Confirmación de Escherichia coli y su distinción de especies de Klebsiella por

formación de gas e indol a 44 y 44.5° C

Carlos Alberto OrozcoJulián Andrés Dorado

Luís Felipe ArcosWilliam Andrés Aponte

RESUMEN

El objetivo de este estudio fue investigar el impacto del test de producción de gas en la confiabilidad para la confirmación de E. coli

Métodos y Resultados

-El impacto de muchos medios de cultivo en el crecimiento, formación de gas y/o indol fue evaluado a 44 y 44.5 ° C usando 547 cultivos medioambientales aislados.

-Se usaron principalmente E. coli, K. pneumoninae, K. oxytoca y E. cloacae.

Conclusiones

-La confirmación de E. coli falso – positivo es posible si la producción de gas no es evaluada y para la confirmación esta basada solo en el test de Indol.

Importancia e Impacto del Estudio

Los resultados positivos erróneos en el análisis rutinario para E. coli pueden ocurrir

Introducción

-Recientemente, el test de producción de gas ha sido borrado en le método Standard internacional (ISO 9308-1 2000).

-En este estudio se comparan 7 diferentes medios líquidos incubados a 44 y 44.5° C para producir crecimiento, gas o formación de indol

cuando se inocularon con más de 500 especies medioambientales aisladas de E. coli y Klebsiella.

- Otras 250 sepas de Klebsiella de diferentes medioambientes y fuentes fecales fueron identificadas y probadas para su máxima temperatura de

crecimiento, todas esas sepas fueron adicionalmente probadas para producción de gas en caldo E. coli a 44.5° C.

Materiales y Métodos

-547 sepas de bacterias coliformes fueron estudiadas, dominantemente especies de E. coli y Klebsiella, 24 Enterobacter, 3 Pantoea y 2 sepas

de Citrobacter.

-Para estudios de Tmax un nuevo set de 250 sepas de Klebsiella fue aislado de diferentes fuentes:

- 209 especimenes de recibidos de NPHIH cultivadas en agar conteniendo inositol y carbenicilina.

-Muestras de agua fueron colectadas en botellas estériles 1-1 borosilicato y transportadas enfriadas al laboratorio.

- Las sepas para el método de identificación fueron identificadas con API 20E o con enterotube II

Diseño experimental

- las medidas se llevaron a cabo en dos laboratorios- Usaron químicos del mismo fabricante y en algunos casos reactivos

de la misma botella.- termómetros fueron calibrados contra el mismo termómetro certificado.

Medios para el Método de Comparación

Los medio usados fueron:

Caldo lactosa peptona (LP), caldo lactosa peptona con sal (LPS), caldo bromocresol púrpura lactosa (BPL), Caldo lauril triptosa manitol con

triptófano (LTM), caldo triptona manitol ricinoleate (TMR), caldo triptona triptófano sal (TTS); formaci{on de indol fue registrado en EC, LTM,

TMR, y TTS.

Preparación de Cultivos

-Los medios fueron mantenidos toda la noche a 44° C para mirar la contaminación y falsa producción de gas.

-Crecimiento y producción de gas fueron leídos luego de 22 +- 2 h y 44 +- 4 h de incubación.

-La producción de gas fue medida en escala semicuantitativa -, +, ++ y +++.

-Reactivo indol fue agregado solo dos días después de la incubación cuando el experimento fue terminado.

- La reacción fue medida -, +, ++.

Tmax Estudios - fue medida con la ayuda de un incubador gradiente-

temperatura en mCF agar.

DISCUSIONESDISCUSIONES El impacto de la composición del medio en el crecimiento fue especifico para las El impacto de la composición del medio en el crecimiento fue especifico para las

especies, donde especies, donde E. coliE. coli y y K. pneumoniaeK. pneumoniae crecieron bien todos los medios y crecieron bien todos los medios y Ent. Ent. cloacaecloacae mostro mayor crecimiento en LTM. mostro mayor crecimiento en LTM.

Ent. CloacaeEnt. Cloacae fue sensible a la temperatura de incubación y al tiempo en medios fue sensible a la temperatura de incubación y al tiempo en medios como LP, LPS, BLP y TMR.como LP, LPS, BLP y TMR.

La temperatura influyo en la separación de las especies de La temperatura influyo en la separación de las especies de Klebsiella.Klebsiella.

Los resultados que se presentaron en el trabajo mostraron lo sensitivo que es este Los resultados que se presentaron en el trabajo mostraron lo sensitivo que es este test a los medios utilizados.test a los medios utilizados.

