COMPOSICIÓN BIOACTIVA DE OLEORRESINA DE LA MICROALGA

VII CONGRESO LATINOAMERICANO Y DEL CARIBE DE PROFESIONALES Y

ESTUDIANTES DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS Y GASTRONOMIA

Cartagena de Indias, Colombia, octubre 10 al 14 de 2017

COMPOSICIÓN BIOACTIVA DE OLEORRESINA DE LA MICROALGA

HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS PARA APLICACIONES ALIMENTARIAS

Ruiz-Domínguez, M.C.1; Jauregui M.1; Espinosa, C. 1; Palma, J.C.1; Jaime, C.2;

Cerezal, P.1

1Laboratorio de Microencapsulación de Compuestos Bioactivos (LAMICBA),

Departamento de Alimentos, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de

Antofagasta. Avda. Universidad de Antofagasta # 02800 – Región de Antofagasta (Chile)

2 Atacama Bio Natural Products S.A, Vía 5 Esq. Vía 9, Bajo Molle, Iquique - Región de

Tarapacá (Chile)

Correo electrónico: [email protected]

(Investigación Parcial)

Resumen: Las microalgas son organismos fotosintéticos conocidas por contener entre

otras, compuestos de alto valor añadido como los carotenoides. Estos cumplen un papel

fundamental como antioxidantes y como agentes protectores sobre la salud humana. En

el presente trabajo se muestra el potencial de la microalga Haematococcus pluvialis

conocida por presentar elevadas concentraciones de astaxantina. Este pigmento tiene

propiedades antioxidantes, es protector contra la inflamación y contra el envejecimiento

y actúa como fotoprotector de la luz UV. Por consiguiente, se presenta el perfil de

carotenoides presentes en la oleorresina enriquecida al ~10% (p/p) en carotenoides

habiendo sido extraída mediante la tecnología limpia de extracción por CO2 supercrítico

Vol 26, No 44 (2018), Revista Alimentos Hoy -18

YURI

Texto tecleado

Recibido 02/08/2017, Aceptado 16/08/2018, Disponible online 31/08/2018

(SCCO2) a partir de la biomasa algal. Se realizó una hidrólisis alcalina de los compuestos

bioactivos para conocer la totalidad de antioxidantes presentes en la oleorresina. Estos

fueron posteriormente separados, identificados y cuantificados mediante HPLC con

detector UV-vis a través de una columna RP-18 y gracias a patrones de calibración. La

oleorresina proveniente de H. pluvialis presentó un perfil: astaxantina 47.69 mg/g, luteína

23.78 mg/g y cantaxantina 29.57 mg/g, respecto al ~10% (p/p) de carotenoides presentes

en las muestras de oleorresina. Finalmente, la extracción por SCCO2 a partir de la

biomasa H. pluviales enriquecida en carotenoides, da lugar a un eficiente

empaquetamiento de compuestos de alto valor con capacidad bioactiva proporcionando

durabilidad y estabilidad de los mismos en el tiempo, abriendo así, un mayor mercado de

las mismas tanto en la industria alimentaria y/o nutracéutica.

Palabras claves: oleorresina, SSCO2, astaxantina, industria alimentaria

Abstract: Microalgae are photosynthetic organisms which are known to contain high

added value compounds such as carotenoids. They play an important role as antioxidant

and as protective agents on human health. This work shows the potential of the microalga

Haematococcus pluvialis which is relevant because it has a high concentration of

astaxanthin. This pigment has antioxidant properties, it is protective against inflammation

and against ageing and it plays as a photoprotector of UV light. Therefore, the profile of

specific carotenoids presents in the oleoresin enriched in carotenoids (~10%, w/w) is

shown in this work. It was extracted by green technology called supercritical fluid

extraction with CO2 (SCCO2) using microalgal biomass. The profile was performed by

alkaline hydrolysis from oleoresin to obtain the total-free bioactive compounds in the

samples. Then, the bioactive compounds were separated, identified and quantified using

HPLC with UV-vis detector and RP-18 column with external standard to calibration. The

oleoresin of H. pluvialis showed a specific profile: astaxanthin 47.69 mg/g, lutein 23.78

mg/g and canthaxanthin 29.57 mg/g, respect to ~10% (w/w) of carotenoids on samples.

