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Cultivo de tejidos (Clonación in-vitro) de Epidendrum falcatum. Resumen Las orquídeas son plantas que pertencen a la familia Orchidaceae, con

aproximadamente 700 a 800 géneros y 25 000 a 35 000 especies.

Taxonomicamente representan una de las familias más evolucionadas. Esta

familia aunque es muy numerosa, algunas especies se encuentran amenazadas o

en peligro de erradicación, debido al saqueo indiscriminado, destrucción de

espacios, contaminación ambiental y deforestación, aunado a los problemas de

lento crecimiento y baja tasa de germinación en condiciones naturales.

Epidendrum falcatum es una orquídea de hábito litófita con pseudobulbos

fusiformes colgantes que portan una sola y estrecha hoja, articulada, coriácea,

carnosa, linear-lanceolada y aguda, en forma de hoz. Florece en la primavera y se

tiene una distribución discontinua en México, esta especie se encuentra en las

rocas y acantilados de piedra caliza en bosques de pino y bosques húmedos de

roble, en el matorral xerófilo y los bosques espinosos y en altitudes de 1000 a

2100 metros.

La conservación ex situ de los recursos genéticos vegetales se puede lograr

mediante el almacenamiento in vitro. Esta técnica es una herramienta que permite

el estudio a corto y largo plazo de plantas vulnerables a la extinción. Así, el

objetivo de esta investigación fue crear cultivos de Epidendrum falcatum para la

regeneración y propagación de esta especie, así como promover su conservación

y aprovechamiento.

Los explantes utilizados fueron semillas, las cuales se cultivaron en medio MS

(Murashige y Skoog), el cual es a base de minerales y nutrientes que el explante

necesitó para desarrollarse; de la misma manera fueron agregados reguladores de

crecimiento, en diferentes dosis (0.1/0.5, 0.1/1 AnA y BaP respectivamente)

monitoreando su crecimiento con un lote testigo, dichos explantes presentaron una

diferencia en cuanto a su desarrollo. El cultivo 0.1/1 presentó más cantidad de

hormonas en comparación con los otros dos, por lo que se obtuvieron resultados

más favorables en su crecimiento. El mayor número de PLB’s (en promedio 25) se

obtuvo en los cultivos basal 0.1/1

  2  

INTRODUCCIÓN

MARCO TEÓRICO. La forma tradicional de propagación de la mayoría de las especies vegetales es

por medio de semillas (frijol, maíz, chile, etc.), aunque algunas especies también

se propagan vegetativamente (papa, agaves, etc.). Sin embargo, en la actualidad,

con el uso de diversas técnicas de cultivo de tejidos, a partir de diferentes tipos de

explantes vegetales se han establecido múltiples cultivos (callos, suspensiones

celulares, protoplastos, embriones, yemas axilares, meristemos, inflorescencias,

etc.) y en muchos casos se han logrado regenerar plantas completas in vitro y

escalar dichos procesos para multiplicar en forma masiva (micropropagación)

algunas especies. Lo anterior ha permitido propagar millones de plantas sin

necesidad de disponer de semillas o de depender del limitado número de brotes

de la propagación vegetativa. Estos diferentes tipos de cultivos, permitieron un

gran avance en los estudios bioquímicos, fisiológicos y moleculares de diferentes

rutas biosintéticas de un gran número de metabolitos primarios y secundarios. El

conocimiento adquirido con las diferentes técnicas del cultivo de tejidos vegetales,

acopladas a las de la ingeniería genética permiten obtener plantas transformadas

con nuevas características genéticas las cuales son de gran importancia en la

agricultura actual.

El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro, es una técnica de reproducción en

condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento

inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas

genéticamente iguales a la planta madre.

A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta

permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en menos tiempo; así

como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es

de gran utilidad en la obtención de: plantas libres de patógenos, plantas

homocigotas, en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de

ingeniería genética, etc. El enorme potencial que posee esta metodología ha

propiciado que en los últimos 25 años se haya incrementado el número de

  3  

laboratorios de cultivo de tejidos en el país para la producción comercial de

plantas ornamentales y frutales lo que ha motivado que algunos floricultores la

estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción.

