Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosas y sus mezclas co

Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosas ysus mezclas con ß-lactoglobulina en solución,

interfases y emulsionesCamino, Nerina Andrea

2010

Tesis Doctoral

Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesUniversidad de Buenos Aires

www.digital.bl.fcen.uba.ar

Contacto: [email protected]

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Fuente / source: Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires

Universidad de Buenos Aires

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Industrias

COMPORTAMIENTO DE

HIDROXIPROPILMETILCELULOSAS Y SUS MEZCLAS

CON -LACTOGLOBULINA EN SOLUCIÓN,

INTERFASES Y EMULSIONES.

Tesis para optar al título de

Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Química Industrial

Ing. Nerina Andrea Camino

Director de tesis: Dra. Ana M.R. Pilosof

Buenos Aires, 2010

Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosas y sus mezclas con -lactoglobulina en

solución, interfases y emulsiones.

Resumen

El objetivo del presente trabajo fue estudiar la funcionalidad de

hidroxipropilmetilcelulosas y sus mezclas con lactoglobulina en coloides alimentarios.

Los estudios realizados muestran que estos polisacáridos en solución presentan un

comportamiento complejo que se manifiesta en la asociación/autoensamblaje mediado por

interacciones hidrofóbicas y modulado fuertemente por el pH, como también por la

concentración y la temperatura.

A pH3 la asociación/autoensamblaje de hidroxipropilmetilcelulosas se ve impedida en

solución. El grado de asociación/autoensamblaje también puede modificarse por la

aplicación de ultrasonidos de lata intensidad, impactando en algunas propiedades físico-

químicas de las celulosas. En la interfase aceite/ agua, las hidroxipropilmetilcelulosas,

especialmente las de bajo peso molecular, presentan una importante actividad, la cual está

modulada también por el pH.

Las hidroxipropilmetilcelulosas presentan buenas propiedades emulsificantes a ambos

pH.

En las mezclas con lactoglobulina se observa la misma tendencia con la variación del

pH y la concentración de los biopolímeros en las mezclas. Existe distinta interacción entre

ellos lo cual afecta su comportamiento en solución y en los coloides estudiados.

Así, el conocimiento y la caracterización de estos biopolímeros permitirán la

manipulación de propiedades macroscópicas de productos alimenticios, controlando las

interacciones de un modo deseable, logrando así la optimización en el uso de los

ingredientes.

Palabras claves: hidroxipropilmetilcelulosa, -lactoglobulina, interacción, interfases,

emulsiones.

Behaviour of hydroxypropylmethylcelluloses and its mixtures with -lactoglobulin

in solution, interfaces and emulsions.

Abstract

The objective of the present work was to study the hydroxypropylmethylcelluloses and

their mixtures with lactoglobulin in food colloids. The studies showed that these

polysaccharides have a complex behavior in solution, leading to self-assembled

structures by hydrophobic interactions, strongly modulated by pH, but also by

polysaccharide concentration and temperature.

Particularly at pH3, the hydroxypropylmethylcelluloses self-assembly would be

impeded. The self- assembly degree could also be modified by the application of high-

intensity ultrasound that impacted in some physico-chemical properties. At the oil-water

interface, the hydroxypropylmethylcelluloses, especially those with low molecular

weight, showed a high interfacial activity also modulated by pH.

Good emulsifying activity was observed for all the hydroxypropylmethylcelluloses at

both pH.

The same was observed in the mixtures with -lactoglobulin as affected by pH and

concentration of componenets. The different interactions observed affected their

behavior in solution and in food colloids (interfaces and emulsions).

Thus, the knowledge and the characterization of these biopolymers would allow the

manipulation of the macroscopic properties of food products and optimizing the use of

these ingredients.

Keywords: hydroxypropylmethylcellulose, -lactoglobulin, interactions, interfaces,

emulsions.

Agradecimientos

A la Dra Ana Pilosof por su constante guía y apoyo, por enseñarme a investigar, por su

invaluable aporte durante el trabajo de investigación y escritura de mi tesis, por

demostrarme su confianza y por los buenos consejos que necesité en muchas

oportunidades. Valoro mucho el poder trabajar junto a ella día a día.

A mis padres por su amor infinito, por su presencia incondicional, por enseñarme tantas

cosas en la vida, por su apoyo constante y porque son mi ejemplo en todo. A mis

hermanos porque los adoro con el corazón, por todos los momentos compartidos y por

su apoyo en todas las decisiones de mi vida.

A Augusto por su constante presencia y apoyo durante estos años, y porque junto a el

conocí el verdadero amor.

A mis amigas de toda la vida, Mari, Andre, Sabi, Sil, por la hermosa amistad que

compartimos, por sus valiosos consejos y porque siempre están conmigo.

A mis compañeros, con quienes comparto mi trabajo diario en el laboratorio, por el

aporte de cada uno en la realización de mi tesis. A Kari, con quien comparto tantas

charlas, por sus consejos y presencia en todo momento y porque en ella encontré una

amiga. A Caro, porque me escuchó, me acompañó y me brindó su amistad en un

momento muy difícil de mi vida. A Oscar por su orientación y predisposición constante

y por ayudarme en muchas mediciones. A Edith, Federico, Julia, Mariana, Paula, Victor

y Rosa por tantos momentos vividos.

A todos los integrantes del grupo de Pilar Buera, por los cumpleaños, congresos,

despedidas compartidos. En especial a Lidia por su inmensa ayuda y colaboración en

este trabajo.

Al Dr Juan Miguel Rodríguez Patino por recibirme en su laboratorio en Sevilla para

realizar mis estudios de interfase, por la orientación en la interpretación de los

resultados y por solucionar rápidamente el problema en el funcionamiento del Tracker

para que pueda terminar mis ensayos. A Cecilio Carrera Sánchez por su guía en el uso

de los equipos, análisis e interpretación de los resultados.

Al CONICET y la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica por haber

financiado mi doctorado con las becas que me otorgaron.

Al Programa Iberoamericano CYTED por haber financiado mi estancia en la

Universidad de Sevilla.

A la Universidad de Buenos Aires, que junto a la Agencia Nacional de Promoción

Científica y Tecnológica brindaron el financiamiento para la realización del trabajo de

investigación.

A todos los integrantes del Departamento de Industrias, que durante estos años de mi

doctorado han participado en mi formación académica y en la docencia que actualmente

realizo.

De corazón, muchas gracias a todos.

A mis padres,

a mis hermanos,

a Augusto

i

Índice Introducción

1. Propiedades funcionales de proteínas y polisacáridos..………………………………….… 1

2. Características de Hidroxipropilmetilcelulosa…………………………………………….. 4

2.1 Celulosa y derivados de celulosa…………………………………………………. 4

2.2 Estructura química ……………………………………………………………….. 4

2.3 Propiedades físicas y químicas……………………………………………………. 5

2.4 Caracterización de los éteres de celulosa………………………………………….. 7

2.5 Hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) ……………………………………………… 7

2.5.1 Antecedentes del empleo de las HPMC en sistemas dispersos………….. 9

3. Características de く-lactoglobulina…………………………………………………………. 11

3.1 Estructura primaria de la く –lactoglobulina…………………………………………12

3.2 Estructura secundaria de la く –lactoglobulina………………………………………12

3.3 Conformación de la く -lactoglobulina ………………………………………………12

3.4 Asociación entre moléculas de く –lactoglobulina………………………………….14

4. Caracterización del estado de asociación de proteínas y polisacáridos en solución…………14

4.1 Dispersión dinámica de luz………………………………………………………...14

5. Propiedades interfaciales de proteínas y polisacáridos……………………………………..16

5.1 Termodinámica de adsorción de biopolímeros…………………………………….16

5.2 Cinética de adsorción en interfases………………………………………………...18

5.2.1 Conformación de los polímeros tensioactivos en la interfase……………19

5.3 Propiedades de las películas poliméricas …………………………………………..22

6. Emulsiones aceite-agua………………………………………………………………………26

6.1 Procesos de formación de emulsiones……………………………………………...27

6.1.1 Homogeneización primaria y homogeneización secundaria……………..27

6.1.2 Procesos críticos durante la formación de emulsiones…………………...28

6.1.3 Fuerzas de ruptura en el proceso de homogeneización…………………..29

6.1.4 Equipos de homogeneización…………………………………………….31

6.2 Evaluación de la eficiencia de los procesos de homogeneización…………………34

6.2.1. Métodos basados en la dispersión de luz ……………………………….34

6.2.2. Distribuciones de tamaño de partículas…………………………………35

6.3 Estabilidad de emulsiones: estabilidad termodinámica y estabilidad cinética…….42

ii

6.4 Mecanismos físicos de desestabilización de emulsiones…………………………46

6.4.1. Cremado…………………………………………………………………49

6.4.2. Floculación………………………………………………………………51

6.4.3. Coalescencia…………………………………………………………….53

6.5 Evaluación de la estabilidad global de una emulsión por medidas de dispersión

múltiple de luz…………………………………………………………………………55

Objetivos

Objetivo general……………………………………………………………………………….57

Objetivos específicos………………………………………………………………….57

Materiales y métodos.

1. Materiales………………………………………………………………………………....59

1.1 Hidroxipropilmetilcelulosa……………………………………………………….59

1.2 く –lactoglobulina………………………………………………………………….60

1.3 Aceite vegetal……………………………………………………………………..60

2. Métodos…………………………………………………………………………………….60

2.1 Preparación de las soluciones de polisacárido y proteína………………………..60

2.2 Determinación de la viscosidad de las soluciones………………………………..61

2.3 Tratamiento de ultrasonido de alta intensidad……………………………………62

2.4 Evaluación visual de la gelificación. Ensayos de inclinación o tilting test………63

2.5 Determinación de la distribución y tamaño de partícula de las soluciones………63

2.6 Determinación de la carga superficial de las partículas en solución……………. 66

2.6.1 Principio de funcionamiento…………………………………………… 67

2.7 Calorimetría diferencial de barrido (DSC)………………………………………..70

2.8 Resonancia magnética nuclear (NMR)……………………………………………71

2.9 Reología dinámica ………………………………………………………………..71

2.10 Emulsiones………………………………………………………………………73

2.10.1 Preparación de las emulsiones……………………………………….. 73

2.10.2 Determinación de la distribución y tamaño de partícula…………….. 74

2.10.2 Determinación de la carga superficial de las emulsiones……………..75

2.10.3 Determinación de la estabilidad de las emulsiones…………………...75

2.10.4 Determinación de la microestructura de las emulsiones.

Microscopia confocal…….……………………………………………76

iii

2.10.5 Determinación la viscosidad de las emulsione…………………………77

2.11 Propiedades interfaciales…………………………………………………78

2.11.1 Determinación de la tensión interfacial/superficial…………… 78

2.11.1.1Tensiómetro tipo Wilhelmy (determinación de isotermas

vs concentración)…………………………………………... 78

2.11.1.2 Tensiómetro de Gota……………………………….. 82

2.11.2 Determinación de la reología de las películas interfaciales…… 89

Resultados

Sección I. Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosa en solución, interfases y

emulsiones.

Capítulo 1. Caracterización del estado de asociación de hidroxipropilmetilcelulosas en solución

por dispersión dinámica de luz.

1.1 Distribución de tamaño de partículas en soluciones de HPMC a pH3 y pH 6………..92

1.2 Efecto de la temperatura en la distribución de tamaño de partícula en las

soluciones de HPMC apH6………………………………………………………….101

1.3 Distribución de tamaño de partículas en soluciones de mezclas de HPMC

y agentes disociantes a pH 6 y temperatura ambiente……………………………. . 107

1.4 Conclusión…………………………………………………………………………..110

Capítulo 2. Efectos de ultrasonidos de alta intensidad en el estado de asociación de

hidroxipropilmetilcelulosas y su impacto en las propiedades funcionales.

2.1 Usos de ultrasonidos de alta intensidad……………………………………….…..111

2.2 Distribución de tamaño de partículas en soluciones de HPMC a pH3 y

pH6 después del tratamiento de ultrasonido……………………..……………….113

2.3 Evolución del tamaño de partícula de las soluciones de HPMC después

del tratamiento de ultrasonido…………………………………………………….117

2.4 Impacto del tratamiento de ultrasonido en la emulsificación y gelificación

de las HPMCs…………………………………………………………………….119

2.5 Impacto del tratamiento de ultrasonido en la viscosidad y movilidad

del agua de soluciones de HPMC………………………………………………….122

2.6 Conclusión…………………………………………………………………………126

iv

Capítulo 3.Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosas en la interfase aceite-agua y

comparación con la interfase aire-agua.

3.1 Comportamiento comparativo de HPMCs en interfases A/W y O/W…………...127

3.1.1 Isotermas de adsorción en la interfase A/W y O/W……………………128

3.1.2 Dinámica de adsorción en la interfase A/W y O/W……………………133

3.1.3 Cinética de adsorción en la interfase A/W y O/W……………………..136

3.1.4 Características viscoelásticas de las películas en la interfase

A/W y O/W………………………………………………………………140

3.2 Efecto del pH en las propiedades interfaciales de HPMC en interfases O/W…..146

3.2.1 Efecto del pH en la dinámica de adsorción de HPMC…………………146

3.2.2 Efecto del pH en la cinética de adsorción de HPMC…………………..150

3.2.3 Efecto del pH en las características viscoelásticas de las películas

de HPMCs……………………………………………………………….152

3.3 Conclusión……………………………………………………………………….160

Capítulo 4.Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosas en emulsiones O/W.

4.1 Características iniciales de las emulsiones……………………………………..161

4.1.1 Distribución de tamaño de gota en emulsiones preparadas con

Ultraturrax (UT)……..………………………………………………..161

4.1.2 Distribución de tamaño de gota en emulsiones preparadas con

ultrasonidos de alta intensidad (USAI)………………………………167

4.2 Estabilidad de las emulsiones preparadas con UT y USAI frente al

almacenamiento estacionario a temperatura ambiente………………………..173

4.2.1 Microscopía óptica de las emulsiones iniciales………………….....177

4.2.2 Estabilidad frente al cremado-floculación…………………………...179

4.2.3 Estabilidad frente a la coalescencia………………………………….183

4.3 Conclusión……………………………………………………………………...188

Conclusión general Sección I……………………………………………………………..190

v

Sección II. Comportamiento de mezclas de hidroxipropilmetilcelulosa y -lactoglobulina en

solución, interfases O/W y emulsiones.

Introducción……………………………………………………………………………...191

Capítulo 1. Caracterización de mezclas de hidroxipropilmetilcelulosa y -lactoglobulina en

solución y en la interfase O/W.

1.1 Comportamiento de soluciones mixtas de HPMCs y lg a pH3 y pH6……..198

1.2 Comportamiento de mezclas de HPMCs y lg en la interfase O/W………….206 1.2.1 Dinámica de adsorción y características viscoelásticas de

las películas a pH6……………………………………………….206 1.2.2 Dinámica de adsorción y características viscoelásticas

de las películas a pH3………………………………………..…212

1.3 Conclusión……………………………………………………………………215

Capítulo 2. Comportamiento de mezclas de hidroxipropilmetilcelulosas y -lactoglobulina en

emulsiones O/W.

2.1 Características iniciales de las emulsiones de mezclas de E5LV y lg………218

2.2 Estabilidad de las emulsiones frente al almacenamiento

estacionario a temperatura ambiente……………………………………….222

2.2.1 Estabilidad frente al cremado-floculación…………………………222

2.2.1 Estabilidad frente a la coalescencia………………………………..223

Conclusión general Sección II…………………………………………………………..226

Bibliografía……………………………………………………………………………....227

Introducción

Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W

1

1. Propiedades funcionales de proteínas y polisacáridos

Las proteínas y polisacáridos son biopolímeros complejos que desempeñan un rol

fundamental en las características organolépticas y estructurales de los alimentos, las cuales

inciden en la aceptabilidad por parte de los consumidores. Ambos son componentes muy

versátiles que cumplen funciones como espesantes, gelificantes, emulsionantes y espumantes

en los alimentos.

Se entiende por propiedades funcionales a las propiedades físico-químicas de

polisacáridos y proteínas que afectan su comportamiento en los productos alimentarios ya sea

durante la preparación, el procesado almacenamiento o consumo de los mismos, es decir,

cualquier propiedad (con excepción de las nutricionales) que afecta su utilización (Hall,

1996).

Las proteínas son las más susceptibles a cambios en su funcionalidad de acuerdo a la

condiciones del medio o procesamiento, debido a su compleja estructura molecular.

Las propiedades funcionales pueden categorizarse en tres grandes grupos (Cheftel y col,

1989):

Propiedades de hidratación: dependientes de las interacciones de la proteína o

polisacárido con el agua. Entre ellas se encuentran la adsorción y retención de

agua, dispersibilidad, solubilidad y viscosidad.

Propiedades dependientes de las interacciones intermoleculares: precipitación,

floculación y gelificación.

Propiedades superficiales: emulsificación y espumado.

La evaluación de la funcionalidad de una proteína o un polisacárido se realiza mediante

la determinación de propiedades fisicoquímicas bien definidas como la viscosidad o tensión

superficial o mediante ensayos sobre su aplicación, como son la medida de la pérdida de agua

de un producto, el volumen de espuma formado a partir de una solución de proteína o el

volumen de pan después de la cocción.

Las propiedades funcionales se pueden evaluar en principio en sistemas modelo que

contienen a una única proteína o polisacárido. A partir del conocimiento del comportamiento

y propiedades de los sistemas modelos se puede avanzar hacia el estudio de sistemas más

complejos y finalmente lograr la formulación de productos que sean viables para su

producción industrial.

Introducción

2

En este trabajo se estudiaron diferentes hidroxipropilmetilcelulosas (HPMC) y como

proteína se seleccionó la く-lactoglobulina (lg).

¿Por qué resulta interesante estudiar las propiedades en solución, interfases y

emulsionantes de HPMC y sus interacciones con lg?

i) Las hidroxipropilmetilcelulosas son derivados de la celulosa, la sustancia orgánica

más abundante en la naturaleza. Posee sustituyentes hidrofóbicos que le permiten

comportarse como surfactante en la interfase aire-agua y aceite-agua, característica

que presentan muy pocos polisacáridos. Se ha encontrado que la HPMC es más

activa superficialmente que las proteínas lácteas (Arboleya y Wilde, 2005; Mezdour

y col, 2007; Pérez, y col., 2007) pero existe en la bibliografía muy pocos estudios de

su comportamiento en la interfase aceite-agua. Ha sido ampliamente utilizada en la

industria farmacéutica como adsorbente de drogas y en su liberación controlada. En

la industria de alimentos la hidroxipropilmetilcelulosa es empleada en una gran gama

de productos alimenticios. Los productos basados en proteínas frecuentemente

necesitan estabilizantes para prolongar su vida útil durante el almacenamiento a

temperatura ambiente o en refrigeración, estos polisacáridos pueden ser agregados

para lograr este objetivo (Coffey y col, 1995). Actualmente existe una fuerte

tendencia en la industria hacia la producción de alimentos reducidos en calorías, esto

resulta en una nueva aplicación de HPMC ya que este polisacárido imparte buenas

características de textura (Mälkki y col, 1993). En particular las HPMC, que son

interfacialmente activas, ofrecen la posibilidad de imitar la textura de los lípidos en

estos productos. También se ha empleado HPMC en la formulación de productos

panificados sin harina de trigo para celíacos (Kobylañsky y col, 2003). Pueden

proveer además estabilidad contra la coalescencia de gotas en emulsiones durante el

almacenamiento.

ii) La -lactoglobulina es la proteína mayoritaria del suero lácteo, de gran valor

biológico y amplia funcionalidad. Es la proteína mayoritaria del suero lácteo,

subproducto de la industria quesera producto de la industria quesera. Por diferentes

técnicas (membranas de ultrafiltración, secado spray, nanofiltración) se obtienen,

suero en polvo por medio de secado spray, concentrados de proteínas, aislados de


3

proteínas y proteínas aisladas como la lg y -lactalbúmina. Estos productos

encuentran gran aplicación en la industria de alimentos.

iii) Generalmente las proteínas y los polisacáridos se encuentran en forma simultánea en

un alimento. Las interacciones proteína – polisacárido juegan un rol significativo en

la estructura y estabilidad de muchos alimentos procesados. El control o la

manipulación de estas interacciones macromoleculares, son un factor clave para el

desarrollo de nuevas texturas y estructuras en los alimentos así como la obtención de

nano y micro estructuras para diferentes aplicaciones (Tolstoguzov, 1997,

McClements, 2006).

Introducción

4

2. Características de Hidroxipropilmetilcelulosas.

2.1 Celulosa y derivados de celulosa

La celulosa es la sustancia orgánica más abundante en la naturaleza, se ha estimado que

anualmente las plantas sintetizan aproximadamente 1011 toneladas (Bovey y Winslow,

1981). Por lo tanto no sorprende que la humanidad haya hecho uso de la celulosa desde

tiempos inmemoriales con distintos fines, para obtener papel, en la minería, en la

construcción e industrias relacionadas y últimamente como una fuente de bioenergía.

Estas aplicaciones conciernen tanto a la celulosa en su estado natural o modificada física o

químicamente.

La celulosa es el principal componente de las paredes celulares de plantas y algas

verdes. Este polímero se presenta en la madera en un 40 – 50%, 80% en fibras de lino y

90% en las fibras de algodón (Marchessault y Sundararajan, 1983). La purificación

comercial de la celulosa se realiza a partir de las fibras de algodón y de la pulpa de

madera, en el primer caso por el alto contenido en este polisacárido y en el segundo por la

accesibilidad de este recurso. En su estado natural la celulosa es difícil de purificar ya que

es insoluble en los solventes comerciales. Así, el aislamiento de la celulosa en su forma

pura incluye tratamiento alcalino para la remoción de ceras, proteínas y ligninas. Las

pulpas destinadas a la obtención de éteres de celulosa sufren pasos de extracción alcalina

adicionales para remover polisacáridos de bajo peso molecular llamados hemicelulosas y

aumentar la fracción de la celulosa pura o alfa (Coffey y col, 1995).

2.2 Estructura química

Químicamente difiere del almidón simplemente por tener uniones く-1,4 en lugar de α-

1,4 con la glucosa. Sin embargo, este pequeño cambio se traduce en una gran diferencia

en sus propiedades funcionales. La celulosa es un poliacetal く-1,4 de 4-O-く-D-

glucopiranosil-D-glucosa (celobiosa) ya que la unidad básica consiste de dos unidades de

glucosa unidas por unión く-1,4 (Coffey y col, 1995). La configuración く-1,4 da como

resultado una estructura lineal y rígida para el polímero (Figura 1). La relativa

abundancia de grupos hidroxilo y la tendencia a formar puentes hidrógeno tanto intra

como intercatenarios es la causa de la formación de agregados lineales los cuales

contribuyen a la rigidez de las paredes celulares y a la relativa insolubilidad de la celulosa

en los solventes comunes, particularmente el agua.


5

Figura 1. Estructura química del polímero lineal de celulosa.

El tamaño molecular puede ser apropiadamente descripto en términos del grado de

polimerización (DP), el cual representa el valor promedio del número de unidades

monoméricas. En estado sólido la celulosa posee zonas cristalinas distribuidas entre

zonas menos ordenadas, amorfas, que constituyen regiones donde los grupos hidroxilo

están más expuestos para participar en una reacción. La reactividad de la celulosa

dependerá de su origen y de las condiciones de aislamiento y purificación.

Distintas técnicas demostraron que las moléculas de celulosa se presentan unidas por

puentes hidrógeno y fuerzas electrostáticas en microfibrillas, las cuales en ciertas áreas

tienen las cadenas en capas apiladas. Estas son las áreas organizadas en forma regular que

constituyen regiones cristalinas discretas conocidas como cristalitos (Coffey y col, 1995).

2.3 Propiedades físicas y químicas

La celulosa es un material higroscópico, insoluble pero capaz de absorber agua, ácidos

diluídos y muchos solventes. Las reacciones químicas en las que participa la celulosa

están determinadas por su naturaleza polimórfica. Las regiones amorfas, menos

ordenadas, son los puntos donde todas las reacciones químicas se inician. Por su parte,

poca o ninguna participación incumbe a las regiones cristalinas más ordenadas (Rorrer y

Hawley, 1993).

Las soluciones alcalinas concentradas penetran la celulosa por absorción y por

subsecuente atracción capilar entran en las regiones cristalinas provocando la disrupción

de las mismas. Este proceso denominado mercerización, es usado para activar a la

celulosa en la producción de éteres de celulosa.

Introducción

6

Es posible mejorar las propiedades de la celulosa a través de modificaciones que

pueden ser físicas o químicas. Una de las modificaciones físicas más comunes consiste en

hacer atravesar una pasta de celulosa por tamices de pequeños orificios bajo condiciones

de gran esfuerzo de corte y altas presiones diferenciales (Coffey y col, 1995). Así se

obtienen las celulosas microfibriladas las cuales tienen mayor capacidad de retención de

agua y son menos propensas a la precipitación. Por modificaciones físicas también se

obtiene la celulosa microcristalina que es producida tratando a la celulosa natural con

ácido clorhídrico para disolver las regiones amorfas del polisacárido, persistiendo

solamente las regiones cristalinas. Estas celulosas generan soluciones donde la viscosidad

no varía con el pH o la temperatura (Brownsey y Redout, 1985).

Si bien existen numerosos derivados obtenidos por modificaciones químicas de la

celulosa natural, sólo unos pocos éteres de celulosa han encontrado aplicación en la

industria alimentaria. Los derivados más comúnmente usados son la

carboximetilcelulosa, metilcelulosa, e hidroxipropilmetilcelulosa. Estos dos últimos son

empleados debido a la capacidad de formar geles termorreversibles y por sus propiedades

interfaciales (Kobashashi y col, 1999; Sarkar y Walker, 1995).

Aunque la variedad de éteres de celulosa es amplia, todos ellos son obtenidos

esencialmente de igual forma (Kondo, 1993). El proceso de producción puede ser

dividido en tres etapas:

I. Obtención del álcali de celulosa. Para ello, se trata a la pulpa de celulosa con

soluciones concentradas de hidróxido de sodio (35 – 60%, p/v). Esta mezcla se deja

reposar durante un tiempo y a una temperatura y presión determinadas para asegurar la

reacción completa. La viscosidad del producto final se controla con el tiempo de reposo.

II. Alquilación o hidroxialquilación. La alquilación se da cuando el producto buscado

es metilcelulosa. El álcali de celulosa reacciona con cloruro de metilo para generar la

metilcelulosa y cloruro de sodio. En cambio durante la hidroxialquilación, el álcali de

celulosa reacciona con óxido de propileno generando hidroxipropilcelulosa. Para obtener

la hidroxipropilmetilcelulosa, se somete a la hidroxipropilcelulosa a alquilación.

III. Purificación final del producto. Debido a que los derivados de celulosa gelifican

durante el calentamiento y los subproductos generados durante las etapas anteriores

tienden a precipitar, el lavado de la pasta conteniendo los derivados en agua a altas

temperaturas constituye un medio eficiente para lograr la separación buscada.

El peso molecular de estos polímeros se manifiesta en la viscosidad de sus soluciones,

así a medida que el peso molecular disminuye, la viscosidad disminuye. Para estos


7

derivados de celulosa la propiedad más importante es entonces la viscosidad (Coffey y

col, 1995).

2.4 Caracterización de los éteres de celulosa

Además de los sustituyentes presentes en el esqueleto carbonado de celulosa y la

viscosidad de sus soluciones, normalmente medidas a concentraciones de 1 o 2% p/v, estos

productos se caracterizan por el grado de sustitución (DS) y la sustitución molar (MS).

Cada unidad de anhidroglucosa en la molécula de celulosa tiene tres grupos hidroxilo

disponibles para la derivatización. De esta manera, si los tres grupos fueran sustituidos el

producto tendría un DS igual a 3. Si un número promedio de dos sobre tres hidroxilos totales

hubieran reaccionado, entonces el DS sería 2 y así sucesivamente. El término DS se relaciona

con aquellos sustituyentes que bloquean los grupos hidroxilo reactivos. Los sustituyentes que

permiten el crecimiento posterior de la cadena son caracterizados por la sustitución molar

(MS). Es decir, el DS define el número de grupos hidroxilos por unidad de glucosa anhidra en

donde el átomo de hidrógeno es reemplazado. MS representa el número promedio de grupos

de oxido de propileno por unidad de glucosa anhidra (Nahringbauer, 1995).

La derivatización de los grupos hidroxilo reactivos con óxido de propileno genera a su

vez sitios hidroxilo disponibles para posteriores reacciones. De esta manera la reacción

continúa con la extensión de la cadena. La proporción de MS/DS da la longitud promedio

de las cadenas de los sustituyentes laterales.

2.5 HIDROXIPROPILMETILCELULOSA (HPMC)

La hidroxipropilmetilcelulosa es un derivado de celulosa que forma parte de una familia

que incluye entre otros a la metilcelulosa (MC), en la cual los sustituyentes son grupos metilo

y a la metilhidroxietilcelulosa (MHEC) la que posee como sustituyentes grupos hidroxietilo

hasta en un 5%. La HPMC presenta en su cadena grupos metilo e hidroxipropilos (Figura 2).

Difieren principalmente entre si en su peso molecular, viscosidad, grado de sustitución (DS) y

sustitución molar (MS).

A lo largo de la cadena de celulosa, los grupos metilos constituyen zonas hidrofóbicas

mientras que los grupos hydroxipropilos son más hidrofílicos. La introducción de estos

substituyentes permite a la HPMC comportarse como surfactante.

Introducción

8

La utilidad de los éteres no iónicos de celulosa se basa fundamentalmente en cuatro

atributos: son espesantes eficientes, presentan actividad superficial, tienen la habilidad de

formar películas interfaciales y la capacidad de formar geles termorreversibles.

Las interacciones hidrofóbicas son responsables de la formación de los geles de HPMC

durante el calentamiento. A medida que la temperatura aumenta, las moléculas adsorben

energía traslacional y pierden gradualmente su hidratación, resultando en una menor

viscosidad. Tienen lugar las interacciones polímero-polímero, debido a interacciones entre los

grupos hidrofóbicos, causando así opacidad en la solución y una red infinita que provoca un

aumento brusco en la viscosidad y la turbidez si la concentración es relativamente alta

(Sarkar y Walker, 1995).

La mayoría de los polisacáridos, siendo hidrofílicos, no tienen tendencia a adsorberse a la

interfase aire-agua o aceite-agua (Baeza y col, 2004.; Huang y col, 2001; Perez y col, 2006).

La HPMC tiende a concentrarse en interfases tanto aire – agua como aceite – agua (Daniels y

Barta, 1993,1994; Ochoa- Machiste y Buckton, 1996; Wollenweber y col, 2000). Con el

incremento en el grado total de sustitución (DS + MS), la hidrofobicidad del polisacárido y así

su actividad interfacial aumentan (Perez y col, 2006; Wollenweber y col, 2000).

La propiedad de comportarse como surfactante es el resultado de la sustitución heterogénea

en el polímero, es decir que hay zonas del polímero ricas en grupos hidrofílicos y otras ricas

en grupos hidrofóbicos. La concentración de este polisacárido en la interfase de soluciones

diluidas puede ser varias veces superior. Esta propiedad puede entonces conducir a la

estabilización de espumas y emulsiones y tener efectos positivos en la estructura de cortezas

panarias, leudado de masas de panadería, etc.

Figura 2. Estructura química de hidroxipropilmetilcelulosa.

Grupo metilo Grupo hidroxipropilo


9

La HPMC es un polisacárido que tiene numerosas aplicaciones, si bien el interés

fundamental reside en el aspecto alimentario, es importante destacar que la industria de

pinturas, la cosmética y la farmaceútica también hacen uso de este polímero en grandes

cantidades. La industria farmaceútica centra sus investigaciones en el empleo de las HPMC en

la liberación controlada de drogas (Ford, 1999) y como adsorbentes de drogas (Nilsonn,

1995). La hidroxipropilmetilcelulosa es empleada en una gran gama de productos

alimenticios. Los productos basados en proteínas frecuentemente necesitan estabilizantes para

prolongar su vida útil durante el almacenamiento a temperatura ambiente o en refrigeración,

estos polisacáridos pueden ser agregados para lograr este objetivo (Coffey y col, 1995).

En productos fritos, estos polisacáridos se usan como rebozador ya que tienen la capacidad

de impedir la pérdida de humedad durante la cocción por formar un gel alrededor del alimento

y simultáneamente bloquean la absorción de aceite.

Las HPMC tienen aplicación como espesantes y como ligantes de agua reduciendo la

sinéresis en alimentos fluidos como salsas, sopas y jarabes. Pueden proveer además

estabilidad contra la coalescencia de gotas en emulsiones durante el almacenamiento. En el

caso de productos batidos, es necesario mantener la integridad estructural de las celdas que

encierran a la fase aire. El polímero es capaz de acumularse en la interfase aire – agua

sufriendo gelificación por su alta concentración en la interfase y como consecuencia estabiliza

el sistema (Coffey y col, 1995).

La HPMC puede ser usada también en productos congelados ya que contribuye al control

del crecimiento de los cristales y a modificar la reología del producto. Esta aplicación tiene

mucha importancia en los productos batidos congelados donde el polisacárido contribuye a la

retención de aire. También en congelados se lo ha empleado para producir texturas similares a

la generada por lípidos en postres congelados bajos en calorías.

2.5.1 Antecedentes del empleo de las HPMC en sistemas dispersos.

La región interfacial que separa las fases aceite y acuosa constituye sólo una pequeña

fracción del volumen total de una emulsión. Sin embargo, tiene un impacto directo en las

propiedades fisicoquímicas y sensoriales de las emulsiones alimentarias, incluyendo su

formación, estabilidad, reología y aroma (McClements, 1999).

El uso de emulsificantes retarda la ruptura de una emulsión. Los emulsificantes son

sustancias con actividad superficial que se adsorben en la superficie de la gotas recién

formadas durante la homogeneización. Una vez en la interfase, facilitan la reducción en el

Introducción

10

tamaño de gota durante el proceso de homogeneización mediante la disminución de la tensión

interfacial. Los emulsificantes reducen también la tendencia de las gotas a la agregación

formando un film protector y/o generando fuerzas repulsivas entre las gotas. Un buen

emulsificante debe adsorberse rápidamente en la superficie de las gotas, disminuir la tensión

interfacial en gran medida y proteger a las gotas contra la agregación durante el

procesamiento de las emulsiones, almacenamiento y utilización (McClements, 1999; Moreau

et al., 2003).

Akiyama y col (2005) indicaron que una buena habilidad espesante del polímero, la

formación de un film elástico y el efecto protector del polímero mediante su adsorción a la

interface aceite-agua son las responsables de la estabilidad de las emulsiones aceite-agua.

Una amplia variedad de emulsificantes sintéticos y naturales pueden emplearse en las

emulsiones alimentarias, incluyendo a surfactantes de bajo peso molecular, fosfolípidos,

proteínas y polisacáridos (Moreau y col., 2003). Dentro del último grupo, se encuentran los

derivados de celulosa que presentan una gran tendencia a acumularse en la interface aire-agua

y aceite-agua (Nahringbauer, 1995). Sin embargo, sólo cuatro de ellos son utilizados en el

área de alimentos: metilcelulosa (MC), carboximetilcelulosa (CMC), hidroxipropilcelulosa

(HPC) e hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). Se ha encontrado que la HPMC es más activa

superficialmente que las proteínas lácteas (Arboleya y Wilde, 2005; Mezdour y col, 2007;

Pérez, y col., 2007).

Las HPMCs se comporten como surfactantes. Así, las HPMCs se adsorben en las interfases

líquidas disminuyendo la tensión interfacial (Daniels y Barta, 1993; Daniels y Barta, 1994;

Nahringbauer, 1995; Ochoa Machiste y Buckton, 1996; Wollenweber y col., 2000). Si bien

existe en la bibliografía un amplio estudio de la adsorción de las HPMC en la interfase aire-

agua (Perez y col., 2006, Nahringbauer, 1995, Perez y col., 2007, Perez y col, 2008,

Wollenweber y col., 2000), ningún estudio se ha focalizado en la interfase aceite-agua con

aceite de girasol comercial, ampliamente empelado en la industria de alimentos.

Sun y col. (2007) informaron que la estabilidad de las emulsiones preparadas con

hidroxietilcelulosa modificada hidrofóbicamente (HMHEC) reside en el mecanismo de

espesamiento causado por HMHEC y en la adsorción de la HMHEC en la interfase aceite-

agua, que puede formar un film con carácter solido y así prevenir la coalescencia de las gotas.

Mezdour y col. (2008) encontraron que la disminución en la tensión superficial, cuando se

adsorbe hidroxipropilcelulosa (HPC) en la interface aceite-agua, y las propiedades reológicas

de la interfase son un factor clave para la estabilidad de una emulsión.


11

3. Características de β-lactoglobulina

Las dos proteínas más importantes en el suero lácteo desde el punto de vista industrial

y funcional son la -lactoglobulina (-lg) y la -lactoalbumina (-la).

La -lg es el componente dominante entre las proteínas del concentrado de suero lácteo

y tiende a gobernar sus propiedades funcionales (Mulvihill y Donovan, 1987; Apenten,

Khokhar y Galani, 2002). Las propiedades fisicoquímicas más importantes de la -lg se

muestran en la Tabla 1.

El polimorfismo genético es una característica de la -lactoglobulina, pudiéndose

identificar siete variantes genéticas denominadas A, B, C, D, E, F y G, siendo las

mayoritarias las formas A y B (Eigel y col, 1984). Todas las variantes de la -

lactoglobulina poseen 162 residuos de aminoácidos, sin embargo cada variante puede

diferir en una a tres posiciones de los residuos, causadas por mutaciones en el código

genético de la proteína.

Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas de la - lactoglobulina (Morr y col, 1993)

Propiedad -lg

Punto isoeléctrico 5,2

concentración en las proteínas del suero (%) 56-60

Peso molecular (Da) 18000

Hidrofobicidad promedio (Kcal/res) 1075

Residuos de aminoácidos totales/ mol 162

Residuos apolares/mol 54

Residuos cisteína/ mol 5

Residuos disulfuro/mol 2

Residuos sulfhidrilo/mol 1

Residuos lisina/mol 15

Residuos ácido glutámico/mol 16

Residuos ácido aspártico/mol 10

Introducción

12

3.1 Estructura primaria de la -lactoglobulina.

Una reciente comparación de las secuencias de aminoácidos en la familia de la -

lactoglobulina ha revelado un promedio de homología en 33 aminoácidos, lo que indica

que esos residuos son decisivos en la estructura y conformación de la proteína. El más

alto grado de homología entre las proteínas ocurre en la región amino- terminal de cada

molécula de proteína, siendo consistente las posiciones de las uniones disulfuro formadas

entre cis 160-cis66 y cis119-cis106 y un grupo tiol libre en cis121.

A pesar de que puede obtenerse mucha información sobre la naturaleza química de la

-lg, lo que verdaderamente le imparte sus características biológicas y propiedades

funcionales es su conformación. El estudio de la estructura y características

conformacionales es fundamental para una interpretación molecular de las propiedades

fisicoquímicas y la relación existente entre estructura y actividad de la proteína.

3.2 Estructura secundaria de la -lactoglobulina.

Se describe la estructura secundaria de la -lg como monómero esférico (diámetro

aproximado 36 Å) (Verheul y col, 1999) y conteniendo una región de estructura tipo α-

hélice de aproximadamente 20 Å de longitud y una región de estructura plana く. Se ha

reportado que la molécula contiene un 10-15% de estructura α-helice, 43% de regiones

planas く y un 47% de estructura desordenada (Timasheff y col, 1966; Phillips y col

,1998).

3.3 Conformación de la -lactoglobulina.

La estructura nativa de una proteína resulta de un balance de fuerzas atractivas y

repulsivas entre las cadenas de polipéptidos y entre las cadenas de estos y el solvente (Relkin,

1996). La conformación nativa de la -lg se representa en la Figura 3 (Philips y col, 1994). En

ella se muestra que la molécula está formada por 9 cadenas planas く antiparalelas envueltas

juntas de forma tal que forman una especie de cono alisado. Las vueltas ocurren entre los

residuos 44 a 47, 59 a 62, 78 a 81 y 84 a 88.

La presencia simultánea de dos uniones disulfuro y de un grupo tiol libre imparten una

estructura espacial rígida. Sin embargo, la posición del grupo tiol libre es imprecisa, podría

estar localizada entre los residuos 119 y 121. Con exactitud se conoce la localización de un


13

enlace disulfuro entre los residuos cis 66 y cis 160, estando el otro posiblemente entre cis 106

y cis 119.

Según la conformación, el grupo tiol estaría mas o menos accesible y podría participar en

los intercambios de uniones diulfuro, que condicionan numerosas características y en

particular la solubilidad.

El grupo tiol libre de cis121 está localizado en la superficie de una región plana く del

monómero de -lg y está normalmente oculto debido a la asociación de dos monómeros. La

disociación del dímero en monómeros de -lg a pH mayor a 7 coincide con un aumento de

actividad en el grupo tiol. Por lo tanto, los reactivos que estabilizan la conformación nativa o

asociada en dímeros de -lg podrían reducir la actividad del grupo tiol libre al quedar ocultos

en el interior de las moléculas asociadas.

La unión disulfuro en las posiciones 106-119 no muestra intercambio con la cis121. La

distancia entre los grupos en las posiciones 119 y 121 es de 10,5Å y cualquier intercambio

entre estos grupos llevaría a un significativo reacomodamiento de la molécula. La ubicación

de la otra unión disulfuro en la posición 66-160 parece hallarse en la superficie externa

uniendo la cadena D a la región terminal de la cadena C (Philips y col, 1994).

Figura 3. Estructura terciaria del monómero de -lactoglobulina. Las flechas indican las zonas

planas b, nominadas con letras A-I. También se indica la ubicación de las uniones disulfuro y el grupo tiol libre (Philips y col, 1994).

Introducción

14

3.4 Asociación entre moléculas de lg

La く-lg bovina existe generalmente como dímero a 25°C entre pH 5,0 y 7,5 (Mc Kenzie,

1971). Esta asociación entre monómeros de く-lg se debe a interacciones electrostáticas entre

los residuos Asp130 y Glu134 con los residuos de lisina en la molécula vecina.

Cuando el pH es mayor a 7, ocurren cambios conformacionales caracterizados por un

aumento en la reactividad del grupo carboxilo oculto, el grupo tiol libre en Cys121 y en el

residuo Tyr. A pH cercanos a 5 se producen una transición mediante la cual la proteína se

asocia en octámeros, en esta forma está presente en un rango de pH de 3 a 5 aproximadamente

(Relkin, 1996). Cuando el pH es menor a 3,5, la proteína se encuentra principalmente como

monómero en solución. La asociación que se da entre las moléculas de proteína en diferentes

condiciones del medio afecta la estabilidad de la misma frente a la desnaturalización

irreversible ya que limita la exposición de grupos ocultos (disulfuros y tiol) en las zonas de

unión de las moléculas y la consiguiente formación de enlaces covalentes entre las moléculas

parcialmente desplegadas.

4. Caracterización del estado de asociación de proteínas y polisacáridos en solución.

4.1 Dispersión dinámica de luz.

La dispersión dinámica de luz (DLS, de sus siglas en inglés dynamic light scattering) es

también conocida como espectroscopía de correlación de fotones (PCS) y como dispersión de

luz casi elástica (QELS). Es una técnica no invasiva, que requiere poco volumen para el

análisis de una muestra y se emplea para la medición del tamaño de partícula, principalmente

en la escala submicrónica. Las aplicaciones más usuales del DLS son las mediciones de

tamaño y distribución de tamaños de las gotas de una emulsión y moléculas dispersas o

disueltas en un líquido como proteínas, polímeros, micelas, carbohidratos, nanopartículas y

dispersiones coloidales (McClements, 1999).

Debido a la dependencia del tamaño de partícula con la intensidad de dispersión de luz, la

asociación de diferentes biopolímeros puede monitorearse fácilmente por medio de

instrumentos de dispersión de luz. Es por ello que en este trabajo, para la caracterización de

interacciones en solución se seleccionó esta técnica con el objetivo de evaluar el efecto de las


15

condiciones del medio sobre el estado de asociación, la agregación o el autoensamblaje de las

moléculas en estudio.

La intensidad de dispersión de luz de una molécula es proporcional al cuadrado del peso

molecular. Por lo tanto, esta técnica es muy sensible a la aparición de formas asociadas o

agregadas. DLS también permite determinar las poblaciones existentes en una muestra con

múltiples tamaños de partículas.

En un equipo de DLS, las partículas en la muestra dispersan la luz en diferentes direcciones,

la cual incide en ellas desde una fuente de luz laser a una determinada longitud de onda. La

luz dispersada es recibida por un detector óptico (Figura 4) y fluctúa con el tiempo debido al

movimiento browniano de las partículas y es medido en DLS y relacionado con el tamaño de

la partícula.

El movimiento browniano es el desplazamiento aleatorio de las partículas debido al

bombardeo de las moléculas del disolvente que las rodean.

La temperatura debe ser conocida con exactitud porque es necesario conocer la viscosidad y

ambas están relacionadas. A mayor temperatura mayor será el movimiento Browniano. La

temperatura debe de ser estable para que no existan corrientes de convección en la muestra

que arruinaría la interpretación correcta del tamaño (Malvern Instruments).

Figura 4. Representación esquemática del equipo de DLS (Mattison y col., 2003).

La velocidad del movimiento Browniano se define por una propiedad conocida como

coeficiente de difusión de translación (D) y se relaciona con el tamaño de la partícula por

medio de la ecuación de Stokes-Einstein: d(H) = kT/( 3D) donde d (H) es el diámetro

hidrodinámico, D el coeficiente de difusión traslacional (m2s-1), k la constante de Boltzmann

(1,38 x10-23 NmK-1), T la temperatura absoluta (K) y la viscosidad (Nsm-2).

L

Á

S

E

R

DETECTOR

ÓPTICO

RECIBE LA LUZ DISPERSADA POR LAS

PARTÍCULAS A UN ÁNGULO FIJO

FUENTE

DE LUZ PÁRTÍCULAS DE LA MUESTRA

DISPERSANDO LA LUZ EN

VARIOS ÁNGULOS

Introducción

16

La Figura 5 muestra la correlación según el movimiento browniano de las partículas en

solución y su tamaño. Cuanto mayor sea la partícula menor será el movimiento Browniano y

viceversa. Si se sigue este movimiento a intervalos de tiempo cortos, puede obtenerse

información de cuánto se ha movido y relacionarlo así con su tamaño y distribución.

Partículas pequeñas se mueven rápidamente

tiempo

Partículas grandes se mueven lentamente

tiempo

Figura 5. Representación esquemática del movimiento browniano de las partículas en solución y su relación con la curva de distribución.

5. Propiedades interfaciales de proteínas y polisacáridos.

5.1 Termodinámica de adsorción de biopolímeros

Una aplicación de las proteínas y polisacáridos tensioactivos es su uso como surfactantes

en alimentos emulsionados o espumados.

Cualquier sustancia tensioactiva tiende a acumularse en la interfase aire-agua o aceite-

agua formando películas monomoleculares que se denominan monocapas. Si la concentración

del tensioactivo es elevada, estas películas son fuertemente condensadas.

El comportamiento de las moléculas de proteína en la interfase es diferente al de

moléculas simples y pequeñas de otros surfactantes. Las sustancias de alto peso molecular con

actividad interfacial, como proteínas y polisacáridos, pueden acumularse en la interfase

gracias a que presentan en su estructura cantidades significativas de grupos polares y no-

polares (Dickinson, 1992; Damodaran, 1996). Sin embargo a altas concentraciones pueden

Ta m a ño ( d.nm )Tamaño (d.nm)

10 100 1000

1

Tam año ( d.nm )Tamaño (d.nm)10 100 1000

1


17

agregarse. Ello dependerá de la solubilidad que presente la molécula, lo cual estará en función

de las interacciones existentes con el agua. Además dichas interacciones estarán influenciadas

por el pH, fuerza iónica, temperatura, y composición de la subfase acuosa.

En el seno de una solución, las moléculas están rodeadas de otras de su misma especie, y

las fuerzas de interacción entre ellas son iguales en todas las orientaciones. Sin embargo, las

moléculas en la superficie del líquido (o en una interfase entre dos líquidos inmiscibles) están

sujetas a una fuerza neta, porque las fuerzas de atracción ejercidas por las moléculas en el

seno de la solución son diferentes a las ejercidas por las de la fase vapor (o la otra fase

líquida) (Figura 6). El desbalance de fuerzas se traduce en una energía libre de superficie (o

interfacial) o energía libre de Gibbs. Como la energía libre de las moléculas en la interfase es

mayor que en el seno de la solución, el líquido tiende a contraerse para minimizar la

superficie expuesta. Una expansión de dicha superficie (A) de contacto requiere de un

trabajo proporcional a dicha expansión (W) según:

W = け.A

donde け es la tensión superficial si la interfase es aire – líquido o la tensión interfacial para

interfases líquido/líquido y tiene unidades de [fuerza]/[longitud] (ej.: N/m). Cuanto menor es

け, menor es el trabajo necesario para aumentar la superficie. Debido a su naturaleza anfifílica,

las proteínas y algunos polisacáridos pueden concentrarse en la superficie formando películas

(films) mono o multimoleculares disminuyendo la tensión superficial y generando una presión

superficial ““, que se define como け0 - け donde け0 y け son la tensión superficial del solvente

y la solución respectivamente.

Aire o aceite

Solución acuosa

Figura 6. Fuerzas de interacción entre moléculas en el seno de la solución y en la interfase.