Finally, SSCO2 extraction from H. pluviales was an efficient packing of bioactive

compounds of high added value with bioactive capacity providing durability and stability


during time, opening a greater market for them both in the food and / or in the

nutraceuticals industry.

Keywords: oleoresin, SSCO2, astaxanthin, food industry

1.- Introducción

Hoy en día, la tendencia de los

consumidores a ingerir productos

naturales está aumentando debido al

interés por una dieta saludable. Debido a

ello, la industria alimentaria está

desarrollando nuevos productos

alimenticios enriquecidos con

ingredientes funcionales que pueden

proporcionar un beneficio para la salud

más allá de los nutrientes tradicionales

que contiene (Milner 1999).

Particularmente, las microalgas son una

fuente relevante de ingredientes

funcionales con varias aplicaciones

potenciales de biotecnología (Michalak y

Chojnacka 2015). Son un gran grupo de

organismos fotosintéticos con una

estructura unicelular eficiente, que les

permite convertir la energía solar en

energía química. Los microalgas se

estudian intensamente por contener una

amplia gama de compuestos de alto valor

bioactivo con importantes aplicaciones

en alimentos, cosméticos, farmacéuticos

y biocombustibles (Amaro y otros 2011;

Gouveia y otros 2008) y estos

compuestos bioactivos han sido

reconocidos para prevenir enfermedades

humanas y mantener una buena salud

(Plaza y otros 2008; Rao y Rao, 2007).

En particular, el grupo de carotenoides

son la clase más extensa de pigmentos

sintetizados por microalgas, a pesar de

que no más de 30 de ellos juegan un

papel directo en la fotosíntesis de

microalgas (Varela y otros 2015). Son

indispensables en la recolección de luz y

transferencia de energía durante la

fotosíntesis e incluso son responsables

como mecanismo de defensa de primera

línea de la presencia de ROS (radical

oxidative species) y por tanto, contra el

daño fotooxidativo (Li y otros 2009). En

concreto, Haematococcus pluvialis es

ampliamente conocida como la mejor

microalga productora de astaxantina,

alcanzando hasta 3-5% de pigmento

natural en peso seco (Saini y Keum,

2017). Lo especial de este carotenoide

rojo-naranja insoluble en agua, es que es

un subproducto de β-caroteno en


condiciones de estrés en la biosíntesis de

carotenoides (D’Alessandro y Antoniosi

Filho, 2016) y es un poderoso

antioxidante que es más eficaz que las

vitaminas C y E (α-tocoferol) u otros

carotenoides como β-caroteno, licopeno,

luteína y zeaxantina (Higuera-Ciapara y

otros 2006; Reyes y otros 2014). La

astaxantina tiene muchos beneficios

para la salud, tales como anti-

inflamatorio (Gross y otros 2006) e

incluso previenen enfermedades

cardiovasculares como arteriosclerosis

(Ciccone y otros 2013). Además, es

ampliamente utilizado en piensos de

pescado y particularmente en piensos de

salmón, crustáceos y aves, donde la

mayoría de las personas conocen que es

la astaxantina el principal responsable

del color rojo-naranja que muestran

(Mata y otros 2010; Sousa y otros 2008;

