Conservación de la Gallina de Chulilla

ProgramaPrograma de conservación de conservación de una población de de una población de gallinas autóctonas gallinas autóctonas

valencianas: valencianas: Gallina de Gallina de

ChulillaChulilla

Amparo Grimal Proyecto INIA RZ2004-00040

IntroducciónIntroducción

Programa de conservación de una población de gallinas autóctonas valencianas: Gallina de Chulilla

•A. Alcaide población de animales de la localidad de Chulilla

•Consellería de Agricultura Pesca y Alimentación (V. García-Menacho y B. Peris) conservación

Cría a partir de huevos fecundados en:

Mas de Noguera (J. Pons)

Teularet (E. Mateu)

•Julio de 2005: llega al C.T.A. la población del Teularet

¿Edad? ¿Parentesco?¿Producciones?¿Censo?

Reunión 9-11-2004: malos antecedentes reproductivos

Teularet, 1ª incubación: 170 huevos 15 pollos (sobreviven 2♀ y 5♂)

Esa semana comenzaba otra incubación (sin datos)

Mas de Noguera, 2ª inc.: 140 huevos 18 pollos

Hay 20 animales jóvenes de 2 incubaciones

Programa de conservación de una población de gallinas autóctonas valencianas: Gallina de Chulilla

Objetivo 1Objetivo 1

Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla, definiendo su patrón

morfométrico y sus posibles variantes. Elección de reproductores


Rejuvenecimiento de la población con vistas a su conservación in situ.

Propuestas de manejo para reducir las tasas de consanguinidad


Conservación ex situ constituyendo bancos de semen y de células

blastodérmicas como un seguro de cara a posibles accidentes para permitir

su reconstitución y para el mantenimiento de la variabilidad genética en

caso de pérdidas parciales


Caracterización genética parcial con una batería de microsatélites, no sólo

para el estudio de la variación intrapoblacional y sus aplicaciones, sino para

estudiar las posibles relaciones con otras poblaciones ya caracterizadas

Objetivo 1: Caracterización morfológica

Objetivo 1Objetivo 1Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla, definiendo su patrón morfométrico y sus posibles variantes. Elección de reproductores

Actividad 1: Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla

Actividad 2: Elección de reproductores



•Medidas zoométricas (longitudes, ángulos): fichas

•Características fenotípicas (color, brillo)

•Información sobre los huevos

•Archivo fotográfico individual

•Caracterización productiva

•Control de puesta

•Curvas de crecimiento


Caracterización básica

•Conformación ligera (tipo mediterráneo)

•Pluma negra (con reflejos verdosos)

•Cresta sencilla

•Orejilla roja o blanca rodeada de rojo

•Pata pizarra, 4 dedos

1389 g

1.194 g

20sem

2.100 g1.174 g554 g39,5 gHembras

2.800 g1.680 g717 g41,5 gMachos

Adultos16 sem8 sem3 díasEdad



Gallina

•Negra o gira plateada

Gallo

•Variedades

•Negros (genotipo EE)

•“Giros” con esclavina plateada (alelos ER y S) o dorada (ER y s+) y plumas de color pajizo en la silla

Pollitos

•Apareamiento al azar: 91% negros con diferentes fenotipos



Control de puesta

Gallinas salas (datos a fecha 31-03-06)

•Número de hembras: 30 gallinas

•Número de huevos: 1.817

•% Puesta: 43,33%

•Puesta media diaria: 12,8 huevos/día

•Puesta Anual Estimada: 155,68 huevos/gallina y año

•% Rotos: 1,01% (18 huevos)

