar de los carbohidratos, su solubilidad en CO2 supercrítico es limitada. Esto

hace que sea necesaria la utilización de modificadores, principalmente etanol, que ayuden a aumentar

la solubilidad de la lactulosa en medio supercrítico.

En la tabla 1 se muestran los datos experimentales de solubilidad de la lactulosa en diferentes

condiciones supercríticas usando como modificador etanol/agua (95:5 v/v), expresados en términos

de masa y como fracción molar, obtenidos por Montañés y colaboradores (Montañes y col., 2009).

Lactulosa atraviesa el estómago y el intestino delgado

↑ Presión osmótica

↓ pH ↓ Degradación bacteriana de la urea

Cambios en el metabolismo bacteriano

Suministro de energía

↓ tiempo de tránsito en el colon

↑ Metabolismo carbohidratos ↓ Degradación proteínas

Crecimiento bacteriano

↓ Ruptura aminoácidos

Acción inmunológica

Suministro carbohidratos

0.25 – 2 % Absorbido

Lactulosa en el colon

Introducción

12

Estos y otros datos sobre el fraccionamiento selectivo de carbohidratos mediante la tecnología de

fluidos supercríticos se obtuvieron a partir de una serie de experimentos llevados a cabo en nuestro

grupo de trabajo, y se recogen de forma más amplia en la Tesis Doctoral titulada “Aplicación de la

tecnología de fluidos supercríticos a la purificación de carbohidratos prebióticios”, presentada en la

Universidad Autónoma de Madrid el 6 de Noviembre de 2009.

Tabla 1. Solubilidad de la lactulosa en SC-CO2 con etanol/agua (95:5 v/v) como modificador (Montañes y col., 2009).

Solubilidad de la lactulosa en SC-CO2 T (ºC) P (bar) modificador (ml/ min) mg/ g disolvente Fracción molar (105)

60 100 0.2 0.2508 3.2154

60 200 0.2 0.0465 0.5962

60 300 0.2 0.1311 1.6802

100 100 0.2 0.4058 5.2026

100 200 0.2 0.0487 0.6756

100 300 0.2 0.1984 2.5436

60 100 0.4 0.1224 1.5633

60 200 0.4 0.0488 0.6233

60 300 0.4 0.1045 1.3347

100 100 0.4 0.1622 2.0716

100 200 0.4 0.0805 1.0282

100 300 0.4 0.3678 4.6976

60 100 0.6 0.1017 1.2950

60 200 0.6 0.0345 0.4392

60 300 0.6 0.4799 6.1092

100 100 0.6 0.2249 2.8634

100 200 0.6 0.0877 1.1170

100 300 0.6 0.2301 2.9292

1.3.3. Análisis de lactulosa por cromatografía de gases (GC)

Muchos son los métodos que se emplean para la identificación y cuantificación de la lactulosa y de

otros carbohidratos, pero sin duda las más empleados son los cromatográficos, por ser los más

sensibles y precisos. De esta manera, mediante cromatografía de gases (GC) se puede lograr una

adecuada cuantificación de la lactulosa presente en una muestra, de forma reproducible y con límites

de detección muy bajos.

Introducción

13

Dado que los carbohidratos son compuestos no volátiles, es preciso llevar a cabo una derivatización

como paso previo al análisis por cromatografía de gases. La formación de trimetil-silil derivados de

oximas de la lactulosa es un método de derivatización muy eficaz que permite que las distintas

formas anoméricas de los azúcares reductores aparezcan en el cromatograma en forma de dos picos

(Shippee y col., 1992).

Las columnas capilares son hoy en día las más utilizadas para la cuantificación de la lactulosa y otros

azúcares por cromatografía de gases, y entre ellas las compuestas por metilsilicona o polisiloxanos

con un porcentaje variable de grupos polares fenil o cianopropil. Así, el uso de columnas con una

composición de 95% de metilsilicona y 5% de grupos fenilo (HP-5 MS) ha sido descrito

previamente para este tipo de análisis (Soria y col., 2010).

Dependiendo del tipo de fase utilizada, soporte y gas portador, la lactulosa eluye en un rango de

temperaturas comprendido entre 200 y 260 ºC.

1.4. FLUIDOS SUPERCRÍTICOS

1.4.1. Generalidades sobre los fluidos supercríticos

Un fluido supercrítico es una sustancia con propiedades intermedias entre dos de las tres formas de

de agregación de la materia que se conocen comúnmente: sólido, líquido y gas. Concretamente, un

fluido supercrítico posee densidades similares a los líquidos, viscosidades en el mismo rango que los

gases, y una difusividad intermedia entre ambos estados, como se puede apreciar en la Tabla 2,

viéndose favorecidas sus propiedades hidrodinámicas y la capacidad de transferencia de materia.

Tabla 2. Densidad, viscosidad y difusividad de diferentes fluidos tipo.

Densidad (g/ml) Viscosidad (g/cm×s) Difusividad (cm2/s)

Gas 10-3 10-4 10-1

Líquido 1 10-2 10-6

Fluido supercrítico 0,2-0,9 10-4 10-3

Introducción

14

En un diagrama de fases clásico como el de la Figura 8, en el que se presenta la relación de los

estados sólido, líquido y gaseoso en función de la temperatura y la presión, se observan las curvas de

fusión, sublimación y vaporización, las cuales muestran las zonas de coexistencia de dos fases, y un

punto de coexistencia de los tres estados, el llamado punto triple (PT). El cambio de estado se asocia

a un cambio brusco de densidad y, para que se produzca, es necesario un aporte extra de energía

denominado entalpía de cambio de estado. Sin embargo, este cambio de densidad no se produce por

encima del llamado punto crítico (PC) por tanto, se podría definir este punto como aquel por

encima del cual no se produce licuefacción al presurizar, ni gasificación al calentar.

Figura 8. Diagrama de fases sólido/líquido/gas.

PT: punto triple, PC: punto crítico, Pc: presión crítica, Tc: temperatura crítica.

En la sucesión de imágenes de la Figura 9, se observa que si un gas se calienta por encima de cierta

temperatura (Tc), por más que se comprima éste no alcanza el estado líquido. Esta misma

observación fue la realizada por Charles Cagniard de la Tour, quien en 1822 definió el punto crítico

por primera vez.

Introducción

15

Figura 9. Desaparición de las fases en el punto crítico.

Por tanto, una sustancia se puede considerar como un fluido supercrítico cuando se encuentra por

encima de su punto crítico, definido tanto por su presión como por su temperatura críticas (Luque

de Castro y col., 1993). Entre las sustancias más comúnmente empleadas en condiciones

supercríticas se encuentran el dióxido de carbono, el argón, el metano, el etano, el propano, el

butano, la acetona, el agua, el amoniaco, el etanol y el metanol. De esta manera, el dióxido de

carbono (CO2) alcanza las condiciones supercríticas (SC-CO2) cuando se encuentra a temperatura y

presión superiores a 31ºC y 72 bar, respectivamente. Sin embargo, para alcanzar el punto crítico del

agua se necesitan unas condiciones mucho más extremas, 375ºC de temperatura y 215 bar de

presión.