Es por esto que en diversos estados de la República se han implantado

laboratorios de cultivo de tejidos para su exitosa propagación, como ejemplo

tenemos el Colegio Profesional de Biólogos del Estado de Veracruz, A.C. el cual

con el apoyo de la Secretaría de Desarrollo Social (SEDESOL) y el Gobierno del

Estado de Veracruz desarrollan un proyecto de producción de plantas de ornato

utilizando la técnica antes mencionada con el propósito de aprovechar sus

bondades, adecuándola a la problemática económica de algunas colonias

populares de la Ciudad de Xalapa y municipios circunvecinos; el proyecto inicio el

primero de noviembre de 1994 con la instalación de un Laboratorio de Cultivo de

Tejidos Vegetales en donde se contempla la producción de especies ornamentales

de interés económico. A la fecha, se tienen resultados satisfactorios en la

producción de Gloxinia (Sinningia speciosa).

El fundamento teórico del cultivo in vitro es el concepto de la totipotencialidad

celular.

Schleiden y Schwan (1887) describen en su teoría celular, que la célula es capaz

de subsistir por sí sola si las condiciones externas le son favorables.

A Morgan (1901) se le atribuye el término de la totipotencialidad celular

propiamente dicho, que dice que una célula es capaz de desarrollarse hasta

formar un organismo completo si las condiciones ambientales le son favorables y

si se le aplican los estímulos adecuados.

Haberlandt (1902) con la idea de la totipotencialidad celular desarrolla el primer

cultivo in vitro de tejidos vegetales. Desafortunadamente sus trabajos no fueron

exitosos debido a que utilizó un medio de cultivo relativamente simple y por otra

parte, tejidos vegetales demasiado diferenciados.

En 1926 dos científicos japoneses descubrieron un compuesto hormonal,

actualmente de uso ordinario en el cultivo in vitro de tejidos vegetales denominado

giberelina el cual es producido por un hongo Gibberella fujikoroi; este compuesto

fue descubierto cuando ellos estudiaban la causa de la pudrición en plántulas de

  4  

arroz. El efecto que producía dicha sustancia era un alargamiento excesivo en los

tallos, sin desarrollo proporcional de la raíz. Actualmente se le atribuyen otros

efectos como la inducción de germinación en semillas y la brotación en algunos

tubérculos como la papa, etc.

White (1932) logra el primer cultivo in vitro estable utilizando en sus experimentos

ápices1 de raíces de jitomate. Los tejidos meristemáticos2 del ápice radical

propiciaron crecimiento en longitud de los mismos en el medio de cultivo. La falla

en los intentos realizados por varios investigadores entre 1902 y 1932 se debió,

como lo menciona White, a la mala elección del material vegetativo y 1a la

simplicidad de los medios de cultivo utilizados. El logro de White le da un buen

impulso al desarrollo de las técnicas de cultivo in vitro; sin embargo, en sus

trabajos realizados hasta entonces no obtiene proliferación celular en forma, los

ápices de raíz solo crecen en longitud como lo harían normalmente parte de la raíz

de la planta intacta.

No es sino hasta 1934 cuando Gautheret logra la proliferación celular in vitro en

tejidos cambiales provenientes de plantas adultas. En 1939 el mismo Gautheret,

Nobecourt (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de la planta de tabaco)

publican casi simultáneamente la formación de una masa de células

parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos) utilizados en sus

experimentos. Este hecho significativo constituye en sí el despegue de las

técnicas de cultivo in vitro.

Un factor importante en el desarrollo de las técnicas de cultivo de tejidos

vegetales, fue el descubrimiento de los reguladores de crecimiento. Overbeek

(1941) observa el efecto de una sustancia presente en el agua de coco que

estimulaba la división celular (efecto citocinínico). Cuando el agua de coco se

combinaba con 2,4-D, tenía un efecto positivo en el desarrollo de tejidos de

zanahoria y papa (Caplin y Steward 1948, 1952).

                                                                                                               1. Punta o extremo.

2. Tejidos meristemáticos, responsables del crecimiento vegetal.  

 

  5  

Skoog y colaboradores observaron que el esperma de arenque, desnaturalizado

por calor, tenía un efecto muy marcado en la formación de brotes a partir de

tejidos de la planta de tabaco. De éste ácido desoxirribonucleico (DNA)

desnaturalizado Miller y colaboradores aislaron un compuesto de naturaleza

purínica denominado 6- furfuril-aminopurina o cinetina.