Introducción

18

5.2 Cinética de adsorción en interfases.

La actividad superficial de una molécula es una medida de su habilidad para acumularse en

una interfase. Esta tiende a acumularse cuando la energía libre del estado adsorbido es

significativamente menor que la del estado en disolución (Hiemenz, 1986). La diferencia

energética entre ambos estados está determinada por las variaciones en las energías de las

interacciones de las moléculas involucradas, como también por efectos entrópicos (Shaw,

1980). Los cambios en las energías de las interacciones que ocurren como consecuencia de la

adsorción, tienen su origen en dos puntos, uno asociado con la interfase y otro con las

moléculas del tensioactivo en sí mismas. Con respecto al primer punto, al adsorberse una

molécula tensioactiva en una interfase es capaz de disminuir el contacto entre las moléculas

de ambas fases. El contacto directo de ambas es reemplazado por contactos entre segmentos

no polares del tensioactivo y moléculas de la fase no-polar y entre segmentos polares y

moléculas de agua (Israelachvili, 1992). Estas interacciones disminuyen la energía libre

generada en la interfase. Con respecto al segundo punto, los polímeros tensioactivos tienen en

sus moléculas segmentos polares y no-polares; cuando la molécula se disuelve en agua estos

últimos manifiestan un efecto hidrofóbico, energéticamente desfavorable, la consecuencia es

entonces su adsorción a la interfase. Las moléculas del tensioactivo son capaces de maximizar

el número de interacciones favorables entre los segmentos polares y el agua mientras

minimizan el número de interacciones desfavorables entre segmentos no-polares y el agua. La

fuerza impulsora que gobierna la adsorción de las moléculas anfifílicas a una interfase es la

hidrofobicidad. Sin embargo, otros tipos de interacciones pueden también contribuir a la

actividad superficial, favoreciendo o dificultando la adsorción (interacciones electrostáticas,

puentes hidrógeno, etc).

Los efectos entrópicos asociados con el proceso de adsorción se deben a que cuando una

proteína se adsorbe en la interfase, se confina en una región que es considerablemente más

pequeña que el volumen que ocuparía en el seno del líquido, de forma que su movimiento

molecular queda restringido. Estos efectos son entrópicamente desfavorables y así una

molécula solamente se adsorberá en una interfase si la energía ganada en las interacciones es

suficientemente grande como para contrarrestar la disminución de entropía. Es decir que

cuando la energía de adsorción es mayor que la energía cinética de las moléculas, éstas se

fijan fuertemente a la interfase presentando una elevada actividad superficial. Cuando ocurre

lo contrario, las moléculas tienden a localizarse principalmente en el seno del líquido

presentando una baja actividad superficial.


19

El descenso de la energía libre de un sistema, el cual ocurre cuando una molécula

superficialmente activa se adsorbe en una interfase, se manifiesta como un descenso en la

tensión superficial, ya que se requiere menor energía para aumentar el área superficial entre

las fases no-polar y acuosa. La magnitud de este descenso depende de la eficacia con que las

moléculas evitan el contacto directo entre las fases, así como de la fuerza de las interacciones

entre los segmentos hidrofóbicos del tensioactivo y la fase no-polar (Israelachvili, 1992).

Cuanto mayor sea la eficacia del tensioactivo en evitar las interacciones entre las fases, más

baja será la tensión superficial.

La habilidad de las moléculas de un tensioactivo en evitar las interacciones directas entre

los líquidos inmiscibles está gobernada por el empaquetamiento óptimo en la interfase, que

dependerá de la geometría molecular. Además de conocer la disponibilidad de un tensioactivo

para adsorberse, sobre lo cual informa la termodinámica, es muy importante también conocer

la velocidad a la que este proceso ocurre. Dicha velocidad debe ser suficientemente alta para

que las moléculas puedan adsorberse en la interfase de gotas o burbujas creadas durante la

formación de la emulsión o la espuma respectivamente.

Esta característica, junto con la disminución de la tensión superficial y la de poder crear

una película interfacial son las tres propiedades más importantes que debe presentar cualquier

tensioactivo en la estabilización de emulsiones o espumas (Dickinson y Mc Clements, 1995;

Walstra, 1996, McClements, 1999, Baeza, 2003).

La velocidad de adsorción depende de las características moleculares del emulsionante

(tamaño, conformación e interacciones), la viscosidad de la fase continua y de condiciones

ambientales (temperatura, agitación mecánica, etc).

5.2.1 Conformación de los polímeros tensioactivos en la interfase

La formación de monocapas estables de compuestos poliméricos, como proteínas y

polisacáridos, depende de la atracción que ejerce la subfase sobre estas moléculas (Gaines,

1966). A bajas concentraciones, los tensioactivos poliméricos forman películas

monomoleculares insolubles tanto en la interfase aire - agua como aceite – agua, de forma que

los segmentos no-polares predominan en la fase hidrofóbica, mientras que los segmentos

polares se encuentran en contacto con el agua (Dickinson, 1992; Damodaran, 1996; Dickinson

y Stansby, 1982). Los polímeros pueden presentar diferentes orientaciones en la interfase ya

que el número de residuos o de segmentos en contacto con la interfase dependerá de la

flexibilidad molecular de la cadena y de la afinidad de esta por el medio de disolución. Así

Introducción

20

Lazos

por ejemplo, los cálculos de área molecular de una molécula de proteína adsorbida indican

que sólo una fracción de la cadena del polipéptido está en contacto con la interfase.

Las configuraciones de un polímero flexible en el plano bidimensional de la interfase pueden

ser representados como se muestra en la Figura 7.

I . Filas (trains): son los segmentos lineales que están en contacto directo con la interfase.

I I . Lazos (loops): son los segmentos del biopolímero entre las filas orientadas hacia el seno

de alguna de la dos fases.

I I I . Colas (tails): son los segmentos terminales de las cadenas de polímeros.

Aire o aceite

Solución acuosa

Figura 7. Configuración de un polímero tensioactivo en la interfase aceite – agua o aire-agua.

En el caso específico de proteínas globulares, éstas adoptan en solución una conformación

tridimensional en la cual los aminoácidos no-polares se disponen preferentemente en el

interior de la molécula, de forma de mantenerse ocultos al agua (Dill, 1990). Cuando una

proteína se adsorbe en la interfase (Figura 8), se encuentra menos rodeada de moléculas de

agua, de forma que puede reducir su energía libre alterando su conformación, orientando sus

aminoácidos hidrofóbicos hacia la fase aire o aceite y los hidrofílicos hacia la acuosa

(Dalgleish, 1996). La velocidad con la que la conformación de una proteína cambia en la

interfase depende de su estructura molecular (Dickinson, 1992). Las moléculas más flexibles,

Filas

Colas


21

que presentan una conformación aleatoria, pueden rápidamente alterar su conformación,

mientras que las moléculas más rígidas de conformación globular, cambian más lentamente.

Las moléculas de proteína se estructuran, interaccionando entre sí, con un consiguiente

aumento en la presión superficial. El reordenamiento de las moléculas adsorbidas en la

superficie puede ser retardado por varios eventos: presencia de una barrera de adsorción,

lentos reordenamientos moleculares, formación de complejos, transiciones de fase en la

superficie y formación o destrucción de una estructura tridimensional (Luchasen- Reynders,

1993).

Aire o aceite

Solución acuosa

Difusión Penetración Reordenamiento

Figura 8. Cambios conformacionales de una proteína globular durante su adsorción en la interfase aceite- agua o aire-agua.

Este modelo es también adecuado para describir las conformaciones estructurales de las

HPMC en la interfase, ya que presentan en sus cadenas carbonadas grupos metilo e

hidroxipropilo, de naturaleza hidrofóbica. La introducción de grupos hidrofóbicos permite a la

HPMC comportarse como un surfactante ya que sus moléculas se adsorben preferencialmente

en la interfase y provocan un descenso de la tensión superficial. Una vez adsorbidos en la

interfase, las cadenas de este polímero sufren reordenamientos moleculares con segmentos en

contacto con la superficie, llamadas filas y otros segmentos completamente inmersos en la

solución llamados lazos y colas (Figura 7) (Nahringbauer, 1995; Wollenweber y col, 2000).

Cuando la concentración del biopolímero adsorbido () se incrementa, se genera una

barrera electrostática sobre el lado acuoso de la superficie debido a la orientación preferencial

de los grupos poliméricos cargados hacia la fase acuosa polar. Las moléculas poliméricas

requieren cierta energía cinética para superar la barrera electrostática (que involucra fuerzas

repulsivas, impedimentos estéricos y osmóticos) y comprimir las moléculas ya adsorbidas en

Introducción

22

la interfase, para permitir la adsorción de polímero adicional. La habilidad de dichas

moléculas para adsorberse, penetrar y crear espacio en la película preexistente y reordenarse

en la interfase, es ahora la determinante de la velocidad. Una vez adsorbidas en la interfase,

las moléculas poliméricas interactúan en la misma, para lograr un estado de menor energía

libre (Phillips y col., 1994). Con el incremento de la cantidad de polímero adsorbido el

ordenamiento de las moléculas en forma extendida disminuye y la película interfacial cambia

su estructura de expandida a comprimida (Kinsella y Phillips, 1989). El proceso de

desnaturalización de una proteínapuede comenzar segundos u horas luego de la adsorción,

dependiendo de la flexibilidad y de la estructura de la misma, y puede continuar en un grado

más bajo durante días, reteniéndose la estructura terciaria en algunas películas (Wilde y Clark,

1996).

Para estudiar la cinética de adsorción de biopolímeros en la interfase se mide la variación

de la concentración superficial y de la presión superficial en función del tiempo. Se alcanza

un valor de equilibrio, presentando la adsorción cierto grado de reversibilidad (Gonzalez y

Mac Ritchie, 1970). Los procesos de desorción pueden ser muy lentos, siendo las barreras

energéticas mayores a menor concentración proteica (Narsimhan y Uraizee, 1992).

5.3 Propiedades de las películas poliméricas

La interfase no es un sistema autónomo y sólo existe como límite entre dos fases, pudiendo

variar su composición durante el transcurso del tiempo.

Para la formación de una película cohesiva, se necesitan extensas interacciones polímero -

polímero que formen una red continua tridimensional y que impartan rigidez estructural; sin

embargo, si el número de interacciones intermoleculares resulta excesivo, puede ocurrir una

coagulación y posterior desestabilización de la película (Halling, 1981). El desarrollo de

películas apropiadas, con óptimas propiedades viscoelásticas, no sería posible en el caso de

películas constituidas por polipéptidos simples de bajo peso molecular, donde las

interacciones intermoleculares son débiles; las interacciones en la interfase deben maximizar

las propiedades de cohesión y resistencia mecánica.

Las propiedades viscoelásticas de las películas determinan su capacidad para resistir y

acomodarse frente a deformaciones sin romperse. La reología interfacial (o de dos

dimensiones) define las relaciones entre tensión, deformación y velocidad de deformación en

términos de coeficientes de elasticidad y viscosidad, y está relacionada con el grado de

hidratación y las interacciones moleculares (Damodaran, 1989). Se presentan principalmente


23

dos clases de deformaciones: a) tensión de corte, que produce cambios de forma y b)

compresión/dilatación que produce cambios en el área. Debe especificarse qué clase de

tensión es aplicada en las mediciones de viscosidad superficial (Lucassen-Reynders, 1993).

Viscosidad superficial de corte:

Es la fuerza requerida para desplazar y mover las moléculas de un punto a otro y refleja la

atracción neta entre los polímeros de la película interfacial y entre esta última y las capas de

líquido adyacentes. Esta viscosidad superficial o resistencia a los esfuerzos de corte de la

superficie de la película suele ser muy alta, refleja la resistencia mecánica de la misma y es un

parámetro importante relacionado con la estabilidad de películas y emulsiones. Las

monocapas polipeptídicas en las interfases contienen entre 1 a 8 mg polipéptido/m² y exhiben

una viscosidad y elasticidad considerable a pesar de su espesor (1 a 10 nm). Luego de cierta

compresión de la película, los polipéptidos dentro de la misma colapsan y coagulan,

reflejando una extensiva interacción entre ellos. La viscosidad superficial se incrementa con el

espesor de la película y varía con el tipo de polipéptido, el tiempo y el pH (Phillips y col.,

1994b).

Elasticidad y viscosidad dilatacional:

Ambas propiedades pueden ser combinadas en un único parámetro, el módulo viscoelástico

superficial de la película “E“ que vincula la variación de la presión superficial() con los

cambios del área superficial “A” (E = -d/d(lnA)) (Kim, 1985). Durante la expansión de la

película ocurren diversos fenómenos: i) difusión del surfactante desde la subcapa en la

solución a la interfase y ii) reordenamientos de las moléculas adsorbidas dentro de la

interfase (los cuales pueden ser retardados por varios eventos: presencia de una barrera de

adsorción, lentos reordenamientos moleculares, formación de complejos, transiciones de fase

en la interfase y formación o destrucción de una estructura tridimensional) (Lucassen –

Reynders, 1993).

Las interacciones biopolímero - biopolímero, el espesor de la película, la presión superficial

desarrollada y las propiedades viscoelásticas están altamente influenciadas por la carga neta

del biopolímero. Las películas formadas a valores de pH cercanos al punto isoeléctrico son

más condensadas, más fuertes y se forman más rápido. Las películas compuestas por mezclas

de biopolímeros solubles con diferente carga neta y distintas relaciones entre residuos

hidrofílicos/hidrofóbicos, son usualmente más estables. La formación de uniones disulfuro

durante la formación de la película también aumenta la estabilidad. La fuerza de las películas

Introducción

24

proteicas tiende a incrementarse con el tiempo, reflejando reordenamientos y el incremento de

las interacciones entre las moléculas componentes de la película (Kinsella y Phillips, 1989).

La tabla 2 muestra los principales equipos utilizados para la evaluación de las propiedades

interfaciales.

Tabla 2. Principales equipos para la evaluación de las propiedades interfaciales de un agente emulsificante

Equipo Propiedad interfacial evaluada

Tensiómetro de placa Variación de en función de la concentración del agente emulsificante

Tensiómetro de anillo Variación de en función de la concentración del agente emulsificante

Tensiómetro de gota Cinética de adsorción interfacial. Variación de en función del tiempo. Reología interfacial.

Balanza de superficie Estructura de la monocapa. Reología interfacial (propiedades viscoelásticas del film interfacial)

Microscopío de ángulo Brewster (BAM) Morfología y espesor de la monocapa

Sin embargo existen numerosas metodologías que han sido desarrolladas para el estudio de

las propiedades interfaciales de biopolímeros y se describen a continuación.

Tensión superficial: puede ser determinada por el método del volumen de las gotas

(estalagmómetro de Traube), por caracterización de la forma y del tamaño de la gota (método

de Sessile) y por distintos métodos dinámicos como el anillo de Du Noüy, método de la gota

pendiente (Tornberg, 1978), tensiolaminómetro de la placa de Wilhelmy (Graham y Phillips,

1979a; German y col., 1985). En los últimos años se han desarrollado metodologías más

modernas: balanzas para películas tipo Langmuir donde se pueden estudiar procesos de

relajación y dilatación por aplicación de ciclos comprensión / expansión, por mediciones

dinámicas de presión superficial y área interfacial (Rodríguez Niño y col., 1998), método de

máxima presión sobre la burbuja, método del jet oscilatorio, método sometiendo gotas en el

interior de un capilar a oscilaciones con determinada frecuencia, medición de la amplitud y

frecuencia de ondas generadas en un capilar lleno de líquido (McClements, 1999).


25

Características de flujo de películas superficiales (umbral de fluencia, viscosidades,

comportamiento no-newtoniano): viscosímetro de tracción viscosa de un canal (Mannheimer

y Schechter, 1970), viscosímetros de anillo (Blank y col., 1969; Blank y Britten, 1970) o

péndulo rotatorio (Miller y col., 1998), cilindros de sobreflujo (Prins, 1999).

Mediciones dilatacionales de la interfase: ensayos de compresión / extensión por

tensiolaminometría, cambios en el área interfacial por aumento o disminución del volumen de

una gota (Miller y col., 1998), técnicas con ondas sometiendo a la película a amplitudes

periódicas y pequeñas (Lucassen – Reynders, 1993).

Concentración superficial (): técnicas con marcadores radioactivos (Hunter y col.,

1991), incluyendo elipsometría (Graham y Phillips, 1979b); FRAP (fluorescence recovery

after photobleaching) donde se determinan por difusión con marcadores isotermas de

adsorción (vs ), características de drenado y de angostamiento de la película (Clark y col.,

1994), interferometría laser donde también se determina el espesor de la películas

(Damodaran, 1989; Wilde y Clark, 1996).

Espesor de la película: técnicas de barrido con luz (light – scattering), aplicación de rayos

X en pequeños ángulos (small-angle-X-ray-scattering), reflexión de neutrones (neutron

scattering), elipsometría (McClements, 1999).

Estudios morfológicos: microscopía del ángulo de Brewster (Rodríguez Niño y col.,

1998), microscopía electrónica con digitalización de imágenes de la formación de finas

películas líquidas suspendidas en aire (Clark y col., 1994; Miller y col., 1998); microscopía de

fuerza atómica (AFM) por medio de la cual se observan las redes interfaciales (Gunning y

col., 1996).

Estabilidad de la película: drenado de la película usando platos porosos, celda de

Sheludko.

Estudios de interacciones moleculares: las interacciones coloidales que involucran

biopolímeros adsorbidos en la interfase ocurren en general a distancias de nanómetros y son

una combinación de fuerzas de Van der Waals, electrostáticas y de interacciones entrópicas y

estéricas. La técnica de medición de fuerzas superficiales permite la determinación de las

magnitudes de las fuerzas moleculares entre dos películas superficiales, resultando una

técnica útil para determinar bases fundamentales de la funcionalidad y el comportamiento de

proteínas (Leckband y Israelachvili, 1993; Toprakcioglu, 1994).

Introducción

26

Además se pueden realizar estudios de estructura proteica, que consisten en dicroismo circular

con radiación UV lejana (Clark y col., 1989); técnicas bioquímicas de hidrólisis enzimática e

inmunoensayos que se aplican para el estudio de la orientación y conformación de las

proteínas en la interfase (McClements, 1999).

6. Emulsiones aceite-agua.

Muchos alimentos naturales o procesados son parcial o totalmente emulsiones o lo han

sido en alguna etapa durante la producción (McClements, 1999).

A pesar de ser los coloides más importantes en la vida diaria y encontrarse en numerosas

aplicaciones, las emulsiones son sistemas termodinámicamente inestables debido al contacto

desfavorable entre las gotas de aceite y la fase acuosa, y como el aceite y la fase acuosa tienen

densidades diferentes, siempre van a separarse en fases con el transcurso del tiempo (Moreau,

Kim, Decker & McClements, 2003).

Que posean estabilidad física durante el tiempo de interés es crucial y lograr la estabilidad

cinética es un desafío al formular emulsiones. Los requerimientos para que una emulsión sea

estable en el tiempo deseado son que no haya cambios en la distribución de tamaños de las

gotas o en su estado de agregación (Karlberg, Thuresson & Lindman, 2005). Esto puede

obtenerse por un control adecuado de los procesos de desestabilización como el cremado,

floculación y coalescencia. Muchas veces, estos procesos se presentan simultáneamente y

pueden retardarse mediante un aumento en la barrera de energía que hace que las gotas se

acerquen e interactúen.

Existen dos formas de lograr un aumento en la energía, por repulsión electrostática

mediante la creación de una doble capa cargada (surfactantes iónicos) y por repulsión estérica

debido a la adsorción de surfactantes no iónicos o polímeros.

El proceso de floculación puede también prevenirse si se aumenta la viscosidad de la fase

continua ya se reduce la velocidad de acercamiento de las gotas.

En una emulsión, los agentes emulsificantes promueven la formación de la emulsión y

estabilidad en el corto tiempo mediante acción en la interfase. Los estabilizantes brindan a la

emulsión estabilidad a largo plazo.

En una emulsión alimentaria, las proteínas tienen un rol principal como emulsificantes y

los polisacáridos son empleados principalmente como estabilizantes pero existen algunos

polisacáridos que actúan también como agentes emulsificantes (Karlberg y col., 2005).


27

Las hidroxipropilmetilcelulosas se encuentran dentro de este grupo.

6.1 Procesos de formación de emulsiones

6.1.1. Homogeneización primaria y homogeneización secundaria

El proceso de convertir dos líquidos inmiscibles en una emulsión se denomina

homogeneización, mientras que el dispositivo diseñado para llevar a cabo este proceso

recibe el nombre de homogeneizador.

Para realizar una distinción según la naturaleza de los materiales de partida es

conveniente clasificar la homogeneización en dos categorías. La creación de una emulsión

a partir de dos fases líquidas separadas se denomina homogeneización primaria, mientras

que el proceso de reducir el tamaño de las gotas en una emulsión ya existente o pre-

emulsión se denomina homogeneización secundaria (Figura 9). La creación de un tipo

particular de emulsión puede involucrar una homogeneización primaria, secundaria o una

combinación de ambas (McClements, 1999).

1 2 Fase

acuosa

Aceite

Figura 9.: Representación esquemática del proceso de homogeneización para una emulsión aceite en agua (o/w): La homogeneización primaria (1) implica la conversión de dos fases separadas en una emulsión, mientras que en la homogeneización secundaria (2) se produce una reducción del tamaño de gota de la emulsión preexistente (Palazolo, 2006).

Introducción

28

6.1.2. Procesos críticos durante la formación de emulsiones

La formación de gotas en una emulsión es un proceso que requiere energía, la que es

suministrada por el homogeneizador. Durante la formación de las gotas el área interfacial

(A) aumenta considerablemente, de manera que la energía libre superficial del sistema se

incrementa en una cantidad . A , donde es la tensión interfacial. Sin embargo la

formación de gotas no es el único proceso que tiene lugar durante la preparación de una

emulsión. Se pueden distinguir tres procesos críticos: formación y ruptura de las gotas,

adsorción del agente emulsificante en la interfase y coalescencia de las gotas (Figura 10)

(McClements, 1999).

Durante el proceso de homogeneización primaria, la interfase entre las dos fases líquidas

inmiscibles se deforma en tal extensión, que comienzan a producirse gotas, en su mayoría,

de tamaño muy grande. Estas gotas deben deformarse y romperse para formar gotas de

menor tamaño, por fuerzas de ruptura. Las gotas de un líquido en otro que es inmiscible,

tienden a adoptar una forma esférica para minimizar la energía libre interfacial.

La fuerza responsable de la forma esférica está dada por la ecuación de Laplace:

donde PL es la diferencia de presión entre el interior y el exterior de la gota, es la

tensión interfacial y D es el diámetro de la gota. Las fuerzas interfaciales ejercen una

presión hacia el interior, que es mayor cuanto menor es el diámetro de las gotas y mayor la

tensión interfacial.

El agente emulsificante es necesario para la formación de la emulsión y para ello debe

adsorberse en la interfase, disminuyendo la tensión interfacial. Este proceso disminuye la

presión de Laplace (ecuación 1), lo cual facilita la deformación y en consecuencia, la

ruptura en gotas de menor tamaño. Además, la formación del film interfacial evita la

coalescencia de las gotas recién formadas (Figura 10).

El transporte de las moléculas del agente surfactante hacia la interfase durante el proceso

de homogeneización no está determinada por difusión sino por convección (Walstra,

1983). Por lo tanto, es sumamente importante que el agente emulsificante recubra la

interfase creada en una escala de tiempo similar a la del proceso de homogeneización. En

)1(D

け4ΔPL


29

caso de que la adsorción sea muy lenta en comparación con la capacidad del

homogeneizador de generar área interfacial, se produce el proceso de coalescencia de las

gotas recién formadas. Esto determina que el proceso de formación de la emulsión no sea

eficiente (Ford y col., 1997).

6.1.3. Fuerzas de ruptura en el proceso de homogeneización

Las gotas se forman mediante las fuerzas de ruptura, que se clasifican en fuerzas

viscosas y fuerzas inerciales. Las fuerzas viscosas generan esfuerzos de corte normales y

tangenciales en la superficie de la gota, mientras que las fuerzas inerciales generan

diferencias de presión en el seno de un fluido. En la práctica, es útil distinguir tres

situaciones que pueden darse durante la homogeneización: flujo laminar, flujo turbulento y

flujo cavitacional (Walstra, 1983).

En la situación de flujo laminar predominan las fuerzas viscosas, las cuales actúan sobre

la superficie de las gotas y producen su deformación y ruptura (en gotas más pequeñas). La

extensión de la deformación se caracteriza por un parámetro adimensional conocido como

número de Weber, WeL, el cual se define como el cociente entre el esfuerzo de corte

producido por las fuerzas viscosas y las fuerzas interfaciales conservativas que tienden a

restablecer la forma esférica de las gotas A un cierto valor de We L, llamado número de

Weber crítico

(We crit L), las fuerzas viscosas alcanzan un valor por encima de la cual se produce la

ruptura de las gotas. El parámetro We crit L, es función del cociente de viscosidades entre las

fases dispersa (D) y continua (C) (We = f(D/C)). Las gotas son menos estables a la

ruptura cuando la relación D/C está entre 0,1 – 1 y por lo tanto esta es la situación de

homogeneización más eficiente. Si D/C < 0,1 las gotas sufren procesos de deformación

sin ruptura; a alta relación de viscosidades (> 5), el tiempo de deformación no es

suficiente para producir la ruptura (Ford y col., 1997; McClements, 1999).

Introducción

30

Homogeneización

ADSORCIÓN RÁPIDA

ESTABILIZACION

ADSORCIÓN LENTA

COALESCENCIA

Figura 10. Proceso de homogenización que involucra la ruptura de gotas grandes en pequeñas y adsorción en la interfase creada del emulsificante (McClements, 1999).


31

El movimiento global del líquido en un flujo turbulento se caracteriza por la presencia

de remolinos de gran tamaño que tienen asociada una energía cinética, la cual puede

transferirse a remolinos de menor tamaño en el seno del líquido sujeto a la agitación

mecánica. Si las gotas de aceite tiene un tamaño menor que los remolinos, estas gotas

siguen el movimiento de los mismos sin ruptura. En cambio, si el tamaño de las gotas es

mayor que el de los remolinos, los gradientes fluctuantes de velocidad en la superficie de

las gotas pueden deformarlas lo suficiente para producir su ruptura (Ford y col., 1997).

La cavitación es un fenómeno que ocurre en fluidos sometidos a cambios bruscos de

presión y es un fenómeno de formación y colapso de pequeñas burbujas de vapor en un

líquido. Un fluido se contrae cuando la presión crece y se expande cuando la presión

decrece. Cuando la presión en un líquido cae por debajo de una presión crítica (la presión

de vapor), se produce una cavidad, la cual crece por expansión y evaporación del fluido.

Durante una nueva compresión la cavidad colapsa repentinamente generando una onda de

choque que se propaga en el líquido circundante, causando deformación y ruptura de las

gotas (Walstra, 1983).

6.1.4. Equipos de homogeneización

Existen muchos tipos diferentes de homogeneizadores para la producción de emulsiones

alimentarias. La elección de un homogeneizador particular depende del volumen de

emulsión que se desea preparar, la naturaleza de los materiales a emulsificar, el tamaño de

gota deseado y el costo (McClements, 1999).

La intensidad de agitación mecánica se atribuye a la densidad de energía en el líquido (), la cual es la cantidad de energía mecánica disipada por unidad de volumen y por unidad de

tiempo (o la potencia por unidad de volumen). La cantidad total de energía mecánica

suministrada debe ser extremadamente grande, debido a la oposición de la presión de

Laplace (ecuación 1) (Walstra, 1983; Ford y col., 1997). La mayoría de la energía

suministrada actúa en un tiempo muy corto y localmente, disipándose como calor. Por tal

motivo, la temperatura del sistema debe controlarse, especialmente en los dispositivos de

alta . La tabla 3 muestra los principales tipos de homogeneizadores utilizados a escala industrial

y de laboratorio.

Los homogeneizadores de baja ( 3000 r.p.m.) y de alta velocidad (hasta 25000 r.p.m.) son

adecuados para producir emulsiones a partir de las fases líquidas separadas. El mecanismo

Introducción

32

de ruptura es un efecto combinado de fuerzas viscosas bajo un régimen de flujo laminar y

turbulento. Al tener baja densidad de energía () producen emulsiones de tamaño de gota

relativamente grande. Los homogeneizadores que tienen diseño rotor/estator de alta

velocidad (Ultraturrax – Polytron) son más efectivos que los de diseño a cuchilla.

Debido al número elevado de revoluciones del rotor, las fases líquidas a procesar se

aspiran axialmente y se presiona a través de las ranuras del conjunto rotor/estator. El

movimiento de alta velocidad a través de las ranuras produce el esfuerzo de corte

responsable de la ruptura de las gotas.

Homogeneizador Densidad de energía

Modo de operación

Mecanismo de ruptura

Tamaño de gota (d)

(m)

Viscosidad de la

muestra (e) () (a) (b) (c)

Homogeneizadores de baja velocidad (sistemas cuchilla)

B D L, T 5 B - M

Homogeneizadores de alta velocidad

(sistema cuchilla y rotor/estator)

B D L, T 2 B - M

Molino coloidal I C L, T 1 M - A

Homogeneizador a válvula de alta

presión

A C T, C 0,1 B - M

Homogeneizador ultrasónico

A D T, C 0,1 B – M

Homogeneizador de membrana

A C T 0,1 B – M

Los molinos coloidales son adecuados para la homogeneización de emulsiones de alta

viscosidad y tienen un diseño rotor/estator al igual que los homogeneizadores de alta

velocidad. La intensidad del esfuerzo de corte en este dispositivo se puede regular por

Tabla 3. Principales dispositivos de homogeneización y características: a) A = alta; M= mediana; B = baja; b) C = continuo; D = discontinuo o batch; c) L= flujo laminar; T= flujo turbulento; C= cavitación; d) tamaño de gota máximo, en promedio; e) B= baja; M= mediana; A=alta. (Palazolo, 2006).


33

variación de la distancia entre el rotor y el estator. Aunque se pueden homogeneizar fases

separadas, son más eficientes para la reducción del tamaño de gota.

Los homogeneizadores a válvula de alta presión son sólo eficaces en reducir el tamaño

de gota de una emulsión preexistente y por ende, realizan una homogeneización

secundaria. A través de una bomba, la pre-emulsión es forzada a pasar a través de una

válvula a presión elevada (entre 10 y 50 MPa). Las gotas de gran tamaño se rompen por un

efecto combinado de flujo turbulento y cavitación. En muchos equipos, la presencia de una

segunda válvula regulada a una presión más baja, favorece la obtención de emulsiones de

gota de distribución de tamaño de gota monomodal.

En los homogeneizadores de membrana la fase dispersa se hace pasar forzosamente a

través de una membrana porosa de vidrio o cerámica. El pasaje forzado a través de los

pequeños orificios de la membrana produce el esfuerzo de corte necesario mientras el

agente emulsificante disperso en la fase acuosa se adsorbe en la superficie de las gotas

generadas. El tamaño de gotas producido depende de la rapidez con la que el agente

emulsificante se adsorbe en la interfase. La principal característica de la homogeneización

con membranas es la formación de emulsiones de distribución de tamaño monomodal.

En los homogeneizadores ultrasónicos, la fuente convierte el voltaje suministrado

(energía eléctrica) en ondas ultrasónicas (hasta 20 kHz) que se transmiten al seno del

líquido y producen millones de cavidades microscópicas. El colapso de estas cavidades

genera ondas de choque que producen deformación y ruptura de las gotas. La temperatura

dentro de las cavidades es extremadamente alta y la presión, superior a 500 atmósferas. Sin

embargo los tiempos de vida media de las cavidades están en el orden de los

microsegundos, con lo cual la energía liberada por cada cavidad es mínima. La alta

densidad de energía de este dispositivo de homogeneización se atribuye al efecto

acumulativo del gran número de cavidades generadas. Hay distintos diseños para uso de

laboratorio (piezoeléctricos, puntas sonicadoras) e industrial (generación de campo

ultrasónico por aguja vibrante) (McClements, 1999).

Introducción

34

6.2. Evaluación de la eficiencia de los procesos de homogeneización

La formación de una emulsión tiene por objeto aumentar del área interfacial entre las fases

continua y dispersa. Al ser un proceso termodinámicamente desfavorable, es necesario el uso

de emulsionantes para evitar los fenómenos de desestabilización.

La eficiencia de un emulsificante está gobernada por varias características, incluyendo la

mínima cantidad necesaria para producir una emulsión estable, su habilidad para prvenir la

agregación de las gotas, la velocidad a la cual se adsorbe a la superficie de una gota durante

la homogeneización, la tensión interfacial y el espesor y la viscoelasticidad de la película

interfacial formada. Todas estas características dependen del alimento en el cual el

emulsificante será empleado y de las condiciones de almacenamiento (pH, fuerza iónica, tipo

de aceite, interacción entre los ingredientes, temperatura y agitación mecánica) (Sherman,

1995; McClements, 1999).

6.2.1. Métodos basados en la dispersión de luz

Muchas propiedades importantes de las emulsiones como la estabilidad a largo plazo, la

apariencia y la textura están íntimamente ligadas al tamaño de las gotas que contienen. Por

consiguiente es sumamente importante poder contar con métodos para medir este parámetro

de manera sencilla y reproducible.

Las técnicas basadas en la dispersión estática de luz se utilizan para determinar tamaños de

partícula de emulsiones comprendidos entre 0,1 y 1000 m; por lo tanto se aplican

exhaustivamente a la caracterización de emulsiones alimentarias. Cuando un haz de luz incide

a través de la emulsión, el mismo es dispersado por las gotas en distintas direcciones. La

intensidad con la que se produce este fenómeno está determinada principalmente por el

tamaño de las gotas (y por ende, el área creada durante el proceso de homogeneización) la

longitud de onda de la luz y la diferencia entre los índice de refracción de las fases dispersa y

continua. La interacción de una onda electromagnética con una emulsión se caracteriza

mediante un patrón de dispersión, el cual representa la dependencia angular de la intensidad

de luz que emerge de la emulsión. A través de teorías adecuadas, este patrón de dispersión

puede dar información sobre la fracción volumétrica de la fase dispersa y el tamaño de gota

de las emulsiones.


35

La interacción entre las ondas electromagnéticas y las gotas en la emulsión puede dividirse

en tres regímenes, de acuerdo a la relación entre el radio de las gotas (R) y la longitud de onda

de la radiación incidente (): régimen de longitud de onda larga (R< /20), régimen de

longitud de onda intermedia (R /20) y régimen de longitud de onda corta (R > /20).

La mayoría de las emulsiones alimentarias contienen gotas cuyo tamaño están en el

régimen de longitud de onda intermedio. El patrón de dispersión es extremadamente

complejo, porque las ondas de luz dispersadas por distintas partes de la misma gota están

fuera de fase y por lo tanto pueden interferirse entre si de manera constructiva o destructiva.

La teoría de Mie fue desarrollada para interpretar patrones de dispersión de emulsiones

diluidas que contienen partículas esféricas independientemente de su tamaño. Esta teoría

asume que las ondas de luz son dispersadas por una partícula por única vez, de manera que

puede aplicarse solo en emulsiones diluídas, cuando la concentración de gotas, , es menor a

0,05 %. En emulsiones más concentradas, el haz de luz dispersado por una gota interactúa

inmediatamente con otra gota, de manera que el patrón de dispersión se altera. La teoría de la

dispersión de luz múltiple se desarrolló para el análisis de patrones de dispersión de

emulsiones concentradas.

La dispersión de la luz por parte de las emulsiones está estrictamente ligada con su

apariencia. La intensidad de luz dispersada es mayor cuando la longitud de onda de la luz

incidente está en el mismo orden que el tamaño de las gotas y cuando la diferencia de índices

de refracción entre las fases continua y dispersa es mínima. Por tal motivo, la mayoría de las

emulsiones alimentarias tienen una apariencia opaca, mientras que las microemulsiones, al

tener un tamaño de gota que cae dentro de un régimen de longitud de onda larga (R< /20)

dispersan la luz con menor intensidad y por ende, son emulsiones traslúcidas (McClements,

1999).

6.2.2. Distribuciones de tamaño de partícula

Las emulsiones alimentarias son siempre polidispersas, es decir, el tamaño de todas las

gotas varían dentro de un rango definido entre un valor mínimo y un valor máximo,

especialmente aquellas que son de fuente natural. En el caso de emulsiones elaboradas de

composición más simple, los métodos de homogeneización normalmente empleados tampoco

tienen la capacidad de generar emulsiones monodispersas.

Por lo tanto, para el análisis del tamaño de gota de las emulsiones alimentarias es

conveniente referirse en términos de una distribución de tamaño de partícula. En una

Introducción

36

emulsión monodispersa este concepto carece de sentido por lo cual el tamaño de las gotas

esféricas puede caracterizarse de manera completa e inequívoca a través de un solo parámetro,

el radio (R) o el diámetro (D). Sin embargo, las emulsiones polidispersas requieren un análisis

más complejo. Dado que el diámetro de las gotas está siempre comprendido entre un valor

mínimo y un máximo, es conveniente dividir la escala de tamaños en varios rangos más

pequeños y discretos, detallando el número de gotas que entran dentro de cada rango. Los

resultados pueden presentarse en forma tabular o mediante un histograma. En la práctica es

más conveniente e informativo presentar los datos como una frecuencia de tamaños en

número, en superficie o en volumen.

f n = ni / N (2)

f s = ai / A (3)

f v = vi / V (4)

ni, ai y vi son el número, área y volumen de las gotas del í-ésimo rango; N es el número

total de gotas, A es el área total creada durante el proceso de homogeneización y V es el

volumen total de la gotas en la emulsión.

La distribución de tamaño de partícula también puede representarse como curvas

continuas: la función de distribución F (Di) y la función de distribución acumulativa C

(Di). La función de distribución en número se genera de manera tal que el área bajo la

curva en el rango de dos diámetros Di y Di + dDi es igual al número de partículas en dicho

rango, ni, de manera tal que ni = F(Di) . dDi. A partir del mismo razonamiento puede

generarse las correspondientes funciones de distribución en superficie y en volumen.

Asumiendo que las emulsiones están formadas por gotas esféricas, las funciones de

distribución en número, Fn (Di), superficie, Fs (Di) y volumen, Fv (Di) pueden relacionarse

entre sí a partir de las siguientes expresiones:

Fv (Di) = (1/6) . . Di3 . Fn(Di) (5)

Fs (Di) = . Di2 . Fn (Di) (6)


37

Las funciones de distribución son monomodales cuando presentan un único pico,

bimodales cuando presentan dos picos principales o multimodales si hay más de dos picos.

En general, la complejidad de las funciones de distribución hace imposible la descripción

mediante un modelo matemático. En algunos casos, cuando las funciones de distribución

son monomodales, se puede hacer un modelado mediante una función de distribución

normal o una función de distribución normal logarítmica.

Por otra parte, las funciones acumulativas C (Di) representan el porcentaje en número,

superficie o volumen de las gotas que son menores a Di. Los gráficos C (Di) en función de

Di son curvas sigmoidales, donde C (Di) varía entre 0 y 100 %. La Figura 11 muestra un

ejemplo de distribuciones en número, superficie y volumen para una emulsión o/w.

La utilización de modelos matemáticos para las funciones de distribución tiene la ventaja

de describir un sistema complejo mediante un número pequeño de parámetros. Aunque en

la mayoría de los casos no puede aplicarse un modelo matemático de manera satisfactoria,

a partir de las funciones de distribución pueden calcularse distintos diámetros promedio

(Tablas 4 y 5).

La determinación de los diámetros promedio D1,0, D2,0 y D3,0 requieren el conocimiento

del número total de gotas. El conteo de gotas en una emulsión es un proceso

extremadamente tedioso y complejo, de manera que se utilizan los diámetros promedio de

Sauter (D3,2) y de De Brouker (D4,3), cuyas fórmulas no contienen el número total de gotas

(Tabla 4). Estos diámetros se conocen como “moment diameters” e introducen otro

término lineal en el diámetro, de manera que en el numerador el término superficial tiene

una dependencia con D3 y el volumen con D4 (McClements, 1999; Wasltra, 1983; Rawle,

2005).

Introducción

38

0,1 1 10 100 10000

3

6

9

12

15

18

d

Fn (Di) Fs (Di) Fv (Di)

N (%

), S

(%),

V (%

)

Tamaño de partícula ( m)

0,1 1 10 100 10000

2

4

6

8

b

Sup

erfic

ie (%

)

Tamaño de partícula ( m)0,1 1 10 100 1000

0

3

6

9

12

15

18

a

N

úmer

o (%

)


0,1 1 10 100 10000

2

4

6

8

10

12

c

Vol

umen

(%)


0,1 1 10 100 10000

20

40

60

80

100e

Cn (Di) Cs (Di) Cv (Di)

N (%

), S

(%),

V (%

)


Figura 11: Distribuciones de tamaño de partícula para una emulsión multimodal: a), b) y c), distribuciones en número,

superficie y volumen, expresadas como histograma; d) y e) las mismas distribuciones anteriores expresadas como una función

de distribución continua o una función de distribución acumulativa (Palazolo, 2006).


39

Tabla 4: Diferentes formas de expresar el diámetro promedio de las gotas en una emulsión polidispersa. Abreviaturas: N = número; S = superficie; V= volumen (Palazolo, 2006).

Diámetros promedio Notación Tipo de distribución relacionada

Diámetro promedio en número

D1,0 N

Diámetro promedio en superficie

D2,0 S

Diámetro promedio en volumen

D3,0 V

Diámetro promedio de Sauter

D3,2 S

Diámetro promedio de De Brouker

D4,3 V

Percentil 0,5 o 50 % (mediana)

D x,0,5 (x = N, S, V)

N, S, V

Tabla 5: Definición matemática de los diámetros promedio más utilizados en emulsiones

(Palazolo, 2006).

3ii

4ii

4,3

2ii

3ii

3,2

3ii

i

3ii

3,0

2ii

2ii

2,0

iiii,

Dn

DnD

Dn

DnD

N

Dn

n

DnD

N

Dn

ni

DnD

N

Dn

ni

Dn01D

Introducción

40

El diámetro promedio D3,2 se puede relacionar con el área interfacial específica (AIE, en

m2/ml de emulsión) a partir de la siguiente expresión (Walstra, 1983):

AIE = 6 . / D3,2 (7)

donde es la fracción volumétrica.

Las emulsiones polidispersas también pueden caracterizarse mediante los percentiles (D x, y)

donde x = n, s o v, dependiendo si la distribución es en número, superficie o volumen y es un

número cualquiera comprendido entre 0 y 1. El percentil 0,5 o del 50 % (D x, 0,5) es el más

común y se denomina mediana de la distribución. La mediana es el valor de tamaño de

partícula que divide a la población de gotas de la emulsión en dos partes iguales, es decir 50

% por encima y 50 % por debajo. Los percentiles 0,1 (10 %) y 0,9 (90 %) también se utilizan

para dar un parámetro relacionado con la polidispersidad (P) de la emulsión:

P = [(D x, 0,9 - D x, 0,1) / D x, 0,5 ] (8)

de manera que la emulsión es más polidispersa cuanto mayor es el valor de P. Los percentiles

Dx, y pueden calcularse fácilmente a partir de las funciones acumulativas.

La determinación del tamaño de partícula debe hacerse en condiciones de alta dilución ( <

0,05) y con agitación, con el objeto de que las gotas se distribuyan de manera uniforme. Un

volumen pequeño de la emulsión se coloca en un recipiente con agua y un haz de radiación

láser incide sobre una cubeta interna transparente por donde recircula la emulsión diluida. La

luz dispersada en distintos ángulos por gotas de diferente tamaño pasa por un complejo

sistema óptico e incide posteriormente sobre un arreglo de detectores obteniendo un patrón

angular de luz dispersada. El software incorporado en el equipo se encarga de traducir este

patrón en la correspondiente distribución de tamaño de partícula (McClements, 1999) (figura

12).

La teoría de Mie ha sido desarrollada para interpretar los patrones de dispersión de luz

de partículas homogéneas y esféricas, independientemente del tamaño de las mismas respecto

a la longitud de onda de la radiación incidente. Esta teoría concuerda muy bien con los

resultados experimentales y es utilizada por la mayoría de los analizadores de tamaño de

partícula. La traducción del patrón angular de dispersión de luz en la correspondiente


41

distribución de tamaño de partícula para una emulsión según la teoría de Mie, requiere el

conocimiento previo del índice de refracción de la fase dispersa y del índice de absorción de

luz que pueda causar el film interfacial. Aunque estos parámetros podrían determinarse

experimentalmente, generalmente están incluidos en una base de datos del software del

equipo.

Figura 12. Esquema de los componentes constituyentes del equipo de dispersión de luz (McClements, 1999).

Además, las distribuciones de tamaño de partícula pueden obtenerse en medios

ópticamente opacos, es decir en las emulsiones concentradas sin realizar una dilución previa:

- Se han desarrollado equipos que permiten obtener distribuciones de tamaño de partícula

en emulsiones concentradas por dispersión de luz. Sin embargo, tienen aplicación en

emulsiones cuyo tamaño de gota es muy pequeño (< 5 m) y por ende, sólo puede aplicarse a

algunos tipos de emulsiones alimentarias (McClements, 1999).

- Las espectroscopía acústica se basa en la interacción de las gotas de la emulsión con ondas

de ultrasonido de baja intensidad. Las mismas son dispersadas, obteniendo un espectro de

atenuación a partir del cual se obtiene la fracción volumétrica de fase dispersa () y

distribución de tamaño de partícula (Dickinson y col., 1997; Alba y col., 1999; McClements,

1999). Las ondas ultrasónicas son de baja intensidad y la energía involucrada es de varios

Emulsión diluída Emulsión diluída Detectores ubicados a

distintos ángulos

Introducción

42

órdenes de magnitud menor a las utilizadas para la emulsificación (Dickinson y McClements,

1996).

- La resonancia magnética nuclear de pulsos permite la obtención de la distribución de

tamaño de partícula de las emulsiones. Aunque los equipos tienen un costo muy elevado, la

principal ventaja es que también permite la caracterización de emulsiones w/o, lo cual no

puede realizarse con los métodos mencionados anteriormente (Dickinson y McClements,

1996).

6.3 Estabilidad de emulsiones: estabilidad termodinámica y estabilidad cinética.

La estabilidad de una emulsión se refiere a la capacidad de la misma de resistir

modificaciones de sus propiedades en función del tiempo. Las propiedades de una emulsión

pueden cambiar debido a la ocurrencia de procesos físicos y químicos. Los procesos físicos

originan variación en la distribución espacial o el tamaño de las gotas, mientras que los

procesos químicos producen una alteración de los componentes de las fases dispersa y/o

continua de la emulsión. En la práctica, estos procesos pueden actuar de manera simultánea.

El período de tiempo en que una emulsión debe permanecer estable depende de la

naturaleza del producto. Mientras que algunos productos deben permanecer estables durante

largos períodos de tiempo (mayonesas, aderezos, “soft drinks”), otros requieren un proceso de

desestabilización controlada durante su manufactura o elaboración (margarinas, manteca y

cremas heladas). La desestabilización total implica la separación de las fases que constituyen

el sistema y obviamente, esta situación no es deseable en una emulsión alimentaria.

Al considerar la estabilidad de una emulsión, es importante distinguir entre la estabilidad

termodinámica y la estabilidad cinética. La termodinámica trata sobre la posibilidad de que

un proceso puede ocurrir o no de manera espontánea; en cambio la cinética se refiere a la

velocidad con la que dicho proceso tiene lugar.

La inestabilidad termodinámica de una emulsión se demuestra de manera sencilla si se

agita vigorosamente un recipiente sellado que contiene agua y aceite. La emulsión

ópticamente opaca que se forma inicialmente se desestabiliza a lo largo del tiempo hasta

observar una capa superior de aceite sobre la capa acuosa, en la cual se minimiza el área de

contacto entre las fases inmiscibles. El origen de la inestabilidad termodinámica puede

ilustrarse comparando la energía libre de un sistema que contiene una fase oleosa dispersa y

una fase acuosa continua, antes y después de la homogeneización. Para simplificar el análisis


43

se asume que las densidades de la fase acuosa continua y dispersa son iguales, de manera que

el estado inicial consiste en una única gota suspendida en la fase continua en lugar de una

capa de aceite sobre la capa acuosa (McClements, 1999) (figura 13).

En el estado inicial, antes de la homogeneización la energía libre del sistema está dada por:

Gi = Gi fd + Gi fc + Gi I – TSi conf (9)

y en su estado final, después del proceso de emulsificación:

Gf = Gf fd + Gf fc + Gf I – TSf conf (10)

Gfd, Gfc y GI son las energías libres de las fases dispersa, continua e interfacial

respectivamente, T es la temperatura absoluta y Sconf es la entropía configuracional de las

gotas de la emulsión; los superíndices i y f se refieren los estados inicial y final del sistema.

Las energía libre de la fase continua y dispersa antes y después de la formación de la emulsión

permanecen constantes de manera que la diferencia de energía libre de los estados inicial y

final del sistema (G formación) viene dada por:

G formación = Gf I – Gi I – (TSf conf – TSi conf) = GI - TS conf (11)

Estado inicial Estado final

Figura 13. La formación de una emulsión es termodinámicamente desfavorable debido al aumento en el área superficial entre las fase aceite y acuosa.

Introducción

44

Las fases acuosa y dispersa son inmiscibles o muy poco miscibles entre sí, de manera que

las mismas presentan una tensión interfacial (). Por consiguiente el término GI es igual al

producto de y el incremento de área entre las fases acuosa y dispersa (A) de manera que:

G formación = A - TS conf (12)

El cambio de energía libre interfacial ( A) es siempre positivo porque el área interfacial

se incrementa después de la formación de la emulsión, mientras que la entropía

configuracional

(- TS conf) es siempre negativo, debido a que el ordenamiento posible que las gotas pueden

adoptar en el estado emulsificado es mucho mayor que en el estado inicial. En la mayoría de

las emulsiones alimentarias, con gotas que varían de 0,1 a 100 m, el término configuracional

es mucho menor que la energía libre interfacial (McClements, 1999).

La ecuación anterior se reduce a:

G formación = . A (13)

Por consiguiente la formación de una emulsión es un proceso termodinámicamente

desfavorable, debido al incremento de área interfacial. El término configuracional sólo puede

dominar el comportamiento del sistema en emulsiones donde la tensión interfacial entre las

fases continua y dispersa es extremadamente baja de manera que se forman sistemas

termodinámicamente estables. Este tipo de sistemas reciben el nombre de microemulsiones

para distinguirlos de las emulsiones.