1.4.2. Fluidos supercríticos para la industria alimentaria

Para que un fluido pueda emplearse como disolvente en la industria y, especialmente, en la industria

alimentaria, debe poseer una serie de propiedades adicionales, como son baja o nula inflamabilidad y

toxicidad, no ser agresivo con el medio ambiente, poseer condiciones críticas moderadas, ser

gaseoso en condiciones de presión y temperatura ambiente (no dejando ningún tipo de residuo en

las preparaciones alimentarias), tener una alta capacidad disolvente, ser fácil de obtener con elevada

pureza y tener un bajo precio (Rozzi y col., 2002). De entre los fluidos supercríticos más estudiados,

el que mejor cumple con todas estas propiedades es el dióxido de carbono (CO2), con la salvedad de

su apolaridad que, en principio, limita su poder solvente para sustancias polares, como los

carbohidratos. Una de las posibilidades para superar esta limitación es el empleo de cosolventes

Introducción

16

declarados GRAS (Generally Recognized As Safe) (etanol y agua) que actúen como modificadores

dotando al medio supercrítico de mayor polaridad.

Así, el dióxido de carbono supercrítico junto con el empleo de una mezcla de etanol y agua como

cosolvente se podría utilizar para la obtención de nuevos ingredientes funcionales a partir de la

impregnación de quitosano con lactulosa, objeto de estudio en este trabajo.

1.4.3. Impregnación con Fluidos Supercríticos

El interés por la tecnología de impregnación supercrítica en matrices poliméricas se deriva de la

oportunidad de utilizar las propiedades de los fluidos supercríticos para la preparación de nuevos

materiales poliméricos con propiedades y beneficios adicionales. La ausencia de tensión superficial

permite a los fluidos supercríticos la rápida penetración dentro de los poros de matrices

heterogéneas. La alta difusividad del dióxido de carbono, permite que se produzca una transferencia

de materia mucho más favorable, así como una distribución homogénea del aditivo en el núcleo de

la matriz polímerica, lo cual es una de las principales ventajas del proceso. Además, dichos fluidos

pueden difundir fácilmente fuera del polímero, una vez que la presión se reduce a valores

ambientales, por lo que no dejan residuos de disolventes en la muestra de polímero impregnado.

De este modo se han desarrollado un amplio número de trabajos que emplean la tecnología de

fluidos supercríticos utilizando CO2 (SC-CO2) en la obtención de derivados de quitosano. Como

ejemplo cabe destacar la preparación de derivados de quitosano con azúcares reductores tales como

glucosa y maltoligosacáridos, en los que se logra una mayor transformación que por métodos

convencionales (Yalpani y col., 1993). También, se han realizado numerosos estudios sobre la

impregnación de quitosano mediante fluidos supercríticos para su aplicación en la encapsulación de

principios activos y posterior liberación controlada de fármacos como la dexametasona (Duarte y

col., 2009), la indometacina (Gong y col., 2006), el flurbiprofeno o el maleato de timolol (Braga y

Introducción

17

col., 2008). Estos estudios se han empleado como punto de partida para abordar la impregnación de

quitosano con lactulosa u otros carbohidratos prebióticos, objeto de estudio en la presente memoria.

El proceso de impregnación con fluidos supercríticos se lleva a cabo empleando un dispositivo

como el que se muestra de forma esquemática en la Figura 10.

Figura 10. Equipo de impregnación supercrítica (Duarte y col., 2008).

El equipo consta básicamente de un saturador (S) y una celda de impregnación (I), colocados dentro

de un horno que mantiene la temperatura, medida mediante un termopar (T). La presión del sistema

se mide con un transductor de presión (P). El saturador se carga con una pequeña cantidad del

aditivo mezclado con arena de mar o cuentas de vidrio para mejorar la transferencia de masa, y la

celda de impregnación se llena con el polímero. La mezcla de CO2 y modificador se calienta a la

temperatura deseada y una vez alcanzada la presión de trabajo, se introduce en el saturador. Una vez

disuelto el soluto, el fluido resultante se introduce en la celda de impregnación donde se encuentra el

polímero a impregnar, que se expone a esta solución durante un tiempo predeterminado seguido de

la despresurización lenta del sistema. El proceso se puede llevar cabo en modo dinámico o estático,

según se encuentre la válvula de salida del flujo de CO2 abierta o cerrada.

Es importante distinguir entre dos mecanismos de impregnación de aditivos en matrices poliméricas

mediante el empleo de fluidos supercríticos (Kazarian y col., 2000). El primer mecanismo implica un

Introducción

18

simple depósito del compuesto cuando el fluido sale de la matriz polimérica hinchada. Según

Kazarian, esta situación consiste en su mayor parte en un soluto con una solubilidad relativamente

alta en el fluido y es específica para la impregnación llevada a cabo en una matriz sujeta al

hinchamiento bajo la exposición al fluido supercrítico. El segundo mecanismo, no específico de los

fluidos supercríticos, corresponde a las interacciones químicas entre el soluto y la matriz.

El proceso de impregnación con fluidos supercríticos se rige por las relaciones de la termodinámica

y la transferencia de masa, que dependen, de una manera compleja, de la presión del fluido

supercrítico y de la temperatura de trabajo. La presión y la temperatura no sólo afectan a la

solubilidad del soluto de interés en el dióxido de carbono, sino que también influyen en el grado de

adsorción del polímero, es decir, en la cantidad de dióxido de carbono que puede disolverse en la

matriz polimérica. La transferencia de materia también dependerá en cierta medida de la preparación

de la muestra, especialmente de la estructura del material y del tamaño de partícula.

La eficacia de la impregnación resulta de un complejo mecanismo que implica interacciones entre el

soluto (aditivo), el portador (fluido supercrítico y modificador) y la matriz polimérica (Duarte y col.,

2007). La fuerza relativa de todas las interacciones binarias (aditivo – SC-CO2, polímetro – SC-CO2,

y aditivo – polímero) contribuirá a la distribución definitiva del soluto entre la fase móvil y el sólido.

Como ejemplo, un aditivo con una baja solubilidad en el fluido supercrítico, pero con una fuerte

interacción con la matriz podría impregnarse en gran medida; por el contrario, un soluto con mayor

interacción con el disolvente en comparación con la matriz será difícilmente impregnado. Por tanto,

considerando la complejidad asociada al proceso de impregnación, será necesario optimizar las

condiciones del mismo en función del soluto a impregnar, el fluido supercrítico (y cosolvente)

empleado y la matriz polimérica.

Materiales y Métodos

19

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. MUESTRAS Y REACTIVOS

El quitosano, la lactulosa (>98% de pureza, calidad HPLC), el patrón interno empleado en el análisis

por cromatografía de gases (fenil-β-D-glucósido), y los agentes derivatizantes (hidrocloruro de

hidroxilamina, hexametildisilazano, y ácido trifluoroacético) fueron suministrados por la empresa

Sigma-Aldrich.

El quitosano utilizado, de bajo y mediano peso molecular, está en forma de polvo procedente del

caparazón de crustáceos, fundamentalmente cangrejos.

En cuanto a los disolventes utilizados, el ácido acético glacial y el hidróxido sódico fueron

proporcionados por Panreac Química, el etanol por BDH Prolabo, el metanol por Sigma-Aldrich y

la piridina por Merck, todos ellos de grado analítico.