Por otro lado las orquídeas son una de las más diversas familias de plantas con

flores, con más de 800 géneros descritos y 25.000 especies. Las orquídeas son

muy apreciadas por sus hermosas flores de larga duración que exhiben una

increíble gama de diversidad en tamaños, forma y color. Hoy en día el cultivo de

orquídeas es algo más que una afición, es una empresa internacional que cubre

alrededor del 8% del comercio de la floricultura mundial y tiene el potencial de

alterar el paisaje económico de un país. Como las orquídeas son alógamas3, su

propagación mediante semillas conduce a la producción de plantas heterocigotas.

Aunque la micropropagación de orquídeas muestra un desarrollo espectacular en

los últimos años, se cree que el uso generalizado de la micropropagación es aún

limitado debido a problemas como la exudación de compuestos fenólicos a partir

de explantes, el trasplante al campo, la variación somaclonal 42 entre otras cosas.

Organogénesis y micropropagación de orquídeas. Las principales aplicaciones de la técnica de cultivo de células, tejidos y órganos

vegetales son en los campos de micropropagación, preservación de

germoplasma5, mejoramiento genético, biosíntesis de metabolitos e investigación

básica en áreas como la genética, la fisiología, etc.

En micropropagación, la embriogénesis y la organogénesis pueden usarse para

obtener clones somáticos y regenerar plantas completas con características

                                                                                                               3. Tipo de reproducción sexual en plantas consistente en la polinización cruzada y fecundación entre individuos genéticamente diferentes. 4. Variación en las plantas que han sido producidas por medio del cultivo de tejidos. 5. Conjunto de genes que se transmite por la reproducción a la descendencia por medio de gametos o células reproductoras.  

  6  

uniformes y así establecer cultivos de plantas valiosas, libres de microorganismos

y difíciles de obtener por métodos de cultivo tradicionales.

Los cultivos in vitro también pueden almacenarse por largos períodos de tiempo

mediante alguno de los métodos de conservación utilizados para microorganismos

como es la refrigeración y criopreservación6. 3

Esta es una forma de eliminar los problemas de espacio físico, exceso de mano de

obra, contaminación de los cultivos y los efectos de la erosión genética.

Si los cultivos in vitro se incuban o someten a condiciones de estrés fisiológico,

pueden expresar características de adaptación y resistencia que en condiciones

naturales nunca manifestaron, creciendo selectivamente sólo aquellas células

capaces de adaptarse a sus nuevas condiciones. Esta variación genética también

se puede inducir por técnicas de mutación, ingeniería genética, fusión de

protoplastos y transformación genética por inclusión de DNA foráneo de manera

similar a las aplicadas comúnmente en microorganismos. En este último caso se

obtienen cultivos o plantas transgénicas en donde el DNA foráneo debe integrarse

al genoma vegetal para garantizar una expresión estable en su progenie.

Micropropagación de orquídeas usando varios explantes

En 1926 Morel y Martin informaron de la producción de dalias libres de virus

utilizando el cultivo de meristemos apicales y posteriormente aplicaron esta

técnica para producir Cymbidium libre de virus (Morel, 1960). Aunque Morel no

sugirió que su método podría ser utilizado para la propagación clonal masiva, sí

dijo que “muy a menudo el cuerpo-protocormo se divide de 4 a 54 estructuras

idénticas y cada una de ellas produce una nueva planta”.

Cultura de hoja segmento. Al contrario que las yemas, los explantes son más fáciles de obtener y no

requieren el sacrificio de la planta materna, además de que su disponibilidad no

está restringida a ninguna estación como los explantes inflorescentes. Wimber

                                                                                                               6. Proceso en el cual células o tejidos son congelados a muy bajas temperaturas, generalmente entre -80 ºC y -196 ºC

  7  

(1965) fue pionero del cultivo de tejido filial y dio el primer reporte bien

documentado de la producción de PLBs de hojas de Cymbidium. En la orquídea

Malaxis paludosa, las yemas naturalmente formaban las hojas. Por lo tanto, la

formación de callos y plantas a través de las hojas reflejaba un inherente tratado

de la orquídea. Estos autores hicieron cortes de la mayor parte de la hoja

(pecíolos, varias secciones de la hoja y la base) madura Laeliocattleya y en

cultivos in vitro de Epidendrum. Las hojas sólo respondieron formando callos7 y

PLBs8.