El cambio de energía libre asociado con la formación de una emulsión determina si el

proceso es o no termodinámicamente desfavorable, pero no da ninguna indicación sobre la

velocidad a la cual las propiedades de la emulsión cambian con el tiempo ni del (de los)

mecanismo (s) responsables de estos cambios. El hecho de que las emulsiones permanezcan

en muchos casos en un estado cinéticamente estable (o metaestable) puede atribuirse a la

existencia de una energía de activación (G*), la cual debe superarse para alcanzar la

separación total de las fases, el estado termodinámico más estable (Figura 14). Para que una

emulsión sea cinéticamente estable el valor de G* debe ser significativamente mayor a la

energía térmica ET (ET = kT). En realidad, debido a que hay diferentes mecanismos por los

cuales una emulsión puede desestabilizarse es muy común que las emulsiones tengan más de


45

un estado metaestable, cada uno de ellos con su propia energía de activación. El pasaje de un

estado metaestable a otro puede ser suficiente para tener un efecto indeseable sobre la

estabilidad.

La estabilidad cinética de las emulsiones se atribuye a la naturaleza dinámica de estos

sistemas bifásicos. Las gotas de una emulsión, lejos de permanecer estáticas están en continuo

movimiento y colisionan unas con otras debido al movimiento browniano, la gravedad o

fuerzas externas aplicadas. Si las gotas se alejan o se fusionan después de una colisión

depende de la naturaleza de las interacciones coloidales entre ellas. Por lo tanto la estabilidad

cinética de las emulsiones está determinada por la dinámica y las interacciones de las gotas

que contienen.

La teoría de la estabilidad coloidal o teoría DLVO (Derjaguin-Landau-Verwey-Oberveek)

establece que la estabilidad cinética de un sistema coloidal depende esencialmente de la

dependencia del potencial creado entre la superficie de dos gotas con la distancia que las

separa (h).

Es muy importante recalcar que la teoría DLVO no permite interpretar todos los

fenómenos que afectan la estabilidad de la emulsión (Friberg, 1997; McClements, 1999). La

complejidad de la estructura de las proteínas y aún de los agentes emulsificantes no proteicos

genera otras interacciones coloidales (Tabla 6).

El potencial total W (h) por lo tanto viene dado por la suma de los potenciales generados

por todas las interacciones coloidales (Tabla 6)

W (h) = W (VdW) + W (elect) + W (est) + W (hid) + W (dep) + W (hidrat) + W (fluc term) (14)

Depende de cada sistema el que algunas de las interacciones posibles sean despreciables

frente a otras, las cuales pasarán a ser las que gobiernan las características de la emulsión.

En el caso de que las emulsiones estén estabilizadas por proteínas, en base a las

características estructurales de estas macromoléculas, las interacciones electrostáticas son

muy importantes lejos del punto isoeléctrico (carga neta elevada) y se hacen despreciables

cerca del mismo, en el cual se intensifican las interacciones de carácter hidrofóbico.

Introducción

46

Tabla 6: Características de las interacciones coloidales posibles entre las gotas en una emulsión (Palazolo, 2006).

Interacción Signo Intensidad Rango Efecto del pH

Efecto de la fuerza iónica

Efecto de la temperatura

Van der Walls A F L N Reducido Disminuye Electrostática R D - F C - L S Reducido Aumenta Estérica: De mezclado A o R D - F C DS DS DS

Elástica R F C DS DS Aumenta Depleción A D - F C DS DS Aumenta Hidrofóbica A F L N S Aumenta Hidratación R F C - L Indirecto Indirecto Disminuye Fluctuación térmica

R F C Indirecto N Aumenta

A: atracción, R: repulsión, F: fuerte, D: débil, L: largo ( 10 nm), C: corto ( 10 nm), DS: dependiente del

sistema,

S: si, N: no

6.4 Mecanismos físicos de desestabilización de emulsiones

Desde el momento en que se forma una emulsión, inmediatamente después de la

homogeneización (y a veces durante), comienza el proceso de desestabilización, el cual tiende

a disminuir el área interfacial y llegar al estado termodinámico más estable, las fases

separadas. Existen distintos mecanismos que contribuyen simultánea y sinérgicamente a la

desestabilización y son la consecuencia de distintos fenómenos físicos, los cuales se

relacionan con la diferencia de densidad de las fases continua y dispersa, las interacciones

coloidales entre las gotas y la estructura y viscoelasticidad del film interfacial (McClements,

1999).

En el caso particular de las emulsiones alimenticias, los cambios producidos por la

desestabilización deben controlarse para que las características de la emulsión se mantengan

dentro de un rango de valores estrechos, fuera del cual ya no sería posible su utilización o

comercialización (Wagner, 2000).

El cremado y la sedimentación se conocen conjuntamente como fenómenos de separación

gravitacional. El cremado describe el movimiento ascendente de las gotas debido a la menor

densidad de la fase dispersa respecto a la de la fase continua, mientras que la sedimentación

describe el movimiento de las gotas en sentido contrario, precisamente también por un

efecto de diferencia de densidad. En general (aunque no de manera exclusiva) el cremado es


47

más común en emulsiones o/w y la sedimentación, en emulsiones w/o. Durante el proceso

de cremado se forma una fase inferior o suero, la cual está empobrecida en gotas y una fase

superior enriquecida en gotas, la fase crema. (Figura 14).

La floculación y la coalescencia son mecanismos de desestabilización que surgen como

consecuencia de un fenómeno de agregación entre las gotas. En el primer caso, las gotas

mantienen su integridad individual, mientras que en la coalescencia el proceso de agregación

entre dos gotas culmina con la formación de una gota de mayor tamaño y por lo tanto

implica la ruptura de la pelicula interfacial. Si la coalescencia se da en mayor extensión,

puede conducir eventualmente a la formación de una capa de aceite libre en la parte superior

de la emulsión (Friberg, 1997). Este fenómeno se conoce, en inglés, como “oiling off” y

culmina con la separación total de las fases constituyentes del sistema (Figura 14).

La desproporción de Ostwald es causada por transporte difusivo de la fase dispersa desde

las gotas más pequeñas a las más grandes en una emulsión. El efecto es el crecimiento de las

gotas más grandes a expensas de las más pequeñas. En la práctica, es muy difícil distinguir

este proceso del de coalescencia. Sin embargo, la insolubilidad del aceite en la fase acuosa

impide el transporte difusional por lo que este mecanismo es más importantes en otros

sistemas dispersos, como las espumas donde el gas de las burbujas puede difundir a través

de la fase acuosa. La presencia de sustancias hidrosolubles en la fase oleosa dispersa

(alcoholes, ácidos grasos de cadena corta) puede inducir en las emulsiones un cierto grado

de desproporción (Friberg, 1997; McClements, 1999).

La inversión de fase es un proceso en el cual se produce un cambio desde una emulsión

aceite en agua (o/w) a una emulsión agua en aceite (w/o) y viceversa. Este mecanismo de

desestabilización es muy importante en la manufactura de algunos productos alimenticios,

como la margarina y la manteca (Dickinson y Stainsby, 1982, McClements, 1999). La base

de este fenómeno es muy compleja, y se cree que involucra aspectos fisicoquímicos de la

floculación, coalescencia, coalescencia parcial (cuando las gotas son semicristalinas) y

formación de emulsiones. Después de la inversión de fase, las propiedades de la emulsión

pueden cambiar considerablemente.

Los mecanismos de desestabilización no ocurren de manera separada o aislada. Una

emulsión puede desestabilizarse simultáneamente por distintos mecanismos, dependiendo de

la viscosidad de la fase continua, el tipo de agente emulsificante empleado y su concentración

inicial en la fase acuosa (u oleosa), la magnitud de , la adición de componentes (sales,

Introducción

48

azúcares), el pH y la aplicación de distintos tratamientos, como trabajo mecánico, ciclos de

temperatura y congelación. En este caso, no se han incluido los mecanismos químicos de

desestabilización, producto de procesos tales como la oxidación lipídica o alteración por

crecimiento microbiano. Los cambios químicos en algunos componentes de la emulsión

pueden favorecer la desestabilización de una emulsión por mecanismos físicos (McClements,

1999).

Emulsión

inicial 1

2

3

4 5

Figura 14. Mecanismos de desestabilización más importantes de una emulsión aceite en agua (o/w): 1- Cremado; 2- Floculación; 3- Coalescencia. Si el proceso de coalescencia continua en el tiempo, se forma una capa de aceite libre en la parte superior de la emulsión (oiling off, 4), que culmina con la separación total de fases (5). Los mecanismos de desestabilización no son independientes. En general, el cremado y la floculación anteceden a la coalescencia (Palazolo, 2006).


49

5.4.1. Cremado

Como se mencionó anteriormente, el cremado es un proceso de separación gravitacional.

La importancia del cremado en la industria alimentaria es muy alta y se estima que el 40 %

del costo de desarrollo de nuevas emulsiones alimentarias se atribuye a la realización de

ensayos de estabilidad frente a este mecanismo, porque da el primer indicio visual de la

desestabilización (Robins, 2000). La velocidad de cremado de una emulsión (v) puede

evaluarse a través de la ley de Stokes:

donde R es el radio de las gotas, es la diferencia de densidad entre la fase continua y

dispersa y es la viscosidad del medio. Según la ley de Stokes, la velocidad es directamente

proporcional al cuadrado del radio de las gotas, a la diferencia de densidad e inversamente

proporcional a la viscosidad del sistema. Sin embargo, esta ley tiene muchas limitaciones para

describir el comportamiento de las emulsiones. Las más importantes se describen a

continuación:

1- En primer lugar las emulsiones son siempre polidispersas (en el mejor de los casos,

tienen una distribución de tamaño de gota monomodal, lo cual no implica un único tamaño de

gotas), por lo tanto, hay diferentes “poblaciones” de gotas de distinto tamaño y por ende, con

una velocidad de cremado diferente. La velocidad de cremado de las gotas más pequeñas

podría frenar el movimiento de las gotas de mayor tamaño, especialmente en emulsiones de

alto (concentración de gotas).

2- La ecuación de velocidad de cremado no tiene en cuenta el movimiento browniano,

debido a la agitación térmica (E = kT). Por un efecto entrópico, este movimiento tiende a

distribuir las gotas de manera uniforme en el seno de la emulsión, lo que se opone al

movimiento ascendente de las gotas. El efecto es importante si el diámetro de las mismas es

menor a 1 m (McClements, 1999).

)15(η9

gΔhR2v

2

Introducción

50

3- Dado que la ley de Stokes predice la velocidad de cremado “a dilución infinita” no

tiene en cuenta el efecto de un aumento en ni las interacciones coloidales entre las gotas en

la emulsión. La magnitud con la que se dan estas interacciones puede determinar la formación

de flóculos, por lo que la velocidad de cremado se puede dar en mayor o menor grado de lo

que podría predecir la ecuación de velocidad de cremado.

4- El film interfacial está altamente hidratado, debido a la interacción de las moléculas de

agua con los restos hidrofílicos de los emulsificantes adsorbidos en la interfase. El efecto es

particularmente importante en gotas de menor tamaño, en la que la magnitud de espesor del

film interfacial es importante respecto al diámetro de la gota. En ese caso, la densidad de las

gotas es más cercana a la de la fase continua circundante, efecto que retarda la velocidad de

cremado.

5- La velocidad de cremado podría disminuir drásticamente durante el almacenamiento

estacionario si la fase continua tiene un comportamiento no-newtoniano, con una alta

viscosidad o con un umbral de fluencia (la emulsión se comporta como sólido en reposo y

como fluido por la aplicación de un esfuerzo de corte), aún cuando el diámetro de las gotas no

sea demasiado pequeño. Esto sucede normalmente en emulsiones alimentarias como la

mayonesa y aderezos.

En una emulsión o/w el cremado, se puede estudiar por distintos métodos. Según su

naturaleza, estos métodos pueden ser destructivos o no destructivos.

En los métodos destructivos, se producen modificaciones permanentes en la emulsión, de

manera que la misma no puede volver a utilizarse para una nueva medición.

Los métodos no destructivos, en cambio son más adecuados para evaluar la cinética de

cremado. Los métodos no destructivos pueden clasificarse en métodos mono-dato y multi-

datos (Robins, 2000). En los métodos mono-dato se obtiene un solo parámetro a un

determinado tiempo, mientras que los métodos multi-dato permiten obtener un perfil de datos

originado a partir de un barrido o “scanning” de la muestra. En muchos casos, el proceso de

floculación puede darse de manera simultánea al de cremado, por lo que estos métodos

evalúan la cinética de cremado-floculación.


51

Tabla 7: Métodos para evaluar el cremado en emulsiones o/w. D: destructivo; ND: no destructivo * método ND- mono-dato, ** método ND multi-datos. Referencias: a) Tornberg y Hermansson (1977); Ye y Singh (2001) b) Dagorn-Scaviner y col. (1987) c) Kato y col., (1985) d) Mengual y col. (1999) e) Dickinson y col. (1997) f) Kauten y col. (1991).

Método Característica Descripción

Gravimétrico (a) D Determinación de materia grasa (MG) por el método de Mojonnier o Röse-Gottlieb. Comparación de MG entre el suero y la emulsión inicial a un tiempo determinado

Volumétrico (b) ND * Variación de la altura de la interfase entre la fase crema y el suero en función del tiempo

Conductimétrico (c) ND ** Variación de conductancia de la emulsión en la parte inferior del recipiente que contiene la muestra

Ópticos (dispersión de luz, d) ND ** Obtención de perfiles de dispersión de luz en función de la altura de la muestra

Ultrasónicos de baja intensidad (e) ND ** Obtención de fracción volumétrica de la emulsión en función de la altura de la muestra

Resonancia magnética nuclear (f) ND ** Obtención de la fracción volumétrica de la emulsión en función de la altura de la muestra / obtención de imágenes

6.4.2. Floculación

La floculación es un proceso de agregación de gotas, que puede ser o no reversible, el cual

depende fundamentalmente de las interacciones coloidales que existen entre las gotas. Se han

propuesto distintos mecanismos, los cuales dependen de la concentración y tipo de proteína o

emulsificante no proteico utilizado, del método de homogeneización y la presencia de

componentes sin actividad interfacial en la fase continua (McClements, 1999). Si las

interacciones atractivas predominan sobre las interacciones repulsivas se produce la atracción

entre las gotas con formación de flóculos.

En emulsiones preparadas con proteínas como agentes emulsificantes puede producirse la

floculación por un mecanismo de puenteo (“bridging flocculation”). Cuando un biopolímero

se adsorbe en la interfase toma configuraciones de “filas”, “lazos” y “colas” (Israelachvili,

1992). La floculación se da cuando las “colas” de una molécula de biopolímero adsorbido en

Introducción

52

la interfase de una gota interaccionan con la interfase de otra gota (Tornberg y col., 1997). La

concentración interfacial de biopolímero es el factor dominante que gobierna este mecanismo.

Sin embargo, también depende de otras propiedades del biopolímero tales como: peso

molecular, grado de disociación, flexibilidad molecular (Tornberg y col., 1997). Para un

determinado biopolímero hay una concentración interfacial donde la floculación es máxima.

Por debajo de esa concentración, la homogeneización es ineficiente debido al predominio de

la coalescencia (Figura H), obteniéndose emulsiones de tamaño de gota elevado. A

concentraciones altas de biopolímero la floculación por puenteo es inhibida (Dickinson y col.,

1997). Durante el proceso de homogeneización, el transporte de las moléculas de biopolímero

a la interfase es por convección (Walstra, 1983); si el biopolímero no se adsorbe

suficientemente rápido en relación a la creación de área interfacial, también puede darse la

floculación. Hay que destacar que la floculación por puenteo es irreversible en condiciones de

dilución y no tiene lugar en emulsiones estabilizadas por agentes surfactantes no proteicos

debido a que su estructura no es tan compleja como la de las proteínas (Tornberg y col.,

1997).

El mecanismo de floculación por puenteo también puede darse en emulsiones en donde las

proteínas cubren eficientemente el área interfacial creada. En el primer caso, cuando las

proteínas tienen una afinidad elevada por ciertos tipos de cationes (por ejemplo, Ca2+), los

mismos pueden servir de “puente” para la interacción entre las gotas. Los iones producen el

apantallamiento (“screening”) de las cargas entre las moléculas de proteína adsorbidas,

favoreciendo la agregación (Ye y Singh, 2001). En segundo lugar, la floculación por puenteo

puede favorecerse por efecto de un hidrocoloide sin o con muy poca actividad interfacial. La

adición de polisacáridos en las emulsiones tiene por objeto aumentar la viscosidad de la fase

continua, con lo cual se logra controlar el cremado. Sin embargo, con algunos polisacáridos a

concentraciones relativamente bajas las moléculas de polisacárido pueden interaccionar

fuertemente con las de proteína en la interfase, favoreciendo la floculación (Dickinson y col.,

1989, Mc Clements, 1999; Damodaran, 2005).

Cuando la floculación por puenteo es irreversible en condiciones de dilución, puede

estudiarse por técnicas de microscopía óptica y confocal (Tornberg y Ediriweera, 1988; Mc

Clements, 1999), turbidimetría y determinación de la distribución de tamaño de gota en

ausencia y presencia de SDS (Ye y Singh, 2001; Anton, 2002; Relkin y Sourdet, 2005). En

este último caso, las condiciones de alta dilución y agitación provocan la ruptura de los

flóculos inestables, dejando sólo aquellos que resisten dichas condiciones. En muchos casos,

las técnicas de dispersión de luz no dan el verdadero tamaño de los flóculos (Mc Clements,


53

1999). A pesar de estas limitaciones y de que los diámetros promedio obtenidos no sean

valores absolutamente fidedignos, este método se utiliza en gran extensión (Ye y Singh, 2001;

Anton, 2002; Relkin y Sourdet, 2005). Como conclusión, hay que destacar que los flóculos

que se determinan son aquellos estables en las condiciones de medición.

Por otra parte, existe un mecanismo de floculación conocido como floculación por

depleción o por agotamiento (“depletion flocculation”) que también fue propuesto para el

caso de emulsiones con polisacáridos (McClements, 1999). La adición de un polisacárido a

las emulsiones induce la floculación por agotamiento por un efecto de volumen de exclusión.

Cuando el espacio entre gotas adyacentes es más pequeño que el volumen hidrodinámico

termodinámicamente más estable del polisacárido, el polímero es excluido del espacio entre

las gotas. Esto establece un gradiente de concentración local y por ende, un gradiente de

presión osmótica que induce la floculación (Damodaran, 2005). Este efecto de depleción se ve

también en emulsiones sin adición de polisacáridos. Las emulsiones estabilizadas con bajas

concentraciones de caseinato de sodio en general son más estables que las estabilizadas con

concentraciones intermedias. El exceso de caseinato de sodio no adsorbido, el cual tiene una

estructura similar a las submicelas de caseína (Creamer y Berry, 1975) puede promover la

floculación por agotamiento, aumentando la velocidad de cremado (Dickinson y Golding,

1997; Dickinson y col., 1997).

6.4.3. Coalescencia

La coalescencia es el principal mecanismo mediante el cual una emulsión evoluciona a su

estado termodinámicamente más estable, ya que se disminuye el área de contacto entre las

fase aceite y acuosa. La fase final de la coalescencia culmina con la formación de una capa de

aceite en la parte superior (conocido como oiling off) (McClements, 1999).

Cuando una emulsión se almacena en condiciones estacionarias, con excepción de que se

haya elegido un método de homogeneización ineficiente, un agente emulsificante inadecuado

o tenga un valor de muy elevado, la coalescencia es un mecanismo de desestabilización

más lento que el cremado y la floculación (Britten y Giroux, 1991). Para que este proceso

ocurra, las gotas deben estar lo suficientemente cercanas entre sí. Este hecho es más probable

que se dé en emulsiones que presentan un alto grado de floculación o cuando se ha formado la

fase crema (Damodaran, 2005).

La coalescencia es un proceso irreversible. Se forma una gota más grande a expensas de

gotas más pequeñas por una ruptura del film interfacial (McClements, 1999; Damodaran,

Introducción

54

2005). Cuando dos gotas se acercan hay una delgada capa de fase continua (o lamela) que

tiene un determinado espesor. Cuando este espesor disminuye por debajo de un valor crítico

se produce la coalescencia. Por lo tanto, la estabilidad frente a la coalescencia en una

emulsión será mayor cuanto más elevado sea el espesor de la lamela que separa a las gotas. La

magnitud de este espesor está gobernada por dos fuerzas de carácter opuesto. En primer lugar,

la presión dentro de una gota de la fase dispersa es superior a la de la fase continua en una

magnitud que está dada por la ecuación de Laplace. La otra fuerza es la presión de

desprendimiento o de separación (“disjoining pressure”). Cuando dos gotas están desprovistas

de agente emulsificante (por ejemplo agua y aceite) la presión de separación es despreciable y

las gotas coalescen fácilmente por colapso del film interfacial cuando se acercan debido a la

presión de Laplace. Sin embargo, cuando las mismas están cubiertas con un agente

emulsificante, las interacciones coloidales entre las moléculas adsorbidas crean una presión de

separación que tiende a incrementar el espesor de la lamela. Por lo tanto, la magnitud y

naturaleza de las interacciones coloidales son de importancia fundamental para determinar si

una emulsión es estable o no frente a la coalescencia.

En los casos en que una emulsión es sometida a esfuerzos de corte (por ejemplo un trabajo

mecánico como es la agitación), la viscoelasticidad del film es de suma importancia para

impedir la coalescencia. En una emulsión en reposo, las gotas también están en continuo

movimiento y colisionan unas con otras. Sin embargo, bajo condiciones de trabajo mecánico,

la frecuencia y eficiencia de colisión entre las gotas puede aumentar considerablemente. El

esfuerzo de corte puede producir deformación en el film interfacial el cual genera hoyos y

posterior ruptura en el mismo, dando lugar a la coalescencia (Lucassen-Reynders, 1993;

Damodaran, 2005). En general los films interfaciales estabilizados por proteínas son más

resistentes a los esfuerzos de corte que los estabilizados por agentes emulsificantes no

proteicos, aún cuando éstos tienen mayor actividad superficial (Mc Clements, 1999;

Damodaran, 2005).

La coalescencia puede evaluarse por los mismos métodos utilizados para el estudio de la

floculación, porque en ambos procesos hay un aumento del tamaño de partícula. Sin embargo,

al ser un mecanismo de desestabilización más lento, se recurre a los métodos acelerados:

centrifugación, efectos combinados de almacenamiento y centrifugación, y fuerzas mecánicas.

Por otra parte, cuando el grado de desestabilización por coalescencia es muy alto, el

tamaño de algunas gotas es tal que se termina formando una capa de aceite en la parte

superior de la emulsión (“oiling off”). En emulsiones con este avanzado grado de


55

desestabilización, gran parte del aceite que permanece emulsionado está contenido en gotas de

tamaño elevado, lo cual dificulta su manipulación y caracterización por las técnicas

mencionadas. Por tal motivo, es necesario recurrir a técnicas que cuantifiquen la cantidad de

aceite separado en una emulsión.

6.5. Evaluación de la estabilidad global de una emulsión por medidas de dispersión múltiple

de luz

El analizador óptico vertical (Quick Scan, Turbiscan) permite evaluar la

desestabilización global de emulsiones, suspensiones y espumas sin dilución, con tamaños de

partícula entre 0,05 a 5000 m y una concentración de 60 % v/v, determinando los diferentes

mecanismos que la conducen. Este equipo consiste de una cabeza lectora que se mueve a lo

largo de una celda cilíndrica de vidrio donde la muestra es almacenada estacionariamente

durante un cierto período de tiempo. La cabeza lectora es una fuente pulsante de radiación

electromagnética en el infrarrojo cercano ( = 850 nm), conjuntamente con dos detectores

sincrónicos: el de transmitancia que detecta la radiación transmitida a través de la muestra y el

de backscattering recibe la radiación dispersada por la muestra en una dirección de 135º

respecto a la fuente (Pan y col., 2002). Este equipo permite medir la desestabilización en

emulsiones concentradas, las cuales son medios ópticamente opacos. El principio de medición

del equipo se basa en la teoría de dispersión múltiple de luz: los valores de transmitancia (T

%) y de backscattering (BS %) dependen no sólo del diámetro de las gotas, sino también de la

fracción volumétrica de la fase dispersa (). El principio de medición del analizador óptico

vertical ha sido exhaustivamente estudiado por Mengual y col. (1999).

La cabeza lectora adquiere los datos de trasmitancia (T %) y de backscattering (BS %)

cada 40 m a lo largo de la celda, en una longitud máxima de 80 mm, realizando un barrido

vertical de la emulsión contenida en la celda (Figura 15). Los resultados son presentados

mediante un software como curvas de T % y de BS % en función de la altura del tubo. La

adquisición de datos puede repetirse a lo largo del tiempo de una forma programada y los

resultados son expresados en función del tiempo. El análisis de los perfiles de T % y BS %

obtenidos permite determinar la cinética para un dado mecanismo de desestabilización

(cremado o coalescencia) si se elige adecuadamente la zona del tubo (Pan y col., 2002).

Introducción

56

Figura 15. Repreentación esquemática del principio de funcionamiento del analizador óptico vertical Turbiscan (Palazolo, 2006).

Analizador óptico verticalAnalizador óptico vertical

Cortesía Beckman Coulter

BackScattering

Transmitancia

Ca

beza

Móv

il

Long

itud

de la

mue

stra

0% 50% 100%

Clara

Turbia

Opaca


57

Objetivo general

La presente tesis tiene como objetivo general el estudio de la funcionalidad de

hidroxipropilmetilcelulosas y sus mezclas con lactoglobulina.

El enfoque del estudio será el siguiente:

1) Estudiar las hidoxipropilmetilcelulosas y sus mezclas con lactoglobulina

en la escala submicrónica (a nivel nanométrico), es decir, el comportamiento

de estos biopolímeros en solución y en interfases.

2) Estudiar el comportamiento a nivel macroscópico, en emulsiones aceite-

agua, y relacionarlo con el comportamiento a nivel nanométrico.

Objetivos específicos

Caracterizar el estado de asociación de HPMCs en solución acuosa a pH3 y pH6

por dispersión dinámica de luz.

Evaluar el efecto de ultrasonidos de alta intensidad en el tamaño de partícula de

las soluciones por medio de dispersión dinámica de la luz y su impacto en

algunas propiedades funcionales relevantes como gelificación, emulsificación,

viscosidad.

Estudiar la adsorción dinámica de HPMCs en la interfase aceite-agua a pH3 y

pH6 y comparar el comportamiento en la interfase aire-agua.

Estudiar el comportamiento de las HPMCs en emulsiones aceite-agua a

temperatura ambiente y su relación con las propiedades interfaciales.

Caracterizar las soluciones acuosas de mezclas de HPMC y -lactoglobulina a

pH3 y pH6 por dispersión dinámica de luz.

Estudiar la adsorción dinámica de mezclas de HPMC y -lactoglobulina en la

interfase aceite-agua a pH3 y pH6.

Evaluar el comportamiento de mezclas de HPMC y -lactoglobulina en

emulsiones aceite-agua a temperatura ambiente y su relación con las propiedades

interfaciales.

Objetivos

58

Se seleccionaron esos dos pHs (3 y 6) para realizar los estudios en el presente trabajo

de tesis por ser pH6 el pH natural de las soluciones de HPMC y pH3 por ser

representativo de los alimentos ácidos donde estos biopolímeros pueden emplearse.

Materiales y métodos


59

1. Materiales.

1.1 Hidroxipropilmetilcelulosa.

Las hidroxipropilmetilcelulosas Methocell E5LV, E15LV, E50LV y E4M (grado alimentario),

fueron gentilmente donadas por Colorcon Argentina, representantes de Dow Chemical Company y

empleadas sin purificación posterior.

La tabla 1 muestra algunas de las propiedades que caracterizan a las HPMCs tales como el

contenido de metilos e hidroxipropilos, la relación metilos/hidroxipropilos, la sustitución molar, el

grado de sustitución, la viscosidad a 25°C de soluciones al 2 % y el peso molecular . El contenido de

humedad fue de 1.6%.

Tabla 1.Propiedades de las HPMCs.

HPMC E4M E50LV E15LV E5LV

% metilos 28,0 29,1 29,2 29,5

% hidroxipropilos 10,2 9,2 9,3 9,7

Relación metilos/ hidroxipropilos 2,3 3,2 3,1 3,0

Sustitución en metilos (DS) 1,90 1,90 1,9 1,9

Sustitución en hidroxipropilos (MS) 0,23 0,23 0,23 0,23

Sustitución total (DS + MS) 2,13 2,13 2,13 2,13

Viscosidad (cp), solución2% p/p, 25°C 4965 41 15 5,4

Peso molecular (Da) 90000 18000 6000 2000


60

1.2 -lactoglobulina.

BioPure -lactoglobulina fue provista por Davisco Foods International, Inc. (Le Sueur,

Minnesota, Estados Unidos). Su composición se resume en la tabla 2.

Tabla 2. Composición -lactoglobulina.

cantidad proteína (%), base seca 97,8 cantidad -lg /total proteínas (%) 93,6

grasa(%) 0,3 cenizas(%) 1,8

humedad(%) 5,0

1.3 Aceite vegetal

Se empleó aceite comercial de girasol (ampliamente utilizado en la industria de

alimentos) sin purificación posterior como fase aceite para la preparación de la emulsiones

como también para los estudios de interfases.

El aceite de girasol contiene triglicéridos, fosfolípidos y ácidos grasos saturados e

insaturados. La longitud de la cadena alquílica varía entre 14 y 22 (Wüstneck, et al ,1999).

Se usó aceite de girasol purificado para algunas de las mediciones en interfases. Para ello

se dejó interactuar al aceite comercial de girasol con un compuesto (Fluorisil 60-100 Mesh,

Aldrich ®) atrapante de las sustancias tensioactivas del aceite (fosfolípidos, ácidos grasos

libres, monoglicéridos) durante 24 hs, se filtró luego (0,22 mm) la fase superior.

2. Métodos

2.1 Preparación de las soluciones de polisacárido y proteína

Las soluciones de hidroxipropilmetilcelulosa, en concentraciones del 0,01 al 7 % p/p

dependiendo de la HPMC, se prepararon disolviendo a 80-90 °C el polvo en buffer fosfato

5mM (para soluciones a pH6) o en buffer citrato/HCl 5 mM (para soluciones a pH3) y luego

enfriando hasta temperatura ambiente. Las soluciones se almacenaron a 4°C durante 24 hs

para lograr una completa hidratación del polisacárido.

Las soluciones de -lactoglobulina, en concentraciones del 0,01 al 7 % p/p, se prepararon

disolviendo a temperatura ambiente el polvo en buffer fosfato (para soluciones a pH6) o en

buffer citrato/HCl (para soluciones a pH3). Para prevenir el crecimiento microbiano, se

adicionó azida sódica (NaN3) en una concentración de 0,02% p/p.


61

Las soluciones mixtas de -lg y polisacáridos a pH3 o pH6, se obtuvieron mezclando

partes iguales de las soluciones de cada biopolímero, preparadas al doble de la concentración

requerida en la mezcla. Las mezclas fueron agitadas al menos durante 30 minutos para lograr

una total dispersión de las soluciones.

El mismo procedimiento se siguió para la preparación de las mezclas de HPMC y SDS al

2%p/p de concentración final en la mezcla. El SDS se preparó con agua desionozada. La

misma solución de SDS fue empelada en las mediciones de estabilidad en emulsiones.

Las soluciones de buffer para ambos biopolímeros, se prepararon con agua desionizada y

luego se filtraron con filtros jeringa de 0,45 y 0,22 m de diámetro de poro para eliminar

cualquier impureza presente. Para los estudios en interfases, la ausencia de contaminantes

tensioactivos en el buffer se verificó mediante medidas de tensión superficial previo a la

preparación de las muestras en dicho buffer. La tensión superficial medida fue la aceptada

por la literatura (72-73 mN/m a 20ºC).

2.2 Determinación de la viscosidad de las soluciones

Se determinó la viscosidad de las soluciones de polisacáridos (2%) y proteína (2%) en un

viscosímetro Brookfield DV-LVT con cono y plato a 25°C, ya sea antes o inmediatamente

después del tratamiento con ultrasonidos de alta intensidad. Se utilizaron los conos CP41 y

CP52, de diámetros 4,8 y 2,4 mm respetivamente. En el rango de velocidad de deformación

de 0,5 a 120 s-1. Se obtuvieron los valores de esfuerzo de corte frente a las velocidades de

deformación. Los datos fueron ajustados mediante la ecuación de la ley de la potencia:

ぷ= 計.べ津 (1)

donde τ es el esfuerzo de corte,

es la velocidad de deformación,

K es el coeficiente de consistencia,

n es el índice de flujo.

Las mediciones de viscosidad se informan como el promedio y la desviación estándar de al

menos tres mediciones.


62

2.3 Tratamiento de ultrasonido de alta intensidad

Se colocaron 5 ml de cada solución de HPMC en un tubo de vidrio de 1,5 cm de diámetro

y 10 cm de longitud y se sonicaron utilizando un procesador ultrasónico Vibra Cell Sonics,

modelo VCX 750 (Sonics & Materials INC.,Newtown, Estados Unidos) a una frecuencia de

20 kHz y una amplitud de 20%, durante 20 minutos continuos (figura 1). Para la sonicación

se utilizó una punta roscada de titanio de 13 mm de diámetro y acoplada a un microtip de 3

mm de diámetro. La muestra contenida en el tubo de vidrio de 10 mm de diámetro, fue

sonicada a temperatura controlada en un baño de glicerina, mantenido a temperatura

constante de 0,5 °C mediante un baño con agua en circulación constante (Polystat,Cole-

Parmer). A esta temperatura, el calor producido durante el proceso de sonicación es

totalmente disipado, manteniendo la muestra a una temperatura por debajo de los 25°C.

Figura 1. Fotografía del equipo de ultrasonido de alta intensidad.

Procesador ultrasónico


63

2.4 Evaluación visual de la gelificación. Ensayos de inclinación o tilting test.

Para la evaluación visual del tiempo de gelificación de los sistemas se utilizó un ensayo

de inclinación o tilting (Relkin y col, 1998). En un baño seco a temperatura constante (70°C),

se calentaron varios tubos conteniendo 2ml de solución. Los mismos fueron sellados por

medio de esferitas de vidrio para evitar así la evaporación del líquido. A tiempos sucesivos se

retiraban de a un tubo por vez del baño y se observaban los cambios visualmente perceptibles

en la solución como el cloud point (aparición de un punto opaco en la muestra) y el menisco

al inclinar levemente el tubo. El tiempo de gelificación (punto gel) se determinó como el

tiempo necesario para que el menisco de la solución no sufra deformación o no fluya al

inclinarlo. En el siguiente esquema (figura 2) se muestra el procedimiento de obtención del

punto gel.

Las mediciones se informan como el promedio y la desviación estándar de al menos tres

mediciones.

t1 t2 t3 t4 t6

t5 = gelt

Figura 2. Representación gráfica de la determinación del punto gel mediante el ensayo de inclinación o tilting test (Baeza, 2003).

2.5 Determinación de la distribución y tamaño de partícula en solución.

Los ensayos de dispersión dinámica de la luz, se llevaron a cabo en un equipo de

dispersión dinámica de luz (Zetasizer Nano-Zs, Malvern Instruments, Worcestershire,

Inglaterra) (Figura 3) provisto con un laser He- Ne (633 nm) y un correlator digital, modelo

ZEN3600. Las mediciones se realizaron a un ángulo de dispersión fijo de 173°. El Zetasizer


64

Nano-ZS determina tamaño de partículas cuyo diámetro hidrodinámico se encuentra en el

rango de 0,6 nm a 6 m.

Las mediciones para las soluciones de HPMC, lg y sus mezclas y para las mezclas de

HPMC y SDS, se realizaron a 25 °C .Las muestras se colocaron en cubetas descartables de

poliestireno de 1 cm de arista y luego en el equipo.

Para el tratamiento térmico de las soluciones de HPMC, la muestra se colocó en cubetas

de vidrio y se varió la temperatura de 25 a 63 °C. Se realizó una medición de tamaño de

partícula por cada temperatura. Las mediciones de tamaño de partícula se informan como el

promedio y la desviación estándar de al menos tres mediciones.

Como se mencionó previamente en la introducción del presente trabajo, en DLS la

muestra es iluminada con un haz de laser y la intensidad de la luz dispersada producida por

las partículas fluctúa a una velocidad que es dependiente del tamaño de partícula

(movimiento browniano). Con un análisis de esta fluctuación de la intensidad, es posible

obtener el coeficiente de difusión de la partícula (D). El tamaño de la partícula es luego

calculado mediante la ecuación de Stokes-Einstein:

D

kTdh 3

(2)

donde dh es el diámetro hidrodinámico, D el coeficiente de difusión traslacional (m2s-1), k la

constante de Boltzmann (1,38 x10-23 NmK-1), T la temperatura absoluta (K) y la viscosidad

(Nsm-2).

Existen dos aproximaciones que pueden ser utilizadas para obtener el tamaño de partícula:

(i) análisis de CUMULANTES que ajusta una exponencial simple a la función de

correlación para obtener el tamaño de diámetro promedio (diámetro hidrodinámico

promedio o z-average) y una estimación del ancho de la distribución (índice de

polidispersidad) que es considerada como un indicador del grado de agregación

(Sharma y col, 1996).

Los resultados que se obtienen mediante este análisis son aplicables con propósitos

de comparación de un simple valor pero es inadecuado para dar una completa

descripción de los resultados de la distribución en sistemas polidispersos.

(ii) análisis de CONTIN que ajusta una exponencial múltiple a la función de

correlación para obtener los percentiles de distribución de los tamaños de


65

partículas/agregados (Stepanek, 1993). Los mismos se informan en un gráfico de

intensidad de luz relativa dispersada por las partículas en varios rangos de tamaños

(distribución de tamaños por intensidad). La distribución de tamaño original

generada por el equipo de DLS es la distribución de tamaños por intensidad.

Mediante la teoría de Mie (1908) puede convertirse a distribución de tamaños por

volumen o número con el objetivo de analizar la importancia de los diferentes

picos en relación a la cantidad de partículas presentes en la muestra.

Figura 3. Fotografía del equipo de dispersión dinámica de luz Zetasizer Nano-Zs, Malvern Instruments

Para comprender las diferencias entre las tres distribuciones mencionadas anteriormente,

puede considerarse como ejemplo una muestra comprendida por partículas esféricas de dos

tamaños, 5 nm y 50 nm, presentes en igual cantidad.

De la distribución por número de estas dos poblaciones de partículas, se obtienen dos

picos ubicados en 5 nm y 50 nm y en una relación 1:1 (figura 4A). Cuando se analiza la

distribución por volumen (figura 4B), la relación entre estas dos poblaciones es ahora 1:1000,

debido a que el volumen de una esfera es 4/γπ(diámetro/2)3 . Al analizar la distribución por

intensidad (figura 4C), la relación entre las partículas es 1:1000000, ya que la intensidad de la

Compartimiento

para la celda de

medición


66

luz dispersada es proporcional al diámetro6 (de la aproximación de Rayleighs) (Malvern

Instruments, 2001).

Es importante recordar que en DLS, la distribución de tamaños que se obtiene originalmente

es en intensidad y que las distribuciones de volumen y número son obtenidas a partir de ésta,

de aquí la importancia de que la lectura del tamaño de partícula se haga a partir de la

distribución de tamaños en intensidad. La distribución de tamaños en volumen se analiza para

obtener información de la proporción de cada pico en la muestra analizada.

La distribución en número no se evaluará ya que arrastra muchos errores a partir de su

cálculo.

Figura 4. Distribución en (A) número, (B) volumen y (C) intensidad de una muestra bimodal de partículas de 5 y 50 nm presentes en igual cantidad (Malvern Instruments, 2001).

2.6 Determinación de la carga superficial de las partículas en solución.

Los estudios para determinar la carga neta superficial de las partículas en solución, se

realizaron mediante la medición del potencial zeta (ξ) en un equipo Zetasizer Nano-Zs

(Malvern Instruments, Worcestershire, Inglaterra) el mismo que se utiliza para la medición de

tamaño de partículas por DLS (Figura 3). Las soluciones, diluídas con su respectivo buffer al

0,02%, fueron inyectadas en la cubeta para medición de movilidad electroforética (Figura 5).

El potencial zeta se determinó midiendo la dirección y velocidad de las partículas al aplicar

un campo eléctrico. Las mediciones de potencial zeta se informan como el promedio y la

desviación estándar de al menos tres mediciones.

Inte

nsid

ad

(%)

Tamaño (d.nm)

(C)

Volu

me

n (%

)

Tamaño (d.nm)

(B)

Tamaño (d.nm)

Núm

ero

(%

)

(A)


67

Figura 5. Celda para la medición del potencial zeta. En los electrodos ubicados a cada lado, el equipo aplica el campo eléctrico (Malvern Instruments, 2001).

2.6.1 Principio de funcionamiento

El desarrollo de una carga neta en la superficie de una partícula, afecta la distribución de

iones de la región interfacial circundante. Esto resulta en un aumento de la concentración de

iones de carga opuesta a la partícula que están cercanos a la superficie. Así, una doble capa

eléctrica se genera alrededor de cada partícula (figura 6).

La capa de liquido que rodea a la partícula se la puede encontrar de dos formas: una región

interna, conocida como capa de Stern donde los iones están fuertemente ligados, y una región

externa, conocida como capa difusa, donde los iones están ligados con menos fuerza a la

partícula. Existe un límite imaginario que termina en la capa difusiva, donde los iones y la

partícula forman una entidad estable (capa de Stern).

Cuando una partícula se mueve (debido a la gravedad por ejemplo), lo hace con los iones

que conforman la capa Stern y la difusa. Este límite se conoce como plano slipping y su

correspondiente se conoce como potencial zeta (figura 6).

La magnitud del potencial zeta es un indicador de la estabilidad del sistema coloidal en

estudio. Esta técnica es empleada ampliamente para determinar la estabilidad de sistemas

coloidales líquidos, como una emulsión. Si todas las partículas en la suspensión tienen un

potencial zeta negativo o positivo alto, todas las partículas tenderán a repelerse evitando así la

floculación de la emulsión.

electrodo electrodo

capilar


68

Figura 6. Esquema de una partícula cargada y la doble capa que la rodea (Malvern Instruments, 2001).

Si las partículas tienen, en cambio, bajos valores de potencial zeta las fuerzas que

previenen que las partículas se acerquen serán más débiles y la tendencia a flocular será

mayor. Se considera que una suspensión es estable cuando tiene valores de potencial zeta

mayores a 30 mV en valor absoluto (+30mV o -30mV). El factor más importante que afecta

el potencial zeta es el pH, especialmente cuando se estudian proteínas. A pH mayores al

punto isoeléctrico el potencial zeta es mayor a cero, y a pH menores es negativo y cero en el

punto isoeléctrico (figura 7).

Figura 7. Variación del potencial zeta con el pH para una proteína (Malvern Instruments, 2001).

Doble capa eléctrica

Plano Slipping

Partícula con carga

superficial negativa

Capa de Stern

Distancia desde la superficie de la partícula

Capa difusa

Potencial superficial

Potencial Stern

Potencial zeta

Punto

isoeléctrico

P Z O E T T E A N (mV) C I A L


69

Una consecuencia importante de la existencia de cargas eléctricas en la superficie de la

partícula es que exhiben ciertos efectos cuando se aplica un campo eléctrico. El efecto que se

analiza para la determinación del potencial zeta es la electroforesis (movimiento relativo de

una partícula cargada en el líquido en el cual está suspendida bajo la influencia de un campo

eléctrico).

Electroforesis

Cuando un campo eléctrico es aplicado a través de un electrolito, las partículas cargadas en

suspensión en el electrolito son atraídas al electrodo de carga opuesta. Las fuerzas viscosas

que actúan sobre las partículas tienden a oponerse a este movimiento. Cuando se alcanza el

equilibrio entre estas dos fuerzas opuestas, la partícula se mueve con una velocidad constante.

La velocidad de la partícula depende de:

- La fuerza del campo eléctrico aplicado o el gradiente de voltaje.

- La constante dieléctrica del medio

- La viscosidad del medio

- El potencial zeta

La velocidad que la partícula tiene al aplicarse el campo eléctrico se conoce como

movilidad electroforética.

El potencial zeta de una partícula se obtiene por medio de la aplicación de la ecuación de

Henry:

戟帳 =態悌佃捗(賃銚)戴禎 (3)

donde:

z es el potencial zeta (mV).

UE es la movilidad electroforética.

i es la constant dieléctrica.

es la viscosidad.

ƒ(Ka) es la function de Henry, que varía entre 1,0 (aproximación de Huckel) o 1,5

(aproximación de Smoluchowski) dependiendo del tamaño de la partícula y la concentración

de electrolitos del medio.


70

2.7 Calorimetría diferencial de barrido (DSC).

Para el estudio de las transiciones térmicas de las soluciones de HPMC antes e

inmediatamente después del tratamiento con ultrasonido de alta intensidad, se utilizó un

calorímetro diferencial de barrido Mettler TA 4000 (Schwerzenbach, Suiza). La

concentración de HPMC fue de 3% para E4M y 7% para E5LV.

Se emplearon cápsulas de aluminio de 160 l para la medición. Como referencia se utilizó

una cápsula vacía. Se trabajó a una velocidad de calentamiento de 10°C/min y el rango de

temperatura barrido fue de 0°C a 130 °C. El análisis de los termogramas y parámetros

térmicos se realizó mediante el software TA72. Se realizó una calibración previa a la

medición utilizando indio y zinc puro según Roos y Karel (1991).

Se informa el promedio y la desviación estándar de al menos dos mediciones.

Parámetros calorimétricos

Se evaluaron las temperaturas de inicio y de pico de desnaturalización así como el cambio

de entalpía aparente (△HT) involucrado.

La temperatura de inicio (Tonset) se obtuvo por intersección de la línea de base con la

pendiente inicial de la curva al iniciarse la transición térmica (Relkin, 1994). La temperatura

de pico (Tp) de la endoterma, que indica la temperatura aparente de desnaturalización, fue

determinada en el punto de máximo flujo calórico para las condiciones de corrida.

El cambio de entalpía correspondiente al proceso de desnaturalización térmica (△HT) se

obtuvo integrando el área de la endoterma entre los valores de inicio (Tonset) y de finalización

(Tf), utilizando una línea de base polinomial ajustada entre los valores de inicio y fin (figura

8).

Figura 8. Parámetros calorimétricos evaluados.

Tonset

Tp

Tf

響HT


71

2.8 Resonancia magnética nuclear (NMR).

Se utilizó un equipo Bruker PC 120 Minispec de resonancia magnética nuclear por pulsos

(NMR), con un campo magnético 0.47 T operando a una resonancia y frecuencia de 20 MHz

(Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten,Germany) y a 20°C. La muestra de HPMC (E4M al 3%

o E5LV al 7%) se colocó previamente en tubos de vidrio de 10 mm de diámetro.

El tiempo de relajación spin-spin (T2) se midió utilizando la secuencia de pulsos Carr–

Purcel–Meiboon–Gill con un espaciamiento entre pulsos de 7 segundos. Las señales de

decaimiento fueron ajustadas con una exponencial simple.

Se informa el promedio y la desviación estándar de al menos tres mediciones.

Los equipos basados en la resonancia magnética nuclear (NMR) utilizan las interacciones

entre ondas de radio y el núcleo de los átomos de hidrógeno para obtener información sobre

las propiedades del material en estudio, como una partícula en suspensión o las gotas de una

emulsión (McClements, 1999).

Básicamente, la muestra se coloca en un gradiente de campo magnético estático y una

serie de pulsos de radiofrecuencias son aplicados. Estos pulsos pueden causar que algunos de

los núcleos de hidrogeno de la muestra se exciten a niveles de energía más altos, lo que lleva

a la generación de señales de NMR detectables. La amplitud de la señal depende del

movimiento del núcleo. La frecuencia, amplitud y tiempo de decaimiento de la señal

dependen de la relación sólido/ líquido en la muestra.

2.9 Reología dinámica.

La determinación de la dinámica de gelificación de las HPMCs se realizó en un reómetro

oscilatorio dinámico Phaar Physica MCR 300 con control de esfuerzo de corte. La geometría

de medición utilizada fue de platos paralelos de 29,95 mm (PP30/S) (Figura 9), con un

espacio o gap entre ellos de 1 mm. Se colocaron aproximadamente 0,7 ml de muestra entre

los platos, lo que permitió llenar completamente el espacio entre ellos. La temperatura del

plato inferior se controló mediante un sistema Peltier y un baño termostatizado (Viscotherm

VT2, Phaar Physica). Luego se cubrieron las superficies de los platos y el área expuesta de

muestra con silicona líquida para evitar la evaporación de agua de la misma.


72

El calentamiento se efectuó a una velocidad de 10ºC/min, desde la temperatura inicial de

25°C hasta la temperatura deseada de 90ºC. Se mantuvo así durante 15 min. y luego se hizo

descender la temperatura con la misma rampa de velocidad hasta 10ºC.

Las condiciones de medición se evaluaron previamente en la zona de viscoelasticidad lineal,

resultando una deformación de 0,01% y una frecuencia de 1 Hz.

Se analizó el punto de gelificación como el punto de cruce entre G´ y G´´ o ascenso brusco de

G´ y descenso de la tan cuando el punto de cruce no quedara claro.

Las determinaciones se realizaron por duplicado siendo las diferencias menores al 10 %. Se

informa el promedio y la desviación estándar.

En un experimento de reología dinámica oscilatoria, la relación entre la deformación y

esfuerzo está descripta por el módulo complejo:

G* =G´+ iG´´ (4)

donde G´es el módulo de almacenamiento (o elástico), G´ ́ es el módulo de pérdida (o

viscoso).

G ́da una idea de la energía almacenada, G´ ́es la energía disipada por la muestra en forma

de flujo. La tangente de pérdida (tan ) indica el carácter viscoelástico del material y es la relación

entre la componente viscosa y la elástica (tan G´´/G )́.

La reometría dinámica es una técnica que involucra pequeñas deformaciones por lo cual es

de mucha utilidad para el estudio de la transición sol-gel y para la caracterización del

comportamiento viscoelástico de geles (Matsumura y col.,1996).