•Peso medio: 57,52 g

•%S: 11,94%

•%M: 70,85%

•%L: 15,86%

•%XL: 0,5%



Puesta Anual Estimada

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

10/11/2005

24/11/2005

08/12/2005

22/12/2005

05/01/2006

19/01/2006

02/02/2006

16/02/2006

02/03/2006

16/03/2006

30/03/2006

Huevos/

galli

na y

año

Control de puesta



Peso medio del Huevo

52,00

53,00

54,00

55,00

56,00

57,00

58,00

10/11/2005

24/11/2005

08/12/2005

22/12/2005

05/01/2006

19/01/2006

02/02/2006

16/02/2006

02/03/2006

16/03/2006

30/03/2006

gra

mos

Control de puesta



Categoría huevos

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

10/1

1/200

5

24/1

1/200

5

08/1

2/200

5

22/1

2/200

5

05/0

1/200

6

19/0

1/200

6

02/0

2/200

6

16/0

2/200

6

02/0

3/200

6

16/0

3/200

6

30/0

3/200

6

%

% S

% M

% L

Control de puesta



Control de puesta

Pollitas (10 plazas entre 27-2 y 30-6)

•Edad al empezar el control:

•Entre 16 y 23 semanas

•Edad de entrada en puesta: 19 semanas (algunas 16)

Puesta semanal

0,00

0,501,00

1,50

2,00

2,503,00

3,50

4,00

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

edad

nh

uev

os

po

r p

oll

ita

y se

man

a



Evolución del peso medio del huevo

35,00

40,00

45,00

50,00

55,00

60,00

65,00

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

Edad (semanas)

gram

os

Control de puesta



Curvas de crecimiento

•10 animales por macho (lotes 8 a 16, 2 ♂ por lote)

•Control del peso individual (Francesch, 2006)

•Semanalmente hasta las 13 semanas

•15, 17, 19 y 21 semanas

•24, 28, 32, 52 y 72 semanas

•Animales en control: 156

•22 bajas en 1ª semana

•14 bajas resto de semanas

•9 sacrificios por coccidiosis

• TOTAL: 111 animales



Pesos Lote 8

0

500

1000

1500

2000

0 5 10 15 20 25 30

semanas

gram

osCurvas de crecimiento



Crecimiento Medio

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,003

d1

s2

s3

s 4s 5 s

6 s 7 s

8 s

9 s

10 s

11 s

12 s

13 s

14 s

15 s

16 s

17 s

18 s

19 s

20 s

21 s

22 s

24 s

28 s

32 s

semanas

peso

(g)

HMTotal

Curvas de crecimiento



Actividad 2: Elección de Reproductores

•Al ser una población envejecida: poco % de eliminaciones

•Objetivo: 50♂ y 50♀, no emparentados

•Asignar aves en función de su aspecto:

•Dos lotes de 15 gallinas cada uno

•Testados 19 (+2) ♂

•Información molecular

Objetivo 2: Conservación in situ

Objetivo 2 Objetivo 2

Rejuvenecimiento de la población con vistas a su conservación

in situ. Propuestas de manejo para reducir las tasas de

consanguinidad

Actividad 3: Rejuvenecimiento de la población con vistas a su conservación in situ

Actividad 4:

Propuestas de manejo para reducir las tasas de consanguinidad


Actividad 3: Rejuvenecimiento de la población con vistas a su

conservación in situ

•Malos antecedentes reproductivos incubar TODOS los huevos

•Recogida de huevos desde el 27-7-05

•Sin restricciones de peso (sólo se eliminan muy sucios y rotos)

•Sin desinfección

•6 incubaciones con nacimientos entre el 28-8 y el 26-10-05

•Huevos almacenados hasta 14 días (Abad, 2003; Campo)

•Incubadora para 216 huevos y una nacedora

•Determinación de las fertilidades y mortalidad embrionaria por embriodiagnosis (50,77% mortalidad en últimas fases del desarrollo)

•Tras 6 lotes 214 pollitos (91% negros)

•SIGUIENTE FASE: lotes de medios hermanos


plumón

66,6722,2211,1188,787,978,07191L6

50,7727,6921,5476,785,165,2214328TOTAL

53,3326,6720,0080,587,570,56288L5

47,0617,6535,2968,583,156,93765L4

50,0050,000,0069,289,762,11829L3

0,0050,0050,0090,087,078,31823L2

50,0028,5721,4336,468,725,0832L1

Pollito formado

Polito con

EmbriónIncubabilidad

FertilidadNacidos (%)