Spolaore y otros 2006). Muchos informes

se centran en el estudio y la

comprobación de diferentes métodos

para la extracción óptima de

carotenoides desde la biomasa en

comparación con los métodos

tradicionales (Grosso y otros 2015; Mäki‐

Arvela y otros 2014; Sowbhagya y

Chitra, 2010). Grosso et al. (2015). En

general, las metodologías más

relevantes descritas son; (i) extracción de

líquidos a presión atmosférica con

Soxhlet (maceración, microondas o

ultrasonidos), (ii) extracción líquida

presurizada, (iii) extracción asistida por

enzimas y (iv) extracción por fluidos

supercríticos (SFE), que a menudo se

basa en el uso de supercríticos de CO2

(SCCO2). Por otro lado, el método de

extracción desde la oleorresina es la

hidrólisis de la astaxantina esterificada

por una sustancia alcalina, hidrólisis

alcalina, o por enzima, hidrólisis

enzimática, para producir toda la

astaxantina libre antes de ser

cuantificada por HPLC. Varios métodos

de saponificación bajo nitrógeno se han

propuesto para proporcionar xantofilas

libres (Kamata y Simpson, 1987; Yuan y

Chen, 1999). En nuestro caso, el material

de estudio utilizado son las muestras de

oleorresina enriquecidas en carotenoides

(~ 10%, p/p) obtenidas desde la

microalga H. pluvialis por SCCO2.

Finalmente, la idea principal de este

trabajo de investigación es proporcionar

información adicional sobre el potencial

antioxidante mostrado en la oleorresina

desde H. pluvialis extraída por SCCO2

donde los carotenoides específicos de la

misma fueron extraídos por hidrólisis


alcalina. Con estos resultados

prometedores, se abren potenciales

aplicaciones biotecnológicas por

contener elevadas concentraciones de

compuestos en la biomasa y

conservándose a lo largo del tiempo.

2.- Materiales y Métodos

Materiales

El material de estudio fue las

muestras de oleorresinas enriquecidas

de carotenoides (~ 10%, p/p), la cual se

extrajo desde la microalga

Haematococcus pluvialis mediante el

proceso de extracción por fluido

supercrítico con CO2 (SCCO2). La

compañía Chilena denominada Atacama

BioNatural Products S.A.

(www.atacamabionatural.com. Iquique,

Chile) suministró las muestras de

estudio. Todos los químicos usados en

este trabajo fueron de calidad

cromatográfica para HPLC (metanol,

acetonitrilo, acetato de etilo y agua).

Particularmente, los patrones de

calibración usados fueron; astaxantina,

luteína y cantaxantina obtenidos de

Sigma-Aldrich con ≥ 98% pureza.

Preparación de extractos para

hidrólisis alcalina

10 mg de oleorresina se mezcló

con 2 mL de DMSO y 3 mL de acetona, 2

mL de salmuera y 2 mL de n-hexano en

un vial de 15 mL. La mezcla fue volteada

durante 15 segundos y posteriormente

centrifugada (Eppendorf Centrifugue

5702) a 2147×g por 3 min. La fase de n-

hexano contenía los mezcla de los

carotenoides y se recolectó a un vial con

1.0 g de sulfato de sodio para eliminar la

humedad. Las extracciones se repitieron

con 2 mL de n-hexano hasta que el

extracto quedara sin color. La fase n-

hexano fue de nuevo transferida a un vial

de 50 mL donde el solvente se eliminó

mediante rotavapor (BÜCHI R-300) (40

°C) hasta concentrar la totalidad de

carotenoides presentes en la oleorresina.

El pellet seco se resuspendió

nuevamente en 10 mL de acetona para

luego ajustar la concentración de

carotenoides óptima por

espectrofotometría (Shimadzu UV-1280).

El rango de absorbancia fue entre 0.8-1.2

a una longitud de onda de lectura de 474

nm. Finalmente 3 mL de las alícuotas de

este extracto se usó para la hidrólisis

alcalina. Los análisis se realizaron por

triplicado.

Hidrólisis alcalina de extractos

de oleorresinas


3 mL de los extractos se

evaporaron en el rotavapor a 40°C y

posteriormente disueltos en 2 mL de

metanol. La hidrólisis alcalina se llevó a

cabo mediante los métodos modificados

de (Mezquita y otros 2015; Yuan y Chen,

1999). Seguidamente, 0.1 mL de KOH a

10 g kg−1 se añadió a la mezcla y

volteado por 1 min. Los ésteres de

astaxantina se hidrolizaron a

temperatura ambiente bajo N2 y

oscuridad durante 18 h. La fase metanol

se extrajo con n-hexano y se lavó con

salmuera hasta alcanzar pH=7. El

extracto de n-hexano se secó

nuevamente con sulfato de sodio y N2.

