Conceptos Basicos Del Cultivo de Tejidos

5/10/2018 Conceptos Basicos Del Cultivo de Tejidos

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; CONCEPTOS BASICOS DEL CULTWO DE TEJIDOS VEGETALES

,/Ana Abdelnour- EsquivelJean Vincent Escalant

1994

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CONTENIDO

Prefacto __AgradectmtentoIntroduccton iiTtpos de crectmtento in vitro 1

Crectmtento orgaruzadoCrectmtento desorgantzado

Termtnos para tdenUftcar los prtnctpales ttpos de propagacton invitroOrganosCallosSuspension de celulas 2ProtoplastosAnteras

Prtnctpales apltcactones del culUvode tejtdosMtcropropagactonObtencton plantas ltbres de vtrus 4MeJoramtento genettcoConservacton de gennoplasma 6

Factores que tntervtenen en el culUvode tejtdosEI ln6culo 0 explanteFactores fistcosFactores quimtcos 8

EImedto de culUvoSales organtcas 9Compuestos organtcosPreparactones naturales complejas 10Matertales tnertes

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Formulacton de sales de Murashlge y Skoog llLa preparacton del medto de cuIUvo 12

EJemplos de medlos de culUvo 15Mtcropropagactcn de apices de MusaMtcropropagaclon de estacas de cafeMtcropropagacion de vaJnillaMtcropropagacton de DioscoteaMtcropropagacton de XanthosomaMteropropagacton de Ipomoea batataMtcropropagacton de orquideas

Metodos de destnfeccton 18EI material vegetalEI medlo de culUvoLa crtstaleriaLa camara de transferenclaLos Instrumentos de trabajoEI cuarto de transferencta

Embrtogenests somattca y suspenstones celulares 21Embrtogenests somattcaSuspenstones celulares 26

Metodos de conservacton de los recursos fttogeneticos 30Conservacton in situConservacton ex situLos bancos de semtllasLas colecctones de campoConservacton in vitro

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PREFACIO

AGRADECIMIENTO

EI presente documento se prepare como ayuda didacttca para aquellosestudtantes que se Intctan en el culttvo de tejtdos a traves de los cursos decapacttacion y entrenamlentos en servteto del Centro. En este encontraranconceptos y terrnmos ruttnartos expl1cados de una manera senctlla, asi comolos prtnclpales campos de apltcacion de estas tecmcas. Tambten podra seruUl1zado como una guia practtca para la preparacton de soluclones madre.medtos de culUvo y metodos de destnfeccton.

Los autores desean hacer un reconoclmlento:AKenneth G. Royo O. por su gran ayuda en la edtcton de este documento.A Domingo Loaiza por la dtagramacion y dtsefio de portada.AI personal del Laboratorto de Cultivo de TeJldos de C.A.T.I.E. por suvaltosa colaboracton,

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INTRODUCCION

El concepto de cultivo de tejidos 0propagacton in vitro (del latin en vidrioIabarca tanto el cultivo aseptlco de tejidos como de celulas y organos. Se lellama in vitro debido a que se cultiva en recipientes de vidrio 0 plasttcotrans parente. Esta tecnlca consiste en cultivar un Inoculo con potencialidadde dtferenclacton bajo condiciones asepttcas en presencia de una dietabalanceada de nutrientes y hormonas. Esta capacidad de regenerar nosolamente tejidos y organos, sino tarnblen una planta entera es unlca enplantas. no puede encontrarse un fenorneno similar en animales superiores.Podemos definir el cultivo de tejidos como un conjunto de tecntcas con lascuales podemos ejercer un control relativo sobre los procesos morfogenetlcos,flstologtcos y bioquimicos que se llevan a cabo en los tejidos bajo estudio.

Al igual que en otros metod os de multlpltcaclon vegetativa 0asexual. losindividuos descendientes de una planta madre propagada in vitro son clones.es declr, son copias genetlcamente ldentlcas entre ellas e Identicas a la plantamadre. En plantas propagadas por semilla (propagaclon sexual). la descen-dencia no es clonica ya que cada semilla tiene su propia base genettca queresulta de la mezcla de ambos progenltores, por 10 tanto. cada individuo esunlco.

Cuando el explante (material inicial en cultivo in vitro. que puede ser unpedacito de tallo, hoja, yema 0 raiz) se coloca en un tubo de ensayo bajo lascondiciones antes descritas. produclra pequenas plantltas, replicas delprogenitor. Produclra un nurnero tan alto de plantulas que se necesttarasepararlas frecuentemente para que puedan sobrevivlr. El nuevo crecimlentoes generalmente iniciado en tejido merlstematlco (conjunto de celulas nodlferencladas para su ultima funclonl. Las celulas mertstematlcas se encuen-tran localizadas en los apices de los tallos y raices, en las axllas de las hojas,en el cambium de tallos, en los margenes de las hojas y en callos, asi. estascelulas dependiendo de su base genetlca y locallzaclon e Influencladas por laluz, temperatura. hormonas y probablemente otros factores se diferencian enhojas. tallos, raices y otros organos y tejidos de una manera organizada.

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TIPOS DE CRECIMIENTO IN VITRO

I. CRECIMIENTO ORGANIZADOSe refiere al tipo de cultlvo que se lnicia con una parte organlzada de la

planta (apices, hojas, brotes, semlllas, etc.) y esa parte u organo stguecreciendo in vitro manteniendo sus caracteristlcas estructurales. Se aplicatamblen cuando se desarrolla una estructura a partir de un tejido desorgani-zado (organogenesis).

II. CRECIMIENTO DESORGANIZADOEste tipo de crecimiento se caracteriza porque a partir de fragmentos de

tejidos u organos se produce un tejido sin estructura especifica que contieneun numero limitado de algunos tlpos de celulas especializadas encontradasen una planta intacta. Un tejido desorganizado (0 callo) puede crecer consubcultivos y puede ser mantenido en medio solido 0 liquido durante variosmeses 0 anos. Puede ser usado para inlciar suspension de celulas yprotoplastos.

TERMINOS PARA IDENTIFICAR LOS PRINCIPALEST1POS DE PROPAGACION IN VITRO

1. Cultivo de organosCorresponde al cultivo de un organo de la planta con el fin de propagar

la planta. Cultlvo de meristemas 0de apices, microestacas, cultlvo deembriones.2. Callos

Corresponde a un conjunto de celulas procedentes de la desorganlzaclonde un tejido 0de una suspension de celulas. El calla tiene la pecuUaridad depresentar celulas no diferenciadas para su ultima funclon pero que conservanel poder de dividirse (celula mertstematica 0 embnogenlca).

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3. Suspenswn de celulasLas suspensiones celulares conslsten de celulas libres y microagregado

de celulas en medio liquido en movimiento.4. Cultivode protoplastos

Es el cultivo de celulas sin pared pectocelulostca, Es deelr, celulas conlos componentes vivos rodeados solamente por la membrana cttoplasmlca.Debido a la ausencia de pared celular los protoplastos son adecuados paratrabajos en mantpulacton genettca que no serian posibles con plantas 0celulas intactas. ademas son muy utilizados para estudios flstologicos.btoquimlcos y biofisicos.5. Cultivode anteras

Consiste en el cultivo de anteras enteras con polen Inmaduro, el polense divide para formar embriones 0callo. Cuando estes se transfleren a losmedios de regeneraclon se forman plantas. Por 1 0 general el cultlvo de anterasse utiliza para la obtenclon de plantas haploides. Estas se regeneran a travesde la embrlogenests somatlca a partir del polen, directamente 0por la via deorganogenesis a partir de un callo. Algunas veces se cultiva el polen una vezaislado de la antera y se le llama cultlvo de polen 0de microesporas.

PRINCIPALES APLICACIONES DEL CULTIVO DE TEJIDOS

El cultivo de tejidos puede utilizarse para diversos proposltos como son:la mtcropropagacton, la obtenclon de plantas libres de virus y otros patogenos,el mejoramiento genettco y la conservaclon de germoplasrna.I. MICROPROPAGACION

La mtcropropagaclon es la tecnlca que ha logrado raplda aceptaclon enla industria y se esta practicando tanto en especies horticolas como enornamentales y aun en lefiosas. Esta metodologia presenta lmportantesventajas sobre los metodos tradicionales de propagacton, entre elIas se puedecitar:- Incremento acelerado del numero de plantas derivadas por genotipo:cuando se usan metod os de propagacton convencionales un esquejeproduce una plantay una semilla produce una planta. sin embargo. unexplante teorlcamente puede prod ucir un infinito nurnero de plantas. Es



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por esta razon que se necesitan muy pocas plantas de donde tomar losexplantes que produclran miles de plantas.

- Reducclon del tlempo de multtpltcaclon.

- Posiblldad de multlpllcar grandes cantidades de plantas en una superfl-cie red uclda, a bajos costos y en un tiempo economlcamente costeable.- Mayor control sanitario del material que se propaga.- Facllldad de transportar el material in vitro de un pais a otro, con menosrestricciones aduaneras.

- PosibUidad de multiplicar rapldamente una varied ad de la cual existenpocos individuos.Debido a que la mlcropropagacton se refiere a un fenomeno de reproduc-

cion asexual. el riesgo de tener "varlantes" fenotipicas 0genettcas es bajo. Sinembargo eso puede suceder cuando no se domina el proceso in vitro. Lasplantas que vienen de un mismo mertstema, spice. 0estaca son llamadasMelones".

La obtenci6n de una planta entera:La obtenclon de una planta entera puede ocurrir a traves de tres vias

diferentes:a) a partir de brotes, prtmordlo. meristema y embriones pre-existente en el"explante" utilizado.

b) a partir de un brote 0meristema iniciado dentro de un callo 0dtrecta-mente sobre el explante inicial. En este caso los brotes 0meristema seforman in vitro (brotes adventicios 0de novo).

c) a partir de un embtioti somalico (embrion similar al embrion ctgottco 0dela semilla) que se forma a partir de un tejido somatlco (embrtogenestssomatlca = asexual).Para la mayoria de las especies que se multiplican in vitro. las vias mas

usadas son las a) y b). Muy pocas especies se multipllcan al nivel industrialpor la tercera via (ejemplo de la palma africana). sin embargo. la apllcaclon deesta tecnlca va en aumento.