El agua ultrapura (18.2 MΩcm de resistivilidad y 1–5 ppb de carbono orgánico total (TOC)) se

obtuvo en el laboratorio mediante un sistema de purificación Milli-Q Synthesis A10 de Millipore.

Finalmente, el nitrógeno y el dióxido de carbono licuado fueron suministrados por Praxair, y la lana

de vidrio lavada químicamente por Panreac Química.

2.2. PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DEL QUITOSANO

El quitosano comercial se ha procesado de dos formas distintas, según los métodos que se describen

a continuación, obteniendo una matriz susceptible de impregnación bien en forma de scaffolds o en

forma de microesferas.

2.2.1. Preparación de scaffolds de quitosano

Los scaffolds de quitosano se prepararon a partir de una disolución al 1% (p/v) de quitosano (bajo

peso molecular) en ácido acético al 1% en agua (v/v). La disolución total se obtuvo por agitación a


20

temperatura ambiente durante 6 h. A continuación, la disolución obtenida se dializó utilizando una

membrana de diálisis con tamaño de poro de 3500 Da con el fin de llevar a cabo una purificación. El

tiempo de dialización fue de 48 h, cambiando el agua 2 veces al día. Posteriormente, el gel obtenido

se congeló a -80ºC y se liofilizó a 4ºC con el fin de eliminar completamente el disolvente (Duarte y

col., 2009) mediante un liofilizador Labconco Modelo 79480.

2.2.2. Preparación de microesferas de quitosano

Las microesferas de quitosano se prepararon a partir de una disolución al 1% (p/v) de quitosano

(mediano peso molecular) en ácido acético al 2% en agua (v/v). A continuación, la disolución

obtenida se precipitó gota a gota mediante una bureta, en una disolución alcalina de hidróxido

sódico al 5% (p/v). Una vez obtenidas las microesferas de quitosano, se neutralizaron lavando con

agua hasta neutralidad (Okano y col., 2009), y se deshidrataron mediante inmersión en una serie

sucesiva de mezclas etanol/agua con cantidades crecientes de alcohol (10, 30, 50, 70, 90, 100%)

durante 15 minutos cada una de ellas. Para llevar a cabo la separación de las microesferas de

quitosano de cada uno de los tres disolventes utilizados (hidróxido sódico, agua y etanol), la mezcla

se centrifugó a 10.000 r.p.m. durante 15 minutos en una centrífuga Beckman Coulter Avanti J-26

XP. Posteriormente, el hidrogel así obtenido (ver Figura 8) se secó mediante CO2 en condiciones

supercríticas mediante el extractor de fluidos supercríticos de escala analítica que se describe en el

siguiente apartado, a una presión de 74 bar y una temperatura de 32 ºC durante 2 horas, con el fin de

eliminar el disolvente orgánico empleado en la preparación (Valentin y col., 2003).

2.3. CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL QUITOSANO

2.3.1. Cromatografía de Exclusión Molecular (SEC)

El peso molecular promedio de los dos quitosanos empleados en este trabajo, se determinó por

Cromatografía de Exclusión Molecular. El equipo utilizado estaba compuesto por una bomba de


21

gradiente HPLC Dionex, dos columnas de exclusión molecular TSKgel Tosoh Bioscience de 30 cm

de longitud y 7.8 mm de diámetro interno (G5000PWXL y G4000SWXL), colocadas en serie, y un

detector de índice de refracción Shimadzu RID-10A. Los valores de peso molecular se determinaron

después de una calibración del sistema.

2.3.2. Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier (FT-IR)

Las muestras de quitosano fueron preparadas para su análisis por espectroscopia infrarroja en forma

de pastillas de Bromuro Potásico (KBr). Las pastillas se prepararon moliendo en un mortero una

pequeña cantidad de quitosano con 100 mg de KBr y prensando la mezcla hasta obtener una pastilla

compacta. Posteriormente, se analizaron en un espectrómetro de infrarrojos con transformada de

Fourier Perkin Elmer Spectrum One.

2.3.3. Microscopia Electrónica de Barrido (SEM)

Las muestras de quitosano antes y después de la impregnación se observaron mediante un

microscopio electrónico de barrido Phillips, modelo XL30, a 25 kV. Previo al análisis por

microscopia electrónica, las muestras se recubrieron con 4 nm de oro paladio para proporcionar la

conductividad necesaria, a 50 A° en una atmósfera de argón, utilizando un metalizador Polaron,

modelo SC7640. Las micrografías fueron tomadas a 50, 200 y 800 aumentos (50x, 200x, 800x).

2.4. PROCESO DE IMPREGNACIÓN CON FLUIDOS SUPERCRÍTICOS

2.4.1. Sistema de impregnación por fluidos supercríticos

La Figura 11 muestra el diagrama del sistema de impregnación por fluidos supercríticos empleado

para llevar a cabo los experimentos.


22

Figura 11. Esquema del sistema de impregnación supercrítica empleado.

El sistema está basado en un extractor Suprex PrepMaster (Thar designs, Pittsburg, EE.UU) de

escala analítica (ver Figura 12) con varias modificaciones. Posee un horno termostatizado calentado

por convección de aire donde se coloca la celda de acero inoxidable con la muestra de quitosano y la

lactulosa. El CO2 se bombea al sistema empleando la bomba del equipo Suprex PrepMaster.

El modificador se introduce en el sistema mediante una bomba Suprex, después de la cual se coloca

una válvula antirretorno (Swagelok CHS2-BU-10), para evitar la entrada de CO2 y el consiguiente

daño del sistema de bombeo. Los dos fluidos se mezclan en un dispositivo diseñado especialmente

para favorecer el mezclado de ambos, a la vez que garantiza que el fluido alcance la temperatura de

impregnación previo a su entrada en la celda, mediante el paso del fluido por un tubo de acero de

dimensiones apropiadas en forma de espiral situado en un baño de glicerina a la temperatura de

(1) Botella de CO2, (2) Bomba de CO2 de doble pistón, (3) Reservorio de modificador, (4) Bomba de modificador, (5) Puntos de lectura de presión, (6) Válvula on/off para CO2, (7) Válvula on/off para modificador, (8) Válvula antirretorno, (9) Baño calefactor, (10) Válvula on/off para la mezcla CO2 /

modificador calefactada, (11) Horno, (12) Celda de acero inoxidable, (13) Válvula de microregulación, (14) Válvula on/off , (15) Celda de expansión, (16) Medidor de flujo másico, (17) Ordenador.


23

trabajo. A la salida de la celda de impregnación se encuentra una válvula micrométrica (Swagelok

SS4-BU-VH) que se emplea para el control fino del flujo a través de la celda.

Para llevar a cabo la medida y el ajuste del flujo de CO2 (gas) que circula por el sistema, de forma

precisa, está adaptado un medidor de flujo másico (EL-FLOW F-111C) controlado por ordenador.

Figura 12. Equipo de extracción supercrítica de escala analítica Suprex PrepMaster y

esquema simplificado de funcionamiento.

Puesto que el dispositivo utilizado en este trabajo no dispone de saturador, el proceso de

impregnación se ha llevado a cabo poniendo tanto la lactulosa como el quitosano en la celda de

impregnación. Como se muestra en la Figura 13, la lactulosa se colocó en la celda separada de la

matriz de quitosano mediante lana de vidrio, de tal manera que el flujo de CO2 entre en contacto en

primer lugar con la lactulosa y posteriormente con la matriz de quitosano. De la misma manera, la

lana de vidrio se empleó para evitar la salida y contaminación de la muestra, colocándola en cada

uno de los extremos de la celda.