En contraste con el anterior informe de explantes de hoja Vanda híbrido104la base

de la hoja fue la región más susceptible de crecimiento con más del 80% que

mostraron proliferación (Mathews y Rao, 1985). Además, las hojas jóvenes

respondieron mejor que las hojas viejas. Conclusiones similares fueron

reportados, cuando se evaluó el potencial de regeneración de segmentos foliares

de Vanda testacea. La actividad se inició de manera meristemática en toda la

superficie de hojas más jóvenes o se limitaba a la parte basal en las hojas más

viejas.5

El éxito en la regeneración de un gran número de plantas de hoja uniforme en

cultivo de tejidos en peligro de extinción de Renanthera imschootiana Rolfe,

también conocida como la Cruz Vanda, ha informado (Seeni y Latha, 1992) que la

formación de yemas se limitó a las bases de las hojas mientras el clorofílico

respondía en la parte distal de las hojas de las plantas con flores y plantas

cultivadas in vitro.

Pero las hojas de V. coerulea (Vanda Azul) de las plantas maduras no formaron

yemas o PLBs en la modalidad in vitro por lo cual los explantes de las plantas

madre podían diferenciarse . La competencia por la regeneración (frecuencia de

                                                                                                               7. Un callo de células de planta consiste en las células somáticas no diferenciadas de un espécimen de planta adulta. 8. Protocorms-like bodies. 9. Vanda es un género de aproximadamente 60 especies de orquídeas de la subfamilia Epidendroideae dentro de la familia Orchidaceae. 10. Especie de orquídea originaria del este del Himalaya China.    

  8  

respuesta y el número y la naturaleza de regenerantes por callo) en los cultivos

foliares de Vanda también fueron influenciados por la juventud de los tejidos en

términos del tamaño de la hoja del donante. La diferencia respondía por los

explantes de las hojas maduras y las jóvenes, bajo condiciones nutricionales

idénticas, indicando la importancia de su fuente de alimentación. A diferencia de

los informes anteriores donde hojas más jóvenes tienen mayor probabilidad de

formar más PLB y disparar las yemas, el potencial de regeneración de explantes

de hojas de plantas maduras de Vanda spathulata fue complementado por el

significativo número de brotes por planta, comparado con los explantes in vitro en

medio suplementado con 66.6 mM BAP11+ 28.5 mM IAA12.6

OBJETIVO. Realizar la clonación de Epidendrum falcatum, de modo que, se obtengan y

propaguen nuevos individuos de esta especie.

PROBLEMA. La biodiversidad de México está siendo disminuida por diversos factores, la

deforestación ha degradado alarmantemente los ecosistemas forestales, lugar en

el que se sustenta la familia Orchidaceae. Las orquídeas han sido objeto de

extracción masiva, lo cual junto con la destrucción masiva del hábitat, han hecho

que un gran número de especies se encuentren amenazadas y otras en peligro de

extinción La dificultad que presentan las semillas de las orquídeas para germinar,

entre otras problemáticas ya expuestas anteriormente, indican la importancia y

necesidad de establecer estrategias eficientes para la micropropagación y

conservación de estas especies. Epidendrum falcatum es una especie endémica

de México, que al igual que otras orquídeas es de lento crecimiento, largo ciclo de

vida, vulnerable a la destrucción de su hábitat. Para esta especie no existen

estudios relacionados a su reproducción y desarrollo; por lo tanto, es importante

generar una metodología que permita propagarla de manera eficiente. Las                                                                                                                11.Hormonas de crecimiento. 12.Hormonas de crecimiento.  

  9  

técnicas de cultivo de tejidos vegetales pueden aplicarse como una herramienta

de gran utilidad para el estudio, propagación y conservación de esta especie.

HIPOTESIS. Las técnicas de clonación in vitro, permitirán obtener un determinado número de

organismos de la especie Epidendrum falcatum a partir de cortes basales y

apicales.

DESARROLLO EXPERIMENTAL Se realizaron cortes de plántulas de Epidendrum falcatum en la parte media para

obtener la parte apical y basal de las semillas. Se utilizó tres tipos de medio a dos

de los cuales se les agrego diferentes cantidades de reguladores de crecimiento:

Testigo - sin reguladores de crecimiento

Experimental 1, con dosis de 0.5 mg de BaP (Ácido Benzylamino Purina)

y 0.1 mg de AnA (Ácido Naftalenacetico)

Experimental 2, con 1 mg de BaP y 0.1 mg de AnA.

Se preparó litro y medio de medio de cultivo MS en cantidades específicas de

cada sustancia que se agregaron conforme el siguiente orden.