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La ventaja mayor de esta tecnlca es poder prod ucir a partir de un explantede una variedad 0especie un numero teoricamente indefinido de plantas deesta mlsma variedad 0especie.II. OBTENCION DE PLANTAS LIBRES DE VIRUS

EI cultlvo de tejidos permite en muchos casos producir plantas Ilbres depatogenos y de virus. En generalla tecnlca consiste en aislar el meristemo deplantas que fueron 0no tratadas con termoterapia. Entre mas pequefio seael meristema inoculado mas exlto se tendra en Ia erradlcaclon del virus. Esnecesario establecer para cada tipo de virus y de planta unas pruebasserologtcas I''Test Elisa") que permiten revelar de manera sencilla la presenciadel virus en la planta in vitro. Estas precauciones son indispensable para elintercambio de materiales vegetales entre paises.III. MEJORAMIENTO GENETICO

La creaclon de hfbrldos con las tecnlcas de hlbrldacton clastcas en elcampo puede ser dificil debido a problemas de esterilidad 0 incompatibilidadde variedades. Algunas de las tecnlcas del cultivo de tejidos pueden ayudary facilitar la creaclon de nuevas variedades. Un incremento de la variabilidadnatural puede ser logrado usando tecnlcas como: callogenests, cultivo decelulas y el cultivo de protoplastos. asociadas 0no a tecntcas de ingenieriagenettca (Introducclon de genes 0 transformaclon). Ya hemos vis to ladefinicion de algunos de estos termlnos. La regeneraclon de plantas a partirde callos, celulas 0 protoplastos se hace via organogenesis 0 embrtogeneslssomatlca.

Obtenci6n de protoplastos:En el transcurso de la expertmentaclon. los blologos constataron que se

podia lograr la agregaclon de celulas una vezeliminada la pared pectoceluloslca,permitlendo asi Ia fusion de material nuclear y cttoplasmatlco. Asi nacto elprincipio de Ia hlbrldaclon somatlca.

EI primer paso para Ia obtenclon de protoplastos es la destrucclon de lapared pectlnoceluloslca para obtener celulas de forma redondeada y Iimitadasuntcamente por Ia membrana cltoplasrnatica. Para esto se hace necesaria lautillzacton de enzlmas pectinasas y celulasas. Una vez obtenidos losprotoplastos se puede manipular el material para prod ucir hibrtdos somatlcos.EI protoplasto puede regenerar rapldamente Ia pared celular y por medio decallogenests, organogenesis 0embrtogenesls somatlca producir plantas. La



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- el intercambio de material no siempre es total. se pueden obteneradlciones incompletas.

htbrtdaclon somatlca 0 fusion consiste en la agregacton de protopastos.Cuando se produce la fusion de dos protoplastos. todo el contenido celular escomun y se puede alcanzar la adlclon total de del material genetlco en los trescompartlmentos que 10 contienen tnucleo, mitocondria y cloroplasto). Estoincrementa el nivel de ploidia. sin embargo. varios eventos pueden perturbarla fusion:

- una vez ocurrida la fusion es posible que se den competiciones yellminaciones crornosomlcas. Por ejemplo, en cada mitosis subsecuentepuede suceder que algunos pares de cromosomas sean desechados.

Ejemplo de hibridos: entre tomate y papas; tomate y berenjenas; tomatey tabaco (disminuir la cantldad de nicotina); tomate y trtgo: etc ... ) muchasveces el paso mas dificil es la regeneracton de la planta.Introducci6n de particulas:

Hoy en dia existen un buen numero de tecnlcas para introducir el ADNen las plantas y de esta manera obtener nuevos materiales (materialestransformados):a. Vso de vectores naturales

El m as comun es Agrobacterlum (A. tumefaciens y A. rhlzogenes).Tamblen se han utilizado virus como vectores (esto por medlo de afldos). Elprimer paso es la Incorporaclon de un ADNforaneo por medlo de una bacteriainfectante que porta un virus latente "el plasmldo" (porclon de gen en elcltoplasma de la bacteria que se dupllca de manera independiente). Seprovoca una herida en la planta para que las bacterias penetren. Agrobacterlumse pega a las paredes de la herida para formar una tnteracclon "llave-cerradura". Los genes de la bacteria son activados (los del plasrnldol ytransferidos a la planta (solo los de la region T)y son incorporados al nucleoy al genoma de la planta. Decimos entonces que la planta fue transformaday se evalua la expreston de los genes. Existe otro metodo en el cual setransforman directamente protoplastos. se Ie llama tamblen "cocultivo".Consiste en incubar las bacterias con protoplastos. la transformaclon es muylenta y el metodo no es muy eficiente.



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b. Transferencia directa de genesEntre estas tecnlcas esta la absorclon de ADNpor protoplastos mediado

por procedlmlentos quimlcos (Ca-PEG. fusion de protoplastos). electroporaclon(Gene Pulser), bombardeo de ADN (Biolistics) y mtcrotnyeccton,

Sin Importar la tecnlca usada, es necesario evaluar la transformacton ypor supuesto la regeneraclon del tejido.Haplometodos:

Consisten en el cultivo de anteras u ovulos para la obtenclon de plantashaploides las cuales despues de doblar sus lotes de cromosomas nos llevana la obtenclon de plantas homoclgotas. Estos metodos presentas c1ertasventajas durante el proceso de mejoramiento:a) la fljacion de un hibrido por haplornetodos permite acortar 5 afios elproceso.

b) facilita el anallsls genetlco debido a que los genes recesivos se expresa-ran en la primera generaclon.

c) la dlploldizaclon permite recombinaciones genettcas nuevas que no seobservaban naturalmente.La tecnica m a s usada pero tamblen la mas dlficil es la androgenesis que

consiste en el desarrollo de un tejido haploide a partir del polen seguldo porla formaclon de una planta haploide.IV. CONSERVACION DE GERMOPLASMA

La conservaclon de plantas es un componente integral de los sistemasde agrtcultura sostenible y des de la perspectiva del mejoramiento de loscultlvos, la conservaclon de germoplasma valioso se ha considerado de altaprioridad por el Consejo Internacional de los Recursos Fttogenettcos (lBPGR.en Ingles). Se ha estimado que de mas de 240.000 especies de angtospermasen el mundo, algo mas de 300 se han utilizado en un tiempo u otro, sinembargo. son doce cultivos principalmente los que proveen a la' poblaclonmundial de allmento. 10 que indica que el hombre depende para su alimenta-cion de unas pocas especles de los miles de angtospermas en el planeta. Comoresultado de conocer su Importancla, se ha dado gran enfasls a la necesidadde preservar los recursos fltogenetlcos como forma demantener la biodiversidad.Mas adelante se comentara sobre los metodos de conservaclon de germoplasmadando enfasts a la conservaclon in vitro.



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FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL CULTIVODE TEJIDO:

Ventajas que presenta el cultivo de tejidos para la conservaci6n degermoplasma:a) se puede almacenar un gran numero de clones en espacio reducido.b) el germoplasma se encuentra libre de patogenos. virus 0Insectos.c) los costos de mantenimiento se reducen sensiblemente.

I. EL INOCULO 0 EXPLANTEEs el organo, tejido 0 fragmento de tejldo, celulas, etc. exclsado del

material parental para Iniciar el cultivo in vltro. La elecclon del explanteadecuado constituye el primer paso para el establecimlento de los culttvos,este vartara de acuerdo al objetivo perseguido. En general. factores como elgenotipo. edad de la planta y su estado fisiologico son lmportantes deconsiderar.II. FACTORES FISICOS

pH. Intercambios gaseosos. humedad, luz y temperatura.- pH: el grado de acidez 0alcaUnidad (pH)del medio de cultivo es importan-te y especiflco para cad a tipo de plantas. al Igual que ocurre en el suelo,por 10 que se hace necesario ajustarlo a los requerimlentos de la especieen estudio. Sin embargo. el pH adecuado estara en un rango de 4.5 a 7para las plantas.

- Intercambio gaseoso: los gases mas corrientes son 02 (oxigeno),CO2(dloxtdo de carbone). y C2H4 (etileno).- La humedad: en condiciones invitro la humedad dentro de los recipienteses casi 100 %. Por eso la planta in vltro en general no desarrollaadecuados sistemas de regulaclon hidrlca tales como cera. estomas.cuticula. etc.

- La luz: en condiciones in vitro clastcas, la Intensidad y calldad de la luzes muy bajo (10 W1m2 en comparaclon de condiciones naturales dondela Iuz puede representar hasta 900 W1m2). La caUdad de la luz tamblen



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es muy baja y se recomienda mezclar diferentes tipos de luz en unamisma sala para tener diferentes longitudes de ondas. El espectro uttlpara los vegetales es de 400 a 700 nanornetros. Dos fenomenosimportantes dependientes de la luz son: fotosintesis y fotornorfogenests.Fotosintesis: es el proceso por medio del cuallas plantas en presenciade luz, agua y en los doroplastos incorporan el dloxldo de carbona paraformar los compuestos organlcos que le permlttran crecer y reprod ucirse.

CO2 + 1\0 -- CARBOHIDRATOS + 02Fotomorfogenesis: La luz es un factor importante en la morfogenests.La morfogenests funciona con la presencia de ptgmentos suceptibles aradlacion azuly roja. Las funciones mas conocidas son las del plgmentosuceptible al rojo: fitocromo (rojo 660 nm y rojo lejano 730 nm);expansion foliar, elongaclon de entrenudos, dlferenclacton de estomas,sintesis de cloroflla. etc.