24

Figura 13. Distribución de la muestra de quitosano (en forma de scaffolds o microesferas) y de la lactulosa en la celda.

2.4.2. Condiciones de impregnación

Todas las impregnaciones se llevaron a cabo a 100 bar de presión, 100 ºC de temperatura y 0.2 ml/

min de modificador etanol/agua 95/5 (v/v). Estas condiciones dieron lugar a una solubilidad de la

lactulosa en el fluido supercrítico de 0.4058 mg/ g disolvente.

La cantidad de quitosano y lactulosa que se colocó en la celda de impregnación guardó una

proporción de 1:0.1 pero varió en función de la forma en que estaba procesado el quitosano de

partida; dicha cantidad fue 500 mg de quitosano y 50 mg de lactulosa para los scaffolds de quitosano

y 1 g de quitosano y 100 mg de lactulosa en el caso del procesado en forma de microesferas. Esta

variación en las condiciones de impregnación entre ambos quitosanos se debió a que las

microesferas tienen una relación peso / volumen muy superior a los scaffolds de quitosano.

Al finalizar cada uno de los experimentos se comprobó que la cantidad de lactulosa se encontraba en

exceso, observando el remanente de lactulosa en la celda de impregnación.

Los experimentos se realizaron empleando dos modalidades de trabajo: estático y dinámico.

El modo de trabajo general seguido en todos los experimentos realizados en estático, combina un

corto periodo de estabilización del sistema (en modo dinámico) y el periodo de impregnación

propiamente dicho en estático. Una vez alcanzadas las condiciones experimentales de presión y

Lana de vidrio

Lactulosa

Scaffolds de quitosano

Microesferas de quitosano


25

temperatura, el disolvente de impregnación (consistente en una mezcla de CO2 y modificador) se

hace pasar a través de la celda a un flujo de 1.2 g/ min durante 20 minutos, para asegurarnos que el

porcentaje de modificador en la celda sea del 6% (ps). Posteriormente comienza el proceso de

impregnación en modo estático durante 1 o 3 horas, y por último se despresuriza. El flujo de

despresurización de CO2 se regula haciendo pasar el flujo de salida de CO2 por un capilar de sílice

fundida de 75 µm de diámetro y una longitud de 50 cm, acoplado en el dispositivo de

despresurización del equipo. Dicho flujo oscila entre 1 y 0.6 bar/ min. Para los experimentos en los

que se realizaron ciclos de impregnación, se repitió el mismo procedimiento de impregnación

(durante 1 hora) y despresurización, 3 veces, pero en cada ciclo, se renovaba la cantidad de lactulosa,

y se tomó parte de la muestra impregnada para su posterior análisis y caracterización.

En los experimentos realizados en modo dinámico, el disolvente de impregnación se hizo pasar a

través de la celda a un flujo de 1.2 g/ min durante 60 minutos, siendo el flujo de despresurización de

3 bar/ min.

2.5. CUANTIFICACIÓN DE LA CARGA DE LACTULOSA

La cromatografía de gases se ha empleado para cuantificar la cantidad de lactulosa impregnada en la

muestra de quitosano, y estudiar así el rendimiento de la impregnación.

2.5.1. Preparación de la muestra

De la muestra de quitosano obtenida en los diferentes experimentos de impregnación supercrítica se

separaron 200 mg y se añadieron 5 ml de agua milli-Q con el fin de disolver la lactulosa impregnada.

A continuación se adicionaron 200 µL de una disolución al 10 % (p/v) de fenil-β-D-glucósido en

metanol/agua (70:30, v/v) como patrón interno. La mezcla se centrifugó durante 5 minutos a 10.000

r.p.m., previo ajuste del pH a condiciones alcalinas (7 - 8.5) para facilitar la precipitación del

quitosano. Una alícuota del sobrenadante se traspasó a un matraz de corazón y se evaporó a

sequedad en un rotavapor Büchi Labortechnik AG R-210 a 40 ºC.


26

2.5.2. Preparación de trimetil-silil derivados de oximas de lactulosa

Las oximas de los carbohidratos se formaron añadiendo a las muestras previamente llevadas a

sequedad, 200 µL de hidrocloruro de hidroxilamina en piridina (2.5 %, p/v) y calentando la mezcla a

70 ºC durante 30 minutos. Posteriormente, las oximas obtenidas en el paso anterior se sililaron con

hexametildisilazano (200 µL) y ácido trifluoroacético (20 µL) y se mantuvieron a 50 ºC durante 30

minutos (Sanz y col, 2004). La mezcla de reacción se centrifugó a 10.000 r.p.m durante 2 minutos.

Los sobrenadantes se inyectaron en el cromatógrafo de gases o se almacenaron a 4 ºC para su

posterior análisis.

2.5.3. Condiciones cromatográficas

Los análisis se realizaron en un cromatógrafo de gases Agilent 7890A (ver Figura 14) equipado con

un inyector automático con divisor de flujo (split/splitless) (1:40) y un detector por ionización de

llama (FID), utilizando nitrógeno como gas portador. Los trimetilsilil éter y las trimetilsilil oximas se

separaron usando una columna capilar de sílice fundida HP-5 MS adquirida de Agilent J&W

Scientific, de 30 m de longitud y 0.32 mm de diámetro interno. La temperatura del horno fijada a

180 ºC, se elevó a 276 ºC a una velocidad de calentamiento de 3 ºC/ min. La temperatura del

inyector y del detector fue de 280 y 325 ºC, respectivamente. El sistema de integración y adquisición

de datos estaba controlado mediante el software MSD Chemstation proporcionado por Agilent

Technologies.

Figura 14. Cromatógrafo de Gases Agilent 7890A.

Resultados y Discusión

27

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL QUITOSANO DE PARTIDA

Como se ha comentado anteriormente, el quitosano comercial se procesó de dos formas distintas, en

forma de scaffolds y en forma de microsesferas. Posteriormente, ambos fueron caracterizados

mediante Cromatografía de Exclusión Molecular (SEC), Espectroscopía Infrarroja con

Transformada de Fourier (FT-IR) y por Microscopía Electrónica de Barrido (SEM).

En la Figura 15 se puede observar una muestra de los scaffolds de quitosano obtenidos. Se trata de

una matriz porosa con un peso molecular promedio de 150 KDa y un grado de desacetilación del

90%.

Figura 15. Scaffolds de quitosano.

En cuanto a las microesferas de quitosano, se obtuvo un aerogel como el que se muestra en la Figura

16, con gran superficie por unidad de peso, un peso molecular promedio de 385 KDa y un grado de

desacetilación del 85%. De igual modo, en la misma figura se muestra el hidrogel obtenido.


28

Figura 16. Microesferas de quitosano: hidrogel (izquierda), y aerogel (derecha).

El cambio del quitosano de bajo peso molecular al de mediano peso molecular en el caso del

procesado en forma de microesferas, fue necesario al comprobar que con el primero las

microesferas no se formaban adecuadamente en el paso de precipitación en el hidróxido sódico.