Macronutrientes (15 ml)

• Calcio (15 ml)

• Micronutrientes (7.5 ml)

• Hierro (15 ml)

• Vitaminas (10 ml)

• Inocitol (10 ml)

• Glicina (10 ml)

• Azúcar refinada (45 gramos)

• Agar (1.75 ml por cada concentración)

Manteniéndolo en constante movimiento, al terminar de agregar el azúcar se

dividió el medio en 3 porciones iguales (500 ml. cada una) y al final se añadió el

agar.

  10  

El método para añadir los reguladores de crecimiento es muy importante y preciso,

con una balanza electrónica se pesan 10 mg de AnA (Ácido Naftalenacético) y se

agregan 5 gotas de Etanol 70 %, una vez disuelto el AnA, se afora a 10 ml con

agua destilada. De igual manera se hace con el BaP (Benzylamino Purina) pero en

lugar de usar Etanol se usó Hidróxido de Sodio.

Se tuvo entonces 10 ml de AnA y otros 10 ml de BaP ahora para saber cuánto

agregar de cada uno de los medios de cultivo se realizo lo siguiente:

AnA.

Cantidad del medio (ml) Multiplica Concentración deseada Igual Microlitros

500 ml x 0.1 = 50 mcl.

500 ml x 0.1 = 50 mcl.

500 ml x 0 = 0 mcl

BaP

Cantidad del medio (ml) Multiplica Concentración

deseada

Igual Microlitros

500 ml x 0.5 = 250 mcl.

500 ml x 1 = 500 mcl.

500 ml x 0 = 0 mcl

Una vez agregados los reguladores de crecimiento se separaron en 3 frascos de

500 ml de medio con sus respectivas concentraciones. Se midió el PH, el cual

debe estar en un rango de: 5.7 - 5.75

  11  

Para subir el PH Para disminuir el PH

Se calentó en un horno de microondas de 4 a 5 minutos por cada concentración y

posteriormente se vació 25 ml de medio en cada frasco, colocando su tapa y

dejando enfriar hasta obtener una forma de gel, por último, se llevaron los frascos

al autoclave un tiempo típico de esterilización de 15 a 20 minutos.

Se obtuvieron 30 frascos, 10 por medio, una vez esterilizados los frascos, el

bisturí, pinzas y cajas de Petri (en una de ellas se encuentran las semillas de las

orquídeas), se colocaron en la campana de flujo laminar. Se abrieron las cajas de

Petri y los frascos con medio, con la ayuda de un bisturí se partieron las semillas

por la mitad para obtener los cortes apical y basal, con unas pinzas, se tomaron

los cortes y se colocaron cuidadosamente sobre el gel, procurando que quedaran

fijos en el medio sin sumergirlos.

Se colocaron 1 corte basal en 5 frascos y 1 corte apical en los otros 5, esto se

repitió con los 3 tipos de medio, por lo tanto, de los 10 frascos que le

correspondían a cada medio, 5 fueron de cortes basal y 5 de cortes apical.

Una vez cerrados los frascos se sellaron con plástico hermético, con un marcador

se anotó en la tapa el nombre de la especie, la fecha y el nombre de quien sembró

los explantes.

Los frascos ya con los cortes se llevaran a la incubadora, la cual debe tener

ciertas medidas específicas como tener el cuarto de cultivo bien acondicionado: 16

NaOH

(0.1)

NaOH

(0.5)

NaOH

(0.01)

Aumenta Aumenta Aumenta

1.00 0.50 0.10

por gota por gota por gota

HCl (0.1) HCl (0.5) HCl (0.01)

Disminuye Disminuye Disminuye

1.00 0.50 0.10

por gota por gota por gota

  12  

9  

15  

22.5  

0  

5  

10  

15  

20  

25  

Apical  0/0  

Apical  0.1/0.5  

Apical  0.1/1  

Tamaño  Apical  (mm)  

Tamaño  Apical  (mm)  

12  14  

17  

0  

5  

10  

15  

20  

Basal  0/0  

Basal  0.1/0.5  

Basal  0.1/1  

Tamaño  Basal  (mm)  

Tamaño  Basal  (mm)  

horas de fotoperiodo y un rango de temperatura entre 22-25°C. 8 horas de

oscuridad con un material luminoso de 2500 a 300 Lux, provistos de fluorescentes

de luz blanca.