Posteriormente, se resuspendió por 3 mL

en acetona para ser analizado por HPLC

(Merck Hitachi Lachrom)

Análisis de carotenoides

específicos mediante HPLC

Cada extracto rico en

carotenoides se filtró mediante filtros de

Ø 0.20 µm PTFE y se usaron en la

separación, identificación y

cuantificación de cada carotenoides

específicos mediante HPLC. El equipo

(Merck Hitachi Lachrom) contenía una

columna de separación RP-18 y detector

UV-vis. El método modificado descrito

por Young et al. 1997 se utilizó para

separar y determinar astaxantina, luteína

y cantaxantina, usando 450 nm como

longitud de onda detección. Las fases

móviles fueron, acetato de etilo (solvente

A) y acetonitrilo-agua (9:1, v/v) (Solvente

B). Los estándares (SIGMA – Aldrich) y

sus correspondientes curvas de

calibración se usaron como referencia

para identificar y cuantificar los

carotenoides específicos en miligramos

de carotenoides por gramos de

oleorresina.

Análisis estadístico

Los resultados experimentales se

expresaron como valores medios ±

desviaciones estándar al realizarse todo

por triplicado. La evaluación estadística

de los resultados se realizó utilizando

métodos estadísticos comunes y el

software de hoja de cálculo de Microsoft

Office Excel 2013. La comparación de la

varianza se efectuó mediante análisis

unidireccional de varianza (ANOVA). Las

diferencias se consideraron significativas

cuando p <0,05.


3.- Resultado y Discusión

En la Figura 1 se presenta un

cromatograma modelo realizado por

HPLC con detector UV-vis de la

oleorresina extraída por SSCO2 a partir

de H. pluvialis. Los extractos de

carotenoides se llevaron a cabo por

hidrólisis alcalina, asegurando así la

totalidad de la extracción de los ésteres

presentes como antioxidantes en la

muestra. En la Tabla 1, se presenta la

concentración expresada en mg de

compuesto bioactivo respecto a los

gramos de oleorresina, siendo además

calculados por el contenido de

carotenoide total, que era alrededor del

10 % de la biomasa total de la

oleorresina. Por lo que se observa, la

presencia de astaxantina es superior a

los otros pigmentos también

antioxidantes, como luteína y

cantaxantina, siendo hasta un 50 %

superior la concentración de astaxantina

respecto a los otros carotenoides

específicos.

La aplicación de pigmentos

naturales con capacidad antioxidante es

cada vez más usado en diversos

formatos. Los carotenoides son

ampliamente usados como aditivos para

colorantes alimentarios en alimentos y es

muy usada la técnica de separación y

cuantificación como el HPLC para

evaluar la estabilidad del compuesto

(Mezquita y otros 2015).

Particularmente, el método de

extracción desde la biomasa es

determinante en la estabilidad del

compuesto, siendo uno de los más

empleados por su eficiencia y

estabilidad, la extracción por fluidos

supercrítico con CO2 (SSCO2) (Poojary y

otros 2016). Estudios actuales identifican

que la técnica SSCO2 es una de las

“tecnologías verdes” sostenibles para la

extracción del propio compuesto y para el

medio ambiente. La técnica utiliza fluidos

en estado supercrítico y en este caso

particular el fluido es el CO2, y estos se

encuentran a temperatura y presión por

encima de su límite crítico en la celda de

extracción del compuesto.

Dado que los fluidos supercríticos

poseen baja viscosidad y alta difusión,

proporcionan propiedades selectivas de

los compuestos a extraer (Lang y Wai,

2001). Otro de los beneficios de la

técnica SSCO2, es el no uso de solventes

orgánicos en la extracción y además el

aumento en el rendimiento de la

extracción (Zougagh y otros 2004).