La transición de una estructura viscosa (sol) a una viscoelástica (gel) durante el calentamiento

es determinada por el punto de cruce entre el módulo viscoso (G’’ ) y el elástico (G’). En este

cruce el ángulo de desfasaje es de 45º y la tan δ es igual a 1. Luego de este punto de cruce o

“punto gel” G’ asciende bruscamente y se observa el consecuente descenso de la tan δ.


73

Figura 9. Sistemas de platos paralelos en posición para colocar la muestra.

2.10 Emulsiones

2.10.1 Preparación de las emulsiones

Las emulsiones aceite en agua (O/W) en relación 10/90 respectivamente, se prepararon

utilizando dos equipos emulsionantes distintos:

1) por homogeneización de 4,5 ml de las soluciones acuosas de HPMC o sus mezclas

con -lg con 0,5 ml de aceite de girasol comercial, utilizando un homogeneizador Ultraturrax

T-8 (IKA-Labortechnik, Staufen, Alemania). La velocidad del rotor (S8N-5G, Staufen,

Alemania) se ajustó en 25.000 r.p.m., el tiempo de homogeneización fue de 3,5 minutos y la

temperatura se mantuvo constante a 25º C 2ºC mediante un baño de agua con hielo durante

el tiempo de proceso. Las condiciones de homogeneización se eligieron con el objeto de

minimizar la inclusión de aire en el seno de la emulsión, la cual es una característica del

método de homogeneización empleado.

2) por homogeneización de 4,5 ml de las dispersiones acuosas de HPMC o sus mezclas

con -lg con 0,5 ml de aceite de girasol comercial, utilizando un procesador ultrasónico Vibra

Cell Sonics, modelo VCX 750 a una frecuencia de 20 kHz y una amplitud de 20%, durante

20 minutos continuos (Figura 1). Se siguió el mismo procedimiento explicado en el apartado

2.3.


74

2.10.2 Determinación de la distribución y tamaño de partícula

Los diámetros promedio y las curvas de distribución de gotas de las emulsiones se

determinaron por dispersión estática de luz en un equipo Mastersizer 2000 con una unidad de

dispersión Hydro 2000MU provisto con un laser He- Ne (633 nm) (Malvern Instruments,

Worcestershire, Inglaterra) (Figura 10). El rango de medición del equipo se encuentra entre

los 0,1 m a 1000 m. La velocidad de la hélice se mantuvo en 1800 RPM. Se utilizó el

índice de refracción (RI) de la fase dispersa (1,47) y su parámetro de absorción (0,001). El

tamaño de gota se informa como el diámetro promedio de volumen-superficie o diámetro de

Sauter (D32= ni di3/ ni di2) y el diámetro promedio de volumen equivalente o diámetro De

Broucker (D43= ni di4/ ni di3) , donde ni es el número de gotas de diámetro di (Huang y

col., 2001; Leroux, y col, 2003).

D32 brinda una medida del diámetro promedio en donde se encuentran la mayoría de las

gotas. D43 está relacionado con cambios en el tamaño de partícula que involucran procesos de

desestabilización.

Se informa también el área interfacial específica (AIE) y la polidispersidad (P) de las

emulsiones, según se vio previamente en Introducción, apartado 6.2.2.

Los parámetros informados corresponden al promedio y la desviación estándar de al menos

tres mediciones

Figura 10. Fotografía del equipo Mastersizer 2000 con su unidad de dispersión Hydro 2000MU


75

2.10.2 Determinación de la carga superficial de las emulsiones

Se determinó la carga superficial de las emulsiones por la medición del potencial zeta

como se indica en el apartado 2.6, en un equipo Zetasizer Nano-Zs (Malvern Instruments,

Worcestershire, Inglaterra) (figura 3). Las soluciones injectadas en la cubeta para medición

de movilidad electroforética figura 7), fueron previamente diluidas con el mismo buffer con

el cual fueron preparadas, hasta una concentración aproximada de 0.02% p/p.

El potencial zeta informado corresponde al promedio y desviación estándar de tres

mediciones.

2.10.3 Determinación de la estabilidad de las emulsiones.

La estabilidad global de las emulsiones se analizó usando un analizador óptico vertical

(Quick Scan, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, Estados Unidos). Las emulsiones

recientemente preparadas se colocaron en una celda cilíndrica de vidrio (80 mm) para

registrar los perfiles de trasmitancia (T %) y backscattering (BS %) en función de la altura en

la celda. Los perfiles de T % y BS % se registraron durante 20 días, a intervalos de 1 minuto

durante las primeras 2 horas para las emulsiones preparadas con Ultraturrax y a intervalos de

15 minutos para las emulsiones preparadas con ultrasonido de alta intensidad. Luego se

realizó una medida cada 24 horas de almacenamiento a temperatura ambiente.

La cinética de cremado-floculación se evaluó a partir de la variación de los valores

promedio de BS % (BSprom %) en la parte inferior del tubo de medida (10-20 mm). La

constante cinética de cremado-floculación (C) se definió por medio de la expresión:

C (h-1) = 103/ BS0 prom % . t1/2 (5) (Palazolo, 2005,2006)

donde BS0 prom % es el valor promedio inicial de BS (correspondiente al perfil a t = 0

min) y t1/2 es el tiempo (expresado en horas) para el cual BSprom % = BS0 prom %/2.

Además de C, la cual da información sobre la velocidad con la que se desarrollan los

procesos de cremado-floculación en los estadios iniciales.


76

A partir de los valores de D4,3 obtenidos de las mediciones de tamaño de gota con y sin el

agregado de SDS, se calcularon los índices de coalescencia (IC %) y el grado de floculación

(GF%) (Palazolo, 2005,2006):

IC % = [(D4,3 +SDS – D4,3 i +SDS)/D4,3 i +SDS].100

GF %= [(D4,3 - SDS - D4,3 +SDS)/D4,3 +SDS].100

donde D4,3 -SDS y D4,3 + SDS son los diámetros promedio de las emulsiones almacenadas un

tiempo t ( en este trabajo 24 hs), medidos en ausencia y presencia de SDS, respectivamente;

D4,3 i +SDS es el diámetro promedio de la emulsión inicial con SDS.

Aunque estos parámetros podrían calcularse también a partir del diámetro promedio de

Sauter D3,2 , a fin de evaluar adecuadamente el grado de coalescencia y el de floculación es

más conveniente utilizar D4,3 debido a que los cambios producidos en las emulsiones son

detectados con mayor sensibilidad (Relkin y Sourdet, 2005, Palazolo, 2006).

La principal diferencia entre IC % y GF % es que el primero toma como referencia a la

emulsión inicial y los cambios producidos en el tamaño de partícula (por coalescencia y

floculación) respecto a la misma. En cambio, GF % refleja simplemente la variación del

tamaño de partícula cuando la distribución se determina en ausencia y presencia de SDS y

por ende, puede calcularse para las emulsiones iniciales y las sometidas a cualquier

tratamiento. Cuando una emulsión no se desestabiliza por coalescencia o por efecto de un

determinado tratamiento, IC % 0.

Las determinaciones se realizaron al menos por duplicado y se informa el promedio y la

desviación estándar.

2.10.4 Determinación de la microestructura de las emulsiones. Microscopia confocal.

La microestructura de las emulsiones se evaluó colocando alícuotas de 10 L de emulsión

(sin dilución previa) sobre un portaobjetos. El cubreobjetos (22 22 mm) se colocó

cuidadosamente y sin deslizamiento para no inducir la coalescencia de las gotas de aceite.

Las emulsiones se observaron con un microscopio confocal Olympus FV 300, operando con

un aumento de 60 X y zoom de 2,5X.


77

La microscopia confocal permite obtener información valiosa sobre la microestructura de

las emulsiones (McClements, 1999). La microscopia confocal brinda una mayor claridad en

las imágenes que la microscopia convencional. Permite además, la generación de imágenes

tridimensionales. En la microscopia confocal, un haz de laser muy estrecho es direccionado a

un punto particular de la muestra analizada y un detector mide la señal de la intensidad

resultante (figura 11).

La observación de la microestructura de sistemas multicomponentes es frecuentemente

facilitada empleando fluorescencia natural. La microscopía confocal se ha empleado para

estudiar el tamaño, concentración y organización de las gotas en una emulsión (Jokela y col.,

1990; McClements, 1999).

Figura 11. En la microscopia confocal, un haz de laser es escaneado a través de un plano particular x-y de la muestra. Combinando distintos planos x-y, es posible obtener una imagen tridimensional

(McClements, 1999).

2.10.5 Determinación la viscosidad de las emulsiones.

La viscosidad de las emulsiones se determinó según el apartado 2.2. Las emulsiones a

analizar se colocaron el sistema de medición sin previa dilución.

Se informa el promedio y la desviación estándar de al menos dos mediciones.


78

2.11 Propiedades interfaciales

2.11.1 Determinación de la tensión interfacial/superficial.

Por definición, la tensión superficial se refiere a la interfase gas-líquido, mientras que la

tensión interfacial a la interfase fluido-fluido. Ambas propiedades son determinadas usando

instrumentos denominados tensiómetros superficiales o interfaciales, respectivamente. Estos

tensiómetros son empleados para obtener información sobre las características de las

superficies o de las interfases y las propiedades de los surfactantes, tales como su

concentración en exceso, su presión superficial, la concentración micelar crítica y cinética de

adsorción (Hiemenz, 1986; Hunter, 1986; Evans y col., 1994; Carrera Sánchez, 2000).

Existen diferentes tipos de tensiómetros (Couper, 1993) que difieren de acuerdo al

principio físico en el que se basan, el diseño mecánico, si las mediciones son dinámicas o

estáticas y si son capaces de medir la tensión superficial, la interfacial o ambas. Las medidas

estáticas se realizan en superficies o interfases que se encuentran en equilibrio, mientras que

las dinámicas se llevan a cabo en sistemas que no están en equilibrio.

Los métodos empleados en este trabajo fueron:

Método basado en la medida de una fuerza: Tensiómetro tipo Wilhelmy

Método dinámico basado en una medida geométrica: Tensiómetro de gota

En los apartados siguientes se presentan los métodos empleados en este trabajo para medir

tensiones superficiales en condiciones de equilibrio y dinámicas, con el fin de determinar las

características estructurales y la estabilidad de las monocapas de HPMC, -lg y sus mezclas a

pH3 y pH6.

2.11.1.1Tensiómetro tipo Wilhelmy (determinación de isotermas vs concentración)

Este tensiómetro permite medir la dependencia de la tensión superficial o interfacial (o

presión superficial o interfacial, ) con la concentración de surfactante en la subfase. Este

método consiste en medir la fuerza adicional sobre una placa vertical inmersa parcialmente

en un líquido.

El tensiómetro empleado para realizar las medidas de tensión superficial en el equilibrio

fue un tensiómetro digital Sigma 701 (KSV, Finlandia) y consta de dos partes (Figura 12), la


79

unidad de medida y una interfase que permite la adquisición de datos. La interfase incluye la

fuente de alimentación y un indicador digital. La unidad de medida posee la placa de

Wilhelmy que se suspende de un brazo de balanza. Esta placa es de platino, de superficies

rugosas y es el sensor de la tensión superficial. Además se encuentra también, una camisa de

circulación de agua termostatizada en cuyo interior se deposita el vaso conteniendo la

solución a medir. La calibración del equipo es automática. Las puertas anchas de la abertura

en frente permiten el fácil acceso al compartimiento que mide, y proporciona la protección

contra disturbios ambientales.

Figura 12. Fotografía del Tensiómetro de Wilhelmy.

Principio de funcionamiento

Esta técnica posee una gran importancia debido a su universalidad, precisión y

simplicidad. Se fundamenta en que las moléculas de la interfase están sujetas a un esfuerzo

(tensión). Cuando un cuerpo sólido se pone en contacto con la interfase, la tensión interfacial

actúa a lo largo de la línea de mojado. En este tensiómetro, el cuerpo sólido es una lámina de

platino rectangular suspendida verticalmente y de geometría conocida. El borde inferior de la

lámina se pone en contacto con el líquido y de ese modo se moja. La fuerza F con que es

empujada la lámina mojada hacia el líquido puede medirse, como lo muestra la Figura 13.


80

Figura 13. Placa del tensiómetro tipo Wilhelmy en posición de medida.

Si Lb es la longitud mojada, entonces la tensión superficial (け) es:

cos

bL

F (8)

donde es el ángulo de contacto; es decir, el ángulo entre la superficie de la lámina y la

tangente a la línea de mojado. Para medir tensiones interfaciales, la placa debe mojarse

completamente por el líquido que se encuentra en un vaso o cápsula de medición.

Descripción del equipo

El equipo consta de un vaso circular, con un área de termostatización de 63,6 cm2, donde

se introduce la cápsula conteniendo la solución acuosa que se desea medir. La figura 14

ofrece una representación esquemática del tensiómetro empleado. La humedad en el interior

del receptáculo del tensiómetro se mantiene constante mediante colocación de un recipiente

con agua dentro de este.

La longitud mojada de la placa de platino está determinada por 2l + 2b, donde l, es el largo

de la placa y b, su espesor. En este caso las dimensiones del plato son: l=19,9 mm y b=0,1

Fuerza, mN/m Placa de platino rugoso

Longitud mojada

Placa

Angulo de contacto0º

Líquido

Fuerza, mN/m Placa de platino rugoso

Longitud mojada

Placa

Angulo de contacto0º

Líquido


81

mm por lo que Lb=40 mm. La temperatura del sistema se mantiene constante 20 °C 0,5ºC,

mediante circulación de agua por una camisa que rodea el recipiente de medida desde un

termostato.

Figura 14. Esquema del Tensiómetro de Wilhelmy con sus partes constituyentes.

Procedimiento experimental

Este equipo se utilizó para realizar medidas de la presión de equilibrio de todas las

soluciones de HPMC. Dicha presión (eq) se determina a partir de la medida de la tensión

superficial, siendo:

eoeq (9)

donde けo es la tensión superficial o interfacial de la fase acuosa en ausencia de tensioactivo y

けe es el valor de equilibrio correspondiente a la tensión superficial o interfacial cuando en la

interfase acuosa hay un exceso de tensioactivo.

Para obtener los valores de equilibrio, se ha procedido de la siguiente forma:

Una vez preparadas las soluciones (el rango de 10-7 a 2 % p/p de concentración), se

conservaron a 4ºC durante 24 hs con el fin de alcanzar el estado de equilibrio, momento en

cual la tensión interfacial fue medida.

Visualización digital de la medida

Ajuste del cero

Placa de Wilhelmy

Camisa de circulación de agua de termostatización

Salida analógica de datos

ON / OFF

Cápsula contenedora de la muestra

Ajuste fino del cero


82

Se introducen aproximadamente 25 ml de solución de las muestras en el vaso de medida.

En primer lugar se ajustó el cero con la placa suspendida muy cerca del líquido. Luego se

subió la plataforma con el vaso que contiene el líquido hasta que entre en contacto con la

placa, momento en que comienza la medida. De esta manera se mide la tensión superficial de

la subfase a la temperatura deseada que en estas experiencias se mantuvo constante a 20ºC.

Se asume que la tensión superficial alcanza el equilibrio, cuando la medida no varía más de

0,1 mN/m en 30 minutos. Cuando se llega al equilibrio en la interfase aire-liquido, se agrega

en la superficie la fase aceite cuidando que se cubra toda la placa de medida. Se mide la

tensión en la interfase aceite- agua hasta que la tensión interfacial alcanza el equilibrio,

cuando la medida no varía más de 0,1 mN/m en 30 minutos (Murray y col, 1998; Murray,

1997; Williams y Prins, 1996).

La representación de la presión superficial de equilibrio en función de la concentración de

surfactante es lo que se denomina isoterma de adsorción ( vs C).

Como norma general, en todas las experiencias realizadas con el tensiómetro de

Wilhelmy, antes de realizar cualquier medida de tensión superficial, la placa de platino se

calienta a la llama de un mechero Bunsen, con el fin de eliminar cualquier impureza que

pueda contaminar la superficie. Los vasos que contenían las soluciones se limpiaron

cuidadosamente, usando primero una mezcla compuesta por ácido sulfúrico y peróxido-

disulfato de amonio, enjuagadas con agua destilada varias veces y secadas por último a la

llama del mechero.

Se informa el promedio de al menos dos mediciones.

2.11.1.2 Tensiómetro de Gota

Las mediciones de tensión superficial dinámica de las películas de HPMC y sus mezclas con

lg adsorbida a la interfase aceite- agua, se realizaron en un tensiómetro automático de gota

(Tracker, IT Concept, Longessaigne, Francia) como se muestra en la Figura 15.


83

Figura 15. Fotografía del tensiómetro de gota.

Principio de funcionamiento

Los métodos de gota montada o sésil pueden ser empleados para determinar tensiones

superficiales o interfaciales de líquidos. La forma de una gota de líquido depende de un

balance entre fuerzas gravitacionales y superficiales. Las fuerzas superficiales favorecen la

forma esférica de la gota ya que ésta minimiza el área de contacto entre el líquido y su

alrededor. Las fuerzas gravitacionales tienden a ocasionar una elongación (si la gota es

pendiente) o un aplastamiento (si se encuentra sobre una superficie). La forma de equilibrio

adoptada por la gota está determinada por su volumen, densidad y su tensión superficial o

interfacial (Mc Clements, 1999). Dependiendo de la densidad relativa de los dos fluidos entre

los que se encuentra la interfase a estudiar, la gota puede estar montada (gota de aceite en

agua) o colgante (gota de agua en aire). En este trabajo se utilizó la segunda modalidad.

El instrumento permite crear deformaciones periódicas del área de la interfase a una

frecuencia fija durante ciertos períodos de tiempo, y calcula de forma automática la evolución

de las propiedades viscoelásticas de la interfase con respecto al tiempo. Para este trabajo, el

protocolo seguido consiste en que la oscilación sinusoidal del volumen de la gota comienza a

los quince minutos de adsorción del tensioactivo. Transcurrido este tiempo, se somete a la

gota a medidas repetidas con cinco ciclos de oscilación seguidos por otros cincuenta ciclos


84

sin oscilación, hasta el tiempo requerido para la adsorción del tensioactivo. Este tipo de

experiencias suele tener una duración de tres horas.

Descripción del equipo

En la unidad de medida del Tracker (Figura 16) se pueden distinguir dos zonas principales:

i) Dispositivo de formación de la gota: en éste se forma y se controla la gota que se

encuentra dentro de la cubeta. Consta de dos partes: la primera de ellas formada por la jeringa

que termina en un capilar (aguja) y su sistema de impulsión; la segunda está formada por una

cubeta de vidrio y una cubierta donde se introduce ésta, que permite el control de su

temperatura.

La tensión interfacial o superficial entre dos fluidos se determina mediante el análisis del

perfil de una gota, formada de manera que el primer fluido se introduce en la jeringa, cuya

punta queda dentro de la cubeta, que contiene al segundo fluido.

Estas dos partes quedan situadas en un dispositivo que permite realizar movimientos

verticales y laterales de forma separada.

ii) Sistema óptico: incluye una fuente de luz, lentes y una cámara CCD. La gota se

ilumina mediante una fuente de luz uniforme, de forma que su perfil queda registrado con la

ayuda de la cámara CCD y la computadora.

Figura 16. Esquema de los componentes y sistema operativo del tensiómetro de gota.

Estas dos zonas principales tienen a su vez diferentes partes que se pueden configurar de

diferentes maneras permitiendo distintas condiciones para realizar las experiencias.


85

Jeringa y aguja: las jeringas empleadas en el Tracker son del tipo Exmire, pero se pueden

emplear otras, usando adaptadores en el caso que fuera necesario.

La jeringa se coloca en una cubierta, cuya temperatura se puede controlar gracias a un baño

de circulación de agua. El rango de temperatura suele oscilar normalmente entre 10 y 60 ºC.

Las puntas empleadas pueden ser rectas o curvadas hacia arriba, suelen estar recubiertas de

teflón de manera que cuando se forme la gota, ésta no se quede adherida al extremo de la

aguja.

Cubeta: la cubeta es de vidrio y tiene forma de paralelepípedo, y sus medidas son 10 mm x 20

mm x 40 mm.

La cubeta se introduce en una cámara cuya temperatura también se controla con un baño de

circulación de agua. El rango de temperatura oscila normalmente entre 10 y 60 ºC.

Sistema óptico: constituido por: eje óptico, fuente de luz que proporciona una iluminación

uniforme a la cubeta mediante una lámpara halógena y lentes y cámara CCD.

Cámara de protección de la unidad de medida: esta cámara tiene sus paredes completamente

oscuras y tiene la misión de proteger a la unidad de medida de las perturbaciones procedentes

del exterior.

Procedimiento experimental

Todos los experimentos en el tensiómetro de gota fueron realizados a una temperatura de

20ºC, la cual se mantuvo constante con una variación de 0,1 ºC por circulación de agua desde

un baño termostatizado.

Las concentraciones utilizadas de las soluciones de HPMC y -lg fueron 10-2 %,1% y 2%

p/p. Además se estudiaron mezclas de proteína y polisacáridos con concentraciones de

0,5%/0,5%; 0,5%/1% y 1%/0,5 % p/p respectivamente.

Antes de la medición se procede a la limpieza de la jeringa para eliminar toda impureza

que pueda existir en el interior de la misma. Una vez limpia, se succiona un volumen de

solución correspondiente a la capacidad total de la jeringa. Se incorpora la aguja y se coloca

la jeringa en un soporte especialmente diseñado para mantenerla en posición. Se observa en


86

la pantalla la punta de la aguja (figura 16), la cual debe quedar perfectamente centrada en la

parte superior del monitor.

Una vez formada la gota, comienza inmediatamente la adquisición de datos de tensión

superficial en función del tiempo. Su perfil es digitalizado y analizado a través de una cámara

CCD acoplada a un digitalizador de perfil de imágenes conectado a un procesador. Para

mantener el control visual de la gota, la imagen de la misma es captada en forma permanente

en un monitor de video. La señal de video se transmite a un procesador–digitalizador, que

graba y procesa los datos geométricos de la imagen.

A partir de los 60 segundos comienzan las oscilaciones sinusoidales para la obtención de

los parámetros reológicos. Estos son: el módulo dilatacional superficial (E), con sus

componentes elástica (Ed) y viscosa (Ev) y el ángulo de desfase (δ), medida de la

viscoelasticidad relativa de la película. Estos datos se registraron a lo largo del tiempo, 12000

s y con una amplitud (ΔA/A) y frecuencia angular (ω). Se determinó la variación del área (%),

de manera que estuviera en la región lineal. De este modo, en todas las experiencias se

mantuvo constante la amplitud y la frecuencia a 10 % y 100 mHz, respectivamente.

La computadora permite la adquisición, el análisis de imagen y la realización de los cálculos

necesarios.

Concluida la medición, se retiró la jeringa, se descartó la solución y se procedió con el

protocolo de limpieza que consta de repetidos lavados de la jeringa con etanol y finalmente

con hexano.

Se informa el promedio de al menos dos mediciones.

Determinación de la tensión superficial a partir del perfil de la gota.

Con un procesador de imágenes se puede obtener, a partir de la imagen de la gota, su perfil

completo y así poder calcular el valor de la tensión superficial en un período de tiempo muy

corto, y puede hacerse con una gran precisión mediante la optimización de dicho perfil

mediante un sistema de ecuaciones.

El perfil de la gota se procesó de acuerdo con la ecuación de Laplace para obtener la tensión

superficial:

(10) zC

bsenx

dx

d

x 2

) (1


87

donde x y z son las coordenadas cartesianas en una posición dada del perfil de la gota, b es el

radio de curvatura de la gota, es el ángulo del perfil de la gota y C es una constante de

capilaridad (C = g / donde け es la tensión interfacial, es la diferencia entre las

densidades de las dos fases y g es la aceleración de la gravedad). El software empleado

calcula tres parámetros característicos de la gota, que son área, A, volumen, V y la tensión

interfacial け. La exactitud promedio de la tensión interfacial con el equipo utilizado en este

trabajo es de 0,1 mN/m. Sin embargo la reproducibilidad de los resultados se encuentra en un

rango que oscila entre 0,5 y 1,5 %, la reproducibilidad mínima corresponde a las altas

temperaturas (Rodríguez Patino y col., 1999).

Determinación de la velocidad de adsorción.

La cinética de adsorción de la sustancia tensioactiva (por ejemplo, proteína, polisacáridos o

lípidos) sobre la interfase aire–agua se analiza a partir de los cambios de presión superficial

(π) con el tiempo.

Las principales etapas de la cinética de adsorción de un tensioactivo fueron definidas en la

Introducción (figura 8) y son las siguientes (Graham y Philips, 1979; MacRitchie, 1978;

MacRitchie, 1990): (i) difusión del tensioactivo desde el seno de la fase acuosa hacia la

interfase aire–aceite; (ii) adsorción (penetración) y desplegamiento interfacial; y (iii)

agregación (reordenamiento) en la interfase, formación de multicapas e incluso gelificación

interfacial.

i) Etapa de difusión hacia la interfase:

Durante la primera etapa, a presiones interfaciales relativamente bajas o bajas

concentraciones de tensioactivo en la interfase (menores a 10 mN/m), que es cuando la

difusión es la etapa controlante del proceso, puede emplearse una forma modificada de la

ecuación de Ward y Tordai (1946) para correlacionar la variación de la presión interfacial con

el tiempo:

)11()14,3/(2 2/10 tDKTC dif

donde Co es la concentración en la fase acuosa; K es la constante de Boltzmann; T es la

temperatura absoluta; Ddif es el coeficiente de difusión; y t es el tiempo de adsorción. Si la


88

tkit

0180

180ln

0 5 10 150

5

10

15

20

(mN

/m)

tiempo1/2 (s0,5)

(A)

difusión es la etapa que controla el proceso de adsorción, la representación de π frente a t1/2

será lineal (de Feijter y Benjamins, 1987; MacRitchie, 1990; Pérez y col, 2008; Xu y

Damodaran, 1994) y la pendiente que se obtiene a partir de esta se corresponderá con la

constante cinética de difusión (Kdif) (figura 17).

Cuando π es mayor a 10 mN/m se puede estimar la constante de difusión como la pendiente

del primer punto de medición y el origen de coordenadas.

ii y iii) Etapas de penetración y reordenamiento interfacial:

A la hora de analizar la penetración en la interfase y el reordenamiento de las moléculas

adsorbidas en la interfase, se emplea la siguiente ecuación semiempírica de primer orden

(Graham y Philips, 1979) :

(12)

donde, π180, π0, y πt son los valores de presión superficial a los 180 min de adsorción, en el

momento inicial t = 0, y en cada momento t, respectivamente, y ki es una constante cinética

de primer orden.


89

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

ln

(( 1

80- t)/

( 180

))

tiempo (s)

(B)

Figura 17. Etapas de adsorción de un biopolímero en la interfase aceite-agua: (A) difusión de las

moléculas hacia la interfase y (B) penetración y reordenamiento de las moléculas adsorbidas.

En la práctica, una representación de dicha ecuación en función del tiempo normalmente

proporciona una o más regiones lineales (figura 17). La pendiente inicial corresponde a la

constante cinética de primer orden del proceso de adsorción/penetración (Kads), mientras que

la segunda pendiente corresponde a la constante cinética de primer orden del proceso de

reordenamiento (Kr), que tiene lugar en un número aproximadamente constante de moléculas

previamente adsorbidas (Graham y Philips, 1979; Suttiprasit y col., 1992). A la hora de

aplicar esta ecuación, hay que tener la precaución de seleccionar un intervalo de tiempo que

no se vea afectado por la difusión.

2.11.2 Determinación de la reología de las películas interfaciales.

Las propiedades reológicas describen el comportamiento mecánico de las películas

interfaciales. Estas determinaciones se realizaron también en el tensiómetro automático de

gota (Tracker, IT Concept, Longessaigne, Francia), simultáneo a la adquisición de los datos

de tensión interfacial.


90

El método consiste en someter a la gota a una compresión–expansión sinusoidal controlada

automáticamente con el consecuente incremento y disminución del volumen de la gota a la

frecuencia y amplitud deseadas.

El módulo dilatacional superficial derivado de un cambio sinusoidal en la tensión

interfacial, dけ resultante de un pequeño cambio sinusoidal en el área superficial de la gota, dA

puede ser descripto como (Lucassen & Van Den Tempel, 1972):

Ad

d

AdA

dE

ln/

(13)

= 0. sen (.t + ) (14)

)(0 tsenAA (15)

donde o y Ao son las amplitudes del esfuerzo y deformación, es el ángulo de desfase entre

la deformación y esfuerzo, es la presión interfacial/superficial, けo es la tensión interfacial

en ausencia del tensioactivo y t es el tiempo.

El módulo dilatacional superficial se compone de una parte real y otra imaginaria, 継 = 継鳥 +件継塚 La parte real del módulo, o componente de almacenamiento, es la elasticidad dilatacional

superficial,

Ed = E ∙ cos δ (16)

La parte imaginaria del módulo, o componente de pérdida, es la viscosidad dilatacional

superficial,

Ev = E ∙ sen δ (17)

Mediante la relación entre la componente de pérdida y la de almacenamiento puede

determinarse la tangente del ángulo de pérdida (tg ), que es el desfase de la respuesta de la

tensión (o la presión) superficial respecto a la deformación que se ha realizado. Esta

magnitud proporciona una idea de cuán elástico es el comportamiento de la película, de

forma que si su valor es muy pequeño se considera que la película es prácticamente elástica,

y por ello, la respuesta de la película será inmediata a la perturbación a la que se somete. Si

por el contrario se trata de un valor alto, en la película hay pérdida de energía suministrada,


91

por lo cual no responderá tan rápidamente a la perturbación externa. En estos casos, se asocia

a la película un comportamiento viscoso en cierto grado, que depende del valor del ángulo de

pérdida.

建訣絞 =帳寧帳匂 (18)

En un material puramente elástico el esfuerzo de corte y la deformación se encuentran en

fase, =0°, de forma que la parte imaginaria del módulo es cero y la tg es cero. En el caso

de un material perfectamente viscoso, el desfase será de 90°, siendo por tanto la parte real del

módulo es nula y la tg es uno. Así, el ángulo de desfase aporta información sobre las

propiedades viscoeláticas del material. Las películas más elásticas (a una determinada

frecuencia), darán lugar a menores ángulos de desfase y por lo tanto a una menor cantidad de

energía disipada por ciclo.

Resultados

SECCIÓN I

Comportamiento de

hidroxipropilmetilcelulosa en

solución, interfases y

emulsiones O/W

CAPÍTULO 1

Caracterización del estado de asociación de

hidroxipropilmetilcelulosas en solución por

dispersión dinámica de luz.

Sección I- Capítulo 1. Caracterización de soluciones de HPMC por DLS

92

1.1 Distribución de tamaño de partículas en soluciones de HPMC a pH3 y pH 6.

Las hidroxipropilmetilcelulosas, como muchos otros derivados de polisacáridos, son

difíciles de caracterizar debido a su heterogeneidad, no sólo en su peso molecular sino

también en su composición química (Rinaudo y col., 1993). Las HPMCs son materiales

polidispersos, cada polisacárido contiene un número de cadenas de monosacárido

diferente, dando origen así a una distribución de peso molecular (Pérez y col., 2009;

Viriden y col., 2009). La naturaleza heterogénea de las celulosas lleva a variaciones en

la habilidad y reactividad de los grupos hidroxilo. Para disminuir esta variación entre

las HPMCs comerciales, las muestras deben tener una viscosidad y grado de sustitución

promedio dentro de ciertos límites, los cuales están estipulados en farmacopeas (U.S.P.,

2008). En el área de la química de polímeros, la polidispersidad puede medirse

experimentalmente por dispersión dinámica de la luz.

En este punto es importante tener claro ciertos conceptos que servirán para la

comprensión de este capítulo.

Autoensamblaje (o “self assembly”): es una organización (asociación)

espontánea y reversible de moléculas por medio de interacciones no covalentes, es

decir, puente hidrógeno, hidrofóbicas, van der Waals, electrostáticas. Algunos ejemplos

de este tipo de asociación son la formación de micelas, de cristales de lípidos y de

monocapas.

Asociación: son cambios a nivel molecular caracterizados por uniones débiles

entre sitios específicos de unión, por ejemplo formación de monómeros, dímeros.

Agregación: es el término general que describe diferentes tipos de interacciones

biopolímero–biopolímero promovidas por factores externos como temperatura que

puede involucrar uniones covalentes y puede entonces ser irreversible.

La figura 1.1 muestra la distribución de tamaños por intensidad para soluciones de

E5LV a pH6 y a distintas concentraciones.


93

1 10 100 1000 100000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Inte

nsi

dad

(%

)

tamaño (d.nm)

> concentración

Figura 1.1. Distribución del tamaño de partícula por intensidad para soluciones de E5LV a pH6 y a distintas concentraciones: 0,2% (►), 0,5% (◄), 1% (●), β% (■), γ% (▲), 4% (♦) y 5% (▼).

En todos los casos se observa una distribución por intensidad multimodal, con

diferentes tamaños dependiendo de la concentración.

De acuerdo al peso molecular promedio de E5LV (tabla 1, materiales y métodos), se

puede estimar mediante el software del equipo de medición de DLS para polisacáridos

lineales que el tamaño de partícula debería ser 2 ,5 nm.

Los resultados indican la existencia de asociaciones o clusters (denominación en

inglés) en las soluciones de HPMC, aún cuando las muestras fueran agitadas con el fin

de destruir los posibles agregados antes de la medición. El autoensamblaje de las

HPMCs se debería a las interacciones hidrofóbicas entre los sustituyentes hidrofóbicos

(Kato y col, 1978) resultando en un incremento del tamaño de los clusters dependiente

de la concentración. Se observa que con el incremento de la concentración, los clusters

tienen tamaños mayores (Figura 1.1).

En la bibliografía se ha reportado que los derivados de celulosa y en general los

derivados de polisacáridos modificados hidrofóbicamente, forman asociaciones o

clusters (Doublier y Launay, 1981).


94

1 10 100 1000 100000

4

8

12

16

20

24

28

Vol

um

en (

%)

Tamaño (d.nm)

(A)

1 10 100 1000 100000

4

8

12

16

20

24

28

Vol

um

en (

%)

Tamaño (d.nm)

(B)

Duval-Terrie, Huguet y Muller (2003) encontraron que los derivados de pululanos

establecen asociaciones hidrofóbicas en solución y que este autoensamblaje ocurre a

concentraciones bajas cuando el número de sitios hidrofóbicos aumenta. Los clusters

que se forman son resultado de asociaciones hidrofóbicas inter e intramoleculares.

Sarkar y Walker (1995) informaron que la metilcelulosa se asocia aún a temperatura

ambiente y que este proceso puede influir en su capacidad para hidratarse y

deshidratarse. Funami, Kataoka, Hiroe, Asai, Takahashi y Nishinari (2007) propusieron

que la metilcelulosa tiene una alta tendencia a asociarse en solución acuosa con el

aumento del peso molecular y/o la concentración y sugirieron la existencia de

interacciones intermoleculares en soluciones de metilcelulosas a partir de mediciones de

viscosidad. Resultados similares se encontraron al estudiar hidroxipropilmetilcelulosas a

pH 6,5 en solución (Jumel y col., 1996) y metilhidroxipropilcelulosa (Yuguchi y col.,

1995).

Como en DLS la intensidad dispersada es proporcional al cuadrado del peso

molecular (o R6), la distribución por intensidad tenderá a sobredimensionar la presencia

de las partículas más grandes. La distribución de tamaños por volumen (figura 1.2A)

indica que las partículas más grandes encontradas entre los 300 y los 5000 nm en la

figura 1.1 para E5LV, representan sólo una pequeña población dentro de la muestra.

Cuando se analiza la distribución de tamaños por volumen para las cuatro HPMCs

estudiadas (Figura 1.2), se observa que en todos los casos los picos mayoritarios

aparecen en tamaños menores a los 100 nm. Sólo para las concentraciones mayores a

1%, se evidencia una pequeña población a los 1000 nm.

En las figuras 1.2 B, C y D, se observa una tendencia similar para HPMCs de mayor

peso molecular como E15LV, E50LV y E4M.


95

1 10 100 1000 100000

4

8

12

16

20

24

28

V

olum

en (

%)

Tamaño (d.nm)

(C)

1 10 100 1000 100000

4

8

12

16

20

24

28

Vol

ume

n (%

)

Tamaño (d.nm)

(D)

1 10 100 1000 100000.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

Inte

nsi

da

d (%

)

Tamaño (d.nm)

(A)

1 10 100 10000.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

Vo

lum

en

(%)

Tamaño (d.nm)

(B)

Figura 1.2. Distribución del tamaño de partícula por volumen para soluciones de E5LV (A),

E15LV (B), E50LV (C) y E4M (D) a pH6 y distinta concentración: 0,2% (►), 0,β5% (), 0,5% (◄), 1% (●), 1,5% (*), β% (■), γ% (▲), 4% (♦) y 5% (▼).

En la figura 1.3A se compara la distribución del tamaño de partícula por intensidad

para una misma concentración de diferentes HPMC (2 % p/p) a pH6. Se evidencia la

misma tendencia, todas presentaron distribuciones multimodales, con distintos tamaños

dependiendo del polisacárido. Las poblaciones de mayor tamaño representan sólo una

pequeña proporción en la muestra, evidenciado por el análisis de la distribución por

volumen (Figura 1.3B).

Figura 1.3. Distribución del tamaño de partícula por intensidad (A) y volumen (B) para

soluciones de HPMCs al 2 % y pH6: (■) E5LV, (▲) E15LV, (▼) E50LV y () E4M.


96

1 10 1000

5

10

15

20

25

7,53 nm

Vol

ume

n (%

)

Tamaño (d.nm)

(A)

2,33 nm

1 10 1000

5

10

15

20

25

8,72 nm4,18 nm

Vol

ume

n (%

)

Tamaño (d.nm)

(B)

1 10 1000

5

10

15

20

25

7,53 nm

5,61 nm

Vo

lum

en

(%

)

Tamaño (d.nm)

(C)

1 10 1000

5

10

15

20

2511,70 nm

10,10 nm

Vo

lum

en (

%)

Tamaño (d.nm)

(D)

La figura 1.4 muestra el efecto del pH (3 o 6) en la distribución por volumen para las

diferentes HPMCs estudiadas a la concentración de 2%.

A pH3 las distribuciones fueron bimodales con un pico predominante a los menores

tamaños, alrededor de 2, 4 y 13 nm para E5LV, E15LV y E50LV respectivamente. Sólo

las soluciones de E4M a pH3 presentaron una distribución monomodal, con el máximo

del pico a los 10 nm.

Figura 1.4. Distribución del tamaño de partícula por volumen para soluciones de HPMCs al 2% a pH3 (símbolos llenos) y a pH6 (símbolos vacíos). E5LV (A), E15LV (B), E50LV (C) y E4M (D).


97

Con el software del equipo Zetasizer Nano ZS se puede realizar una estimación del

peso molecular de las HPMCs, ingresando para tal fin el diámetro hidrodinámico

obtenido. Los valores obtenidos de la curva de distribución corresponden a 2,1; 7,4;

13,6 y 39 kDa para E5LV, E15LV, E50LV y E4M respectivamente.

Sin embargo, los picos obtenidos fueron anchos, siendo esto indicativo de la

existencia de una distribución de pesos moleculares. La estimación del peso molecular

basado en los extremos del pico de distribución indica un rango de pesos moleculares,

0,9 -7,7 kDa para E5LV, 2,7-12 kDa para E15LV, 4,6-80 kDa para E50LV y 10,1 -

246,8 kDa para E4M.

Como puede observarse, los pesos moleculares informados para los monómeros de

HPMCs (Tabla 1, Materiales y Métodos) se encuentran dentro de la distribución de

pesos moleculares obtenida por DLS para cada HPMC.

El pico a mayores tamaños (y de menor % volumen) (Figura 1.4) corresponde a formas

autoensambladas o clusters formados por cada HPMC. La tendencia de las HPMC a

asociarse sería consecuencia de su alto grado de substitución con grupos metilos (Tabla

1, Materiales y Métodos), lo cual permitiría fuertes interacciones hidrofóbicas.

A pH6, todas las distribuciones resultaron monomodales, con un pico ancho lo que

indica la presencia de una amplia distribución de tamaños de partícula. Este pico, con

excepción de E4M, coincide con el pico de menor tamaño observado a pH3 alrededor

de los 10 nm, atribuido a las formas autoensambladas del polisacárido.

Puede verse también la ausencia del pico a tamaños menores que se observó a pH3. El

máximo del pico monomodal para pH6 está alrededor de los 8 nm para E5LV, E15LV y

E50LV indicando la ausencia de la forma monomérica. La estimación de los pesos

moleculares en base a los valores de tamaños del ancho del pico, indicaron un rango de

7,7-189,1 kDa para E5LV, 10,1-322,6 kDa para E15LV y 7,7-342,6 kDa para E50LV.

Esto revela la existencia de clusters y la ausencia de las formas monoméricas a pH6.

El pH casi no afecta la distribución de tamaños de E4M (Figura 1.4D), las

asociaciones están presentes en mayor proporción a pH6 (Figura 1.4 D) dentro de las

curvas de distribución obtenidas. Se presentan formas asociadas de hasta 247 kDa. Este

comportamiento estaría vinculado al menor % de metilos de esta HPMC (tabla 1,

materiales y métodos) y a la menor tendencia a la asociación al aumentar el peso

molecular (Sarkar, 1977).

Con el fin de explicar las diferencias observadas con el pH, se estudió la carga

superficial por medio de la medición del potencial zeta (tabla 1.1).


98

Tabla 1.1 Potencial zeta determinado en soluciones de HPMCs al 2 %p/p

* promedio DS de al menos n = 3

A pH3, las HPMCs presentan una pequeña carga neta superficial negativa, que

causaría un menor autoensamblaje, predominando las formas monoméricas (Figura 1.4).

A pH6, el potencial zeta ligeramente positivo estaría relacionado con la fuerte tendencia

a la formación de clusters observada en la figura 1.4.

Dada la naturaleza no iónica de las HPMCs, la carga negativa a pH3, sería

consecuencia de la presencia de los iones cloruro, provenientes del buffer citrato. Estos

iones podrían interactuar con las moléculas de HPMC, generando una repulsión

electrostática que impediría las interacciones hidrofóbicas.

Sin embargo, la magnitud del potencial zeta (carga negativa) no es suficientemente

alta como para justificar la falta de interacción entre los residuos hidrofóbicos debido a

fuerzas de repulsión electrostáticas. En estos polisacáridos a bajas temperaturas las

moléculas de agua se disponen rodeando los grupos hidrofóbicos constituyendo

estructuras llamadas tipo-jaula (Sarkar, 1995). Puede pensarse que los iones cloruro

estén interaccionando con los grupos hidrofóbicos, reforzando la estructura tipo jaula

del agua alrededor de estos grupos e impidiendo así el autoensamblaje.

Un efecto similar se observa para las proteínas. Phillips, Whitehead y Kinsella

(1994) informaron que los solutos como hidrocloruro de guanidina y urea pueden alterar

la estructura del agua alrededor de los residuos amino no polares. La alteración en la

estructura de las moléculas de agua que rodean los grupos no polares de las proteínas

aumenta la solubilidad porque debilita las interacciones hidrofóbicas y aumenta las

interacciones dipolo-dipolo entre las proteínas y el agua.

Tritt-Goc y Pislewski (2002), al estudiar la hidratación de HPMCs a pH2 y pH6,

encontraron una gran afinidad entre las moléculas de HPMCs y el medio circundante a

HPMC pH3* pH6*

E4M -1.04 0.10 +0.81 0.08 E50LV -1.22 0.15 +0.79 0.10 E15LV -1.23 0.08 +0.41 0.15

E5LV -1.81 0.05 +0.78 0.05


99

E4M E50LV E15LV E5LV0

100

200

300

400

500

(A)

d(H

) p

rom

edio

(n

m)

pH 2. A bajos pH predomina un alto número de uniones hidrógeno entre los protones

del solvente y las moléculas de HPMCs.

Por lo tanto, el aumento de las interacciones entre las HPMCs y el solvente sería un

factor adicional que previene las interacciones hidrofóbicas, responsables de la

formación de agregados.

Sawyer y Reed (2001) también señalaron que un cambio en el pH tiene influencia en

las propiedades de las moléculas de HPMC cuando se adsorben sobre partículas sólidas.

Ellos observaron que las uniones hidrógeno son dependientes del pH del medio. Hay

menor adsorción a la interfase de las partículas sólidas a mayores pHs, indicando mayor

interacción entre las moléculas de HPMCs.

A fin de comparar el efecto del pH, se muestra en la figura 1.5 el análisis de

cumulantes, diámetro promedio (d(H)) y el índice de polidispersidad (IPD) para las

soluciones de HPMCs 2% a ambos pHs. Se observa que el diámetro promedio es mayor

en todos los casos a pH6 y mayor para E4M, es decir, las asociaciones son dependientes

del peso molecular. La polidispersidad, asociada con el grado de asociación, es mayor

también a pH6 y creciente con el peso molecular del polisacárido.

A pH3, E4M presenta la menor carga superficial, evidente en el mayor diámetro

promedio e índice de polidispersidad (Figura 1.5) como también en la distribución por

volumen (Figura 1.4).


100

Figura 1.5. Diámetro promedio (A) e índice de polidispersidad (B) para soluciones de HPMCs 2% p/p a pH3 (…) y pH6 (░).

El efecto del pH puede verse reflejado también en el coeficiente de difusión (D) (tabla

1.2) calculado por DLS y que proviene del movimiento browniano de las partículas

como se vio en la introducción, aparatado 4.1. Este coeficiente relaciona la movilidad de

las moléculas de HPMC en el seno de la solución y está directamente relacionado con el

peso molecular.

Puede observarse que el D disminuye con el incremento del peso molecular, es mayor

para E5LV y menor para E4M, polisacáridos con el menor y mayor peso molecular

respectivamente. El diámetro promedio también resultó mayor para E4M (Figura 1.5A).

Las soluciones a pH6, presentaron un D menor que las soluciones de HPMCs a pH3.

Esto está directamente relacionado con las formas asociadas a pH6 mientras que a pH3

prevalece la forma monomérica.

E4M E50LV E15LV E5LV0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

(B)IP

D


101

Tabla 1.2. Coeficientes de difusión, D (m2/s), para soluciones de HPMC 2% a pH3 y pH6

* promedio DS de al menos n = 3.

1.2 Efecto de la temperatura en la distribución de tamaño de partícula en las

soluciones de HPMC a pH6.

Existen en la literatura diferentes interpretaciones acerca del mecanismo de

gelificación de soluciones acuosas de metilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa. La

mayoría de los trabajos coinciden en que la gelificación de estas moléculas

involucra dos etapas. La etapa I, llamada régimen pre-gel, incluye interacciones

hidrofóbicas con la consecuente formación de asociaciones o clusters. Kato y col.

(1978) han propuesto que la etapa I está determinada principalmente por la

asociación de los dominios más hidrofóbicos de la cadena de celulosa, que son los

residuos de glucosa trisustituidos con grupos metilo. Esto lleva a la formación de

asociaciones hidrofóbicas de tamaño creciente (Figura 1.6).

La etapa II, o régimen gel, corresponde a la gelificación propiamente dicha que

ocurre a altas temperaturas y está comúnmente asociada con la separación de fases

(Yuguchi y col, 1995; Kobayashi, 1999). Según Kato y col (1978) la segunda etapa

involucra la asociación hidrofóbica de dominios menos hidrofóbicos (glucosas di y

mono sustituidas). Las formas autoensambladas o clusters, crecen y forman

cristalitos que causan la separación de fases (Yuguchi y col, 1995). La presencia de

cristalitos formados por trimetilglucosas ha sido confirmada por la técnica de

difracción de rayos X (Kato y col, 1978) y por microcalorimetría (Yuguchi y col,

1995). En este último caso se han observado dos picos exotérmicos en el

termograma correspondiente al enfriamiento de geles de HPMC. El pico presente

alrededor de 60ºC corresponde a la disolución de las dos fases separadas y el de

50ºC a la fusión de las micelas cristalinas.

pH6* pH3*

E4M 0,96 0,13 1,04 0,10 E50LV

1,90 0,10 2,72 0,17

E15LV

8,02 0,20 10,90 0,15 E5LV 14,1 0,15 17,10 0,17


102

La temperatura que divide a ambas etapas ha sido establecida alrededor de 50ºC

por Kobayashi y col (1999). Esta interpretación del proceso de gelificación fue

fundamentada por trabajos que incluyen el estudio teórico del proceso (Tanaka y

col, 1996).

25ºC >55ºC >74ºC TºC

Grupos hidrofóbicos

Cadenas de celulosa

Agua

Figura 1.6. Asociación de las cadenas de HPMC durante la gelificación por calor

(Perez, 2005).

En la literatura se encuentran diversos trabajos donde se caracteriza la agregación y/o

gelificación de los derivados de celulosa por medio de calorimetría y reometría

dinámica (Desbrieres y col., 1998; Duval- Terrie, J. y Muller, 2003; Funami y col, 2007;

Hussain y col, 2002; Sekiguchi y col., 2003; Silva y col, 2008). Muy pocos autores se

centran en la caracterización de las soluciones de HPMC durante el calentamiento por

DLS, a pesar de ser este método muy sensible a la aparición de formas asociadas o

agregados. Es un método ampliamente utilizado para la caracterización de la agregación

de otros biopolímeros, como la lg (Bauer y col., 1998; Schokker y col., 2000). Funami

y col. (2007) utilizaron la técnica de dispersión estática de la luz para estudiar

soluciones acuosas de metilcelulosas.

Con el fin de caracterizar el comportamiento de las HPMCs frente al calentamiento,

se seleccionaron las celulosas de mayor y menor peso molecular, que también difieren

en el porcentaje de grupos metilo (Tabla 1, materiales y métodos).


103

1 10 100 1000 100000

5

10

15

20

25

30

35

40

Vol

umen

(%

)

Tamaño (d.nm)

> Temperatura(A)

1 10 100 1000 100000

5

10

15

20

25

30

35

40

Vo

lum

en

(%

)

tamaño (d.nm)

> Temperatura

(B)

En la figura 1.7, se muestra la variación en la distribución de tamaños por volumen

para soluciones de E5LV y E4M al 2 % p/p a pH6 al aumentar la temperatura desde 25

a 63 °C.

