Consideraciones Prácticas en LC/MS y...

Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló

Isidro MasanaQuímico de Aplicaciones6 de Noviembre, 2003

Consideraciones Prácticas en LC/MS y CE/MS

Horario: 15.00 - 16.00 p.m. CETTeléfono: (+34) 902 011.818Coordinador: Dr. Carlos Barceló

Puede descargarse una copia de la presentación de la dirección:http://webshop.chem.agilent.com/iccdocs/pubDocument.shtml





Comienza en Cinco Minutos

Marque éste nº. El sonido sólo se puede

recibir via telefónica






Comienza en Un Minuto

Marque éste nº. El sonido sólo se puede

recibir via telefónica



1.- Introdución Técnicas de Ionización a Presión Atmosférica Utilizadas en LC/MS y CE/MS

2.- Consideraciones en la Selección de Eluyentes y Tampones para LC/MS y CE/MS

3.- Características del Espectro de Masas por Ionización a Presión Atmosférica (ESI/APCI/APPI):


Consideraciones Prácticas en LCMS y CE/MS

1.- Introducción Técnicas de Ionización a Presión Atmosférica Utilizadas en

Las distintas fuentes de ionización son intercambiables entre los Agilent-1100 LC/MS y CE/MS con Cuadrupolo y Trampa de Iones

LC/MS y CE/MS• API-Electrospray• APCI• APPI• Electrospray CE/MS• MALDI (fuente “off-line”)

Muy Rápido Intercambio de Fuentes:


Aplicabilidad Relativa de las Técnicasde Ionización en LC/MS

API-Electrospray (LC y CE):• La técnica de ionización más suave.• Ideal también para compuestos lábiles.• Interfase con mayor sensibilidad y aplicabilidad.• Válida para compuestos de baja-media a muy

alta polaridad que se puedan ionizar en solución.• Mediante la formación de iones con múltiples

cargas, permite el análisis de compuestos de muy elevado peso molecular.

APCI (LC):• Válida para compuestos de baja a alta polaridad;

no se requiere que estén ionizados en solución.• Requiere compuestos con una cierta volatilidad.• Buena sensibilidad para compuestos de polaridad

y peso molecular intermedios.• Técnica que complementa a API - Electrospray

para el análisis de analitos poco polares.APPI (LC y CE):• Válida para compuestos de muy baja a alta polaridad;

no requiere que estén ionizados en solución.• Requiere compuestos con una cierta volatilidad.• Posibilita el análisis de compuestos apolares.

Las interfases LC/MS tipo A.P.I.: Electrospray /APCI

son hoy en día las más utilizadas

Peso

Mol

ecul

ar

Polaridad del analito/Solubilidad en Agua

API-Electrospray

ParticleBeam

APCI1000

100,000

10,000

Thermospray

no polar muy polar

GC/MS

FAB

APPI


Diseño Ortogonal de la Fuente de Iones API - Electrospray

EvaporaciónLímite

RayleigAlcanzado

ExplosiónCoulomb Iónes Analito

DesolvatadoEvaporación

+

-

++

-

++

+ ++ +

++

+++

-- -

- -- ++ +

+

+ +++

+++

-- -- --

+

++

+

+ +++

++

+-- -

- --

+

+ +++

+++

-- ---

++++

++

----

+ +++

++ ----

++

++

+

+--

-

-

+++ +

+

+---

-

++++++ -- --

++++++- --

+++

+ + +++

+++

-- -

- -- ++++++

++

+++- -- -- +

++++ +

++

+++

-- -- --

+

+

++

++ ----

+

Iones Desolvatados

+

Gas de secado(nitrógeno calentado)

Entrada Capilar Dieléctrico

Disolvente Nebulizado

Gas de Nebulización (N2)

-4.500 V (End Plate)

en un angulo de 90º con La punta del nebulizador está

respecto a la entrada del

NEBULIZADOR ORTOGONAL

capilar

+++ +

++

+ + + + + + + + + + + + + + +

HPLC

p.e. Vcap: -5,000 V (típico -1500 -6000)

0 V (nebulizador conectado a tierra)muy conveniente para CE/MS

Mesh Assembly: -3500 V(atraerá cargas + a la superficiede la gota)

Ejemplo con Polaridad +

Iones en solución

N2

SECADO

La presencia de sales no volátiles dificultara considerablemente la eficiciencia del proceso de desolvatación

+

+

+

+

+

+

++

+

+


Proceso APCI (Ionización Química)

Vapor

Formación del gas reactivo cargado

El disolvente vaporizado se ioniza mediante descargas eléctricas producidas por el electrodo/aguja de descarga

Aerosol con el analito

Iones de Analito

Transferencia de carga al analito según su afinidad

protónica para captar ó ceder un protón al gas reactivo (o su afinidad

electronónica)

+

++

+

+

+ +++

+ ++

++

++

++

+

+++

+

++ + +

+

Evaporación

Capilar

EntradaHPLC Nebulizador

Vaporizador(calentador)

Gas de Secado

+ + + ++ +

+

AgujaCorona

fasegasMeOH + e- [MeOH]+ + 2 e-- [MeOH]+ + MeOH [MeOH2]+ + MeO-fase

gas

fasegas

AcN + e- [AcN]+ + 2 e-- [AcN]+ + H2O [AcN-H]+ + OH-gasfase

fasegas

H2O + e- [H2O]+ + 2 e-- [H2O]+ + H2O [H3O]+ + OH-fasegas

[Solv+H]+ + A --> Solv + [A+H]+Proceso APCI +El analito CAPTA

protones del disolventeEmpleados en APCI -

Empleados en APCI +[Solv+H]+

APCI

Entre otros mecanismos:

N2 + e- N2+ + 2 e- N2

+ + Solv [Solv.+H ]+ + N2fasegas

fasegas


Proceso APPI (Fotoionización)

Capilar MS

Capilar

EntradaHPLC

Nebulizador

Vaporizador(calentador)

hv

Gas deSecado

+ + + ++ +

+

LámparaKripton

Evaporación

Vapor

Se fotoioniza a un Agente Dopante yéste actúa como gas reactivo

Aerosol que contiene al analito

Iones de Analito+

+

++

+

+ +++

+ +

+

++

++

+

++

++

+

+

Fotones ionizan al

analito (con P.I.<10eV) +

+ ++

+

+

++

+

+

hv

hv

APPI


CE/MS Diseño exclusivo Agilent de la Fuente de Iones API - Electrospray

+++

+ + +++

+++

-- -- -- ++++++

+++

++

-- -- --

+++++++++

++-- -- --

++

+++ ++++++

-- -- -- +

+++

++

----

+++

++

+----

+

++++

+ ----

+

+++--

++

--

+++ +++-

++

EvaporaciónLímite

RayleigAlcanzado

ExplosiónCoulomb Ión AnalitoEvaporación

++ ++--

+

++++ + +

++

+++

-- -- -- ++++++

+++

++

-- -- -- ++++++

+++

++-- -- --

+++

++

+ ----

• Mediante un simple intercambio de nebulizador se conmuta entre LC/MS y CE/MS

• Diseño “Nebulizador Triconcéntrico” con “Cámara de flujo co-axial ”.

• Aguja del Spray conectada a tierra.• Se requiere una bomba para

adicionar el “Liquid Shield”.• El “Liquid Shield” proporciona el

contacto eléctrico para la CE.

Punta del Nebulizador

+++

+++

++++

++

gas de nebulización

+

+

++

+++

+

++ +++++ +

+

+

++

++

+

+

+

++ ++ +

+

+ ++

+

++

++

+ ++

+

+++

+

+

+

+

+

+++++++

CAPILAR ++ + ++ ++

+

Gas de secado(nitrógeno calentado)

Entrada CapilarDieléctrico

DisolventeNebulizado

Gas deNebulización (N 2 )

Iones Electrospray

-5,000 Ven un ángulo de 90º conLa punta del nebulizador está

respecto a la entrada del

NEBULIZADORORTOGONAL

capilar

+++ +

++

+ + + + + + + + + + + + + + +

“Liquid Shield”

“Liquid Shield”

N2

N2


Ejemplos de Aplicación de la Técnica LC/MSAPI-Electrospray:

SulfonilureasHidratos de CarbonoLSDBenzodiazepinasMorfinasPesticidasPigmentosMicotoxinasPéptidos y proteinasFármacosSalbutamolPenicilinaAminas AromáticasAntidepresivosEsteroides y corticoesteroidesAntocianinas

APCI:CarbamatosHerbicidas: FenilureaPesticidasTriglicéridosAditivos en pláticosExplosivosMicotoxinasFármacosAntioxidantesAzúcaresÁcido SuccínicoCompuestos FenólicosAldehídos / Cetonas*a

Amidas *b

Recordatorio: LC/MS-API no puede detectar analitos que no se ionicen !!

*a APCI: Los compuestos carbonílicos en ocasiones pueden llegar a protonarse. *b APCI: Las amidas e hidroxilos aromáticos perder un protón.


Criterios Selección Técnica IonizaciónELECTROSPRAY:• Compuestos iónicos, o polímeros/biopolímeros que en disolución

adquieren múltiples cargas (péptidos – proteínas - ...).• Compuestos termolábiles con grupos funcionales ionizables en

disolución, o de los que se pueden obtener sus sales sódicas (ESI-) o sus clorhidratos (ESI+)

• Técnicas que requieran trabajar a nano o microflujosAPCI / APPI:• Compuestos NO termolábiles de media-baja polaridad y que contengan

algún heteroátomo. Moléculas sin grupos funcionales ionizables.• Preferencia por trabajar con fases móviles NO tamponadas • “Necesidad” de trabajar con fases fuertemente tamponadas por

necesidades cromatográficas. (APCI/APPI toleran mayores concentraciones de tampón)

APPI:• Compuestos apolares NO termolábiles y sin heteroátomos

En buena parte de los casos se podrán utilizar las 3 técnicas



2.- Consideraciones en la Selecciónde Eluyentes y Tampones paraLC/MS y CE/MS

• pH• Concentración y Volatilidad del tampón

• Tampones y Disolventes Típicos en LC/MS y CE/MS• Supresión de la Ionización por formación par iónico fuerte• Iones típicos de “Background”• Adaptación de un método de HPLC a LC/MS• ...................

Influencia de:

Consideraciones Varias:


Consideraciones Electrospray “versus” APCIElectrospray:1.- La sensibilidad depende de la

concentración de analito; por ello admite flujos muy bajos (microbore /CE).

2.- El pH de la fase móvil es crítico. Con gradientes habrá que controlar pH en todos los canales (acidular/basificar también fases orgánicas).

3.- El solvente orgánico de la fase móvil apenas afecta a la ionización.

4.- [Tampón volátil] < 25mM**Concentraciones elevadas pueden dificultar la evaporación/ionización por formación de par iónico

5.- [Tampón no volátil]* <5-10mM*tampón no volátil dificulta la desolvatación/ionización (el fosfato la dificulta menos con polaridad negativa, pero ensucia más el detector).