3.1.1. Cromatografía de Exclusión Molecular (SEC)

Puesto que cuando hablamos de un polímero, no nos referimos a un solo peso molecular, sino a una

distribución de pesos moleculares, fue necesario un análisis de la muestra por Cromatografía de

Exclusión Molecular (Size Exclusion Chromatography, SEC), para conocer este dato con mayor

exactitud. De esta manera, podemos asegurar una cierta reproducibilidad en posteriores

experimentos, puesto que puede haber diferencias significativas entre el peso molecular del

quitosano de unas partidas comerciales a otras.

A partir de los análisis realizados, se obtuvo un gráfico como el de la Figura 17 que nos describía la

distribución de pesos moleculares alrededor del peso molecular promedio. Es decir, el pico nos

proporciona información sobre el número de moléculas de quitosano con peso molecular promedio

y qué cantidad tienen peso superior o inferior al promedio.


29

Figura 17. Típico gráfico obtenido por Cromatografía de Exclusión Molecular.

En la interpretación de este tipo de gráficos, es importante tener en cuenta que las moléculas con

mayor peso molecular, tienen un menor tiempo de retención que las de bajo peso molecular, por lo

los valores de peso molecular aumentan de izquierda a derecha.


La espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FT-

IR) nos permite por un lado identificar los grupos funcionales presentes en la muestra y por otro

lado determinar el grado de acetilación del quitosano.

En un espectro de infrarrojo (IR) como el de la Figura 18, se pueden apreciar las bandas características

del quitosano a 3450 cm-1 (tensión del grupo -OH), a 3292 cm-1 (tensión del grupo N-H), a 2919 y

2862 cm-1 (tensión del grupo C-H), a 1655 cm-1 (amida I), a 1580 cm-1 (amida II), a 1417 cm-1 (grupo

CH3), a 1313 cm-1 (amida III), a 1154 cm-1 (tensión asimétrica del enlace C-O-C), a 1082 y 1032 cm-1

(vibraciones propias de su estructura piranósica) y a 896 cm-1 (tensión C-H de los grupos

anoméricos). La figura muestra además las líneas base utilizadas para el cálculo del grado de

desacetilación del quitosano por el método de Brugnerotto y colaboradores (2001).

Nº

mol

écul

as

Peso Molecular

Tiempo


30

Figura 18. Espectro de IR de una muestra de quitosano (Brugnerotto y col., 2001).

A continuación se presentan los espectros de IR correspondientes a los scaffolds y microesferas de

quitosano obtenidos en esta investigación (Figuras 19 y 20). En ellos se puede observar una gran

correspondencia con las bandas características obtenidas por Brugnerotto y colaboradores (2001).

Figura 19. Espectro de IR de una muestra de los scaffolds de quitosano obtenidos en este trabajo.

Longitud de onda (cm-1)

Tra

nsm

itanc

ia (%

)

3450

32

92 29

19

2862

1082

10

32

1655

15

80

1417

1154

896

1313


31

Figura 20. Espectro de IR de una muestra de las microesferas de quitosano obtenidas en este trabajo.

El grado de desacetilación calculado a partir de la relación entre las bandas de absorción a 1320 cm-1

y 1420 cm-1 (ecuación [1]) (Brugnerotto y col., 2001), dio un valor del 90% en el caso de los scaffolds

de quitosano y del 85% en el caso de las microesferas de quitosano.


Otra forma de caracterizar los scaffolds y las microesferas de quitosano obtenidos fue mediante su

análisis por Microscopia Electrónica de Barrido (Scanning Electron Microscopy, SEM).

En la Figura 21 se muestra una de las micrografías obtenidas de la matriz de quitosano procesado en

forma de scaffolds, antes de ser impregnado, en los que puede observar su estructura laminada.


32

Figura 21. Micrografía SEM de scaffolds de quitosano (800x).

Para el caso de las microesferas de quitosano, las micrografías de la Figura 22, muestran su

estructura superficial.

Figura 22. Micrografías SEM de microesferas de quitosano (50x y 800x).

3.2. PROCESO DE IMPREGNACIÓN SUPERCRÍTICA

3.2.1. Experimentos realizados y condiciones de operación

Los experimentos realizados y las condiciones de operación empleadas para la impregnación tanto

de los scaffolds como de las microesferas de quitosano, se muestran resumidas en las Tablas 3 y 4,

respectivamente.


33

Tabla 3. Experimentos realizados y condiciones de operación, en los scaffolds de quitosano.

Temperatura

(ºC)

Presión

(bar)

Modificador

(ml/min)

Tiempo

(min) Modo de trabajo

Flujo (bar/min) despresurización

100 100 0.2 60 Estático 1

100 100 0.2 180 Estático 0.6

100 100 0.2 60 Dinámico

(1.2 g/ min) 3

Tabla 4. Experimentos realizados y condiciones de operación, en las microesferas de quitosano.

Temperatura

(ºC)

Presión

(bar)

Modificador

(ml/min)

Tiempo



100 100 0.2 60 Estático 1

100 100 0.2 60 (x 3 ciclos) Estático 1 (x 3 ciclos)

100 100 0.2 60 Dinámico

(1.2 g/ min) 3

Como se ha comentado anteriormente, para todos los experimentos realizados se utilizaron las

condiciones en las que se conseguía una solubilidad de la lactulosa en el fluido supercrítico de 0.4058

mg/ g disolvente; estas correspondían a una temperatura de 100 ºC y 100 bar de presión. El fluido

supercrítico consistía en una mezcla de CO2 a un flujo de 1.2 g/ min y 0.2 ml/min de modificador

etanol / agua 95:5. Estas condiciones se determinaron a partir de los datos de solubilidad de la

lactulosa en medio supercrítico obtenidos en los trabajos llevados a cabo por Montañés y

colaboradores (2009), y se tomaron como las más adecuadas teniendo en cuenta las condiciones de

presión, temperatura y densidad del fluido más favorables para que se produzca la impregnación, así

como la selección de unas condiciones de operación que permitan mantener una alta solubilidad de

la lactulosa en el fluido supercrítico.


34

Por otra parte, se probó tanto el modo de trabajo estático como el dinámico, con el fin de evaluar el

rendimiento en ambos procesos de impregnación. En un primer momento se pensó que se podría

obtener un mayor rendimiento en el proceso dinámico, por la mayor cantidad de fluido supercrítico

que se haría pasar a través de la celda de impregnación. Sin embargo, experimentos llevados a cabo

sobre la impregnación de fármacos en matrices poliméricas, por el grupo de investigación dirigido

por el doctor Herminio de Sousa, demostraban tener un mayor rendimiento cuando el proceso se

llevaba a cabo en modo estático (Duarte y col., 2007; Duarte y col., 2008), al explicar que la

impregnación se produce cuando el sistema se despresuriza lentamente, y vuelve a la presión

atmosférica. De esta forma, se conseguía además, una dispersión del aditivo a lo largo de la matriz

polimérica, mucho más homogénea. Teniendo en cuenta estos experimentos, el flujo de

despresurización conseguido para nuestro caso concreto, se consideró el adecuado.

Otra de las variables estudiadas fue el tiempo de contacto. A tal fin, se realizaron experimentos

durante 60 y 180 minutos. En el caso de los scaffolds de quitosano, las 3 horas de impregnación se

llevaron a cabo de forma continua, sin embrago, en el caso de las microesferas, se realizaron 3 ciclos

de impregnación de 1 hora de duración cada uno, con sus consiguientes 3 ciclos de despresurización.