Cuarto de cultivo Se construyó una caja que cubriera la incubadora con láminas de madera

prensada, pues este material resiste la humedad; se cortó la madera para las

paredes de 45 cm de ancho y 35 cm de alto. En las paredes de los lados se

colocaron dos listones: uno a cuatro centímetros desde el borde que quedó en el

suelo y otro a seis centímetros del primero (estos listones fueron los soportes para

las bandejas).

En la parte frontal de la incubadora se realizó un corte en la tabla de madera en

donde se colocó una puerta que a la cual se le coloco un vidrio para poder ver lo

que sucedía dentro de la incubadora.

Se instaló un termostato digital en una de las paredes de la incubadora, para

regular la a temperatura la oscilo entre los 20° y los 25 °C. Se usaron bombillas

para mantener la incubadora caliente, así como una bandeja para depositar los

frascos en el interior de la incubadora, se estuvieron revisando los frascos cada

semana. Anotando el desarrollo de cada explante en relación a crecimiento.

RESULTADOS

Gráfica 1: Comparación de tamaños de

hojas entre los cultivos apical basal (0/0)

(0.1/0.5) (0.1/1)

Gráfica 2: Comparación de tamaños

de hojas entre los cultivos basal (0/0)

(0.1/0.5) (0.1/1)

  13  

13  

20  25  

0  5  10  15  20  25  30  

Basal  0/0    

Basal  0.1/0.5  

Basal  0.1/1  

PLB's  Basal  

PLB's  Basal  10  

18  22  

0  

5  

10  

15  

20  

25  

Apical  0/0  

Apical  0.1/0.5  

Apical  0.1/1  

PLB's  Apical  

PLB's  Apical  

Gráfica 1 se observó un crecimiento promedio de la plántula, de 9 mm en apical

0/0, 15 mm en apical 0.1/0.5 y finalmente un desarrollo de hasta 22.5 mm en

apical 0.1/1; Gráfica 2, el tamaño de las plántulas basal en 0/0 es de 12 mm, en

0.1/0.5 es de 14 mm y en 0.1/1 hay un crecimiento total de 17 mm.

Comparando las gráficas 1 y 2 los cultivos sin hormonas (0/0) se observa una

diferencia en el crecimiento de 3 mm; entre el cultivo basal con el apical, en

cambio en el cultivo basal con hormonas 0.1/0.5 se observó una diferencia de

1mm, siendo más grande el apical; por último, en hormonas 0.1/1 se notó una

mayor diferencia, siendo el cultivo basal 5.5 mm. menor que el apical.

En las orquídeas, después del proceso de germinación se forma una masa de

células con una alta totipotencialidad llamada protocormo, el cual puede

diferenciarse en una plántula o formar cuerpos parecidos a protocormos (PLB’s).

En la gráfica 3, en promedio, cada dos semanas crecía 1 PLB’s en apical sin

hormonas, 3 PLB’s en apical 0.1/0.5 y hasta 3 PLB’s en apical con hormonas

0.1/1; en la gráfica 4, en cuanto a basal sin hormonas se desarrollaban 2 PLB’s

cada dos semanas, 3 PLB’s en basal con hormonas 0.1/0.5 y en basal 0.1/1

llegaban a crecer hasta 4 PLB’s.

Gráfica 3: Comparación de cantidad de

PLB’s entre los cultivos apical (0/0)

(1/0.5) (1/0.1)

Gráfica 4: Comparación de cantidad de

PLB’s entre los cultivos basal (0/0)

(1/0.5) (1/0.1)

  14  

Imagen 2; Apical 9 mm, 2 PLB’s. Hormonas 0/0

Por lo que se puede observar que los cultivos basal presentaron un desarrollo

mayor de protocormos comparado con los cultivos apical.

Imagen 1; Basal 10 mm, 12 PLB’s. Hormonas 0/0

Imagen 3; Basal 10.5 mm , 20 PLB’s. Hormonas 0.1/0.5

Imagen 4; Apical 20.5 mm , 6 PLB’s. Hormonas 0.1/0.5

  15  

Imagen 6; Basal 22 mm, 24 PLB’s. Hormonas 0.1/1

Imagen 5; Apical 22 mm, 17 PLB’s. Hormonas 0.1/1

  16  

En la imagen 5 se muestra una plántula de apical con hormonas 0.1/1, presenta

un tamaño de 22 mm y 17 protocormos, por otra parte la imagen 6 es de un

cultivo basal 0.1/1, con un tamaño de 22 mm y 24 protocormos.