Pollitos Nacidos

Nº Huevos

Lotes

Mortalidad embrionaria

Parámetros reproductivos en los 6 primeros lotes con apareamiento al azar

Actividad 3: Rejuvenecimiento de la población con vistas a su conservación in situ


Actividad 4: Propuestas de manejo para reducir las tasas de consanguinidad

•Primer objetivo: maximizar el censo efectivo

•Baja relación reproductiva

•Descendientes de todos los individuos

•Reemplazo de reproductores: selección intrafamiliar

•1 hijo por cada M y 1 hija por cada H

•Conservación asistida por marcadores

¿Qué propusimos? ¿Qué hacemos?

¡Más parques!

Testando todos los machos: Familias de medios hermanos

Sólo podemos asegurar el padre

¿Pruebas de paternidad?

Objetivo 2: Conservación in situActividad 4: Propuestas de manejo para reducir las tasas de consanguinidad

Familias de medios hermanos

•Dos lotes con 15 gallinas cada uno, vamos testando gallos

•Gallina almacena el semen del gallo durante varios días:

•3 semanas desde que recojo huevos de un ♂ y he retirado el anterior

•Lotes de pollitos cada 4 semanas

•Testados 19 ♂:

•Lotes 8 a 17: 10 lotes (cada lote 2 ♂)

•Incubándose huevos de dos machos más

•Valoración de los gallos:

•Fertilidad

•Crecimiento de sus hijos, puesta de las hijas.

•Reemplazo: sólo aseguramos paternidad

•Hembras: todas las que “cumplan el estándar”

•Machos: al menos 3 (por seguridad)

•Pruebas de paternidad

Objetivo 3: Conservación ex situ


Conservación ex situ constituyendo bancos de semen y de células

blastodérmicas como un seguro de cra a posibles accidentes para permitir

su reconstitución y para el mantenimiento de la variabilidad genética en

caso de pérdidas parciales

Actividad 5: Extracción de semen

Actividad 6: Congelación de semen. Constitución del banco. Material macho

Actividad 7: Constitución de criobanco de células blastodérmicas. Material

Hembra


Actividad 5: Extracción de semen

•Recogida de semen por masaje dorso-abdominal con “ordeño” de la cloaca

•Valoración en laboratorio:

•volumen, aspecto, concentración, motilidad masal

Objetivo 3: Conservación ex situActividad 5: Extracción de semen

•Prueba de inseminación en fresco•Dilución 1:1 •Diluyente IRTA ( Na glutamato, glucosa, Mg acetato, K acetato y PVP)


Actividad 6: Congelación de semen. Constitución del banco. Material macho

• Dilución 1:1 con diluyente Lake 4º, 30 min

•Glicerol hasta el 11% (con solución Lake con 22% glicerol) 4º, 30 min

•Envasar en pajuelas de 0,5ml y congelar:

•De 4ºC hasta -35ºC a -7ºC/min

•De -35ºC hasta -140ºC a -20ºC/min

•Descongelación:

•Baño de agua, 4ºC, 3 min

•Resuspender pajuelas en medio Lake 7.1

•Centrifugar para eliminar el glicerol

•Resuspender pellets en Lake 7.1


Actividad 7: Constitución de criobanco de células blastodérmicas. Material hembra

•Protocolo de Kino y col. (1996)