El mejor de los medios utilizados fue LTM: 95% de El mejor de los medios utilizados fue LTM: 95% de E. coliE. coli y 85% de y 85% de K. pneumoniaeK. pneumoniae dieron una respuesta positiva en el test de gas con este mediodieron una respuesta positiva en el test de gas con este medio

De todas las cepas De todas las cepas Pantoea agglomeransPantoea agglomerans es la mas problemática debido a que se es la mas problemática debido a que se encuentra en mucho residuo industrial y sus cepas son indol-positivoencuentra en mucho residuo industrial y sus cepas son indol-positivo

El indol positivo El indol positivo K. oxytocaK. oxytoca no pudo crecer en un medio sólido mFC a 44°C o a no pudo crecer en un medio sólido mFC a 44°C o a temperaturas mas altas de incubación sin embargo creció en medio liquido lo cual temperaturas mas altas de incubación sin embargo creció en medio liquido lo cual demuestra la sensibilidad de este al medio de cultivo y a la temperatura de demuestra la sensibilidad de este al medio de cultivo y a la temperatura de incubación.incubación.

La determinación de La determinación de E. coliE. coli no fue totalmente eficiente con la prueba de indol a alta no fue totalmente eficiente con la prueba de indol a alta temperatura por los falsos positivos de temperatura por los falsos positivos de K. oxytocaK. oxytoca..

Para separar Para separar E. coliE. coli de las especies de de las especies de KlebsiellaKlebsiella, es necesario excluir , es necesario excluir K. K. pneumoniaepneumoniae con la prueba del indol y con la prueba del indol y K. oxytocaK. oxytoca usando la prueba de producción de usando la prueba de producción de gas.gas.

Todas las Todas las K. pneumoniaeK. pneumoniae se excluyeron por el test negativo de la producción de se excluyeron por el test negativo de la producción de indol, al mismo tiempo pruebas de producción de gas a altas temperaturas fueron indol, al mismo tiempo pruebas de producción de gas a altas temperaturas fueron utilizadas para la eliminación de falsos positivos.utilizadas para la eliminación de falsos positivos.

El método Standard internacional presente para coliformes y El método Standard internacional presente para coliformes y E. coliE. coli en el cual la en el cual la producción de gas se descarta como un criterio para la confirmación de producción de gas se descarta como un criterio para la confirmación de E. coli,E. coli, y y detección de falsos positivos de detección de falsos positivos de E. coliE. coli..

Es posible basar la diferenciación de Es posible basar la diferenciación de E. coliE. coli en un test totalmente diferente en un test totalmente diferente como el de la como el de la ββ-glucuronidasa y el de los marcadores moleculares.-glucuronidasa y el de los marcadores moleculares.

Según trabajos de Shadix y Rice (1991) el medio EC a 44.5° C en un día Según trabajos de Shadix y Rice (1991) el medio EC a 44.5° C en un día produjo un porcentaje de 11.7% de falsos negativos en la producción de produjo un porcentaje de 11.7% de falsos negativos en la producción de gas la cual esta cerca del 9.1% de este estudio en las mismas condiciones gas la cual esta cerca del 9.1% de este estudio en las mismas condiciones pero alta con respecto al 4.5% en condiciones optimas.pero alta con respecto al 4.5% en condiciones optimas.

En su estudio 4.8% de las cepas de En su estudio 4.8% de las cepas de E. coliE. coli eran anaerogénicas e incapaces eran anaerogénicas e incapaces de producir gas en el medio de fermentación de lactosa convencional a 35 y de producir gas en el medio de fermentación de lactosa convencional a 35 y 44.5° C. la tasa correspondiente que se observo en este estudio fue del 44.5° C. la tasa correspondiente que se observo en este estudio fue del 3.6% en condiciones optimas.3.6% en condiciones optimas.

Es evidente que tanto las condiciones de incubación como la composición Es evidente que tanto las condiciones de incubación como la composición del medio afectan la prueba de del medio afectan la prueba de ββ-glucuronidasa, por eso es necesaria la -glucuronidasa, por eso es necesaria la utilización de elementos traza en su dilución.utilización de elementos traza en su dilución.

CONCLUSIONCONCLUSION

La identificación de La identificación de E. coliE. coli por pruebas fisiológicas no por pruebas fisiológicas no esta exenta de incertidumbre. Cada una de las pruebas esta exenta de incertidumbre. Cada una de las pruebas de identificación y de confirmación para estas especies de identificación y de confirmación para estas especies no es absolutamente reproducible. Los resultados de no es absolutamente reproducible. Los resultados de este estudio muestran como pequeñas diferencias en este estudio muestran como pequeñas diferencias en las condiciones de la prueba afectan significativamente las condiciones de la prueba afectan significativamente los resultados de la misma. Bajo optimas condiciones, la los resultados de la misma. Bajo optimas condiciones, la confirmación de confirmación de E. coliE. coli produjo 6 % de falsos negativos produjo 6 % de falsos negativos simultáneamente permitiendo un 7% de simultáneamente permitiendo un 7% de K. oxytocaK. oxytoca dar dar resultados falsos positivos. Esto es comparable a la tasa resultados falsos positivos. Esto es comparable a la tasa de falsos negativos del 4.6% para las pruebas de de falsos negativos del 4.6% para las pruebas de ββ--galactosidasa y galactosidasa y ββ-glucuronidasa. Shadix y Rice (1991) -glucuronidasa. Shadix y Rice (1991)