3.2.2. Rendimiento del proceso de impregnación

En este trabajo se ha definido el rendimiento de la impregnación como la cantidad relativa de

lactulosa impregnada en el quitosano, expresado como la relación entre el peso de la lactulosa y el

peso del quitosano.

Puesto que se podría considerar que partimos de una matriz heterogénea en cuanto a estructura y

composición, previo al análisis por cromatografía de gases fue necesario homogenizar la muestra, así

como analizar una gran cantidad de la misma. De esta manera, los datos de la cantidad de lactulosa

obtenidos son representativos del total de muestra de quitosano impregnado.


35

En la Figura 23 se muestra un cromatograma correspondiente a la cantidad de lactulosa impregnada

en el quitosano en uno de los experimentos realizados. Se obtuvieron los picos correspondientes al

fenil-β-D-glucósido (patrón interno) y a las oximas de la lactulosa. Como puede observarse, no

existen interferencias y estos picos se cuantifican sin dificultad. Tras el análisis de la cantidad de

lactulosa presente en cada muestra, se analizó la lactulosa residual, resultando no ser en ninguno de

los casos una cantidad significativa, por lo que se concluyó que el método propuesto fue lo

suficientemente eficaz.

Figura 23. Cromatograma obtenido por GC correspondiente a la lactulosa impregnada en quitosano.

Es importante resaltar que el método de análisis de lactulosa por cromatografía de gases empleado

se utilizó para cuantificar la lactulosa impregnada en el quitosano por el mecanismo de depósito, es

decir, aquella lactulosa que no ha reaccionado y se encuentra de forma libre.

Sin embargo, de la estructura química de la lactulosa y el quitosano se puede inferir que se establecen

posibles interacciones entre el grupo carbonilo de la lactulosa y el grupo amino del polímero, para

dar lugar a la formación de bases de Schiff. Para cuantificar la lactulosa que ha reaccionado, se

podría hacer una determinación del porcentaje de grupos amino libres que tiene la muestra de

Patrón interno (fenil-β-D-glucósido)

Lactulosa


36

quitosano antes y después de la impregnación. A parte de las técnicas mencionadas anteriormente

para el cálculo del grado de desacetilación, diversos autores han utilizado a tal fin el método de la

Ninhidrina (Curotto y Aros, 1993; Prochazkova y col., 1999).

En las dos siguientes tablas (Tabla 5 y 6), se muestran los rendimientos de impregnación

conseguidos para los experimentos realizados, tanto para los scaffolds como para las microesferas de

quitosano, expresados en tanto por ciento (%). Se trata de rendimientos adecuados si consideramos

que la cantidad máxima de lactulosa que se podría impregnar no es muy elevada puesto que los

experimentos se han realizado a escala analítica en el laboratorio. El rendimiento aumentaría al

escalar el proceso a planta piloto debido a que la cantidad de lactulosa disponible con respecto a la

cantidad de quitosano que se encuentra en la celda de impregnación sería más favorable,

conduciendo a apropiadas concentraciones para su futura aplicación en la industria alimentaria.

Tabla 5. Rendimientos de impregnación y condiciones de operación, en los scaffolds de quitosano.

Tiempo



Rendimiento de impregnación (%)

60 Estático 1 0.40

180 Estático 0.6 1.45

60 Dinámico

(1.2 g/ min) 3 0.65

Tabla 6. Rendimientos de impregnación y condiciones de operación, en las microesferas de quitosano.

Tiempo



Rendimiento de impregnación (%)

60 Estático 1 0.50

60 (x 3 ciclos) Estático 1 (x 3 ciclos) 0.65

60 Dinámico

(1.2 g/ min) 3 1.90


37

En el presente trabajo se observa que, a igual tiempo de contacto (60 minutos), los experimentos

realizados en modo dinámico conducen a un mayor rendimiento de impregnación que sus

correspondientes en modo estático. Por otro lado, como sería de esperar, un aumento del tiempo de

la impregnación, se correlaciona con un aumento en el porcentaje de lactulosa impregnada en la

matriz polimérica. Según Duarte y colaboradores, la cantidad de aditivo impregnado se puede ajustar

en cierta medida hasta los valores deseados al cambiar el tiempo de contacto de la impregnación

(Duarte y col., 2009). En cuanto a los ciclos de impregnación realizados en las microesferas de

quitosano, no se observo un gran aumento en el rendimiento al triplicar el proceso. Sin embargo, si

que se observaron diferencias en cuanto al aspecto de la muestra obtenida tras el segundo y tercer

ciclo, a partir de los cuales se observo un cierto pardeamiento de algunas de las microesferas, lo que

podría indicarnos que se ha producido algún tipo de interacción. Del análisis por cromatografía de

gases de las microesferas pardeadas, se dedujo que en ellas se depositaba mucha mayor cantidad de

lactulosa que en las que no se observaba tal pardeamiento.

Por tanto, de los resultados obtenidos en este trabajo, se puede concluir que el mayor rendimiento

de impregnación se consigue trabajando en modo dinámico y con largos tiempos de contacto. Esta

diferencia con el mayor rendimiento obtenido en el proceso en modo estático en los experimentos

realizados por el grupo de investigación anteriormente mencionado, dirigido por el doctor Herminio

de Sousa, podría explicarse debido a que el mecanismo que controla el proceso de impregnación es

diferente. De acuerdo con sus resultados, el principal mecanismo de impregnación estudiado es por

interacción química (Duarte y col., 2009), sin embargo, para el caso concreto presentado en este

trabajo se ha evaluado fundamentalmente el mecanismo de impregnación por depósito.

Por otro lado, los resultados que aquí se presentan muestran que las microesferas secadas con SC-

CO2 son más adecuadas para su utilización en la tecnología de impregnación con fluidos

supercríticos, comparados con los scaffolds de quitosano secados por liofilización. En esta forma de


38

preparación del quitosano (como microesferas) y utilizando la tecnología de fluidos supercríticos

como forma de secado, los grupos amino libres del quitosano se encuentran más expuestos y con

mayor accesibilidad, siendo, por tanto, más reactivos y por ende más fácil su interacción con los

grupos carbonilo de los azúcares reductores (Zarzycki y col., 2009; Valentin y col., 2007).

3.3. CARACTERIZACIÓN DEL COMPLEJO QUITOSANO - LACTULOSA

Una vez obtenido el quitosano impregnado con lactulosa es necesaria su caracterización de modo

que nos permita establecer en un futuro, una relación entre su estructura y sus propiedades

funcionales. Por otro lado, esta caracterización, nos puede ayudar a complementar los resultados

obtenidos mediante el análisis por cromatografía de gases. Para ello, se han utilizado las técnicas de

Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier (FT-IR) y Microscopía Electrónica de

Barrido (SEM). En el caso concreto de la FT-IR, dicha caracterización se utiliza además como paso

inicial del estudio del rendimiento del proceso de impregnación por el mecanismo de interacción.


En las Figuras 24 y 25 se muestran los espectros de infrarrojo obtenidos para los scaffolds y

microesferas de quitosano impregnados con lactulosa, en comparación con los espectros resultantes

del quitosano de partida.