6.- Fácilmente forma aductos con Na y K- Basta una concentración 25-100µM para una buena

formación de aductos.- Los aductos con NH4 son menos estables.- La formación de aductos dificulta la Fragmentación

APCI (/APPI):1.- La sensibilidad depende de la

CANTIDAD de analito; por ello no convienen flujos muy bajos

2.- El pH de la fase móvil NO es crítico. No requiere del empleo de tampones

3.- El solvente orgánico de la fase móvil afecta mucho a la ionización.Metanol o Acetona (y aún más el agua) mejor que Acetonitrilo

4.- [Tampón volátil] < 100mM

5.- [Tampón no volátil] <5-10mM6.- No forma aductos con Na y K. Si los

puede formar con NH47.- En modo APCI Negativo, se puede

mejorar la sensibilidad mediante la adición al eluyente de 0.5-1% de compuestos clorados* (o el empleo de un 1-2% de oxígeno en el gas de secado/ nebulizado).* Según analito se puede formar el (M+X)- o el (M-H)- .


Influencia del pH en LC/MS con Electrospray

• Para Óptima Sensibilidad con Electrospray trabajar:pH (básico) > pK + 1 (2) para Ácidos en modo negativopH (ácido) < pK - 1 (2) para Bases en modo positivo

• Para una buena repetibilidad de la respuesta obtenida en Electrospray y de lostiempos de retención será especialmente importante un buen control del pH de la fase móvil, cuando éste sea próximo al pKa (+/-1 (2)) de alguno de los analitos, dada la gran variabilidad en su grado de ionización en esta zona

pH Comp. Básicos Comp. ÁcidospH=pK+2 (pH básico) 1% ionización

10% ionización50% ionización90% ionización99% ionización

99% ionizaciónpH=pK+1 90% ionizaciónpH=pK 50% ionizaciónpH=pK-1 10% ionizaciónpH=pK-2 (pH ácido) 1% ionización

Modo Ión Positivo

H - N R + A+

2

3R

R 1-

AnalitoIonizado

ÁcidoBase

:N R2 + HA

R1

R3

(Analito NOIonizado)

Modo ión NegativoO

BaseÁcidoR C O + H:BO

+-R C OH + :BpH Ácido

pH Básico

(Analito NO Ionizado)

Analito Ionizado

pH Ácido

pH Básico

x100 x100


Influencia del pH en la Detección de Iones Negativos mediante Electrospray (ESI)

R C OH + :B

100

Compound Class

b-Lactams Aminoglycosides Ivermeitin Tetracyclines Sulfamides

Rel

ativ

eR

espo

nse

pH 7

pH 10

pH 3

1 .5 1.2 1.1 .90

50

pH3 7 10

• Para iones Negativos trabajar a pH básico : pH> pk+1 ó 2 (análisis de ácidos)

pH3 7 10

pH3 7 10

pKa aprox. 5 pKa aprox. 7 pKa aprox.7.5

Modo ión NegativoO

BaseR C O + H:BO

+-Analito

IonizadoÁcido

(Analito NO Ionizado)

pH Ácido

pH Básico


Comparación entre Tampón Volátil y NO Volátil (ambos a pH 4.6)

Condiciones MS:Ionización: ESIModo: PositivoRango Masa: 100 –200 (m/z )Volt. Capilar: 3.5kV Volt. Fragm.: 100V“Gas secado”: N2 (12.0L/min 350ºC)“Gas Nebulizacióm”: N2 (50psi)

2) 5mM KH2PO4 pH 4.6

1) 5mM AcONH4 pH 4.6

Condiciones HPLC:Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C18

2.1 x 150 mm, 5µmEluyente: 1) 5mM AcONH4 (pH 4.6)/MeOH=80:20

2) 5mM KH2PO4 (pH 4.6)/MeOH=80:20Flujo: 0.2mL/minTemp: 40ºC Volumen iny.: 5µL sol. 10ppm

Los tampones no volátiles dificultan considerablemente el proceso de desolvatación y producen una muy importante pérdida de sensibilidad y robustez del método de LC/MS


Comparación entre Tampón Volátil y NO Volátil (fosfato a pH 2.5)

Condiciones HPLC:Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C18

2.1 x 150 mm, 5µmEluyente: 1) 5mM AcONH4 (pH 4.6)/MeOH=80:20

2) 5mM KH2PO4 (pH 2.5)/MeOH=80:20Flujo: 0.2mL/minTemp: 40ºC Volumen iny.: 5µL sol. 10ppm

Condiciones MS:Ionización: ESIModo: PositivoRango Masa: 100 –200 (m/z )Volt. Capilar: 3.5kV Volt. Fragm.: 100V“Gas secado”: N2 (12.0L/min 350ºC)“Gas Nebulizacióm”: N2 (50psi)

2) 5mM KH2PO4 pH 2.5

1) 5mM AcONH4 pH 4.6

* En este ejemplo se observa que al reducir el pH del tampón fosfato de 4.6 a 2.5 se mejora algo la respuesta


Ejemplo de Mejora Sensibilidad en APCINegativo por Adición Solvente Clorado* a la Fase Móvil

m/z150 200 250 300 350 400

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

Abundance 395.

337

7.3

365.

3

335.

3

421.

3

[M+Cl]-

m/z150 200 250 300 350 400

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

Abundance

O

O

OH

OHHO

Con CH2Cl2 Sin Clorado

O

O

OH

OHHO

* Adiciones típicas: 0.5-1% de solvente

clorado

m/z150 200 250 300 350 400 m/z150 200 250 300 350 400

La Prednisolone en APCI(-) en presencia de CH2Cl2*, proporciona un intenso ión [M+Cl]-.


Consideraciones Prácticas en Electrospray "versus" APCI

• Sensibilidad• Si una muestra puede ser ionizada por ambas técnicas, Electrosprayes normalmente más sensible y da menos ruido de fondo.

• Efectos de la matriz y la fase móvil.• Electrospray es más sensible que APCI al tipo de matriz de la muestra y a la supresión de ionización por exceso de sales en el disolvente.• Electrospray requiere una menor concentración de tamponesvolátiles con respecto a APCI.• La elección del disolvente orgánico afecta fuertemente a la ionización en APCI: el metanol suele dar mejor resultado que el acetonitrilo.