Figura 1.7. Distribución del tamaño de partícula por volumen para soluciones de HPMCs al

2% a pH6, E4M (A) y E5LV (B) . (■) β5°C, (●) γ0°C, (▲) γ5°C, (▼) 40°C, (◄) 45°C, (►)50°C, ()55°C, ()60°C y ()63°C.


104

Puede verse en la figura 1.7 que para ambas HPMCs hay un gran aumento de

tamaño a partir de los 50 °C, temperatura relacionada con el inicio de la etapa II, donde

las formas asociadas o clusters previamente formados, crecen y forman un gel.

Similares resultados fueron obtenidos por Silva y col. (2008) al estudiar la asociación y

gelificación de las HPMCs. Entre los 25 y los 55°C los resultados de fluorescencia

indicaron que hay poca interacción pero ocurre una desorganización en los dominios

hidrofóbicos de la molécula. Luego de los 55°C, hay un marcado aumento en las

interacciones hidrofóbicas, indicando una mayor asociación del polímero.

Todas las HPMCs estudiadas tienen un grado de sustitución (DS) mayor a 1,5 (Tabla

1, materiales y métodos), necesario para que las asociaciones hidrofóbicas tengan lugar

(Funami y col., 2007; Hirrien y col., 1996).

Por encima de los 50°C aparecen formas autoensambladas de tamaño mayor a 300

nm, aproximadamente 30 veces más grandes que los obtenidos a temperaturas menores.

Funami y col. (2007) estudiaron la asociación de soluciones acuosas de metilcelulosa y

encontraron que a partir de los 60°C, el tamaño de partícula de los polisacáridos

aumenta marcadamente.

E4M tiene menor % de grupos metilos pero es la HPMC con mayor peso molecular, lo

cual se traduce en una mayor grado promedio de polimerización, en realidad es cuatro

veces mayor que la correspondientes a las otras HPMC (dato suministrado por Dow

Chemical Co.). Es por ello, que los picos a cada temperatura en la curva de distribución

se presentan con un porcentaje en volumen más alto para las soluciones de E4M (Figura

1.7A) que para las soluciones de E5LV (Figura 1.7B). En la sección 1.1.1 del presente

capítulo, se evidenció que con el aumento del peso molecular, el tamaño de los clusters

es mayor.

Funami y col. (2007), Nishinari, Hofmann, Moritaka, Kohyama y Nishinari (1997) y

Vigouret, Rinaudo y Desbrieres (1996), informaron que la gelificación de la

metilcelulosa depende no solamente del peso molecular, sino también del patrón de

sustitución.

Según Kobayashi, Huang y Lodge (1999) durante la primera etapa del proceso de

gelificación se observa la transición de soluciones transparentes a turbias que acontece a

una temperatura que se denomina cloud point, el cual ocurrió alrededor de 38ºC para

las HPMCs de mayor peso molecular y a los 45 °C y 50°C para E15LV y E5LV

respectivamente, como se verá en el capítulo 2 de esta sección. El cloud point es

indicativo del comienzo de las asociaciones mediadas por interacciones hidrofóbicas. A


105

20 25 30 35 40 45 50 55 60 650

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Temperatura (°C)

d(H

) pr

ome

dio

(nm

)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

D (m

2/s)

cloud point

(A)

bajas temperaturas el polímero en solución presenta moléculas de agua que se disponen

rodeando los grupos hidrofóbicos constituyendo estructuras llamadas tipo-jaula

provocando el aumento en la solubilidad del polímero (Figura 1.6). Con el

calentamiento, las estructuras tipo-jaula sufrirían distorsiones, eliminación del agua de

hidratación y finalmente desorganización exponiendo las regiones hidrofóbicas e

induciendo la formación de agregados (Sarkar y col., 1995). Kobayashi y col. (1999)

informaron que entre los 55 °C y los 65 °C hay un aumento importante en el valor de G´

(módulo de almacenamiento) que ellos atribuyen a la formación de un gel fuerte, donde

no hay flujo. Comprobaron también por DLS que el aumento en el valor de G´ va

acompañado por una mayor formación de formas asociadas. Perez, Wargon y Pilosof

(2006) encontraron, al estudiar la asociación de soluciones de HPMCs, que hay dos

etapas bien diferenciadas en el proceso de gelificación y que el punto gel detectado por

tilting test difiere del detectado por reometría dinámica, más sensible a la formación de

una estructura primaria de gel.


106

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Temperatura (°C)

d(H

) pr

omed

io (

.nm

)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

D (m

2/s)

(B)

cloud point

Figura 1. 8. Diámetro promedio (d(H)) y coeficiente de difusión (D) en función de la temperatura para HPMCs 2% a pH6. (A) E4M y (B) E5LV. Desviación estándar < 1%.

El análisis del diámetro promedio (d(H)), Figura 1.8), muestra un brusco ascenso en su

valor después de los 50°C para ambos polisacáridos. A partir de este valor, empiezan a

crecer los clusters formados en la etapa pre-gel (etapa I), las interacciones hidrofóbicas

aumentan y finalmente se llega a la formación de una estructura de red tridimensional.

Funami y col. (2007) también concuerdan con que la asociación por temperatura de las

metilcelulosas, lleva a la formación de una estructura tipo red.

En la figura 1.8 se muestra también el coeficiente de difusión en solución,

directamente relacionado con la movilidad y tamaño de las partículas. Este disminuye

gradualmente con el aumento de la temperatura, pero el mayor descenso se observa

también a los 50°C, donde el tamaño de las formas agregadas se hace mayor y la

difusión en solución, entonces, se enlentece.

Puede observarse también, que el diámetro promedio obtenido para E4M es mayor

que para E5LV a todas las temperaturas, y que el coeficiente de difusión en solución es

menor para E4M, relacionado con su mayor peso molecular.

En la figura 1.8 se indica también el cloud point determinado experimentalmente. Se

observa que a esta temperatura crítica el tamaño de las formas agregadas en ambas


107

0.1 1 10 100 1000 100000

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Inte

nsi

dad

(%

)

tamaño (d.nm)

(A)

HPMC es similar (alrededor de los 40 nm) y representa el inicio de la visualización de

la turbidez en la solución. Para E4M la temperatura de cloud point es menor.

1.3 Distribución de tamaño de partículas en soluciones de mezclas de HPMC y

agentes disociantes a pH 6 y temperatura ambiente.

En la bibliografía existen muchos trabajos donde se han estudiado las interacciones

entre las HPMC y SDS principalmente (Avranas y Iliou, 2003; Nilsson, 1995; Ridell y

col., 2002; Soviljy y col., 2006), pero muy pocos se han focalizado en el estudio de

estas interacciones por DLS.

Los aspectos más importantes de esta interacción son el grado de redistribución

(adsorción) de las moléculas anfifílicas (SDS), la fuerza iónica, los solventes presentes y

del tipo y tamaño de los clusters formados (Nilsson, 1995).

En este apartado, se estudian las interacciones de E5LV con SDS 2%.

En la Figura 1.9 se muestra la distribución de tamaños de partículas por intensidad

(Figura 1.9A) y por volumen (Figura 1.9B) en presencia de SDS 2%.


108

0.1 1 10 100 10000

5

10

15

20

25

30

Vo

lum

en (

%)

tamaño (d.nm)

sds 2%

E5LV + sds 2%

E5LV

(B)

Figura 1.9. Distribución del tamaño de partícula por intensidad (A) y volumen (B) para soluciones de E5LV + SDS 2% a pH6, (■) 0,25%, (●) 0,50% y (▲) 1%. En Figura B: E5LV: (□) 0,β5%, (0)0,50%, () 1% y SDS 2% solo (*).

De la interacción de E5LV y SDS 2% en solución, puede observarse en la figura

1.9A, una distribución por intensidad multimodal, con tres poblaciones bien definidas.

La primera con un máximo de 2,5 nm, la segunda alrededor de los 20 nm y la última

varía entre los 200 nm y los 2000 nm dependiendo de la concentración de E5LV en la

solución. Puede verse que a mayor concentración, las familias de mayor tamaño

aparecen a mayores tamaños.

Al ser las HPMCs de naturaleza polidispersa (Rinaudo y col., 1993; Viridén y col,

2009), estas poblaciones a mayores tamaños pueden deberse a formas autoensambladas

al igual que cuando las HPMCs están solas en solución (sección 1.1).

Cuando se analiza la distribución por volumen de estas soluciones (Figura 1.9B),

puede verse una distribución monomodal. Los picos pertenecientes a las soluciones de

E5LV +SDS 2% están todas por debajo de los 5 nm, indicando que las formas asociadas

de mayor tamaño sólo presentan una pequeña proporción dentro de la mezcla.

En la figura 1.9B se compara simultáneamente la distribución de las mezclas con las

correspondientes a E5LV sola y a la solución de SDS 2%.


109

Se observa que para todas las concentraciones estudiadas, las distribuciones de tamaño

para las mezclas de E5LV y SDS, tienen un diámetro promedio (3nm) que es mucho

menor que el correspondiente a las soluciones de E5LV solas. Para las soluciones de

E5LV solas el máximo está en los 4nm para 0,25 % y 0,5% y en los 10nm para 1%,

presentando esta última concentración una distribución monomodal.

Es decir, en todos los casos las distribuciones correspondientes a las mezclas de

HPMC+SDS 2% presentan una distribución cuyos diámetros están por debajo de los

correspondientes a las soluciones de HPMC solas en solución pero son mayores al

diámetro de la solución de SDS 2% sola (Figuras 1.9).

Con el agregado de SDS 2%, se ve afectado la asociación de las HPMCs en solución.

Por naturaleza, las HPMCs tienden a asociarse en solución (figura 1.4) pero la

presencia de SDS hace que estas formas asociadas sean de menor tamaño (figura 1.9B ).

Se conoce que el SDS forma micelas en solución y que a partir de una concentración

dada (concentración micelar crítica, CMC), el tamaño de estas micelas no aumenta. Esta

concentración está determinada en 7,5 mM (Nilsson, 1995), mucho menor a la

concentración empleada en los ensayos realizados con SDS 2% ( 20mM).

Nilsson (1995) y Sovilj y col. (2006), al estudiar las interacciones de HPMCs y SDS en

solución acuosa, informaron que a partir de una cierta concentración de SDS, se

detectan cambios en la interacción con las HPMCs. También coinciden en que la

interacción entre HPMC y SDS provoca cambios conformacionales en la molécula del

polímero.

Estos autores sostienen que cuando el SDS es agregado a una solución acuosa de

HPMC, no se detecta ninguna interacción hasta que se supera cierta concentración de

SDS, determinada en 4mM. Luego, el SDS comienza a adsorberse a la cadena de

HPMC en forma de pequeñas micelas. El SDS continúa redistribuyéndose a lo largo de

la cadena de HPMC hasta que el polímero se satura. Si la concentración de SDS

aumenta, se forman luego micelas de mayor tamaño entre las moléculas de SDS. Estas

micelas de mayor tamaño interaccionan con los sitios hidrofóbicos de cada molécula

impidiendo así su interacción.

Las curvas de distribución obtenidas para E5LV en mezclas con SDS 2%, coinciden

con el modelo de interacción descripto ya que reflejan la desaparición de los clusters de

E5LV y de las micelas de SDS y la aparición de partículas con un d(H) correspondiente

a la forma monomérica de E5LV o a complejos con SDS.


110

Al ser tan alta la concentración de SDS empleada, las micelas que se forman

interaccionan con los sitios hidrofóbicos de las HPMCs, impidiendo o enlenteciendo así

la asociación entre las moléculas de HPMC.

1.4 Conclusión.

Las HPMC muestran una fuerte tendencia a autoensamblarse en solución mediantes

uniones hidrofóbicas, especialmente a pH6, donde las formas monoméricas se aprecian

en menor proporción. El tamaño de los clusters formados aumenta con la concentración

de HPMC y con el tamaño molecular de los mismos siendo menores a 100 nm.

Esta tendencia se minimiza a pH3, donde ocurriría una modificación en la estructura del

agua asociada a los grupos hidrofóbicos, previniendo su interacción y la formación de

estructuras autoensambladas. Un aumento de temperatura favorece el autoensamblaje de

las HPMC mientras que la presencia de SDS lo previene.

Capítulo 2

Efecto de ultrasonidos de alta intensidad en el

estado de asociación de

hidroxipropilmetilcelulosas y su impacto en las

propiedades funcionales.

Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones

111

2.1 Usos de ultrasonidos de alta intensidad.

Los ultrasonidos de alta intensidad (USAI) (16– 100 kHz, 10-1000 W cm-2)

presentan un inmenso potencial para una gran variedad de procesos en la industria de

alimentos. El efecto del ultrasonido está relacionado a la cavitación, calor, agitación

dinámica, esfuerzo de corte y turbulencia (Floros y Liang, 1994; Fukas y col, 1994;

Mason y col, 1996). Puede causar cambios físicos y químicos en un medio viscoso

mediante la generación y colapso de cavidades. El incremento de presión y temperatura

en la vecindad de estas cavidades es la base de los efectos químicos y mecánicos

observados.

El rápido colapso de las burbujas (cavidades) produce esfuerzos de corte en el seno

del líquido que las rodea y estos esfuerzos son lo suficientemente fuertes por ejemplo,

para romper enlaces covalentes en materiales poliméricos que están en suspensión en el

líquido (Güzey, 2002).

Los ultrasonidos de alta intensidad han sido aplicados para acelerar los procesos de

transporte de masa en el mezclado, secado y extracción, degasificación de líquidos en

alimentos, para la inducción de reacciones de oxidación / reducción, para la extracción

de enzimas y proteínas, para inactivación microbiológica y enzimática, para la

inducción de la nucleación en cristales y también es uno de los pocos métodos que

permite la obtención de emulsiones submicrónicas (McClements, 1995; Mason y col,

1996; Knorr y col, 2004).

La aplicación de ultrasonidos de alta intensidad para modificar los biopolímeros está

siendo muy estudiado y muchos trabajos se centran en la habilidad del ultrasonido de

depolimerizar a los polisacáridos tales como dextrano, - carragenano, quitosano y

almidón (Lorimer y col, 1995; Chen y col, 1997; Kardos y Luche, 2001; Eschette y

Norwood, 2003; Liu y col, 2006; Iida y col, 2008) con el objetivo de modificar sus

propiedades funcionales. Kardos y Luche (2001) encontraron que la irradiación de

ultrasonido ofrece un importante potencial para la conversión de materiales de biomasa

cruda tales como carbohidratos polimericos a moléculas de mayor utilidad y de menor

peso molecular.

El efecto de los ultrasonidos de alta intensidad sobre la estructura y funcionalidad de

proteínas ha sido menos estudiado. Recientemente se han reportado cambios

estructurales y funcionales en albumina de suero bovino (BSA) (Gurelsen y col, 2007).

Los autores informan un incremento en la actividad superficial y cambios mínimos en la

Sección I- Capítulo 2. Efectos de USAI en la asociación de HPMC y su impacto en las propiedades funcionales

112

estructura global de la BSA. El tamaño de partícula aumentó hasta 3,4 veces después de

un tratamiento de 90 minutos de ultrasonido. El aumento en el tamaño de partícula y el

decrecimiento del número de grupos sulfhídricos libres fue atribuido a la formación de

agregados.

El efecto de los ultrasonidos en la degradación de polisacáridos depende de la

concentración, temperatura, tipo de solvente y tiempo del tratamiento de ultrasonido.

Los polisacáridos son degradados en mayor medida en soluciones diluídas y a

temperaturas bajas (Chen y col, 1997). La degradación aumenta con un mayor tiempo

de ultrasonido. Generalmente, los polisacáridos de mayor peso molecular son

degradados en mayor extensión (Xiaodong y col, 1998; Liu y col, 2006). Esto puede

deberse a que hay más chances de ser atacado por la energía de la cavitación al tener

mayor peso molecular. Las especies de menor peso molecular tienen tiempos de

relajación menores y entonces, pueden resistir el stress de la cavitación en mayor

medida que las especies de mayor peso molecular. Recientemente, Iida y col (2008) han

informado que el poder del ultrasonido puede efectivamente disminuir la viscosidad de

soluciones de almidón después de su gelatinización pero el proceso no induciría grandes

cambios en la estructura química.

A continuación se describen los principales factores que afectan al proceso:

1) Presencia de gases: La eficiencia del ultrasonido reside en la generación y el

colapso de las cavidades. La introducción de cavidades de gas (burbujas) en un sistema

aumenta el número de sitios de nucleación. Esto lleva a una distribución de la energía

más uniforme en todo el sistema. Los gases monoatómicos con capacidad calorífica alta

como argón pueden mejorar los efectos de la cavitación (Güzey, 2002).

2) Temperatura: Mason y col., (1996) investigaron el efecto de la temperatura del

medio en la eficiencia de la reducción del tamaño de partícula utilizando ultrasonidos.

Observaron un decrecimiento en la intensidad de la energía de ultrasonidos de 79 a 23

W cm-2 cuando la temperatura se incrementó de 0 a 90 °C. Esta relación inversa entre la

temperatura y la energía de ultrasonido se atribuye al incremento en la presión de vapor

del solvente resultando en un retardo en el tiempo de colapso de las burbujas de aire.


113

1 10 100 1000 100000

5

10

15

20

25

30

Vol

umen

(%

)

Tamaño (d.nm)

(A)

1 10 100 1000 100000

5

10

15

20

25

30

Vo

lum

en

(%

)

Tamaño (d.nm)

(B)

3) Propiedades del solvente: La presión de vapor, viscosidad y la tensión superficial

del solvente tienen una importante influencia en la intensidad de la energía de

ultrasonidos. El volumen del solvente procesado es otro factor importante que puede

influenciar la energía entregada.

2.2. Distribución de tamaño de partículas en soluciones de HPMC a pH3 y pH6

después del tratamiento de ultrasonido.

Se estudió el impacto del tratamiento de ultrasonidos en el tamaño de partícula de

distintas soluciones de HPMC a pH 3 y pH6. La figura 2.1 A-D muestra la distribución

de tamaños por volumen de soluciones a pH6 2% p/p de E5LV, E15LV y E50LV y de

0,5 % p/p de E4M inmediatamente después del tratamiento del ultrasonido en

comparación a las distribuciones de las muestras sin tratamiento. En todos los casos el

pico de la muestra sin tratamiento decrece o desaparece y aparecen clusters de mayor

tamaño en las muestras sonicadas, la mayoría de los cuales tienen un tamaño cercano a

los 1000 nm.


114

1 10 100 1000 100000

5

10

15

20

25

30

Tamaño (d.nm)

Vol

umen

(%

)

(C)

1 10 100 1000 100000

5

10

15

20

25

30

Vo

lum

en

(%

)

Tamaño (d.nm)

(D)

Figura 2.1. Distribución de tamaño de partículas por volumen para soluciones de HPMC a pH6 sin tratamiento (símbolos llenos) y con tratamiento (símbolos vacíos) para (A) E5LV 2% (B) E15LV

2%, (C) E50LV 2% y (D) E4M 0.5%.

La figura 2.2 muestra el diámetro promedio (Zaverage) de las partículas antes e

inmediatamente después del tratamiento de ultrasonido en función de la concentración

de soluciones de HPMC a pH6.

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

10

100

1000

10000

E4M USAI

E4M sin USAI

(A)

concentración (% p/p)

d(H

) pr

omed

io (

nm)


115

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.010

100

1000

10000

E50LV sin USAI

E15LV sin USAI

E50LV USAI

E15LV USAI

E5LV sin USAI

E5LV USAI(B)

concentración (% p/p)

d(H

) pr

omed

io (

nm)

Figura 2.2. Diámetro promedio (d(H)) en función de la concentración para soluciones a pH6 sin tratamiento (símbolos rellenos) y con tratamiento de ultrasonido (símbolos vacíos) para (A):

(劬, 劭) E4M, (B):(鏡, ) E15LV, (▼,) E50LV y (■, ☐) E5LV. Desviación estándar < 1%.

El tratamiento de ultrasonido aumentó el tamaño promedio de las partículas de

HPMC siendo la magnitud de este incremento máxima a la menor concentración, donde

las soluciones exhiben una menor viscosidad. Cuando la viscosidad aumenta, las fuerzas

de atracción entre las moléculas son mayores generando un mayor umbral para el inicio

de la cavitación (Behrend y Schubert, 2000).

Generalmente se asume que los efectos de corte como el colapso de las burbujas de

la cavitación, son los responsables de los cambios en la estructura de los biopolímeros,

es decir, de la ruptura de los enlaces químicos en una macromolécula. Los estudios de

distribución de tamaño de partícula con dispersión dinámica de luz después de tratar con

ultrasonido a las soluciones de HPMCs (Figura 2.1), no sugirieron la degradación de la

estructura, ya que ningún nuevo pico en diámetros de menor tamaño pudo ser detectado.

Además, las formas asociadas de mayor tamaño fueron predominantes. Puede ser

posible que el ensayo de DLS no haya revelado la presencia de estos pequeños

fragmentos ya que es una técnica muy sensible a la formación de agregados. Sin

embargo, si hubiera ocurrido en algún grado la degradación del polímero, ésta podría no

haberse detectado por la fuerte tendencia de las HPMCs a auto ensamblarse.


116

Una burbuja de cavitación puede tener una vida media tan pequeña como 0,1 s y

genera puntos localizados de alta temperatura de aproximadamente 4000 K. Estos

puntos calientes pueden promover la pérdida gradual del agua de hidratación de las

moléculas de HPMCs favoreciendo así las interacciones hidrofóbicas entre los

sustituyente metilos. Este escenario es comparable con el fenómeno que tiene lugar

durante el primer estadío de la gelificación de soluciones de metil e

hidroxipropilmetilcelulosas, mediado por interacciones hidrofóbicas que lleva a la

asociación del biopolímero (formación de clusters) (Kobayashi y col, 1999).

Cuando se analiza el efecto del ultrasonido a pH3, se observa el mismo efecto que a

pH6. La figura 2.3 A-D muestra la distribución de tamaños por volumen de soluciones a

pH3 2% p/p de E5LV, E15LV y E50LV y de 0,5% de E4M inmediatamente después del

tratamiento del ultrasonido en comparación con las distribuciones de las muestras sin

tratamiento. En todos los casos el pico principal de la muestra sin tratamiento decrece o

desaparece y formas asociadas de mayor tamaño aparecen en las muestras tratadas con

ultrasonidos. Para E50LV, E15LV y E5LV aumenta la proporción del pico de mayor

tamaño en las muestras sonicadas.

No obstante a este pH, el aumento en el tamaño de partícula debido al USAI es mucho

menor que a pH6. Como se analizó en el capítulo 1, a pH3 las HPMCs tienen baja

tendencia a autoensamblarse y ello podría ser una razón de los menores tamaños de

partícula de los clusters luego del ultrasonido.

A ambos pH se observa que las HPMC de menor peso molecular (E5LV y E15LV)

son las que más se agregan por efecto de USAI, si se considera la variación entre el

tamaño inicial de las partículas y el obtenido al finalizar el tratamiento por USAI. Esta

mayor tendencia a la asociación al disminuir el peso molecular ha sido descripta por

Sarkar (1977) quien encontró que las metilcelulosas de pesos moleculares menores

exhibieron un menor cloud point, debido a la tendencia de éstas a asociarse (formación

de clusters).


117

1 10 100 10000

5

10

15

20

25

30

35

40

Vol

umen

(%

)

Tamaño (d.nm)

(A)

1 10 100 10000

5

10

15

20

25

30

35

40

Vo

lum

en (

%)

Tamaño (d.nm)

(B)

1 10 100 10000

5

10

15

20

25

30

35

40

Vol

umen

(%

)

Tamaño (d.nm)

(C)

1 10 100 10000

5

10

15

20

25

30

35

40

Vol

umen

(%

)

Tamaño (d.nm)

(D)

Figura 2.3. Distribución de tamaño de partículas por volumen para soluciones de HPMC a pH3 sin tratamiento (símbolos llenos) y con tratamiento (símbolos vacíos) para (A) E5LV 2% (B) E15LV

2%, (C) E50LV 2% y (D) E4M 0.5%.

2.3 Evolución del tamaño de partícula de las soluciones de HPMC después del

tratamiento de ultrasonido.

Con el fin de estudiar si el tamaño de partícula revertía luego de la aplicación de

USAI, se determinó la evolución del tamaño promedio (d(H)) de las soluciones

sonicadas con el tiempo de almacenamiento a 20°C. Para todas las HPMCs estudiadas a

pH3 y pH6, el diámetro promedio disminuyó con el tiempo de almacenamiento,

2,33 nm 4,18 nm

5,61 nm

7,03 nm

14,23 nm 17,33 nm

15,75 nm

19,03 nm


118

tendiendo hacia el valor del diámetro promedio de las muestras antes del tratamiento,

como se muestra en las tablas 2.1 y 2.2 respectivamente.

Tabla 2.1. Evolución del d(H) (nm) con el tiempo de almacenamiento a 20 ºC para soluciones de HPMC al 2% a pH6.

HPMC Inicial* Después del

ultrasonido*

1 día* 2días* 3 días*

E5LV 65,0 587,0 524,0 285,0 184,0

E15LV 125,1 1038,0 986,0 547,0 204,0

E50LV 353,3 2040,0 576,0 573,0 373,0

E4M 499,6 3090,0 793,0 475,0 458,0

* promedio 0.1 nm (DS) de n= 3.

Tabla 2.2. Evolución del d(H) (nm) con el tiempo de almacenamiento a 20 ºC para soluciones de HPMC al 2% a pH3.

HPMC Inicial* Después del

ultrasonido*

1 día* 2días* 3 días*

E5LV 33,2 285,2 110,1 87,8 57,7

E15LV 45,2 340,0 225,9 178,0 83,5

E50LV 175,5 872,3 239,0 224,1 204,0

E4M 341,4 1081,2 729,0 406,2 354,3

* promedio 0.1 nm (DS) de n= 3.

La naturaleza reversible de las formas asociadas producidas durante el tratamiento de

ultrasonido, indica que no se establece ningún enlace covalente durante la formación de

clusters inducidos por USAI. Un menor decrecimiento en el tamaño de las formas

agregadas se observó para E15LV y E5LV a pH6.


119

2.4 Impacto del tratamiento de ultrasonido en la emulsificación y gelificación de las

HPMCs.

Debido a que la aplicación de USAI modifica el grado de asociación de las HPMC, es

posible que esto se manifieste en un cambio en sus propiedades funcionales. Por ello, se

estudiaron algunas propiedades funcionales al finalizar el tratamiento de ultrasonido.

Se seleccionaron las celulosas de mayor y menor peso molecular (E4M y E5LV

respectivamente) y se trabajó en concentraciones que permitan la obtención de

emulsiones submicrónicas y la gelificación por calor (3% p/p para E4M y 7% p/p para

E5LV). La tabla 2.3 muestra los diámetros de gota promedios de las emulsiones

formadas por ultrasonidos. No se observaron diferencias apreciables entre el tamaño de

gota obtenido en la emulsión preparada con la solución de HPMC tratada previamente

con ultrasonidos y la emulsión obtenida con la solución de HPMC sin tratamiento. Esto

indica que el comportamiento durante la emulsificación no es afectado.

Tabla 2.3. Diámetros de gota de emulsiones preparadas con soluciones de HPMC a pH6 sin y con tratamiento previo de ultrasonido.

E4M (3%p/p) E 5LV (7% p/p)

Sin tratamiento * Con tratamiento* Sin tratamiento * Con tratamiento *

D32(m) 0,67 0,61 0,58 0,50

D43(m) 0,98 0,83 0,78 0,67

* promedio 0.20 m (DS) de n= 5.

Cuando se estudió la gelificación, se obtuvieron resultados distintos.

Durante la primera etapa del calentamiento de las HPMCs, se observa una transición en

la solución de transparente a turbio. Como se analizó en el capítulo 1, la temperatura

que corresponde a esta transición, conocida como cloud point, indica el comienzo de la

formación de clusters mediante interacciones hidrofóbicas, suficientemente grandes

como para producir turbidez visualmente. La tabla 2.4 muestra que el cloud point de las

soluciones de HPMC disminuyó entre 8 y 9°C, señalando que el tratamiento de


120

ultrasonido modificó el comportamiento de las HPMC durante la primera etapa del

proceso de gelificación, relacionado con este cloud point.

Tabla 2.4. Gelificación, transiciones térmicas, viscosidad aparente () y movilidad del agua (T2) para soluciones de HPMC a pH6 antes y después del tratamiento con ultrasonido.

E4M( 3% p/p) E5LV

(7%p/p)

Sin tratamiento Después del

ultrasonido

Sin

tratamiento

Después del

ultrasonido

Cloud point (ºC) 38,0 1,1 30,0 0,9 37,0 1,1 28,0 1,2

Temperatura de gelificación (ºC) 63,0 1,1 61,0 0,9 65,0 1,1 67,0 0,8

Tp (ºC) 62,4 1,1 64,0 0,9 63,1 0,8 63,5 1,0

T onset (ºC) 53,0 0,5 53,0 0,8 55,0 0,6 56,5 0,8

H( J/g) 0,4 0,1 0,5 0,2 0,7 0,2 0,8 0,2

(cp) 9708ª 6 6446ª 5 43b 2 43 b 2

T2 (ms) 32 4 23 2 18,8 0,8 18,0 0,8

a esfuerzo de corte: 1,2 s-1

b esfuerzo de corte: 24 s-1

El fenómeno de cavitación que se produce durante el tratamiento de ultrasonido,

induce el autoensamblaje de las HPMC (Figuras 2.1 y 2.3) formando clusters que

facilitan la aparición de formas asociadas de mayor tamaño durante la etapa pre-gel.

Sarkar y Walker (1995) estudiaron la asociación de metilcelulosa almacenada a

temperatura ambiente, la cual mostró un menor cloud point que aquellas soluciones sin

almacenamiento previo, debido a las asociaciones existentes aún a temperatura

ambiente.

La temperatura de gelificación (Tabla 2.4) determinada por el ensayo de inclinación,

no mostró cambios significativos debido al tratamiento con ultrasonidos. El punto gel

que se detecta por el ensayo de inclinación corresponde a la temperatura donde la


121

estructura de gel es desarrollada completamente, es decir la estructura formada no fluye

cuando se inclina el tubo. Esta temperatura es levemente mayor que la temperatura de

gelificación obtenida por mediciones reológicas dinámicas, donde se detecta la

formación de una estructura de gel primaria (Perez y col, 2006).

Las transiciones endotérmicas (determinadas por DSC) alrededor de los 50°C, se

atribuyen a la ruptura de la estructura del agua que rodea a las cadenas de HPMC

(Sarkar y Walker, 1995; Yuguchi y col, 1995). De acuerdo a Yuguchi y col (1995), la

ruptura de esta estructura del agua es termodinámicamente más dominante que la

formación de la estructura gelificada. El punto de gel determinado por el incremento del

módulo elástico G’ se encuentra entre las temperaturas de inicio (Tonset) y de pico (Tp)

determinado por las mediciones de DSC (Perez y col, 2006). Algunos autores han

atribuido el pico endotérmico en la curva obtenida en el DSC principalmente a la

formación de un gel turbio a través de interacciones hidrofóbicas (Desbrieres y col,

1998). En la tabla 2.4 se muestran las entalpías y las temperaturas de inicio (Tonset) y de

pico (Tp) en las muestras de HPMC sin tratamiento y sonicadas.

Las temperaturas de transición (Tonset y Tp) no se modificaron por el tratamiento de

ultrasonido, lo cual está de acuerdo con los resultados obtenidos por el ensayo de

inclinación en la determinación de la temperatura de gelificación. Entonces, se puede

concluir que la segunda etapa del proceso de gelificación no se ve afectada por la

formación de clusters en las muestras sonicadas. El calor de transición se incrementó

levemente en las soluciones sonicadas, lo cual indica que se requiere una energía mayor

para formar una estructura de gel.

Resultados similares en todas las propiedades anteriores, se obtuvieron para las otras

HPMCs, otras concentraciones y también a pH3. A modo de ejemplo en la tabla 2.5 y

2.6, se muestran la temperatura de gelificación obtenida por el ensayo de inclinación

para soluciones de HPMCs a 2% p/p pH6 y pH3 respectivamente.

Tabla 2.5. Gelificación para soluciones de HPMC 2% p/p a pH6 antes y después del tratamiento con ultrasonido.

Cloud point (°C) Tgelificacion (°C)

Sin tratamiento Con tratamiento Sin tratamiento Con tratamiento

E4M 38 ,0 ± 1,1 32,0 ± 1,1 65 ,0± 0,8 65 ,0± 0,8 E50LV 38,0 ± 1,1 35,0 ± 0,8 65,0 ± 0,9 65,0 ± 0,9 E15LV 45,0 ± 0,9 41,0 ± 0,8 sin formacion gel * sin formacion gel * E5LV 50,0 ± 1,0 43,1 ± 0,9 sin formacion gel* sin formacion gel *

* hasta los 70°C, sin formación gel


122

20 40 60 80 100 120 140 1600

1

2

3

4

5

6

7

(Pa)

(s)

(A)

Tabla 2.6. Gelificación para soluciones de HPMC 2% p/p a pH3 antes y después del tratamiento con ultrasonido.

Cloud point (°C) Tgelificacion (°C)

Sin tratamiento Con tratamiento Sin tratamiento Con tratamiento

E4M 40 ,0 ± 1,1 32,0 ± 1,1 65 ,0± 0,8 65 ,0± 0,8 E50LV 41,0 ± 1,1 38,0 ± 0,8 65,0 ± 0,9 65,0 ± 0,9 E15LV 48,0 ± 0,9 40,0 ± 0,8 sin formacion gel * sin formacion gel * E5LV 63,0 ± 1,0 43,1 ± 0,9 sin formacion gel* sin formacion gel *

* hasta los 70°C, sin formación gel

Las temperaturas correspondientes al cloud point de las muestras sin ultrasonido son

mayores a pH3 lo cual refleja la baja tendencia al autoensamblaje que muestran las

HPMCs a este pH, en comparación con pH6. Sin embargo, luego del tratamiento las

temperaturas de la primera etapa de la gelificación son muy similares. Como se mostró,

el ultrasonido a pH3 promueve la asociación entre las moléculas de HPMC (figuras 2.1

y 2.3), pero en menor grado que a pH6.

2.5 Impacto del tratamiento de ultrasonido en la viscosidad y movilidad del

agua de soluciones de HPMC.

Se evaluó el comportamiento de flujo de las soluciones de HPMCs a pH3 y pH6

antes y después del tratamiento con ultrasonido.

Como ejemplo se muestran en la figura 2.4 las curvas de flujo obtenidas para E4M y

E5LV, las HPMCs de mayor y menor peso molecular respectivamente, a ambos pH

estudiados.


123

0 20 40 60 80 100 120 140 1600

20

40

60

80

100

120

140

160

180

(P

a)

(s-1)

(B)

Figura 2.4. Esfuerzo de corte () en función de la velocidad de deformación () para

soluciones al 2%. (A) E5LV pH3 (鏡, 響) y pH6 (斤, 欣); (B) E4M pH3 (●,○) y pH6

(峡,強). Símbolos llenos: muestras sin tratamiento. Símbolos vacíos: muestras tratadas con

USAI.

En la tabla 2.7 y 2.8 se observan los valores obtenidos para el índice de consistencia

(K) y el índice de flujo (n).

Tabla 2.7. Parámetros de flujo de las soluciones a pH3 de HPMC al 2% obtenidos a partir del modelo de Ostwald. K, índice de consistencia; n, índice de flujo. R2 > 0,97.

HPMC sin tratamiento con tratamiento

K n K n

E5LV 0,038 ± 0,002 0,995 ± 0,009 0,038 ± 0,002 0,991 ± 0,010 E15LV 0,107 ± 0,006 0,979 ± 0,012 0,080 ± 0,002 0,977 ± 0,005 E50LV 0,427 ± 0,017 0,960 ± 0,008 0,132 ± 0,006 0,985 ± 0,013

E4M 25,370 ± 0,285 0,982 ± 0,007 0,439 ± 0,034 0,977 ± 0,003


124

Tabla 2.8. Parámetros de flujo de las soluciones a pH6 de HPMC al 2% obtenidos a partir del modelo de Ostwald. K, índice de consistencia; n, índice de flujo. R2 > 0,97.

Para ambos pHs, tanto en las muestras sin tratamiento como las tratadas con USAI,

el valor de K, indicativo de la naturaleza viscosa de la solución, fue en aumento según el

peso molecular de las HPMC (Tabla 1, materiales y métodos), siendo significativamente

mayor para E4M.

El índice de consistencia a pH3 es menor para todas las HPMC que a pH6,

mostrando una menor interacción entre las moléculas del polisacárido. El

comportamiento viscoso revela las diferencias en el grado de asociación de las HPMCs

en función del pH. De hecho en el capítulo 1, se mostró que el diámetro promedio a

pH3 es significativamente menor que a pH6 (Figura 1.5).

Puede observarse un mayor impacto del tratamiento con ultrasonido en las

propiedades de flujo de las soluciones de HPMC de mayor peso molecular (E50LV y

E4M) para ambos pH. Esta diferencia es significativamente más notable para E4M, el

polisacárido de mayor peso molecular (Tabla 1, materiales y métodos). En estos casos el

índice de consistencia de las soluciones, mostró una gran disminución luego del

tratamiento de USAI.

Con respecto al índice de flujo, todas las muestras presentaron un comportamiento

Newtoniano antes y después del tratamiento con USAI.

La disminución del índice de consistencia podría deberse a una modificación en la

estructura molecular de las HPMCs o a una modificación de la interacción con el agua.

La primera opción no se desprende de los estudios por DLS, como se mostró

anteriormente. Con respecto a la interacción de las HPMCs con el agua, a temperatura

ambiente, la HPMC estaría hidratada con las moléculas de agua rodeando los grupos

hidrofóbicos, conformando una estructura conocida como tipo jaula (cage-like en

inglés) (Sarkar, 1977; Kobayashi y col, 1999) (figura 1.6).

Cuando la temperatura se incrementa alrededor de los 40°C, las moléculas pierden

gradualmente el agua de hidratación. Esto resulta en una desorganización de las

HPMC sin tratamiento con tratamiento K n K n

E5LV 0,052 ± 0,003 0,977 ± 0,011 0,049 ± 0,005 0,980 ± 0,019 E15LV 0,127 ± 0,003 0,995 ± 0,005 0,085 ± 0,002 0,991 ± 0,005 E50LV 0,665 ± 0,085 0,982 ± 0,027 0,168 ± 0,010 0,975 ± 0,013 E4M 32,910 ± 0,322 0,992 ± 0,007 0,689 ± 0,097 0,997 ± 0,003


125

estructuras tipo jaula, lo cual implica una disminución en la viscosidad de las soluciones

(Sarkar, 1977) y un decrecimiento del módulo elástico (G’) (Pérez y col, 2006). Durate

la aplicación de USAI se produciría una deshidratación parcial de las moléculas de

HPMc debido a los puntos calientes generados durante la cavitación (apartado 2.2)

produciendo una disminución de la viscosidad de las soluciones de HPMC.

Para comprobar si la interacción entre el agua y la HPMC se afectó durante el

tratamiento de ultrasonido, se determinó el tiempo de relajación (T2) por medio de

RMN como un indicador de la movilidad molecular del agua asociada a E4M y E5LV

(tabla 2.4). Los valores más altos de T2, se corresponden con una mayor movilidad del

agua. Un decrecimiento en el tiempo de relajación para las soluciones de E4M durante

el tratamiento de ultrasonido puede asociarse con un decrecimiento en la movilidad de

los protones, mientras que esta movilidad no se vio afectada cuando se trató a las

soluciones de E5LV con ultrasonido.

La falta de cambios en la viscosidad y la movilidad del agua en las soluciones de

E5LV con el tratamiento puede indicar una mínima modificación de su estructura y /o

interacción con las moléculas de agua. Las especies de menor peso molecular presentan

tiempos de relajación menores y, entonces, pueden resistir el stress causado por el

ultrasonido en mayor medida.

Contrariamente, la molécula de E4M, debido a su alto peso molecular, presenta más

posibilidades de ser modificada por el ultrasonido. El decrecimiento anómalo de la

movilidad del agua reflejaría otras modificaciones en la estructura causadas por el

ultrasonido, posiblemente la desintegración de los empaquetamientos en las regiones no

sustituidas o con pocos sustituyentes de la celulosa que incrementaría la unión de las

moléculas de agua con estas regiones hidrofílicas. Haque y Morris (1993) sugirieron

que las cadenas de metilcelulosa están presentes en solución como formas asociadas

estabilizados por interacciones hidrofóbicas entre los grupos metilos en zonas de la

cadena de celulosa donde el número de estos sustituyentes es alto o bien por

empaquetamiento de regiones no sustituídas o poco solubles de la celulosa. Cuando se

eleva la temperatura durante el régimen de pre gel, estos empaquetamiento o clusters se

expanden y los grupos metilos antes ocultos se exponen al medio circundante. Las

moléculas de agua rodean estos grupos y forma la estructura conocida como jaula de

agua (water-cage en inglés) alrededor de estos grupos funcionales.

.


126

2.6. Conclusión.

La aplicación de USAI a soluciones de HPMC induce la formación de clusters de

carácter reversible por interacciones hidrofóbicas. La formación de estos clusters se

refleja en una disminución del punto de turbidez (cloud point) de las HPMC,

independientemente del peso molecular o del pH.

Los cambios en la viscosidad e interacción con el agua por aplicación de USAI, se

observan sólo en las HPMC de mayor peso molecular.

Las propiedades de emulsificación de las HPMC estudiadas no se modifica por

efecto de la aplicación de USAI.

Capítulo 3

Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosas

en la interfase aceite-agua y comparación con la

interfase aire-agua.


127

3.1 Comportamiento comparativo de HPMCs en interfases A/W y O/W.

La estructura y composición del film que rodea a las gotas de aceite en una emulsión y las

burbujas de aire en una espuma, son fundamentales para la estabilidad y comportamiento de

los sistemas dispersos durante su procesamiento. Sin embargo, debido a la diferente

naturaleza de la fase hidrofóbica (aire o aceite) el comportamiento de un biopolímero (por

ejemplo una proteína o polisacárido), puede diferir en ambas interfases. No existen en la

literatura muchos trabajos comparando el comportamiento en ambas interfases.

Williams y Prins (1996) compararon el comportamiento dilatacional de dos proteínas

lactéas, - lactoglobulina y -caseina, en ambas interfases y establecieron una sorprendente

similitud entre las dos interfases para ambas proteínas. Esto sugiere que la estructura

interfacial de las moléculas de proteína en la interfase O/W y A/W pueden ser similares.

Wüstneck, Moser y Muschiolik (1999), al estudiar la adsorción de la -lactoglobulina en la

interfase A/W y O/W (aceite de girasol o tetradecano), encontraron que la concentración

requerida para la saturación interfacial fue menor en la interfase con aceite de girasol.

La elasticidad dilatacional interfacial y la viscosidad interfacial fueron mayores en la

interfase aire- agua y resultaron menores en la interfase con aceite de girasol. Las similitudes

y diferencias de los sistemas estudiados se atribuyeron al comportamiento de adsorción y a la

solvatación de los segmentos polares y apolares de las moléculas de proteína.

Más recientemente, Rotureau, Leonard, Dellacherie y Durand (2004) estudiaron la

adsorción de un polisacárido, un derivado anfifílico del dextrano, en la interfase A/W y O/W.

Concluyeron que la cinética de adsorción del polímero a la interfase aceite es similar a la

cinética en la interfase aire.

Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W

128

-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1

0

5

10

15

20

25

30

35

40

-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1

0

5

10

15

20

25

30

35

40

-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1

0

5

10

15

20

25

30

35

40

log (concentración,% p/p)

(mN

/m)

(A)

3.1.1 Isotermas de adsorción en la interfase A/W y O/W.

Las isotermas de adsorción de las HPMCs en la interfase A/W y O/W, se determinaron a

pH6.

Las mediciones de presión en el equilibrio, se muestran comparativamente en la figura 3.1

para la interfase A/W (figura 3.1A) y O/W (figura 3.1B) para concentraciones de polisacárido

de 1.10-7 hasta 2% p/p.

Como sucede con las proteínas, un verdadero equilibrio en la adsorción no parece ser posible

con las HPMCs (donde no se detecte cambio alguno en el valor de con el tiempo) (Perez y

col., 2006; Rodríguez Niño y Rodríguez Patino, 1998). Luego, se consideró la presión

superficial después de 24 hs de almacenamiento como valor de pseudo-equilibrio.


129

-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 10

5

10

15

20

25

30

35

40

-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 10

5

10

15

20

25

30

35

40

-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 10

5

10

15

20

25

30

35

40

-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 10

5

10

15

20

25

30

35

40

(mN

/m)

log (concentración, % p/p)

(B)

Figura 3.1. Isotermas de adsorción para E4M (斤), E50LV (▼), E15LV(鏡) y E5LV(■) en la interfase A/W (A) y O/W (B). Temperatura 20°C, pH 6.0 y I= 0.05 mM.

En la interfase A/W, se observó un comportamiento sigmoideo, el cual es similar para

biopolímeros superficialmente activos y surfactantes de bajo peso molecular (Damodaran y

Song, 1988b; Graham y col., 1979; Rodríguez Niño y col., 1998; Suttiprasit y col., 1992). La

presión superficial () aumenta con el aumento de la concentración de HPMC en el seno de la

solución y tiende a un valor de pseudo-equilibrio. Nahringbauer (1995) obtuvo resultados

similares con etilhidroxietilcelulosa (EHEC) en la interfase aire-agua; encontró que los

menores valores de tensión (mayor ), se alcanzan para las soluciones más concentradas.

También indicó que existe un valor crítico de concentración por encima del cual no se

aprecian cambios en el valor de la tensión interfacial.

A las menores concentraciones en el seno de la solución (1.10-6%), E4M mostró actividad

superficial, mientras que fueron necesarios dos órdenes de magnitud mayores en la

concentración para observar el mismo efecto para E50LV, E15LV y E5LV. Para las

concentraciones entre 10-6 y 1.10-4%, E5LV mostró una presión superficial levemente mayor

que E15LV, seguido por E50LV. Para las concentraciones entre 1.10-4% y 1.10-1%, no se

observan diferencias en la presión superficial entre las HPMCs estudiadas. Por encima de

(B)


130

1.10-1%, E4M mostró mayores valores en . De acuerdo a los resultados, el orden en la

actividad interfacial sería: E4M E15LV E5LV E50LV.

Las isotermas -c en la interfase aire-agua, presentan inflexiones a medida que la

concentración en el seno de la solución aumenta lo cual está relacionado con diferentes

patrones estructurales adoptados por los segmentos de los polisacáridos en la interfase.

Li y col. (2008) y Perez y col. (2008) presentaron evidencia del cambio en el patrón

estructural de las monocapas de HPMCs a medida que aumenta la concentración: de una

estructura I ( estructura más expandida con la formación de trenes) a una estructura II, de

conformación más condensada. Para las concentraciones más altas en el seno de la solución,

puede formarse una estructura colapsada con la eventual formación de multicapas. La

hidrofobicidad y flexibilidad molecular de las HPMCs permite que más moléculas se

adsorban y compacten en la interfase, provocando un mayor incremento en la presión

superficial. Como se informó previamente (Pérez y col., 2008), E50LV sólo adopta la

estuctura I para finalmente colapsar y E4M, la estructura I y II con formación de multicapas

en la estructura colapsada. De acuerdo al presente trabajo, E5LV y E15LV presentarían un

comportamiento similar a E50LV.

En la interfase O/W (Figura 3.1B), las isotermas -c no fueron sigmoideas y no se observó

ninguna inflexión en todo el rango de concentraciones estudiado, sugiriendo que no ocurre

ningún cambio estructural. Además, el incremento en la concentración de HPMC en el seno

de la solución tuvo un efecto pequeño. A concentraciones mayores que 1.10-4%, la interfase

aceite- agua parece estar saturada, ya que no hay cambios apreciables en la presión

superficial con el aumento de la concentración en el seno de la solución.

Para el estudio de la actividad interfacial y de las propiedades emulsionantes de las HPMC

se seleccionó como fase aceite el aceite comercial de girasol, ya que éste es el más utilizado a

nivel comercial. Sin embargo, desde el punto de vista de estudios básicos, su utilización

puede no ser tan conveniente debido a la presencia de componentes con actividad interfacial.

Los componentes activos superficialmente en el aceite de girasol pueden ser una mezcla de

monoglicéridos, ácidos grasos libres y fosfolípidos.

De acuerdo a Wüstneck y col. (1999), estos contaminantes pueden ser esenciales para el

comportamiento interfacial del aceite.


131

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

tiempo (s)

(mN

/m)

Para establecer la contribución de los componentes con actividad interfacial presentes en el

aceite comercial, se realizaron mediciones de la dinámica de adsorción con el aceite de girasol

purificado.

En la Figura 3.2 se muestra la presencia de bajos niveles (o de baja actividad superficial) de

compuestos con actividad interfacial en el aceite de girasol, con efectos hasta los 10 mN/m.

Puede verse además que las impurezas del aceite se adsorben rápidamente y alcanzan un valor

de equilibrio a tiempos muy cortos (2000 s). Este comportamiento es característico de los

surfactantes de bajo peso molecular.

Figura 3.2. Presión interfacial en función del tiempo para el sistema aceite de girasol comercial y buffer (sin agregado de HPMC) (□) y E5LV 1% de concentración en la interfase aceite de girasol-

buffer (*) y aceite de girasol purificado-buffer (ɒ). Temperatura 20°C, pH 6.0 y I= 0.05 mM.

En la Figura 3.2 se muestra también que el aceite de girasol purificado por tratamiento con

un agente secuestrante de las sustancias activas superficialmente (Fluorisil, ver materiales y

métodos), presenta un comportamiento similar al no purificado en presencia de HPMC (en

este caso E5LV). A tiempos menores a 2000 s se manifiesta ligeramente el efecto de las

impurezas.

Los resultados de la figura 3.2 indican que los valores de para concentraciones de HPMCs

menores a 1.10-5% en la figura 3.1B, pueden verse afectados por los compuestos


132

superficialmente activos del aceite. A tan bajas concentraciones, este efecto puede estar

magnificado (Williams y col., 1996).