39

Figura 24. Comparación de los espectros de IR de los scaffolds de quitosano antes (negro) y después (verde)

del proceso de impregnación.

Figura 25. Comparación de los espectros de IR de microesferas de quitosano antes (negro) y después (verde)

del proceso de impregnación.


40

De los espectros obtenidos para las matrices de quitosano impregnadas con lactulosa se puede

deducir la formación de bases de Schiff., cuya banda de absorción característica se sitúa a un número

de onda en torno a 1630, como resultado de las posibles interacciones entre el grupo carbonilo de la

lactulosa y el grupo amino del polímero. Dicha banda será más evidente a medida que se aumente la

dosis de carga de lactulosa.

Por otra parte, el grado de desacetilación calculado a partir de la relación entre las bandas de

absorción a 1320 cm-1 y 1420 cm-1 (ecuación [1]), para el caso de los quitosanos impregnados, dio un

valor más bajo al de sus correspondientes matrices de quitosano de partida. Estos datos nos indican

que el porcentaje de los grupos amino libres presentes en la muestra ha disminuido y por tanto, se

puede estar produciendo algún tipo de reacción.


En cuanto a las micrografías obtenidas mediante Microscopia Electrónica de Barrido de las matrices

de quitosano después de la impregnación (Figura 26), no se observan diferencias significativas con

las micrografías del quitosano de partida.

Figura 26. Micrografías SEM de scaffolds y microesfereas de quitosano después de la impregnación (800x).

Por tanto, el análisis SEM realizado nos indica que la lactulosa no se deposita en la superficie de la

matriz, siendo posible que se encuentre en la mayor parte del scaffold, entre las láminas del

quitosano, o en el interior de la estructura de las microesferas.

Conclusiones y Perspectivas de Futuro

41

4. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS DE FUTURO

La conclusión más importante que se puede obtener de este trabajo de investigación es que en las

condiciones experimentales utilizadas se ha logrado la impregnación de quitosano con lactulosa. Por

tanto, los resultados presentados apoyan la potencialidad de la impregnación empleando fluidos

supercríticos y su posible uso en la industria alimentaria. De esta manera, una amplia caracterización

del quitosano a través de las diversas técnicas disponible a tal efecto, permitirá conocer de una forma

más completa la estructura y propiedades biológicas de las matrices de quitosano antes y después de

la impregnación con carbohidratos prebióticos, con el fin último de que puedan ser empleados con

éxito como ingredientes alimentarios con propiedades funcionales específicas.

Los ensayos realizados se pueden utilizar como punto de partida para abordar el estudio de la

impregnación de quitosano con otros carbohidratos prebióticos como la lactosa, la tagatosa, y la

galactosa, de los que se tienen datos de su solubilidad en los fluidos supercríticos, o bien la

impregnación de quitosano procesado de otras formas, como en membranas, películas y fibras. Para

obtener un elevado rendimiento de impregnación, se podría pensar en realizar un estudio de la

cinética de impregnación, así como el escalado del proceso del laboratorio a planta piloto.

En definitiva, mediante este novedoso proceso de impregnación se ha corroborado las posibilidades

del empleo de los fluidos supercríticos como técnica medioambientalmente limpia para obtener

compuestos con potencial actividad funcional. Sin embargo, es necesario continuar la investigación

para desarrollar un procedimiento óptimo de formación de complejos glicosilados de quitosano, los

cuales constituyen una interesante vía de investigación con un prometedor futuro para la industria

alimentaria. Como resultado de estas investigaciones, los subproductos y excedentes de la industria

pesquera se podrían convertir en un material muy valioso, que daría lugar por un lado a una fuente

de riqueza, y por otro a la eliminación de un problema ecológico.

Bibliografía

42

5. BIBLIOGRAFIA

Arai, S. (1996). Studies on functional foods in Japan - State of the art. Bioscience, Biotechnology, and

Biochemistry, 60(1), 9-15.

Baxter, A., Dillon, M., Anthony Taylor, K.D., Roberts, G.A.F. (1992). Improved method for IR

determination of the degree of N-acetylation of chitosan. International Journal of Biological

Macromolecules, 14(3), 166-169.

Braga, M.E.M., Pato, M.T.V., Silva, H., Ferreira, E.I., Gil, M.H., Duarte, C.M.M., de Sousa, H.C.

(2008). Supercritical solvent impregnation of ophthalmic drugs on chitosan derivatives. The Journal of

Supercritical Fluids, 44(2), 245-257.

Brugnerotto, J., Lizardi, J., Goycoolea, F.M., Argüelles-Monal, W., Desbrieres, J., Rinaudo, M.

(2001). An infrared investigation in relation with chitin and chitosan characterization. Polymer, 42(8),

3569-3580.

Curotto, E., Aros, F. (1993). Quantitative determination of chitosan and the percentage of free

amino groups. Analytical Biochemistry, 211(2), 240-241.

Diplock, A.T., Aggett, P.J., Ashwell, M., Bornet, F., Fern, E.B., Roberfroid, M.B. (1999). Scientific

Concepts in Functional Foods in Europe. British Journal of Nutrition, 81(1), 1-27.

Domard, A. (1987). Determination of N-acetyl content in chitosan samples by c.d. measurements.

International Journal of Biological Macromolecules, 9(6), 333-336.

Duarte, A.R.C., Mano, J.F., Reis, R.L. (2009). Preparation of chitosan scaffolds loaded with

dexamethasone for tissue engineering applications using supercritical fluid technology. European

Polymer Journal, 45(1), 141-148.

Duarte, A.R.C., Simplicio, A.L., Vega-Gonzalez, A., Subra-Paternault, P., Coimbra, P., Gil, M.H.,

de Sousa, H.C., Duarte, C.M.M. (2008). Impregnation of an intraocular lens for ophthalmic drug

delivery. Current Drug Delivery, 5(2), 102-107.

Bibliografía

43

Duarte, A.R.C., Simplicio, A.L., Vega-González, A., Subra-Paternault, P., Coimbra, P., Gil, M.H., de

Sousa, H.C., Duarte, C.M.M. (2007). Supercritical fluid impregnation of a biocompatible polymer for

ophthalmic drug delivery. The Journal of Supercritical Fluids, 42(3), 373-377.

Duarte, M.L., Ferreira, M.C., Marvao, M.R., Rocha, J. (2001). Determination of the degree of

acetylation of chitin materials by 13C CP/MAS NMR spectroscopy. International Journal of Biological

Macromolecules, 28(5), 359-363.

Goldberg, I. (1996). Functional foods: Designer foods, pharmafoods, nutraceuticals. Chapman and

Hall. Londres, Gran Bretaña.

Gong, K., Darr, J.A., Rehman, I.U. (2006). Supercritical fluid assisted impregnation of indomethacin

into chitosan thermosets for controlled release applications. International Journal of Pharmaceutics,

315(1-2), 93-98.

Kamil, J., Jeon, Y.J., Shahidi, F. (2002). Antioxidative activity of chitosans of different viscosity in

cooked comminuted flesh of herring (Clupea harengus). Food Chemistry, 79(1), 69-77.

Kasaai, M.R. (2009). Various Methods for Determination of the Degree of N-Acetylation of Chitin

and Chitosan: A Review. Journal of Agricultural and Food Chemestry, 57(5), 1667-1676.