• Flujos de fase móvil• Electrospray también trabaja adecuadamente a flujos bajos (<100 µl/min) y puede ser utilizada en CE/MS mientras que APCI no.• APCI es más sensible y tiene menos ruido que el Electrospray a flujos altos ( >750µl/min).• APPI mediante fotoionización directa puede proporcionar también buena sensibilidad a flujos bajos y utilizarse en CE/MS.


Disolventes Compatibles con LC/MSAdecuados para ES y APCI

MetanolEtanolPropanolIsopropanolButanolAcetonitriloAguaDMF(1)

DMSO(1)

Ácido Acético Ácido FórmicoAcetonaCH2Cl2CHCl3

Adecuados sólo en APCIToluenoBencenoHidrocarburos (p.e., Hexano)EstireneCCl4CS2Hidrocarburos Ciclicos (p.e., Ciclohexano)

(1) A bajos porcentajes (<10%) en ES


Descanso - Sesiónde PreguntasNúmero 1

Para preguntar en directo,

Marque 1 en su teléfono

o use la “Chat Box”

“Chat” Público

“Chat” Privado X( sólo lo reciben los moderadores)

Enviar mensaje

Texto Pregunta/Mensaje


Tampones Típicos para API-ES y APCIModo ión positivo (uso pH < 7.0; <5 preferido)

• Ácido acético (rango pH 3.8-5.8)• Ácido fórmico (rango pH 2.8-4.8)• (Ácido trifluoroacético (TFA) (rango pH 1.5-2.5))

(no recomendable – usar mínima concentración posible de TFA)

Modo ión negativo (pH > 7.0; 9 preferido)• Hidróxido amónico (rango pH 8.2-10.2) (o formiato/ acetato amónico)• Trietilamina (TEA) (rango pH 10.0-12.0) • Dietilamina (DEA) (rango pH 9.5-11.5) • Piperidina (rango pH 10.1-12.1)

Consideraciones Varias:• La adición post-columna de ácido o base permite ajustar el pH si el proceso cromatográfico necesita otro de diferente.

• Los tensoactivos pueden interferir en la evaporación. Los reactivos de par iónico suelen producir un elevado background, si se requieren utilizarlos volátiles como tributilamina (TBA) o ácido heptaflurobutírico (HFBA). La formación de un par iónico fuerte puede suprimir la ionización del analito.

MSD

Bomba

Eluyente

Mta

Columna

Inyector

BombaAuxiliar

AdiciónPost-columna

ConexiónT


Supresión de la señal al usar TFAModo FIA con CH3-COOH vs. TFA

1.0% CH3-COOH

min

Abundance

10.00 12.00 14.00 16.002.00 4.00 6.00 8.00

50000100000150000200000250000

0.2% TFA

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00

50000100000150000200000250000

min

Abundance

[M+H]+ + [CF3COO]- => [M+H CF3COO] +

La formación de un “fuerte par iónico” suprime la ionización

Convendrá utilizar la mínima cantidad posible de TFA !!!, o.......


Aumento de la Señal mediante AdiciónPost-Columna cuando se utiliza TFA

1.00 2.00 3.00 4.00 min

Abundance

CON "TFA-Fix"Incremento Señal 30x !!

1.00 2.00 3.00 4.00min

40000

80000

120000

160000

200000

240000

280000

320000

Abundance

40000

80000

120000

160000

200000

240000

280000

320000SIN "TFA-Fix"

Condiciones: 100% agua0.2% TFA

Flujo: 200 µl/min

1(LC):2 Adición post-columna de 75/25 ácido propiónico/ isopropanol El propiónico desplaza al TFA del par iónico, formando un par iónico más débil que se “deshace” en la fuente de iones del MS. Evitándose así la “supresión iónica” producida por el “fuerte par iónico” que forma el TFA.


Iones más Típicos como ”Background"Iones Modo Procedencia

64 ES + Acetonitrilo + Na102 ES + Trietilamina (se absorbe en teflón y plástico del HPLC)

113 ES - TFA116 ES + ó - Contenedor de calibrante145,147 ES + Acetonitrilo + Cu (proviene del acero del sistema)

149, 391, 419, 413 ES + ó - Ftalatos (contenedores de dtes., N2, filtro de gases...)

331 ES + Polietilén propilenoES - Sellos de las válv.CDS

Para evitar contaminaciones “persistentes” de aditivos utilizados anteriormente, se recomienda reservar un canal (y material de vidrio: botellas – matraces-…) para utilizar con aditivos “problemáticos“ (TEA / aminas / TFA / … ) que queden adsorbidos


Tampones Típicos para CE/MSTampones

• Ácido acético• Ácido fórmico• Acetato amónico• Formiato amónico• Tampones diluidos

de CE

• Metanol/H2O o Isopropanol/H2O(40 - 70 % orgánico)

• a pH ácido en modo positivo (ácido acético o fórmico al 0.1 - 1 % )

• a pH básico en modo negativo (acetato amónico o amoniaco 1-5 mM)

Soluciones “Liquid Shield”

Se recomienda la utilización de tampones no volátiles dado que éstos no interfieren en el proceso de ES.

Con detección DAD+MS si la ventana del detector queda más próxima a la entrada del capilar que a la salida, se recomienda trabajar a no más de 15-20Kv para evitar que un potencial excesivo en la ventana de detección UV (zona sin recubrimiento de poliamida) facilite “fugas” de corriente y fisure el capilar.