•Criopreservación de células del blastodermo en estadío X

•Donantes para constituir animales quimeras que mediante cruces de

machos y hembras quimeras darían animales de la raza de las células

criopreservadas

Objetivo 4: Caracterización genética


Caracterización genética parcial con una batería de microsatélites, no sólo

para el estudio de la variación intrapoblacional y sus aplicaciones, sino para

estudiar las posibles relaciones con otras poblaciones ya caracterizadas

Actividad 8: Toma de muestras. Extracción de DNA

Actividad 9: Genotipado de microsatélites

Actividad 10: Filtrado y análisis estadístico


Actividad 8: Toma de muestras. Extracción de DNA

Toma de Muestras

•Muestras de sangre de todos los animales 78 muestras

•Punción en vena del ala

•Jeringas de 2ml

•Almacena en Vacutainer con EDTA

Objetivo 4: Caracterización genéticaActividad 8: Toma de muestras. Extracción de DNA

Extracción de ADN

• Metodología:

a) Aplicación del protocolo de extracción

b) Electroforesis horizontal con gel de Agarosa

• Comprobar si hay ADN

• En cada pocillo: 10 µl muestra+ 3µl Azul (Ficoll, Azul Bromofenol, Xylenocianol)

• Correr el gel a 100v, 30.45 min

c) Cálculo de la concentración de ADN

• Homogeneizar concentraciones

• Alicuotar

• Congelar


Protocolo de extracción

1. REAL PURE SPIN KIT

•200-300 µl de sangre total

•No funcionó, se coagulaba la sangre en el paso 2 (pruebas, protocolo de tejidos):

•Tras incubar 200µl de sangre, 10 min a 70ºC, con 200µl de Tampón de Lisis/unión y 20 µl de proteinasa K, añadir 100µl de Isopropanol

•Causa: Las aves tienen los hematíes nucleados.

2. PROTOCOLO DE ANGUILAS

•40 µl de sangre total

•Reactivos:•Tampón de Lisis I (Tris-HCl, EDTA)•Tampón de Lisis II (Tris-HCl, EDTA, SDS)•Proteinasa K•Solución de precipitación (NaCl)•Isopropanol•Etanol•Tampón de Elución (500µ)


Concentración de ADN

•Dilución 1:100 (10µl de ADN nativo + 990 µl de TE)

•Espectrofotómetro: A260 no coincidencia de lecturas sucesivas

•Bioespectrofotómetro (lee a 230, 260, 280 y 320; y calcula la concentración)

•Concentración media: 199,11 µg/ml

•Recorrido: 56,8 – 622,5 µg/ml

•Cantidad neta media: 95,57 µg

•Recorrido: 27,26-298,8 µg

•Igualar concentraciones a 50 µg/ml

•100µl de ADN nativo + TE hasta conseguir 50µg/ml

•Congelar ADN nativo


Actividad 9: Genotipado de microsatélites

•FAO (2004) batería de 30 microsatélites, en 7 multiplex:

•1: ADL0278, ADL0268, LEI0094, MCW0248, MCW0216

•2: MCW0081, MCW0034, MCW0069, MCW0222, MCW0295

•3: MCW0111, MCW0037, MCW0016, LEI0166, LEI0234

•4:MCW0183, ADL0112,MCW0014

•5: MCW0165, MCW0020, MCW0123, MCW0104

•6:MCW0078,MCW0067,MCW0330,MCW0098

•7: MCW0206, MCW0103

•Sin información: MCW0284, LEI0192

•Proyecto AVIANDIV: 22 microsatélites, 52 poblaciones europeas

•Objetivo: caracterizar genéticamente la población (heterocigosidades, equilibrio H-W), cálculo de distancias genéticas con otras poblaciones

•7 muestras testigo del proyecto AVIANDIV y 24 muestras de Castellana Negra

Objetivo 4: Caracterización genéticaActividad 9: Genotipado de microsatélites

PCR

•Reactivos: 50 µg/ml de ADN, primers 20µM, Master Mix (Taq, dNTPs, Cl2Mg), H2O

•Volumen:20 µl

•Termociclador:

•2 min, 94ºC

•35 ciclos de amplificación:

•1 min 94ºC

•1 min 60ºC (58º, M4)

•1 min 72ºC

•10 min 72ºC

•4ºC, almacenar (congelamos)