ID. FACTORES QUlMlCOS- EImedio de cultivo: consiste de una mezcla de determinadas sustanciassobre 0dentro del cual crecen los explantes Un6culos). Para su usc, elmedio de cultivo se esteriliza ya sea en autoclave 0por flltraclon a travesde filtros de papel miliporosos.

EL MEDIO DEL CULTIVO

Como se menclono anteriormente, para mantener la viabilidad de uncultivo de tejidos, estimular su dlferenctaclon y gutar su crecimiento, esterequerlra de una dieta balanceada de nutrientes y hormonas.

Los medios de cultivo son combinaciones de sustancias quimlcas que losInvesttgadores han descrito despues de numerosos experimentos y quepermiten que las plantas crezcan y se multipUquen in vitro,

Los ingredientes de un medio de cultivo vegetal pueden clasificarse en:1) sales Inorganlcas (minerales), 2) compuestos organtcos, 3) preparacionesnaturales complejas y 4) materiales inertes.



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I. SALES INORGANICASLos esfuerzos realizados para optimlzar las necesidades de plantas

especificas. han dado como resultado numerosas formulas de mezclas desales. Sin embargo. los elementos mayores esenciales que todas las plantasrequiereny que estan presentes en los fertillzantes comunes. tamblen formanparte de los medios de cultivo: Nltrogeno (N).Fosforo (P). Potasio (K).Azufre(5). Calcio (Ca). Magnesio (Mg)y Hierro (Fe).

Adernas de los elementos menores, que tamblen son esenciales pero quese requiere en cantidades extremadamente pequefias: Boro (B). Mollbdeno(Mo).Manganeso (Mn).Cobalto (Co).Zinc (Zn).Cobre (Cu). Cloro (Cl)y Iodo (I).

Una de las mezclas de sales mas usadas es la descrita por Murashtge ySkoog. Esta es conocida como formula MSy es descrita mas adelante.II. COMPUESTOS ORGANICOS

En esta categoria se encuentran sustancias comocarbohidratos. hormo-nas 0reguladores de crecimiento. vitaminas y algunos otros compuestos quese han descrito como beneflciosos para el cultivo de tejidos: arnlnoactdos,amldas, purinas y pirimldinas y acidos organlcos.

- Los carbohidratos: son sustancias organtcas como los azucares queproveen tres de los elementos mayores esenciales: Hldrogeno (H).Carbono (C)y Oxigeno (0).

Los azucares son producto de la fotosintests, proceso por medio del cualla planta convierte el dloxtdo de carbono y agua en carbohidratos con la ayudade la cloroflla y la luz. Sin embargo. las plantas que crecen in vitro. debido ala baja intensidad lurninlca, no pueden fabrtcar todo el azucar que requieren.por 10 que se adicionan altas concentraciones de sacarosa al medio de cultivo.

- Hormonas: las sustancias hormo-nales criticas en el cultivo detejidos son las auxinas y las citoquininas. Estas intervienen en la elongactony division celular, formaclon de brotes y rakes y en la germlnacton de lassemillas.

Entre las auxinas mas utillzadas en el cultivo de tejidos se encuentra:acldo lndolacetlco (A.I.A.).acldo naftalenacetlco (ANA).2.4-D. picIoram. Entrelas citoquininas se encuentra: benzilaminopurina (BA).la kinetina y zeatina.



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Las glbereltnas y el acldo absfclco son tamblen utUizadas en algunoscasos.

- Vitaminas: la vitamina que se ha demostrado consistentementecomo importante en el cultivo de tejidos es la tiamina. Sin embargo. otras hansido utillzadas con frecuencia por estimular procesos especificos: blotlna,acldo mcotinlco, plrldoxlna, pantolenato. riboflavina.

- Aminoacidos: entre los arnlnoacldos y amidas que se han mostradomas frecuentemente como beneficiosos esta Lvarglnlna, L-acido asparttco, L-glutamlna, L-acido glutamlco y L-tirosina.

Otros compuestos organlcos comunmente empleados en el cultivo detejidos son el inositol. adentna, sulfato de adenlna. el acldo citrico y elasc6rbico (para evitar la oxldaclon de los tejidos).ID. PREPARACIONES NATURALES COMPLEJAS

Una gran variedad de sustancias de composlclon indefinida han sideutUizadas para enriquecer los medios de cultivo. Entre elIas se menciona:extracto de malta. agua de coco. extracto de levadura. pulpa de banano,case ina hidrolizada y jugo de naranja y tomate.IV. MATERIALES INERTES- Geles hurnedos que actuan como agentes de soporte: agar. gelrtte, fltogel.- Carbon actlvado que en bajas concentraciones contrarresta efectosnegativos que producen algunas sustancias liberadas al medio por elcultivo (fenoles).



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FORMULACION DE SALES DE MURASIDGE Y SKOOG tDebido a que esta formula es frecuentemente usada en la

mlcropropagacton de un gran numero de especies vegetales, se describe acontmuaclon:

MacroelementosCompuestos mg/L

16501900 . ,.

440370170

Microelementos6.2

MnS04I\O 16.88.6

KI 0.830.250.0250.025

Hierro37.327.8

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LA PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO

Se expllcara con detalle el procedimlento de preparaclon de los medlosde cultlvo, de manera que el estudiante que se inicia en el area del cultivo detejidos encuentre aqui una guia. Debe tener en cuenta que exlsten en elmercado formulas completas listas para su uso que podran usarse cuando elproceso es rutlnarto, sin embargo. estas son mas costosas. Debido a que elmedio de cultivo es uno de los factores mas importantes en el exlto del procesoes importante trabajar con cuidado y despacio al principio para poderanticipar las consecuencias de cada accton y famlliarizarse con el equtpo,crtstaleria. etc.

Preparacion de las soluciones madre:Por 1 0 general. la preparaclon del rnedto de cultivo se inicia preparando

soluciones concentradas (madre) de uno 0mas compuestos. Determinadovolumen de cada una de estas soluciones se mezclara mas tarde para prepararel medio de cultivo final. Es recomendable preparar las soluciones madre encantidades relativamente altas y con antelaclon para ahorrar el tiempo y eltrabajo que implica pesar cada uno de los ingredientes cada vezque se preparaun medio de cultlvo. Ademas, como muchos de los componentes(mlcroelementos. vttamlnas, hormonas) son requeridos en pequenas cantida-des. si se multi plica esa cantidad por un determlnado numero de veces parapreparar la solucion madre. la labor de pesado sera mas facll y m a s precisa.La concentraclon de la solucion madre debe ser un factor a considerar.Soluclones madre muy concentradas tienden a formar precipitados. Enalgunos cas os estos precipitados son el resultado de mezclar suatanctasincompatibles, por ejernplo, calcio y fosfato 0sulfate, magnesio y fosfato. Esrecomendable que la soluclon madre no sea mayor de 100 veces (1OOX ) laconcentracton final del medlo, sin embargo. el volumen de medio a prepararpor semana en el laboratorto dara la pauta para considerar el grado deconcentracton de la solucion madre. 51 la soluclon madre presenta preclpl-tados es mejor des carta rIa ya que no poseera el balance adecuado desustancias. alguna proporclon de estas. estara en el fondo con el precipitado .. La caUdad del agua:

Otro punto importante de tener en cuenta es el uso de agua destonfzada(desmineralizada), destilada 0bidestilada para la preparaclon de los mediosde cultivo.



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-Almacenamiento de las soluciones madre:Las soluciones madre deben ahnacenarse en el refrtgerador. Nose puede

dar un dato exacto de cuanto tiempo pueden permanecer almacenadas sin quesufran detertoro, pero como regla general. los compuestos Inorgarucos sonmas estables que los organtcos, por 10 que se ha recomendado almacenarauxlnas y citocininas por un maximo de 2 semanas y los otros componentespor 2 meses, sin embargo. si se observa un precipitado la soluclon debedescartarse inmediatamente.

Con un ejemplo se explicara como seprepara una solucioti madre (50X)tomando como base Iaformula de sales minerales de Murashige y Skoog.

Preparacion de los macroelementos y microelementos:NH.NOs la formula indica 1650 mg/I en el medio de culttvo, por 10 tanto.para preparar una soluclon SOX (50 veces mas concentrada. que sera

suflctente para preparar 50 litros de medio de cultivo) multipUque 1650 mg x50 = 82500 mg (82.5 g).De Iamisma manera multlpllque la cantidad indicadapara cada uno de los otros macroelementos. En un halon aforado de 1 litroque contenga aproxtrnadamente 500 ml de agua destilada agregue lascantidades pesadas de cada uno de los macroelementos. aglte y Ilene el haloncon agua hasta la marca de aforo. Vuelque el balon de manera que quede unaburbuja en el fondo y agite varias veces. Replta unas 2 veces. Transfiera lasolucion de macroelementos a una botella para su almacenamiento en elrefrtgerador, Etiquete la botella. Noolvide escribir la formula que uso (MacroMS). concentraclon (SOX).fecha, nombre de la persona que los prepare. Pararecordar la cantidad a agregar por litro de medio de cultivo a preparar recuerdedividir 1000 mI / 50 = 20 ml de la solucion madre / 1 litro de medio de cultivo.Repita la operacion pero con los microelementos.

Preparacton del Hierro:Para preparar la solucion madre de hierro. ponga a hervir aproxlmada-

mente 700 ml de agua bidestilada (destilada 0desionizada dependiendo de lasfacilidades con que disponga) en un erlenmeyer de 1000 mi. cuando estahirviendo agregue la cantidad pesada de Na~EDTAy FeS04.7f\O (recuerdeque esta preparando una soluclon madre SOX. por 10 tanto. multiplique lacantidad indicada en la formula por 50) hasta que desarrolle color. Tapela ydejela enfriar en un lugar oscuro. Cuando este a la temperatura ambientetransflerala a un balon aforado y agregue agua hasta Ia marca de aforo.