Adaptación de un Método HPLC a LC/MSELECTROSPRAY

• Sustitución de tampones no volátiles por tampones volátiles• La concentración de tampón volátil deberá ser < 10 mM• Si ha de emplearse tampón no volátil, usar uno donde la parte aniónica o catiónica sea volátil (y a la menor concentración posible)

Fosfato amónico en lugar de fosfato sódico ó potásico• Mejor si la porción no volátil del tampón es ionizable en el modo usado

Fosfato (H2PO4- ) en modo negativo

APCI• Debe emplearse tampón volátil• La concentración de tampón volátil deberá ser < 100 mM• Al no requerir APCI el uso de tampones para controlar la ionización del analito bastantes métodos pueden transferirse directamente


Selección de Fases Estacionarias según el pH de Fases Móviles Típicas en LC/MS

+++xxxx

Hidróxido AmónicopKa = 9.2

Típicas Fases Móviles en LC/MS

+++++++++Bonus-RP

++++++Extend-C18

++++++++Eclipse XDB

++++++Rx-C18

+++++++++StableBond

Acetato*pKa = 4.8

Formiato*pKa = 3.8

TFAÁcido fuerte

pKa< 2

Fases Estacionarias(Zorbax)

+++

* Usado como ácidos fórmico ó acético o como sus respectivas sales amónicas

+++ : Opción óptima ++ : Opción adecuada x : Opción inadecuada


Fuentes y Nebulizadores a Utilizar enLC/MS y CE/MS

µ

Nano-Electrospray

Ortogonal

Nano LC 100 µm75 µm50 µm

500 nl/min250 nl/min100 nl/min

Micro LC 1 mm800 µm

40 µl/min20 µl/min

LC Capilar 300 µm180 µm

4 µl/min2 µl/min

LC Estándar 4.6 mm2.1 mm

1000 µl/min200 µl/min

AplicaciónFlujotípicoD.I. Columna

Ganancia Teórica en Sensibilidad

~ 1~ 5

~ 20~ 30

~ 200~ 600

~ 2000~ 3500~ 8500

Elec

tros

pray

Neb

uliz

ador

Sta

ndar

dM

icro

-N

ebul

izad

or

Electroforesis Capilar (CE/MS): Electrospray + nebulizador CE (triconcéntrico)

• En Nano / Cap - LC se pueden inyectar volúmenes “muy grandes” (p.e. 8 µl en nano-LC) mediante configuraciones multi-válvulas.• La Nano-LC interesa cuando se dispone de muy poca de muestra y/o se requiere máxima sensibilidad (p.e. en Proteómica).

x10

x200

Muy utilizadas en ESI



3.- Características del Espectro de Masas por Ionización a Presión Atmosférica (ESI/APCI/APPI)

• Características Generales del Espectro de LC/MS• La Formación de Aductos y Dímeros• Características de Espectros de Iones con Múltiples Cargas

El Espectro de Masas en LC/MS:


Características Típicas del Espectro en LC/MSH2N S NH

O

O S

NN

CH3

m/z100 150 200 2500

20

40

60

80

100API-ES, Pos, Scan, Frag: 75, "Pos scan"

Max: 120.223271.

0

156.

1

272.

0

293.

0

157.

1

m/z100 150 200 2500

10

20

30

40

50

60 API-ES, Neg, Scan, Frag: 100, "Neg scan" Max: 73.200269.

1

196.

1

270.

0

197.

1

M+H

M+Na

M-HPolaridad Positiva : M+1

Modo iones PositivosH N R + A

Muestra

+2

3R

R 1-

Modo iones Negativos

Polaridad Negativa : M-1

R C O + H:BR C OH + :BO

BaseÁcido Muestra

O+-

Base Ácido

:N R2 + HAR3

R1Distinta

Fragmentación entre + / –

ESI+

ESI-

• Suele presentar poca fragmentación• El pico base suele ser el ión “quasi molecular”• El espectro y proporción entre iones es instrumento-dependiente >> Las bibliotecas se las debe crear el propio usuario

Utilizar en los cálculos Pesos mono-Isotópicos (no los moleculares)Ejemplo Cl = 35 (ó 37 para cálculos isotópicos - no 35.45)


Calculadora Pesos Moleculares mono-Isotópicos (Software Deconvolución LC/MS con cuadrupolo)

En MS hay que utilizar “Pesos Moleculares Mono-Isotópicos” calculados a partir de la masa el isótopo más abundante (no el que viene en los catálogos/frascos de reactivo)

4) Copiar directamente

en la tabla SIM

2.- Seleccionar el aducto de la lista o teclearlo (número o fórmula)

1.- Teclear Fórmula Molecular

(p.e. CH3-COOH )también C2H4O2

3) Calcular la masa (m/z)

Es sensible a mayúsculas/ minúsculas

Un error en el cálculo de PMevitaría la detección del analito

cuando se trabaja en SIM

Teclear ShowMW en la línea de comandos

Alternativa – teclear directamente p.e.: PRINT MW ("CH2Cl2") (Es sensible a mayúsculas/ minúsculas)


Ejemplos Espectros LC/MS (AP-ESI / APCI)

M+3 = 1/3 (M+1) >> Existencia de 1 Cl

Ión con doble carga

• Representaciones en forma “diagrama barras”• Representación espectro “completo”

Siduron

VENTAJAS MÍNIMA FRAGMENTACIÓN DEL ESPECTRO LC/MS:

• Mayor Selectividad

• Mayor Sensibilidad

INCONVENIENTES:

• Menor información estructural*

* En LC/MS aumentando suficientemente el Voltaje del Fragmentador (voltaje a la salida del capilar) se puede aumentar la fragmentación en los espectros para obtener mayor información estructural, aunque la mejor alternativa es la utilización de sistemas de LC/MSn

• Los espectros en LC/MS suelen presentar poca fragmentación

• Las proporciones de los iones a A, A+2, A+4,... Permite reconocer la presencia de ciertos elementos