A concentraciones mayores a 10-5%, las moléculas de HPMC desplazarían los bajos niveles de

impurezas presentes, como se observa en los altos valores de presión superficial de equilibrio

alcanzada (Figura 3.1B) por todos las HPMCs (alrededor de 20 mN/m), el cual permanece constante

con el aumento de la concentración de HPMC en el seno de la solución.

Las HPMCs y las impurezas deben competir por la interfase pero las HPMCs dominan la presión

superficial aún a tiempos cortos de adsorción (Figura 3.2) debido a las siguientes consideraciones:

(a) Alta actividad interfacial de las HPMC que lleva a un fuerte comportamiento competitivo que

desplaza a otras moléculas (Pérez y col., 2007; Pérez y col., 2009). Además, todas las HPMCs

estudiadas exhibieron mayores valores de que las impurezas, aún a muy bajas concentraciones. Ha

sido reportado previamente que las HPMCS dominan la presión superficial en mezclas con proteínas

aún cuando ambos componentes pueden saturar la interfase (Martinez y col., 2007; Pérez y col., 2007).

(b) Saturación de la interfase a muy bajas concentraciones en el seno de la solución. En la

interfase A/W o O/W la saturación de la interfase se alcanza por encima de una concentración en el

seno de la solución de 10-4% (Figura 3.1A y 3.1B).

En mezclas de emulsificantes solubles en aceite (monoglicéridos y fosfolípidos) y proteínas, la

actividad superficial está determinada por la proteína, la cual satura la interfase (Rodríguez Patino y

col., 2003). Un comportamiento similar debería esperarse en mezclas de impurezas (monoglicéridos,

fosfolípidos y ácidos grasos libres) y HPMCs, especialmente porque las celulosas son más activas

superficialmente que muchas proteínas (Arboleya y Wilde, 2005; Mezdour y col., 2007; Pérez y col.,

2007). Murray (1997) mostró que las impurezas del aceite, no generaban diferencias substanciales al

estudiar la adsorción de sero albúmina bovina (BSA) en la interfase aceite-agua. Luego, no tomaron

ninguna precaución para remover estas impurezas durante el ensayo.

El comportamiento de las HPMCs en la interfase O/W (Figura 3.1B) fue apreciablemente diferente

al exhibido en la interfase A/W (Figura 3.1A). Estas diferencias pueden deberse a la naturaleza de la

fase hidrofóbica (aceite) formada por triglicéridos y ácidos grasos. La presión superficial alcanzada a

cada concentración de HPMC fue menor en la interfase O/W. Wüstneck y col.(1999) obtuvieron la

misma tendencia en las isotermas de presión superficial al estudiar el comportamiento de -

lactoglobulina en la interfase A/W y O/W. Valores menores de en la interfase O/W han sido


133

reportados por Rotureau y col.(2004) al trabajar con derivados anfifílicos de dextrano y por Ganzevles,

Cohen Stuart, Vliet y de Jongh (2006) en mezclas de -lactoglobulina y pectinas.

La mejor solvatación ofrecida por la fase aceite para los grupos hidrofóbicos, en comparación con el

aire, puede explicar la menor eficiencia de las HPMCs para incrementar la presión superficial en la

interfase O/W. εędrzycka y Zwierzykowski (2000) propusieron que existen más interacciones entre

las moléculas de la cadena carbonada del surfactante en la interfase A/W. Tales interacciones estarían

ausentes, o presentes en un menor número, en la interfase O/W.

El orden para la actividad interfacial en la interfase O/W sería: E15LV E5LV E4M E50LV. La

HPMC E50LV fue la menos eficiente en la disminución de la presión superficial en ambas

interfases. Al contrario de lo que sucede en la interfase A/W, las HPMCs de menor peso

molecular (E5LV y E15LV), promovieron un fuerte decrecimiento en la tensión superficial en

la interfase O/W. La mayor eficiencia de estas dos HPMCs en la fase aceite puede explicarse

por su hidrofobicidad (es decir, substitución en metilos) y menor peso molecular que les

permitiría una mayor flexibilidad para anclarse entre los triglicéridos de la fase aceite

(Hutchinson, 1948).

3.1.2 Dinámica de adsorción en la interfase A/W y O/W.

Para comparar la dinámica de adsorción de las HPMCs en las interfases A/W y O/W,

fueron seleccionados dos tipos de HPMCs. E4M posee características moleculares que la

hacen singular, mayor peso molecular, mayor viscosidad y también, mayor eficiencia de

adsorción y actividad superficial en la interfase A/W. Además, esta HPMC presenta todas las

transiciones estructurales descriptas: estructura I, estructura II y colapso de la monocapa

(Perez y col, 2006).

Por otro lado, E50LV, representa al grupo de HPMCs de baja viscosidad analizado en este

trabajo, carece de transiciones estructurales durante su adsorción en la interfase A/W y

presenta mayor carácter hidrofóbico (Tabla 1, materiales y métodos).

La figura 3.3 muestra la evolución de la presión superficial () con el tiempo para E4M y

E50LV en la interfase A/W y O/W para dos concentraciones en el seno de la solución,

1.10-2% (Figura 3.3A) y 1% (Figura 3.3B). Estas concentraciones en el seno de la solución

fueron lo suficientemente altas para la saturación de la interfases A/W o O/W, como puede

deducirse de las correspondientes isotermas -c (Figura 3.1A y 3.1B respectivamente).


134

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

(mN

/m)

tiempo (s)

(A)

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

(mN

/m)

(mN

/m)

tiempo (s)

(B)

El incremento de la presión superficial está asociado a la adsorción de los polisacáridos a la

interfase (Damodaran y Song, 1988; Graham y col., 1979). El rápido aumento inicial de por

la difusión de moléculas de HPMC a la interfase es seguido por una etapa más lenta,

controlada por la penetración, desplegamiento y reordenamiento de las moléculas adsorbidas.

Figura 3.3. Presión interfacial en función del tiempo para E4M (斤,欣) y E50LV (▼,) en la interfase aire-agua (símbolos llenos) y aceite-agua (símbolos vacíos) para concentraciones en el seno de la solución de 1∙10-2 % (A) y 1%p/p (B). Temperatura 20°C, pH 6.0 y I= 0,05 mM.

La presión interfacial es apreciablemente menor en la interfase O/W. Graham y col (1979)

observaron resultados similares al estudiar la adsorción de -caseina en la interfase A/W y

O/W y Ganzevles, Fokkink, van Vliet, Cohen Stuart y de Jongh (2008) obtuvieron menores

valores en la presión superficial para la interfase O/W al comparar el comportamiento de

mezclas de -lactoglobulina con pectinas de bajo y alto metoxilo en la interfase A/W y O/W.

Esta tendencia se correlaciona perfectamente con la obtenida en las isotermas -c, donde los

valores de en el equilibrio resultaron menores para la interfase O/W (Figura 3.1).

Como se mencionó previamente, la razón para este comportamiento reside en la diferente

naturaleza de la fase hidrofóbica. Murray (1997) al estudiar las características superficiales

de -lactoglobulina y sero albúmina bovina (BSA) en ambas interfases, concluyó que las

diferencias en el comportamiento de estas proteínas se debían a la mejor solvatación ofrecida


135

por el aceite para las cadenas hidrofóbicas de los residuos de amino ácidos hidrofóbicos, lo

cual se traduce en una menor actividad interfacial.

Al analizar la interfase A/W en la figura 3.3, se observan pequeñas diferencias en los valores

de presión superficial para largos tiempos de adsorción con diferentes concentraciones de

HPMC. Es decir, el valor final de para E4M al 1% en la interfase A/W es 29 mN/m,

mientras que fue 26 mN/m para 1.10-2%. La misma tendencia puede deducirse para la

interfase O/W. Sin embargo, los valores de obtenidos en los estudios dinámicos resultaron

ligeramente menores que los obtenidos en las mediciones de equilibrio debido a que en los

estudios dinámicos (hasta 3 hs), el valor de pseudo-equilibrio no se alcanzó.

En la interfase O/W y a 10-2% de concentración en el seno de la solución (Figura 3.3A), no

se observan diferencias apreciables en el valor de de pseudo-equilibrio (16 mN/m) entre

E4M y E50LV a t > 8000s. Cuando t < 8000 s si hay diferencias entre ellas, ya que E4M

promueve un mayor aumento en la presión superficial.

Beverung, Radke y Blanch (1999) postularon que el número de segmentos en contacto con la

interfase juega un papel importante en la presión superficial de una interfase fluida. Como se

reportó anteriormente (Pérez y col., 2006), E4M presenta el mayor número de segmentos que

potencialmente pueden adsorberse, ya que su grado de polimerización promedio es 4 veces

mayor al de E50LV. Esto se traduce en un rápido y continuo incremento de .

E4M y E50LV no mostraron diferencias a 1% de concentración en el seno de la solución

(Figura 3.3B) en la interfase O/W, es decir, en la forma de las curvas y valores de presión

superficial. Los valores de para 1% resultaron levemente mayores que a 1.10-2%, al menos

durante el tiempo de las mediciones dinámicas.

En la interfase A/W, se observaron diferencias en el comportamiento de adsorción durante

todo el tiempo estudiado y para ambas concentraciones. El efecto de incrementar la

concentración fue más importante para la interfase A/W que para la O/W, en coincidencia con

las isotermas obtenidas en cada caso (Figura 3.1).


136

3.1.3 Cinética de adsorción en la interfase A/W y O/W.

El paso más importante en la formación de una espuma o emulsión es la adsorción inicial

del biopolímero en la interfase. A bajas concentraciones superficiales, la presión es baja y las

moléculas se adsorben irreversiblemente por difusión. En el caso de la adsorción controlada

por la difusión, en ausencia de convección, la difusión es gobernada por el gradiente de

concentración (McRitchie, 1978).

Entonces como se vio en materiales y métodos, es posible monitorear la cinética de

adsorción en la interfase aceite-agua midiendo los cambios que se producen en la presión

interfacial () con el tiempo. Como la velocidad de cambio en la presión interfacial depende

principalmente de la velocidad de adsorción del biopolímero en los primeros tiempos, se

utilizó la ecuación de Ward y Tordai para describir estos cambios en función del tiempo.

Se observó que el proceso de difusión para estos polisacáridos (con excepción de las

HPMCs a la concentración de 1.10-2% en la interfase O/W) fue muy rápido (el primer valor de

resulta > 10 mN/m) para ser detectado por la técnica experimental empleada en este trabajo.

Por ello se informa una estimación de las constantes de difusión obtenidas entre el primer

punto y el origen de coordenadas (Tabla 3.1).


137

Tabla 3.1. Comparación de los parámetros cinéticos para la adsorción de HPMCs en la interfase A/W y O/W. T= 20°C, pH6 y I= 5mM.

Perez y col, (2008). * promedio DS de al menos n = 2. Kdiff, Kads constantes de difusión, penetración/ adsorción y reordenamiento respectivamente. (RL): coeficiente de regresión lineal.

HPMC (%p/p) Kdif .104 ( mN·m-1·s-0.5) Kads .104

(s-1)(RL) t fin ads (s)

A/W O/W A/W O/W A/W O/W

E4M (10-2) 28,80± 0,10 7,00 ± 0,10 2,90±0,10 (0,98) 1,62 ±0,11(0,97) 10000 7500

E50LV (10-2) 80,40± 0,05 2,40±0,06 2,20±0,06( 0,77) 1,09±0,09(0,96) 11000 7000

E4M (1) 88,10±0,11 73,10±0,05 2,00±0,05 (0,99) 2,01±0,06(0,99) 9300 8000

E50LV (1) 101,40±0,07 55,50±0,08 2,20±0,05(0,93) 1,25±0,08 (0,97) >10000 7500


138

Independientemente de la HPMC, KdifA/W > Kdif

O/W, demostrando que la naturaleza de la

fase (aire o aceite) influencian el proceso de difusión. A la concentración de 10-2%, la

velocidad de difusión en la interfase O/W podría estar afectada por la presencia de

componentes activos superficialmente en la fase aceite, que competirían a bajas

concentraciones y en tiempos cortos de adsorción (< 2000 s) por la interfase.

Después de la difusión inicial de las HPMCs a la interfase, la velocidad de adsorción

de las HPMCs es controlada por la penetración y reordenamiento de las macromoléculas

en la interfase (Pérez y col., 2008; Rodríguez Niño y Rodríguez Patino, 2002).

Malmsten y Lindman (1990) encontraron que la cantidad de etilhidroxietilcelulosa

(EHEC) adsorbida en la interfase aumenta inmediatamente después del contacto entre

la solución del biopolímero y el aceite. Luego disminuye, indicando la saturación de la

interfase.

Como se vio en materiales y métodos, la grafica de la ecuación empleada para

determinar las constantes de adsorción y reordenamiento (figura 17) permite obtener

dos o más regiones lineales. La primer pendiente se corresponde con la constante de

primer orden de penetración (desplegamiento/ adsorción), Kads, y la segunda pendiente

con la constante de primer orden de reordenamiento , Kr, que ocurre entre un número

prácticamente constante de moléculas adsorbidas (Graham y col., 1979).

Debido a que la concentración en la interfase es muchas veces mayor que la presente

en el seno de la solución, los procesos de desplegamiento y reordenamiento están

magnificados, especialmente para macromoléculas de alto peso molecular (Pérez y col,

2008).

La figura 3.4 muestra el ajuste de los datos experimentales para E4M y E50LV al 1%

en la interfase A/W y O/W. La mayor diferencia observada entre las dos interfases es el

quiebre que se produce en el gráfico lineal a tiempos cortos para la interfase O/W.


139

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000 2000 4000 6000 8000 10000 12000-6

-5

-4

-3

-2

-1

ln (

( 18

0- )/ 18

0)

tiempo (s)

(A)

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000-6

-5

-4

-3

-2

-1

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000-6

-5

-4

-3

-2

-1

ln(

tiempo(s)

(B)

Figura 3.4. Evolución de la presión interfacial con el tiempo de adsorción según la velocidad de adsorción y reordenamiento en la interfase aire-agua (A) y aceite-agua (B) para E4M (●) y E50LV (▲) a la concentración de 1% en el seno de la solución. Temperatura β0°C, pH6 y I= 0,05M.

El proceso de reordenamiento en la interfase A/W para E4M, parece comenzar luego

de los 10000 s, cuando se alcanza una alta presión superficial, pero para E50LV el

proceso de reordenamiento no se apreció durante el tiempo de las mediciones dinámicas

(12000 s).


140

Baeza, Sanchez, Pilosof y Patino (2004) obtuvieron resultados similares al estudiar la

adsorción de alginatos de propilenglicol (PGA) en la interfase A/W, ya que sólo

observaron una constante de primer orden, relacionada con la penetración del

polisacárido en la interfase.

La tabla 3.1 resume los tiempos en los cuales comienza el proceso de reordenamiento

(o termina el proceso de penetración) como también la constante de penetración

(desplegamiento/ adsorción), Kads. El proceso de reordenamiento de las HPMCs que

ocurre a menores presiones superficiales y tiempos de adsorción en la interfase O/W,

estaría relacionado con un impedimento estérico debido a la presencia de las moléculas

de triglicéridos que forman la fase aceite. En forma análoga, las constantes de

adsorción fueron menores en presencia de la fase aceite.

Puede verse también en la tabla 3.1 que KadsA/W > Kads

O/W. Hutchinson (1948) sugirió

que las moléculas de aceite están presentes en la interfase con las moléculas adsorbidas

del surfactante, entonces, existe una competencia a nivel interfacial entre las porciones

no polares de la molécula del surfactante y el aceite. Como consecuencia, la penetración

de la molécula de HPMC estaría impedida estéricamente debido a la presencia de las

moléculas de ácidos grasos en la interfase O/W.

Con respecto a la concentración del seno de la solución, K ads en la interfase O/W

aumenta levemente con el aumento de la concentración (Tabla 3.1). Rodriguez Patino,

Rodriguez Niño y Carrera Sánchez (1999) al estudiar la adsorción de aislados de

proteínas del suero lácteo, encontraron que la adsorción y penetración ocurrieron más

fácilmente a mayores concentraciones. Sin embargo, K ads disminuyó o resultó igual en

la interfase A/W cuando aumentó la concentración de HPMC (Tabla 3.1)

3.1.4 Características viscoelásticas de las películas en la interfase A/W y O/W.

Al igual que en la mediciones -t, en este apartado se analizan las características

reológicas de las películas (films) interfaciales formadas por E4M y E50LV. La figura

3.5 muestra la evolución de los parámetros reológicos interfaciales con el tiempo de

adsorción: elasticidad dilatacional (Ed) y tangente del ángulo de desfase (tg ).


141

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

E

d(m

N/m

)

tiempo (s)

(A)

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

tg

tiempo (s)

(B)

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000123456789

101112131415161718

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000123456789

101112131415161718

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000123456789

101112131415161718

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Ed(

mN

/m)

tiempo(s)

(C)

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

tg

tiempo (s)

(D)

Con respecto a la contribución de los componentes activos superficialmente presentes

en el aceite, no se observaron diferencias apreciables en los parámetros reológicos

superficiales al comparar las películas obtenidas con aceite de girasol purificado o sin

purificar.

Figura 3.5. Elasticidad dilatacional superficial, Ed, y tangente del ángulo de desfase, tg , en función del tiempo de adsorción para películas de E4M (斤,欣) y E50LV (▼,) en la

interfase aire-agua (símbolos llenos) y aceite-agua (símbolos vacíos) a las concentraciones de HPMC en el seno de la solución de 1.10-2% (A y B) y 1% (C y D). Temperatura 20°C, pH6 y I= 0,05 mM.


142

En la interfase O/W ambas HPMCs presentaron un aumento continuo en el valor de

Ed con el tiempo de adsorción, indicando una lenta pero mayor evolución, en muchos

casos, de la estructura interfacial en comparación con la interfase A/W (Figuras 3.5 A y

C). La lenta evolución de la estructura se hace evidente también en la evolución de la

viscoelasticidad relativa de la película (tg ) en la figura 3.5 B y D, principalmente para

E50LV.

Los valores de Ed para 1.10-2% de concentración (Figura 3.5A) fueron mayores en la

interfase A/W durante todo el tiempo de adsorción, principalmente para E4M. Esta

celulosa mostró un fuerte carácter elástico, con un Ed máximo de 21 mN/m, el cual fue

alcanzado casi instantáneamente. Esto demuestra una rápida adsorción y estructuración

de las monocapas de E4M en la interfase A/W, como consecuencia de la existencia de

fuertes asociaciones entre las moléculas adsorbidas (Rodriguez Patino y col., 1999).

Al igual que para los valores de (Figuras 3.2 A) los valores de Ed fueron menores

en la interfase O/W. Como previamente se ha reportado (Benjamins y col., 1996;

Wüstneck y col, 1999), las condiciones para formar una estructura interfacial de alta

estabilidad mecánica son mejores cuando los cambios conformacionales no están

restringidos, es decir, en la interfase con aire. Las interacciones intramoleculares entre

la moléculas de HPMC necesarias para formar un film elástico estarían restringidas por

la solvatación de los grupos hidrofóbicos en la fase aceite. Williams y col. (1996)

también obtuvieron menores valores en el módulo elástico en la interfase O/W cuando

estudiaron el comportamieno de -lactoglobulina y -caseína en ambas interfases.

La viscoelasticidad relativa (tg ) de las películas de HPMC (Figura 3.5B) para una

concentración en el seno de la solución de 1.10-2%, indica que las películas más

viscoelásticas (menores tg ) se forman en la interfase A/W. El valor casi constante en

la tgindica que Ed y Ev cambian en la misma magnitud con el tiempo. Los valores de

tg por debajo de 1, alcanzados en el transcurso de la adsorción, muestran que las

películas tienen una estructura tipo gel, lo cual implica la asociación de los grupos

metilos de las HPMCs (Kita, Kaku, Kubota y Dobashi, 1999), con excepción de E50LV

en la interfase O/W, donde una película viscoelástica se formó recién a largos tiempos

de adsorción (t> 8000 s).

Para una concentración en el seno de la solución de 1%, el carácter sólido de las

películas en la interfase O/W aumenta lentamente con el tiempo de adsorción , como se

discutió previamente. E4M formó películas más elásticos en la interfase A/W debido al


143

10 15 20 25 30 35

5

10

15

20

25

10 15 20 25 30 35

5

10

15

20

25

10 15 20 25 30 35

5

10

15

20

25

10 15 20 25 30 35

5

10

15

20

25

10 15 20 25 30 35

5

10

15

20

25

10 15 20 25 30 35

5

10

15

20

25

10 15 20 25 30 35

5

10

15

20

25

10 15 20 25 30 35

5

10

15

20

25

10 15 20 25 30 35

5

10

15

20

25

E

(m

N/m

)

(mN/m)

aumento de la viscosidad dilatacional relacionada con el colapso de la película y

formación de multicapas (Pérez y col., 2008).

El carácter elástico de las películas de E50LV al 1% en presencia de la fase aceite,

aumentó marcadamente luego de los 6000 s de adsorción y alcanzó valores mayores que

aquellos observados para la interfase A/W (Figura 3.5C). Análogamente, la

viscoelasticidad relativa de las películas aumenta (menores tg ), alcanzando los valores

observados para la fase aire (Figura 3.5D).

La evolución del módulo dilatacional superficial E con la presión superficial para la

adsorción de las HPMCs en ambas interfases se observa en la figura 3.6. Si los valores

del módulo dilatacional superficial se deben únicamente a la cantidad de HPMC

adsorbida en la interfase, todos los valores de E deberían poder normalizarse en una

curva patrón. La figura 3.6 indica que esta normalización no fue posible para ninguna

concentración de HPMC en ninguna de las interfases estudiadas, indicando un

comportamiento no- ideal y reflejando el impacto de las interacciones de las

macromoléculas.

Figura 3.6. Módulo dilatacional superficial, E, en función de la presión interfacial, , para las películas de E4M y E50LV en la interfase aire-agua (símbolos llenos) y aceite-agua (símbolos vacíos). Frecuencia: 0,1 HZ. Amplitud de los ciclos de compresión/expansión: 10%. Las

concentraciones de HPMC en el seno de la solución fueron: 1.10-2% (E4M,■, □ y E50δV, ▲,) y 1% (E4M ●,○ y E50LV ♦, ◊). Temperatura β0°C, pH6 y I= 0,05mM.


144

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 300.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 300.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 300.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 300.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

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0.7

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10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 300.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

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10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 300.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

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10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 300.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

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10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 300.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

(mN/m)

tan

Al igual que para otros biopolímeros, como las proteínas (Horne y Rodriguez Patino,

2003; Rodríguez Patino y col., 2003) y otros polisacáridos (Baeza y col., 2004), E

aumentó en la mayoría de los casos con la presión interfacial y esta dependencia refleja

la existencia de mayores interacciones entre los residuos de los polisacáridos

adsorbidos.

El aumento de E con la presión interfacial, excepto para E50LV en la interfase A/W, es

consistente con el aumento de las interacciones entre las HPMCs adsorbidas, las cuales

son mayores a mayores tiempos y/o a mayores concentraciones en el seno de la solución

(a mayores ).

Figura 3.7. Tangente del ángulo de desfase, tg , en función de la presión interfacial, , para las películas de E4M y E50LV en la interfase aire-agua (símbolos llenos) y aceite-agua (símbolos vacíos). Frecuencia: 0,1 HZ. Amplitud de los ciclos de compresión/expansión: 10%. Las concentraciones de HPMC en el seno de la solución fueron: 1.10-2% (E4M,■, □ y E50δV, ▲,) y 1% (E4M ●,○ y E50LV ♦, ◊). Temperatura β0°C, pH6 y I= 0,05mM.

La figura 3.7 muestra la normalización de la viscoelasticidad relativa de las

películas (tg = Ev/Ed) en función de la presión interfacial. Se observa un decrecimiento

casi lineal de la tg con el aumento de , excepto para E4M 1%, indicando un aumento

del carácter elástico de los films. El aumento de la tg con el aumento de para E4M al

1%, se atribuye al colapso y formación de multicapas lo cual aumenta la contribución

viscosa (Pérez y col., 2008). Esto puede comprobarse en la figura 3.8 donde se muestra

la componente viscosa del módulo dilatacional en función de la presión interfacial.


145

10 15 20 25 30 350

2

4

6

8

10

10 15 20 25 30 350

2

4

6

8

10

10 15 20 25 30 350

2

4

6

8

10

10 15 20 25 30 350

2

4

6

8

10

10 15 20 25 30 350

2

4

6

8

10

10 15 20 25 30 350

2

4

6

8

10

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2

4

6

8

10

10 15 20 25 30 350

2

4

6

8

10

(mN/m)

Ev(

mN

/m)

Figura 3.8. Componente viscosa, Ev, del modulo dilatacional, E, en función de la presión interfacial, , para películas de E4M y E50LV en la interfase aire-agua (símbolos llenos) y aceite-agua (símbolos vacíos). Frecuencia: 0,1 HZ. Amplitud de los ciclos de compresión/expansión: 10%. Las concentraciones de HPMC en el seno de la solución fueron:

1.10-2% (E4M,■, □ y E50δV, ▲,) y 1% (E4M ●,○ y E50LV ♦, ◊). Temperatura β0°C, pH6 y I= 0,05mM.

Sin embargo, fuertes diferencias en el comportamiento de las HPMCs en las dos

interfases se observan al analizar las figuras 3.6 y 3.7:

(a) en la interfase O/W se forman películas con estructura tipo gel y con alta

viscoelasticidad (tg = 0,2) a presiones interfaciales mucho menores que en la

interfase A/W (18 mN/m en O/W y 25 mN/M en A/W).

(b) en la interfase A/W la estructura tipo gel se alcanza rápidamente al comienzo

de la adsorción se alcanzan con valores de tg debajo de 0,5. En la interfase

O/W la adsorción es más lenta (Figura 3.2) entonces también lo es la formación

de la estructura tipo gel en la interfase. Este resultado refleja el rol de la fase

hidrofóbica en la estructuración de la película interfacial debido a la interacción

de las moléculas de triglicéridos con los segmentos hidrofóbicos de las HPMCs.


146

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

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22

(mN

/m)

(m

N/m

)

tiempo(s)

(A)

(mN

/m)

(mN

/m)

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

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20

22

tiempo(s)

(B)

(mN

/m)

(mN

/m)

(mN

/m)

3.2 Efecto del pH en las propiedades interfaciales de HPMC en interfases O/W.

3.2.1 Efecto del pH en la dinámica de adsorción de HPMC

La Figura 3.9 muestra la evolución de la presión interfacial en función del tiempo de

adsorción en forma comparativa para las diferentes HPMCs a pH6.


147

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

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20

22

(mN

/m)

(mN

/m)

tiempo(s)

(C)

(mN

/m)

(mN

/m)

Figura 3.9. Presión interfacial en función del tiempo de adsorción para E4M (欣), E50LV (), E15LV () y E5LV (強) en la interfase aceite-agua a pH6 y una concentración de HPMC en el

seno de 1∙10-2 %p/p (A), 1%p/p (B) y 2% p/p (C). Temperatura 20 ºC, pH6 y I = 5mM.

A la concentración de 1.10-2 % en el seno de la solución y bajos tiempos de

adsorción (t < 8000 s) (Figura 3.9A), el incremento de la presión interfacial sigue el

siguiente orden E4M > E15LV E5LV > E50LV. Sólo E4M parece alcanzar un estado

de pseudo-equilibrio. La mayor presión interfacial alcanzada por E4M al comenzar la

adsorción estaría relacionada con su estructura molecular. E4M posee el menor número

de grupos metilos (hidrofóbicos) (Tabla 1, materiales y métodos) pero tiene un grado de

polimerización promedio cuatro veces mayor que las otras HPMCs. Esto involucra un

aumento en el número de segmentos que potencialmente se pueden adsorber por mol de

polímero (Perez y col., 2006).

Luego de los 8000 s, se observa un aumento en para E5LV, E50LV y

especialmente E15LV. Este comportamiento obedecería al mayor número de grupos

hidrofóbicos (metilos) y menor peso molecular que estos tres polisacáridos poseen en

comparación con E4M (Tabla 1, materiales y métodos) que les permitiría seguir

penetrando y reacomodándose a largos tiempos de adsorción.

Para la concentración de 1% (Figura 3.9B), E5LV muestra la mayor actividad

interfacial y sólo E4M parece llegar a un estado de pseudo-equilibrio en el tiempo de

adsorción, como resultó también para la concentración de 1.10-2%. E15LV y E50LV

muestran un incremento continuo en la presión indicando una constante adsorción y


148

0 2000 4000 6000 8000 10000 1200010

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(mN

/m)

(mN

/m)

tiempo(s)

(mN

/m)

(mN

/m)

(A)

reordenamiento en esta interfase. E5LV es la HPMC con menor peso molecular (Tabla

1, materiales y métodos), lo cual le permitiría un mayor incremento de la presión

superficial, seguido por E15LV y E50LV.

Baeza y col (2004) encontraron también una correlación entre el mayor incremento

en la presión superficial y el mayor grado de esterificación y mayor viscosidad en

alginatos de propilenglicol en la interfase aire- agua.

A la concentración de 2% p/p (Figura 3.9C), no se observan grandes diferencias en la

presión interfacial de las cuatro HPMC. Los valores obtenidos de presión son muy

similares a los obtenidos para 1% de concentración. Esto podría deberse a la saturación

de la interfase a concentraciones superiores a 10-2%, como se mostró en las isotermas de

adsorción (Figura 3.1).

La Figura 3.10 muestra la evolución de la presión interfacial con el tiempo de

adsorción en forma comparativa para las diferentes HPMCs a pH3.

Es interesante destacar que para todas las HPMCs y todas las concentraciones, el valor

de presión alcanzado a pH3 es menor que el obtenido a pH6. Un valor de pseudo-

equilibrio parece alcanzarse en todos los casos.


149

0 2000 4000 6000 8000 10000 1200013

14

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0 2000 4000 6000 8000 10000 1200013

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0 2000 4000 6000 8000 10000 1200013

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0 2000 4000 6000 8000 10000 1200013

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(mN

/m)

tiempo(s)

(B)

(mN

/m)

(mN

/m)

(mN

/m)

0 2000 4000 6000 8000 10000 1200011

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0 2000 4000 6000 8000 10000 1200011

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0 2000 4000 6000 8000 10000 1200011

12

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(mN

/m)

tiempo(s)

(mN

/m)

(mN

/m)

(mN

/m)

(C)

Figura 3.10. Presión interfacial en función del tiempo de adsorción para films de E4M (斤), E50LV (), E15LV () y E5LV (強) en la interfase aceite-agua a pH3 y una concentración de HPMC en el seno de 1∙10-2 % p/p (A), 1% p/p (B) y 2% p/p (C). Temperatura 20 ºC, pH6 y I =

5mM.

Como se mostró en el capítulo 1, todas las HPMCs presentan una carga superficial

neta negativa (potencial zeta) a pH3 que está ausente a pH6. Esta carga superficial

debida principalmente a la posible interacción de los iones cloruro con los grupos

hidrofóbicos, impediría en parte su adsorción, causando una menor presión interfacial

a pH 3.


150

3.2.2 Efecto del pH en la cinética de adsorción de HPMC.

Como se mostró en la figura 3.9, la difusión para las HPMC a pH6 (con excepción de

las HPMCs a la concentración de 10 -2%) fue muy rápida ( 10 mN/m) al inicio de la

medición para ser detectada por la técnica experimental empleada en este trabajo.

El rápido aumento de al inicio estaría relacionado con el peso molecular

principalmente de acuerdo a lo esperado, ya que a mayor peso molecular, menor kdif.

Excepto para la concentración de 10-2% donde la presencia de compuestos activos

superficialmente es relevante a tiempos cortos.

En la tabla 3.2 se resumen las constantes de adsorción y reordenamiento obtenidas

para las cuatro HPMCs.

Las Kads son del mismo orden de magnitud para todas las HPMCs. Las asociaciones

entre las HPMC dependientes de la concentración, enlentecería también el proceso de

adsorción a la concentración de 2%, ya que requeriría una previa desorganización de los

agregados. Esto ocurriría más fácilmente para las HPMCs con menor número de grupos

metilos. E4M presenta el menor número (Tabla 1, Materiales y Métodos), por lo cual se

adsorbería más fácilmente en la interfase O/W (Tabla 3.2).

No se observó la etapa de reordenamiento para E4M y E50LV al 2% dentro del

tiempo de adsorción. En los otros casos, se observa un aumento de la constante de

velocidad de reordenamiento a medida que disminuye el peso molecular. Estos

resultados indicarían que a medida que aumenta el tamaño molecular de la HPMC, su

reordenamiento interfacial se hace más dificultoso, es decir requiere más tiempo.


151

Tabla 3.2. Parámetros cinéticos para la adsorción de HPMCs a pH6 en la interfase aceite-agua. 20°C y I= 5mM.

HPMC (%p/p) Kdif .104 *(s-1) Kads .104

*(s-1)(RL) t end ads (s) Kr .104

*(s-1)(RL)

E4M (10-2) 7,00 ± 0,10 1,62 ±0.11(0,97) 8000 3,94 ± 0,80 (0,94)

E50LV (10-2) 24,89±0,06 1,09±0.09(0,96) 8000 11,80 ± 2,45(0,95)

E15LV (10-2) 11,14 ±0,09 1,39±0,17(0,89) 7200 12,2±1,80(0,97)

E5LV (10-2) 10,82±0,05 1,14±0,09 (0,98) 6800 5,85±0,43(0,98)

E4M (1) 23,10±0,05 2,10 ±0.06(0,99) 8500 4,13 ± 0,90 (0,89)

E50LV (1) 25,50±0,08 1,78±0.08 (0,97) 8800 6,64 ± 0,42 (0,99)

E15LV (1) 28,63±0,05 2,01±0,17(0,97) 7400 8,13±0,94(0,98)

E5LV (1) 55,332±0,05 1,88±0,07(0,99) 6900 9,26±3,54(0,80)

E4M (2) 14,97 ± 0,05 1,85 ± 0,06 (0,98) 10000 --------

E50LV (2) 22,33 ± 0,05 1,73± 0,11 (0,98) 10000 --------

E15LV (2) 36,28± 0,10 1,77±0,14(0,97) 8000 8,47±0,64(0,98)

E5LV (2) 63,82±0,10 1,60±0,08 (0,98) 8000 8,74±2,22(0,92)

* promedio DS de al menos n = 2. Kdif, Kads, Kr: constantes de difusión, penetración/ adsorción y reordenamiento respectivamente. (RL): coeficiente de

regresión lineal.


152

En la tabla 3.3, se presentan las constantes cinéticas obtenidas para las HPMCs a pH3.

Las constantes de difusión siguen el orden E5LV ˃ E15δV ˃ E50δV ˃ E4ε para

todas las concentraciones estudiadas, contrariamente a lo observado a pH6. De acuerdo

a la figura 1.4, a pH3 predomina la forma monomérica de la HPMC que sería la especie

que se adsorbe en la interfase. Por lo tanto difunden en mayor medida (mayor kdif) las

HPMC de menor peso molecular. A pH6 predominan las formas asociadas (figura 1.4),

siendo el grado de autoensamblaje mayor para las HPMC de mayor peso molecular.

Las constantes de adsorción son mayores a 10-2% p/p, principalmente para E4M y

E50LV. Probablemente, a mayores concentraciones del polisacárido, exista una barrera

de energía para la adsorción y, en consecuencia, la habilidad de las moléculas de

HPMCs para crearse espacio y reacomodarse en la película ya formado, sea

determinante en la velocidad de adsorción. La repulsión electrostática entre los grupos

metilos, presente a pH3, de las moléculas previamente adsorbidas y las que arriban a la

interfase, impediría también la posterior adsorción.

No se obtuvo ninguna constante de reordenamiento para E4M, E50LV y E15LV al 2%

(Tabla 3.3). Como es un proceso que transcurre en un lapso de tiempo largo, la carga

neta negativa presente a este pH en las HPMCs y su mayor peso molecular (en

comparación con E5LV) impediría el proceso de reordenamiento en el lapso de tiempo

estudiado.

3.2.3 Efecto del pH en las características viscoelásticas de las películas de HPMCs.

La evolución con el tiempo del módulo elástico dilatacional, o de sus componentes

elástica (Ed) y viscosa (Ev) así como de la tangente del ángulo de desfase (tg ) para las

películas de HPMCs, se obtuvieron en forma simultánea con los estudios de adsorción

dinámica. En la figura 3.11 se muestra para pH6 la evolución con el tiempo del módulo

elástico dilatacional (Ed) para las concentraciones en el seno de la solución de 10-2%

(Figura 3.11A), 1% (Figura 3.11B) y 2% p/p (Figura 3.11C). En todos los casos las

cuatro HPMCs presentaron un continuo aumento en los valores de Ed, lo cual indica una

lenta y gradual evolución de la estructura interfacial. La lenta evolución en la estructura

de las películas, se observa también en la evolución de la viscoelasticidad relativa del

film (tg ) en la Figura 3.12.


153

Tabla 3.3. Parámetros cinéticos para la adsorción de HPMCs a pH3 en la interfase aceite-agua. 20°C y I= 5mM.

* promedio DS de al menos n = 2.

Kdiff, Kads, Kr: constantes de difusión, penetración/ adsorción y reordenamiento respectivamente. (RL): coeficiente de regresión lineal.

HPMC (%p/p) Kdiff .104 * (s-1)(R Kads .104

*(s-1)(RL) t end ads (s) Kreor .104

*(s-1)(RL)

E4M (10-2) 8,17± 0,08 3,49±0,48(0,92) 10000 -----

E50LV (10-2) 7,95±0,15 11,1±1,34(0,94) 10000 -----

E15LV (10-2) 25,68±0,05 2,66±0,23(0,96) 10000 -----

E5LV (10-2) 38,72±0,05 1,56±0,08(0,98) 5800 4,90±1,30(0,93)

E4M (1) 45,60± 0,05 1,24±0,21(0,85) 10000 -----

E50LV (1) 48,42±0,07 1,97±0,43(0,98) 10000 -----

E15LV (1) 50,5±0,10 2,4±0,39(0,92) 10000 -----

E5LV (1) 52,03±0,05 1,55±0,10(0,97) 5800 5,35±0,21(0,99)

E4M (2) 44,76±0,10 1,98±0,22(0,91) 10000 -----

E50LV (2) 50,53±0,08 1,72±0,55(0,82) 10000 -----

E15LV (2) 49,28± 0,05 1,95±0,27(0,95) 10000 -----

E5LV (2) 68,56±0,07 9,57±0,11(0,95) 6000 4,91±0,13(0,99)


154

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

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14

16

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

Ed(

mN

/m)

tiempo(s)

(B)

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

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12

14

16

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

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14

16

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

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6

8

10

12

14

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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

tiempo(s)

Ed(

mN

/m)

(C)

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

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14

16

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

Ed(

mN

/m)

Ed(

mN

/m)

tiempo(s)

(A)

Figura 3.11. Evolución del módulo elástico dilatacional, Ed, con el tiempo de adsorción para

las películas de E4M (欣), E50LV (), E15LV () y E5LV (強) en la interfase aceite-agua a pH6 para las concentraciones de HPMC en el seno de la solución de 1∙10-2 % (A), 1% (B) y 2% p/p (C). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.


155

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

tg

(A)

tiempo (s)

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

tiempo (s)

(B)

tg

En general, independientemente de la concentración, E5LV y E15LV presentaron

una mejor habilidad para la formación de películas elásticas. E4M presentó los valores

más bajos de Ed, probablemente relacionado con su menor grado de sustitución de

grupos metilo (tabla 1, materiales y métodos).

Las interacciones entre las moléculas de HPMC necesarias para formar una película

elástica estarían restringidas por la solvatación de los grupos hidrofóbicos en la fase

aceite, como se discutió anteriormente al comparar con el comportamiento en la

interfase aire-agua.

Con respecto a la evolución de la viscoelasticidad relativa (tg ) de las películas

(Figura 3.12) en la mayoría de los casos se forman películas viscoelásticas (tg 1).


156

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

2.6

tg

(C)

tiempo (s)

Figura 3.12. Evolución de la tangente del ángulo de desfase, tg , con el tiempo de adsorción

para las películas de E4M (欣), E50LV (), E15LV () y E5LV (強) en la interfase aceite-agua a pH6 para concentraciones de HPMC en el seno de la solución de 1∙10-2 % (A), 1% (B) 2% p/p (C). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.

Mayoritariamente, los valores de la tg alcanzados durante la adsorción a tiempos

largos, están todos por debajo de 1, indicando que los films formados poseen una

estructura con carácter tipo gel. Esto involucra la asociación de los grupos hidrofóbicos

metilos de las HPMCs (Kita, Kaku, Kubota y Dobashi, 1999).

En la figura 3.13 se presenta la evolución con el tiempo de adsorción del módulo

elástico dilatacional (Ed) para las concentraciones en el seno de la solución de 10-2%

(Figura 3.13A), 1% (Figura 3.13B) y 2% (Figura 3.13C) a pH3.

El continuo incremento del carácter elástico observado para los films a pH6 (Figura

3.11), no fue evidente a este pH. Esto indica que la estructura sólida del film no presenta

una evolución con el transcurso del tiempo de adsorción.


157

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

Ed

(m

N/m

)

tiempo(s)

(A)

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

tiempo(s)

Ed

(mN

/m)

(B)

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

Ed(m

N/m

)

tiempo(s)

(C)

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 1400010

15

20

25

Ed

(m

N/m

)

tiempo (s)

Figura 3.13. Evolución del módulo elástico dilatacional, Ed, con el tiempo de adsorción para

las películas de E4M (欣), E50LV (), E15LV () y E5LV (強) en la interfase aceite-agua a


158

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

(mN/m)

(A)

E (

mN

/m)

pH3 para las concentraciones de HPMC en el seno de la solución de 1∙10-2 % (A), 1% (B) 2% p/p (C). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.

Más aún, los valores de Ed son muy bajos ( 5 mN/m) para las tres concentraciones

estudiadas, con excepción de E4M al 2% (figura inserta) en donde los valores de Ed

son mayores a 15 mN/m hasta los 8000 segundos de adsorción. Al analizar los valores

de tg para los films de HPMCs a pH3, sólo las HPMCs al 1%, y en particular E5LV,

presentaron carácter viscoelástico (tg 1) a todos los tiempos de adsorción (datos no

mostrados). Al 2% de concentración ninguna de las HPMCs tuvo carácter viscoelástico

y al 10-2%, sólo E5LV presentó valores de tg 1 a tiempos de adsorción menores a

6000 segundos.

Como se discutió previamente, las HPMCs a este pH no se autoensamblan como a

pH6 (figura 1.4) lo que les impediría la formación de una estructura sólida en la

interfase.

La relación entre el módulo dilatacional superficial (E) y la presión interfacial para

la adsorción de las HPMCs a ambos pH, se observa en la Figura 3.14. Si el módulo

dilatacional superficial se debe solamente a la cantidad de HPMC adsorbida en la

interfase aceite-agua, todos los datos de E deberían normalizarse en una curva patrón.


159

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

16

18

(mN/m)

E (

mN

/m)

(B)

Figura 3.14. Módulo dilatacional superficial, E, en función de la presión interfacial, , para films de HPMCs adsorbidas en la interfase aceite-agua a pH3 (A) y pH6 (B). Frecuencia: 0,1 HZ. Amplitud de compresión/expansión por ciclo: 10%. Concentración de HPMC en el seno de

la solución: 1∙10-2 % p/p (E4M , E50LV ◮, E15LV,ɒ; E5LV ◨), 1 % p/p ( E4M,♢;

E50LV,△; E15LV, ○; E5LV, □) y 2% p/p (E4M, ◆;E50LV,▲; E15δV,●; E5δV,■). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.

Se observa que esta normalización no fue posible para ninguna de las

concentraciones, indicando un comportamiento no ideal y reflejando así el impacto en

las interacciones entre las macromoléculas.

Como sucede para otros biopolímeros, tales como las proteínas (Horne y Rodriguez

Patino, 2003; Rodríguez Patino, Molina, Carrera, M.R. y Añon, 2003) y polisacáridos

(Baeza y col., 2004b), el módulo E aumenta, en la mayoría de los casos con la presión

superficial y esta dependencia refleja la existencia de mayores interacciones entre los

residuos adsorbidos de los polisacáridos. El incremento del módulo E con la presión, es

consistente con el incremento entre las interacciones entre las HPMCs adsorbidas, que

es mayor a tiempos largos de adsorción (Baeza y col., 2004).

El incremento del módulo E con la presión interfacial a pH3 (Figura 3.14A) fue

prácticamente nulo y marcadamente menor que a pH6 (Figura 3.14B), revelando la

ausencia de interacciones entre las moléculas de HPMC adsorbidas.


160

3.3. Conclusión.

El comportamiento en la interfase O/W se vio fuertemente influenciado por el pH y

guarda correlación con el comportamiento en solución, estudiado por DLS en el

capítulo 1.

Se ha mostrado que el pH modula la asociación hidrofóbica entre las moléculas de

HPMC, lo cual impacta enormemente en su comportamiento en solución como en la

interfase O/W.

A pH3 el autoensamblaje de las HPMC se ve impedido tanto en solución como en la

interfase O/W. Por ello todas las HPMC a pH3 mostraron una reducción en su actividad

interfacial con respecto a pH6 y las películas interfaciales no presentaron propiedades

elásticas.

Con respecto al comportamiento de cada celulosa, se concluye que las HPMC de menor

peso molecular y mayor hidrofobicidad (E5LV y E15LV) son más eficientes para la

estabilización de la interfase O/W, mientras que el comportamiento contrario se observa

en la interfase A/W.

Capítulo 4

Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosas

en emulsiones O/W


161

4.1 Características iniciales de las emulsiones.

4.1.1 Distribución de tamaño de gota en emulsiones preparadas con Ultraturrax

(UT).

La figura 4.1 muestra la distribución de tamaños de gota para las emulsiones O/W en

relación aceite/solución HPMC 10/90 respectivamente, preparadas con UT a ambos

pHs.

Puede observarse que tanto a pH3 (Figura 4.1A) como a pH6 (Figura 4.1 B), se

obtienen poblaciones trimodales para todas las HPMCs, con predominio de la población

II (Figura 4.1). Mitidieri y Wagner (2002) y Palazolo (2006) también encontraron

poblaciones trimodales al estudiar emulsiones O/W preparadas con proteínas de soja

mediante UT.

La población I tiene el máximo del pico a los 0,2 m para todas las emulsiones a

pH6 y para las emulsiones de E5LV y E15LV a pH3. Este primer pico se encuentra

desplazado a 0,3 m para E50LV y a 1 m para E4M a pH3.

La población II tiene su máximo en 10 m para las emulsiones a pH3 y pH6. Por

último, la población III tiene su máximo en los 100 m para ambos pHs. A pH3, las

emulsiones de E5LV, E15LV y E50LV tienen una pequeña proporción de este tamaño

de gotas y es mayoritario para las emulsiones de E4M. A pH6 este máximo se encuentra

en los 100 m para las emulsiones de E50LV y E4M. Las emulsiones de E5LV no

presentan la población III y las correspondientes a E15LV presentan una pequeña

proporción de este tamaño de gotas.

Sección I- Capítulo 4. Comportamiento de HPMC en emulsiones O/W

162

0.01 0.1 1 10 100 1000 100000

2

4

6

8

10

Vol

um

en

(%)

tamaño gota (m)

(A)III

II

I

0.01 0.1 1 10 100 1000 100000

2

4

6

8

10

Vol

ume

n (%

)

tamaño gota (m)

I

II

III

(B)

Figura 4.1. Distribución del tamaño de gota por volumen (%) para emulsiones O/W de HPMC al 2% preparadas por Ultraturrax a pH3 (A) y pH6 (B). E5LV (峡,強), E15LV (鏡,響), E50LV

(▼,) y E4M (斤,欣). I: tamaño de gotas incluidas en la población I. II: tamaño de gotas incluídas en la población II. III: tamaño de gotas incluidas en la población III.


163

Las distribuciones de tamaño de partícula expresadas en número (no mostradas)

fueron similares para todas las emulsiones y presentaron una gran proporción de gotas

de la población I y en menor medida de la población II. Esto significa que la población I

y parcialmente la II, no contribuyen ampliamente al volumen total de la fase dispersa

(Figura 4.1) pero si al área creada durante el proceso de homogeneización (Palazolo,

2006). Por el contrario, la población II y la población III, concentra casi todo el

volumen de la fase dispersa de las emulsiones.

El comportamiento de estos sistemas coloidales, en lo que se refiere al cremado y la

coalescencia, está gobernado por la presencia de gotas de mayor tamaño, aún cuando

están presentes en un pequeño porcentaje con respecto al número total de gotas.

Cuando mayor sea el tamaño de gotas en una emulsión, serán más propensas a la

coalescencia inducida por colisión. Las fuerzas de impacto que se generan y la magnitud

de las mismas durante una colisión, se hacen mayores con el aumento del tamaño de las

gotas (McClements, 1999). Es por este motivo que el análisis de estabilidad se realiza

en base a las distribuciones de tamaño de partícula en volumen (Palazolo, 2006).

La tabla 4.1 muestra los diámetros promedio, la polidispersidad y el área superficial

específica creada para las emulsiones de HPMCs recién preparadas con UT.

A partir de la mediana (Dv,0,5) y los percentiles 10 y 90 % (Dv,0,1 y Dv,0,9

respectivamente) de la distribución en volumen, se calculó el grado de polidispersidad

de las emulsiones (apartado 6.2.2 de la introducción).

El área interfacial específica (AIE) o área superficial por unidad de masa de la fase

dispersa, es calculada por el software del Mastersizer mediante el valor del diámetro

promedio D3,2 (Carrera Sanchez y Rodriguez Patino, 2005; Cornec y col.., 1998).

Durante el proceso de homogeneización con un agitador de alta velocidad, las fases

acuosa y oleosa son sometidas a una agitación mecánica intensa en un régimen de flujo

laminar y turbulento. Por consiguiente, el área interfacial resultante es un balance entre

los procesos de ruptura (creación de área interfacial) y coalescencia (reducción de área

interfacial) de las gotas ((McClements, 1999; Palazolo, 2006; Walstra, 1993). Las

condiciones de homogeneización fueron las mismas para todas las emulsiones, lo cual

permite inferir que la variación del AIE se atribuye en mayor medida al emulsificante

empleado (en esta sección HPMC), que favorece o inhibe en distinto grado los procesos

mencionados.