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Almacene en el refrtgerador en una botella ambar para evitar lafotodescompostclon. Si no dispone de botella arnbar forre una botella conpapel aluminio. Identifiquela.Preparaci6n de la soluci6n madre de 1 a hormona:

Cada hormona se prepara por separado y las mas frecuentemente usadasse preparan de manera similar. Ejemp)o. Soluclon madre de Benciladenina:Pese 25 mg de BA. en un balon aforado de 250 mi. agregue la hormona y 5mlde agua. Con un gotero agregue lentamente y con agttacion HCII Mhasta queel BA se disuelva. Agregue agua para completar el volumen. Esta soluctonprovee 0.1 mg de BApor mlde soluclon madre. Si para el medio de cultivo queprepara se indica adicionar 1 mg de BA por lltro. se deberan tomar 10ml dela soluclon madre para obtener la cantidad recomendada. Para aquellasconcentraciones que se indiquen en ppm (partes por mlllon) recuerde que 1mg/l equivale a Ippm.

Preparaci6n del medio de cultivo:Yase han preparado las soluciones madre. ahora se procedera a preparar

el medio de cultivo. Para esto tomaremos como ejemplo el medio de Inlclaclonpara banano.

Se pre para 1 litro de medio de lnlclacton de banana el cual consiste enlas sales MS. 100 mg/l de mlo-Inosttol, 1 mg/l de BAP. 30 mg/l de sacarosay 7gil de agar. EI pH se ajusta a 5.7. En su libreta de trabajo en ellaboratorioordene cada componente de la stgutente manera y ponga una marca de vistobueno despues de agregar cada uno. asi podra revisar en caso de error 0duda:SacarosaMacro MSMicro MSFe-EDTAVitaminasBAPIO.IllIg/1)pHAgar

30 g20 ml (solucton madre 50X)20 ml (solucton madre 50X)20 ml (solucton madre 50X)10ml (soluclon madre 100X)10 ml5.6 - 5.87g

En un balon aforado de 1 lltro, agregue cerca de 400 mi de agua. PeseIa sacarosa y disuelva en el balon. Con la ayuda de pipetas graduadas mldael volumen de soluclon requerlda (no debe plpetear directamente de los frascosque contienen las soluciones madre. transflera volumenes pequefios de estas



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a erlenmeyers y pipetee de estos). Una vez que se han agregado la sacarosa,los macro, microelementos, el hierro, las vitaminas y hormonas afore conagua. Transfiera a un erlenmeyer y ajuste el pH (puede usar HCI0KOH 1Mo 0.1M). Agregue el agar y dtsuelvalo calentando la soluclon ya sea usandoel horno de microondas (aproximadamente 9 minutos por litro de medio decultlvo) 0 una hornllla 0quemador. EI medio esta listo para transferir a losfrascos 0tubos de cultivo (el medio debe transferirse estando caliente ya queal enfriarse se solldfflcaral. Esterilice en autoclave. 51no se va a usar el mediode cultlvo Inmedlatamente es recomendable guardarlo en refrtgeraclon.EJEMPLOS DE MEDIOS DE CULTIVO

A conttnuaclon se detallaran los medios de cultivo utlllzados en elLaboratorio de Cultlvo de Tejldos de CATIE para la mlcropropagacton debananos y platanos, cafe, orquideas, flame, camote, tlqulsque, valnillay yuca.Medios de cultivo para la micropropaci6n de lipices de Musa sp. (Bananos YPlatanos):

Iniciaci6n Multiplicaci6n DesarrolloS a c a r o s a 30 gIl 30 gIl 30 gILM a c r o M S M S M SM i c r o M S M S M SV i t a m i n a s M S M S M SBAP 1mgll 3 mgllpH 5.7 5.7 5.7agar 7 gIl 7 gIl 7 gIl 7 gIl



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Mediosde cultivo para la micropropagaci6n de microestacas de car~:Iniciaci6n Multiplicaci6n Enraizamiento* ** ***

Sacarosa 15 gIl 30 gIl 15 gIlMacroMicroelementos MS MS 1 1 2 MSVitaminas Morel Morel MorelPVP 10 gIlBenlate 1 gIlBAP 5 mgll 1 mgllAlB 100 mgllANA 25 mgllKinetina 5 mgllpH 4 . 8 5.6 5.6

Agar 7 gIl 7 gIl

EI benJate debe permanecer en el medio 15 diaa, despues de esteperiodo se prepara el mlsmo medio pero sin benlate y el pHse ajusta a 5.6. Losexplantes permanecen en la oscuridad. Una vez que brotan las estacas setransfieren al medio de multtpllcaclon .

Este medio tarnblen se utillza como medlo de desarrollo de lasmicroestacas. antes del enraizamiento pero la concentraclon de BAPse red ucea 0.3 mg/I. Duranteestos periodos los explantes permanecen a la luz.

Las plantulas deben permanecer en este medio por 15 horas en laoscuridad.



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Medios de cultivo para la mtcropropagacton de vainilla:Para preparar este medio de cultivo se agregan 30 gil de sacarosa, las

sales minerales y vttamlnas MS. 125 mgl Ide carbon actlvado y se ajusta el pHa 5.8. Se adiciona 7gil de agar. Para la etapa de desarrollo se ellmina el carbonactivado del medio.Medios de cultivo para Ia mtcropropagacfon de Dioscorea (name):

Para la etapa de Inlciaclon se prepara un medio de cultlvo con las salesmlnerales y vitaminas de Murashtge y Skoog. se agrega 0.1 mg/I de BAP. Seajusta el pH a 5.7 y se adiciona 7 gil de agar. Para la etapa de desarrollo sepre para el mlsrno medio pero se ellminan los reguladores de crecimiento.

Medios de cultivo para Ia mfcropropagaclen de apices de Xanthosoma(tiquisque):El medio de Inlctaclon de tiquisque consiste de las sales mlnerales y

vttamlnas MS. 30 gil de sacarosa y 0.1 mgll de BAP. Para el periodo demultlpllcaclon se prepara el mismo medio pero con 3 mgll de BAPy en la etapade desarrollo se ellmina la hormona. En todos los casos el pH se ajusta a 5.8y se agrega 7 gil de agar. Los explantes siempre premanecen en presencia deluz,Medio para Ia micropropagacion de apices de Ipomoea batata (camote):

Para la Inlciaclon y multlpllcackin de camote se prepara un medio decultlvo con 30 gil de sacarosa, sales minerales y vitaminas MS. 0.1 mgll deANAy 0.1 mg/I de BAP. El pH se ajusta a 5.8 y se agrega 7 gil de agar. Parala etapa de desarrollo se ellminan las hormonas del medio de cultlvo. Losexplantes permanecen en conclctones de luz.



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Medios de cultivo para Ia mlcroprcpegacfen de orquideas (iniciando consemillas):

Para la Inlctaclon 0germtnacton de las semlllas se prepara un mediocon 30 gil de sacarosa y las sales minerales y vitaminas MS. Se ajusta el pHa 5.8 y se agrega 7 gil de agar. Para la multtpllcaclon y desarrollo de lasplantulas se prepara el medlo anterior pero se adicionan 200 mg/l de caseinahidrolizada y 400 mg/l de extracto de malta. Se puede adicionar 1mg/l de BAPa este medio si se desea acelerar la multtpllcacion.

METODOS DE DESINFECCION

El cultivo in vitro consiste en cultivar un explante con potencialidad dedlferenclaclon bajo condiciones aseptlcas en presencia de una dieta balancea-da de nutrientes y hormonas. Estas a la vez son condiciones ideales para elcrecimiento y prollferaclon de microorganlsmos contaminantes, de am quepodemos Imaglnar la importancia de losmetodos que usemos para desinfectarsuperflcialmente los explantes, esterillzar los medios de cultlvo, desinfectarlos instrumentos. la camara de transferencia de flujo laminar y limpiar loscuartos de trabajo,

- Material vegetal:El procedimiento de destnfecclon superficial del explante debe ellmlnar

los microorganismos pero a la vez debe causar el menor dana posible alexplante. Varios compuestos se han recomendado y entre los mas usadosestan el hipoclorito de sodio (cloro comercial del2% aI5%) y de calcio (del 6%aI12%) que se recomienda como menos toxlco y el etanol (70%). Tarnbien seha recomendado la adiclon de un detergente (2 a 4 gotas de Tween-20) pararomper la tension superficial y permitir que el explante este en mejor contactocon el quimlco, Por ejernplo, para desinfectar ramas ortotroplcas de cafe quese colectan en el campo. primero se enjuagan con agua corrtente, se incubanen hipoclorito de calcio all 0% por 30 minutos y luego en hipoclorito de calcioal 8% por 20 mlnutos, en la camara de transferencia de flu]o laminar seenjuagan con agua destllada esterll al menos 3 veces antes de inlciar su cultlvoin vitro. El uso de anttblottcos se recomienda como ultima alternativa paralimpiar los explantes. estos pueden Influlr negativamente en otros procesosdel cultlvo.



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No se puede generallzar sobre el tlpo de desinfectante 0la concentraclonde este a utlllzar ya que cada especie y tipo de explante es un caso particular10 que resalta la importancia de experimentar con diferentes metod os utlllzan-do un numero reducido de explantes. Sin embargo. se puede decir que laconcentraclon mas liviana de desinfectante que sea efectiva contra la conta-mlnacton de determinado explante es la mas adecuada. si es mas dUuida queesta no se ellmlnaran los microorganismos y si es mas concentrada sequernara el explante. Para facilitar la limpieza del explante es importanteconsiderar que los brotes nuevos son mas limpios que los viejos. materialesque crecen en el invernadero son mas limpios que los que se mantienen en elcampo yentre mas pequefio sea el explante a introd ucir a cultivo in vitro menorsera la contammacion a ellmlnar, sin embargo. el tamafio debe ser tal quefacilite el establecimiento del tejido. Otra recornendaclon que se ha formuladoes el uso de antioxidantes si se observa coloracion cafe en el explante duranteel proceso de destnfecclon. Por ejemplo, 100 mg de acido ascorblco y 150 mgde acldo citrico en un litro de agua destilada. Esta solucton de antioxidantesse esterUiza yen ella se sumergen los explantes antes de iniciar el proceso dereducclon de su tamafio para iniciar el cultivo.