Br2 Cl2

Br3 ClBr2 Cl2

Cl4Br4 Si4 S4 BrCl3

Br Cl

Cl3Br3 Si3

Si2

Si S

S2

S3

BrCl

33%

65%

11%

5%3%

10%7%0.4

98%

77%

49%

11%1%

3%

32%

98%

15%11%

1%

20%15%

2%1% 3%22%

2%

2%13%

51%65%

18%

2%

38%

89%

32%

4%

2%9%

1%4.4%

77%

24%

26%

85%

49%

8%

98%

51% 49%

34% 32%

17%

68%65%

16%

A+X: +0 +2 +4 +6 +8

M = impar

nº impar de N

M = par

no existe N o existe un nº par de N

nº C ~ %(A+1)* / 1.11

Contribución C13

* %(A+1) = % de abundancia de la señal correspondiente al C13 (A+1)

con respecto a la del C12 (A). A+X: +0 +2 +4

+1 +3A+X:+0 +2 +4

+1 +3

Pérfiles y Proporciones Isótopos (A+2 )

A+X: +0 +2 +4 +6 +8A+X: +0 +2 +4 +6 +8 10x C -> A+1= 11.1% de A


Formación de Aductos en LC/MS• Na+, K+, NH4+, pueden competir con los H+ en la ionización del analito. • En Electrospray +: en presencia pequeñas concentraciones*a de sales Na+ (K+ / NH4

+) se observan muy habitualmente los aductos M+23 (M+39 / M+18). Estos NO se observan en polaridad negativa. En caso de duda (p.e. análisis de trazas) la adición de Na+ y K+ puede ayudar a confirmar el M. Incluso en algunas ocasiones pueden facilitar su ionización: algunas moléculas neutras con tendencia a formar puentes de hidrógeno (p.e. Mentol y carbohidratos) se pueden conseguir ionizar mediante la formación de aductos con NH4+ y metales alcalinos (probar AcNH4 o AcNa como tampón).

• En APCI+: Se pueden formar aductos con NH4+, pero NO con Na+ o K+.

• En APCI-: se pueden formar en ocasiones aductos con compuestos halogenados si el eluyente contiene algún disolvente halogenado (basta un pequeño porcentaje).• En modo Negativo (ESI y APCI) puede adicionarse un anión procedente del eluyente: M + A- => [M+A]-

A-: Carboxilato (AcO-, HCOO-, TFA-), Haluro (Cl-,I-,,...)• En instrumentos que no desolvaten perfectamente al analito se puede observar la formación de aductos con disolvente. (p.e. acetonitrilo - por formación puentes hidrógeno) (no con LC/MSD serie 1100 Agilent) .

*a Bastan niveles µM de Na, K o NH4 para poder obtener aductos.

Aducto con NH4+

APCI+

NH4 presente en eluyente

300 400 500 600 700 800 900 1000

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000

m/z-->

Abundancia

603639

903

987

<- [M+NH4+ ]

Trioleina (C18:1,[cis]-9) M 884.781 C57H104O6


Ejemplos Formación Aductos LC/MS:Espectros Aflatoxinas (ESI+) y Saponina (ESI-)

ADUCTO ESI- con TFA-ADUCTOS ESI+ con Na+

• Muestra analizada por ESI(-) mediante infusión de una disolución que contiene TFA (ácido trifluoroacético)

Aductos por la presencia de Na+ en eluyentePérdidas agua (-18)

120 160 200 240 280 320

285

Aflatoxina B1

335

313[M+H]+

O

OCH3OO

O

O50

90

[M+Na]+

120 160 200 240 280 320 360

50

90

329[M+H]+

243 283

Aflatoxina G1

351

311[M-OH]+

OO

O O

O O

OCH3[M+Na]+

331[M+H]+

120 160 200 240 280 320 360

50

90 Aflatoxina G2

353[M+Na]+

313[M-OH]+

OO

O OO O

OCH3

-18+22

120 160 200 240 280 320

50

90

287

Aflatoxina B2

O

OCH3OO

O

O

315

337[M+Na]+

[M+H]+

MS/MS con Trampa IonesMS2 (1363)

m/z20

60

100

-TFAH (-114)

1363

1249

1087

250 500 750 1000 1250

-Glc

(M + TFA)--

(M + TFA)--

(M -1)--

MS

20

60

100 1363COO-Glc

Rha Glc GlcGlc

O

(M-H)-

Saponina ESI(-)M=1250

M (CF3-COOH) = 114


Ejemplo de Detección de Dímeros con Electrospray

• Algunas moléculas pueden agregarse en solución dando nM+H+ (pueden provenir de la disolución inyectada o formarse en la fuente cuando el analito está a elevadas concentraciones).• La mayor energía del proceso de ionización por APCI suele disgregar/evitar la formación de agregaciones en la fuente

DIMEROS Siduron

Siduron

APCI

ESI

• La mayor suavidad del proceso de ionización

por ESI facilita la detección de agregados


Espectros de Iones con Múltiples Cargas

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

12000

10000

8000

6000

40002000

Abun

dan c

eAb

u nda

nce

18000160001400012000100008000600040002000

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

800

600

400

200

Abun

d anc

e

pH 2.5

pH 6

pH 12

Ejemplo de Iones + con Múltiples cargas

+14

+13

+12

+11

+10+9+15

+14

+13

+12+11

+10

+9

+15+8

m/z: (14.306+11)/11= 1302

• Moléculas de gran tamaño, p.e. péptidos y proteínas, suelen proporcionar en ESI iones con Múltiples Cargas respuesta a múltiples relaciones m/z (masa/carga)

• Con moléculas amfotéricas (moléculas con grupos ácidos y básicos - p.e. Péptidos y Proteínas) si pH = pI (pto. Isoeléctrico) => molécula globalmente será neutra:

• El perfil del espectro de iones con múltiples cargas variará en función del pH de la fase móvil.