Actualmente, el CO2 es el disolvente


preferido, ya que puede alcanzar

fácilmente una concentración

supercrítica y tiene varias ventajas

incluyendo baja toxicidad, inflamabilidad

y costo además de alta pureza (Poojary y

otros 2016). Además, se presenta la

necesidad de la extracción de

ingredientes y compuestos funcionales a

partir de fuentes naturales como es la

microalga H. pluvialis. Este organismo

fotosintético posee una elevada

concentración intracelular de

astaxantina, entre otros compuestos,

pero presenta una resistente pared

celular que protege a la astaxantina de

las condiciones medioambientales,

aunque disminuye la biodisponibilidad

del pigmento, lo que hace necesaria su

extracción.

Una alternativa es la extracción

por SSCO2 la cual es capaz de extraer

desde dicha biomasa. Tal como se

observa en la Tabla 1, la mitad de los

carotenoides presentes en la oleorresina

es astaxantina. El método de extracción

desde la oleorresina hidroliza la

astaxantina esterificada por un químico

para producir toda la astaxantina libre

antes de ser cuantificada por HPLC. Esto

implica ver la totalidad de xantofilas

libres.

4.- Conclusiones

La extracción es un problema

significativo en la cuantificación de

carotenoides. Además, la hidrólisis

alcalina mejora la cuantificación de los

mismos desde los extractos de

oleorresina pues extrae todas las

xantofilas dejándolas libres y es mucho

más económica que la hidrólisis

enzimática.

5.- Agradecimientos

Financiamiento al proyecto PAI

n°79160037, VIU-FONDEF-VIU

n°155E0082 y n°15E0050 (CONICYT-

Chile) y a la corporación Atacama Bio

Natural Products S.A. (Iquique, Chile) por

la oleorresina de estudio.


Figura 1. Cromatograma por HPLC-UV vis de carotenoides específicos presentes en la

oleorresina de H. pluvialis extraída por hidrólisis alcalina.

Tabla 1. Concentración de carotenoides específicos presentes en la oleorresina extraída

por Hidrólisis alcalina de H. pluvialis.

Carotenoides

específicos

Concentración

(mg/g oleorresina)

Astaxantina 47.69 ± 2.22

Luteína 23.78 ± 1.12

Cantaxantina 29.57 ± 1.38

6.- Referencias

Atacama Bio Natural Products Inc.

2010. Iquique, Chile. Retrieved

from www.atacamabionatural.com

Amaro HM, Guedes AC, Malcata

FX. 2011. Antimicrobial activities

of microalgae: an invited review.

Science against microbial

pathogens: communicating

current research and


technological advances, 3, 1272-

1284.

Ciccone MM, Cortese F, Gesualdo

M, Carbonara S, Zito A, Ricci G,

De Pascalis F, Scicchitano P.

Riccioni G. 2013. Dietary intake of

carotenoids and their antioxidant

and anti-inflammatory effects in

cardiovascular care. Mediators of

inflammation, 2013. doi:

10.1155/2013/782137

D’Alessandro EB, Antoniosi Filho

NR. 2016. Concepts and studies

on lipid and pigments of

microalgae: a review. Renewable

and Sustainable Energy Reviews,

58, 832-841.

Gouveia L, Coutinho C, Mendonça

E, Batista AP, Sousa I, Bandarra

NM, Raymundo A. 2008.

Functional biscuits with PUFA‐ω3

from Isochrysis galbana. Journal

of the Science of Food and

Agriculture, 88(5), 891-896.

Gross GJ, Hazen SL, Lockwood

SF. 2006. Seven day oral

supplementation with Cardax TM

(disodium disuccinate

astaxanthin) provides significant

cardioprotection and reduces

oxidative stress in rats. Molecular

and cellular biochemistry, 283(1-

2), 23-30.

Grosso C, Valentão P, Ferreres F,

Andrade PB. 2015. Alternative

and efficient extraction methods

for marine-derived compounds.

Marine drugs, 13(5), 3182-3230.

Higuera-Ciapara I, Felix-

Valenzuela L, Goycoolea F. 2006.