- El medio de cultivo:Por 10 general el medio de cultlvo se esterillza en el autoclave a una

presion de 115 lb. (l212C) durante 20 mlnutos, sin embargo. el tiempo deestertllzaclon dependera del volumen de medio. Otro metodo muy utilizadoes la estertllzaclon en frio utUizando para esto filtros miliporosos que puedenretener hongos y bacterias. Para esta operaclon es necesario esterUlzarprimero tanto los recipientes como los flltros que se usaran, Para facilitar estetipo de esterlllzacton una operon podria ser la utlllzaclon de aparatos deflltracton previamente esterUizados y desechables que se encuentran en elmercado.

- La cristaleria:La cristaleria debe lavarse con detergentes que se eliminen factlmente

con agua, Es recomendable que la crtstaleria que haya estado en contacto conaltas concentraciones de hormonas se enjuague con etanol al 70% antes delavarla con agua y detergente para asegurarnos de eliminar los residuos. Unavez finalizado el proceso de lavado es recomendable dar un ultimo enjuaguecon agua destllada.



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- La camara de transferencia deflujo laminar:La camara de transferencia de flujo laminar esta provtsta de un flltro

HEPA(elcual no debe ser tocado debido a su fragilidad) que permite que el aireque suavemente circula a traves de la camara sea estertl. Esto permite altecnlco abrir libremente los tubos y realizar las transferencias de manerarazonablemente segura. Sin embargo. antes de iniciar las labores debe limpiarlas superflcies de la camara (mesa y paredes interiores). para esto se utiUzaalcohol de 702 Otra recomendacton que ayudara a mejorar la tecnlca detraba]o en la camara es nunca colocar beakers. frascos de cultivo u otros, alfrente del area de trabajo ya que esto interrumpe el flujo de aire estertl. UtUicelas 3/4 partes mas internas de la camara para trabajar y coloque cerca dedonde se abren los frascos de cultivo el mechero 0quemador. de manera queno tengan que permanecer abiertos por mucho tiempo. Estas practtcas Ieayudaran a reducir la contammacion en los cultivos.

- Los instrumentos de trabajo:La tecnlca cornunmente utilizada para esterilizar los instrumentos

metalicos, plnzas, btsturies. tijeras. etc. es el flarneo previa Inmerston enalcohol de 952 Si se usa vidrio como base para las operaciones de transferen-cia este puede asperjarse con alcohol de 952 y flamearse. Cuando se utilizanplatos petri 0papel, estos deberan esterilizarse antes haciendo uso delautoclave. Otra recomendaclon uttl es la de asperjar el exterior de los frascosde cultivo, agua estertl, etc. con etanol para asi reducir las posibles fuentes decontarnlnacion.

- El cuarto de transferencia:La limpieza del cuarto de transferencia es un factor importante para

lograr el exlto. Este debe Ilmpiarse con desinfectantes y a fondo. Esrecomendable hacer la limpieza al final del dia de manera que a la mananaslgutente el cuarto este libre de olores y se pueda iniciar el trabajo temprano.Nodebe permitirse el ingreso de alimentos a esta habltacion.

- El tecnicotEItecnlco debe ser cuidadoso en las operaciones que realiza, estar atento

a no hacer movimientos bruscos dentro de la camara de transferencia para nointerrumpir el flujo de aire. Antes de iniciar labores de transferencia de20 Digitized byGoogle


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cultivos es recomendable que limpie sus manos y brazos con alcohol. usar unabata de laboratorio limpla y trabajar a brazos extendidos de manera que puedahacer las manlpulaclones en la parte mas interna posible de la carnara y a lavez que el allento de su resplraclon no llegue a los explantes evitando con estocontamtnaclon.

EMBRIOGENESIS SOMATICA Y SUSPENSIONESDE CELULAS

Estas tecnlcas tuvieron su ortgen en el concepto de Totlpotencia enun-ciado por Haberland en 1902. Totipotencla stgnlflca que todas las celulasvegetales tienen la capacidad de formar plantas completas.

La totlpotenclalldad de la celula vegetal se debe a la particularidad quetlene cualquler celula vegetal de perder su dfferenctaclon (desdlferenctactonl.

Los primeros resultados a favor de esta teoria fueron los obtenldos porReinert en 1958 y Steward et al. en 1958. Estos Investtgadores lograronInduclr la forrnacton de embriones sornatlcos a partlr de raices de zanahorla.A la fecha se han reallzado clentos de estudios con dlferentes plantasconflrrnadose los resultados anteriores. Algunas revisiones sobre laernbrtogenests somatica se pueden encontrar en: Tisserat et al. 1979:Ammlrato 1983: Evans et at. 1981: Vasil 1982.

EMBRIOGENESIS SOMATICA

La embrtogenests se refiere a la forrnaclon de un ernbrton somatico apartir de celulas somatlcas que no son el producto de la fusion de gametos.Esta termlnologia fue utllizada por Tokin en 1963 para describir la forrnaclonde un individuo a partir de una 0varlas celulas somattcas, Sin embargo. estefenomeno no debe confundirse con la organogenesis.Caracteristicas de un embri6n somatfcos

Son estructuras bipolares con un eje radical-apical, y no poseen conexlo-nes vasculares con el tejido materno (generalmente alslados por una epider-mls). Esta estructura es capaz de crecer y formar una planta completa. Enmuchos aspectos de su desarrollo los embriones sornatlcos mantienen una



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slmilitud con los embriones ctgotlcos. Sin embargo. pueden ocurrir anorma-lldades en el desarrollo como por ejemplo la fusion de los cotUedones.Embriogenesis directa 0indirecta:

Aunque a veces esta distinel6ri no es admttida es importante resaltar quela embrtogenesls somatlca puede acornpanarse de un fen6meno llamadocallogenesis 0formaclon de un cal!,p(un calla puede ser definidos como unconjunto desorganizado de celulasvcapaces de dlvldlrse, pudiendo sermertstemattcas 0embriogenicas).' Es :~l~~lltado de la totipotenelalidad.Factores que afectan Ia embriogenesis somatica:

Ala fecha existen muchas teorias sobre la embrtogenesla somatlca y losfactores que favorecen este proceso. sin embargo. no parecen existir reglas nirecetas universales.El Explante:

En base a la definicion de totipotencia, vlrtualmente todos los tejldosvegetales tienen capaeldad para formar embriones sornancos in vitro. Sinembargo. dependlendo de las especies y de las condiciones de cultlvo. pocosexplantes son capaces de inielar la embrtogenests somatlca, En general. losexplantes util1zados con mas exlto en varias especies de la mayoria de lasfamjltas. de plantas son 10$ eotlledones, los hlpocotllos y los embriones. SinemhB:rgo. tamblen se umi~l?n los apices. segmentos de hoja, raices eInflorescenclas. Por ejernplo, los embriones clgottcos inmaduros han resul-tado el explante m a s favorable para Inducir la embrtogenests somatlca en lamayoria de los cereales. Tamblen se han util1zado las hojas en sorgo. cafe ypalmaceas y las nucelas en citrtcos y mango. En general se puede admitir queentre mas joven sea el tejido util1zado Iestadio juvenil poco diferenciado) masfacll sera desviarlo de su programa genettco y asi obtener la desdtferenclactonhacla la formaclon de ernbrtogenesls somatlca.

Segun Lttz, 1984 YDhed'a et al, 1991, un factor a considerar es quemuchas veces dentro de una misma especle, las reacciones de las diferentesvariedades pueden ser muy diferentes. Asi. un metodo establecido para uncultivar 0varied ad podra no aplicarse a otro indlviduo de la misma especle.

La semilla y sus tejidos juegan un papel muy Importante en el desarrollodel ernbrton ctgotlco. Los tejidos en .muchas especles crean barreras quepermiten regular el lntercarnblo gase'oS6 asi, el oxigeno disponible para elctgoto es limitado. Anivel de nutrtcton, los teiidos de la semilla como la nucela



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y el endospermo proveen al clgoto los elementos necesarios para su desarrollo:carbohldratos. Iipldos y proteinas. Los tegumentos juegan tarnblen un papellmportante en la regulacton de la luz.Factores Extemos:

En contraste con los esfuerzos que se han dedicado al estudio de losmedios de cultivo y las sustancias de crectmlento. pocos Investtgadores se handedicado a estudiar el efecto de los factores ambientales.Eloxigeno:

EI nivel del oxigeno en cultivo de tejidos depende de los gases presentesalrededor y dentro del recipiente de cultivo y de su proporclon. EI nivel deoxigeno dependera entonces de la manera en que se clerre el frasco de cultlvo,de Ia frecuencia de los subcultivos y del metabollsmo de los tejldos que rodeanal tejido embrtogenlco (callos). En trtgo, Carman (1989) demostro que bajasdosls de oxigeno favorecian la embrlogenests somatlca. Por otro ladeEngelmann (1990). trabajando con palma africana encontro que la conserva-cion de cultivos embrtogenlcos se favoreclo en presencia de una atmosfera al1% de 02 + 99% de N2ya que el nttrogeno des plaza rapldarnente el oxigeno.El medio:

Los medios sernf-solldoa son los mas empleados. Sin embargo. existenvartos estudios que demuestran la importancia del agente gellflcante : agar.gelrtte, agarosa.

Aunque en la fase de tntctaclon de Ia embrlogenests somatlca se utUizapreferencialmente el medio solido. el medio liquldo es muy utillzado en lamultlpllcaclon a gran escala.

'EI cultivo en medio liqutdo presenta varias ventajas:- Indtvtduallzacton de todos los embriones somatlcos.- Aumento del potencial embrtogenlco.- Aumento en la expreston de los pro-embrlones y por ende, un aumentodel nurnero de embriones sornatlcos

- Mejoramiento de la maduraclon de los embriones y como consecuenciamejorarnlento de la gerrnlnaclon de los mismos.