+

+

+

+-

-

-

-

pH < pI pH = pI pH > pICarga: positiva neutra negativa

Espectro MS (ESI+) de LISOZIMA proteína M=14.306


Reconocimiento de Iones con Múltiples Cargas

m/z

[M+2H]2+

644 646 648 650 652 654

20

40

60

80

100 648.92

649.40

649.89

∆=0.48

Iones con 2 cargas: ∆m/z = 0.5

Con Trampa Iones∆=0.48

790 795 800 805 810 815 8200.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 807.00

807.50

807.92

808.60

m/z

Intens.x106

Con Cuadrupolo

[M+2H]2+

∆=0.50

∆=0.42

Iones con 2 cargas: ∆m/z =0.5

• Los sistemas con Trampa de Iones proporcionan mayor resolución y selectividad espectral que los sistemas con cuadrupolo

100

1294 1296 1298 1300 1302 1304

20

40

60

80

1297.29

1298.28

1299.26

[M+H]+

m/z

∆=0.99

% A

bund

anci

a R

elat

iva

∆=0.98

Iones con 1 carga: ∆m/z = 1.0• En Iones con 1 sola carga la diferencia entre las señales correspondientes a C12 y C13 es de ∆m/z = 1.• En iones con múltiples cargas la diferencias serán:

∆m/z = 1 /z (nº cargas) • Por consiguiente:

∆m/z = 1.0 1 carga ∆m/z = 0.5 2 cargas∆m/z = 0.33 3 cargas ∆m/z = 0.25 4 cargas

• Para reconocimiento del nº de cargas se recomienda guardar el espectro de masas en modo completo

Con Trampa Iones

TRAP: Angiotensina I Humana: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu PM 1296


Espectros de Iones con Múltiples Cargas

DECONVOLUCION ESPECTROS

• Proceso matemático de localización de series de señales en un espectro de masas que correspondan al mismo peso molecular:

M = (m/z).z - z.(H+) m/z=[M+z(H+)]/z

• La deconvolución de espectros de masas de ESI de iones con múltiples cargas permitirá la determinación de Pesos Moleculares de grandes moléculas con gran exactitud (hasta 0.02%)

Obtenido con Trampa de Iones - estas

diferencias son ya muy difíciles de

apreciar en sistemas con cuadrupolo

% A

bund

anci

a R

elat

iva

428 430 432 434 436 438

20

40

60

80

100 432.82

433.18

433.51

[M+3H]3+

m/z


∆=0.36

∆=0.33


323 324 325 326 327 328

20

40

60

80

324.85

325.10

[M+4H]4+

325.36

m/z

∆=0.26

∆=0.25

m/z600 800 1000 1200 1400

0

20

40

60

80

100

*MSD1 SPC, time=4.664:4.817 of MSDEMO\PROT_FIA.D API-ES, Pos, Scan, Frag: 120

Max: 87866

893.

1

848.

5

942.

6

998.

1

808.

0

1060

.5

1131

.0

771.

5

738.

2

622.

0

921.

9

1211

.8

1304

.8

637.

2

754.

3

694.

0

947.

0

1413

.6

600 800 1000 1200 14000

1000020000300004000050000600007000080000

A:2

4 A:2

3A

:22 A

:21 A

:20

A:1

9A

:18

A:1

7A

:16

A:1

5

A:1

4

A:1

3

A:1

2

Espectro MioglobinaMcalculado = 16.950

nº cargas calculado

Con Trampa Iones


Sesión Final dePreguntas

Para preguntar en directo,

Marque 1 en su teléfono

o use la “Chat Box”

“Chat” Público

“Chat” Privado X( sólo lo reciben los moderadores)

Enviar mensaje

Texto Pregunta/Mensaje


Algunas Direcciones Web de Utilidad>> Acceso a la página web para búsqueda y visualización de Notas de Aplicación y otras publicaciones de Agilent Technologies:

http://www.chem.agilent.com/scripts/LiteratureSearch.asp

>> Acceso web para inscripción a los Agilent "e-seminars" (gratuita)*, bastará conectarse a la dirección de internet:

http://webshop.chem.agilent.com* En el período Septiembre-Noviembre 2003 se han programado 10 “e-seminars” en Español sobre HPLC - DAD - LC/MS - GC - GC/MS - CE/MS - CE y Validación de Métodos Analíticos (éste último está previsto a mediados de Noviembre)

>> Acceso web del grupo de análisis químico de Agilent Technologies:

http://www.chem.agilent.com

>> Acceso web española de Agilent Technologies que permite acceso directo información por técnicas analíticas y productos: HPLC, LC/MS, GC, GC/MS, Electroforesis Capilar, UV/VIS,Columnas y accesorios,.....

http://www.chem.agilent.com/scripts/cHome.asp?country=ES


ANEXOS VARIOS

• Programa MS TOUR (diciembre 2003)• Parámetros Típicos de Trabajo• Orden Recomendado de Optimización de Parámetros


MS TOUR, Diciembre 2003 – Programa:• Nuevo 5973 inerte para análisis de compuestos activos por GC/MS• Nuevas Columnas Inertes para GC/MS y la Importancia de la Inercia en el Análisis de Trazas• Trap XCT• Evaluación de “Unknowns” por LC/MS con Analizadores de Tiempo de Vuelo y Trampa de Iones• Nuevo Agilent LC/MS TOF • Mejoras en el LC/MS de un Cuadrupolo • LC Preparativa – Preparación de Muestras por GPC• Selección de Columnas y Condiciones para LC/MSHorario: 9:30 – 16:00h. (solicite formulario de inscripción en el teléfono: 901.11.6890)