En las seis imágenes se aprecia que los cultivos de apical (Imagenes 2, 4, 5) presentan más hojas que los cultivos de basal (Imagenes 1, 3, 6), no obstante

tienden a desarrollar una cantidad inferior de protocormos.

Los cultivos realizados de Epidendrum falcatum tuvieron diferente desarrollo

dependiendo de la concentración de indicadores de crecimiento. Después de tres

meses, se realizo un cambio en el mismo ya que habían agotado los minerales

presentes en el medio los explantes; de esta manera ocurrió un cambio en su

ambiente pues se trasladaron a un medio que carecía de las hormonas a las que

ya se habían acostumbrado las plantas, específicamente los explantes basales por

este motivo las plantas pertenecientes al grupo tratado con 0.1/1 de reguladores

de crecimiento tuvieron un cierto grado de disminución en su avance como se

muestra en la Gráfica 7, a partir del segundo, al tercer mes muestran una

disminución en el incremento de PLBs el cual hasta ese momento había sido de 3

a 5 PLBs por mes disminuyo a 2 o 3, por lo tanto al contraponerlo con el avance

presentado por el grupo que se trato con hormonas 0.1/0.5 se observa un notable

0  

2  

4  

6  

8  

10  

12  

14  

Mes  1   Mes2   Mes3   Mes  4  

Apical  

Basal  

GRÁFICA  6  

  17  

cambio en las estadísticas de incremento de los mismos, (Gráfica 7) ya que estas

habían experimentado un crecimiento de entre 2 a 3 PLBs por mes, al realizar su

cambio de medio su crecimiento cambio sorprendentemente a 2 PLBs

estabilizándose en ese número y acercándose al crecimiento experimentado por el

anterior grupo.

ANALISIS DE RESULTADOS. Se observó que los explantes tratados con las hormonas BAP y ANA al 0.1/1

respectivamente, mostraron un desarrollo mayor en cuanto a tamaño (Gráfica1) y

numero de PLBs (Gráfica 2) al que mostraron los otros dos grupos tratados con

menos de estas hormonas, las cuales tienen un efecto catalítico en el crecimiento

de las plántulas, al contar con estos reguladores más los minerales y nutrientes

necesarios para desarrollarse presentes en el medio de cultivo se logra un

crecimiento claramente notorio a los explantes que no presentaron reguladores de

crecimiento en su medio. Tomando el avance presente en los explantes basales

respecto al número de PLBs presentados por los explantes apicales del mismo

lote se observa un incremento en el número de estos en el explante, ya que, al ser

0  

5  

10  

15  

20  

25  

30  

Mes  1   Mes  2   Mes  3   Mes  4  

0/0  

0.1/0.5  

0.1/1  

GRÁFICA  7    

  18  

la parte basal la que presenta el callo esta tiene más facilidad de crear nuevos

organismos (totipotencialidad) en cambio los explantes apicales al tener la parte

superior de la plántula, presentan para crear nuevos organismos únicamente las

hojas presentes en ella como se muestra en la Imagen 5.

Los explantes pertenecientes al grupo testigo mostraron un avance gradual

(Gráfica 6), en relación al número de PLBs los explantes basales mostrando un

incremento mayor desde el primer momento a los explantes apicales.

CONCLUSIONES

• Se observó que las plantas injertadas por los explantes de 0/0 tuvieron

resultados poco favorables, teniendo entre 10 a 13 PLBs y 7 hojas; en el

caso de los cortes apicales respecto de las plantas con los explantes

sometidos al tratamiento de 0.1/0.5 hubo un rango entre 18 a 20 PLBs y por

ultimo con mejores resultados 0.1/1 del cual se obtuvo un rango de 22 a 25

PLBs incluso hasta 10 hojas en el caso de los cortes apicales.

• El medio tratado con hormonas 0.1/1, tuvo mayor contenido de nutrientes

en comparación con el testigo, lo cual ayudo a que crecieran más algunos

de los explantes.

• Los explantes pertenecientes al grupo testigo, al estar sometidos al mismo

tratamiento en ambos casos presentaron un crecimiento normal.

• Se observó una diferencia clara en el comportamiento de las plántulas, así

como un incremento en los cortes apicales del tratamiento testigo en PLBs

(incrementaron en un 40%, pasando de 10 PLBs a 14 en un plazo de 2

meses); sobre los cortes apicales tratados con 0.1/1 los cuales se

estancaron en el crecimiento cuando se cambiaron del medio a uno sin

hormonas.

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