Kasaai, M.R., Charlet, G., Paquin, P., Arul, J. (2003). Fragmentation of chitosan by

microfluidization process. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 4(4), 403-413.

Kazarian, S.G. (2000). Polymer processing with supercritical fluids. Polymer Science, 42(1), 78-101.

Kean, T., Thanou, M. (2010). Biodegradation, biodistribution and toxicity of chitosan. Advanced Drug

Delivery Reviews, 62(1), 3-11.

Kumar, R., Majeti, N.V. (2000). A review of chitin and chitosan applications. Reactive and Functional

Polymers, 46(1), 1-27.

Kurita, K. (2006). Chitin and chitosan: Functional biopolymers from marine crustaceans. Marine

Biotechnology, 8(3), 203-226.

Bibliografía

44

Luque de Castro, M.D.L., Valcárcel, M. (1993). Extracción con fluidos supercríticos en el proceso

analítico. Reverte. Barcelona, España.

Miura, T., Usami, M., Tsuura, Y., Ishida, H., Seino, Y. (1995). Hypoglycemic and hypolipidemic

effect of chitosan in normal and neonatal streptozotocin-induced diabetic mice. Biological and

Pharmaceutical Bulletin, 18(11), 1623-1625.

Montañés, F., Fornari, T., Stateva, R.P., Olano, A., Ibáñez, E. (2009). Solubility of carbohydrates in

supercritical carbon dioxide with (ethanol + water) cosolvent. The Journal of Supercritical Fluids, 49(1),

16-22.

Nguyen, S., Winnik, F.M., Buschmann, M.D. (2009). Improved reproducibility in the determination

of the molecular weight of chitosan by analytical size exclusion chromatography. Carbohydrate

Polymers, 75(3), 528-533.

Okamoto, Y., Yano, R., Miyatake, K., Tomohiro, I., Shigemasa, Y., Minami, S. (2003). Effects of

chitin and chitosan on blood coagulation. Carbohydrate Polymers, 53(3), 337-342.

Okano, K., Minagawa, T., Yang, J., Shimojoh, M., Kurita, K. (2009). Amorphous reprecipitated

chitosan as a novel morphological form. Polymer Bulletin, 62(2), 119-126.

Okuyama, K., Noguchi, K., Kanenari, M., Egawa, T., Osawa, K., Ogawa, K. (2000). Structural

diversity of chitosan and its complexes. Carbohydrate Polymers, 41(3), 237-247.

Olano, A., Corzo, N. (2009). Lactulose as a food ingredient. Journal of the Science of Food and

Agriculture, 89(12), 1987-1990.

Ormrod, D.J., Holmes, C.C., Miller, T.E. (1998). Dietary chitosan inhibits hypercholesterolaemia

and atherogenesis in the apolipoprotein E-deficient mouse model of atherosclerosis. Atherosclerosis,

138(2), 329-334.

Park, P.J., Je, J.Y., Kim, S.K. (2003). Angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory activity of

hetero-chitooligosaccharides prepared from partially different deacetylated chitosans. Journal of

Agricultural and Food Chemestry, 51(17), 4930-4934.

Bibliografía

45

Prochazkova, S., Vårum, K.M., Ostgaard, K. (1999). Quantitative determination of chitosans by

ninhydrin. Carbohydrate Polymers, 38(2), 115-122.

Qin, C., Du, Y., Xiao, L., Li, Z., Gao, X. (2002). Enzymic preparation of water-soluble chitosan and

their antitumor activity. International Journal of Biological Macromolecules, 31(1-3), 111-117.

Qin, C., Du, Y., Zong, L., Zeng, F., Liu, Y., Zhou, B. (2003). Effect of hemicellulase on the

molecular weight and structure of chitosan. Polymer Degradation and Stability, 80(3), 435-441.

Rabea, E.I., Mohamed, E.T.B., Stevens, C.V., Smagghe, G., Steurbaut, W. (2003). Chitosan as

antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules, 4(6), 1457-1465.

Rinki, K., Dutta, P.K., Hunt, A.J., Clark, J.H., Macquarrie, D.J. (2009). Preparation of chitosan

based scaffolds using supercritical carbon dioxide. Macromolecular Symposia, 277, 36-42.

Roche, H.M. (2006). Nutrigenomics-new approaches for human nutrition research. Journal of the

Science of Food and Agriculture, 86(8), 1156-1163.

Rozzi, N.L., Singh, R.K. (2002). Supercritical fluids and the food industry. Comprehensive Reviews in

Food Science and Food Safety, 1(1), 33-44.

Sanz, M.L. Sanz, J., Martinez-Castro, I. (2004). Gas chromatographic-mass spectrometric method

for the qualitative and quantitative determination of disaccharides and trisaccharides in honey.

Journal of Chromatography A, 1059(1-2), 143-148.

Schumann, C. (2002). Medical, nutritional and technological properties of lactulose. An update.

European Journal of Nutrition, 41(1), 17-25.

Shippee, R.L., Johnson, A.A., Cioffi, W.G., Lasko, J., LeVoyer, T.E., Jordan, B.S. (1992).

Simultaneous determination of lactulose and mannitol in urine of burn patients by gas-liquid

chromatography. Clinical Chemistry, 38(3), 343-345.

Sloan, A.E. (1999). The new market: foods for the not-so-healthy. Food Technology, 53(2), 54-60.

Bibliografía

46

Soria, A.C., Corzo-Martínez, M., Montilla, A., Riera, E., Gamboa-Santos, J., Villamiel, M. (2010).

Chemical and physicochemical quality parameters in carrots dehydrated by power ultrasound. Journal

of Agricultural and Food Chemistry, (en prensa).

Speiciene, V., Guilmineau, F., Kulozik, U., Leskauskaite, D. (2007). The effect of chitosan on the

properties of emulsions stabilized by whey proteins. Food Chemistry, 102(4), 1048-1054.

Tan, S.C., Khor, E., Tan, T.K., Wong, S.M. (1998). The degree of deacetylation of chitosan:

advocating the first derivative UV-spectrophotometry method of determination. Talanta, 45(4), 713-

719.

Tsaih, M.L., Chen, R.H. (2003). The effect of reaction time and temperature during heterogenous

alkali deacetylation on degree of deacetylation and molecular weight of resulting chitosan. Journal of

Applied Polymer Science, 88(13), 2917-2923.

Valentin, R., Bonelli, B., Garrone, E., Di Renzo, F., Quignard, F. (2007). Accessibility of the

functional groups of chitosan aerogel probed by FT-IR-monitored deuteration. Biomacromolecules,

8(11), 3646-3650.

Valentin, R., Molvinger, K., Quignard, F., Brunel, D. (2003). Supercritical CO2 dried chitosan: an

efficient intrinsic heterogeneous catalyst in fine chemistry. New Journal of Chemistry, 27(12), 1690-

1692.

Yalpani, M. (1993). Supercritical fluids: puissant media for the modification of polymers and

biopolymers. Polymer, 34(5), 1102-1105.

Zarzycki, R., Modrzejewska, Z., Dorabialska, M., Rogacki, G., Wojtasz-Pajak, A. (2009). Properties

of chitosan microgranules formed by supercritical fluid processing. Drying Technology, 27(12), 1370-

1378.

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