Lugar: Barcelona, 3 diciembre 2003: World Trade CenterMadrid, 4 diciembre 2003: Casino Gran Madrid Torrelodones

Presentadores: • Dr. Amadeo Rguez. Fernández-Alba (Responsable Servicio Espectrometría Masas - Universidad Almería)• Pedro Arranz / Bernhard Wuest / Mitch Hastings / Andre Dams (Agilent Technologies)


Parámetros Típicos de Trabajo (I)"Drying Gas Flow" (mantener siempre un mínimo de 3 l/min)

Electrospray: Flujo HPLC (µl/min) Flujo Gas secado (l/min)<100 7100-300 10>300 13

APCI: 0-1500 típico 4 (rango habitual 3-5)

"Nebulizer Pressure":(Con eluyentes muy acuosos puede convenir incrementar ligeramente los valores indicados)

Electrospray: Flujo HPLC (µl/min) Presión Nebulizador (psi.)<50 1050-300 20300-600 30600-800 40800-1000 50>1000 60

APCI: 0-1500 60

(Durante el autosintonizado se recomienda una presión de nebulizador de 10 psi)

• Los parámetros aquí indicados se refieren a modelos LC/MS Agilent 1100 (tanto con cudrupolo como con Trampa de Iones). Otros equipos pueden requerir valores diferentes.

• En algunos equipos NO Agilent, dependiendo del flujo se deberá cambiar manualmente la posición del nebulizador.


Parámetros Típicos de Trabajo (II)"Drying Gas Temperature" : típico 325ºC

Se puede reducir para compuestos termolábiles o eluyentes muy volátiles

"Vaporizer Temperature" (sólo APCI): típico 350ºC rango habitual: 300-400ºCSe puede incrementar para flujos y porcentajes acuosos elevados o reducir para compuestos termolábiles

"Capillary Voltage": Modo Positivo (V) Modo Negativo (V)

Electrospray (ESI): típico 3000 (rango habitual 1500-6000) típico 2500 (rango habitual 1500-3000)APCI/APPI*: 3000 (*1500 appi con dopante acetona o tolueno) 3000

- Para la mayoría de compuestos voltajes en el rango 2500-5000 volts apenas afectan a la respuesta. - Para moléculas de elevado peso molecular, como proteínas, valores en el rango 5000-6000 volts ó 3000-4000

volts para péptidos suelen proporcionar una mejor respuesta con ESI+.- En ESI(-) un voltaje excesivo puede producir "descargas corona" (chispas azules y repentino incremento “chamber current”)

"Corona Current" (sólo APCI): Modo Positivo (µA) Modo Negativo (µA)

típico 4 (rango habitual 4-6) típico 25 (hab.25-40) (4 para sintonizado)- En modo negativo y en presencia de compuestos electronegativos (en eluyente o gases de secado/

nebulización) la corriente óptima es mucho más baja (proporciona menor ruído y mayor sensibilidad).- La adición en APCI (-) de un 0.5-1% de cloroformo al eluyente o de un 1-2% de oxígeno* en el gas de

secado/nebulizado puede proporcionar una mejor sensibilidad (comp. electronegativos --> menor corrientecorona). * No sobrepasar el 2% de oxígeno, con los disolventes en APCI podría producir una atmósfera potencialmente explosiva.


Orden Recomendado para la Optimización Parámetros de TrabajoDependientes de Flujo y Composición Eluyente (Q+Trap):1.- Presión Nebulizador2.- Temperatura del Gas de Secado /+Vaporizador (APCI)3.- Voltaje del Capilar4.- Flujo del Gas de secadoDependiente del Analito (parámetros importantes a optimizar) :5.- Vfrag (Q)/“Compound Stability” (Skimmer+Cap Exit en Trampa de iones)

- Es independiente del modo y condiciones de ionización (ES o APCI) empleado.- La fragmentación se incrementa al aumentar el voltaje del fragmentador (Q)/ “compound stability” (Trap)/.

6.- sólo en MS/MS/…(con Trap) : “Frag. Ampl.”- Afecta a la energía utilizada para fragmentar al ión precursor. Valores excesivamente bajos no fragmentarán al ión precursor, valores excesivamente altos expulsarán de la trampa al ión precursor y a los iones “hijo” obtenidos.

7.- sólo en MS/MS/… : “Frag. CutOff”- Define la masa mínima de los iones “hijo” obtenidos que son capaces de permanecer en la trampa y afecta considerablemente a la eficiencia en el atrapado de los iones obtenidos. Los valores óptimos típicos suelen rondar alrededor del 27% de la m/z del ión precursor seleccionado.

Para disponer de una óptima sensibilidad la optimización manual o semi-automática de todos estos parámetros “compuesto-dependientes” es importante para la óptima eficiencia de todo el proceso.

EXC

LUSI

VOS

TRA

MPA

IO

NES

EN

MO

DO

MSn

CO

MU

NES

CU

AD

RU

POLO

Y TR

AM

PA IO

NES

TRAMPA IONES


Cierre / Conclusiones Finales “e-Seminar”

Gracias por asistir a este seminario electrónico organizado por Agilent Technologies.

Deseamos les haya resultado útil.

Nuestros “e-seminars” se imparten regularmente. Por favor visite nuestras webs:

www.agilent.com/chem http://www.chem.agilent.com/scripts/cHome.asp?country=ES (versión española)

http://webshop.chem.agilent.com


Si tienen dudas adicionales, por favor contacte: Isidro Masana

[email protected] (o telefónicamente: 901.11.6890)

Consideraciones Prácticas en LC/MS y...

Documents

Transcript of Consideraciones Prácticas en LC/MS y...