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EIproceso conslste en transferir el cultivo embrlogeruco a un erlenmeyercon medio llquldo con agttacton 0en bioreactores. Tarnblen se puede utiUzarel"Slstema de Inmerston Temporal". el cual ha sido desarrollado reclentemen-teo Este sistema consiste en sumergtr el cultlvo en el medio a intervalosregulares, por ejemplo, 4 veces al dia por un periodo de 1 minuto.EI medio de cultivo:

Por 10general. se utUiza elmedio de Murashlge y Skoog 0modificacionesde este.Sacarosa:

La sacarosa se utillza en nlveles de 2 a 3% (20 a 30 gIl). Sin embargo.exlsten varios estudios que demuestran que aItas dosls de sacarosa puedenfavorecer la embrlogenesls sornatlca. As], Wetherell (1984) reporto el uso desacarosa a 120 gIl en zanahoria. Por otro lado, Escalant y Teisson (1989)demostraron que en Musa fue necesario utilizar 60 gIl de sacarosa. SegunFiner (1987). otra ventaja que conlleva el utillzar altas concentraciones desacarosa (120 gil) es poder disminuir la dosls de auxina.Nitrogeno:

EI nltrogeno es ~in duda un elemento esencial en el cultivo de tejidos.Existen varias formas de sumlntstrarlo siendo las mas comunes el NH.(amonio) y el N03 (nitrato). Tamblen se puede complementar la dosls con elnttrogeno organlco provisto por amino acldos tales como glutamina y alanma,la caseina hidrollzada 0por el agua de coco.Carbon Activado:

EI carbon activado se utlllza principalmente para llmitar los problemasde oxldaclon asociados al cultivo de teJidos (ltberaclon de compuestosfenollcos que provocan la oxldaclon y muerte del tejido). EI carbon activadoadsorbe las sustancias quirnlcas en general. limitando asi su Intervenclon conel tejido cultivado. Con respecto a las auxinas y citocininas. se cree que elcarbon activado las retiene Ilberandolas progresivamente en el medio favore-ciendo asi la embrtogenests somatlca. Las dosts cornunmente utUizadas vande O.1 gl I a Igl 1 .



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Reguladores del Crecimiento:- Las auxinasDe acuerdo con Evans et al. 1981, en la mayoria de los sistemas de

embrtogenesls somatlca la ind ucclon requiere una concentraclon alta auxinao equivalente: AlA; ANA; 2.4-0; 2.4.5-T; picloram (4-amino-3.5.6-trichloropicolinic acid); dicamba. EI 2.4-D slendo el mas utiUzado. Lasconcentraciones utiUzadas son muyvariables (0.5 - 27.6pM hasta 450 pM enpresencia de carbon activado).

- Las citocininas:Las citocininas como el SAP.la kinetinay la zeatina son a veces utiUzadas

en el medio de Inducclon de la embrlogenests somatlca, Sin embrago sonmucho mas utiUzadas en la fase de dlferenclaclon y maduraclon del embrtonsornatlco.

- Otras sustancias:- En el caso de las especies lenosas, se ha recomendado incorporar el acldogiberellco (G~) con el fin de ayudar a la maduraclon y gerrnlnaclon delos embriones somaticos.

- El ABA0acldo abscislco puede favorecer la embrtogenesis somatlca. Entrigo, se observe que en ausencia de ABAel embrlon ctgottco utiUzadocomo explante primario germinaba (Javed. 1989). La adlclon de ABA(0.5- I mg/I) al medio de cultivo permite inhibir la germlnacton y aumentarlos porcentajes de callos ernbrtogentcos. Otro punta importante resideen el control que tiene el ABAsobre el desarrollo del embrlon somatlcoreduclendo la producclon de embriones anormales.



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SUSPENSIONES CELULARES

Los primeros ensayos de cultivo de celulas vegetales alsladas fueronreallzados por Haberlandt. Para 1937. en un estudio con celulas aisladas dela cofia de raices, Gautheret resalto la importancia de condicionar previamen-te el medio de cultivo (nodriza) antes de inocular las celulas aisladas.

Las suspensiones celulares consisten en celulas libres y agregadoscelulares puestos en un medio Hquldo en movimiento. Tales suspensionespueden ser permanentes mediante el suministro continuo de nutrientes.Inleiaeion de las suspensiones

Expiante: EI material comunrnente utilizado consiste en trozos detejidos friables de tipo "callo". A veces es necesarto, utllizar enzimas(pectinasas y celulasas) para liberar las eelulas. La calldad del explante iniciaIes muy tmportante, el mejor Inoculo consiste de un cultivo friable con un altoritmo de division celular, por ejemplo, un cultivo embrlogentco el cual es untejido friable constituido por celulas embrtogenlcas y proembriones somatlcos.

Recipiente: Por 1 0 general el lnoculo se siembra en erlenmeyers. Sinembargo. debido a la gran importancia de la relaclon volumen de medio yvolumen del Inoculo es aconsejable algunas veces utilizar recipientes de tipo"Multi-Well Tissue Culture Plates" 0 sea. cajas de petri con varias celditas.Para la produccion mas iva de celulas 0 metabolitos secundarios a nivelindustrial se utiliza los "bloreactores".

Muchos de los trabajos publlcados sobre suspensiones celulares resal-tan la importancla de la densidad del Inoculo en el exlto de las suspensiones.En general se recomienda empezar con volumenes pequefios de medio (10 a50 ml)Yun Inoculo de 2 a 5 g (peso materia fresca).Caraeteristieas de las suspensiones eelulares:

En su fase de Inlciacton las suspenslones celulares cons tan de variostipos de celulas:- Celulas diferenciadas sin capacidad de division: son celulas aIargadas ygrandes con una vacuola enorrne y un citoplasma reducido con unnucleo pequefio.



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- Celulas mertstemattcas: mas pequefias, con un citoplasma mas densoocupando todo el espacio intracelular.

- Celulas embrtogenlcas: con un citoplasma ocupando todo el espacioIntracelular, sustancias de reservas como almldon, proteinas y Iipidos.En resumen. durante el periodo de Inlclaclon Iasuspensiones celulares

constan de varios tlpos de celulas asi como de agregados de diferentestamanos y en ciertos casos de proembriones y embriones somatlcos.Desarrollo de la suspension de celulas

EI desarrollo de Ia suspension celular, por 10 general. comprende tresfases: una fase inicial de latencia durante la cualla densidad de celulas noaumenta: una fase de alto crecimiento durante Ia cual el volumen celularaumenta y una ultima fase llamada "estacionaria" durante la cual el erect-miento se manteniene constante y el volumen celular no aumenta. Elcrecimiento de una suspension de celulas es por 10 tanto de tipo exponencial.

EI desarrollo de Ia suspension celular esta relacionado con variosfactores:- Tipo de explante inicial.- Calldad del medio de cultivo: reguladores del crecimiento. compuestosorganlcos y minerales.

- Condiciones ambientales: relaclon oxigeno/C02. luz/oscuridad.- Velocidad de agttaclon (60 - 100 rpm).- Densidad en materia celular: relacton volumen de celulas I volumen demedio.

Es dificUestablecer reglas en 10 que concierne a estos parametres. sinembargo. en la gran mayoria de los casos, se recomienda un cambio de medlocada semana (en ciertos casos cada 3 dias). Varios estudios han demostradoque durante la fase de crecimiento la suspension celular puede acabarrapldamente con varios de los nu trientes. Por ejemplo, Browny Beevers (1987)demostraron que en suspensiones de arroz. el fosfato y el azucar del mediofueron limitantes despues de 7dias de cultivo. Existe tambien gran evidenciade que la division celular se favorece en presencia de reguladores tipo auxinacomo el 2.4-D: el picloram. etc. Por el contrarlo, la forrnaclon de embrionessomatlcos requiere de una dtsmtnuclon en la concentraclon en auxina y laIntroducclon de citocininas al medio de cultivo.



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Tarnblen es muy importante conslderar el cultlvo de celulas en presenciade "nodrizas". En efecto, en Ia mayoria de los casos, cuando se trata desuspensiones de celulas aisladas (es decir obtenidas a traves de un flltro de50 j4 ) la division celular y el crecimiento de estas celulas dependen de lapresencia cercana de un tejido "nodrlza" que proporcione a las celulas losmetabolitos necesarios.

Existe varlos tipos de nodriza como por ejemplo: los callos embrtogenlcoeo mertstematlcos, EI cultivo con nodriza puede realizarse en varias formas.Una es el cultlvo de las celulas aisladas en presencia de nodrtzas (callo)en sualrededor 0tam bien se puede precondicionar un sustrato dejando la nodrizaun cierto tiempo y removlendola al momento de inocular las celulas aisladas.Se plensa as! que las sustancias necesarias al buen desarrollo de las eelulasaisladas son proporcionadas a traves del medio de cultivo.

Una vez que las condiciones de cultivo son establecldas. se puedemultiplicar una suspension. Para esto se realizan divisiones sucesivas de lamasa celular colocandose estas en otros recipientes.Evaluaci6n del crecimiento:

Existen diferentes metodos para Ia evaluaclon del crecimiento de unasuspension de celulas.Conteo de celulas:

Es necesario en este caso tener una suspension sin agregados grandee,de 10 contra rio se haria necesario un tratamiento con enzimas tipo pectinasa(0.1% durante 16 h a 262C). EI conteo se realiza usando un microscopio.Determinaci6n del volumen celulari

Se toma una fracclon de Ia suspension celular y se transflere a un tubograduado de centrifugacton. Despues de centrifugarla durante 3 minutos a2500 rpm. el material celular sedimenta y se puede apreciar el volumencelular, Se expresa en mi de celulas por ml de medio. Este metodo deevaluaclon es facll y rapldo. Ademas, puede realizarse en condicionesestertles, 10 que permite conservar la totalidad de Ia suspension.Pesofresco

Peso seco Turbidez:



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Usando un fotocolorimetro con filtro azul (400-465 nm). Indice miiotico:

Consiste en la evaluaclon del numero de celulas en estado de mitosis.Este Indlce se calcula de la slgutente manera:

1M= Celulas en mitosis xtotal de celulas

1 0 0

Regeneracion de plantas a partir de suspenstones celulares:La regeneracton de plantas completas a partir de suspensiones celulares

puede ocurrir mediante varios procesos tales como: calla + organogenesis;calla + embrtogenests sornatlca 0 embrtogenests somatlca "directa". Por 10general. la regeneraclon a partir de callos ocurre despues de "platear" unaaUquota de la suspension sobre un medio semi-solido adecuado. La formaclonde plantas a traves de la embrtogenesls somatlca puede ocurrir directamenteen el medio liquido 0despues del "plateo" sobre el medio seml-soltdo.