Astaxanthin: a review of its

chemistry and applications.

Critical reviews in food science

and nutrition, 46(2), 185-196.

Kamata T, Simpson KL. 1987.

Study of astaxanthin diester

extracted from Adonis aestivalis.

Comparative Biochemistry and

Physiology Part B: Comparative

Biochemistry, 86(3), 587-591.

Lang Q, Wai CM. 2001.

Supercritical fluid extraction in

herbal and natural product

studies—a practical review.

Talanta, 53(4), 771-782.

Li Z, Wakao S, Fischer BB, Niyogi

KK. 2009. Sensing and

responding to excess light. Annual

review of plant biology, 60, 239-

260.

Mäki‐Arvela P, Hachemi I, Murzin

DY. 2014. Comparative study of


the extraction methods for

recovery of carotenoids from

algae: extraction kinetics and

effect of different extraction

parameters. Journal of Chemical

Technology and Biotechnology,

89(11), 1607-1626.

Mata TM, Martins AA, Caetano

NS. 2010. Microalgae for biodiesel

production and other applications:

a review. Renewable and

Sustainable Energy Reviews,

14(1), 217-232.

Mezquita PC, Huerta BEB,

Ramírez JCP, Hinojosa CPO.

2015. Milks pigmentation with

astaxanthin and determination of

colour stability during short period

cold storage. Journal of Food

Science and Technology, 52(3),

1634-1641.

Michalak I, Chojnacka K. 2015.

Algae as production systems of

bioactive compounds.

Engineering in Life Sciences,

15(2), 160-176.

Milner J. 1999. Functional foods

and health promotion. The Journal

of nutrition, 129(7), 1395S-1397s.

Plaza M, Cifuentes A, Ibáñez E.

2008. In the search of new

functional food ingredients from

algae. Trends in Food Science &

Technology, 19(1), 31-39.

Poojary MM, Barba FJ,

Aliakbarian B, Donsì F, Pataro G,

Dias DA, Juliano P. 2016.

Innovative Alternative

Technologies to Extract

Carotenoids from Microalgae and

Seaweeds. Marine drugs, 14(11),

214.

Rao AV, Rao LG. 2007.

Carotenoids and human health.

Pharmacological research, 55(3),

207-216.

Reyes FA, Mendiola JA, Ibañez E,

del Valle JM. 2014. Astaxanthin

extraction from Haematococcus

pluvialis using CO 2-expanded

ethanol. The Journal of

Supercritical Fluids, 92, 75-83.

Saini RK, Keum YS. 2017.

Carotenoid extraction methods: a

review of recent developments.

Food Chemistry.

Sousa I, Gouveia L, Batista AP,

Raymundo A, Bandarra N. 2008.

Microalgae in novel food products.

Food chemistry research

developments, 75-112.


Sowbhagya H, Chitra V. 2010.

Enzyme-assisted extraction of

flavorings and colorants from plant

materials. Critical reviews in food

science and nutrition, 50(2), 146-

161.

Spolaore P, Joannis-Cassan C,

Duran E, Isambert A. 2006.

Commercial applications of

microalgae. Journal of bioscience

and bioengineering, 101(2), 87-

96.

Varela JC, Pereira H, Vila M, León

R. 2015. Production of

carotenoids by microalgae:

achievements and challenges.

Photosynthesis Research, 125(3),

423-436.

Yuan JP, Chen F. 1999.

Hydrolysis kinetics of astaxanthin

esters and stability of astaxanthin

of Haematococcus pluvialis during

saponification. Journal of

Agricultural and Food Chemistry,

47(1), 31-35.

Zougagh M, Valcárcel M, Rıos A. 2004.

Supercritical fluid extraction: a critical

review of its analytical usefulness. TrAC

Trends in Analytical Chemistry, 23(5),

399-405.


COMPOSICIÓN BIOACTIVA DE OLEORRESINA DE LA MICROALGA

Documents

Transcript of COMPOSICIÓN BIOACTIVA DE OLEORRESINA DE LA MICROALGA