SECUENCIADOR

Secuenciador CEQTM 8000 Beckman Coulter

•Placa, en cada pocillo:

•10 µl PCR

•30 µl SLS (Sample Loading Solution)

•0,2 µl DNA Size Satnadard Kit-400

•Aceite mineral

•Placa con Tampón

•Jeringa con Separation Gel-LPA I

Interpretar la lectura del secuenciador


SECUENCIADOR

0

2 5 0 0 0

5 0 0 0 0

7 5 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 2 5 0 0 0

1 5 0 0 0 0

1 7 5 0 0 0

1 3 5 1 4 0 1 4 5 1 5 0 1 5 5 1 6 0 1 6 5

M 3 . 6 0 . D 0 9 _ 0 6 1 0 2 3 1 4 F B

S i z e ( n t )

Dye S

ignal 134.68

136.68

136.83

137.73

137.96

138.96

139.04

140.07

140

141.18

142.15

142.27

143.33

143.39

144.43

145.52

145.58

146.61

147.65

147.72

148.74

148.82

149.91

150.81

151.87

152.96

153.51

153.95

155.68

156.79

157.77

160

Verde: MCW 0016

Negro: MCW 0037


SECUENCIADOR

0

2 5 0 0

5 0 0 0

7 5 0 0

1 0 0 0 0

1 2 5 0 0

1 5 0 0 0

8 0 8 5 9 0 9 5 1 0 0 1 0 5 1 1 0 1 1 5

M 3 . 3 6 . D 0 6 _ 0 6 1 0 2 3 1 4 F 7

S iz e ( n t )

Dye S

ignal

79.11

79.86

80

80.81

82.84

84.77

86.73

87.47

88.37

90

99.22

100.23

100

101.28

102.27

110.92

MCW 0111


RESULTADOSAmplifican 21 microsatélites

•Probando los que no amplifican con más ciclos de PCR

•Problemas con algunas multiplex y testigos

•Analizando los testigos

12LEI0192s/i

39MCW0206, MCW01037

73MCW0078, MCW0067, MCW0330, MCW00986

68MCW0123, MCW01655

69MCW0014, MCW01834

65MCW0111, MCW0037, MCW00163

21MCW0295, MCW0069, MCW00342

36MCW0278, MCW0216, MCW0248, LEI00941

Muestras analizadasAmplificanMultiplex


RESULTADOS PRELIMINARESMultiplex 6

0,0161

0,3468

0,0565

0,5645

0,0161

Frecuencia

254

255

256

257

258

0,0078

0,1405

0,0859

0,0078

0,0234

0,1016

0,0156

0,0625

0,4063

0,1484

Frecuencia

256

257

258

259

268

269

276

277

288

289

0,2031

0,0156

0,4766

0,0938

0,1953

0,0156

Frecuencia

171

172

173

174

177

178

0,0859

0,0859

0,1172

0,6250

0,0703

0,0156

Frecuencia

134

135

138

139

140

143

F(255-257)= 0,5484F(257-288)= 0,2031F(171-173)= 0,3125F(139-139)= 0,4844

Ho: 0,3710

Hoe: 0,4426

Ho: 0,2656

Hoe: 0,2294

Ho: 0,25

Hoe: 0,3158

Ho: 0,6094

Hoe: 0,4243

Alelos (5)Alelos (10)Alelos (6)Alelos (6)

MCW0098MCW0330MCW0067MCW0078


Actividad 10: Filtrado y análisis estadístico

Villafr

Chulilla0

Bresse

Castell

•Calcular

•Frecuencias alélicas

•Heterocogosis observadas y esperedas

•Equilibrio H-W

•Distancias genéticas

•Nei

•Cavalli-Sforza

•Reynolds

•FST

•Genepop, Phylip, Dispan, Biosys-1, etc.

ProgramaPrograma de conservación de conservación de una población de de una población de gallinas autóctonas gallinas autóctonas

valencianas: valencianas: Gallina de Gallina de

ChulillaChulilla

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