En general. el desarrollo de plantas a partir de suspensiones celularesrequiere una dlsmlnuclon de las auxinas y la Introduccion de citocininas.Tamblen puede ser muy uttl la presencia del acldo abscisico (ABA)comoregulador de las divisiones celulares. EI ABA favorece la obtenclon deembriones sornattcos bien formados (evita los problemas de embriones plurt-cotUedonarios) y tamblen lagermtnacton y la obtenclon de plantas completas.



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METODOS DE CONSERVACIONDE LOS RECURSOS FITOGENETICOS

Durante los ultlmos anos el germoplasma vegetal. al Igual que otrosrecursos naturales. se esta perdiendo en forma alarmante, en muchos casosantes de percatarnos de su exlstencla, su potencial y su valor real. Ladestruccton de los habitat. la selecclon natural. los agentes btotlcos yparadojtcamente, el abandono de las variedades tradicionales en favor de lasnuevas variedades mejoradas, han sldo los factores involucrados en estaerosion genetlca. Recordemos que el germoplasma vegetal es un recursoirrenovable y que es vital para la seguridad allmentaria de la humanidad y porende para un desarrollo sostenible. Debido a esta erosion genenca aceleradade las especies vegetales se ha despertado gran Interes por desarrollarmetodos eficientes para conservar el germoplasma, esto es, preservar con lamayor integridad posible toda la variabilidad dlsponlble en una especie dada.I. CONSERVACION IN SITU

Idealmente ladiversidad vegetal deberia conservarse in situ coexistiendocon otros organismos vivos en su ambiente natural. .Sin embargo. diferentesexperlenctas sefialan que a fin de garantizar la exlstencla del recurso, serequlere de otros metodos de preservaclon. Como resultado. se han desarro-llado sistemas de conservaclon ex situ.II. CONSERVACION EX SITU

Estos metodos dependeran del tipo de propagaclon de la especie enparticular y /0el tipo de semilla que presentan.Los bancos de semillas:

En general los bancos de semillas son adecuados para la conservaclona largo plazode especies con semillas ortodoxas, es declr, semillas que resistenalto grado de desecaclon y almacenamiento a bajas temperaturas (entre 50Cy -20OC).Sin embargo. este tlpo de almacenamiento es inadecuado 0imposiblepara un alto numero de cultivos debido a que poseen semUlas recalcitrantes(no resisten la desecaclon y el almacenamiento por largos periodos sin perderrapldamente la vlabllidad),0son propagados vegetativamente. Este es el casodel cacao. coco. mango. hule, banano, aguacate, yuca, ptna, cafe. pimienta ymuchos otros cultivos. Para la conservaclon de especies con semillas



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recalcitrantes 0 propagadas vegetativamente las colecciones en el campo ymas reclentemente, las colecctones in vltro representan altematlvas a cons i-derar.Las coiecciones de campo:

Las colecciones de campo son dificiles de implementar presentandoseproblemas como la decision del tamafio adecuado de la muestra paraconservar la diversidad genetlca. Dependiendo de la especle, esta podriavariar desde unos pocos individuos hasta miles de plantas para podermantener la heterocigocidad. Esto impllca que el espacio requerido para laconservaclon sera considerable. mas aun cuando se piensa en conservaclonde especies forestales. Por otra parte. cuando se piensa en conservaclon a largoplazo este no serfa el metodo mas adecuado. Las plantas estan expuestas adesastres naturales. agentes blotlcos, errores humanos y camblos en laspolittcas instltucionales 0gubemamentales. Ademas.Jos costos de manteni-miento y labor son muy altos.Conservaci6n in vitro:

Con el desarrollo de las tecnlcas de cultlvo de tejidos es posible laconservaclon y el intercambio de germoplasma vegetal in vltro. La conserva-cion in vltro ha estado sujeta a dtscuslones, principalmente debido a que elgermoplasma debe mantenerse bajo estrictos controles de asepsia. Sinembargo. esto es precisamente 10 que permite el intercambio de materialvegetal entre paises sin pasar por el periodo de cuarentena. Esta tecnlca ofrecemuchas otras ventajas. por ejernplo, permite el almacenamiento de grannumero de especies en un espacio reducldo, se elimina el riesgo de ataquesde plagas y enfermedades. Para aquellos materiales de ciclos cortos se puedealargar los perfodos de transferencta, ademas, es posible producir y mantenerplantas libres de virus con altas tasas de multtplicacton y todo esto indepen-diente de las condiciones cllmatlcas.Bajo esta modalidad la conservaclon puede realizarse:1. a mediano plazo. modificando la tasa de crecimiento del cultivo paraalargar los periodos entre transferencias y por ende, disminuir los riegos devartaclon.2. a largo plazo 0crioconservaci6n que consiste en suprimir totalmente elcrecimiento y metabolismo del material almacenandolo a~ltra bajas tempe-raturas (rutrogeno liquldo, -196C)por tiempo indefinido.



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Oonservacton in vitro a mediano plazo:EI metodo consiste en mantener los cultivos (yemas. plantulas 0

meristemos) en condiciones flslca (factores ambientales) y quimlcas (compo-stolon del medio de cultlvo) que permltan extender al maximo el lntervalo detransferencia a los medios de cultivo frescos. sin afectar su vlabilldad yreduciendo la posibilldad de perdlda por manlpulaclon y contamlnaclon. Lareducclon en la tasa de crecimlento generalmente se logra dismlnuyendo enunos grados la temperatura del ambiente y /0 Ia intensldad de la luz,dependlendo la temperatura de almacenamlento de la sensibUidad de laespecie. Por ejemplo, IaRed Internacional para el Mejoramiento del Bananoy el Platano (INlBAP. en Ingles) conserva la colecclon mundial in vitro debananos y platanos bajo esta modalldad de crecimiento reducido almacenan-do los merlstemos apicales a una temperatura de 152C y una IntensidadIuminlca de 2000 lux. Por otro lado, el Centro Intemacional de AgrtculturaTropical (CIAT)conserva la colecclon in vitro de yuca a 222C. ya que tempera-turas inferiores a los 182Cson perjudiciales para estos materiales a menos quela Intensidad lurninlca se reduzca por debajo de 500 lux. Sin embargo.modificaciones en la concentraclon de nutrientes. reguladores de crectmlento,presencia de osmottcos, oxigenaclon y el fotoperiodo son factores que tamblenafectan el crecimiento.Crtoconservacien 0Conservacton in vitro a largo plazo:

La crtoconservaclon consiste en lIevar material blologlco desde sutemperatura flslologtcarnente normal hasta ultra bajas temperaturas y denuevo a su temperatura normal sin causar dano. Esta tecnlca tiene sus raiceshtstortcas en estudios realizados sobre Ia sobrevivencia de especies vegetalesen condiciones de temperaturas bajo cero grados centfgrados, en zonastempladas y en la busqueda de resistencia a las heladas. sin embargo. no fuesino hasta 1973 cuando se logro una verdadera crtoconservaclon en nttrogenoIiqutdo de celulas de zanahoria.

AIpresente, la crtoconservaclon se ha considerado como el unlco metodoviable para el almacenamiento de germoplasma vegetal a largo plaza bajocondiciones de alta estabilldad genetlca y con un minimo de mantenimiento.Una vez que el material ha sido congelado a -196OC.las funciones metab611cascesan, por 10 tanto. no ocurre division celular, deterioro 0 mutaciones. Masaun, elmaterial puede permanecer en este estado por tiempo Indeflnldo, Otrasventajas que presenta este metodo de almacenamiento son los bajos costos delabor y mantenimiento y el reducido espacio requerido. Ademas, permite laconservacton no solo de meristemos. sino tambten de embriones ctgottcos,somatlcos. callos embrtogentcos. polen y suspensiones celulares, es declr,material generado en ellaboratorio y por ingenieria genetlca.



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Requisitos para la crioconservaci6n de especies vegetales:- Habilidad de cultivar el material in vitro.- HabUidad de multlpllcarlo in vitro.- Los materiales deben reststlr los pretratamientos y crioprotectores.- El tejldo debe regenerarse despues del congelamiento.

Etapas en el proceso de crioconservaci6n:a) La seleccion y aislamiento del material a conservar. En esta etapa se debe

de considerar la establlidad genettca tntrinseca del sistema. por 10tanto.los meristemos y embriones son los materiales prloritarios en programasde conservaclon de germoplasma.

b) Pretratamiento y crtoproteccton, se induce cierto grado de deshldrataclonen las celulas y tejidos para evitar dafios causados por la formaclon decristales de hielo durante los procesos de congelamiento ydescongelamiento. El material puede cultivarse desde unos pocosminutos hasta varios dias en presencia de sustancias crloprotectorascomo la sacarosa, gltcerol, sulfoxldo de dimetilo y otras. Ademas deinducir una deshldrataclon protectora, estas sustancias disminuyen latemperatura a la cual el agua intracelular se congela e intervienen en laestablllzaclon de membranas y en la protecclon de sitios de enlace deenzimas durante el proceso de congelamiento.

c) Congelamtento, este puede ser ultra rapldo por Inmerston directa ennltrogeno liquido 0lento siendo necesario un congelador prograrnablepara obtener resultados precisos y reproducibles. El almacenamiento ennttrogeno liquido es recomendable ya que las fases liquida y vapor seestabillzan a -150QC. 10que evita el deterioro progresivo del material.

d) Descongelamlento, ella mayoria de los cas os se realiza por Inmerston delos viales que contienen las muestras en banos de agua a 40QC. sinembargo. se han reportado algunas excepciones donde eldescongelamiento lento ha sido necesario.

e) Recuperaclon. es el tratamiento a que se somete el material despues deldescongelamiento. Consiste en ellavado 0dlluclon de loscrioprotectoresy el cultlvo de las muestras en condiciones opttmas para asegurar sucrecimiento.