164

Tabla 4.1. Diámetros promedios de Sauter (D32), de De Brouker (D43), polidispersidad y área específica interfacial (AIE) de las distribuciones

de tamaño de gota de las emulsiones de HPMC al 2% preparadas con UT a ambos pH. Desviación estándar máxima: 5%.


pH3 pH6 pH3 pH6 pH3 pH6 pH3 pH6

D32 (m) 21,301 2,921 2,902 2,481 1,512 1,991 1,441 1,811

D43(m) 52,211 25,413 20,302 20,903 17,241 12,771 18,742 10,771

polidispersidad 4,951 3,902 4,532 3,763 4,431 2,553 4,161 2,161

AIE (m2/g) 0,282 2,981 2,471 2,023 3,902 3,082 3,441 3,321


165

Los diámetros promedio D32 para las emulsiones de E4M y E50LV resultaron

mayores a pH3 que a pH6, mientras que ocurrió lo contrario para las emulsiones de

E15LV y E5LV. Sin embargo, las emulsiones de E4M fueron las que mostraron mayor

variación en el D32 con el pH.

El área superficial específica creada fue mayor cuando menor es el valor de D3,2

(Carrera Sanchez y col., 2005). Por lo tanto también las emulsiones de E4M fueron las

que exhibieron una mayor variación en el área interfacial con el pH.

Los D4,3, que están relacionados con los fenómenos de desestabilización, por ser más

sensible a la variación de volumen y la polidispersidad fueron mayores en todos los

casos para las emulsiones a pH3.

Como se ha mostrado en el capítulo 3, las películas interfaciales de HPMCs a pH3

presentan una baja viscoelasticidad y pobre carácter sólido. Para minimizar la

coalescencia de las gotas de aceite la película interfacial debe ser suficientemente

resistente para evitar que las mismas se fusionen durante el proceso de

homogeneización (McClements, 1999; Palazolo, 2006). Por lo tanto, las emulsiones de

HPMCs a pH3 tendrían una mayor tendencia a desestabilizarse durante su formación.

Baeza (2003) también encontró correlación entre la estabilidad de espumas de lg y

polisacáridos con el módulo elástico de los films y la viscosidad de las soluciones a

partir de las cuales se formaron las espumas.

Para ambos pHs, los valores de polidispersidad siguieron el orden E4M > E50LV>

E15LV> E5LV. Esto se evidenció en las distribuciones de tamaño de gota (Figura 4.1),

principalmente en la proporción de gotas en la población III para las distintas HPMCs.

A ambos pH, las HPMC más eficientes en cuanto a la obtención de un menor

diámetro de gota (D32 o D43) fueron las de menor peso molecular (E5LV y E15LV) las

cuales, como se discutió en el capítulo 3, pueden producir un aumento más rápido de la

presión interfacial y generan películas interfaciales elásticas.

La viscosidad de las soluciones iniciales también tiene influencia en el tamaño de

gota formado. La viscosidad es una medida cualitativa de las interacciones moleculares,

cuando mayor es la viscosidad, mayores son las fuerzas atractivas entre las moléculas

del polisacárido y mayor debe ser la energía entregada por el sistema para obtener gotas

de menor diámetro (Behrend, Ax y Schubert, 2000). En todos los casos el valor del

índice de consistencia sigue el mismo orden que el establecido para la polidispersidad y

es mayor en la emulsiones a pH6 (Tabla 4.2).


166

Tabla 4.2. Parámetros de flujo de las emulsiones de HPMC al 2% preparadas por UT obtenidas a partir del modelo de Ostwald. K, índice de consistencia; n, índice de flujo. R2 > 0,97.

HPMC pH3 pH6

K n K n

E5LV 0,050 1,036 ± 0,025 0,340 ± 0,087 0,927 ± 0,055

E15LV 0,272 ± 0,067 1,015 ± 0,077 0,377 ± 0,005 0,917 ± 0,006

E50LV 0,273 ± 0,063 1,015 ± 0,073 5,399 ± 0,304 0,935 ± 0,012

E4M 43,030 ± 1,056 1,034 ± 0,026 67,370 ± 1,833 1,024 ± 0,047


167

0.01 0.1 1 10 100 1000 100000

2

4

6

8

10

Vol

ume

n (%

)

tamaño gota(m)

Como puede observarse en la tabla 4.2, las viscosidades iniciales de las emulsiones

guardan relación con las viscosidades iniciales de las soluciones de HPMC (tabla 2.7 y

2.8, capítulo 2). Las emulsiones de E4M a ambos pHs, presentan un valor mucho mayor

lo cual refleja la mayor viscosidad de esta celulosa.

Para las emulsiones preparadas con UT, el comportamiento obtenido fue Newtoniano,

a pH3 y pseudoplástico para las emulsiones a pH6, con excepción de E4M.

La viscosidad de una emulsión está influenciada por varios factores, viscosidad de la

fase continua, viscosidad de la película interfacial y tamaño de gota principalmente.

4.1.2 Distribución de tamaño de gota en emulsiones preparadas con ultrasonidos de

alta intensidad (USAI).

Existen en la bibliografía muchos trabajos que proponen preparar una pre-emulsión

con un agitador antes de formar una emulsión con ultrasonidos o con altas presiones,

con el fin de disminuir el tamaño de partícula (Carrera Sanchez y col.., 2005; Gu y col.,

2005; Schulz y Danields, 2000). Por ello se determinó si era conveniente hacer una pre-

emulsión con UT y luego tratarla con USAI.

La figura 4.2 muestra las curvas de distribución para emulsiones O/W 10/90 de

E5LV 2% a pH6 preparadas con 20 minutos de USAI y pre-emulsionadas con UT

durante 1 minuto antes de los 20 minutos continuos con USAI.

Figura 4.2. Distribución del tamaño de gota por volumen (%) para emulsiones O/W de

E5LV al 2% y pH6 preparadas por 20 minutos con USAI (欣) y pre- emulsionada con UT

durante 1 minuto (斤).


168

Se observa que la emulsión preparada con USAI es monomodal, con un máximo de

pico a 1 m y una población polidispersa con tamaño de gota entre los 0,2 m y los 4

m. La emulsión pre-emulsionada previamente al tratamiento con ultrasonidos,

presentó una población con cuatro tamaños bien definidos, siendo la población de 2 m

la mayoritaria. Se distinguen dos poblaciones con tamaño de gota mayores a los 10 m,

una con un máximo a los 30 m y la otra en los 200 m. Behrend y col. (2000)

sostienen que son necesarias una amplia gama de frecuencias de ultrasonidos para

obtener un tamaño de partícula gobernante y así una distribución monomodal y

estrecha. Esto es bastante difícil de conseguir cuando se parte de una pre-emulsión con

una distribución con varios tamaños de partículas, como sucede con el UT.

Por lo tanto, en el presente trabajo, se preparararon emulsiones de HPMCs a ambos

pH directamente con 20 minutos de USAI.

En la figura 4.3 se muestra la distribución de tamaños de gotas para las emulsiones

O/W en relación aceite/solución HPMC 10/90, preparadas con USAI y a ambos pHs.

Se observa la misma tendencia a ambos pHs. Mayoritariamente las poblaciones son

monomodales, con excepción de las emulsiones de E4M, las cuales presentan una

distribución bimodal. Las emulsiones de E5LV, E15LV y E50LV aún siendo

monomodales, son polidispersas ya que presentan una población que varía entre los

0,15 m y los 3 m con un máximo en la distribución a 1 m. La emulsión de E4M

presenta gotas entre los 0,15 m y los 6 m con el máximo de la población mayoritaria

a los 2 m.

Las distribuciones de tamaño de partícula expresadas en número (no mostradas)

fueron similares para todas las emulsiones y presentaron una población monomodal con

predominancia de gotas alrededor de los 0,3 m. En todos los casos, las poblaciones en

número presentaron un tamaño menor a los 0,5 m. Esto indica que las gotas mayores a

0,5 m contribuyen ampliamente al volumen total de la fase dispersa pero no al área

creada durante el tratamiento con USAI.

Es importante destacar, que el tamaño de gotas obtenido para todas las emulsiones se

encuentra mayoritariamente por debajo de los 2 m, lo cual implica una mayor

estabilidad de las emulsiones en función del tiempo ya que las gotas de mayor tamaño

aceleran los procesos de cremado y floculación (McClements, 1999).


169

Figura 4.3. Distribución del tamaño de gota por volumen (%) para emulsiones O/W de

HPMC al 2% preparadas por USAI a pH3 (A) y pH6 (B). E5LV (峡,強), E15LV (鏡,響),

E50LV (▼,) y E4M (斤,欣).

0.01 0.1 1 10 1000

2

4

6

8

10

Vol

ume

n (%

)

tamaño gota (m)

(A)

0.01 0.1 1 10 1000

2

4

6

8

10

Vo

lum

en (

%)

tamaño gota (m)

(B)


170

Es de esperar entonces, que las emulsiones preparadas con USAI sean más estables

durante el almacenamiento a temperatura ambiente que las emulsiones preparadas con

UT. Estas últimas presentaron tamaños de gotas mayores a los 10 m y una distribución

trimodal en la mayoría de las emulsiones analizadas (Figura 4.1).


específica creada para las emulsiones de HPMCs recién preparadas con USAI.

Cuando se comparan las emulsiones obtenidas por UT (tabla 4.1 y Figura 4.1) con

las emulsiones obtenidas por USAI (tabla 4.3 y Figura 4.3), se observa una gran

influencia del equipo empleado para su obtención. Las emulsiones preparadas con USAI

presentaron menores diámetros promedio y la polidispersidad también fue menor en

todos los casos. El área interfacial creada (AIE) es notablemente mayor para las

emulsiones con USAI, lo cual está asociado a un menor tamaño de gota.

Al igual que para las emulsiones preparadas por UT, se obtienen mayores diámetros

promedio (D32 y D43) para todas las HPMCs estudiadas a pH3. El orden de

polidispersidad obtenido también es el mismo (E4M > E50LV> E15LV> E5LV). Las

emulsiones de E4M son las más polidispersas a ambos pHs, lo cual se ve reflejado en la

curva de distribución (Figura 4.3). El área específica interfacial creada es mayor a pH6.

En estas emulsiones preparadas por USAI, también son más eficientes en reducir el

tamaño de gota las HPMc de menor peso molecular.

Jafari, He y Bhandari (2007) al preparar, emulsiones O/W de d-limoneno con

maltodextrina y almidón modificado con agitación mecánica y ultrasonidos, encontraron

que tanto el D32 como el D43 eran tres veces mayores en las emulsiones preparadas con

agitación mecánica que las preparadas con ultrasonidos. Las curvas de distribución de

gotas en volumen (%), resultaron bimodales cuando se prepararon las emulsiones con

agitación mecánica.

Abismail, Canselier, Wilhelm, Delmas y Gourdon (1999) estudiaron

comparativamente emulsiones de Tween 60 y aceite de girasol formadas por agitación

mecánica (Ultraturrax) y por ultrasonidos. Para todos los tiempos de tratamiento

analizados, encontraron que el diámetro promedio D32 fue mayor para las emulsiones

preparadas con UT. Resultaron más estables durante el almacenamiento y menos

polidispersas, las emulsiones preparadas con ultrasonidos.


171

Tabla 4.3 Diámetros promedio de Sauter (D3,2), de De Brouker (D4,3), polidispersidad y área interfacial específica (AIE) de las distribuciones de tamaño de gota de las emulsiones de HPMC al 2% preparadas con USAI a ambos pH. Desviación estándar máxima: 5%.


pH3 pH6 pH3 pH6 pH3 pH6 pH3 pH6

D32 (m) 0,814 0,708 0,620 0,546 0,623 0,587 0,614 0,537

D43(m) 1,531 1,370 0,923 0,843 0,944 0,866 0,959 0,812

polidispersidad 2,053 2,089 1,703 1,851 1,693 1,815 1,599 1,599

AIE (m2/g) 7,370 8,470 9,680 11,000 11,599 10,200 9,770 11,200


172

Las diferencias encontradas residen en la energía que se le entrega al sistema. Cuando

se emplea un agitador mecánico, como el Ultraturrax, las fuerzas involucradas son

esfuerzos cortantes en régimen laminar que no causan una buena ruptura de las gotas.

Por eso hay poblaciones en la distribución con tamaño mayor a los 10 m.

Durante la emulsificación por ultrasonidos, la cavitación es la causa de la ruptura de las

gotas. Hay otros fenómenos involucrados como calor, agitación dinámica, esfuerzos de

corte y turbulencia (Floros y Liang, 1994; Fukase y col., 1994; Guzey, 2002; Mason y

col., 1996) que causan cambios físicos y químicos mediante la generación y el colapso

de las cavidades. El rápido colapso de estas cavidades producen fuerzas de corte lo

suficientemente fuertes para romper enlaces covalentes en materiales poliméricos

(Guzey, 2002). Es por ello que al emulsificar con USAI, es posible obtener tamaño de

gotas submicrónicas (Jafari, He y Bhesh, 2006).

Si bien la influencia del USAI es notable en la reducción de tamaños cuando se

compara con las emulsiones preparadas con UT (tabla 4.1), al comparar las emulsiones

de HPMCs entre sí, se observan diferencias. En la tabla 4.2, puede verse que se obtienen

mayores D32 y D43 para las emulsiones de E4M tanto a pH3 como a pH6. Las curvas de

distribución en volumen correspondientes (Figura 4.3) presentan una distribución

bimodal, mientras que para las otras 3 HPMCs, las emulsiones presentan curvas de

distribución monomodales. Esto indica un efecto diferente del USAI en la preparación

de emulsiones estabilizadas con E4M. Loning, Horst y Hoffmann (2002) sostienen que

cuando mayor es la viscosidad de la fase continua, resulta más difícil de inducir el

fenómeno de cavitación. Esto llevaría a obtener diámetros promedios levemente

mayores (Tabla 4.2) y una distribución bimodal (Figura 4.3) en las emulsiones de E4M.

Luego de la preparación de las emulsiones con USAI, se determinaron las curvas de

flujo de las mismas (Tabla 4.4).

Tabla 4.4. Parámetros de flujo de las emulsiones de HPMC al 2% prepraradas por USAI obtenidas a partir del modelo de Ostwald. K, índice de consistencia; n, índice de flujo. R2 > 0,97.

HPMC pH3 pH6 K n K n

E5LV 0,058 ± 0,005 0,916 ± 0,020 0,056 ± 0,004 0,968 ± 0,015 E15LV 0,129 ± 0,003 0,973 ± 0,005 0,121 ± 0,001 0,979 ± 0,003 E50LV 0,070 ± 1,165 0,820 ± 0,035 0,086 ± 0,018 1,070 ± 0,043 E4M 3,843 ± 1,694 0,749 ± 0,091 1,099 ± 0,028 0,978 ± 0,005


173

Puede observarse un mayor valor de K para las emulsiones de E4M a ambos pH. El

efecto del USAI es mayor en las emulsiones preparadas con las HPMCs de mayor peso

molecular, especialmente E4M. Se observa gran reducción en el valor de K, en

comparación con las emulsiones preparadas con UT (tabla 4.2) y con las soluciones sin

tratamiento (tabla 2.7 y 2.8). Como se discutió en el capítulo 2, las ondas ultrasónicas

promueven la deshidratación parcial y/o modificación en la estructura de la E4M en la

fase continua, provocando una disminución global en la viscosidad de la emulsión.

En la tabla 4.5 se muestra la carga superficial de las gotas en las emulsiones a pH3 y

pH6 obtenidas por UT y USAI. Se observa la misma tendencia que en las soluciones de

HPMCs a esos pHs (tabla 2.7 y 2.8). Es decir una carga neta negativa a pH3 y positiva a

pH6.

Es interesante destacar que el valor absoluto del potencial zeta resultó

significativamente mayor en las emulsiones formadas con USAI, lo cual está vinculado

al menor tamaño de gota de las mismas (McClements, 1999).

Tabla 4.5 Potencial zeta de emulsiones de HPMCs al 2 %p/p a pH3 y pH6, preparadas con UT y USAI. Desviación estándar: 1%

HPMC E4M E50LV E15LV E5LV pH UT USAI UT USAI UT USAI UT USAI 3 -1,040 -1,320 -0,683 -1,910 -1,080 -2,340 -1,510 -2,590 6 +0,239 +0,687 +0,125 +0,118 +0,253 +0,413 +0,291 +0,928

* promedio de al menos n = 5

4.2 Estabilidad de las emulsiones preparadas con Ultraturrax y ultrasonidos de alta

intensidad frente al almacenamiento estacionario a temperatura ambiente.

El término estabilidad en una emulsión se refiere a la habilidad para resistir los

cambios en sus propiedades a través del tiempo; cuando más estable es una emulsión,

más lento es el proceso de cambio en sus propiedades (McClements, 1999).

El tiempo durante el cual una emulsión debe ser estable, depende de la naturaleza del

producto alimentario (Dickinson, 1992). Algunas emulsiones alimentarias se generan en

etapas intermedias durante un proceso de manufactura por lo tanto sólo se necesita que


174

sea estable durante algunos segundos, minutos o horas. Otras emulsiones deben

presentar estabilidad por días, meses o hasta años previamente a su consumo.

En esta sección se analizarán los resultados obtenidos de la evaluación global de las

emulsiones de HPMCs O/W (10/90) a pH3 y pH6.

Las emulsiones con baja relación volumétrica entre las fases dispersas y acuosas, como

las emulsiones en estudio, tienden a desestabilizarse por cremado. La floculación tiene

una gran influencia sobre el cremado y puede favorecer la separación gravitacional

dependiendo del tamaño y estructura de los flóculos (McClements, 1999; Palazolo,

2006). Después de un tiempo de almacenamiento, se forma en la parte superior de la

emulsión una fase crema, la cual no es más que una emulsión más concentrada en gotas

que la inicial. La fase inferior o suero está empobrecida en gotas de aceite y por lo tanto

enriquecida en agua.

En general, en ausencia de fuerzas externas aplicadas, la coalescencia es un mecanismo

de desestabilización lento, en comparación con el cremado y la floculación. Por lo tanto,

excepto que el proceso de emulsificación o el agente emulsificante no hayan sido

efectivos, la coalescencia tiene lugar una vez que se ha formado la fase crema, es decir,

cuando el cremado y la floculación han alcanzado un grado avanzado de desarrollo.

En una emulsión más concentrada en la fase dispersa, como la fase crema, las gotas

pierden movilidad y pueden permanecer en íntimo contacto durante un período

prolongado, lo cual promueve la coalescencia (Palazolo, 2006). La naturaleza de las

interacciones coloidales entre las gotas y la resistencia del film interfacial determinará el

grado de desestabilización (McClements, 1999). Por consiguiente, la estabilidad frente a

la coalescencia de una emulsión O/W, se evalúa a través de las características de la fase

crema después del almacenamiento estacionario (Palazolo, 2006).

La estabilidad de las emulsiones, se analizó mediante los perfiles de backscattering

(BS%) en función de la longitud del tubo de medida. Si bien el principal objetivo de

este estudio es la evaluación de la estabilidad de las emulsiones preparadas, los perfiles

iniciales dan cierta información de la microestructura de la emulsión de partida

(Palazolo, 2006). El BSo permite hacer una evaluación cualitativa del tamaño de las

gotas en la emulsión. Márquez, Palazolo y Wagner (2005) han encontrado una relación

similar entre BSo % y D32 en emulsiones preparadas con leche de soja, aceite de girasol

y grasa láctea.


175

0 10 20 30 40 50 60 700

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

BS

o (

%)

longitud del tubo (mm)abajo arriba

Las figuras 4.4 y 4.5 muestran los perfiles iniciales de backscattering (BSo %) de las

emulsiones formadas con UT y USAI, respectivamente.

Los valores de BS% dependen no sólo del diámetro de las gotas (D), sino también de

la fracción volumétrica de la fase dispersa () (Mengual y col., 1999; Palazolo, 2006).

Los perfiles de BSo % corresponden a las emulsiones recién preparadas, donde las gotas

están uniformemente distribuidas a lo largo del todo el tubo de medida, es decir con un

valor de constante. Por lo tanto, inicialmente el BSo % dependerá sólo del diámetro de

las gotas.

Figura 4.4. Perfiles iniciales de backscattering (BSo%) de emulsiones de HPMCs O/W

preparadas con Ultraturrax a pH3 (símbolos llenos) y pH6 (símbolos vacíos) para E4M (斤,欣)

y E5LV (峡,強) .


176

0 10 20 30 40 50 60 700

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

BS

o (

%)

longitud del tubo (mm)abajoarriba

(A)

0 10 20 30 40 50 60 700

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

BS

o (

%)


(B)

Figura 4.5. Perfiles iniciales de backscattering (BSo%) de emulsiones de HPMCs O/W

preparadas con Ultrasonidos de alta intensidad a pH3 (A) y pH6 (B) para E5LV (強,峡),

E15LV (響,鏡), E50LV (,▼) y E4M (欣,斤).


177

Para las emulsiones preparadas con UT, se muestra los perfiles de BSo para las

emulsiones de E4M y E5LV (Figura 4.4), con viscosidades extremas (tabla 4.2), a

ambos pHs.

A fracción volumétrica constante, como es el caso de estas emulsiones, las gotas de

menor tamaño dispersan una mayor cantidad de luz. Esto se traduce en un mayor

porcentaje de BSo.

Este comportamiento puede verse en la figura 4.4 donde las gotas de mayor tamaño

de las emulsiones de E4M a pH3, dispersan una menor cantidad de luz, produciendo un

menor valor de BSo (50%), lo cual está en concordancia con el tamaño de gota obtenido

(Tabla 4.1), un orden mayor para las emulsiones de E4M a pH3.

No se observaron diferencias (figura 4.4) entre las emulsiones a pH6 ni para E5LV,

indicando un menor tamaño de gota inicial. El BSo% obtenido para estas emulsiones es

de 60%.

Cuando se analizan los perfiles de BSo obtenidos para las emulsiones de HPMCs

preparadas con USAI, puede verse un mayor % de BSo en comparación con las

emulsiones preparadas con UT (Figura 4.5 y 4.4, respectivamente), lo cual refleja un

menor tamaño de gota (tabla 4.3). Se observan también mayores diferencias en los

perfiles de las emulsiones obtenidas a pH3 (figura 4.5 A) en comparación con las

emulsiones a pH6 (figura 4.5B).

4.2.1 Microscopía óptica de las emulsiones iniciales

En una microscopía óptica, las gotas que se observan con mayor facilidad son

aquellas de mayor tamaño, las cuales dominan el proceso de cremado. Sin embargo

debe tenerse en cuenta que no son las mayoritarias en número y por lo tanto las

micrografías nos brindan una información parcial de la microestructura de las

emulsiones. Lo que puede verse claramente es si las gotas visibles están o no floculadas

y las características de los flóculos formados (Palazolo, 2006). La presencia de flóculos

se atribuye a un balance entre las interacciones coloidales atractivas y repulsivas entre

las gotas (McClements, 1999; Palazolo, 2006). Si hay un predominio de las

interacciones atractivas, las gotas se agregan formando flóculos.

Las figuras 4.6 y 4.7 muestran las micrografías obtenidas para las emulsiones recién

preparadas con ultrasonidos de alta intensidad a pH3 y pH6 respectivamente.


178

Cuando se analizan las micrografías de las emulsiones a pH3 para ninguna emulsión

se observa gran tendencia a la formación de flóculos (Figura 4.6)

Figura 4.6.Micrografías ópticas (60 X, zoom 2,5 X) de emulsiones de HPMCs recién preparadas con USAI a pH3. (A) E4M, (B) E50LV, (C) E15LV y (D) E5LV. Barras blancas:

20 m

D C

B A

A B


179

Figura 4.7. .Micrografías ópticas (60 X, zoom 2,5 X) de emulsiones de HPMCs recién preparadas con USAI a pH6. (A) E4M, (B) E50LV, (C) E15LV y (D) E5LV. Barras blancas:

20 m.

Para las emulsiones de HPMCs preparadas a pH6, tampoco se observa una gran

tendencia a la formación de flóculos.

Para todas las emulsiones a ambos pHs, se observa una distribución de tamaño de

partículas uniforme, con baja polidispersidad, lo cual es visible en la tabla 4.3 en

comparación con la emulsiones preparadas con UT (Tabla 4.1), más polidispersas y con

distribuciones trimodales (Figura. 4.1).

4.2.2 Estabilidad frente al cremado-floculación.

Para evaluar la cinética de cremado de las emulsiones, se analizaron los perfiles de

BS% durante el almacenamiento estacionario a T ambiente.

En todas las emulsiones analizadas, se obtuvieron los perfiles de BS cada 5 minutos

durante la primera hora de preparada la emulsión. Luego cada dos horas durante los

primeros tres días y por último, cada un día.

En los estadíos iniciales de un almacenamiento estacionario y dependiendo de la

relación entre las velocidades de floculación (Vfloc) y de cremado (Vcrem), pueden

presentarse tres casos (Figura 4.8) (Palazolo, 2006; van Aken, Blijdenstein & Hotrum,

2003).

Cuando Vcrem > Vfloc se produce predominantemente la migración de las gotas

individuales. Si VcremV floc, se forman flóculos de estructura cerrada, los cuales migran

como partículas individuales de mayor tamaño. Finalmente, cuando V crem< Vfloc, se

favorece la formación de flóculos de estructura más abierta y reticular.

C D


180 0 10 20 30 40 50 60 700

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

BS

(%

)

> tiempo

(A)

Figura 4.8. Evolución estructural de emulsiones O/W para diferentes relaciones de velocidades de cremado (Vcrem) y floculación (Vfloc); a) Vcrem> Vfloc, migración de gotas individuales; b)

VcremVfloc, formación de floculos de estructura cerrada; c) Vcrem< Vfloc, formación de flóculos de estructura abierta (Palazolo, 2006; van Aken et al., 2003).

Las figuras 4.9 y 4.10 muestran los perfiles de BS (%) para las emulsiones de E4M y

E5LV preparadas con UT y USAI respectivamente.

a

b

c


181

0 10 20 30 40 50 60 700

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

BS

(%

)


> tiempo

(C)

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

BS

(%

)


> tiempo

(D)

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

BS

(%

)


> tiempo

(B) Figura 4.9. Perfiles de Backscattering (BS%) de emulsiones de HPMCs preparadas con UT

a pH3 (A,B) y pH6 (C, D) para E4M (A , C) y E5LV (B, D). Las flechas indican el avance de los perfiles en función del tiempo de almacenamiento estacionario. Se seleccionó la parte


182

0 10 20 30 40 50 60 700

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

tiempo

BS

(%

)

longitud del tubo (mm) arribaabajo

(A)

10 20 30 40 50 60 70

0

20

40

60

80

100

BS

(%

)

longitud del tubo(mm)abajo arriba

tiempo

(B)

0 10 20 30 40 50 60 700

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

BS

(%

)


> tiempo

(C)

inferior del tubo (10-20 mm) para la evaluación de la cinética de cremado-floculación. Tiempo analizado: 1-20 dias.


183

0 10 20 30 40 50 60 700

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

BS

(%)

longitud del tubo (mm)abajoarriba

> tiempo

(D)

Figura 4.10. Perfiles de Backscattering (BS%) de emulsiones de HPMCs preparadas con

USAI a pH3 (A,B) y pH6 (C, D) para E4M (A , C) y E5LV (B, D). Las flechas indican el avance de los perfiles en función del tiempo de almacenamiento estacionario. Se seleccionó la parte inferior del tubo (10-20 mm) para la evaluación de la cinética de cremado-floculación. Tiempo analizado: 1-20 dias.

En los perfiles de BS (%) para las emulsiones formadas con UT (Figura 4.9) puede

verse una gran variación en función del tiempo, siendo más notoria para E5LV,

polisacárido con menor peso molecular y menor viscosidad (tabla 1.1, materiales y

métodos). Aún cuando el tamaño de gota de las emulsiones de E4M es el mayor debido

a su mayor viscosidad, los fenómenos de cremado y floculación se ven minimizados

(McClements, 1999), ya que la velocidad con la cual se pueden mover las gotas es

mucho menor. Las emulsiones a pH3 evidencian una mayor variación en los perfiles de

BS (%), principalmente E5LV.

Los perfiles de BS(%) de las emulsiones preparadas con USAI presentan una menor

variación en función del tiempo, indicando mayor estabilidad (Palazolo, 2006).

Las constantes de la cinética de cremado-floculación (C) obtenidas para las

emulsiones preparadas con UT y USAI a ambos pHs, se muestran en la tabla 4.6. Las

mismas se obtienen de la inversa de la pendiente del grafico correspondiente a la capa

inferior de la emulsión (10-20 mm en el tubo de medida) en función del tiempo (Carrera

Sanchez y col., 2005; Chanamai y McClements, 2000). Cuando mayor es el valor de

esta constante, mayor es el grado de desestabilización en la emulsión en estudio

(Palazolo, 2006).


184

Tabla 4.6. Constantes cinéticas de cremado-floculación (C) de emulsiones de HPMCs a pH3

y pH6 preparadas con UT y USAI.

Analizando los datos se observa que existe una gran diferencia entre las emulsiones

preparadas con UT y con USAI en cuanto a la velocidad de cremado que es dos órdenes

de magnitud menor en estas últimas. Esto guarda relación con el menor tamaño de gota

obtenido por USAI. Las curvas de distribución (figura 4.2) y los valores de los

diámetros promedios obtenidos (tabla 4.3) para las emulsiones preparadas con USAI,

son muy similares entre sí e indicativo de emulsiones con baja polidispersidad. Es decir,

la población es mayoritariamente monomodal, con un tamaño de gota predominante, lo

cual fue evidenciado en las micrografías obtenidas (figura 4.7 y 4.8).

Los perfiles de BS (%) (figura 4.10), muestran poco cambio con el tiempo, en

concordancia con el tamaño de partícula obtenido para estas emulsiones.

El fenómeno de cremado y floculación presente en estas emulsiones sería debido a

la migración de las gotas individuales, donde Vcrem>Vfloc (figura 4.6) debido

principalmente a la baja tendencia a la formación de flóculas detctada por microscopía

(figuras 4.7 y 4.8).

Las emulsiones preparadas con UT, presentan mayor diferencia entre los diámetros

promedio D32 y D43 (Tabla 4.1), lo cual es indicativo de una mayor tendencia a la

desestabilización (Gu y col., 2005). También su mayor polidispersidad (tabla 4.1)

promueve el cremado y floculación.

En cuanto al efecto del pH, se observa una tendencia similar para las emulsiones

obtenidas por UT y USAI, la velocidad de cremado es mayor a pH3. Esto estaría

relacionado al mayor tamaño de gota obtenido a este pH.

La tabla 4.6 muestra además que la velocidad de cremado en las emulsiones preparadas

por UT como por USAI aumenta en el orden E5LV > E15LV> E50LV> E4M, lo cual

C x 102 (h-1) UT USAI

HPMC pH3 pH6 pH3 pH6

E5LV 340,6 291,9 ± 0,8 1,6 ± 0,1 1,0 ± 0,1

E15LV 154,2 ± 0,3 103,8± 1,0 1,4 ± 0,3 0,6 ± 0,1

E50LV 50,2 ± 1,1 43,0 ± 0,9 0,9 ± 0,2 0,6 ± 0,1

E4M 30,3 ± 1,5 27,2 ± 1,1 0,8 ± 0,1 0,4 ± 0,1


185

refleja el enorme impacto de la viscosidad de la emulsión (Tabla 4.2 y 4.4) y de la fase

continua (Tabla 2.7 y 2.8) en los fenómenos de cremado y floculación. De hecho, las

emulsiones de E4M aún teniendo un D32 mucho mayor que, por ejemplo, E5LV, crema

más lentamente por la predominancia del efecto viscoso.

4.2.3 Estabilidad frente a la coalescencia.

El párametro D43 permite estimar los procesos de coalescencia y floculación con

mayor sensibilidad. A partir de los diámetros promedio D4,3 sin y con SDS puede

determinarse el grado de floculación (GF %) y coalescencia (IC%). (Palazolo, 2006;

Relkin & Sourdet, 2005). La dilución y agitación durante la medición en el analizador

de partículas (Mastersizer 2000), disocia los flóculos formados por interacciones débiles

dejando intactos los flóculos formados por interacciones fuertes (McClements, 1999;

Palazolo, 2006).

En este contexto, es importante señalar que la presencia de flóculos no está

necesariamente relacionada con el carácter bimodal de una distribución. Por ejemplo, si

una distribución de tamaño de partícula en ausencia de SDS es monomodal no significa

la ausencia de flóculos. De la misma manera, una distribución bimodal o multimodal no

siempre indica que en la emulsión haya flóculos; los picos pueden corresponder a

distintas poblaciones de gotas individuales, las cuales se logran generalmente con

dispositivos de homogeneización de baja energía (como el Ultraturrax empleado en este

trabajo). Sólo a partir de la comparación entre las distribuciones determinadas en

ausencia y presencia de SDS es posible evaluar la existencia de flóculos. En este caso,

nuevamente hay que destacar que los flóculos detectados son estables en las condiciones

de medición (dilución y agitación) del analizador de tamaño de partícula (Palazolo,

2006). La adición de SDS previene la floculación, el SDS adsorbido le da las gotas una

carga neta negativa, lo cual previene su agregación debido a la repulsión electrostática

(Palazolo, 2006).

Las tablas 4.8 y 4.9 muestran los valores de los parámetros IC% y GF% para las

emulsiones preparadas con UT y USAI respectivamente, para E4M y E5LV como

ejemplo.


186

Tabla 4.8. Parámetros de desestabilización a partir del diámetro D43, para las emulsiones O/W de HPMCs al 2% preparadas con UT. IC%: coalescencia. GF%: grado de floculación. Máxima desviación estándar: 1%. Tiempo de análisis: a las 24 hs de almacenamiento.

pH3 inicial (m) sin SDS(m) con SDS (m) IC% GF%

E4M 52,210 56,815 52,821 31,100 8

E5LV 18,743 21,683 19,740 59,700 10

pH6 inicial (m) sin SDS(m) con SDS (m) IC% GF% E4M 25,411 28,123 25,781 27,000 9

E5LV 10,768 15,804 11,493 42,500 38

Tabla 4.9. Parámetros de desestabilización a partir del diámetro D43, para las emulsiones O/W de HPMCs al 2% preparadas con USAI. IC%: coalescencia. GF%: grado de floculación. Máxima desviación estándar: 1%. Tiempo de análisis: a las 24 hs de almacenamiento.

pH3 inicial (m) sin SDS(m) con SDS (m) IC% GF% E4M 1,531 1,581 1,553 2,200 2

E5LV 0,959 1,043 0,991 0,200 5,24

pH6 inicial (m) sin SDS(m) con SDS (m) IC% GF% E4M 1,370 1,372 1,372 0 0

E5LV 0,812 0,813 0,812 0 0,08

Puede observarse que para las emulsiones preparadas con UT a pH3 (tabla 4.8), hay a

las 24 hs un alto grado de coalescencia a las 24 hs, visible en su índice %C cercano a

30-60 %. Si bien hay floculación en estas emulsiones, el grado de floculación es menor

en comparación con la coalescencia presente. La mayor desestabilización reside en el

fenómeno de coalescencia. A pH6 el grado de floculación es similar al de las

emulsiones a pH3, pero la coalescencia se reduce enormemente (tabla 4.8). Para ambos

pHs, se aumenta la estabilidad con el aumento de la viscosidad de la fase continua

(mayor estabilidad para E4M).

La coalescencia puede también evidenciarse en el aumento del diámetro promedio D32

con el tiempo de almacenamiento hasta 25 días, a temperatura ambiente (tabla 4.10)


187

(Carrera Sanchez et al., 2005), relacionado con el tamaño promedio de todas las

partículas en la emulsión (Gu et al., 2005). El gran aumento en el D32 en las emulsiones

preparadas con UT, confirma indefectiblemente el fenómeno de coalescencia,

principalmente en las emulsiones de E5LV.

Tabla 4.10. Diámetros promedios de Sauter, D32 (m), para las emulsiones de HPMCs al 2% preparadas con UT y almacenadas a T ambiente. Desviación estándar:1%.

pH3 pH6

recién

preparada Día1 Dia5 Dia25 recién

preparada Día1 Dia5 Dia25 E4M 21,301 23,501 28,109 33,851 2,921 3,501 3,703 7,951

E5LV 1,441 2,532 10,931 28,137 1,811 2,602 5,327 9,304

Es evidente que en las emulsiones preparadas con UT, los fenómenos de

desestabilización son importantes. La coalescencia puede originarse debido a la

existencia de una población trimodal (Figura 4.1). Las gotas de mayor tamaño crecen a

expensas de las más pequeñas, debido a la ruptura del film interfacial o porque hay

zonas en la gota sin polisacárido adsorbido. La viscosidad de la fase continua es

importante en evitar que las gotas se acerquen, es por ello que las emulsiones de E4M

tienen un menor grado de coalescencia.

Se logran emulsiones más estables con USAI. La evolución del diámetro D32 para

emulsiones preparadas por USAI (Tabla 4.11), muestra que para E4M el D32

prácticamente no varía con el tiempo (25 días) mientras que lo hace ligeramente para la

emulsión de E5LV.

Tabla 4.11. Diámetros promedios de Sauter, D32 (m), para las emulsiones de HPMCs a 2% preparadas con USAI y almacenadas a T ambiente. Desviación estándar:1%.

pH3 pH6

recién

preparada Día1 Dia5 Dia25 recién

preparada Día1 Dia5 Dia25

E4M 0,804 0,834 0,830 0,883 0,798 0,718 0,771 0,773

E5LV 0,614 0,624 0,756 0,772 0,537 0,587 0,699 0,769


188

4.3 Conclusión.

La determinación de posibles correlaciones entre las características de las películas en

la interfase aceite-agua y las emulsiones O/W resulta de gran interés para un mejor

control de estos sistemas coloidales. El rol principal del agente emulsificante es reducir

la tensión interfacial en la interfase aceite-agua y formar una película interfacial que

proteja a las gotas de la coalescencia (Phillips, Whitehead & Kinsella, 1994).

En la bibliografía hay muy pocos trabajos que han abordado este tema. Dickinson,

(2001) estudió la influencia de las propiedades interfaciales en emulsiones estabilizadas

por proteínas lácteas y encontró que la reología superficial interfacial tiene gran

influencia en la estabilidad de estas emulsiones. Carrera Sanchez y col. (2005)

observaron una correlación entre la estabilidad de emulsiones de caseinato de sodio y la

presión superficial de equilibrio, el modulo dilatacional superficial, y la viscosidad

superficial.

El método de preparación tiene gran influencia sobre las características de las

emulsiones resultantes. Una mayor energía entregada al sistema permite obtener

emulsiones de menor diámetro de partícula y más estables, siempre que haya en la fase

continua suficiente emulsionante para cubrir esta mayor superficie creada. El tiempo

que tarda un emulsificante en adsorberse en la superficie de las gotas recién formadas

también es un factor determinante del tamaño de gota final en una emulsión

(McClements, 1999).

El efecto del pH parece ser bastante general para ambos métodos de preparación (UT

y USAI) en la emulsiones de HPMC.

A pH3 la asociación por interacciones hidrofóbicas se ve impedida por lo cual no se

forma una película elástica. Hay coalescencia entonces durante la formación de la

emulsión, resultando en mayores tamaños iniciales de gota que a pH6.

Durante el almacenamiento, las emulsiones a pH3 se desestabilizan más rápidamente,

principalmente las obtenidas por UT, ya que las obtenidas por USAI sólo muestran

cambios muy pequeños en el tiempo analizado. La mayor desestabilización a pH3

estaría relacionada con las características iniciales de la emulsión, es decir, mayor D32,

mayor índice de polidispersidad, menor elasticidad de la película interfacial y menor

viscosidad de las emulsiones o de la fase continua.

Con respecto al tipo de HPMC empleado, el diámetro inicial de las emusliones guarda

relación con el peso molecular y/o viscosidad de la HPMC, siendo las de menor peso


189

molecular las que generaron un menor tamaño de gota. Esta tendencia se minimiza al

utilizar USAI. Además la de menor peso molecular (E5LV) fue la HPMC que generó

películas interfaciales más elásticas por su alto grado de sustitución en grupos metilo y

bajo peso molecular que le permite un alto grado de adsorción.

Sin embargo, las HPMC de menor peso molecular presentaron mayores velocidades de

desestabilización por cremado/floculación y coalescencia reflejando la importancia de la

viscosidad de la fase continua como barrera al movimiento de las gotas de aceite

(McClements, 1999).

En conclusión, si es importante obtener un pequeño diámetro promedio, es conveniente

emplear E5LV como emulsificante, incorporando un estabilizante que aumente la

viscosidad y así enlentecer la desestabilización.

Si lo que interesa es que la emulsión sea estable en el tiempo estudiado, es conveniente

emplear a E4M como emulsificante.

CONCLUSIÓN GENERAL

Sección I

Sección I- Conclusión general

190

En esta sección se analizó el comportamiento en solución, en interfases y en emulsiones

O/W a dos pH, de distintas HPMCs con diferente peso molecular.

Los estudios realizados para caracterizar el estado de asociación/ autoensamblaje de las

HPMC, muestran que estos polisacáridos en solución presentan un comportamiento

complejo que se manifiesta en un autoensamblaje mediado por interacciones hidrofóbicas y

modulado fuertemente por el pH, como también por la concentración y la temperatura. En

particular se observa que a pH3 el autoensamblaje de HPMC se ve impedido.

El grado de asociación/autoensamblaje también puede modificarse por la aplicación de

USAI, impactando en algunas propiedades físico-químicas de las celulosas.

Las HPMC, especialmente las de bajo peso molecular, presentan una importante actividad

en la interfase aceite/ agua, la cual está modulada por el pH.

A pH ácido (pH 3) se afecta drásticamente la formación de una película interfacial

viscoelástica, reflejando el impacto del pH en el grado de autoensamblaje de las HPMC, tal

como ocurre en solución.

No obstante, debido a su buena actividad interfacial aún a pH 3, las HPMC presentan

buenas propiedades emulsificantes a ambos pH.

SECCIÓN II

Comportamiento de mezclas de

hidroxipropilmeticelulosas y

-lactoglobulina en solución,

interfases O/W y emulsiones.


191

Introducción

Las interacciones proteína – polisacárido juegan un rol significativo en la estructura

y estabilidad de muchos alimentos procesados. El control o la manipulación de estas

interacciones macromoleculares, son un factor clave para el desarrollo de nuevos

productos alimenticios (Tolstoguzov, 1997).

Las interacciones principales entre proteínas y polisacáridos son las siguientes

(McClements, 2006):

Interacciones electrostáticas: estas interacciones son importantes para

aquellos biopolímeros que tienen una carga eléctrica bajo las condiciones de

trabajo (pH y fuerza iónica). Pueden ser atractivas o repulsivas dependiendo

si las cargas de los grupos involucrados tienen signos opuestos o similares,

respectivamente.

Volúmenes de exclusión: es una interacción repulsiva que se produce debido

al gran volumen que ocupan algunos biopolímeros en solución, produciendo

un importante efecto sobre la repulsión estérica, es decir hay una reducción

en el volumen disponible a ser ocupado por una molécula de biopolímero.

Interacciones hidrofóbicas: resultan importantes estas interacciones para

aquellos biopolímeros con grupos no polares y se manifiestan por la

tendencia que poseen los grupos no polares.

Uniones hidrógeno: estas interacciones son enlaces de hidrógeno

relativamente fuertes que ocurren en biopolímeros con segmentos a lo largo

de su cadena que pueden formar estos enlaces con los segmentos de otras

moléculas.

La importancia relativa de estas interacciones en un determinado sistema depende del

tipo de biopolímero considerado (peso, molecular, densidad de carga superficial,

flexibilidad, hidrofobicidad), de la composición de la solución (pH y fuerza iónica) y de

las condiciones del medio circundante (temperatura, cizalla) (McClements, 2006).

Manipulando estos parámetros es posible controlar las interacciones entre los

biopolímeros y, entonces, crear diferentes atributos funcionales en un sistema

alimentario.

Sección II- Introducción

192

La mezcla de proteínas y polisacáridos puede originar una fase estable o dos fases

separadas, dependiendo de la naturaleza de los biopolímeros, la composición de la

solución y las condiciones del medio circundante. La interacción entre ellos es

segregativa cuando los biopolímeros se repelen mutuamente (incompatibilidad) o

asociativa cuando los biopolímeros se atraen (de Kruif y Tuinier, 2001; Tolstoguzov,

1986, 2003).

Pueden originarse cuatro tipos de sistemas que difieren en sus estructuras y

propiedades (figura 1). En un sistema de una fase, los dos biopolímeros pueden

presentarse como moléculas individuales (cosolubilidad, sistema d, la mezcla resulta

estable debido al efecto predominante de la entropía de mezclado) o como complejos

solubles distribuidos en todo el sistema (sistema a). Este último fenómeno se da en

ciertos casos de atracción electrostática.

En un sistema de dos fases, la solución se separa en dos fases bien definidas que

presentan diferente composición de cada biopolímero. Esta separación en dos fases

puede ocurrir por dos mecanismos, separación por asociación o segregativa.

En la separación por asociación (sistema b) existe una atracción fuerte entre los dos

biopolímeros que causa una asociación entre ellos (puede ser por atracción electrostática

entre moléculas de carga opuesta). Una de las fases es rica en ambos biopolímeros

mientras que la otra es diluída en ellos. La fase que contiene a los biopolímeros puede

estar coacervada o precipitada, dependiendo de la fuerza de atracción y de la naturaleza

de los biopolímeros. Este fenómeno de complejamiento es la coacervación compleja.

En la separación segregativa hay una fuerte repulsión entre los dos biopolímeros (cargas

netas similares) (sistema c y d, conocido como incompatibilidad termodinámica).

La diferencia entre el sistema c y el sistema d reside en la concentración de los

biopolímeros. A baja concentración, los dos biopolímeros están íntimamente mezclados

y forman una fase (sistema d). Cuando se excede cierta concentración de biopolímeros,

se separa en dos fases la solución con una fase rica en uno de los bipolímeros y diluída n

el otro (sistema c) (Ledward, 1994; Samant, Singhal, Kulkarni & Rege, 1993,

McClements, 2006, deKruif y Tuinier, 2001).


193

+

Figura 1. Representación esquemática de cuatro posibles sistemas obtenidos de la mezcla de soluciones de proteína y polisacárido (Tolstoguzov, 1997, McClements, 2006).

El término “compatibilidad entre biopolímeros” implica miscibilidad de diferentes

biopolímeros a nivel molecular. El proceso de mezcla de dos biopolímeros es

espontáneo si el cambio en la energía libre de Gibbs de la mezcla ̈GM¨ es negativo:

GM = HM - TSM 0

donde HM y SM son la entalpía y la entropía de mezcla, respectivamente, y T es la

temperatura absoluta.

La incompatibilidad termodinámica se presenta cuando GM 0. SM depende del

volumen molar, la forma, el tamaño, la flexibilidad y de la fracción de cada componente

en la mezcla. El cambio entrópico es levemente positivo en mezclas de polisacáridos de

largas cadenas y proteínas globulares compactas. El cambio entálpico, basado en

Solución de

proteína

Solución de

polisacárido

INTERACCIONES

ATRACTIVAS

INTERACCIONES

REPULSIVAS

Complejamiento Baja

concentración

Alta

concentración

1 fase 2 fases 2 fases 1 fase

(a) Complejo

soluble

(b) Coacervado o

precipitado

(c) incompatibilidad (d) Cosolubilidad


194

fuerzas repulsivas y atractivas será entonces determinante de la compatibilidad del

sistema. El mismo está determinado por la magnitud de varias interacciones

intermoleculares existentes en la mezcla acuosa de biopolímeros: polímero1 – solvente;

polímero2 – solvente; polímero1 – polímero1; polímero2 – polímero2 y solvente –

solvente (Schmitt, Sanchez, Desobry – Banon & Hardy, 1998; Tolstoguzov, 1997).

Formación de complejos electrostáticos (coacervación compleja)

Las interacciones macromoleculares involucradas en la formación de complejos

pueden ser de tres tipos: a) entre macroiones, b) entre grupos con cargas opuestas

(ácidos y básicos) y c) entre otros grupos disponibles de los macroiones. En el primer

caso, la carga neta, forma, tamaño y flexibilidad de las macromoléculas son

importantes, mientras que en los otros casos es importante la reactividad de los grupos

de los residuos de aminoácidos disponibles en la superficie exterior de la molécula

proteica y de las unidades de azúcares de las cadenas de los polisacáridos (Tolstoguzov,

1997).

La formación de complejos electrostáticos es usualmente un proceso reversible que

depende del pH y la fuerza iónica del medio, entre otros factores y está favorecida

cuando los componentes presentan cargas opuestas (Tolstoguzov, 1997).

Durante la formación de los complejos electrostáticos, la carga neta disminuye,

reduciéndose la hidrofilicidad y la solubilidad del complejo. Las partículas dispersas de

complejo insoluble se agregan y precipitan. Existen diversas técnicas para caracterizar

la estructura de complejos proteína - polisacárido: CD (dicroismo circular); SANS

(dispersión de neutrones en ángulos pequeños); IR (espectroscopía infrarroja); NMR

(resonancia magnética nuclear); DSC (calorimetría diferencial de barrido); DLS

(dispersión de luz).

Algunas aplicaciones industriales de complejos proteína – polisacárido son la

purificación de macromoléculas (ej. proteínas); microencapsulación, cosméticos,

farmacia y medicina; ingredientes alimenticios: sustitutos de grasas, aceites, crema,

análogos de carne, biomateriales: formación de películas comestibles,

empaquetamiento, injertos y bioprótesis en medicina (Schmitt y col., 1998). En

alimentos se aplican en la estabilización de productos lácteos procesados, inhibición de

la precipitación de proteínas (en bebidas lácteas saborizadas), recuperación de proteínas

(de plasma y lácteas), estabilización de calcio en proteínas vegetales sensibles al calcio,


195

formación de geles, concentración y purificación de proteínas, texturización de

proteínas, extrusión termoplástico (Samant y col., 1993).