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Durante los ulttmos 20 afios las investigaciones en esta area hangenerado gran numero de reportes sobre tecntcas desarrolladas para lacrtoconservaclon no solo de especies vegetales de clima templado sinotamblen de especies tropicales comoMusa spp.Manlhot esculenia, Theobromacacao. Elaels gulneensls. Coffea spp. Rubus. Cocos nucifera, Saccharumofftctnarum y muchas otras. Actualmente son pocos los laboratorios queutllizan lacrtoconservacton, sin embargo. el interes par conocer e implementareste nuevo metodo de preservacion de germoplasma va en aumento.



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LITERATURA PARA CONSULTAAlvard. D.; Cote. F.; Teisson. C. 1993. Comparison of methods of liquid medium

culture for banana mlcropropagation. Eflfects of temporary Immersion ofexplants. Plant Cell. Tissue and Organ Culture 32: 55-60

Ammirato. P.V. 1983. EmbryogenesIs. En: Evans. D.A.;Sharp. W.R.;Ammlrato. P.V.and Yamada. Y. (eds.). Handbook of plant cell culture. Mac Millan Publishing.Nueva York. v.v 1. p. 82-123.

Reinert. J. 1958. Untersuchungen uber die morphogenese und gewebekulturen.Ber. Dtsch. Bot. Ges. 71-15.

Ammirato. P.V.; Steward. F.C. 1971. Some effects of the environment on thedevelopment of embryos from cultured free cells. Bot. Gaz. 132: 149-158.

Brown. D.J.; Beevers. H. 1987. Growth and respiration of rice (Oryza sativa L.)cellssuspension culture. Plant Cell. Tissue and Organ Culture 10: 175-186.

CIAT (Centro Internacional de Agrlcultura Tropical). 1991. Cultivo de Tejidos en laAgrtcultura: Principios yAplicaciones. Roca,W.M.;Mrogtnskt, L.A.(eds.). Cali.Colombia. p.xil, 970.

Dheda. D.; Dumortier. F.; Pards, B.; Vuylsteke. D.; De Langhe. E. 1991. Plantregeneration In cell suspension cultures of the cooking banana cv.Bluggoe'(Musa spp. ABBgroup). Fruits 46: 125-135.

Dublin. P. Embryogenese somatique directe sur fragments de feuilles de cafeterArabusta. Cafe. Cacao. The (Paris). vol. XXV.n 4. Oct.-Dec. p. 237-242.

Engelmann. F. 1990. Utilisation d'atmospheres a teneur en oxygene redulte pour laconservation de cultures d'embryons somatiaues de palmier a huile (ElaeisguCneensis Jacq.). C.R.Acad. Sci. Paris. t.31 0, serte 111.p. 679-684.

Engelmann. F. 1991. Tropical plant germplasm conservation. In: Conference oftheInternational Plant Biotechnology Network. (4. 1191, San Jose. Costa Rica).Proceedings ofBiotechnology for Tropical Crop Improvement In Latin America.

Escalant. J.V.; Teisson. C. 1989. Somatic embryogenesIs and plants regenerationfrom immature zygoticembryos ofspecies Musa acumCnataand Musa balbisiana,Plant. Cell. Rep. 7: 665-668.



44/48

Evans, D.A.; Sharp, W.R.; Flick, C.E. 1981. Growth and behavior of cell cultures:Embryogenesis and organogenests. En: Thorpe. T.A. (ed.): Tissue culture:Methods and applications In agriculture. Academic. Press. Nueva York. p.45-113.

FAO (Organizaci6n de las Naciones Unidaspara laAgricultura YlaAUmentaci6n).1990. Fundamentos Teortco-Practices del Cultivo de TeJidos Vegetales. Rosell.C.H.; Villalobos. V.M. (eds.). Rome.

Finer. J. 1987. Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from immatureembryos ofhybrid sunflower (Heltanthusannuus L.)on high sucrose-containingmedium. Plant. Cell. Rep. 6: 372-374.

Herman, E.B.; Haas, G.J. 1975. Clonal propagation ofCoffea arabtca L.from callusculture. HortSclence (saint Joseph. USA).vol. 10. n 6. p. 588-589.

Kyte, L. 1987. Plants From Test Tubes: an introduction to micropropagation. TimberPress. Inc. Portland. Oregon.

Litz, R.E. 1984. Invitro somatic embryogenesis from nucellarcallus ofmonoembryonicmango. HortScience 19: 715-717.

Lu. C.; Vasil, I.K. 1981. Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaftissues ofPanicum maximum Jacq. Theor. Appl. Genet. 59: 275-280.

Pannetier, C.; BufJard-Morel. J. 1982. Production of somatic embryos from leaftissues ofcoconut. Cocosnucifera L. En: Fujiwara. A. (ed.). Plant tissue culture.Japan Assoc. Plant Tissue Culture. Tokio. p.755-756.

Mroginsld, L.A.;Roca, W.M.;Kartha,K.K. 1991. Crioconservaclondelgermoplasma.In: Cultivo de Tejldos en la Agricultura. Roca, W.M.; Mrogtnskl, L.A. (Eds.).ClAT. Colombia. pp.715-730.

Niino, T.; Sakai, A.; Yakuwa, H. 1992. Cryopreservation of Dried Shoot Tips ofMulberry Winter Buds and Subsequent Plant Regeneration. Cryo-Letters,13:51-58.

Ochoa, N. 1990. Conservacton de germoplasma. In Fundamentos teortco-practtcosdel cultivo de teJidos vegetales. Rosell. C.yVlllalobos, V. (Eds.) FAO.Roma. pp.55-59.

Panls, B.J.; Withers, L.A.; De Langhe. 1990. Cryopreservation ofMusa suspensioncultures and subsequent regeneration of plants. CryoLetters. 11:337-350.



45/48

Qureshi. J.A.; Kartha. K.K.; Abrams. S.R.; Steinhauer. L. 1989. Modulation ofsomatic embryogenesis In early and late-stage embryos of wheat (Triticumaestivum L.)under the Influence of(+/ -l absclslc acid and Its analogs. Plant. Cell.Tissue and Organ Culture 18: 55-69.

Rangan. T.S.; Murashige. T.; Bitters. W.P. 1968. In vitro initiation of nucellarembryos In monoembryonic Citrus. HortScience 3: 226-227.Reed. B.M. 1988. Cold Acclimation asa Method to Improve Survival ofCryopreserved

Rubus Merlstems. Cryo-Letters. 9:166-171.Sondahl. M.R.; Sharp. W.R. 1977. High frequency Induction of somatic embryos in

cultured leaf explants ofCoffea arabica L. Zeitschrtft fiir Pflanzenphystologle(Stuggart), vol. 81. p. 395-408.

Steponkus. P.L.; Lanphear. F.O. 1967. Refinement of the triphenyl tetrazoliumchloride method of determining cold injury. Plant Physlol. 42: 1423-1426.

Steward. F.e.; Mapes. M.O.; Mears. K. 1958. Growth and organized development ofcultured cells; 2: Organization in cultures grown from freely suspended cells.Amer. J. Bot. 45: 705-708.

Steward. F.e.; Shantz. E.M. 1959. The chemical induction ofgrowth in plant tissuecultures. En: Wain. R.L. and Wightman. F. (eds). The chimestry and mode ofaction of plant growth substances. Academic. Press. NewYork. p. 165-187.

Steward. F.e.; Shantz. E.M. 1959. The chemical Induction of growth in plant tissuecultures. En: Wain. R.L. and Wightman. F. (eds). The chemistry and mode ofaction of plant growth substances. Academic. Press. NewYork. p. 165-187.

Tisserat. B.; Esan, E.B.;Murashige. T. 1979. Somatic embryogenesis Inangiosperms:Hort. Rev. 1: 1-78.

Vasil. I.K. 1982. Plant cell culture and somatic cell genetics of cereals and grasses.En: Vasil. I.K.; Scowcroft. W.R. and Frey, K.J. (eds.). Plant Improvement andsomatic cell genetics. Academic. Press. NewYork. p. 179-203.

Vasil. V.;Vasil.I.K. 1980. Isolation and culture ofcereal protoplasts; 2: Embrogeneslsands plantlet formation from protoplasts of Pennisetum americanum. Theor.Appl. Genet. 56: 97-100.

Villalobos. V.; Abdelnour. A. 1992. Cryopreservation ofMusa spp and Its PotentialFor Long-Term Storage of Other Tropical Crops. In: Conservation of PlantGenes. Adams. R. and Adams. E. (Eds.). Academic Press. Inc. pp.197-210.



46/48

Vuylsteke. D.R. 1989. Shoot-tip culture for the propagation. conservation andexchange ofMusa germplasm. IBPGR. Rome.

Wernicke. W.; Brettell. R. 1980. Somatic embryogenests from Sorghum blcolorleaves. Nature 287: 138-139.

Wetherell. D.F. 1984. Enhanced adventive embryogenesis resulttngfrcm plasmolysisof cultured wild carrot cells. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 3: 221-227.

Wlldom. J.M. 1972. The use offluorscein dlacetate and phenosafranin for determiningviability of cultured plant cell. Stain Technol. 47: 189-194.

Withers. L.A. 1987. Long-term preservation of plant cells. tissues and organs. OxfordSurveys of Plant Molecular and Cell Biology. 4:221-272.



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