Incompatibilidad termodinámica

Este fenómeno se observa en condiciones en las cuales la formación de complejos

está inhibida y se promueve la asociación entre macromoléculas del mismo tipo

(sistema c y d). La Figura 2 representa un diagrama de fases de la mezcla de soluciones

de proteína y polisacárido. La región debajo de la curva binodal, corresponde a una

única fase formada por una solución de ambos biopolímeros, mientras que la región

superior representa un sistema de dos fases.

Figura 2. Composición de fases en un sistema termodinámicamente incompatible agua- proteína-polisacárido.

La fase A, rica en proteína (Pr), contiene una fracción en peso 1w de proteína y 2w

de polisacárido (Ps). La fase B, rica en polisacárido, contiene una fracción en peso 1w

de proteína y 2w de polisacárido. El punto I corresponde a la composición global del

sistema (Pr= 1w y Ps= 2w ). La longitud de las líneas AI y BI son proporcionales a las

fracciones de los volúmenes de las fases de A y B respectivamente. Las líneas de unión

TM Curva binodal

Líneas de unión

A

B

I

Ps %p/ p

Pr %p/ p 1w

2w

2w

2w

1w

1w

PM


196

vinculan la composición de las fases coexistentes. TM y PM significan miscibilidad

total y parcial respectivamente (Dickinson & McClements, 1995).

A una concentración total de biopolímero alta (en general mayor a un 4%) las

soluciones acuosas de diferentes biopolímeros se separan en dos fases, que coexisten en

equilibrio, formándose una emulsión agua / agua, la cual presenta una tensión interfacial

muy baja, debido a la significativa co-solubilidad y a tener ambas fases el mismo

solvente (agua). Un fenómeno de limitada compatibilidad termodinámica se presenta a

bajas concentraciones, por debajo de la curva binodal, observándose una co-solubilidad

parcial. La incompatibilidad entre los biopolímeros incrementa la actividad

termodinámica, es decir la concentración efectiva y el potencial conformacional de

ambos. El potencial conformacional puede definirse como la habilidad de una proteína

para formar uniones intermoleculares que contribuyen a potenciar propiedades físico –

químicas, reológicas y estructurales (por ej. la formación de geles, estabilización de

espumas y emulsiones) (Tolstoguzov, 1993).

Usualmente existe cierto grado de asimetría en los diagramas de fase, presentándose

una diferencia de escala entre el eje de las concentraciones de proteína y de

polisacárido, siendo la concentración de la proteína en la fase A mayor que la del

polisacárido en la fase B (1w 2w ). La asimetría puede atribuirse al mayor volumen

molecular ocupado por el polisacárido expandido con respecto al componente proteico

más compacto e hidrofóbico (Tolstoguzov, 1986).

La interacción de los biopolímeros entre sí y con el solvente puede describirse

cuantitativamente por los valores del segundo coeficiente del virial (Apr-w, Apr-pr, Aps-w y

Aps-ps) y del valor de cruce del segundo coeficiente del virial (A pr-ps), según: pspsprprprprprprprpr mAmAmmRT 00 /ln , donde es el potencial químico y

mi son las concentraciones molales (una expresión análoga existe para el polisacárido).

Si Apr-ps es positivo, indica interacciones termodinámicas desfavorables. La exclusión

de las moléculas de un biopolímero del volumen de solución ocupado por las moléculas

del otro biopolímero (denotando incompatibilidad), reduce la entropía de mezcla. Si el

valor de Apr-ps es negativo, es indicativo de mutua atracción y miscibilidad,

disminuyendo (Grinberg & Tolstoguzov, 1997; Semenova, 1996; Tolstoguzov, 1997).

La incompatibilidad de los biopolímeros depende de la intensidad de las

interacciones entre ellos, entre las moléculas de cada uno consigo mismas y con el

solvente (diferencias en la hidrofilicidad de los biopolímeros). A una concentración total


197

de biopolímero moderada, la separación del sistema en dos fases depende de la carga

del biopolímero, del pH y la fuerza iónica, siendo el factor entrópico determinante en la

posibilidad de dicha separación (Alves, Antonov & Gonçalves, 1999). Otros factores

también influyen sobre la incompatibilidad, la cual puede aumentar por: i) el aumento

del peso molecular y la rigidez estructural de los biopolímeros; ii) la desnaturalización

de proteínas globulares debido al incremento de la hidrofobicidad y al tamaño de las

cadenas polipeptídicas agregadas; iii) aumento de la concentración de sales y de la

temperatura (Tolstoguzov, 1997). Los polisacáridos con estructura lineal presentan

mayor incompatibilidad que los de estructura ramificada, y disminuye la

incompatibilidad en el orden polisacáridos con grupos carboxilo neutros sulfato

(Grinberg y col., 1997). La compatibilidad termodinámica también varía por la

presencia de otros componentes como moléculas lipofílicas y de sacarosa, los cuales

presentan en general un efecto negativo y positivo respectivamente (Semenova, 1996).

Distintos métodos pueden aplicarse para determinar la incompatibilidad

termodinámica en sistemas acuosos: determinación de los segundos coeficientes del

virial por dispersión de luz, variaciones en índices de refracción, modificaciones en

termogramas obtenidos por DSC, calorimetría diferencial de mezcla (medición de la

variación entálpica por mezcla de soluciones de ambos biopolímeros) (Semenova y col.,

1999).

La incompatibilidad termodinámica presenta numerosas aplicaciones: concentración

de soluciones proteicas por “ósmosis sin membrana”, fraccionamiento de biopolímeros,

cambios en las propiedades funcionales de las macromoléculas donde la actividad

termodinámica de cada componente aumenta en la mezcla, comportándose como si

estuvieran en soluciones de mayor concentración.

CAPÍTULO 1

Caracterización de mezclas de hidroxipropilmetilcelulosa y

lactoglobulina en solución y en la interfase O/W.

Sección II- Capítulo 1.Caracterización de mezclas de HPMC y lg en solución y en interfases O/W

198

1.1 Comportamiento de soluciones mixtas de HPMCs y lg a pH3 y pH6.

Cuando se mezcla una proteína (PR) globular, como la lg, y un polisacárido (PS), la

interacción resultante depende fuertemente del pH, fuerza iónica y proporción de cada

biopolímero en la mezcla. En esta sección, se estudiaron mezclas de HPMC (E5LV) y lg a

bajas concentraciones totales (máximo 2%p/p) a pH3 y pH6.

A pH3 la proteína está cargada positivamente (pH< pI) y a pH6 negativamente. Las HPMcs

son polisacáridos no iónicos, por lo cual no se ven afectados mayoritariamente por cambios en

el pH. Sin embargo, como se mostró en el capítulo 1 de la sección I, a pH3 las HPMCs están

principalmente presentes en solución en forma monomérica y poseen una carga neta negativa

pequeña. A pH6 en cambio, presenta una pequeña carga positiva y fuerte tendencia a

autoensamblarse formando clusters.

A pH6, por encima del punto isoeléctrico (pI) de la proteína existe una limitada

compatibilidad termodinámica entre la proteína y el polisacárido, debido a interacciones de

repulsión y una afinidad diferente con el solvente (Martinez y col., 2007; Tolstoguzov, 1997).

A este pH, en la región de bajas concentraciones, la proteína y el polisacárido pueden

coexistir en una sola fase (miscibilidad) (sistema d, figura 1, Introducción Sección II) pero

en dominios en los cuales se excluyen mutuamente. Trabajos anteriores (Perez y col, 2008;

Jara y Pilosof, 2009) han mostrado que a pH6 a estas concentraciones no hay separación de

fases. A pH3 en cambio, las mezclas de HPMC y proteínas del suero lácteo son compatibles

aún a altas concentraciones (Jara y Pilosof, 2009).

La figura 1.1 muestra las curvas de distribución por intensidad de mezclas en donde el

polisacárido está presente en igual concentración que la proteína y donde uno de los dos

biopolímeros se encuentra en exceso.

Cuando se observa la distribución por intensidad de tamaños de la lg sola (figura 1.1), se

aprecia una distribución trimodal, con una población mayoritaria (I) cuyo tamaño varía entre

los 2 nm y los 10 nm, con un máximo en los 4 nm para pH3 (figura 1.1A), y a los 3 y los 15

nm, con un máximo en los 6 nm para pH6 (figura 1.1B). Estos tamaños son consistentes con

la presencia de monómeros a pH3 y dímeros a pH6 (Phillips y col., 1994; Griffin y Griffin,

1993; Harnsilawat y col., 2006; Hoffmann y van Mil, 1999; Mc Kenzie y Sawyer, 1967;

Mulvihill y Donovan, 1987).


199

0.1 1 10 100 10000

2

4

6

8

10

12

14

16

Inte

nsid

ad (

%)

tamaño (d.nm)

I

II

III

(A)

0.1 1 10 100 10000

2

4

6

8

10

12

14

16

Inte

nsi

dad

(%

)

tamaño (d.nm)

I

II

III

(B)

Figura 1.1. Distribución del tamaño de partícula por intensidad para mezclas de E5LV: lg , 1%: 1%

(鏡), 1%:0,5% (▼), 0,5%: 1% (◄) a pH3 (A) y pH6 (B). lg sola: 0,5 % (強), 1% (○). Temperatura 25°C.


200

Figura 1.2. Distribución del tamaño de partícula por volumen para cada mezclas de lg: E5LV a pH3 en comparación con los biopolímeros solos, (A) mezcla 1%:1%, (B) 0,5%:1%. (C) 1%: 0,5%. lg sola

(強), E5LV solo (峡) mezcla (◨).Temperatura 25°C.

1 10 100

tamaño (d.nm)

(B)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

Vol

um

en

(%)

(A)

1 10 1000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

Vo

lum

en

(%

)

tamaño (d.nm)

(C)


201

Figura 1.3. Distribución del tamaño de partícula por volumen para cada mezcla de lg: E5LV a pH6

en comparación con los biopolímeros solos, (A) mezcla 1%:1%, (B) 0,5%:1%.,(C) 1%: 0,5%. lg sola

(強), E5LV solo (峡) mezcla (◨).Temperatura 25°C.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

volu

men (

%)

(A)

1 10 1000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

vo

lum

en (

%)

tamaño (d.nm)

(C)1 10 100

tamaño (d.nm)

(B)


202

Hay que tener en cuenta, que al ser una población con una amplia distribución de tamaños,

también se encuentran en menor proporción agregados de lg de mayor tamaño. En la

bibliografía se han encontrado la presencia de agregados a estos pH (Bauer y col., 1998;

Verheul y col., 1998).

En las mezclas con HPMC a ambos pH, se observa que el pico correspondiente a la lg se

hace menor con respecto a la intensidad de la luz dispersada y aparecen poblaciones entre los

20 nm y 800 nm (población II y III, figura 1.1), ausentes o presentes en menor proporción en

la solución de proteína sola (figura 1.1).

Al analizar las curvas de distribución por volumen (figura 1.2 y figura 1.3), se observa que los

agregados II y III no representan gran proporción con respecto a la población total de

partículas, ya que no están presentes en la distribución por volumen de las mezclas, son

despreciables cuantitativamente. La mayoría de las partículas se encuentran por debajo de los

100 nm.

En la figura 1.2 se muestra la distribución de tamaños de partícula por volumen para cada

mezcla en comparación con los componentes solos a pH3. En las mezclas lg:E5LV 0,5%/1%

y 1%/0,5% (figuras 1.3B y C) se observa claramente que los picos correspondientes a E5LV

monomérico no están presentes en la mezcla así como tampoco parte del pico correspondiente

a la lg sola, desplazándose la curva de las mezclas hacia tamaños mayores. En todos los

casos se observa la desaparición de las formas autoensambladas de E5LV (pico de mayor

tamaño en la distribución de E5LV solo).

La figura 1.3 muestra la comparación entre las distribuciones de las mezclas y los

componentes solos a pH6. A este pH predomina la forma dimérica de la lg mientras que

E5LV está presente en formas autoensambladas (capítulo 1, sección I).

La curva de distribución de tamaños para las mezclas se sitúa en todos los casos entre las de

los componentes solos, lo cual en principio indicaría la ausencia de interacciones.

En el capítulo 1 de la sección I, se analizó el coeficiente de difusión molecular (D) calculado

por DLS. Este coeficiente relaciona la movilidad de las moléculas en el seno de la solución y

está directamente relacionado con el tamaño molecular. Un menor valor en D, indica una

menor difusión en la solución, relacionado con un aumento en el tamaño molecular.


203

En la figura 1.4 se muestran en forma comparativa los coeficientes de difusión (D) de los

componentes solos y las mezclas a pH3. Salvo en el caso de la mezcla lg:E5LV 1%:1%

donde el valor de D se acerca a un promedio aritmético, en las otras mezclas el valor de D es

mucho menor a lo esperado si no existieran interacciones, lo cual indica la formación de

partículas más grandes a expensas de las partículas más pequeñas (lg y E5LV

monoméricos).

A pH6 (figura 1.5) sólo se observa una tendencia a la formación de partículas de mayor

tamaño (menor D) en la mezcla lg: E5LV 0,5%:1%. En los otros casos el valor de D de las

mezclas presenta un comportamiento intermedio a los componentes solos.

Figura 1.4. Coeficientes de difusión, D (m2/s) para mezclas de lg: E5LV a pH3. M: mezcla. (….)

lg1%, E5LV1%, M: 1%:1%.(峡) lg0,5%, E5LV1%, M: 0,5%:1%. (//) lg 1%, E5LV0,5%, M: 1%:0,5%. Desviación estándar máxima: 0,5%.

Dos posibles fenómenos podrían explicar los resultados anteriores:

(a) La formación de complejos entre la lg y E5LV.

(b) La agregación de la lg debido a la presencia del polisacárido, producto de una

limitada compatibilidad termodinámica entre ambos biopolímeros.

Dado el carácter no iónico de las HPMC, la formación de complejos electrostáticos no debería

ser muy factible. Sin embargo a pH3 se evidencia un complejamiento que podría ocurrir por

lg E5LV M lg E5LV M lg E5LV M0

10

20

30

40

D ( m

2 /s)

lg E5LV M lg E5LV M lg E5LV M


204

interacción de la lg cargada positivamente con la HPMC que presenta una ligera carga

negativa. A pH6 los resultados de DLS no arrojan una evidencia de complejamiento.

Figura 1.5. Coeficientes de difusión, D (m2/s) para mezclas de lg: E5LV a pH6. M: mezcla. (….)

lg1%, E5LV1%, M: 1%:1%.(峡) lg 0,5%, E5LV1%, M: 0,5%:1%. (//) lg 1%, E5LV0,5%, M: 1%:0,5%. Desviación estándar máxima: 0,5%.

Pérez y col., (2007) al estudiar la interacción entre concentrado de suero lácteo y HPMC,

sostienen que el fenómeno de formación de complejos entre la proteína y el polisacárido es

menos probable a pH6 por estar la proteína por encima de su punto isoeléctrico.

Martínez y col (2007) y Tolstoguzov (1997) afirman que por encima del punto isoeléctrico de

la proteína, existe una limitada compatibilidad termodinámica con el polisacárido debido a

diferentes afinidades de los biopolímeros por el solvente.

Para comprobar la afirmación anterior, se midió también el potencial zeta en la mezcla de

E5LV 1% + lg 1% como ejemplo y se lo comparó con la carga neta superficial obtenida para

los biopolímeros solos a ambos pHs. Los resultados se muestran en la tabla 1.1.

McClements y col., (2008) emplearon esta técnica para verificar la interacción entre lg y

pectinas a distintos pH y concentraciones.

lg E5LV M lg E5LV lg E5LV 0

10

20

30

40D

(m

2 /s)

lg E5LV M lg E5LV M lg E5LV M


205

Gu y col., (2005) al estudiar la influencia del pH en la interacción entre carragenanos y lg

en emulsiones, también emplearon la técnica de potencial zeta para corroborar el grado de

interacción entre los biopolímeros.

Tabla 1.1. Potencial zeta determinado en soluciones de lg y en mezclas con E5LV.

potencial zeta (mV)

pH3 pH6

lg 1% 9,33 0.10 -10.60 0.08 E5LV 1% -1,71 0.05 0,78 0.10

lg 1% /E5LV 1% 7,49 0.10 -10.30 0.05

Puede observarse que la proteína presenta carga positiva a pH3, lo cual hace posible el

complejamiento con la HPMC que presenta carga neta negativa a este pH.

En la mezcla analizada el valor del potencial se hace menor al de la proteína sola, por lo tanto

puede inducirse que ocurre interacción electrostática entre ambos biopolímeros.

A pH6 no hay cambios apreciables en el valor del potencial zeta en la mezcla. Por lo que

tanto la proteína y el polisacárido estarían presentes en la mezcla en dominios en los cuales

ambos polímeros se excluyen mutuamente debido a una limitada compatibilidad

termodinámica.

Samant y col., (1993) sostienen que cuando más cerca se está del punto isoeléctrico de la

proteína (en este caso sería pH6), se observa que disminuye la compatibilidad termodinámica

de la proteína con un polisacárido neutro (como es el caso de las HPMC en el presente

trabajo).

Ganzevles y col., (2007) encontraron que un aumento en el radio hidrodinámico como

también una reducción en la carga neta negativa eran indicativos de la formación de

complejos entre lg y pululanos a pH 4,5 (pH<pI).

Jara y Pilosof (2009) al estudiar la interacción entre HPMC y WPC (concentrado de suero

lácteo) por microscopia confocal y por DSC, encontraron que a pH 3 las mezclas presentaban

una sola Tg indicando que son compatibles aún a mayores concentraciones que las de este

trabajo. Esto pudo ser comprobado por microscopía confocal donde también, tanto la proteína

como el polisacárido se encuentran en una fase. A pH6 se observaron dos Tg indicando que


206

ambos biopolímeros coexisten en fases separadas, aún sin separación macroscópica. Lo

mismo pudo verse en las imágenes microscópicas.

1.2 Comportamiento de mezclas de HPMCs y lg en la interfase aceite- agua.

1.2.1 Dinámica de adsorción y características viscoelásticas de las películas a pH6.

El estudio de la interacción entre proteínas y polisacáridos a nivel interfacial es de gran

importancia dado la implicancia directa en las propiedades de emulsificación, como se analizó

para el caso de las emulsiones estabilizadas sólo por HPMCs (capítulo 4).

Como la lg y también la HPMC poseen actividad interfacial, ambos competirán por la

interfase.

Las figuras 1.6 y 1.7 muestran la evolución de la presión interfacial en función del tiempo de

adsorción para mezclas de E5LV y lg a pH6. Las concentraciones de cada biopolímero son

capaces de saturar la interfase O/W (Pérez y col., 2007).

La dependencia de la presión interfacial con el tiempo, mostró que la adsorción en la

interface aceite- agua comienza con una rápida difusión de los biopolímeros a la interfase.

A pH6 en las mezclas de 0.5%/0.5% (Figura 1.6A) y 1%/1% (Figura 1.6B), la actividad

interfacial es dominada por la HPMC en los primeros instantes (t2000s). Luego, la actividad

de la mezcla presenta comportamiento similar al de くlg sola, indicando que la HPMC es

desplazada de la interfase.

En la mezcla de 2%/2% (Figura 1.6 C), existe un efecto ligeramente sinérgico entre los dos

biopolímeros en todo el rango de tiempo estudiado, con predominio de la くlg en la interfase

O/W.


207

Figura 1.6. Presión interfacial en función del tiempo de adsorción para mezclas en igual

concentración de lg y E5LV en la interfase aceite-agua a pH6. (A) mezclas de 0,5% de cada biopolímero. (B) mezclas de 1% de cada biopolímero (C) mezclas de 2% de cada biopolímero (D)

comparación distintas mezclas. E5LV (峡) y lg (強).mezclas de lg y E5LV (◨). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.

Es decir, en todos los casos la proteína predomina en la interfase O/W. Según Graham y

Phillips (1979), hay mayor desplegamiento de la lg (proteína globular) en la interfase O/W,

con mayor exposición de los grupos hidrofóbicos antes ocultos desarrollando una mayor

presión superficial que en la interfase aire-agua.

Se ha informado anteriormente que la lg presenta una menor actividad interfacial que las

HPMCs la interfase A/W. Tal es el caso de Pérez y col. (2007) al estudiar la adsorción de

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

(mN

/m)

(mN

/m)

(A)

(mN

/m)

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000 2000 4000 6000 8000 10000 120000 2000 4000 6000 8000 10000 12000

tiempo (s)

(B)

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

(mN

/m)

tiempo(s)

(C)


208

mezclas de distintas HPMC con concentrado de proteínas del suero lácteo. Martinez y col.

(2007) también llegaron a la misma conclusión al estudiar la adsorción de proteínas de soja

con distintos polisacáridos, entre ellos HPMC.

En el presente trabajo, la fase hidrofóbica la constituye el aceite y previamente se ha discutido

(capítulo 3, sección I) que es un mejor solvente para los grupos hidrofóbicos de los

biopolímeros. Entonces, es de esperarse un mayor desplegamiento de esta proteína globular

con una mayor presión superficial en la interfase O/W que en la interfase A/W. Por otro lado

se ha mostrado en la sección I que las HPMCs son menos activas en la interfase O/W que en

A/W.

El efecto sinérgico obtenido para las mezclas al 2% (Figura 1.4C) podría deberse a la

limitada compatibilidad termodinámica entre ambos biopolímeros que prevalece cuando

mayor es la concentración (Pérez et al., 2007).

Cuando se analiza la adsorción en la interfase O/W de mezclas de lg y E5LV en distinta

concentración, se obtienen resultados similares (figura 1.7), es decir, la presión de la mezcla

es dominada por la くlg.

Los resultados en ambos casos indican que la proteína desplaza al polisacárido de la

interface aceite- agua a tiempos superiores a 2000s, aún cuando la misma esté presente en la

mezcla a menor concentración que la HPMC.

Figura 1.7. Presión interfacial en función del tiempo de adsorción para mezclas en distinta

concentración de lg y E5LV en la interfase aceite-agua a pH6. (A) mezclas de lg 1% +E5LV 0,5%

0 2000 4000 6000 8000 10000 1200002468

1012141618202224262830

(mN

/m)

tiempo (s)

(A)

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000tiempo(s)

(B)


209

(B) mezclas de lg 0,5% + E5LV 1%. E5LV (峡) y lg (強).mezclas de lg y E5LV (◨). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.

La figura 1.8 muestra la evolución con el tiempo del módulo elástico dilatacional (Ed) para

las mezclas de E5LV y lg a pH6.

Figura 1.8. Evolución del módulo elástico dilatacional, Ed, con el tiempo de adsorción a pH6 para

mezclas de lg y E5LV (◨), (A) 0,5%:0,5%, (B) 1%: 1%, (C) 0,5%:1% (D) 1%: 0,5%. En todos los

casos, se compara con los componentes solos. E5LV (峡) y lg (強). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

Ed(

mN

/m)

Ed(

mN

/m)

tiempo(s)

Ed(

mN

/m)

(A)

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

0

5

10

15

20

25

30

35

Ed

(mN

/m)

Ed

(mN

/m)

tiempo (s)

(B)

0 2000 4000 6000 8000 100000

5

10

15

20

25

30

35

0 2000 4000 6000 8000 100000

5

10

15

20

25

30

35

0 2000 4000 6000 8000 100000

5

10

15

20

25

30

35

Ed(

mN

/m)

(C)

tiempo(s)

0 2000 4000 6000 8000 100000

5

10

15

20

25

30

35

0 2000 4000 6000 8000 100000

5

10

15

20

25

30

35

0 2000 4000 6000 8000 100000

5

10

15

20

25

30

35

Ed

(mN

/m)

tiempo(s)

(D)


210

La lg sola forma películas muy elásticas aún a tiempos muy cortos de adsorción (t< 200s)

llegando a tiempos largos a valores de Ed entre los 25 y 35 mN/m, dependiendo de la

concentración en el seno de la solución. Por otro lado, E5Lv forma películas de muy baja

elasticidad (Ed 5-7 mN/m) dependiendo de la concentración.

El comportamiento de las películas mixtas muestra un mayor predominio de la proteína en el

carácter elástico de la película a tiempos largos de adsorción. La lg tiene mayor actividad

superficial (figuras 1.6 y 1.7) y mucho mayor carácter elástico en comparación con el

polisacárido, por lo tanto domina la interfase a este pH.

La evolución en la estructura de las películas interfaciales determinada mediante la

evolución de la viscoelasticidad relativa de la película (tg ) se muestra en la Figura 1.9 para

pH6.

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(A)

tg

tiempo (s)0 2000 4000 6000 8000 10000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 2000 4000 6000 8000 100000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 2000 4000 6000 8000 100000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

tiempo(s)

(B)

tg


211

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

tg

tiempo (s)

(D)

Figura 1.7. Evolución de la viscoelasticidad dilatacional, tg , con el tiempo de adsorción a pH6 para

mezclas de lg y E5LV (◨), (A) 0,5%:0,5%, (B) 1%: 1%, (C) 0,5%:1% (D) 1%: 0,5%. En todos los

casos, se compara con los componentes solos. E5LV (峡) y lg (強). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.

Puede verse que en todos los casos, el carácter viscoelástico de las películas en las mezclas

está dominado por la proteína, con carácter tipo gel (tg < 0,2).

Martinez, Carrera Sanchez, Pizones Ruiz-Henestrosa, Rodríguez Patino y Pilosof (2007) y

Pérez, Carrera-Sánchez, Rodríguez-Patino y Pilosof (2007) encontraron que tanto el carácter

sólido de la película como su viscoelasticidad relativa, estaban dominadas por la HPMC y no

por la proteína, principalmente antes de los 8000 s de adsorción. Como se discutió

previamente, la fase aceite ofrece mejor solvatación que la fase aire para los grupos

hidrofóbicos de la proteína globular. Esto le permite desarrollar mayor carácter elástico (Ed) y

mayor carácter gel que en la interfase aire, incluso muy por encima de los valores obtenidos

por el polisacárido (figuras 1.6, 1.7, 1.8 y 1.9).

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

tiempo (s)

(C)

tg


212

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

(mN

/m)

(C)

(mN

/m)

tiempo(s)

(mN

/m)

1.2.2 Dinámica de adsorción y características viscoelásticas de las películas a pH3.

La figura 1.10 muestra la evolución de la presión interfacial en función del tiempo de

adsorción para mezclas de E5LV y lg a pH3.

Figura1.10. Presión interfacial en función del tiempo de adsorción para mezclas de lg y E5LV en la

interfase aceite-agua a pH3. (A) mezclas de 1% de cada biopolímero (B) mezclas de lg 1% + E5LV

0,5%. (B) mezclas de lg 0,5% + E5LV 1%. E5LV (峡) y lg (強).mezclas de lg y E5LV (◨). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.

Al igual que a pH6, analizando los componentes solos a pH3, el polisacárido presenta menor

presión superficial que la lg en todas las concentraciones estudiadas (Figuras 1.10). Sin

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

(mN

/m)

tiempo(s)

(A)

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

(B)

(mN

/m)

tiempo(s)


213

embargo a este pH la lg domina la presión interfacial sólo en el sistema 1%:1%. En las otras

mezclas domina E5LV.

Como se discutió previamente, tanto la proteína como el polisacárido, se encuentran en

solución en forma monomérica mayoritariamente a pH3 y posiblemente interactúen

electrostáticamente (formación complejos) debido a sus cargas netas opuestas, lo cual se

evidenció en las mediciones de potencial zeta (tabla 1.1) y en la distribución de tamaños de

partícula.

El complejamiento de estos biopolímeros, tendría efectos antagónicos sobre la adsorción de la

lg en la mezcla, impidiendo que la misma domine la interfase en los sistemas mixtos.

La figura 1.11 muestra la evolución con el tiempo del módulo elástico dilatacional (Ed)

para las mezclas de E5LV y lg a pH3.

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ed(

mN

/m)

(A)

Ed(

mN

/m)

tiempo(s)

Ed(

mN

/m)

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ed(

mN

/m)

tiempo(s)

(B)

Ed(

mN

/m)

Ed(

mN

/m)


214

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

tiempo (s)

(B)

tg

Figura 1.11. Evolución del módulo elástico dilatacional, Ed, con el tiempo de adsorción a pH3 para

mezclas de lg y E5LV (◨), (A) 1%: 1%, (B) 0,5%:1% (C) 1%: 0,5%. En todos los casos, se compara

con los componentes solos. E5LV (峡) y lg (強). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.

Para todas las mezclas, se obtiene un módulo elástico con valor igual al polisacárido (figura

1.11C) o entre el valor de los biopolímeros solos (figura 1.11 A y B).

La evolución en la estructura de la película de las mezclas, se observa también en la

viscoelasticidad relativa de la película (tg ) en la Figura 1.12.

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ed

(mN

/m)

tiempo(s)

(C)

Ed

(mN

/m)

Ed

(mN

/m)

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

tiempo(s)

tg

(A)


215

Figura 1.12. Evolución de la viscoelasticidad dilatacional, tg , con el tiempo de adsorción a pH3 para

mezclas de lg y E5LV (◨), (A) 1%: 1%, (B) 0,5%:1% (C) 1%: 0,5%. En todos los casos, se compara

con los componentes solos. E5LV (峡) y lg (強). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.

Los valores indican que en las mezclas 1%:1% y 0,5%:1% se forman películas

viscoelásticas (tg 0,3) (figura 1.10 A y B). En la mezcla de lg/E5LV 1%/0,5% se forma

una película viscoelástica (tg <1) en los primeros tiempos de adsorción (t< 4000 s), luego

la viscoelasticidad relativa revela que las mezclas tienen poca estructura de gel (tg

figura 1.12Cen forma similar al polisacárido solo.

1.3 Conclusión.

Los resultados obtenidos a pH6 indican que tanto la presión interfacial como el carácter

elástico de la película interfacial en las mezclas (Ed), son dominados por la proteína la cual

guarda relación con que la lg es más activa interfacialmente y forma películas muy elásticas

(valores altos de Ed) que impediría la adsorción del polisacárido.

0 2000 4000 6000 8000 100000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

tg

tiempo(s)

(C)


216

A este pH en trabajos previos (Jara y col, 2009; Perez y col, 2008) se ha reportado que

existe incompatibilidad entre las HPMC y la lg, que se manifiesta a altas concentraciones

como una separación de fases.

En las concentraciones estudiadas en el presente trabajo, no se observó una separación

macroscópica de fases, no obstante existe un fenómeno de exclusión a nivel molecular.

Los resultados de DLS, avalan esta situación ya que no se observan la aparición de partículas

de mayor tamaño en las mezclas (por ejemplo, debido a la formación de complejos) (figura

1.3).

A pH3 se observa otra interacción entre los biopolímeros. Si bien la lg presenta mayor

actividad interfacial y forma películas interfaciales muy elásticas, en ningún caso domina el

comportamiento interfacial como lo hace a pH 6. La presión interfacial como el carácter

elástico de la película interfacial, se ven influenciados por la presencia del polisacárido en la

mezcla (figuras 1.10 y 1.11).

En general, lo que se observa a pH3 es que la presencia del polisacárido en la mezcla, inhibe a

la lg en la formación de una película elástica. Puede verse en la mezcla 1%:0,5% que el

pobre carácter elástico de la mezcla está determinado por el polisacárido, aún cuando la

proteína puede formar películas muy elásticas (alto valor de Ed). Es decir, la proteína ve

impedida su interacción en la interfase aceite-agua.

Este comportamiento altamente antagónico se observa también en la siguiente figura para

mezclas 0,5%:0,5%.

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

tiempo(s)

(mN

/m)


217

Presión interfacial en función del tiempo de adsorción .E5LV (峡) y lg (強).mezclas de lg y E5LV

(◨). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.

Puede verse que tanto la presión superficial como el carácter elástico de la película, están

dominados por el polisacárido en la mezcla.

Este comportamiento puede ser atribuido a la formación de complejos entre ambos biopolímeros lo

cual bloquearía las regiones de la proteína que pueden interactuar en la formación de una película

interfacial elástica (formación de geles). El antagonismo parece ser máximo cuando E5LV se

encuentra a 0,5% en la mezcla, lo cual puede estar relacionado al predominio de la forma monomérica,

mayormente en las concentraciones menores (capítulo 1, sección I), que sería la que interactúa con la

lg.

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 2000 4000 6000 8000 10000 120000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ed(

mN

/m)

Ed(

mN

/m)

Ed(

mN

/m)

tiempo (s)

CAPÍTULO 2

Comportamiento de mezclas de hidroxipropilmetilcelulosas

y β−lactoglobulina en emulsiones O/W.

Sección II- Capítulo 2.Comportamiento de mezclas de HPMC y βlg en emulsiones O/W

218

0.01 0.1 1 10 1000

2

4

6

8

10

Volu

men

(%

)

tamaño (μm)

I

II

2.1. Características iniciales de las emulsiones de mezclas de E5LV y βlg.

En este capítulo, se estudió principalmente el efecto del pH (3 o 6) en las propiedades

de emulsiones O/W 10/90 respectivamente, formadas a partir de mezclas de βlg 1%: E5LV

1%, siendo la concentración total de biopolímeros 2%.

Se ha mostrado anteriormente que el pH tiene un alto impacto en el estado de asociación

de las HPMCs y en su interacción con la βlg, afectando el comportamiento interfacial.

En la figura 2.1 se muestra la distribución de tamaños de gotas para las emulsiones O/W,

preparadas con USAI a pH3 y pH6.

Figura 2.1. Distribución del tamaño de gota por volumen (%) para emulsiones O/W de βlg 1% +

E5LV 1% a pH3 (■) y pH6 (●)

Las curvas de distribución de gotas para ambas emulsiones son similares, con una

distribución bimodal, indicando que son emulsiones polidispersas. El tamaño de gotas está

comprendido entre 0,1 μm y 5 μm para pH3 y 0,1 μm y 6 μm para pH6.

La población II es mayoritaria en volumen, aunque cuando se analiza la distribución en

número (no mostrada), ésta representa sólo una pequeña proporción, indicando que

Comportamiento de HPMC y sus mezclas con βlg en solución, interfases y emulsiones

219

contribuye significativamente al volumen total de la fase dispersa pero no al área creada

durante el tratamiento con USAI.

Como se analizó en la sección I, los fenómenos de desestabilización, principalmente el

cremado y la coalescencia, están gobernados por la presencia de gotas de mayor tamaño,

aún cuando están presentes en un pequeño porcentaje con respecto al número total de gotas.

Cuando mayor sea el tamaño de gotas en una emulsión, serán más propensas a la

coalescencia inducida por colisión. Las fuerzas de impacto que se generan y la magnitud de

las mismas durante una colisión, se hacen mayores con el aumento del tamaño de las gotas

(McClements, 1999).


específica creada para las emulsiones de mezclas de E5LV 1% y βlg 1% recién preparadas.

Tabla 2.1 Diámetros promedios de Sauter (D3,2), de De Brouker (D4,3), polidispersidad y área

específica interfacial (SSA) de las emulsiones de mezclas de E5LV y βlg a ambos pHs. Desviación

estándar máxima: 5%.

Puede observarse que se obtienen mayores diámetros promedio a pH6. El área superficial

específica creada fue mayor cuando menor es el valor de D32 (Carrera Sanchez &

Rodriguez Patino, 2005).

Los D43, que están relacionados con los fenómenos de desestabilización, y la

polidispersidad fueron mayores para las emulsiones a pH6. Esto puede verse reflejado en

las curvas de distribución (Figura 2.1), donde las emulsiones de pH6 presentan una mayor

proporción de gotas entre los 5 μm y los 6 μm.

En el capítulo 1, se indicó que a pH6 la proteína y el polisacárido están presentes en la

mezclas en dominios en los cuales se excluyen mutuamente debido a una limitada

compatibilidad termodinámica.

D32 (μm) D43 (μm) polidispersidad AIE (m2/g)

pH3 0,672 1,338 1,952 8,930

pH6 0,711 1,463 2,047 8,440


220

Cuando se analiza la carga superficial de las gotas de las emulsiones a pH3 y pH6, se

obtiene la misma tendencia observada en las soluciones de βlg sola. Cabe recordar que las

HPMC presentan una carga neta superficial cercana a cero (capítulo 1, sección I), por lo

tanto la carga neta de las emulsiones estaría principalmente gobernada por la carga neta de

la proteína (Tabla 2.2). Sin embargo a pH3, debido a la presencia de una carga negativa en

E5LV y al complejamiento con la proteína el potencial zeta positivo de la mezcla se ve

reducido.

Tabla 2.2. Potencial zeta determinado en emulsiones de mezclas de E5LV 1% y βlg 1% a pH3

y pH6. Desviación estándar máxima: 5%.

pH3 pH6

βlg 1% 11,80± 0.10 -11,40± 0.08

E5LV 1% -1,71± 0.05 0,78± 0.10

E5LV 1%+βlg 1% 8,83± 0.10 -11,30± 0.10

Como se discutió en el capítulo 4, en una microscopía óptica las gotas que se observan

con mayor facilidad son aquellas de mayor tamaño, las cuales dominan el proceso de

cremado. Sin embargo debe tenerse en cuenta que no son las mayoritarias en número y por

lo tanto las micrografías nos brindan una información parcial de la microestructura de las

emulsiones. Lo que puede verse claramente es si las gotas visibles están o no floculadas y

las características de los flóculos formados (Palazolo, 2006).

La figura 2.2 muestra las micrografías obtenidas para las emulsiones recién preparadas

de las mezclas de E5LV 1% y βlg 1%.

En las imágenes microscópicas, puede evidenciarse el alto grado de floculación presente

en las emulsiones a pH6, mientras que a pH3 (Figura 2.2A) las gotas están distribuidas en

forma más uniforme.

A pH3, la reología de la película interfacial revela que ambos biopolímeros están presentes

en la interfase cuando la relación entre βlg y E5LV es 1%/1% (Capítulo 1, sección II). Por

ello, no existiría una adsorción preferencial a esta relación de E5LV y βlg. A este pH la

mezcla no evidenció incompatibilidad termodinámica y como se mostró (capítulo 1,

sección II) predomina la formación de complejos.


221

Jourdain y col., (2008) al estudiar la estabilización de emulsiones O/W con caseinato de

sodio y dextranos, sostienen que en los casos que existe complejamiento entre los

biopolímeros, la emulsión resultante es estable (no ocurre floculación) si la concentración

del polisacárido supera 1%. Tal es el caso de las emulsiones analizadas en el presente

trabajo a pH3 (figura 2.2A).

A pH6 los estudios interfaciales mostraron que la presión interfacial, el carácter elástico de

la película, y la viscoelasticidad relativa (capítulo 1, sección II) están dominados por la βlg,

lo cual indica que se adsorbe mayoritariamente quedando E5LV en la fase continua.

Figura 2.2. Micrografías ópticas (60 X, zoom 2,5 X) de emulsiones de mezclas de E5LV 1% y βlg

1%HPMCs recién preparadas con USAI a (A) pH3 y (B) pH6. Barras blancas: 20 μm.

Según se reporta en la bibliografía, los hidrocoloides localizados en la fase continua de la

emulsión, pueden inducir la desestabilización de la emulsión por el mecanismo de

floculación por depleción (depletion flocculation en inglés) (Dickinson, 1995, Dickinson y

Euston, 1991, Dickinson, 2003, McClements, 1999). Este fenómeno ocurre cuando dos

gotas se acercan de tal manera que el espacio entre ellas es menor al volumen

hidrodinámico más estable del polisacárido en la fase continua. La exclusión del

(A) (B)


222

polisacárido del espacio entre las gotas está asociada a la tendencia del solvente a fluir del

espacio entre las gotas debido a un gradiente de presión osmótica (Napper, 1983,

Dickinson, 2003). Esta fuerza atractiva entre la gotas se hace mayor cuando se incrementa

la concentración de los biopolímeros (Aronson, 1991; Dickinson y Golding, 1997,

McClements, 1999).

Cuando la concentración del polisacárido es alta (1%), la emulsión se desestabiliza por un

rápido cremado y separación de fases con un alto grado de floculación por depleción

(Dickinson, 2003).

Este fenómeno explica lo observado en la emulsión a pH6 (figura 2.2B).

En la bibliografía existen numerosos estudios en emulsiones que indican que numeros

polisacáridos no adsorbidos (hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, dextrano, goma

xántica) provocan floculación pos depleción (Radford y Dickinson, 2004).

2.2 Estabilidad de las emulsiones frente al almacenamiento estacionario a

temperatura ambiente.

2.2.1 Estabilidad frente al cremado-floculación.

Se evaluó la estabilidad al cremado /floculación mediante el análisis de los perfiles de

BS% durante el almacenamiento estacionario a temperatura ambiente.

Se obtuvieron los perfiles para las emulsiones de las mezclas de E5LV 1% +βlg 1% cada

5 minutos durante la primera hora de preparada la emulsión. Luego cada dos horas durante

los primeros tres días y por último, cada un día. La figura 2.3 muestra los perfiles de BS%

obtenidos para las emulsiones a pH3 (A) y pH6 (B).

En los perfiles obtenidos puede verse reflejado el alto grado de floculación presente en las

emulsiones a pH6, evidenciado en las imágenes microscópicas (Figura 2.2). La exclusión

entre ambos biopolímeros presente a este pH, permite que las gotas se acerquen y favorece

este fenómeno de desestabilización.

Los perfiles de BS(%) de las emulsiones a pH3 presentan una menor variación en función

del tiempo, indicando mayor estabilidad.


223

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

BS

(%

)longitud del tubo (mm)abajo arriba

> tiempo

(B)

10 20 30 40 50 60 70

0

20

40

60

80

100

BS

(%

)

longitud del tubo(mm)abajo arriba

> tiempo

(A)

Figura 2.3. Perfiles de Backscattering (BS%) de emulsiones de mezclas de E5LV 1% y βlg 1%

a pH3 (A) y pH6 (B). Las flechas indican el avance de los perfiles en función del tiempo de

almacenamiento estacionario. Se seleccionó la parte inferior del tubo (10-20 mm) para la evaluación

de la cinética de cremado-floculación. Tiempo analizado: 1-20 dias.

Las constantes de la cinética de cremado-floculación (C) obtenidas para estas emulsiones

a ambos pHs, fueron 0,108 ± 0,001 a pH3 y 2,542 ± 0,003 a pH6.

Se observa que la velocidad de cremado es dos órdenes de magnitud menor para la

emulsión preparada a pH3. Esto guarda relación con lo observado en las imágenes

microscópicas pero no con el valor de los diámetros promedio obtenidos en la emulsión

recién preparada (Tabla 1.1). Si bien el valor de D43 es ligeramente mayor a pH6, no refleja

el grado de floculación presente (Figura 2.2). Es lógico suponer, entonces, que los flóculos

formados son debido a interacciones débiles, ya que son fácilmente disociados por la

agitación durante la medición del tamaño de partícula en el Mastersizer 2000. La medición

en el Turbiscan es no invasiva y no destructiva por lo tanto es posible evidenciar la

presencia de estos flóculos al igual que en las imágenes microscópicas (Palazolo, 2006).

El fenómeno de cremado y floculación presente en estas emulsiones a pH6 sería debido

a la migración de flóculos a causa de la exclusión entre ambos biopolímeros, siendo Vfloc

>Vcrem (Figura 4.8, capítulo 4, sección I).


224

2.2.2 Estabilidad frente a la coalescencia.

Como se analizó en el capítulo 4, el diámetro D43 permite estimar los procesos de

coalescencia y floculación con mayor sensibilidad.

La tabla 6.4 muestran los valores de los parámetros IC% y GF% para las emulsiones de

mezclas de E5LV 1% y βlg 1% a ambos pHs.

Tabla 2.3. Parámetros de desestabilización a partir del diámetro D43, para las emulsiones de

mezclas de E5LV 1% y βlg 1% a pH3 y pH6. C%: coalescencia. GF%: grado de floculación.

Máxima desviación estándar: 1%. Tiempo de análisis: 24 hs.

E5LV 1%+βlg 1% inicial (μm) sin SDS(μm) con SDS (μm) C% GF%

pH3 1,367 1,576 1,437 2,43 2,03

pH6 2,053 2,875 2,134 2,54 4,53

Según los resultados anteriores, no hay un grado de coalescencia significativo a las 24 hs

a ambos pH. El hecho de que no haya grandes diferencias cuando las determinaciones se

realizaron en presencia de SDS, no es indicativo de la ausencia de flóculos, como se discutió

previamente, el SDS disocia las interacciones hidrofóbicas.

La coalescencia también puede evidenciarse en el aumento del diámetro promedio D32 con

el tiempo de almacenamiento a temperatura ambiente (tabla 2.4) (Carrera Sánchez y col.,

2005), relacionado con el tamaño promedio de todas las partículas en la emulsión (Gu,

Decker & McClements, 2005).

La poca variación en el D32 en las emulsiones a ambos pHs durante 25 dias de

almacenamiento, confirma el bajo grado de coalescencia de ambas emulsiones. Sin

embargo el aumento porcentual en D32 fue mayor a pH3 (29 %) que a pH6 (21%). La

coalescencia depende muy fuertemente de las características reológicas de las películas

interfaciales.

Tabla 2.4. Diámetros promedios de Sauter, D32 (μm), para las emulsiones de mezclas de

E5LV 1% y βlg 1% a pH3 y pH6 almacenadas a T ambiente. Desviación estándar:1%.

recién preparada Día1 Dia5 Dia25

pH3 0,672 0,680 0,687 0,867

pH6 0,711 0,742 0,783 0,861


225

Como se ha mostrado al estudiar la reología de las películas interfaciales de los sistemas

mixtos βlg: E5LV, la presencia de E5LV en los sistemas a pH6 no afecta la capacidad de la

βlg para formar películas muy elásticas. Sin embargo, a pH3 la presencia de E5LV tiene un

efecto antagónico en la mezcla ya que disminuye el carácter elástico de la película (o

aumenta tg δ) en relación al comportamiento de la βlg sola.

Por lo tanto es de esperar que las gotas de las emulsiones mixtas a pH3 sean menos

resistentes a la coalescencia debido a su menor elasticidad.

CONCLUSIÓN GENERAL

SECCIÓN II

226

En esta sección se analizó el comportamiento en solución, en interfases y en emulsiones

O/W, de mezclas de HPMC con lg a pH3 y 6 comparativamente.

Al igual que en la sección anterior, el pH del medio afecta considerablemente el

comportamiento de estas mezclas en solución, interfases y emulsiones.

El pH modula la formación de complejos lg:E5LV, lo cual se refleja en una disminución

de la actividad interfacial de la lg y de las propiedades viscoelásticas de las películas

interfaciales a pH3. Esto impacta en las emulsiones a pH3 que muestran una coalescencia

ligeramente mayor que a pH6. Aún así el grado de coalescencia durante el tiempo de

almacenamiento estudiado fue muy bajo. Sin embargo, las emulsiones a pH6, presentan una

mayor desestabilización por cremado-floculación debido al fenómeno de floculación por

depleción, por la presencia de HPMC en la fase continua.

Bibliografía


227

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FE DE ERRATAS

“COMPORTAMIENTO DE HIDROXIPROPILMETILCELULOSAS Y SUS

MEZCLAS CON -LACTOGLOBULINA EN SOLUCIÓN, INTERFASES Y

EMULSIONES”

Resumen donde dice “aplicación de ultrasonidos de lata intensidad” debe decir “aplicación de ultrasonidos de alta intensidad”. Indice, pag iii Punto 2.10.5 donde dice “Determinación de la viscosidad de las emulsione” debe decir “Determinación de la viscosidad de las emulsiones”. Página 10 donde dice “ampliamente empelado” debe decir “ampliamente empleado”. Página 68 donde dice “A pH mayores al punto isoeléctrico el potencial zeta es mayor a cero, y a pH menores es negativo” debe decir “A pH menores al punto isoeléctrico el potencial zeta es mayor a cero, y a pH mayores es negativo”.

Página 89 Figura 17, eje y, donde dice “ 健券 (訂迭添轍貼肺禰訂迭添轍 ) ” debe decir “健券 (

訂迭添轍貼肺禰訂迭添轍貸訂轍) ”

Página 91 donde dice “siendo por tanto la parte real del módulo es nula y la tg es

uno” debe decir “siendo por lo tanto la parte del módulo nula y la tg uno”.

Página 104 donde dice “ se traduce en una mayor grado”…”cuatro veces mayor que la correspondientes” debe decir “ se traduce en un mayor grado”…”cuatro veces mayor que las correspondientes”.

Página 110 donde dice “a autoensamblarse en solución mediantes” debe decir “a autoensamblarse en solución mediante”.

Página 122-123. Figura 2.4 eje x. donde dice “(s-1)” debe decir “ (s-1)”.

Figura 2.4 Leyenda. Donde dice “velocidad de deformación ()” debe

decir “velocidad de deformación ()”. Página 125 donde dice “Durate la aplicación de USAI” debe decir “Durante la aplicación de USAI”

Página 163 donde dice “Esto significa que la población I y parcialmente la II, no contribuyen ampliamente al volumen total de la fase dispersa” debe decir “Esto significa que la población I no contribuye ampliamente al volumen total de la fase dispersa”.

donde dice “baja tendencia a la formación de flóculas detctadas por microscopia” debe decir “baja tendencia a la formación de flóculos detectadas por microscopía”.

Página 185 donde dice “el SDS adsorbido le da las gotas” debe decir “el SDS adsorbido le da a las gotas”.

Página 186 donde dice “hay a las 24 hs un alto grado de coalescencia a las 24 hs” debe decir “hay un alto grado de coalescencia a las 24 hs”.

Página 188 donde dice “el diámetro inicial de las emusliones” debe decir “el diámetro inicial de las emulsiones”.

Página 212. Leyenda Figura 1.10, donde dice “(B) mezclas de lg 0,5% + E5LV 1%” debe decir “(C) mezclas de lg 0,5% + E5LV 1%”.

Página 222 donde dice “en emulsiones que indican que números polisacáridos no adsorbidos” debe decir “en emulsiones que indican que numerosos polisacáridos no adsorbidos”.

Página 224 donde dice “La tabla 6.4 muestran” debe decir “La tabla 2.3 muestra”.

Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosas y sus mezclas co

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